JP6108382B2 - New ionic liquids and their applications - Google Patents
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Description
本発明は、イオン液体に関するものである。より詳細には、アンモニウムカチオンにアルキルエーテル基を導入したイオン液体に関するものである。本発明はまた、新規イオン液体を用いたタンパク質を壁材とするナノサイズのカプセルの製造方法にも関する。本発明により製造されたタンパク質カプセルは、ライフサイエンス、医療（治療、診断を含む。）等の分野で有用である。 The present invention relates to an ionic liquid. More specifically, the present invention relates to an ionic liquid in which an alkyl ether group is introduced into an ammonium cation. The present invention also relates to a method for producing nano-sized capsules using protein as a wall material using a novel ionic liquid. The protein capsule produced by the present invention is useful in fields such as life science, medicine (including treatment and diagnosis).
イオン液体は、常温でも結晶化せずに溶融している有機塩であり、高極性、蒸気圧が極めて低いなど塩の特徴を有した液体である。他に、不燃性、高イオン電導性、大熱容量、低粘性、不揮発性であり、広い温度域で液体であるなどの性質を持ち、これまでの溶媒では持ちえなかった様々な特徴を有している。 An ionic liquid is an organic salt that is melted without crystallizing at room temperature, and has a characteristic of salt such as high polarity and extremely low vapor pressure. In addition, it has properties such as nonflammability, high ionic conductivity, large heat capacity, low viscosity, and non-volatility, and it is liquid in a wide temperature range, and has various characteristics that could not be possessed by conventional solvents. ing.
これまでに種々のイオン液体が調製され（例えば、特許文献１〜３）、有機化学反応や光化学反応の反応場、分離・抽出溶媒、分子集合体形成の媒体としての利用、リチウムイオン電池、太陽電池などへの応用が検討されてきた。 Various ionic liquids have been prepared so far (for example, Patent Documents 1 to 3), reaction fields for organic chemical reactions and photochemical reactions, separation / extraction solvents, use as media for molecular assembly formation, lithium ion batteries, solar Application to batteries has been studied.
一方、本発明者らは、イオン液体と他の溶媒の成す界面に注目し、これを無機材料の合成場や生体高分子の集積場として利用することで、機能性マテリアルを創製してきた。イオン液体 / トルエン界面でゾル―ゲル反応を行うことにより金属酸化物のマイクロカプセルの作製に成功している（非特許文献１）。また、イオン液体 / 水界面で Au(OH)4 - の光還元やタンパク質の吸着を行うことにより、金のナノシート（非特許文献２）や、タンパク質を壁材としたマイクロカプセル（非特許文献３）の調製にも成功している。このタンパク質マイクロカプセルの調製方法においては、イオン液体中に導入したマイクロ水滴を鋳型として利用することにより、有機溶媒を一切使用しない。 On the other hand, the present inventors have paid attention to an interface formed by an ionic liquid and another solvent, and have created a functional material by using this as a synthesis field for inorganic materials and a collection field for biopolymers. A metal oxide microcapsule has been successfully produced by performing a sol-gel reaction at the ionic liquid / toluene interface (Non-Patent Document 1). In addition, by performing photoreduction of Au (OH) 4 − and protein adsorption at the ionic liquid / water interface, gold nanosheets (Non-patent Document 2) and microcapsules using protein as a wall material (Non-patent Document 3) ) Has also been successfully prepared. In this method for preparing protein microcapsules, no organic solvent is used by using micro water droplets introduced into an ionic liquid as a template.
核酸や酵素などを内包したナノカプセルは、ドラッグターゲティング等におけるナノキャリアとして注目されている。これまでに、天然のウイルスキャプシドや両親媒性分子の自己集合により形成される球状集合体を利用する調製方法や、テンプレート粒子と交互積層法を組み合わせた中空粒子作製法などが開発されてきた（例えば、特許文献４）。タンパク質カプセルは、優れた生分解性を有することから、ナノキャリアとして特に有望視されている。 Nanocapsules encapsulating nucleic acids and enzymes are attracting attention as nanocarriers in drug targeting and the like. So far, preparation methods using spherical aggregates formed by self-assembly of natural virus capsids and amphipathic molecules, and hollow particle production methods combining template particles and alternate lamination methods have been developed ( For example, Patent Document 4). Protein capsules are particularly promising as nanocarriers because of their excellent biodegradability.
微小カプセルを生体に適用するには、1. 適切なサイズ、2. 表面修飾性、3. 内包性が重要である。したがって、用途に応じた望ましい粒径に制御でき、また表面修飾や種々の物質の内包が可能なタンパク質カプセルが得られれば、医療分野への更なる応用が期待できる。 In order to apply microcapsules to living bodies, 1. appropriate size, 2. surface modification, 3. inclusion are important. Therefore, if a protein capsule that can be controlled to a desired particle size according to the use and can be surface-modified or encapsulated with various substances can be obtained, further application to the medical field can be expected.
これまで、本発明者らは、水との相溶性が低いイオン液体と高いイオン液体を組み合わせて用いることで、イオン液体 / 水界面で形成されるタンパク質カプセルのサイズの縮小化を検討した。そして、水との相溶性が低いイオン液体（1-ブチル-3-メチルイミダゾリウムビストリフルオロメタンスルホニルイミド）に相溶性が高いイオン液体（1-ブチル-3-メチルイミダゾリウムブロミド）を加えて用いることで、サイズが数百 nm〜数 mmに分布するタンパク質カプセルが調製できることを確認した。しかしながら、得られたタンパク質カプセルは分散性が高く、イオン液体相から回収することが困難であった。 Up to now, the present inventors have studied to reduce the size of the protein capsule formed at the ionic liquid / water interface by using a combination of an ionic liquid having a low compatibility with water and a high ionic liquid. Then, an ionic liquid (1-butyl-3-methylimidazolium bromide) having high compatibility is added to an ionic liquid (1-butyl-3-methylimidazolium bistrifluoromethanesulfonylimide) having low compatibility with water. Thus, it was confirmed that a protein capsule having a size ranging from several hundred nm to several mm could be prepared. However, the obtained protein capsule has high dispersibility, and it was difficult to recover from the ionic liquid phase.
本発明者らは、ジエチルグリコール基を有する第三級アンモニウムイオンをカチオン、ビス(トリフルオロメタンスルホニル)イミドイオンをアニオンとする新しいイオン液体を調製した。このイオン液体と水とを含む連続相中では、水滴がナノサイズで分散可能であり、またイオン液体が水との相溶性が高いため、ナノカプセル調製後は、連続相を水に溶解させ、水とともにイオン液体を除去できた。また、カプセル粒子の調製に際しては、タンパク質溶液を多孔質膜を通過させる膜乳化法を適用し、物理的に液滴の大きさを小さくすることにより、カプセルのサイズ制御を試みた。そのようにして得られた知見に基づいて、本発明を完成した。 The present inventors prepared a new ionic liquid having a tertiary ammonium ion having a diethyl glycol group as a cation and a bis (trifluoromethanesulfonyl) imide ion as an anion. In the continuous phase containing this ionic liquid and water, water droplets can be dispersed in nano-size, and since the ionic liquid is highly compatible with water, after the nanocapsule preparation, the continuous phase is dissolved in water, The ionic liquid could be removed together with water. In preparing capsule particles, a membrane emulsification method in which a protein solution is passed through a porous membrane was applied to attempt to control the capsule size by physically reducing the size of the droplets. The present invention was completed based on the knowledge thus obtained.
本発明は、以下を提供する。
[１］ 下記式（I）：
The present invention provides the following.
[1] The following formula (I):
R1〜R4は、少なくとも1つはR5-O-(R6)n-R7-であり、他はHであり；
このとき、R5は、炭素数1〜8の直鎖または分岐のアルキル基、フェニル基またはベンジル基であり、
R6は、CH2CH2Oまたは
R 1 to R 4 are at least one R 5 —O— (R 6 ) n —R 7 — and the other is H;
At this time, R 5 is a linear or branched alkyl group having 1 to 8 carbon atoms, a phenyl group or a benzyl group,
R 6 is CH 2 CH 2 O or
であり、
nは、1〜3の整数であり、
R7は、炭素数1〜6の直鎖または分岐鎖のアルキル基であり；
Xは、炭素数1〜3のアルキルスルホン酸イオン、テトラフルオロホウ酸イオン、ヘキサフルオロリン酸イオン、炭素数1〜3のフルオロアルキルスルホン酸イオン、フルオロもしくはパーフルオロアルキルスルホニルアミドイオン、および炭素数1〜3のアルキル硫酸イオンから選ばれるいずれかのアニオンを示す。）で表される、イオン液体。
[２］ X-が、臭化物イオン、テトラフルオロホウ酸イオン、ヘキサフルオロリン酸イオン、炭素数1〜3のアルキルスルホン酸イオン、炭素数1〜3のフルオロアルキルスルホン酸イオン、フルオロもしくはパーフルオロアルキルスルホニルアミドイオンまたは炭素数1〜3のアルキル硫酸イオンから選択される、[１］に記載のイオン液体。
[３］ X-が、Br-、BF4 -、PF6 -、または(YSO2)2N-（Yは、F、CF3またはC2F5である。）である、[２］に記載のイオン液体。
[４］ R1〜R4の、少なくとも２つがR5-O-(R6)n-R7-であり、他がHであり；このとき、
R5が、メチル、エチル、ブチル、イソブチル、プロピル、イソプロピル、ヘキシル、2エチルヘキシル、アリル、フェニル、またはベンジルであり、
R6が、1に定義した通りであり、
nが、1〜3の整数であり、
R7が、メチル、エチル、ブチルである、３に記載のイオン液体。
[５］ R5が、メチルであり、
R6が、CH2CH2Oであり、
nが、1〜3の整数であり、
R7が、エチルであり、
X-が、(CF3SO2)2N-である、[４］に記載のイオン液体。
[６］ 下記の構造である、[５］に記載のイオン液体。
And
n is an integer from 1 to 3,
R 7 is a linear or branched alkyl group having 1 to 6 carbon atoms;
X is an alkyl sulfonate ion having 1 to 3 carbon atoms, tetrafluoroborate ion, hexafluorophosphate ion, fluoroalkyl sulfonate ion having 1 to 3 carbon atoms, fluoro or perfluoroalkylsulfonylamide ion, and carbon number An anion selected from 1 to 3 alkyl sulfate ions is shown. An ionic liquid represented by
[2] X − is bromide ion, tetrafluoroborate ion, hexafluorophosphate ion, alkyl sulfonate ion having 1 to 3 carbon atoms, fluoroalkyl sulfonate ion having 1 to 3 carbon atoms, fluoro or perfluoroalkyl The ionic liquid according to [1], which is selected from a sulfonylamide ion or an alkyl sulfate ion having 1 to 3 carbon atoms.
[3] In [2], X − is Br − , BF 4 − , PF 6 − , or (YSO 2 ) 2 N − (Y is F, CF 3 or C 2 F 5 ). The ionic liquid described.
[4] At least two of R 1 to R 4 are R 5 —O— (R 6 ) n —R 7 —, and the other is H;
R 5 is methyl, ethyl, butyl, isobutyl, propyl, isopropyl, hexyl, 2-ethylhexyl, allyl, phenyl, or benzyl
R 6 is as defined in 1,
n is an integer from 1 to 3,
4. The ionic liquid according to 3, wherein R 7 is methyl, ethyl, butyl.
[5] R 5 is methyl;
R 6 is CH 2 CH 2 O,
n is an integer from 1 to 3,
R 7 is ethyl;
The ionic liquid according to [4], wherein X − is (CF 3 SO 2 ) 2 N − .
[6] The ionic liquid according to [5], which has the following structure.
[７］ イオン液体であって、水と相溶性であり、かつ該イオン液体を含む液相を分散媒、水性液からなるナノサイズの液滴を分散質として乳化物を形成可能な、イオン液体を用い、
イオン液体を含む連続相に、カプセル壁材を含む水性液からなるナノサイズの液滴を分散して乳化物を得て、このとき連続相と分散相との界面に壁材が配され；
該壁材を架橋して液滴を鋳型とするナノサイズのカプセルを形成させ；
カプセルを含む連続相に水を加えて水性相とし；
水性相からカプセルを回収する
工程を含む、ナノカプセルの製造方法。
[８］ 壁材がタンパク質であり、タンパク質ナノカプセルの製造方法である、[７］に記載の製造方法。
[９］ カプセルの表面を改質する工程をさらに含む、[７］または[８］に記載の製造方法。
[１０］ イオン液体が、飽和含水率が3.0〜20.0重量％であり、飽和溶解量が0.05〜0.40Mであるものである、[７］〜[９］に記載の製造方法。
[１１］ イオン液体が、１〜６のいずれか１項に記載のイオン液体である、[７］〜[１０］のいずれか１項に記載の製造方法。
[１２］ 水性液からなるナノサイズの液滴が機能性物質を含み、機能性物質を内包したタンパク質ナノカプセルを製造するための、[７］〜[１１］のいずれか１項に記載の製造方法。
[１３］ [１２］に記載の製造方法で製造されたナノカプセルを含む、医薬組成物。
[7] An ionic liquid which is an ionic liquid, is compatible with water, and can form an emulsion using a liquid phase containing the ionic liquid as a dispersion medium and nano-sized droplets composed of an aqueous liquid as a dispersoid. Use
Nano-sized droplets composed of an aqueous liquid containing a capsule wall material are dispersed in a continuous phase containing an ionic liquid to obtain an emulsion, and at this time, the wall material is arranged at the interface between the continuous phase and the dispersed phase;
Cross-linking the wall material to form nano-sized capsules using droplets as templates;
Adding water to the continuous phase containing the capsules to form an aqueous phase;
A method for producing nanocapsules, comprising the step of recovering capsules from an aqueous phase.
[8] The production method according to [7], wherein the wall material is protein and is a production method of protein nanocapsules.
[9] The production method according to [7] or [8], further comprising a step of modifying the surface of the capsule.
[10] The production method according to [7] to [9], wherein the ionic liquid has a saturated water content of 3.0 to 20.0% by weight and a saturated dissolution amount of 0.05 to 0.40M.
[11] The production method according to any one of [7] to [10], wherein the ionic liquid is the ionic liquid according to any one of 1 to 6.
[12] The production according to any one of [7] to [11], for producing a protein nanocapsule including a functional substance in which nano-sized droplets made of an aqueous liquid contain the functional substance. Method.
[13] A pharmaceutical composition comprising nanocapsules produced by the production method according to [12].
本発明は、下記式（I）で表される新規イオン液体を提供する。 The present invention provides a novel ionic liquid represented by the following formula (I).
式中：
R1〜R4は、少なくとも1つはR5-O-(R6)n-R7-であり、他はHであり；
このとき、R5は、炭素数1〜8の直鎖または分岐のアルキル基、フェニル基またはベンジル基であり、
R6はCH2CH2Oまたは
nは、1〜3の整数であり、
R7は、炭素数1〜6の直鎖または分岐鎖のアルキル基であり；
Xは、炭素数1〜3のアルキルスルホン酸イオン、テトラフルオロホウ酸イオン、ヘキサフルオロリン酸イオン、炭素数1〜3のフルオロアルキルスルホン酸イオン、フルオロもしくはパーフルオロアルキルスルホニルアミドイオン、および炭素数1〜3のアルキル硫酸イオンから選ばれるいずれかのアニオンを示す。
In the formula:
R 1 to R 4 are at least one R 5 —O— (R 6 ) n —R 7 — and the other is H;
At this time, R 5 is a linear or branched alkyl group having 1 to 8 carbon atoms, a phenyl group or a benzyl group,
R 6 is CH 2 CH 2 O or
n is an integer from 1 to 3,
R 7 is a linear or branched alkyl group having 1 to 6 carbon atoms;
X is an alkyl sulfonate ion having 1 to 3 carbon atoms, tetrafluoroborate ion, hexafluorophosphate ion, fluoroalkyl sulfonate ion having 1 to 3 carbon atoms, fluoro or perfluoroalkylsulfonylamide ion, and carbon number An anion selected from 1 to 3 alkyl sulfate ions is shown.
カチオン部分：
本発明で「R1〜R4は、少なくとも1つはR5-O-(R6)n-R7-であり、他はHである」というときは、特に記載した場合を除き、R1〜R4がすべてR5-O-(R6)n-R7-であり、HであるR1〜R4が存在しない場合も包含する。R1〜R4のうち、２以上がR5-O-(R6)n-R7-であるとき、それぞれはR5-O-(R6)n-R7-で定義される限り、同一であってもよく、異なっていてもよい。本発明の一の態様においては、R1〜R4のうち、２以上がR5-O-(R6)n-R7-であるとき、それぞれは同一であってもよい。一般に，対称性の高い分子は融点が高くなる傾向があり、対称性を低くすると融点が下がる。一方、柔軟なエーテル鎖は、結晶化を抑制する。よって式（I）で表される化合物は、各R1〜R4が同一であり、対称的な構造であっても、イオン液体でありうるという特徴を有する。
本発明の式（I）で表される新規イオン液体の、他の好ましい態様の１つにおいては、
R1〜R4の、少なくとも２つがR5-O-(R6)n-R7-であり、他がHであり；このとき、R5が、メチル、エチル、ブチル、イソブチル、プロピル、イソプロピル、ヘキシル、2エチルヘキシル、アリル、フェニル、またはベンジルであり、R6が、上に定義した通りであり、
nが、1〜3の整数であり、R7が、メチル、エチル、ブチルである。
Cationic moiety:
In the present invention, when “R 1 to R 4 are at least one of R 5 —O— (R 6 ) n —R 7 — and the other is H”, R 1 to R 4 are all R 5 —O— (R 6 ) n —R 7 —, and the case where R 1 to R 4 which is H does not exist is also included. When two or more of R 1 to R 4 are R 5 —O— (R 6 ) n —R 7 —, each is defined as R 5 —O— (R 6 ) n —R 7 — , May be the same or different. In one embodiment of the present invention, when two or more of R 1 to R 4 are R 5 —O— (R 6 ) n —R 7 —, each may be the same. In general, molecules with high symmetry tend to have a high melting point, and lowering the symmetry lowers the melting point. On the other hand, a flexible ether chain suppresses crystallization. Therefore, the compound represented by the formula (I) is characterized in that each of R 1 to R 4 is the same, and even if it has a symmetric structure, it can be an ionic liquid.
In another preferred embodiment of the novel ionic liquid represented by the formula (I) of the present invention,
At least two of R 1 to R 4 are R 5 —O— (R 6 ) n —R 7 — and the other is H; where R 5 is methyl, ethyl, butyl, isobutyl, propyl, Isopropyl, hexyl, 2-ethylhexyl, allyl, phenyl, or benzyl, R 6 is as defined above;
n is an integer of 1 to 3, and R 7 is methyl, ethyl, or butyl.
本発明の式（I）で表される新規イオン液体の、他の好ましい態様の１つにおいては、R5が、メチルであり、R6が、CH2CH2Oであり、nが、1〜3の整数であり、R7が、エチルである。
本発明の式（I）で表される新規イオン液体における、より具体的なカチオン部分の例は、下記のものである。
In another preferred embodiment of the novel ionic liquid represented by the formula (I) of the present invention, R 5 is methyl, R 6 is CH 2 CH 2 O, and n is 1 Is an integer of ˜3 and R 7 is ethyl.
Examples of more specific cation moieties in the novel ionic liquid represented by the formula (I) of the present invention are as follows.
アニオン部分：
本発明の式（I）で表される新規イオン液体の好ましい態様の１つにおいては、X-が、臭化物イオン、テトラフルオロホウ酸イオン、ヘキサフルオロリン酸イオン、炭素数1〜3のアルキルスルホン酸イオン、炭素数1〜3のフルオロアルキルスルホン酸イオン、フルオロもしくはパーフルオロアルキルスルホニルアミドイオン、または炭素数1〜3のアルキル硫酸イオンから選択される。
Anion moiety:
In one preferred embodiment of the novel ionic liquid represented by the formula (I) of the present invention, X − represents bromide ion, tetrafluoroborate ion, hexafluorophosphate ion, alkyl sulfone having 1 to 3 carbon atoms. It is selected from an acid ion, a fluoroalkyl sulfonate ion having 1 to 3 carbon atoms, a fluoro or perfluoroalkylsulfonylamide ion, or an alkyl sulfate ion having 1 to 3 carbon atoms.
炭素数1〜3のアルキルスルホン酸イオンの例は、メタンスルホネートイオン（CH3SO3 -）である。 An example of an alkyl sulfonate ion having 1 to 3 carbon atoms is methane sulfonate ion (CH 3 SO 3 − ).
炭素数1〜3のフルオロアルキルスルホン酸イオンの例は、トリフルオロスルホン酸イオン（CF3SO3 -）である。 An example of the fluoroalkyl sulfonate ion having 1 to 3 carbon atoms is a trifluorosulfonate ion (CF 3 SO 3 − ).
フルオロもしくはパーフルオロアルキルスルホニルアミドイオンの例は、(YSO2)2N-（Yは、F、CF3またはC2F5である。）であり、より詳細な例は、ビス（トリフルオロメチルスルホニル）イミドイオン（(CF3SO2)2N-）である。 An example of a fluoro or perfluoroalkylsulfonylamide ion is (YSO 2 ) 2 N − (Y is F, CF 3 or C 2 F 5 ), more specific examples are bis (trifluoromethyl Sulfonyl) imide ion ((CF 3 SO 2 ) 2 N − ).
炭素数1〜3のアルキル硫酸イオンの例は、メチル硫酸イオン（CH3SO4 -）である。 An example of an alkyl sulfate ion having 1 to 3 carbon atoms is methyl sulfate ion (CH 3 SO 4 − ).
本発明の式（I）で表される新規イオン液体の、他の好ましい態様の１つにおいては、X-が、Br-、BF4-、PF6-、または(YSO2)2N-（Yは、F、CF3またはC2F5である。）である。 In another preferred embodiment of the novel ionic liquid represented by the formula (I) of the present invention, X − is Br − , BF 4 − , PF 6 − , or (YSO 2 ) 2 N − (Y is , F, CF 3 or C 2 F 5 ).
本発明の式（I）で表される新規イオン液体の、特に好ましい態様の１つにおいては、X-が、ビス（トリフルオロメチルスルホニル）イミドイオン（(CF3SO2)2N-）である。このイオンを、「Tf2N」と記載することがある。 In one particularly preferable embodiment of the novel ionic liquid represented by the formula (I) of the present invention, X − is a bis (trifluoromethylsulfonyl) imide ion ((CF 3 SO 2 ) 2 N − ). . This ion may be described as “Tf 2 N”.
本発明の式（I）で表される新規イオン液体の、より具体的な例は下記のものである。 More specific examples of the novel ionic liquid represented by the formula (I) of the present invention are as follows.
本発明のイオン液体の製造は、当業者であれば、本明細書の実施例の記載と技術水準に基づき、入手可能な出発材料より適宜合成可能である。 Production of the ionic liquid of the present invention can be appropriately synthesized by those skilled in the art from available starting materials based on the description of the examples and the technical level of the present specification.
本発明により提供される式（I）で表される新規イオン液体は、有機化学反応、光化学反応のための反応場として、分離・抽出溶媒として、また分子集合体形成媒体として利用することができる。本発明により提供される式（I）で表される新規イオン液体は、次に説明するタンパク質ナノカプセル製造において用いるのに、特に適している。 The novel ionic liquid represented by the formula (I) provided by the present invention can be used as a reaction field for organic chemical reaction and photochemical reaction, as a separation / extraction solvent, and as a molecular assembly forming medium. . The novel ionic liquid represented by the formula (I) provided by the present invention is particularly suitable for use in the production of protein nanocapsules described below.
〔タンパク質ナノカプセルの製造方法〕
本発明はまた、水と相溶性であるイオン液体を用いた、タンパク質のナノカプセルの製造方法を提供する。
[Producing method of protein nanocapsule]
The present invention also provides a method for producing protein nanocapsules using an ionic liquid that is compatible with water.
本発明の製造方法に用いられるイオン液体は、水と相溶性であるのみならず、かつ当該イオン液体を含む液相を分散媒、水性液からなるナノサイズの液滴を分散質として乳化物を形成可能なものである。このようなイオン液体の典型例は、上述した式（I）で表されるイオン液体である。 The ionic liquid used in the production method of the present invention is not only compatible with water, but also an emulsion using a liquid phase containing the ionic liquid as a dispersion medium and nano-sized droplets composed of an aqueous liquid as a dispersoid. It can be formed. A typical example of such an ionic liquid is the ionic liquid represented by the formula (I) described above.
本発明において、イオン液体の性質に関し、水と「相溶性」であるというときは、特に記載した場合を除き、水とイオン液体が任意の組成比で自由に混合可能ではなく、混合比に拠り、均一相になったり、二相分離したりする性質を指す。通常、水へのイオン液体の溶解度、およびイオン液体への水の溶解度それぞれが、比較的高い場合に、相溶性である。なお、イオン液体への水の溶解度は、「飽和含水率」として表すことができ、また水へのイオン液体の溶解度は、「飽和溶解量」として表すことができる。本発明において「飽和含水率」または「飽和溶解量」について、値を示すときは、特に記載した場合を除き、25℃における値である。 In the present invention, regarding the properties of the ionic liquid, when it is “compatible” with water, it is not possible to freely mix the water and the ionic liquid at an arbitrary composition ratio unless otherwise specified. , Refers to the property of becoming a homogeneous phase or two-phase separation. Usually, it is compatible when the solubility of the ionic liquid in water and the solubility of water in the ionic liquid are relatively high. The solubility of water in the ionic liquid can be expressed as “saturated water content”, and the solubility of the ionic liquid in water can be expressed as “saturated solubility”. In the present invention, when “saturated water content” or “saturated dissolved amount” is indicated, it is a value at 25 ° C. unless otherwise specified.
水との相溶性が高い、という点に関し、上述の式Iで表されるイオン液体において、特に重要な構造は、エーテル酸素を含むアンモニウムカチオン部分である。式Iで表されるイオン液体以外のイオン液体であっても、水との適切な程度の相溶性を有していれば、本発明の製造方法への適用が期待できる。例えば、イオン液体として汎用な、ジアルキルイミダゾリウム塩においては、水溶性の高いものが知られており、アルキル基の比較的短い化合物や、アルキル鎖の末端に水酸基を有する化合物が水との相溶性が高いことが報告されている。 In the ionic liquid represented by the above-mentioned formula I in terms of high compatibility with water, a particularly important structure is an ammonium cation moiety containing ether oxygen. Even an ionic liquid other than the ionic liquid represented by Formula I can be expected to be applied to the production method of the present invention as long as it has an appropriate degree of compatibility with water. For example, dialkyl imidazolium salts that are widely used as ionic liquids are known to have high water solubility, and compounds having a relatively short alkyl group or a compound having a hydroxyl group at the end of the alkyl chain are compatible with water. Has been reported to be high.
具体的には、飽和含水率および飽和溶解量が、トリス[2-(2-メトキシエトキシ)エチル]アンモニウム-ビストリフルオロメタンスルホニルイミドと同程度、より具体的には、飽和溶解量が0.05〜0.40M、好ましくは0.052〜0.35M、より好ましくは0.054〜0.30Mであり、飽和溶解量がいずれの場合においても、飽和含水率が3.0〜20.0重量％、好ましくは6.0〜18.0重量％、より好ましくは7.0〜16.0重量％であるイオン溶液を、好適に用いることができるであろう。 Specifically, the saturated water content and the saturated dissolution amount are the same as those of tris [2- (2-methoxyethoxy) ethyl] ammonium-bistrifluoromethanesulfonylimide, and more specifically, the saturated dissolution amount is 0.05 to 0.40. M, preferably 0.052 to 0.35M, more preferably 0.054 to 0.30M, and in any case of saturated dissolution, the saturated moisture content is 3.0 to 20.0% by weight, preferably 6.0 to 18.0% by weight, more preferably An ionic solution that is 7.0 to 16.0% by weight could be suitably used.
本発明への適用が期待できるイオン液体の例は、下記に示すものである。 Examples of ionic liquids that can be expected to be applied to the present invention are shown below.
上記のイオン液体の製造方法ついては、J. Phys. Chem. B 2008, 112, 1218-1225およびAnal. Chem. 2006, 78, 7735-7742を参考にすることができる。これらのイオン液体の飽和含水率は、7〜10 wt%、飽和溶解量は55〜260 mMである。 For the production method of the ionic liquid, J. Phys. Chem. B 2008, 112, 1218-1225 and Anal. Chem. 2006, 78, 7735-7742 can be referred to. These ionic liquids have a saturated water content of 7 to 10 wt% and a saturated dissolution amount of 55 to 260 mM.
本発明の製造方法は、具体的には、下記の工程を含む：
(1) イオン液体を含む連続相に、壁材を含む水性液からなるナノサイズの液滴を分散して乳化物を得る工程；
(2) 工程(1)により、このとき連続相と分散相との界面に壁材が配されるが、該壁材を架橋して液滴を鋳型とするナノサイズのカプセルを形成させる工程；
(3) カプセルを含む連続相に水を加えて水性相とする工程；そして
(4) 水性相からカプセルを回収する工程。
このような製造方法の概略を、図１に示した。
The production method of the present invention specifically includes the following steps:
(1) A step of obtaining an emulsion by dispersing nano-sized droplets composed of an aqueous liquid containing a wall material in a continuous phase containing an ionic liquid;
(2) In the step (1), a wall material is arranged at the interface between the continuous phase and the dispersed phase at this time, and the wall material is cross-linked to form a nano-sized capsule using a droplet as a template;
(3) adding water to the continuous phase containing the capsules to form an aqueous phase; and
(4) A step of recovering capsules from the aqueous phase.
An outline of such a manufacturing method is shown in FIG.
本発明においては、イオン液体／水界面に配されることができ、および界面において架橋などにより安定な膜を形成することができるものであれば、種々の壁材を用いうる。壁材の典型的な例は、タンパク質であるが、本発明者らは、従来の疎水性イオン液体を用いた方法では、タンパク質以外の材料を壁材として用いて、マイクロカプセルを調製できることを確認している。例えば、アミノ基を有する多糖（キトサン等）、アミノ基を側鎖に有する合成ポリペプチド（ポリリシン等）、アミノ基を有する合成高分子（ポリアリルアミン等）は、本発明の製造方法において、壁材として、好適に用いることができるであろう。本明細書では、本発明のナノカプセルの製造方法を、壁材としてタンパク質を用いた場合を例に説明することがあるが、その説明は、特に記載した場合を除き、他の壁材を用いた場合にも当てはまる。 In the present invention, various wall materials can be used as long as they can be arranged at the ionic liquid / water interface and can form a stable film by crosslinking or the like at the interface. A typical example of a wall material is protein, but the present inventors confirmed that microcapsules can be prepared by using a material other than protein as a wall material in the conventional method using a hydrophobic ionic liquid. doing. For example, a polysaccharide having an amino group (such as chitosan), a synthetic polypeptide having an amino group in its side chain (such as polylysine), and a synthetic polymer having an amino group (such as polyallylamine) are used as wall materials in the production method of the present invention. As such, it can be suitably used. In the present specification, the nanocapsule production method of the present invention may be described by taking the case of using protein as a wall material as an example. However, the description uses other wall materials unless otherwise specified. It is also true if
工程(1)は、イオン液体を含む連続相に、タンパク質を含む水性液からなるナノサイズの液滴を分散して乳化物を得る工程である。連続相は、通常、イオン液体のほかタンパク質を含む水性液由来のものを含む。
水性液は、典型的には、カプセル形成上有効な濃度でタンパク質を水または適切な水性
緩衝液に溶解したものである。タンパク質の濃度は、当業者であれば適宜設計できる。タンパク質は、リジン残基のε-アミノ基、システイン残基のSH基等、架橋可能な基を有している種々のものを用いることができる。
Step (1) is a step of obtaining an emulsion by dispersing nano-sized droplets made of an aqueous liquid containing protein in a continuous phase containing an ionic liquid. The continuous phase usually includes those derived from an aqueous liquid containing proteins in addition to the ionic liquid.
The aqueous liquid is typically a protein dissolved in water or a suitable aqueous buffer at a concentration effective for capsule formation. A person skilled in the art can appropriately design the protein concentration. As the protein, various proteins having a crosslinkable group such as an ε-amino group of a lysine residue and an SH group of a cysteine residue can be used.
水性液には、機能性物質を溶解または分散させることにより、得られるナノカプセルに機能性物質を内包させることができる。内包させる物質は、治療薬、診断薬、造影剤、抗体、核酸等であり得る。 In the aqueous liquid, the functional substance can be encapsulated in the resulting nanocapsules by dissolving or dispersing the functional substance. The substance to be encapsulated can be a therapeutic agent, a diagnostic agent, a contrast agent, an antibody, a nucleic acid, or the like.
工程２における乳化方法は、ナノサイズの乳化のための従来技術が利用できる。これには、撹拌法（高圧ホモゲナイザー乳化法を含む）、膜透過法が含まれる。膜を透過させることにより分散させる液滴の大きさを制御する膜透過法は、本発明の製造方法においては、サイズ制御が容易、サイズをナノオーダーにできる、サイズ分布をより均一にできる（粒度分布がシャープ）である等の観点から、本発明へ好ましく適用することができる。 As the emulsification method in step 2, a conventional technique for nano-size emulsification can be used. This includes a stirring method (including a high-pressure homogenizer emulsification method) and a membrane permeation method. In the production method of the present invention, the membrane permeation method that controls the size of the droplets dispersed by allowing the membrane to permeate is easy to control the size, the size can be in the nano order, and the size distribution can be made more uniform (particle size From the viewpoint that the distribution is sharp), it can be preferably applied to the present invention.
工程(1)により、連続相と分散相との界面にタンパク質が配される。 By the step (1), the protein is arranged at the interface between the continuous phase and the dispersed phase.
工程(2)は、該界面タンパク質を架橋して液滴を鋳型とするナノサイズのカプセルを形成させる工程である。架橋に際しては、グルタルアルデヒドのような、架橋剤を添加することによって行ってもよい。 Step (2) is a step of cross-linking the interface protein to form nano-sized capsules using droplets as templates. The crosslinking may be performed by adding a crosslinking agent such as glutaraldehyde.
工程(3)は、カプセルを含む連続相に水を加えて水性相とする工程である。用いられるイオン液体は水と相溶するものであるので、このような工程の実施が可能である。水性相からは、遠心分離等の固液分離のための方法に拠り、容易にカプセルを回収することができる。 Step (3) is a step of adding water to the continuous phase containing the capsules to form an aqueous phase. Since the ionic liquid used is compatible with water, such a process can be performed. Capsules can be easily recovered from the aqueous phase by a method for solid-liquid separation such as centrifugation.
本発明の製造方法はさらに、(5) カプセルの表面を改質する工程を含んでいてもよい。改質の目的は特に限定されず、カプセル表面の親水性または疎水性を高めるために実施してもよく、またカプセルを標識するために実施してもよい。 The production method of the present invention may further include (5) a step of modifying the capsule surface. The purpose of the modification is not particularly limited, and may be performed to increase the hydrophilicity or hydrophobicity of the capsule surface, or may be performed to label the capsule.
標識のための蛍光基の例は、下記である。 Examples of fluorescent groups for labeling are as follows.
本発明により得られたナノカプセルは、医薬組成物として使用することできる。本発明において「医薬組成物」というときは、特に記載した場合を除き、疾患または状態の、診断、予防または治療のために用いられる組成物をいう。 The nanocapsules obtained by the present invention can be used as a pharmaceutical composition. In the present invention, “pharmaceutical composition” refers to a composition used for diagnosis, prevention or treatment of a disease or condition, unless otherwise specified.
医薬組成物として用いる場合、タンパク質ナノカプセルのサイズが重要であろう。再送の設計に際しては、EPR 効果（腫瘍組織では,正常組織に比べ血管透過性が著しく亢進しているため,高分子や微粒子が血管より流出しやすい。また、リンパ系が未発達なため,腫瘍組織に到達した物質は蓄積する現象）を考慮し、カプセルの平均粒子径を、50〜200 nmとすることができる。また、細胞表面のレセプターに結合する分子（リガンド）をカプセルの表面に修飾することで、標的細胞への内包薬剤の選択的送達が期待できる。 When used as a pharmaceutical composition, the size of the protein nanocapsules may be important. When designing the resending, the EPR effect (tumor tissue has significantly increased vascular permeability compared to normal tissue, so polymers and fine particles are more likely to flow out of the blood vessel. The average particle size of the capsules can be set to 50 to 200 nm in consideration of the phenomenon that substances that reach the tissue accumulate). In addition, by selectively modifying a molecule (ligand) that binds to a cell surface receptor on the surface of the capsule, selective delivery of the encapsulated drug to the target cell can be expected.
〔実施例１：[1]・Tf2N の合成〕
1 L 三角フラスコに蒸留トリス[2-(2-メトキシエトキシ)エチル]アミン（M.W. 323.43、ALDRICH）94.55 g（0.292 mol）を加え、次に 1 M HCl 292 ml（0.292 mol）を加えた。これに、リチウムビス(トリフルオロメタンスルホニル)イミド（LiTf2N）（M.W. 287.08、関東化学）92 g（0.321 mol）を加え、1 h 撹拌したところ二相にわかれた。このとき、上相は黄色の水相であり、下相は茶黄色で粘性のあるイオン液体相だった。水相側を除去し、残ったイオン液体相に超純水を加えて分液により洗浄を行った。この分液による洗浄を 3 回行ったのち、イオン液体相を脱色するためにメタノール 250 ml 加え、活性炭を大さじ 6 杯加え、アルミホイルで遮光しながら 1.5 h 撹拌した。 その後、吸引ろ過により活性炭を除去した。この脱色操作を 7 回繰り返したのち、吸引ろ過およびメンブレンフィルターろ過を行い、活性炭を完全に除去した。この溶液中のメタノールを減圧留去により取り除いたのち、真空ラインを用いてイオン液体中の水を除去した。このイオン液体の 1H-NMR 測定を行い、合成を確認した。 To a 1 L Erlenmeyer flask was added 94.55 g (0.292 mol) of distilled tris [2- (2-methoxyethoxy) ethyl] amine (MW 323.43, ALDRICH), followed by 292 ml (0.292 mol) of 1 M HCl. To this, 92 g (0.321 mol) of lithium bis (trifluoromethanesulfonyl) imide (LiTf 2 N) (MW 287.08, Kanto Chemical) was added and stirred for 1 h. At this time, the upper phase was a yellow aqueous phase, and the lower phase was a brownish yellow and viscous ionic liquid phase. The aqueous phase was removed, and ultrapure water was added to the remaining ionic liquid phase, followed by washing with liquid separation. After washing with this liquid separation three times, 250 ml of methanol was added to decolorize the ionic liquid phase, 6 tablespoons of activated carbon was added, and the mixture was stirred for 1.5 hours while being shielded from light with aluminum foil. Thereafter, the activated carbon was removed by suction filtration. After this decolorization operation was repeated seven times, suction filtration and membrane filtration were performed to completely remove the activated carbon. After removing methanol in this solution by distillation under reduced pressure, water in the ionic liquid was removed using a vacuum line. 1 H-NMR measurement of this ionic liquid was performed to confirm the synthesis.
化合物 1 のみの場合に比べて、合成したイオン液体の a プロトンの化学シフトのピークは、2.79 ppmから 3.84 ppm にシフトしていた。 Compared to compound 1 alone, the chemical shift peak of the a proton in the synthesized ionic liquid was shifted from 2.79 ppm to 3.84 ppm.
水と実施例１で得られた[1]・Tf2Nを、 1：1（体積比）でサンプル管に加え、3 時間撹拌したところ、水と [1]・Tf2N は完全には混和せず、エマルションができた。これを 30 分間静置すると水相（上相）と [1]・Tf2N 相（下相）に分かれた。水相の重さを測ると 1.01727 g/ml だったため、この比重と純水の比重（1.0 g/ml）を用いて「[1]・Tf2N の水中での飽和溶解量」を計算したところ、0.0629 g/ml（0.10 M）となった。また、「[1]・Tf2N の飽和含水率」を求めるために、[1]・Tf2N 相をカールフィッシャー測定したところ 9.849 wt% H2O であることがわかった。 When water and [1] · Tf 2 N obtained in Example 1 were added to the sample tube at 1: 1 (volume ratio) and stirred for 3 hours, water and [1] · Tf 2 N were completely An emulsion was formed without mixing. After standing for 30 minutes, it separated into an aqueous phase (upper phase) and a [1] Tf 2 N phase (lower phase). Since the weight of the water phase was 1.01727 g / ml, we calculated the “saturated dissolution amount of [1] Tf 2 N in water” using this specific gravity and the specific gravity of pure water (1.0 g / ml). However, it became 0.0629 g / ml (0.10 M). In addition, the Karl Fischer measurement of the [1] · Tf 2 N phase to determine “[1] · Tf 2 N saturated water content” revealed that it was 9.849 wt% H 2 O.
・化合物名：Tris[2-(2-methoxyethoxy)ethyl]ammonium bis(trifluoromethanesulfonyl) imide
分子量：604.59
比重：1.38 g/ml（実測値）
飽和含水率：9.849 wt%
水中での飽和溶解量：0.0629 g/ml（0.10 M）
・ Compound name: Tris [2- (2-methoxyethoxy) ethyl] ammonium bis (trifluoromethanesulfonyl) imide
Molecular weight: 604.59
Specific gravity: 1.38 g / ml (actual measurement)
Saturated water content: 9.849 wt%
Saturated dissolution in water: 0.0629 g / ml (0.10 M)
〔実施例２：タンパク質ナノカプセルの製造（１）〕
これまでは、撹拌法によりタンパク質ナノカプセルの作製を試みた。しかし、様々な条件を試みたが、期待される粒径の縮小化は見られなかった。そこで、リポソーム調整器を用いて、1 μm のメンブレンフィルター膜を通過させることにより物理的に水滴の大きさを小さくし、それによるカプセルのサイズ制御を試みた。
[Example 2: Production of protein nanocapsules (1)]
Until now, production of protein nanocapsules was attempted by a stirring method. However, although various conditions were tried, the expected particle size was not reduced. Therefore, using a liposome adjuster, we tried to control the capsule size by physically reducing the size of the water droplets by passing through a 1 μm membrane filter membrane.
（実験操作）
リポソーム調整器（AVESTIN, メンブレンフィルター：孔径 1 μm, polycarbonate 製）の片側のハミルトンシリンジ（容量：500 μl）に、順に [1](Tf2N)（M.W. 604.59、実施例１）475 μl、0.5 wt% タンパク質水溶液（ALDRICH）50 μlを加えた。次に、タンパク質水溶液は膜を通過しないように、イオン液体である [1](Tf2N) だけ膜を 8 回通過させた。その後、タンパク質水溶液も膜を通過させ、プランジャーを 41 回交互に押し込み、エクストル―ジョンを行った。得られたエマルションを丸底容器に入れ、1,000 rpmで攪拌しながら 25 % グルタルアルデド溶液（M.W. 100.12、キシダ化学）10 μl を加え、30 ℃で 30 分間攪拌した。これを 0.01 M 2-アミノエタノール水溶液（M.W. 61.08、キシダ化学）11 ml（グルタルアルデヒドの 4 等量）に撹拌しながら少しずつ滴下していき、イオン液体を完全に水に溶解させた（CLSM 観察（Fig. 5、6）を行った）。これをガラスの遠心管に移し、遠心分離（約 5 秒）をしたのち、上積み液を除去した。これに超純水を加えて、手ではじいて分散させたのち、遠心分離（約 5 秒）を行い、上積み液を除去して洗浄した。
この操作を下線部分のタンパク質が変わるように、下表に従って同様に行ったのち、SEM 観察を行った。また SEM 写真から、粒径分布を求めた。
(Experimental operation)
[1] (Tf 2 N) (MW 604.59, Example 1) 475 μl, 0.5 in the Hamilton syringe (capacity: 500 μl) on one side of the liposome regulator (AVESTIN, membrane filter: pore size 1 μm, manufactured by PET) 50 μl of wt% aqueous protein solution (ALDRICH) was added. Next, the aqueous protein solution was passed through the membrane 8 times by [1] (Tf 2 N), which is an ionic liquid, so that it did not pass through the membrane. Thereafter, the protein aqueous solution was also allowed to pass through the membrane, and the plungers were alternately pushed 41 times to perform extrusion. The obtained emulsion was put in a round bottom container, and 10 μl of 25% glutaralded solution (MW 100.12, Kishida Chemical) was added while stirring at 1,000 rpm, and stirred at 30 ° C. for 30 minutes. This was added dropwise with stirring to 11 ml of 0.01 M 2-aminoethanol aqueous solution (MW 61.08, Kishida Chemical) (4 equivalents of glutaraldehyde) to completely dissolve the ionic liquid in water (CLSM observation) (Fig. 5, 6)). This was transferred to a glass centrifuge tube, centrifuged (about 5 seconds), and then the supernatant was removed. After adding ultrapure water to this and dispersing by hand, it was centrifuged (about 5 seconds), and the upper liquid stack was removed and washed.
This operation was similarly performed according to the table below so that the protein in the underlined portion was changed, and then SEM observation was performed. The particle size distribution was obtained from SEM photographs.
（結果および考察）
エクストルージョン法により数百 nm サイズのタンパク質カプセルが製造できた。FITC アルブミンに比べて牛血清アルブミンのカプセルサイズが少し大きくなっており、粒径分布も多少広くなっているが、これはプランジャーを押し込む速度などの実験操作による可能性がある。また、FITC アルブミンのフルオレセインはリシン残基の NH2 部位に結合しているので、牛血清アルブミンに比べてカチオン性が低くなっている。そのため、FITC アルブミンのほうが界面へ集まりにくくなり、カプセルサイズが小さくなっている可能性がある。
(Results and Discussion)
Protein capsules with a size of several hundred nm could be produced by the extrusion method. Compared to FITC albumin, the capsule size of bovine serum albumin is slightly larger and the particle size distribution is somewhat wider, but this may be due to experimental manipulations such as the speed at which the plunger is pushed. In addition, fluorescein of FITC albumin binds to the NH 2 site of the lysine residue, and therefore has a lower cationicity than bovine serum albumin. Therefore, FITC albumin is less likely to collect at the interface and the capsule size may be smaller.
見た目の形状は FITC アルブミンではしぼんだものが見られるが、牛血清アルブミンではきれいな球状のものしか見られない。この理由として、FITC アルブミンカプセルの膜は牛血清アルブミンカプセルよりも薄い可能性が考えられる。
SEM 像からタンパク質カプセル同士が凝集していることが確認される。これは、乾燥過程による可能性があるが、エタノールアミンに抽出した時点で、目視でも固体を確認できるので条件的に凝集しやすい可能性もある。
The appearance of FITC albumin is deflated, but bovine serum albumin only shows a clean spherical shape. The reason may be that the film of FITC albumin capsule is thinner than bovine serum albumin capsule.
From the SEM image, it is confirmed that the protein capsules are aggregated. This may be due to a drying process, but at the time of extraction to ethanolamine, solids can be visually confirmed, so that there is a possibility that the particles are likely to aggregate conditionally.
〔実施例３：タンパク質ナノカプセルの製造（２）〜膜の孔径の影響についての検討〜〕
タンパク質が FITC アルブミンの場合、孔径が 1 μm のメンブレンフィルターでは、平均粒径 285 nm のタンパク質ナノカプセルを製造できた。膜の孔径を小さくすることで、さらに小さなナノカプセルの作製が期待できる。そこで、孔径が400 nm、100 nm の膜においてエクストルージョン法を行い、それによるカプセルのサイズ制御を試みた。
[Example 3: Production of protein nanocapsules (2)-Examination of influence of membrane pore size-]
When the protein was FITC albumin, protein nanocapsules with an average particle size of 285 nm could be produced using a membrane filter with a pore size of 1 μm. Production of smaller nanocapsules can be expected by reducing the pore size of the membrane. Therefore, an extrusion method was performed on membranes with pore sizes of 400 nm and 100 nm, and capsule size control was attempted.
（実験操作）
リポソーム調整器（AVESTIN, メンブレンフィルター：孔径 1,000 nm, polycarbonate 製）の片側のハミルトンシリンジ（容量：500 μl）に、順に [1](Tf2N)（M.W. 604.59、実施例１合成品）475 μl、0.5 wt% FITC アルブミン水溶液（ALDRICH）50 μlを加えた。次に、FITC アルブミン水溶液は膜を通過しないように、イオン液体である [1](Tf2N) だけ膜を 8 回通過させた。その後、FITC アルブミン水溶液も膜を通過させ、プランジャーを 41 回交互に押し込み、エクストル―ジョンを行った。得られたエマルションを丸底容器に入れ、1,000 rpmで攪拌しながら 25 % グルタルアルデド溶液（M.W. 100.12、キシダ化学）10 μl を加え、30 ℃で 30 分間攪拌した。これを 0.01 M 2-アミノエタノール水溶液（M.W. 61.08、キシダ化学）11 ml（グルタルアルデヒドの 4 等量）に撹拌しながら少しずつ滴下していき、イオン液体を完全に水に溶解させた（CLSM 観察）。これをガラスの遠心管に移し、遠心分離（約 5 秒）をしたのち、上積み液を除去した。これに超純水を加えて、手ではじいて分散させたのち、遠心分離（約 5 秒）を行い、上積み液を除去して洗浄した。
この操作を下線部分の膜の孔径が変わるように、下表に従って同様に行ったのち、SEM 観察を行った。また SEM 写真から粒径分布を求めた。
(Experimental operation)
Into the liposome syringe (AVESTIN, membrane filter: pore size 1,000 nm, manufactured by Polymer) on one side Hamilton syringe (capacity: 500 μl), in order [1] (Tf 2 N) (MW 604.59, Example 1 synthetic product) 475 μl 50 μl of 0.5 wt% FITC albumin aqueous solution (ALDRICH) was added. Next, in order to prevent the FITC albumin aqueous solution from passing through the membrane, the membrane was passed 8 times by [1] (Tf 2 N), which is an ionic liquid. Thereafter, the FITC albumin aqueous solution was also passed through the membrane, and the plungers were alternately pushed 41 times to perform extrusion. The obtained emulsion was put in a round bottom container, and 10 μl of 25% glutaralded solution (MW 100.12, Kishida Chemical) was added while stirring at 1,000 rpm, and stirred at 30 ° C. for 30 minutes. This was added dropwise with stirring to 11 ml of 0.01 M 2-aminoethanol aqueous solution (MW 61.08, Kishida Chemical) (4 equivalents of glutaraldehyde) to completely dissolve the ionic liquid in water (CLSM observation) ). This was transferred to a glass centrifuge tube, centrifuged (about 5 seconds), and then the supernatant was removed. After adding ultrapure water to this and dispersing by hand, it was centrifuged (about 5 seconds), and the upper liquid stack was removed and washed.
This operation was carried out in the same manner according to the following table so that the pore diameter of the underlined membrane was changed, and then SEM observation was performed. The particle size distribution was obtained from SEM photographs.
（結果および考察）
膜の孔径を 1,000 nm から 400 nm に小さくしたが、得られたタンパク質ナノカプセルの大きさはあまり変わらなかった。また、孔径が 400 nm では粒径分布が広くなっている。これらはプランジャーを押し込む速度などの実験操作による可能性がある。一方、孔径 100 nm の場合は膜が破れてしまい、きれいなナノカプセルを作製することができなかった。孔径が小さくなることでイオン液体やタンパク質カプセルが通過しにくくなり、膜にかかる圧力が大きくなったためと考えられる。この問題を解決するには、イオン液体中の含水量を増やし、流動性を上げる必要がある。今回は室温で実験を行ったが、より高い温度でも行えれば膜を通過しやすくなると思われる。
(Results and Discussion)
Although the pore size of the membrane was reduced from 1,000 nm to 400 nm, the size of the obtained protein nanocapsules did not change much. In addition, the particle size distribution is wide when the pore size is 400 nm. These may be due to experimental manipulations such as the speed at which the plunger is pushed. On the other hand, when the pore diameter was 100 nm, the membrane was broken, and it was impossible to produce clean nanocapsules. This is probably because the ionic liquid and protein capsules are less likely to pass due to the smaller pore size, and the pressure applied to the membrane is increased. In order to solve this problem, it is necessary to increase the water content in the ionic liquid and increase the fluidity. This time, the experiment was conducted at room temperature, but if it can be performed at a higher temperature, it will be easier to pass through the membrane.
〔評価１：タンパク質ナノカプセルへのデキストランの内包〕
実施例２のタンパク質ナノカプセルの作製では、エクストルージョン法によりタンパク質ナノカプセルが得られることがわかった。そのため、そのカプセルに物質を内包できるかどうか実験を行った。イオン液体 / 水界面を用いて、タンパク質が界面に集合することでカプセルを形成するので、内包したい物質をタンパク質水溶液の中に溶かしておくことで容易に内包できる可能性がある。
[Evaluation 1: Encapsulation of dextran in protein nanocapsules]
In the production of the protein nanocapsules of Example 2, it was found that protein nanocapsules were obtained by the extrusion method. Therefore, an experiment was conducted to determine whether or not the capsule could contain a substance. Since the ionic liquid / water interface is used to form a capsule by gathering proteins at the interface, it may be easily included by dissolving the substance to be included in the protein aqueous solution.
（実験操作）
リポソーム調整器（AVESTIN、メンブレンフィルター：孔径 1 μm, polycarbonate 製）の片側のハミルトンシリンジ（容量：500 μl）に、順に [1](Tf2N)（M.W. 604.59、実施例１合成品）475 μl、0.5 wt% 牛血清アルブミン（ALDRICH）と 0.05 wt % フルオレセイン修飾デキストラン（M.W. 40,000、ALDRICH）からなる水溶液50 μlを加えた。次に、イオン液体である [1](Tf2N) だけ膜を 8 回通過させた。その後、牛血清アルブミンとフルオレセイン修飾デキストランからなる水溶液も膜を通過させ、プランジャーを 41 回交互に押し込み、膜乳化を行った。得られたエマルションを丸底容器に入れ、1,000 rpmで攪拌しながら 25 % グルタルアルデド溶液（M.W. 100.12、キシダ化学）10 μl を加え、30 ℃で 30 分間攪拌した。これを 0.01 M 2-アミノエタノール水溶液（M.W. 61.08、キシダ化学）11 ml（グルタルアルデヒドの 4 等量）に撹拌しながら少しずつ滴下していき、イオン液体を完全に水に溶解させたのち CLSM 観察を行った。
(Experimental operation)
To one side of the liposome preparation device (AVESTIN, membrane filter: pore size 1 μm, manufactured by PET) Hamilton syringe (capacity: 500 μl), in order [1] (Tf 2 N) (MW 604.59, Example 1 synthetic product) 475 μl 50 μl of an aqueous solution consisting of 0.5 wt% bovine serum albumin (ALDRICH) and 0.05 wt% fluorescein modified dextran (MW 40,000, ALDRICH) was added. Next, the membrane was passed 8 times by [1] (Tf 2 N), which is an ionic liquid. Thereafter, an aqueous solution consisting of bovine serum albumin and fluorescein-modified dextran was also passed through the membrane, and the plunger was pushed alternately 41 times to perform membrane emulsification. The obtained emulsion was put in a round bottom container, and 10 μl of 25% glutaralded solution (MW 100.12, Kishida Chemical) was added while stirring at 1,000 rpm, and stirred at 30 ° C. for 30 minutes. This was added dropwise with stirring to 11 ml of 0.01 M 2-aminoethanol aqueous solution (MW 61.08, Kishida Chemical) (4 equivalents of glutaraldehyde), and the ionic liquid was completely dissolved in water, followed by CLSM observation Went.
（結果および考察）
上のCLSM像中、(1)は数百 nm のサイズであり、フルオレセイン修飾デキストラン（M.W. 40,000）を内包した牛血清アルブミンカプセルと思われる。また、(1)ではフルオレセインに由来する発光が観察されるのに対し、(2)の水相では発光が見られない。もしデキストランが内包されていないのであれば、すべての点においてフルオレセイン由来の発光が確認されると思われる。したがって、カプセル内にデキストランが内包されていることを示している。
(Results and Discussion)
In the above CLSM image, (1) is a size of several hundred nm, and it seems to be a bovine serum albumin capsule containing fluorescein-modified dextran (MW 40,000). In addition, luminescence derived from fluorescein is observed in (1), whereas no luminescence is observed in the aqueous phase of (2). If dextran is not encapsulated, luminescence from fluorescein will be confirmed at all points. Therefore, it is shown that dextran is encapsulated in the capsule.
〔参考例１：水と混和するイオン液体（emimBF4）によるタンパク質カプセル製造（１）〜エクストルージョン法による〜〕
水と混和するイオン液体（emimBF4（M.W. 197.97、関東化学））を用いて、タンパク質カプセル製造を試みた。
[Reference Example 1: Production of protein capsules with ionic liquid (emimBF4) miscible with water (1)-by the extrusion method-]
An attempt was made to produce protein capsules using an ionic liquid (emimBF 4 (MW 197.97, Kanto Chemical)) that is miscible with water.
（実験操作）
リポソーム調整器（AVESTIN, メンブレンフィルター：孔径 400 nm polycarbonate 製）の片側のハミルトンシリンジ（容量：500μl）に、順に emimBF4（M.W. 197.97、関東化学）475 μl、0.5 wt% FITC アルブミン水溶液 50 μl を加えた。次に、FITC アルブミン水溶液は膜を通過しないように、イオン液体である emimBF4だけ膜を 8 回通過させた。この時点で、タンパク質が変性し、凝集し始めてるのを確認した。その後、FITC アルブミン水溶液も膜を通過させ、プランジャーを 41 回交互に押し込み、エクストルージョンを行った。
(Experimental operation)
Add 475 μl of emimBF 4 (MW 197.97, Kanto Chemical) and 50 μl of 0.5 wt% FITC albumin aqueous solution to the Hamilton syringe (capacity: 500 μl) on one side of the liposome preparation device (AVESTIN, membrane filter: 400 nm pore size). It was. Next, the ionic liquid emimBF 4 was passed through the membrane 8 times so that the FITC albumin aqueous solution did not pass through the membrane. At this point, it was confirmed that the protein was denatured and started to aggregate. Thereafter, the FITC albumin aqueous solution was also passed through the membrane, and the plungers were alternately pushed 41 times to perform extrusion.
（結果および考察）
emimBF4 を用いると膜にはタンパク質が多く残った。これはemimBF4 が水と混和することにより、タンパク質の大きな凝集体ができたためと思われる。一方、[1]Tf2N を用いた場合は、膜にはほとんどタンパク質は残っておらず、カプセルとして通過したことがわかる。
(Results and Discussion)
When emimBF 4 was used, many proteins remained in the membrane. This is probably because emimBF 4 was mixed with water to form large protein aggregates. On the other hand, when [1] Tf 2 N was used, almost no protein remained in the membrane, indicating that it passed as a capsule.
〔参考例２：水と混和するイオン液体（emimBF4）によるタンパク質カプセル製造（２）〜撹拌法による〜〕
（実験操作）
USI 恒温槽付き撹拌装置（Max：1,000 rpm）にガラス製の丸底容器をはめこみ、温度を 30 ℃に設定した。30 ℃になったのち、[1](Tf2N)（M.W. 634.65、実施例１合成品）1.9 ml（含水率：0.80 wt % H2O）を加え、ゆっくりと撹拌しながら15 分間静置した。その後、1.0 wt % フルオレセイン修飾アルブミン水溶液（FITC アルブミン）（ALDRICH）0.1 ml を滴下し、20 分間撹拌（1,000 rpm）した。次に、25 % グルタルアルデヒド溶液（M.W. 100.12、キシダ化学）40 μl を加え、30 分間撹拌し続けた。この溶液をガラスの遠心管に加え、遠心分離（10 分）を行ったのち、上積みのイオン液体部分を取り除いた。これに、0.1 M 2-アミノエタノール水溶液（M.W. 61.08、キシダ化学）を加え、指で軽くはじき水相側にタンパク質カプセルを抽出した。抽出したタンパク質カプセルを含む水溶液を遠心分離（約 5 秒）したのち、上積み液を除去した。これに超純水を加えて、指ではじいて分散させたのち、遠心分離（約 5 秒）を行い、上積み液を除去した。これを 3 回繰り返し、タンパク質カプセルを洗浄した。その後、SEM および CLSM 観察を行った。
[Reference Example 2: Production of protein capsules with ionic liquid (emimBF 4 ) miscible with water (2) -by stirring method]
(Experimental operation)
A glass round bottom container was fitted in a stirrer with a USI constant temperature bath (Max: 1,000 rpm), and the temperature was set to 30 ° C. After reaching 30 ° C, add 1.9 ml of [1] (Tf 2 N) (MW 634.65, synthetic product of Example 1) (moisture content: 0.80 wt% H 2 O) and let stand for 15 minutes with slow stirring. did. Thereafter, 0.1 ml of 1.0 wt% fluorescein-modified albumin aqueous solution (FITC albumin) (ALDRICH) was added dropwise and stirred (1,000 rpm) for 20 minutes. Next, 40 μl of 25% glutaraldehyde solution (MW 100.12, Kishida Chemical) was added and stirring was continued for 30 minutes. This solution was added to a glass centrifuge tube, centrifuged (10 minutes), and then the ionic liquid portion on top was removed. To this, 0.1 M 2-aminoethanol aqueous solution (MW 61.08, Kishida Chemical) was added, and the protein capsule was extracted to the aqueous phase side by lightly repelling with a finger. After centrifuging the aqueous solution containing the extracted protein capsules (about 5 seconds), the supernatant was removed. Ultrapure water was added to this and dispersed by fingering, followed by centrifugation (about 5 seconds) to remove the upper layer liquid. This was repeated 3 times to wash the protein capsule. Thereafter, SEM and CLSM observations were performed.
（結果および考察）
emimBF4 をイオン液体として用いると凝集体ができ、タンパク質カプセルは得られなかった。これは emimBF4 が水と混和するため、カプセル形成の鋳型となるエマルションが出来ないためだと思われる。これにより、[1]Tf2N がタンパク質ナノカプセル製造に適していることが示された。なお、
(Results and Discussion)
When emimBF 4 was used as an ionic liquid, aggregates were formed and protein capsules were not obtained. This seems to be because emimBF 4 is miscible with water, making an emulsion that cannot be used as a mold for capsule formation. This indicates that [1] Tf 2 N is suitable for protein nanocapsule production. In addition,
〔実施例３：タンパク質ナノカプセルの製造（３）〜膜の通過回数の影響についての検討〜〕
今までエクストル―ジョン法では、膜を 41 回通過させてタンパク質ナノカプセル作製を行ってきた。しかしながら、この回数が適切かわからないので、通過回数を変えて CLSM 観察を行った。
（実験操作）
リポソーム調整器（AVESTIN, メンブレンフィルター：孔径 400 nm, polycarbonate 製）の片側のハミルトンシリンジ（容量：500 μl）に、順に[1](Tf2N)（M.W. 604.59、実施例1合成品）475 μl、0.5 wt% タンパク質水溶液（ALDRICH）50 μlを加えた。次に、タンパク質水溶液は膜を通過しないように、イオン液体である [1](Tf2N) だけ膜を 8 回通過させた。その後、タンパク質水溶液も膜を通過させ、プランジャーを 41 回交互に押し込み、エクストル―ジョンを行った。その際、1, 11, 21, 31, 41 回において CLSM 観察を行った。
[Example 3: Production of protein nanocapsule (3)-Examination of influence of number of times of passage through membrane-]
Until now, in the extrusion method, protein nanocapsules have been produced by passing the membrane 41 times. However, since we do not know whether this number is appropriate, we performed CLSM observation by changing the number of passages.
(Experimental operation)
Into the Hamilton syringe (capacity: 500 μl) on one side of the liposome preparation device (AVESTIN, membrane filter: pore size 400 nm, manufactured by PET), sequentially [1] (Tf 2 N) (MW 604.59, Example 1 synthetic product) 475 μl 50 μl of 0.5 wt% protein aqueous solution (ALDRICH) was added. Next, protein aqueous solution is not to pass through the membrane was passed through an ionic liquid [1] (Tf 2 N) film only eight times. Thereafter, the protein aqueous solution was also allowed to pass through the membrane, and the plungers were alternately pushed 41 times to perform extrusion. At that time, CLSM observation was performed at 1, 11, 21, 31, and 41 times.
（結果および考察）
膜の通過回数 1 回では、タンパク質水溶液が集まっており、ナノカプセルができなかった。11 回、21 回では小さなものが増えてきたが、まだ大きなものも見られた。31 回、41 回まで行うと、小さなタンパク質カプセルが形成していることがわかった。このことから、何度も膜を通過するうちに、水滴が小さくなり、その界面でナノカプセルが形成していると考えられる。
(Results and Discussion)
When the membrane was passed once, the protein aqueous solution was collected and nanocapsules could not be formed. Small things increased at 11th and 21st, but there were still big ones. After 31 and 41 times, it was found that small protein capsules were formed. From this, it is considered that the water droplets become smaller and the nanocapsules are formed at the interface while passing through the membrane many times.
〔実施例４：タンパク質ナノカプセルの製造（３）〜水中での分散性の向上〜〕
これまで、エクストル―ジョン後の SEM 観察により、ナノカプセルの形成を確認してきた。しかし、ナノカプセルが凝集している可能性が示唆された。そこで、水中にタンパク質カプセルを抽出する際のエタノールアミンの濃度を上げ、分散性の向上を目指すとともに、ナノカプセルの粒度分布をDLSで測定した。
（実験操作）
リポソーム調整器（AVESTIN, メンブレンフィルター：孔径 1,000 nm, polycarbonate 製）の片側のハミルトンシリンジ（容量：500 μl）に、順に[1](Tf2N)（M.W. 604.59、筆者合成品）475 μl、0.5 wt% FITC アルブミン水溶液（ALDRICH）50 μlを加えた。次に、FITC アルブミン水溶液は膜を通過しないように、イオン液体である [1](Tf2N) だけ膜を 8 回通過させた。その後、FITC アルブミン水溶液も膜を通過させ、プランジャーを 41 回交互に押し込み、エクストル―ジョンを行った。得られたエマルションを丸底容器に入れ、1,000 rpmで攪拌しながら 25 % グルタルアルデド溶液（M.W. 100.12、キシダ化学）10 μl を加え、30 ℃で 30 分間攪拌した。これを 0.1 M 2-アミノエタノール水溶液（M.W. 61.08、キシダ化学）11 ml に撹拌しながら少しずつ滴下していき、イオン液体を完全に水に溶解させた。その後、DLS 測定（透析前）を行った。また、残りの水溶液のうち 500 μl を透析し、不要物を除去したのち再度 DLS 測定を行った。透析は pH により、エタノールアミンが除去できたかどうかで追跡した。
Until now, the formation of nanocapsules has been confirmed by SEM observation after extrusion. However, it was suggested that the nanocapsules may be aggregated. Therefore, the concentration of ethanolamine when extracting protein capsules in water was increased to improve dispersibility, and the particle size distribution of nanocapsules was measured by DLS.
(Experimental operation)
Into the Hamilton syringe (capacity: 500 μl) on one side of the liposome preparation device (AVESTIN, membrane filter: pore size 1,000 nm, manufactured by polyurethane), [1] (Tf 2 N) (MW 604.59, author's synthetic product) 475 μl, 0.5 50 μl of wt% FITC albumin aqueous solution (ALDRICH) was added. Next, in order to prevent the FITC albumin aqueous solution from passing through the membrane, the membrane was passed 8 times by [1] (Tf 2 N), which is an ionic liquid. Thereafter, the FITC albumin aqueous solution was also passed through the membrane, and the plungers were alternately pushed 41 times to perform extrusion. The obtained emulsion was put in a round bottom container, and 10 μl of 25% glutaralded solution (MW 100.12, Kishida Chemical) was added while stirring at 1,000 rpm, and stirred at 30 ° C. for 30 minutes. The solution was gradually added dropwise to 11 ml of 0.1 M 2-aminoethanol aqueous solution (MW 61.08, Kishida Kagaku) with stirring to completely dissolve the ionic liquid in water. Thereafter, DLS measurement (before dialysis) was performed. In addition, 500 μl of the remaining aqueous solution was dialyzed to remove unnecessary substances, and then DLS measurement was performed again. Dialysis was followed by pH based on whether ethanolamine could be removed.
（結果および考察）
透析前の DLS 測定では、粒径が数百 nm のカプセルが確認できた。したがって、カプセルは凝集しておらず、分散していると考えられた。また、透析後の DLS 測定でも同様にナノカプセルを確認できた。したがって、純水中でも、カプセルは分散していると考えられる。
(Results and Discussion)
In DLS measurement before dialysis, capsules with a particle size of several hundred nm were confirmed. Therefore, it was considered that the capsules were not aggregated and dispersed. The nanocapsules were also confirmed by DLS measurement after dialysis. Therefore, it is considered that the capsules are dispersed even in pure water.
〔合成例１：イオン液体の原料化合物tetrakis(2-(2-methoyethoxy)ethyl)ammmoniumの合成〕
1-1. Dietylene Glycol Monomethyl Ether のトシル化1-1. Tosylation of Dietylene Glycol Monomethyl Ether
Dietylene Glycol Monomethyl Ether （東京化成, Mw.120.15）を減圧蒸留した。このDietylene Glycol Monomethyl Ether 20.0ｇ(1.66×10-1mol) をピリジン40ｍLに溶解させた後、攪拌しながら0℃まで冷却した。これに、tosyl chloride（キシダ, Mw=190.65）63.0g（3.3×10-1mol）のピリジン溶液75mL を45分間で滴下した。30分間室温で放置した後、100ｍLのミリQ水で希薄した。これにジエチルエーテルを加えエーテル抽出した後、エーテル相を5％HCl 50mL で洗浄した。分液し、エーテル層を硫酸ナトリウムで乾燥させた。濾過した後、ジエチルエーテルを減圧留去すると薄黄色の液体を得た。 Dietylene Glycol Monomethyl Ether (Tokyo Kasei, Mw. 120.15) was distilled under reduced pressure. After 20.0 g (1.66 × 10 −1 mol) of this Dietylene Glycol Monomethyl Ether was dissolved in 40 mL of pyridine, it was cooled to 0 ° C. with stirring. To this, 75 mL of a pyridine solution of 63.0 g (3.3 × 10 −1 mol) of tosyl chloride (Kishida, Mw = 190.65) was added dropwise over 45 minutes. After standing at room temperature for 30 minutes, it was diluted with 100 mL of milli-Q water. Diethyl ether was added thereto for extraction with ether, and the ether phase was washed with 50 mL of 5% HCl. Liquid separation was performed, and the ether layer was dried over sodium sulfate. After filtration, diethyl ether was distilled off under reduced pressure to obtain a pale yellow liquid.
展開溶媒にヘキサン/酢酸エチル（ v/v, 1：1 ）を用いてTLCを行うと、Tosyl Dietylene Glycol Monomethyl Ether (RF=0.5) , ピリジン (RF=0.4), 原料 (RF=0), の３スポット現れたため、カラムクロマトグラフィーで分離した。分離後再びTLCを行うとピリジンのピークも見えたため、凍結乾燥を行うと、Tosyl Dietylene Glycol Monomethyl Ether (RF=0.5)の1スポットとなった。 When TLC was performed using hexane / ethyl acetate (v / v, 1: 1) as the developing solvent, Tosyl Dietylene Glycol Monomethyl Ether (R F = 0.5), pyridine (R F = 0.4), raw material (R F = 0 ), 3 spots appeared, and were separated by column chromatography. When TLC was performed again after separation, a peak of pyridine was also visible, so when lyophilized, it became one spot of Tosyl Dietylene Glycol Monomethyl Ether (R F = 0.5).
1-2. Tosyl Dietylene Glycol Monomethyl Ether と trisMEEA の反応1-2. Reaction of Tosyl Dietylene Glycol Monomethyl Ether and trisMEEA
trisMEEA（ALDRICH, Mw=323.43）5.0g (15.4mmol) と1-1で合成したTosyl Dietylene Glycol Monomethyl Ether 8.49g (30.9mmol) を混合した後、5mL トルエンを加え加熱還流（100℃）した。五時間後、水を加え抽出し凍結乾燥を行うと黄色の粘性のある液体が得られた。tetrakisMEEAは陽イオンであるため、弱酸性のH+型の陽イオン交換樹脂に吸着させた後、塩酸を流すことにより、黄色の液体として生成された。
〔合成例２：イオン液体の原料化合物bisMEEAの製造〕 [Synthesis Example 2: Production of ionic liquid raw material compound bisMEEA]
2-1. 2-methoxyethanol のトシル化2-1. Tosylation of 2-methoxyethanol
2-methoxyethanol（キシダ, Fw=76.10）を減圧蒸留した。2-methoxyethanol 12.63g (1.66×10-1mmol) をピリジン40ｍLに溶解させた後、攪拌しながら0℃まで冷却した。これに、tosyl chloride（キシダ, Mw=190.65）62.9g（3.3×10-1mol）のピリジン溶液75mL を55分間で滴下した。1時間室温で放置した後、100ｍLのミリQ水で希薄した。これにジエチルエーテルを加えエーテル抽出した後、エーテル相を5％HCl 50mL で洗浄した。分液し、エーテル層を硫酸ナトリウムで乾燥させた。濾過した後、ジエチルエーテルを減圧留去すると薄黄色の液体を得た。収量：6.69g (29.1mmol)。収率：17.5%。 2-methoxyethanol (Kishida, Fw = 76.10) was distilled under reduced pressure. 12.63 g (1.66 × 10 −1 mmol) of 2-methoxyethanol was dissolved in 40 mL of pyridine, and then cooled to 0 ° C. with stirring. To this, 75 mL of a pyridine solution of 62.9 g (3.3 × 10 −1 mol) of tosyl chloride (Kishida, Mw = 190.65) was added dropwise over 55 minutes. After standing at room temperature for 1 hour, it was diluted with 100 mL of milli-Q water. Diethyl ether was added thereto for extraction with ether, and the ether phase was washed with 50 mL of 5% HCl. Liquid separation was performed, and the ether layer was dried over sodium sulfate. After filtration, diethyl ether was distilled off under reduced pressure to obtain a pale yellow liquid. Yield: 6.69 g (29.1 mmol). Yield: 17.5%.
2-2. N- trityldiethanolamine の合成2-2. Synthesis of N-trityldiethanolamine
diethanolamine（Fw.105.14, キシダ）を減圧蒸留した。200ml 三角フラスコに蒸留した diethanolamine 8.34g (79.3mmol) のDMF溶液 34ml を加えて0℃まで冷却した後、tritylchloride（Mw.278.78, キシダ）9.97g (35.8mmol) のジクロロメタン溶液 21ml を13分間滴下した。0℃で36時間放置後、ジエチルエーテル 19ml と水 25 ml 加えると2層に分離した。沈殿が生じる予定だったが生じなかったため、下層の有機層を分液漏斗を用いて分取し1時間減圧留去した。溶媒がすべて除去されなかったため、残った溶液にジエチルエーテルを加えエーテル抽出すると、白い沈殿物を得られた。16時間フリーザーで放置した後、吸引濾過し水/アセトン (1/2) で再結晶を行った。白色の固体が得られた。
収量：5.31 g (15.2mmol)。収率：42.6％。
Diethanolamine (Fw.105.14, Kishida) was distilled under reduced pressure. Distilled diethanolamine 8.34 g (79.3 mmol) in 34 ml of DMF solution was added to a 200 ml Erlenmeyer flask and cooled to 0 ° C. Then, 21 ml of 9.97 g (35.8 mmol) of tritylchloride (Mw.278.78, Kishida) in dichloromethane was added dropwise for 13 minutes. . After standing at 0 ° C. for 36 hours, 19 ml of diethyl ether and 25 ml of water were added to separate into two layers. Precipitation was scheduled to occur but did not occur, so the lower organic layer was separated using a separatory funnel and evaporated under reduced pressure for 1 hour. Since all the solvent was not removed, diethyl ether was added to the remaining solution and extracted with ether to obtain a white precipitate. After standing in a freezer for 16 hours, the solution was suction filtered and recrystallized with water / acetone (1/2). A white solid was obtained.
Yield: 5.31 g (15.2 mmol). Yield: 42.6%.
展開溶媒ヘキサン/AcOEt , 50/50のTCLで、RF=0.18にスポットが見られた。
2-3. N,N-bis(bisethyleneglycolmonomethyleter)tritylamine の合成2-3. Synthesis of N, N-bis (bisethyleneglycolmonomethyleter) tritylamine
50％ NaOH 水溶液 24mL と触媒として用いる Tetrabutylammonium Hydrogen Sulfate （東京化成, Mw=339.53）の入った丸底フラスコに N-trityldiethanolamine 4.02g と2-1で合成した2-Methoxyethyl p-Toluenesulfonate 6.62g のTHF溶液40ｍLを加えた。これを18時間加熱還流（70℃）した後、80ｍL のミリQ水 80ｍLで希釈した。ここにジエチルエーテルを加えてエーテル抽出を行い、エーテル層をNa2SO4 で乾燥した。そして、濾過を行い、ジエチルエーテルを減圧留去した。その後，シリカゲルカラムクロマトグラフィー（展開溶媒；酢酸エチル：ヘキサン=2：1）にて, Rf値 = 0.4の成分を単離した． A THF solution of 2-Methoxyethyl p-Toluenesulfonate 6.62g synthesized with N-trityldiethanolamine 4.02g and 2-1 in a round bottom flask containing 24mL of 50% NaOH aqueous solution and Tetrabutylammonium Hydrogen Sulfate (Tokyo Kasei, Mw = 339.53) used as a catalyst 40 mL was added. This was heated to reflux (70 ° C.) for 18 hours and then diluted with 80 mL of 80 mL of milliQ water. Diethyl ether was added thereto for extraction with ether, and the ether layer was dried over Na 2 SO 4 . And it filtered and diethyl ether was depressurizingly distilled. Then, the component with Rf value = 0.4 was isolated by silica gel column chromatography (developing solvent; ethyl acetate: hexane = 2: 1).
2-4. polyethoxylamineの脱トリチル化2-4. Detritylation of polyethoxylamine
5％HClが入っている滴下漏斗付の丸底フラスコに220mgのN,N-bis(bisethyleneglycol‐monomethyleter)tritylamineを溶かしたメタノール溶液1.41mlを室温で滴下した。15分間室温で放置し沈殿したtritylcarbinolをろ過した。次に残量が初めの水層の量とほぼ等しくなるまで減圧留去した後、1.06mlのジエチルエーテルでエーテル抽出した。溶液を飽和重炭酸ナトリウムで塩基性化し、水を減圧留去した。ジクロロメタンを加え15分攪拌し残った固体をろ過した。有機相をNa2SO4で乾燥し、減圧留去した。 To a round bottom flask equipped with a dropping funnel containing 5% HCl, 1.41 ml of a methanol solution in which 220 mg of N, N-bis (bisethyleneglycol-monomethyleter) tritylamine was dissolved was dropped at room temperature. The tritylcarbinol that had been allowed to stand at room temperature for 15 minutes was filtered off. Next, after distilling off under reduced pressure until the remaining amount was almost equal to the amount of the first aqueous layer, ether extraction was performed with 1.06 ml of diethyl ether. The solution was basified with saturated sodium bicarbonate and water was removed in vacuo. Dichloromethane was added and stirred for 15 minutes, and the remaining solid was filtered. The organic phase was dried over Na 2 SO 4 and evaporated under reduced pressure.
Claims (13)
R1〜R4は、少なくとも1つはR5-O-(R6)n-R7-であり、他はHであり；
このとき、R5は、炭素数1〜8の直鎖または分岐のアルキル基、フェニル基またはベンジル基であり、
R6は、CH2CH2Oまたは
nは、1〜3の整数であり、
R7は、炭素数1〜6の直鎖または分岐鎖のアルキレン基であり；
X-は、臭化物イオン、炭素数1〜3のアルキルスルホン酸イオン、テトラフルオロホウ酸イオン、ヘキサフルオロリン酸イオン、炭素数1〜3のフルオロアルキルスルホン酸イオン、フルオロもしくはパーフルオロアルキルスルホニルアミドイオン、および炭素数1〜3のアルキル硫酸イオンから選ばれるいずれかのアニオンを示す。）で表される、イオン液体、及び水を含む、ナノカプセルの製造のための分散系おいて分散媒として使用するための、組成物。 Formula (I) below
R 1 to R 4 are at least one R 5 —O— (R 6 ) n —R 7 — and the other is H;
At this time, R 5 is a linear or branched alkyl group having 1 to 8 carbon atoms, a phenyl group or a benzyl group,
R 6 is CH 2 CH 2 O or
n is an integer from 1 to 3,
R 7 is a straight-chain or branched-chain alkylene group having 1 to 6 carbon atoms;
X − represents bromide ion, alkyl sulfonate ion having 1 to 3 carbon atoms, tetrafluoroborate ion, hexafluorophosphate ion, fluoroalkyl sulfonate ion having 1 to 3 carbon atoms, fluoro or perfluoroalkylsulfonylamide ion And any anion selected from alkyl sulfate ions having 1 to 3 carbon atoms. The composition for using as a dispersion medium in the dispersion system for manufacture of a nanocapsule containing the ionic liquid and water represented by this.
R5が、メチル、エチル、ブチル、イソブチル、プロピル、イソプロピル、ヘキシル、2エチルヘキシル、アリル、フェニル、またはベンジルであり、
R6が、請求項1に定義した通りであり、
nが、1〜3の整数であり、
R7が、メチレン、エチレン、ブチレンであるものである、請求項３に記載の組成物。 The ionic liquid is R 1 to R 4 , at least two of which are R 5 —O— (R 6 ) n —R 7 —, and the other is H;
R 5 is methyl, ethyl, butyl, isobutyl, propyl, isopropyl, hexyl, 2-ethylhexyl, allyl, phenyl, or benzyl
R 6 is as defined in claim 1;
n is an integer from 1 to 3,
R 7 is what is methylcarbamoyl Ren, ethylene Ren, butyl Len The composition of claim 3.
R5が、メチルであり、
R6が、CH2CH2Oであり、
nが、1〜3の整数であり、
R7が、エチレンであり、
X-が、(CF3SO2)2N-であるものである、請求項４に記載の組成物。 Ionic liquid
R 5 is methyl;
R 6 is CH 2 CH 2 O,
n is an integer from 1 to 3,
R 7 is ethyl Ren,
Wherein X -, (CF 3 SO 2) 2 N - are those wherein A composition according to claim 4.
イオン液体を含む連続相に、カプセル壁材を含む水性液からなるナノサイズの液滴を分散して乳化物を得て、このとき連続相と分散相との界面に壁材が配され；
該壁材を架橋して液滴を鋳型とするナノサイズのカプセルを形成させ；
カプセルを含む連続相に水を加えて水性相とし；
水性相からカプセルを回収する
工程を含む、ナノカプセルの製造方法であって、イオン液体が、請求項１〜６のいずれか１項に定義されたイオン液体である、製造方法。 Using an ionic liquid, which is an ionic liquid, is compatible with water, can form an emulsion using a liquid phase containing the ionic liquid as a dispersion medium, and nano-sized droplets made of an aqueous liquid as a dispersoid,
Nano-sized droplets composed of an aqueous liquid containing a capsule wall material are dispersed in a continuous phase containing an ionic liquid to obtain an emulsion, and at this time, the wall material is arranged at the interface between the continuous phase and the dispersed phase;
Cross-linking the wall material to form nano-sized capsules using droplets as templates;
Adding water to the continuous phase containing the capsules to form an aqueous phase;
A method for producing nanocapsules comprising a step of recovering capsules from an aqueous phase , wherein the ionic liquid is an ionic liquid as defined in any one of claims 1-6 .
得られたナノカプセルを用いて医薬組成物を調製する
工程を含む、医薬組成物の製造方法。 Performing the production method according to claim 11 to obtain nanocapsules;
The manufacturing method of a pharmaceutical composition including the process of preparing a pharmaceutical composition using the obtained nanocapsule.
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