JP6076832B2

JP6076832B2 - Menthol derivative, and cooling sensation agent, TRPM8 activator, cooling sensation imparting method and TRPM8 activation method using the same

Info

Publication number: JP6076832B2
Application number: JP2013109587A
Authority: JP
Inventors: 智大白井; 堅太郎組橋
Original assignee: Kao Corp
Current assignee: Kao Corp
Priority date: 2013-05-24
Filing date: 2013-05-24
Publication date: 2017-02-08
Anticipated expiration: 2033-05-24
Also published as: JP2014227390A

Description

本発明は、メントール誘導体、並びにこれを用いた冷感剤、ＴＲＰＭ８活性化剤、冷感付与方法及びＴＲＰＭ８活性化方法に関する。 The present invention relates to a menthol derivative, and a cooling sensation agent, a TRPM8 activator, a cooling sensation imparting method, and a TRPM8 activation method using the same.

使用中や使用後における清涼感を付与することを目的として、化粧品、ヘアケア製品、トイレタリー製品、入浴剤、医薬品等の各種製品に、冷感物質がしばしば配合されており、斯様な冷感物質として、メントールが広く用いられている。
メントールによる冷感付与は、皮膚や粘膜組織中に存在する知覚神経終末にメントールが直接作用することにより生じると考えられており、この冷感付与に関するメカニズムの検討が進められてきた。 For the purpose of imparting a refreshing sensation during and after use, a cooling sensation substance is often blended in various products such as cosmetics, hair care products, toiletry products, bathing agents, and pharmaceuticals. As menthol, it is widely used.
It is thought that menthol imparts a cooling sensation by direct action of menthol on sensory nerve endings present in the skin and mucous membrane tissues, and studies have been conducted on mechanisms for imparting a sensation of cooling.

まず、ラットの感覚神経のうち、弱い冷却刺激に応答して内向きのイオン電流を生じるニューロンが、メントールに対しても同様の応答性を示すことが発見された（非特許文献１）。この発見により、メントールの刺激による冷感が内向きのカルシウム電流により引き起こされるものであることが明らかとなった。 First, it was discovered that among sensory neurons in rats, neurons that generate inward ionic currents in response to weak cooling stimuli exhibit similar responsiveness to menthol (Non-Patent Document 1). This finding revealed that the sensation of cooling by menthol was caused by an inward calcium current.

そして、メントール及び冷刺激に応答性を示す受容体として、三叉神経ニューロンからＣＭＲ−１（ｃｏｌｄａｎｄｍｅｎｔｈｏｌｓｅｎｓｉｔｉｖｅｒｅｃｅｐｔｏｒ）が同定された（非特許文献２）。この受容体はＴＲＰＭ８と呼ばれており（非特許文献３）、ＴＲＰイオンチャネルファミリーに属する興奮性のイオンチャネルであるこの受容体が、前述のカルシウム電流を引き起こすと考えられる。 As a receptor responsive to menthol and cold stimulation, CMR-1 (cold and menthol sensitive receptor) was identified from trigeminal neurons (Non-patent Document 2). This receptor is called TRPM8 (Non-Patent Document 3), and this receptor, which is an excitable ion channel belonging to the TRP ion channel family, is considered to cause the aforementioned calcium current.

これらの報告によって、感覚神経に存在するＴＲＰＭ８にメントールが結合して内向き電流が発生することにより、メントールによる冷感が生じることが明らかとなっている。 From these reports, it is clear that menthol is bound to TRPM8 present in the sensory nerve and an inward current is generated, thereby causing a cooling sensation due to menthol.

ＲＥＩＤ，Ｇ．＆ＦＬＯＮＴＡ，Ｍ．Ｌ．（２００２），Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｌｅｔｔ．，３２４，ｐ１６４−１６８REID, G. & FLONTA, M.M. L. (2002), Neurosci. Lett. , 324, p164-168 ＭＣＫＥＭＹ，Ｄ．Ｄ．，ＮＥＵＨＡＵＳＳＥＲ，Ｗ．Ｍ．＆ＪＵＬＩＵＳ，Ｄ．（２００２），Ｎａｔｕｒｅ，４１６，ｐ５２−５６MCKEMY, D.M. D. , NEUHAUSSER, W.M. M.M. & JULUS, D. (2002), Nature, 416, p52-56. ＰＥＩＥＲ，Ａ．Ｍ．，ＭＯＱＲＩＣＨ，Ａ．，ＨＥＲＧＡＲＤＥＮ，Ａ．Ｃ．，ＲＥＥＶＥ，Ａ．Ｊ．，ＡＮＤＥＲＳＳＯＮ，Ｄ．Ａ．，ＳＴＯＲＹ，Ｇ．Ｍ．，ＥＡＲＬＥＹ，Ｔ．Ｊ．，ＤＲＡＧＯＮＩ，Ｉ．，ＭＣＩＮＴＹＲＥ，Ｐ．，ＢＥＶＡＮ，Ｓ．＆ＰＡＴＡＰＯＵＴＩＡＮ，Ａ．（２００２），Ｃｅｌｌ，１０８，ｐ７０５−７１５PEIER, A.M. M.M. , MOQRICH, A.M. , HERGARDEN, A. C. , REEVE, A. J. et al. , ANDERSSON, D.M. A. , STORY, G .; M.M. , EARLEY, T. J. et al. DRAGONI, I. , MCINTYRE, P.M. , BEVAN, S. & PATAPOUTIAN, A. (2002), Cell, 108, p705-715. ＢＥＨＲＥＮＤＴ，Ｈ．−Ｊ．，ＧＥＲＭＡＮＮ，Ｔ．，ＧＩＬＬＥＮ，Ｃ．，ＨＡＴＴ，Ｈ．＆ＪＯＳＴＯＣＫ，Ｒ．（２００４），Ｂｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，１４１，ｐ７３７−７４５BEHRENDT, H.C. -J. , GERMANN, T .; , GILLEN, C.I. , HATT, H. & JOSTOCK, R. (2004), Br. J. et al. Pharmacol. 141, p737-745

しかしながら、メントールは、多量に使用した場合に、皮膚や粘膜への刺激や特有の不快な刺激臭等が問題となるため、使用量が制限されることがある。
また、メントールの他に、リナロール、ゲラニオール、ヒドロキシシトロネラール等もＴＲＰＭ８を活性化することが知られているが（非特許文献４）、近年では強い清涼感やその持続性が要求される傾向があり、これらによるＴＲＰＭ８活性化作用では斯かる要求を充分には満足できない。 However, when menthol is used in a large amount, the amount of use may be limited because of irritation to the skin and mucous membranes and peculiar unpleasant irritating odor.
In addition to menthol, linalool, geraniol, hydroxycitronellal and the like are also known to activate TRPM8 (Non-Patent Document 4), but in recent years, a strong refreshing feeling and its sustainability tend to be required. Thus, the TRPM8 activation action by these cannot sufficiently satisfy such a requirement.

したがって、本発明は、強い冷感を付与することができる新規化合物、並びにこれを用いた冷感剤、ＴＲＰＭ８活性化剤、冷感付与方法及びＴＲＰＭ８活性化方法に関する。 Therefore, the present invention relates to a novel compound capable of imparting a strong cooling sensation, a cooling sensation agent, a TRPM8 activator, a cooling sensation imparting method, and a TRPM8 activation method using the same.

本発明者らは、８，４'−オキシネオリグナン類似構造を有する特定の新規メントール誘導体が、優れたＴＲＰＭ８活性化作用を有し強い冷感を付与できることを見出し、本発明を完成した。 The present inventors have found that a specific novel menthol derivative having an 8,4′-oxyneolignan-like structure has an excellent TRPM8 activation action and can impart a strong cooling sensation, thereby completing the present invention.

すなわち、本発明は、下記式（１） That is, the present invention provides the following formula (1):

〔式（１）中、Ｒ¹は、水素原子、ヒドロキシ基又は炭素数１〜３のアルコキシ基を示し、Ｒ²は、水素原子又はヒドロキシ基を示し、Ｒ³は、水素原子、炭素数１〜６のアルキル基、炭素数２〜６のアルケニル基又は炭素数１〜３のアルコキシ基を示し、Ｒ⁴は、水素原子又は炭素数１〜３のアルコキシ基を示す。〕
で表される化合物（以下、化合物（１）とも称する）を提供するものである。 [Equation (1), R ¹ represents a hydrogen atom, a hydroxy group or an alkoxy group having 1 to 3 carbon atoms, R ² represents a hydrogen atom or a hydroxy group, R ³ is a hydrogen atom, C 1 -C 6 alkyl group, an alkenyl group or an alkoxy group having 1 to 3 carbon atoms having 2 to 6 carbon atoms, R ⁴ represents a hydrogen atom or an alkoxy group having 1 to 3 carbon atoms. ]
(Hereinafter, also referred to as compound (1)).

また、本発明は、化合物（１）を有効成分とする冷感剤を提供するものである。
更に、本発明は、化合物（１）を有効成分とするＴＲＰＭ８活性化剤を提供するものである。
更に、本発明は、化合物（１）を用いる非治療的な冷感付与方法を提供するものである。
更に、本発明は、化合物（１）を用いる非治療的なＴＲＰＭ８活性化方法を提供するものである。 Moreover, this invention provides the cooling agent which uses a compound (1) as an active ingredient.
Furthermore, this invention provides the TRPM8 activator which uses a compound (1) as an active ingredient.
Furthermore, the present invention provides a non-therapeutic cooling sensation method using the compound (1).
Furthermore, the present invention provides a non-therapeutic method for activating TRPM8 using compound (1).

本発明の化合物は、優れたＴＲＰＭ８活性化作用を有し強い冷感を付与することができる。 The compound of the present invention has an excellent TRPM8 activation action and can impart a strong cooling sensation.

本発明の化合物は、下記式（１） The compound of the present invention has the following formula (1)

〔式（１）中、Ｒ¹は、水素原子、ヒドロキシ基又は炭素数１〜３のアルコキシ基を示し、Ｒ²は、水素原子又はヒドロキシ基を示し、Ｒ³は、水素原子、炭素数１〜６のアルキル基、炭素数２〜６のアルケニル基又は炭素数１〜３のアルコキシ基を示し、Ｒ⁴は、水素原子又は炭素数１〜３のアルコキシ基を示す。〕
で表されるものである。斯かる化合物は新規化合物である。
式（１）中、Ｒ¹は、水素原子、ヒドロキシ基又は炭素数１〜３のアルコキシ基を示すが、水素原子、炭素数１〜３のアルコキシ基が好ましく、より好ましくは水素原子である。上記アルコキシ基は直鎖状でも分枝状でもよく、メトキシ基、エトキシ基、ｎ−プロポキシ基、イソプロポキシ基が挙げられる。
Ｒ²は、水素原子又はヒドロキシ基を示すが、水素原子が好ましい。 [Equation (1), R ¹ represents a hydrogen atom, a hydroxy group or an alkoxy group having 1 to 3 carbon atoms, R ² represents a hydrogen atom or a hydroxy group, R ³ is a hydrogen atom, C 1 -C 6 alkyl group, an alkenyl group or an alkoxy group having 1 to 3 carbon atoms having 2 to 6 carbon atoms, R ⁴ represents a hydrogen atom or an alkoxy group having 1 to 3 carbon atoms. ]
It is represented by Such compounds are novel compounds.
In formula (1), R ¹ represents a hydrogen atom, a hydroxy group or an alkoxy group having 1 to 3 carbon atoms, preferably a hydrogen atom or an alkoxy group having 1 to 3 carbon atoms, more preferably a hydrogen atom. The alkoxy group may be linear or branched, and examples thereof include a methoxy group, an ethoxy group, an n-propoxy group, and an isopropoxy group.
R ² represents a hydrogen atom or a hydroxy group, preferably a hydrogen atom.

Ｒ³は、水素原子、炭素数１〜６のアルキル基、炭素数２〜６のアルケニル基又は炭素数１〜３のアルコキシ基を示すが、水素原子、炭素数２〜６のアルケニル基が好ましく、ＴＲＰＭ８活性化作用の観点から、炭素数２〜６のアルケニル基がより好ましい。
また、上記アルキル基の炭素数は、好ましくは１〜３である。一方、アルケニル基の炭素数は、好ましくは２〜４であり、より好ましくは２又は３であり、更に好ましくは３である。 R ³ represents a hydrogen atom, an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms, an alkenyl group having 2 to 6 carbon atoms or an alkoxy group having 1 to 3 carbon atoms, preferably a hydrogen atom or an alkenyl group having 2 to 6 carbon atoms. From the viewpoint of activating TRPM8, an alkenyl group having 2 to 6 carbon atoms is more preferable.
Moreover, carbon number of the said alkyl group becomes like this. Preferably it is 1-3. On the other hand, the carbon number of the alkenyl group is preferably 2 to 4, more preferably 2 or 3, and still more preferably 3.

また、上記Ｒ³で示されるアルキル基、アルケニル基、アルコキシ基は直鎖状でも分枝状でもよく、アルキル基としては例えば、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基、ｎ−ブチル基、イソブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基、ｓｅｃ−ブチル基、ｎ−ペンチル基、ネオペンチル基、ｎ−ヘキシル基等が挙げられる。
また、上記アルケニル基としては例えば、ビニル基、１−プロペニル基、２−プロペニル基、イソプロペニル基、１−ブテニル基、２−ブテニル基、３−メチル−１−ブテニル基、１−ペンテニル基、１−ヘキセニル基等が挙げられる。斯様なアルケニル基の中でも、ＴＲＰＭ８活性化作用の観点から、末端二重結合を有するアルケニル基が好ましい。
また、上記アルコキシ基としては例えば、Ｒ¹で示されるアルコキシ基として例示したものが挙げられる。 The alkyl group, alkenyl group and alkoxy group represented by R ³ may be linear or branched. Examples of the alkyl group include a methyl group, an ethyl group, an n-propyl group, an isopropyl group, and an n-butyl group. Group, isobutyl group, tert-butyl group, sec-butyl group, n-pentyl group, neopentyl group, n-hexyl group and the like.
Examples of the alkenyl group include a vinyl group, 1-propenyl group, 2-propenyl group, isopropenyl group, 1-butenyl group, 2-butenyl group, 3-methyl-1-butenyl group, 1-pentenyl group, 1-hexenyl group etc. are mentioned. Among such alkenyl groups, an alkenyl group having a terminal double bond is preferred from the viewpoint of TRPM8 activation.
Examples of the alkoxy group include those exemplified as the alkoxy group represented by R ¹ .

Ｒ⁴は、水素原子又は炭素数１〜３のアルコキシ基を示すが、ＴＲＰＭ８活性化作用の観点から、炭素数１〜３のアルコキシ基が好ましい。斯かるアルコキシ基としては、Ｒ¹で示されるものと同様のものが挙げられ、メトキシ基が好ましい。 R ⁴ represents a hydrogen atom or an alkoxy group having 1 to 3 carbon atoms, and an alkoxy group having 1 to 3 carbon atoms is preferable from the viewpoint of activating TRPM8. Examples of such an alkoxy group include the same groups as those represented by R ¹ , and a methoxy group is preferable.

また、式（１）の構造から明らかなように、化合物（１）は少なくとも５つの不斉炭素原子を有し、斯かる不斉炭素原子に由来して、化合物（１）には３２種の立体異性体が存在する。化合物（１）は、これら立体異性体のいずれでもよく、これら異性体の混合物であってもよいが、ＴＲＰＭ８活性化作用の観点から、メントールに由来する構造がｌ−メントールに由来するもの又はｄ−メントールに由来するものであるのが好ましい。なお、上記ｌ−メントールに由来する構造をもつ化合物は、下記式（１−１）で表され、上記ｄ−メントールに由来する構造をもつ化合物は、下記式（１−２）で表される。 As is clear from the structure of the formula (1), the compound (1) has at least 5 asymmetric carbon atoms, and derived from such asymmetric carbon atoms, the compound (1) has 32 types of Stereoisomers exist. Compound (1) may be any of these stereoisomers or a mixture of these isomers. From the viewpoint of TRPM8 activation, the structure derived from menthol is derived from 1-menthol or d. -Preferably from menthol. The compound having a structure derived from l-menthol is represented by the following formula (1-1), and the compound having a structure derived from d-menthol is represented by the following formula (1-2). .

（式中、各記号は前記と同義である。） (In the formula, each symbol has the same meaning as described above.)

次に、化合物（１）の合成方法について説明する。
化合物（１）は、Ｋ．Ｋｏｎｙａ，Ｚｓ．Ｖａｌｇａ＆Ｓ．Ａｎｔｕｓ，Ｐｈｙｔｏｍｅｄｉｃｉｎｅ，２００１，８（６），４５４−４５９に記載の方法等の常法を適宜組み合わせれば合成できる。また、Ａ．Ｉｓｏｇａｉ，Ｓ．Ｍｕｒａｋｏｓｈｉ，Ａ．Ｓｕｚｕｋｉ＆Ｓ．Ｔａｍｕｒａ，Ａｇｒ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１９７３，３７（４），８８９−８９５などに記載の方法に準じ、天然物から単離、或いは単離したネオリグナン類の７位炭素に結合している基−ＯＨに、メントールを常法に従って付加することによっても調製できる。
斯様な方法として、例えば、以下の合成方法が挙げられる。なお、斯かる方法においては、後述する工程（ｉ）〜（vi）に、保護反応や脱保護反応、光学分割を必要に応じて適宜組み合わせて行ってもよい。 Next, a method for synthesizing compound (1) will be described.
Compound (1) is a compound described in K.I. Konya, Zs. Valga & S. It can be synthesized by appropriately combining conventional methods such as those described in Antus, Phytomedicine, 2001, 8 (6), 454-459. A. Isogai, S .; Murakoshi, A .; Suzuki & S. Tamura, Agr. Biol. Chem. , 1973, 37 (4), 889-895, etc., menthol is added to the group —OH isolated from natural products or bonded to the 7-position carbon of neolignans isolated according to a conventional method. It can also be prepared by adding.
Examples of such a method include the following synthesis methods. In such a method, the steps (i) to (vi) described later may be appropriately combined with a protection reaction, a deprotection reaction, and an optical resolution as necessary.

工程（ｉ）は、原料化合物（ａ）とグリニャール試薬（ｂ）を反応させ、中間体（ｃ）を得る工程である。
原料化合物（ａ）としては、バニリン、５−ヒドロキシバニリン、シリンガアルデヒド等が挙げられる。
また、グリニャール試薬（ｂ）としては、エチルマグネシウムブロマイド等が挙げられる。 Step (i) is a step of reacting the raw material compound (a) with the Grignard reagent (b) to obtain an intermediate (c).
Examples of the raw material compound (a) include vanillin, 5-hydroxyvanillin, syringaldehyde and the like.
Examples of the Grignard reagent (b) include ethyl magnesium bromide.

工程（ii）は、酸化剤を用いて、中間体（ｃ）の基−ＯＨを基＝Ｏに変換し、中間体（ｄ）を得る工程である。酸化剤としては、二酸化マンガン等が挙げられる。
工程（iii）は、中間体（ｄ）をα臭素化し、中間体（ｅ）を得る工程である。 Step (ii) is a step of obtaining the intermediate (d) by converting the group -OH of the intermediate (c) to the group = O using an oxidizing agent. Examples of the oxidizing agent include manganese dioxide.
Step (iii) is a step in which intermediate (d) is α-brominated to obtain intermediate (e).

工程（iv）は、中間体（ｅ）と化合物（ｆ）を塩基存在下で反応させ、中間体（ｇ）を得る工程である。
化合物（ｆ）としては、例えば、６−メトキシオイゲノール、４−（１−プロペニル）シリンゴール、オイゲノール、イソオイゲノール等が挙げられる。
また、塩基としては、炭酸カリウム等が挙げられる。 Step (iv) is a step of obtaining intermediate (g) by reacting intermediate (e) with compound (f) in the presence of a base.
Examples of the compound (f) include 6-methoxyeugenol, 4- (1-propenyl) syringol, eugenol, isoeugenol and the like.
Moreover, potassium carbonate etc. are mentioned as a base.

工程（ｖ）は、中間体（ｇ）の７位炭素に結合している基＝Ｏを、基−ＯＨに変換し、中間体（ｈ）を得る工程である。
なお、本反応を水素化アルミニウムリチウム等の強い還元剤存在下で行えば、中間体（ｈ）のエリトロ体が得られ、一方、水素化ホウ素ナトリウム等の弱い還元剤とクラウンエーテルの存在下で行えば、中間体（ｈ）のトレオ体が得られる。 Step (v) is a step of obtaining intermediate (h) by converting group = O bonded to the 7-position carbon of intermediate (g) to group -OH.
When this reaction is carried out in the presence of a strong reducing agent such as lithium aluminum hydride, an erythro isomer of intermediate (h) is obtained, while in the presence of a weak reducing agent such as sodium borohydride and crown ether. If it carries out, the threo body of an intermediate body (h) will be obtained.

工程（vi）は、ｌ−メントールやｄ−メントール等のメントールを用いて、中間体（ｈ）の７位炭素に結合している基−ＯＨにメントールを付加し、化合物（１）を得る工程である。なお、本反応は、必要に応じて塩酸等の強酸存在下で行ってもよい。 In step (vi), menthol is added to group —OH bonded to the 7-position carbon of intermediate (h) using menthol such as l-menthol and d-menthol to obtain compound (1). It is. In addition, you may perform this reaction in presence of strong acids, such as hydrochloric acid, as needed.

なお、前記各工程において、各反応生成物の単離は、必要に応じて、ろ過、洗浄、乾燥、再結晶、再沈殿、遠心分離、各種溶媒による抽出、中和、クロマトグラフィー等の通常の手段を適宜組み合わせて行えばよい。 In each of the above steps, isolation of each reaction product may be performed by usual filtration, washing, drying, recrystallization, reprecipitation, centrifugation, extraction with various solvents, neutralization, chromatography, etc., if necessary. The means may be combined appropriately.

前記のようにして得られる化合物（１）は、後記実施例に示すように、優れたＴＲＰＭ８活性化作用を有し強い冷感を付与することができる。また冷感持続性にも優れる。
したがって、化合物（１）は、冷感剤及びＴＲＰＭ８活性化剤（以下、冷感剤等とも称する）としてそのまま用いることができ、また、冷感剤等を製造するための素材として使用することができる。なお、上記冷感剤等は仮にメントールを含んでいなくても上記効果を得ることが可能である。 The compound (1) obtained as described above has an excellent TRPM8 activating action and can impart a strong cooling sensation, as shown in Examples below. It also excels in sustaining cooling.
Therefore, the compound (1) can be used as it is as a cooling sensation agent and a TRPM8 activator (hereinafter also referred to as a cooling sensation agent), and can be used as a raw material for producing the cooling sensation agent and the like. it can. In addition, even if the said cooling sensation agent etc. do not contain menthol, the said effect can be acquired.

次に、本発明の冷感剤及びＴＲＰＭ８活性化剤について説明する。
本発明の冷感剤等は、前記化合物（１）を有効成分とするものである。 Next, the cooling sensation agent and TRPM8 activator of the present invention will be described.
The cooling sensation agent and the like of the present invention comprises the compound (1) as an active ingredient.

前記冷感剤等は、ヒト又は動物用の医薬品、化粧料、飲食品、口腔用組成物、ペットフード、他の嗜好品（タバコ等）等として使用できる。 The said cooling sensation agent etc. can be used as a pharmaceutical for humans or animals, cosmetics, food / beverage products, compositions for oral cavity, pet food, other luxury goods (such as tobacco) and the like.

前記冷感剤等を医薬品として使用する場合、任意の投与形態で投与され得る。投与形態は、経粘膜、経皮等の非経口投与と経口投与とに大別される。
また、前記医薬品の剤型は特に限定されない。非経口投与用の医薬品の剤型としては、例えば、液剤、ゲル剤、クリーム剤、軟膏剤、パップ剤、エアゾール剤、ローション剤、ファンデーション等の皮膚外用剤の他、点眼剤、点鼻剤等が挙げられる。
一方、経口投与用の医薬品の剤型としては、例えば、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、粉剤、丸剤、糖衣錠、内服液、懸濁液、シロップ剤等が挙げられる。
また、前記医薬品は、消炎鎮痛剤、殺菌消毒剤、収斂剤、抗生物質等の他の薬効成分を１種又は２種以上含んでいてもよい。 When the cooling agent or the like is used as a pharmaceutical, it can be administered in any dosage form. The administration forms are roughly classified into parenteral administration such as transmucosal and transdermal and oral administration.
Moreover, the dosage form of the said pharmaceutical is not specifically limited. Examples of pharmaceutical dosage forms for parenteral administration include, for example, liquid preparations, gel preparations, cream preparations, ointments, poultices, aerosols, lotions, foundations, and other skin external preparations, eye drops, nasal drops, etc. Is mentioned.
On the other hand, pharmaceutical dosage forms for oral administration include, for example, tablets, capsules, granules, powders, powders, pills, dragees, liquids for internal use, suspensions, syrups and the like.
Moreover, the said pharmaceutical may contain 1 type (s) or 2 or more types of other medicinal components, such as an anti-inflammatory analgesic, a bactericidal disinfectant, an astringent, and antibiotics.

また、前記冷感剤等を化粧料として使用する場合、その形態は特に限定されない。例えば、皮膚外用剤（虫除けスプレー等）、洗浄剤、化粧水、乳液、スキンクリーム、ファンデーション、口紅、頭皮用化粧料、毛髪化粧料（シャンプー、ヘアトニック等）、入浴剤等とすることができる。
また、前記化粧料は、化合物（１）の他に、油剤、セラミド類、擬似セラミド類、ステロール類、保湿剤、抗酸化剤、紫外線吸収剤、美白剤、アルコール類、キレート剤、ｐＨ調整剤、防腐剤等を１種又は２種以上含んでいてもよい。 Moreover, when using the said cooling agent etc. as cosmetics, the form is not specifically limited. For example, it can be used as an external preparation for skin (insect repellent spray, etc.), detergent, lotion, emulsion, skin cream, foundation, lipstick, scalp cosmetic, hair cosmetic (shampoo, hair tonic, etc.), bath preparation, etc. .
In addition to the compound (1), the cosmetics include oils, ceramides, pseudoceramides, sterols, humectants, antioxidants, ultraviolet absorbers, whitening agents, alcohols, chelating agents, pH adjusters. One or two or more kinds of preservatives may be included.

また、前記冷感剤等を飲食品として使用する場合、その形態は特に限定されない。例えば、キャンディ、ガム、タブレット、カプセル、飲料水等が挙げられる。 Moreover, when using the said cooling agent etc. as food-drinks, the form is not specifically limited. Examples include candy, gum, tablet, capsule, and drinking water.

また、前記冷感剤等を口腔用組成物として使用する場合、その形態は特に限定されず、例えば、歯磨剤、洗口液、歯肉マッサージクリーム等が挙げられる。 Moreover, when using the said cooling sensation agent etc. as a composition for oral cavity, the form is not specifically limited, For example, dentifrice, a mouthwash, a gingival massage cream etc. are mentioned.

また、前記冷感剤等に含まれる化合物（１）の含有量は特に限定されないが、経口投与のための医薬品、飲食品、口腔用組成物又はペットフードである場合、ＴＲＰＭ８活性化作用の観点から、下限として、０．１ｐｐｍ以上が好ましく、１ｐｐｍ以上がより好ましく、１０ｐｐｍ以上が更に好ましく、５０ｐｐｍ以上が更に好ましい。一方、その上限としては、下限と同様の観点から、１００００ｐｐｍ以下が好ましく、１０００ｐｐｍ以下が更に好ましく、７５０ｐｐｍ以下が更に好ましい。具体的には、ＴＲＰＭ８活性化作用の観点から、０．１ｐｐｍ以上が好ましく、１〜１００００ｐｐｍがより好ましく、１０〜１０００ｐｐｍが更に好ましく、５０〜７５０ｐｐｍが特に好ましい。
一方、非経口投与のための医薬品、化粧料又は他の嗜好品である場合は、ＴＲＰＭ８活性化作用の観点から、下限として、０．００１質量％以上が好ましく、０．０１質量％以上がより好ましい。一方、その上限としては、下限と同様の観点から、１０質量％以下が好ましい。具体的には、ＴＲＰＭ８活性化作用の観点から、０．００１質量％以上が好ましく、０．０１〜１０質量％がより好ましい。
なお、前記冷感剤等の投与又は摂取対象者としては、それを必要としている者であれば特に限定されない。 Further, the content of the compound (1) contained in the cooling sensation agent and the like is not particularly limited, but in the case of a pharmaceutical, food or drink, oral composition or pet food for oral administration, a viewpoint of TRPM8 activation action Therefore, the lower limit is preferably 0.1 ppm or more, more preferably 1 ppm or more, further preferably 10 ppm or more, and further preferably 50 ppm or more. On the other hand, the upper limit is preferably 10,000 ppm or less, more preferably 1000 ppm or less, and further preferably 750 ppm or less, from the same viewpoint as the lower limit. Specifically, from the viewpoint of TRPM8 activation action, 0.1 ppm or more is preferable, 1 to 10000 ppm is more preferable, 10 to 1000 ppm is still more preferable, and 50 to 750 ppm is particularly preferable.
On the other hand, in the case of pharmaceuticals, cosmetics or other luxury products for parenteral administration, the lower limit is preferably 0.001% by mass or more and more preferably 0.01% by mass or more from the viewpoint of TRPM8 activation. preferable. On the other hand, the upper limit is preferably 10% by mass or less from the same viewpoint as the lower limit. Specifically, from the viewpoint of TRPM8 activation action, 0.001% by mass or more is preferable, and 0.01 to 10% by mass is more preferable.
In addition, if it is a person who requires it as administration person of the said cooling sensation agent or ingestion, it will not specifically limit.

次に、本発明の冷感付与方法、ＴＲＰＭ８活性化方法について説明する。
本発明の冷感付与方法、ＴＲＰＭ８活性化方法は、前記化合物（１）を用いるものである。
また、斯かる冷感付与、ＴＲＰＭ８活性化方法の態様としては、化合物（１）の塗布・服用等が挙げられる。また、前記化合物（１）を用いるに際し、該化合物（１）として前記冷感剤等を用いてもよい。 Next, the cooling sensation imparting method and the TRPM8 activation method of the present invention will be described.
The cooling sensation imparting method and the TRPM8 activating method of the present invention use the compound (1).
Moreover, application | coating, taking, etc. of a compound (1) are mentioned as an aspect of such a cool feeling provision and TRPM8 activation method. Moreover, when using the said compound (1), you may use the said cooling agent etc. as this compound (1).

また、これら方法は、ヒト若しくは非ヒト動物、又はそれらに由来する検体における使用であり得、また治療的な使用であっても非治療的な使用であってもよい。ここで、「非治療的」とは、医療行為を含まない概念、すなわち人間を手術、治療又は診断する方法を含まない概念、より具体的には、医師又は医師の指示を受けた者が人間に対して手術、治療又は診断を実施する方法を含まない概念である。斯様な非治療的使用としては、エステティシャンによる施術が挙げられる。 These methods can also be used in humans or non-human animals, or specimens derived therefrom, and can be either therapeutic or non-therapeutic. Here, “non-therapeutic” means a concept that does not include medical practice, that is, a concept that does not include a method for operating, treating, or diagnosing a human. More specifically, a doctor or a person who has received instructions from a doctor is a human. It is a concept that does not include a method for performing surgery, treatment, or diagnosis on a patient. Such non-therapeutic use includes treatment by estheticians.

上述した実施形態に関し、本発明は更に以下の化合物等を開示する。 In relation to the above-described embodiment, the present invention further discloses the following compounds and the like.

＜１＞上記式（１）で表される化合物。 <1> A compound represented by the above formula (1).

＜２＞上記式（１）で表される化合物を有効成分とする冷感剤。
＜３＞上記式（１）で表される化合物を有効成分とするＴＲＰＭ８活性化剤。
＜４＞上記式（１）で表される化合物を用いる冷感付与方法。
＜５＞上記式（１）で表される化合物を投与又は摂取する冷感付与方法。
＜６＞上記式（１）で表される化合物を用いるＴＲＰＭ８活性化方法。
＜７＞上記式（１）で表される化合物を投与又は摂取するＴＲＰＭ８活性化方法。
＜８＞非治療的な方法である＜４＞〜＜７＞のいずれか１に記載の方法。
＜９＞冷感剤を製造するための、上記式（１）で表される化合物の使用。
＜１０＞ＴＲＰＭ８活性化剤を製造するための、上記式（１）で表される化合物の使用。
＜１１＞冷感付与に使用するための、上記式（１）で表される化合物。
＜１２＞ＴＲＰＭ８活性化に使用するための、上記式（１）で表される化合物。
＜１３＞前記＜１＞〜＜１２＞において、Ｒ¹は、好ましくは水素原子、炭素数１〜３のアルコキシ基であり、より好ましくは水素原子である。
＜１４＞前記＜１＞〜＜１２＞において、Ｒ²は、好ましくは水素原子である。
＜１５＞前記＜１＞〜＜１２＞において、Ｒ³は、好ましくは水素原子、炭素数２〜６のアルケニル基、より好ましくは炭素数２〜６のアルケニル基であり、更に好ましくは末端二重結合を有する炭素数２〜６のアルケニル基である。
＜１６＞前記＜１＞〜＜１２＞において、Ｒ⁴は、好ましくは炭素数１〜３のアルコキシ基であり、より好ましくはメトキシ基である。 <2> A cooling sensation agent comprising a compound represented by the above formula (1) as an active ingredient.
<3> A TRPM8 activator comprising a compound represented by the above formula (1) as an active ingredient.
<4> A cooling sensation imparting method using the compound represented by the formula (1).
<5> A cooling sensation imparting method in which the compound represented by the above formula (1) is administered or ingested.
<6> A method for activating TRPM8 using a compound represented by the above formula (1).
<7> A TRPM8 activation method of administering or ingesting a compound represented by the above formula (1).
<8> The method according to any one of <4> to <7>, which is a non-therapeutic method.
<9> Use of a compound represented by the above formula (1) for producing a cooling sensation agent.
<10> Use of a compound represented by the above formula (1) for producing a TRPM8 activator.
<11> A compound represented by the above formula (1) for use in imparting cooling sensation.
<12> A compound represented by the above formula (1) for use in TRPM8 activation.
<13> In the above items <1> to <12>, R ¹ is preferably a hydrogen atom or an alkoxy group having 1 to 3 carbon atoms, and more preferably a hydrogen atom.
<14> In the above items <1> to <12>, R ² is preferably a hydrogen atom.
<15> In the above items <1> to <12>, R ³ is preferably a hydrogen atom, an alkenyl group having 2 to 6 carbon atoms, more preferably an alkenyl group having 2 to 6 carbon atoms, and more preferably a terminal two. It is a C2-C6 alkenyl group having a heavy bond.
<16> In the above items <1> to <12>, R ⁴ is preferably an alkoxy group having 1 to 3 carbon atoms, and more preferably a methoxy group.

後述する実施例で得られた化合物の分析条件は以下の通りである。 Analytical conditions for the compounds obtained in the examples described later are as follows.

＜ＮＭＲスペクトル＞
¹Ｈ−ＮＭＲスペクトルは、ＣＨＣｌ₃（７．２４）を内部標準物質として用いて、Ｂｒｕｋｅｒ社製Ａｖａｎｃｅ−６００により測定した。
¹³Ｃ−ＮＭＲスペクトルは、ＣＨＣｌ₃（７７．０）を内部標準物質として用いて、Ｂｒｕｋｅｒ社製Ａｖａｎｃｅ−６００により測定した。 <NMR spectrum>
^{The 1} H-NMR spectrum was measured by Bruker Avance-600 using CHCl ₃ (7.24) as an internal standard substance.
^{The 13} C-NMR spectrum was measured by Bruker Avance-600 using CHCl ₃ (77.0) as an internal standard substance.

単離例
下記の単離スキームに従い、下記式で表されるエリトロ−Δ８'−４，７−ジヒドロキシ−３，３'，５'−トリメトキシ−８−Ｏ−４'−ネオリグナン（以下、エリトロ体（１）とも称する）をニクズクより単離した。 Example of isolation According to the following isolation scheme, erythro-Δ8′-4,7-dihydroxy-3,3 ′, 5′-trimethoxy-8-O-4′-neolignan represented by the following formula (hereinafter, erythro isomer) (Also referred to as (1)) was isolated from a nutmeg.

ニクズク（ＭｙｒｉｓｔｉｃａｆｒａｇｒａｎｓＨｏｕｔｔ．）の種子４００ｇに、５０ｖｏｌ％エタノール水溶液を４Ｌ添加し、室温で２日間浸漬して抽出した後、濾過して粗抽出液を得た。これを減圧濃縮後、エタノール２Ｌを添加し、不溶物を濾過した。濾液を減圧濃縮後、水と酢酸エチルを各２Ｌ添加して分液を行い、酢酸エチル層を減圧乾燥して固形分１３．１５ｇを得た。このうち５．００ｇをシリカゲルクロマトグラフィーによって精製し、エリトロ体（１）を含む画分１．１０ｇを得た。これを更に逆相ＨＰＬＣ（ＩｎｅｒｔｓｉｌＯＤＳ−３）によって精製し、エリトロ体（１）を得た。 4 L of 50 vol% ethanol aqueous solution was added to 400 g of seeds of Myrtica fragrance Hout., Extracted by immersion for 2 days at room temperature, and then filtered to obtain a crude extract. After concentration under reduced pressure, 2 L of ethanol was added, and insoluble matters were filtered. After the filtrate was concentrated under reduced pressure, 2 L each of water and ethyl acetate were added for liquid separation, and the ethyl acetate layer was dried under reduced pressure to obtain 13.15 g of a solid content. Of this, 5.00 g was purified by silica gel chromatography to obtain 1.10 g of a fraction containing erythro isomer (1). This was further purified by reverse phase HPLC (Inertsil ODS-3) to obtain erythro isomer (1).

実施例１
単離例１で得られたエリトロ体（１）（１１．０ｍｇ）を６０℃で融解したｌ−メントール（１９０ｍｇ）に溶解後、濃塩酸（２μＬ）を添加して６０℃で３時間反応させた。冷却後、酢酸エチルと飽和炭酸水素ナトリウム水溶液を加え、酢酸エチル層を減圧濃縮後、シリカゲルクロマトグラフィーによって精製し、Δ８'−７−（ｌ−メントキシ）−４−ヒドロキシ−３，３'，５'−トリメトキシ−８−Ｏ−４'−ネオリグナン（以下、混合物（２）とも称する）（８．９ｍｇ）を、ジアステレオマー比３６：２６：２６：１２で得た。 Example 1
The erythro isomer (1) (11.0 mg) obtained in isolation example 1 was dissolved in 1-menthol (190 mg) melted at 60 ° C., concentrated hydrochloric acid (2 μL) was added, and the mixture was reacted at 60 ° C. for 3 hours. It was. After cooling, ethyl acetate and saturated aqueous sodium hydrogen carbonate solution were added, and the ethyl acetate layer was concentrated under reduced pressure and purified by silica gel chromatography to obtain Δ8′-7- (1-menthoxy) -4-hydroxy-3,3 ′, 5. '-Trimethoxy-8-O-4'-neolignan (hereinafter also referred to as mixture (2)) (8.9 mg) was obtained in a diastereomeric ratio of 36: 26: 26: 12.

実施例２
実施例１と同様にして、エリトロ体（１）（１３．５ｍｇ）を６０℃で融解したｄ−メントール（１３４ｍｇ）に溶解後、濃塩酸（２μＬ）を添加して６０℃で３時間反応させた。冷却後、酢酸エチルと飽和炭酸水素ナトリウム水溶液を加え、酢酸エチル層を減圧濃縮後、シリカゲルクロマトグラフィーによって精製し、Δ８'−７−（ｄ−メントキシ）−４−ヒドロキシ−３，３'，５'−トリメトキシ−８−Ｏ−４'−ネオリグナン（以下、混合物（３）とも称する）（９．５ｍｇ）を、ジアステレオマー比３６：２６：２６：１２で得た。 Example 2
In the same manner as in Example 1, erythro isomer (1) (13.5 mg) was dissolved in d-menthol (134 mg) melted at 60 ° C., concentrated hydrochloric acid (2 μL) was added, and the mixture was reacted at 60 ° C. for 3 hours. It was. After cooling, ethyl acetate and saturated aqueous sodium hydrogen carbonate solution were added, and the ethyl acetate layer was concentrated under reduced pressure and purified by silica gel chromatography. Δ8′-7- (d-menthoxy) -4-hydroxy-3,3 ′, 5 '-Trimethoxy-8-O-4'-neolignan (hereinafter also referred to as mixture (3)) (9.5 mg) was obtained in a diastereomeric ratio of 36: 26: 26: 12.

得られた混合物（２）および（３）のＮＭＲスペクトルと化学構造を以下に示す。なお、混合物（２）および（３）は互いにエナンチオマーの関係にあるため、ＮＭＲスペクトルは一致する。 The NMR spectra and chemical structures of the obtained mixtures (2) and (3) are shown below. Since the mixtures (2) and (3) are in an enantiomeric relationship with each other, the NMR spectra match.

¹HNMR (600 MHz, CDCl₃) δ 7.19 (d, J = 1.7 Hz, 0.12H), 7.06 (dd, J = 8.1, 1.7 Hz, 0.12H), 6.95 (m, 0.26H), 6.92 (d, J = 1.6 Hz, 0.26H), 6.88-6.76 (m, 2.24H), 6.38 (s, 0.24H), 6.36 (s, 0.52H), 6.26 (s, 0.72H), 5.98-5.86 (m, 1H), 5.58-5.44 (br, 1H), 5.11-5.01 (m, 2H), 4.71 (d, J = 5.8 Hz, 0.26H), 4.69 (d, J = 3.8 Hz, 0.12H), 4.60 (d, J = 4.2 Hz, 0.26H), 4.47 (d, J = 6.4 Hz, 0.36H), 4.37 (m, 0.26H), 4.35 (m, 0.12H), 4.31 (m, 0.36H), 4.22 (m, 0.26H), 3.88 (s, 0.36H), 3.86 (s, 0.78H), 3.84 (s, 0.78H), 3.80 (s, 1.08H), 3.78 (s, 1.56H), 3.76 (s, 0.72H), 3.71 (s, 1.56H), 3.66 (s, 2.16H), 3.45 (td, J = 10.5, 4.1 Hz, 0.26H), 3.33-3.24 (m, 2H), 3.16 (td, J = 10.5, 4.1 Hz, 0.12H), 2.98 (td, J = 10.5, 4.1 Hz, 0.36H), 2.91 (td, J = 10.5, 4.1 Hz, 0.26H), 2.60-2.51 (m, 0.26H), 2.30-2.18 (m, 1.1.36H), 2.12-2.07 (m, 0.26H), 1.86 (m, 0.12H), 1.70-1.46 (m, 2H), 1.33 (d, J = 6.3 Hz, 1.08H), 1.32-0.67 (m, 14.06), 0.46 (d, J = 6.9 Hz, 0.78H), 0.31 (d, J = 7.0 Hz, 1.08H);
¹³CNMR (150 MHz, CDCl₃) δ 153.5, 153.4, 153.2, 153.1, 146.1, 145.9, 145.8, 145.6, 144.8, 144.7, 144.3 (2C), 137.5, 137.4 (2C), 137.3, 135.7, 135.2, 134.9 (2C), 134.8, 134.7 (2C), 134.6 (2C), 132.8, 132.7, 131.6, 121.9, 121.5, 120.6, 120.3, 115.9, 115.8 (2C), 115.7, 113.4, 113.2, 113.1 (2C), 110.7, 110.5, 110.4, 110.0, 105.8, 105.6, 105.5 (2C), 83.2, 82.9, 81.4(2C), 80.9, 80.8, 80.3, 80.0, 79.8, 79.6, 74.6 (2C), 56.1, 55.9 (2C), 55.8 (4C), 55.7, 49.3, 48.8, 48.4, 42.2, 41.9, 40.5 (3C), 40.4, 39.9, 39.5, 34.6 (3C), 34.5, 31.6 (2C), 31.4, 31.2, 25.2, 25.1, 24.9, 24.8, 22.9 (2C), 22.8, 22.7, 22.5 (2C), 22.4, 22.3, 21.5, 21.4, 21.3 (2C), 16.5, 16.4, 15.9 (2C), 14.9, 14.8. ¹ HNMR (600 MHz, CDCl ₃ ) δ 7.19 (d, J = 1.7 Hz, 0.12H), 7.06 (dd, J = 8.1, 1.7 Hz, 0.12H), 6.95 (m, 0.26H), 6.92 (d, J = 1.6 Hz, 0.26H), 6.88-6.76 (m, 2.24H), 6.38 (s, 0.24H), 6.36 (s, 0.52H), 6.26 (s, 0.72H), 5.98-5.86 (m, 1H ), 5.58-5.44 (br, 1H), 5.11-5.01 (m, 2H), 4.71 (d, J = 5.8 Hz, 0.26H), 4.69 (d, J = 3.8 Hz, 0.12H), 4.60 (d, J = 4.2 Hz, 0.26H), 4.47 (d, J = 6.4 Hz, 0.36H), 4.37 (m, 0.26H), 4.35 (m, 0.12H), 4.31 (m, 0.36H), 4.22 (m, 0.26H), 3.88 (s, 0.36H), 3.86 (s, 0.78H), 3.84 (s, 0.78H), 3.80 (s, 1.08H), 3.78 (s, 1.56H), 3.76 (s, 0.72H ), 3.71 (s, 1.56H), 3.66 (s, 2.16H), 3.45 (td, J = 10.5, 4.1 Hz, 0.26H), 3.33-3.24 (m, 2H), 3.16 (td, J = 10.5, 4.1 Hz, 0.12H), 2.98 (td, J = 10.5, 4.1 Hz, 0.36H), 2.91 (td, J = 10.5, 4.1 Hz, 0.26H), 2.60-2.51 (m, 0.26H), 2.30-2.18 (m, 1.1.36H), 2.12-2.07 (m, 0.26H), 1.86 (m, 0.12H), 1.70-1.46 (m, 2H), 1.33 (d, J = 6.3 Hz, 1.08H), 1.32- 0.67 (m, 14.06), 0.46 (d, J = 6.9 Hz, 0.78H), 0.31 (d, J = 7.0 Hz, 1.08H);
¹³ CNMR (150 MHz, CDCl ₃ ) δ 153.5, 153.4, 153.2, 153.1, 146.1, 145.9, 145.8, 145.6, 144.8, 144.7, 144.3 (2C), 137.5, 137.4 (2C), 137.3, 135.7, 135.2, 134.9 ( 2C), 134.8, 134.7 (2C), 134.6 (2C), 132.8, 132.7, 131.6, 121.9, 121.5, 120.6, 120.3, 115.9, 115.8 (2C), 115.7, 113.4, 113.2, 113.1 (2C), 110.7, 110.5 , 110.4, 110.0, 105.8, 105.6, 105.5 (2C), 83.2, 82.9, 81.4 (2C), 80.9, 80.8, 80.3, 80.0, 79.8, 79.6, 74.6 (2C), 56.1, 55.9 (2C), 55.8 (4C ), 55.7, 49.3, 48.8, 48.4, 42.2, 41.9, 40.5 (3C), 40.4, 39.9, 39.5, 34.6 (3C), 34.5, 31.6 (2C), 31.4, 31.2, 25.2, 25.1, 24.9, 24.8, 22.9 (2C), 22.8, 22.7, 22.5 (2C), 22.4, 22.3, 21.5, 21.4, 21.3 (2C), 16.5, 16.4, 15.9 (2C), 14.9, 14.8.

試験例１ＴＲＰＭ８活性化作用確認試験
以下の手順に従い、試験サンプルのＴＲＰＭ８活性化作用におけるＥＣ₅₀値を測定した。
（１）ヒトＴＲＰＭ８安定発現株の作製
ヒトＴＲＰＭ８安定発現ＨＥＫ２９３細胞株を作製するため、ヒトＴＲＰＭ８遺伝子のクローニングを行った。全長ヒトＴＲＰＭ８遺伝子は、ヒト前立腺組織全ＲＮＡ（ＣＯＳＭＯＢＩＯ社製）より、ＲＴ−ＰＣＲ法を用いて増幅した。
得られたＰＣＲ産物をエントリーベクターｐＥＮＴＲ−Ｄ／ＴＯＰＯ（インビトロジェン社製）へクローニングした後、ｐＣＤＮＡ３．２−Ｖ５／ＤＥＳＴ（インビトロジェン社製）へサブクローニングし、リポフェクトアミン２０００（インビトロジェン社製）によりＨＥＫ２９３細胞へ形質導入した。形質導入された細胞を、４５０μｇ／ｍＬのＧ−４１８（プロメガ社）を含有するＤＭＥＭ培地中で増殖させて選抜した。ＨＥＫ２９３細胞は内在性のＴＲＰＭ８を発現しないため、ＴＲＰＭ８形質導入株に対するコントロールとして使用できる。 Test Example 1 TRPM8 Activation Action Confirmation Test According to the following procedure, the EC ₅₀ value in the TRPM8 activation action of the test sample was measured.
(1) Production of human TRPM8 stable expression strain To produce the human TRPM8 stable expression HEK293 cell line, the human TRPM8 gene was cloned. The full-length human TRPM8 gene was amplified from human prostate tissue total RNA (manufactured by COSMOBIO) using the RT-PCR method.
The obtained PCR product was cloned into the entry vector pENTR-D / TOPO (Invitrogen), then subcloned into pCDNA3.2-V5 / DEST (Invitrogen), and HEK293 using Lipofectamine 2000 (Invitrogen). Cells were transduced. Transduced cells were selected by growing in DMEM medium containing 450 μg / mL G-418 (Promega). Since HEK293 cells do not express endogenous TRPM8, they can be used as a control for TRPM8 transduced strains.

（２）カルシウムイメージング
ＨＥＫ２９３細胞へ形質導入したＴＲＰＭ８活性の測定は、蛍光カルシウムイメージング法により行った。
まず、培養したＴＲＰＭ８発現細胞をポリ−Ｄ−リジンコートされた９６ウェルプレート（ＢＤファルコン社製）へ播種（３０，０００細胞／ウェル）し、３７℃で一晩インキュベートした後、培養液を除去し、Ｆｌｕｏ４−ＡＭ液（同仁化学社製；カルシウムキットＩＩ）を添加し、３７℃で３０〜６０分間インキュベートした。その後、９６ウェル穴プレートを蛍光プレートリーダー（ＦＤＳＳ３０００；浜松ホトニクス社製）にセットし、装置庫内温度を３２℃とした状態で、励起波長４８０ｎｍで励起したときのＦｌｕｏ４による蛍光イメージを、ＣＣＤカメラを用いて検出波長５２０ｎｍにより捕捉した。
測定は１秒毎に計４分間行い、測定開始１５秒後に、ＦＤＳＳ３０００内蔵の分注器から試験サンプル（下記表１に示す各化合物を１０ｍＭ濃度でそれぞれエタノールに溶解したストック液を作成し、さらにハンクスリンガー液に終濃度の３倍の濃度で溶解させたもの）を添加し、蛍光強度の変化によりＴＲＰＭ８の活性を評価した。 (2) Calcium imaging TRPM8 activity transduced into HEK293 cells was measured by the fluorescent calcium imaging method.
First, cultured TRPM8-expressing cells were seeded (30,000 cells / well) in a 96-well plate (BD Falcon) coated with poly-D-lysine, incubated at 37 ° C. overnight, and then the culture solution was removed. Fluo4-AM solution (manufactured by Dojin Chemical Co., Ltd .; calcium kit II) was added and incubated at 37 ° C. for 30-60 minutes. Thereafter, the 96-well plate was set in a fluorescent plate reader (FDSS3000; manufactured by Hamamatsu Photonics), and the fluorescence image by Fluo4 when excited at an excitation wavelength of 480 nm with the temperature inside the apparatus being set at 32 ° C. Was captured at a detection wavelength of 520 nm.
Measurement is performed every second for a total of 4 minutes, and 15 seconds after the start of measurement, a test sample (stock solution in which each compound shown in Table 1 below is dissolved in ethanol at a concentration of 10 mM is prepared from a dispenser built in FDSS 3000, TRKS8 activity was evaluated based on changes in fluorescence intensity.

（３）ＴＲＰＭ８活性化の評価
ＴＲＰＭ８活性は、試験サンプル添加後の蛍光強度比の最大値を用いて評価した。下記の式を用いて蛍光強度比を算出した。
蛍光強度比＝各時点の蛍光強度／測定開始時蛍光強度
各処理群あたり２ウェルで評価を行い、その平均値を用いた。 (3) Evaluation of TRPM8 activation TRPM8 activity was evaluated using the maximum value of the fluorescence intensity ratio after addition of the test sample. The fluorescence intensity ratio was calculated using the following formula.
Fluorescence intensity ratio = fluorescence intensity at each time point / fluorescence intensity at the start of measurement Evaluation was performed with 2 wells for each treatment group, and the average value was used.

（４）ＴＲＰＭ８活性化作用の評価結果
以下の表１に示す各試験サンプルのＴＲＰＭ８活性化作用を、終濃度１ｎＭから１μＭの範囲で上記方法により測定した。測定結果より、最小二乗法を用いてヒルの式に近似した容量依存曲線を求め、これよりＥＣ₅₀値を算出した。各試験サンプルのＴＲＰＭ８活性化作用におけるＥＣ₅₀値は以下の表１に示すとおりであった。 (4) Evaluation results of TRPM8 activation action The TRPM8 activation action of each test sample shown in Table 1 below was measured by the above method in a final concentration range of 1 nM to 1 μM. From the measurement results, a capacity dependence curve approximated to Hill's equation was determined using the least square method, and EC ₅₀ values were calculated from this. The EC ₅₀ values for the TRPM8 activation action of each test sample were as shown in Table 1 below.

前記表１に示すように、実施例で得られた各化合物は優れたＴＲＰＭ８活性化作用を有する。したがって、これら実施例で得られた各化合物によれば強い冷感を付与することができる。 As shown in Table 1, each compound obtained in the examples has an excellent TRPM8 activation action. Therefore, according to each compound obtained in these examples, a strong cooling sensation can be imparted.

Claims

Following formula (1)

[Equation (1), R ¹ represents a hydrogen atom, a hydroxy group or an alkoxy group having 1 to 3 carbon atoms, R ² represents a hydrogen atom or a hydroxy group, R ³ is a hydrogen atom, C 1 -C 6 alkyl group, an alkenyl group or an alkoxy group having 1 to 3 carbon atoms having 2 to 6 carbon atoms, R ⁴ represents a hydrogen atom or an alkoxy group having 1 to 3 carbon atoms. ]
A compound represented by

A cooling sensation agent comprising the compound according to claim 1 as an active ingredient.

A TRPM8 activator comprising the compound according to claim 1 as an active ingredient.

A non-therapeutic cooling sensation method using the compound according to claim 1.

A non-therapeutic method for TRPM8 activation using the compound of claim 1.