JP6049795B2

JP6049795B2 - Ｌ−グルタミン測定キット

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Publication number: JP6049795B2
Application number: JP2015078020A
Authority: JP
Inventors: 荒井　智; 智荒井; 均日下部
Original assignee: Yamasa Corp
Current assignee: Yamasa Corp
Priority date: 2014-04-10
Filing date: 2015-04-06
Publication date: 2016-12-21
Anticipated expiration: 2035-04-06
Also published as: JP2015204825A

Description

本発明はＬ−グルタミンの測定試薬および、当該試薬を含むキットに関する。

Ｌ−グルタミンは抗体医薬や組換えタンパク質製剤などのバイオ医薬品の製造過程において、そのタンパク生産効率や糖鎖構造に影響を及ぼすことが知られる。また、各種サプリメントの機能性成分や、微生物・培養細胞の培地における栄養源としてもきわめて有用な成分であり、その濃度管理は非常に重要である。

従来、Ｌ−グルタミンの測定する方法として、高速液体クロマトグラフィーを用いる方法や、酵素を利用した方法が多く利用されてきた。酵素を利用した方法としては、とくに、試料中のＬ−グルタミンに対してグルタミナーゼを作用させてＬ−グルタミン酸とし、ついで遊離するＬ−グルタミン酸に対しＬ−グルタミン酸オキシダーゼを作用させ、反応に伴う酸素の消費量を検出するか、反応時に生じる過酸化水素、アンモニアもしくはα−ケトグルタル酸の生成量を検出する方法（特許文献１〜３）や、遊離するＬ−グルタミン酸に対してＬ−グルタミン酸デヒドロゲナーゼを作用させて、補酵素ＮＡＤ（Ｐ）Ｈの生成に伴う３４０ｎｍの吸光度変化を測定する方法（非特許文献１）が知られている。

上記のＬ−グルタミナーゼおよびＬ−グルタミン酸オキシダーゼを用いたＬ−グルタミンの測定法では、試料中に内在性のＬ−グルタミン酸が含まれていたとき、測定値に誤差が生じる恐れがある。内在性Ｌ−グルタミン酸の測定値から補正するため、たとえば、グルタミナーゼとＬ−グルタミン酸オキシダーゼの双方を保持する測定セルと、Ｌ−グルタミン酸オキシダーゼのみを保持する測定セルの２つの測定セルで測定を行い、２つの測定値の差からＬ−グルタミンを測定する方法（公知文献２）や、Ｌ−グルタミナーゼのみ、Ｌ−グルタミン酸オキシダーゼのみ、あるいは双方の酵素を固定化した固定化体で測定を行い、それぞれの検出値から得た検量線をもとにＬ−グルタミン量を算出する方法（公知文献３）が知られている。

より具体的には、下記（１）〜（３）のような３段階の反応によって、あらかじめ内在性のＬ−グルタミン酸を除去した後にＬ−グルタミンを定量する方法が知られている。
（１）内在性のグルタミン酸を除去する段階
試料にＬ−グルタミン酸オキシダーゼおよびカタラーゼを作用させる。Ｌ−グルタミン酸オキシダーゼの作用により内在性のグルタミン酸は分解し、また、このとき生じる過酸化水素も、カタラーゼによって分解するため、試料中より除去される。一方、Ｌ−グルタミンは未反応のまま試料中に残る。
（２）Ｌ−グルタミンをＬ−グルタミン酸へと反応させる段階
上記（１）の反応が十分に行われた試料中に、Ｌ−グルタミナーゼおよびアジ化ナトリウムを作用させる。このとき、反応液Ｉに含まれていたカタラーゼは、アジ化ナトリウムの作用によりただちに失活する。

一方、試料中のＬ−グルタミンは、Ｌ−グルタミナーゼの作用によりＬ−グルタミン酸へと変わった後、（１）の工程で添加されたＬ−グルタミン酸オキシダーゼの作用によって分解し、過酸化水素を生じる。
（３）生じた過酸化水素を定量する段階
当該過酸化水素の生成量を測定することによって、Ｌ−グルタミンを定量する。

ここで、Ｌ−グルタミン測定時の上記各種物質の生成量を測定する方法としては、酵素反応液に、上記の酵素のほかに発色剤およびペルオキシダーゼを加え、発色剤、ペルオキシダーゼと過酸化水素の反応によって生じた発色量を、吸光光度計によって測定する方法がある。このときの発色剤としては、例えば新トリンダー試薬とカプラー化合物の組み合わせが利用される。

従来Ｌ−グルタミン酸オキシダーゼを用いるグルタミンの測定キットは、測定試薬を凍結乾燥品として供するものであった。また、従来の凍結乾燥品を用いたキットは、Ｌ−グルタミン酸オキシダーゼおよびカタラーゼを含む反応液Ｉの凍結乾燥試薬にカプラー化合物を配合し、上記反応液ＩならびにＬ−グルタミナーゼおよびカタラーゼ失活剤を含む反応液ＩＩの溶解用溶液に新トリンダー試薬を含むものであった。凍結乾燥品の測定試薬を用いる従来の方法においては、使用前の溶解が必要となるなど操作が煩雑であった。測定試薬である凍結乾燥品を溶液化した後では、溶液の泡立ち、時間経過に伴う酵素および発色剤の失活による測定試薬自体の不安定化、あるいは発色剤の自然着色による試薬ブランクの吸光度上昇などが発生し、その結果、検体および標準品の吸光度の変動が生じ、検体の正確な測定値を算出することができなくなるため、溶解後の使用期限を１週間程度に限定する必要があった。

測定試薬を初めから溶液の形で供するキットであれば、自動比色分析機への適用も容易であり、より簡易にＬ−グルタミンを測定することが可能であるが、そのためには、溶液状態で酵素を安定して保存するため、反応液の組成等を十分に検討することが必須である。しかしながら、このような検討は従来なされておらず、知見も得られていなかった。

特公平４−２４９９７号公報特開平２−５０１００９号公報特開２００３−３２２６３５号公報

Methods of Enzymatic Analysis Vol.8, 357-363 (Weinheim, 1986)

本発明が解決すべき課題は、Ｌ−グルタミンを簡易な方法によって、精度よく測定することである。また、本発明の別の課題は、凍結乾燥品の酵素を用いる方法における問題、具体的には、溶液の泡立ち、時間経過に伴う酵素および発色剤の失活による測定試薬自体の不安定化、あるいは発色剤の自然着色による試薬ブランクの吸光度上昇等を抑えるため液体状の反応試薬を用いる方法を提供することである。さらに、本発明のさらなる課題は、当該液体試薬を長期間安定な状態で保管することができる測定キットを提供することである。

発明者らは、鋭意検討を行う中で、酵素を溶液状態で保存する上記（１）〜（３）の工程によるＬ−グルタミンの測定キットにおいて、新トリンダー試薬と４−アミノアンチピリンを適切に組み合わせることが安定性の向上に重要であるという課題を新たに見出した。

そこでさらに詳細な検討を行うことにより、発明者らは、下記（Ａ）（Ｂ）を含有するＬ−グルタミンの測定キットにおいて、従来の凍結乾燥試薬を用いる方法とは異なる組み合わせ、具体的には、反応液Ｉに新トリンダー試薬、反応液ＩＩにペルオキシダーゼおよびカプラー化合物を添加することで、意外にも酵素を含む測定試薬を液体状態で保存した際にも、保存時間経過や保存時の温度負荷に伴う試薬ブランク吸光度の上昇や検体の吸光度低下が抑制され、長期間にわたって安定した測定値を提供できるような、酵素を溶液の形で使用するＬ−グルタミン測定キットを製造・使用できることを見出し、本発明を完成させたものである：
（Ａ）反応液Ｉ（Ｌ−グルタミン酸オキシダーゼ、カタラーゼ、及び新トリンダー試薬を含む）、
（Ｂ）反応液ＩＩ（グルタミナーゼ、ペルオキシダーゼ、カタラーゼ失活剤、カプラー化合物を含む）。

本発明のキットは、Ｌ−グルタミンを簡易な方法によって、精度よく測定することができる。また、酵素を液体試薬として供給しているものであるために、溶液の泡立ち、時間経過に伴う酵素および発色剤の失活による測定試薬自体の不安定化、あるいは発色剤の自然着色による試薬ブランクの吸光度上昇などの従来の凍結乾燥品における課題が解決されているだけでなく、当該液体試薬を長期間安定な状態で保管することができ、測定キットとしてきわめて有用なものである。

本発明のＬ−グルタミン測定キットは、下記（Ａ）及び（Ｂ）の構成試薬を少なくとも含む。
（Ａ）反応液Ｉ（Ｌ−グルタミン酸オキシダーゼ、カタラーゼ及び新トリンダー試薬を含む）、
（Ｂ）反応液ＩＩ（グルタミナーゼ、ペルオキシダーゼ、カタラーゼ失活剤及びカプラー化合物を含む）。

本発明に用いる分析試料としては、Ｌ−グルタミンを含有することが予想されるものであれば、特に限定されない。具体的には、血清、血漿、尿、羊水、組織抽出物等の生体試料、組織・細胞・微生物等の培養液、食品、食品原料等を挙げることができる。

本発明で使用するＬ−グルタミン酸オキシダーゼ、カタラーゼ、グルタミナーゼおよびペルオキシダーゼは、公知のものを利用することができる。具体的には、Ｌ−グルタミン酸オキシダーゼとして、Streptomyces sp. X-119-6、Streptomyces violascens、および Streptomyces endusなどの微生物由来のＬ−グルタミン酸オキシダーゼを挙げることができる。カタラーゼとしてはウシ肝臓由来カタラーゼの他、Aspergillus nigerやCorynebacterium glutamicumなどの微生物由来のカタラーゼを挙げることができる。グルタミナーゼとしてはBacillus amyloriquefaciens由来のグルタミナーゼなどを挙げることができる。ペルオキシダーゼとして西洋わさび由来のペルオキシダーゼなどを挙げることができる。

また、本発明で使用する新トリンダー試薬としては、発色試薬として公知のものを使用することができ、たとえばＮ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３−メチルアニリン・ナトリウム塩（ＴＯＯＳ）、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３−メトキシアニリン（ＡＤＯＳ）、Ｎ−(２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル)−３，５−ジメトキシアニリン(ＨＤＡＯＳ)、Ｎ−エチル−Ｎ−スルホプロピル−３−メトキシアニリン（ＡＤＰＳ）、Ｎ−エチル−Ｎ−スルホプロピルアニリン（ＡＬＰＳ）、Ｎ−エチル−Ｎ−スルホプロピル−３−メチルアニリン(ＴＯＰＳ)、Ｎ−エチル−Ｎ−スルホプロピル−３，５−ジメトキシアニリン（ＤＡＰＳ）、Ｎ−（２−カルボキシエチル）−Ｎ−エチル−３，５−ジメトキシアニリン（ＣＥＤＢ）、又はＮ−（２−カルボキシエチル）−Ｎ−エチル−３−メトキシアニリン（ＣＥＭＯ）、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３，５−ジメトキシ−４−フルオロアニリン（ＦＤＡＯＳ）、Ｎ−エチル−Ｎ−スルホプロピル−３，５−ジメトキシ−４−フルオロアニリン（ＦＤＡＰＳ）などを利用することが可能である。中でも、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３−メチルアニリン・ナトリウム塩（ＴＯＯＳ）、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３−メトキシアニリン（ＡＤＯＳ）、Ｎ−(２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル)−３，５−ジメトキシアニリン(ＨＤＡＯＳ)、Ｎ−エチル−Ｎ−スルホプロピル−３−メトキシアニリン（ＡＤＰＳ）、Ｎ−エチル−Ｎ−スルホプロピルアニリン（ＡＬＰＳ）またはＮ−エチル−Ｎ−スルホプロピル−３−メチルアニリン（ＴＯＰＳ）のいずれかを用いるのが好ましい。

本発明で使用するカプラー化合物としては、新トリンダー試薬との組み合わせで発色を生ずる化合物として任意のものを用いればよく、たとえば４−アミノアンチピリン（４−ＡＡ）、バニリンジアミンスルホン酸、メチルベンズチアゾリノンヒドラゾン（ＭＢＴＨ）、スルホン化メチルベンズチアゾリノンヒドラゾン（ＳＭＢＴＨ）、アミノジフェニルアミン、１−（４−スルホフェニル）−２，３−ジメチル−４−アミノ−５−ピラゾロン（ＣＰ２−４）、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−ｍ−トルイジンまたはその誘導体などを用いることができる。中でも、４−アミノアンチピリン（４−ＡＡ）を用いるのが好ましい。

本発明で使用する反応液Ｉは、Ｌ−グルタミン酸オキシダーゼ、カタラーゼおよび新トリンダー試薬を含有する。上記酵素および新トリンダー試薬を含有させる液としては、各種緩衝液を利用することができる。緩衝液としては、酢酸、リン酸、クエン酸、ホウ酸、トリスアミノメタン、ＨＥＰＥＳ、ＭＥＳ、Ｂｉｓ−トリス、ＡＤＡ、ＡＣＥＳ、ＰＩＰＥＳ、ＭＯＰＳＯ、ＭＯＰＳ、ＢＥＳ、ＴＥＳ、ＤＩＰＳＯ、ＴＡＰＳＯ、ＴＡＰＳ、ＣＨＥＳ、ＣＡＰＳＯ、ＣＡＰＳおよびこれらの塩などを利用することが可能である。本発明において、反応液Ｉは、カプラー化合物を含まないことが好ましい。本発明において、反応液Ｉが「カプラー化合物を含まない」とは、反応液Ｉに実質的にカプラー化合物を含まないことを意味する。より具体的には本発明において、語句「カプラー化合物を含まない反応液Ｉ」には、カプラー化合物を全く含まない反応液Ｉだけでなく、本発明の効果を棄損しない限度でごく微量のカプラー化合物を含む反応液Ｉも包含される。

反応液Ｉにおける緩衝液等への各酵素および新トリンダー試薬の含有量としては、Ｌ-グルタミン酸オキシダーゼ０．０５〜２Ｕ/ｍＬ、カタラーゼ１００〜３０００Ｕ/ｍＬ、新トリンダー試薬０．０１〜２μｍｏｌ/ｍＬの範囲にあることが好ましく、特にＬ-グルタミン酸オキシダーゼ０．２〜０．８Ｕ/ｍＬ、カタラーゼ５００〜２０００Ｕ/ｍＬ、新トリンダー試薬０．４〜０．８μｍｏｌ/ｍＬの範囲にあることがより好ましい。

次に本発明で使用する反応液ＩＩは、Ｌ−グルタミナーゼ、ペルオキシダーゼ、カタラーゼ失活剤およびカプラー化合物を含有する。上記酵素、カタラーゼ失活剤およびカプラー化合物を含有させる液としては、各種緩衝液を利用することができる。緩衝液の例としては、酢酸、リン酸、クエン酸、ホウ酸、トリスアミノメタン、ＨＥＰＥＳ、ＭＥＳ、Ｂｉｓ−トリス、ＡＤＡ、ＡＣＥＳ、ＰＩＰＥＳ、ＭＯＰＳＯ、ＭＯＰＳ、ＢＥＳ、ＴＥＳ、ＤＩＰＳＯ、ＴＡＰＳＯ、ＴＡＰＳ、ＣＨＥＳ、ＣＡＰＳＯ、ＣＡＰＳおよびこれらの塩などを利用することが可能である。本発明において、反応液ＩＩは、新トリンダー試薬を含まないことが好ましい。本発明において、反応液ＩＩが「新トリンダー試薬を含まない」とは、反応液ＩＩに実質的に新トリンダー試薬を含まないことを意味する。より具体的には本発明において、語句「新トリンダー試薬を含まない反応液ＩＩ」には、新トリンダー試薬を全く含まない反応液ＩＩだけでなく、本発明の効果を棄損しない限度で新トリンダー試薬を含む反応液ＩＩも包含される。

カタラーゼ失活剤としては、カタラーゼを速やかに失活させる作用を有する物質であれば任意のものを用いればよく、たとえばアジ化ナトリウムや３−アミノ−１，２，４−トリアゾールなどを用いることができる。

緩衝液等への各酵素、カタラーゼ失活剤およびカプラー化合物の含有量は、グルタミナーゼ０．０１〜２Ｕ/ｍＬ、ペルオキシダーゼ１〜３０Ｕ/ｍＬ、カタラーゼ失活剤０．０１〜０．１％、カプラー化合物０．０１〜２μｍｏｌ/ｍＬの範囲にあることが好ましく、特にグルタミナーゼ０．１〜０．５Ｕ/ｍＬ、ペルオキシダーゼ５〜２０Ｕ/ｍＬ、カタラーゼ失活剤０．０５〜０．１％、カプラー化合物０．２〜０．８μｍｏｌ/ｍＬの範囲にあることがより好ましい。

本発明で使用する反応液Ｉ、ＩＩには、上記の各試薬のほかに防腐剤等を含んでいても良い。防腐剤としては、プロクリン３００、プロクリン９５０、クロラムフェニコールなど公知のものを用いることができる。

本発明のキットには、上記反応液Ｉ、ＩＩのほかに、Ｌ−グルタミン標準品、吸光度測定用の９６穴プレートまたはセル、検体希釈液等を添付することもできる。

本発明のＬ−グルタミン測定キットは、酵素を液体状態で長期間安定に保存することが可能である。具体的には、好ましい実施形態において、本発明のキットは、３７℃で１０週間保管した反応液Ｉ及び反応液ＩＩをこの順にＬ−グルタミンを所定濃度含む溶液に添加したときの吸光度と、保管０日目の反応液Ｉ及び反応液ＩＩをこの順に前記溶液と同一のＬ−グルタミン溶液に添加した吸光度の測定値の差が±１０％以内という高い安定性を有する。当該実施形態において、「Ｌ−グルタミンを所定濃度含む溶液」としては、例えば、本願実施例２で用いられたＬ−グルタミン２０ｍｇ／Ｌ水溶液、Ｌ−グルタミン１００ｍｇ／Ｌ水溶液及びＬ−グルタミン１０００ｍｇ／Ｌ水溶液が挙げられる。本発明においては、これら３種類のＬ−グルタミン２０ｍｇ／Ｌ水溶液のうち１つを測定した場合に、３７℃で１０週間保管した反応液Ｉ及び反応液ＩＩと保管０日目の反応液Ｉ及び反応液ＩＩとで吸光度の測定値の差が±１０％以内であることが好ましく、これら３種類のＬ−グルタミン２０ｍｇ／Ｌ水溶液の全てを測定した場合に、いずれも３７℃で１０週間保管した反応液Ｉ及び反応液ＩＩと保管０日目の反応液Ｉ及び反応液ＩＩとで吸光度の測定値の差が±１０％以内であることがより好ましい。

本発明では、Ｌ−グルタミンを測定するため、まず試料に反応液Ｉを添加する。試料中に内在性のＬ−グルタミン酸が存在する場合、当該工程によりこれを除去する。当該反応条件は、使用する酵素の至適ｐＨ、至適温度にしたがって設定すればよいが、おおむね、ｐＨ６．０〜８．０、温度１５〜３０℃の条件下で、５〜２０分ほど実施することができる。

次に、上記反応液Ｉによる反応が十分進行した後、反応液ＩＩをさらに添加することにより、Ｌ−グルタミンをＬ−グルタミン酸に変換させ、さらにこれを分解し、過酸化水素を生じせしめ、当該過酸化水素と発色剤、ペルオキシダーゼを反応させることにより発色を生じる。当該反応条件は、使用する酵素の至適ｐＨ、至適温度にしたがって設定すればよいが、おおむね、ｐＨ６．０〜８．０、温度１５〜３０℃の条件下で、５〜３０分ほど実施することができる。

最後に、生じた発色の程度を、吸光度によって測定し、試料中のＬ−グルタミン濃度を算出する。吸光度測定において、測定する波長は用いる発色試薬の種類に応じて選択すればよい。

本発明においては、上記方法に加え、試料に代えて標準溶液として濃度既知のＬ−グルタミン溶液（例えば、１００ｍｇ／ＬのＬ−グルタミン溶液）を用いて同様の方法をさらに行ってもよい。当該実施形態においては、試料およびＬ−グルタミン標準液について吸光度を測定した後は、試料の代わりに水を用いたブランクの吸光度を差し引き、下記式１を用いることにより、試料中のＬ−グルタミン量を算出することができる。

以下、参考例及び実施例を示し本発明を具体的に説明するが、本発明がこれに限定されないのは明らかである。

（参考例）カプラー化合物と新トリンダー試薬の検討（１）
反応液中にカプラー化合物および新トリンダー試薬を加えた酵素試薬の安定性を調べるために、安定性試験を実施した。カプラー化合物としては、４−アミノアンチピリンを用いた。

Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３−メチルアニリン・ナトリウム塩（略称：ＴＯＯＳ）およびＮ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３，５−ジメトキシアニリン（略称：ＤＡＯＳ）の２種類の新トリンダー試薬を用いて、下記表１のように、反応液Ｉに４−アミノアンチピリンと新トリンダー試薬の双方を含む組成の溶液状酵素試薬を調製した。なお、表中「Ｌ−ＧＬＯＸ」はＬ−グルタミン酸オキシダーゼ、「４−ＡＡ」は４−アミノアンチピリンを示し、以下本文中の略称も同様とする。各成分を溶解する緩衝液にはＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．１）を使用した。

調製した試薬を等量ずつポリプロピレン遠沈管に分注し、加速試験として３０℃で保存し、保存開始後０日目と４週目に、各酵素試薬を用いて検体測定を実施することで、安定性を評価した。

《測定方法・反応液量・反応時間》
検体測定は、以下のような手順にしたがって実施した。
まず、ガラス試験管に反応液Ｉ４５０μＬおよび試料を入れ、室温で１０分間反応させた。その後、反応液ＩＩをさらに４５０μＬ添加し、同様に２０分間反応させた。反応終了後、ディスポーザブルセミマイクロキュベット（バイオラッド社）に液を０．９ｍＬ移し、分光光度計で５５５ｎｍの吸光度測定（純水を対照として測定）を行った。Ｌ−グルタミン濃度１０〜５００ｍｇ／Ｌで検量線が一次式となるような試料の液量を定めた。試料の添加量は、試験１では６０μＬ、試験２では３０μLとした。

《測定結果および考察》
測定結果（各検体の吸光度）を表２に示した。新トリンダー試薬としてＤＡＯＳを使用した試験２では、３０℃で４週間保存したときの試薬ブランクの吸光度は、保存０日のものに比べて３８倍に上昇し、それに伴い各試料の吸光度が保存０日の場合に比べて上昇していた。４−アミノアンチピリンと新トリンダー試薬を共存させることで自然に酸化縮合反応が起こって着色し、吸光度上昇をもたらしたと考えられた。

また試験２のＬ−グルタミン溶液の吸光度について、３０℃４週保存したものでは、Ｌ−グルタミン５００ｍｇ／Ｌの測定値が０日の場合に比べて４割前後まで低下した。その原因としては、反応液中の酵素の活性低下が考えられた。同時に、本来除去されているはずのＬ−グルタミン酸の測り込みも検出され、同様に反応液中の酵素の失活が示唆された。

一方、ＴＯＯＳを使用した試験１でも、３０℃４週保存後では保存０日に比べて試薬ブランクの吸光度が１５倍に上昇し、それに伴い各試料の吸光度がＤａｙ０に比べて上昇しており、発色試薬の自然着色が示唆された。

表２に示すように３０℃４週でＬ−グルタミン酸の測り込みが検出されたことから、３０℃４週保存では反応液中の酵素の失活が起こっていることが考えられた。

以上の結果から、反応液Ｉにカプラー化合物と新トリンダー試薬を共存させることは、発色試薬の自然着色を生じるとともに、反応液に含まれる酵素および新トリンダー試薬自体の活性の低下をもたらすと考えられた。

（実施例１）カプラー化合物と新トリンダー試薬の組み合わせ検討（２）
参考例の結果から、反応液ＩにＤＡＯＳ、ＴＯＯＳ等の新トリンダー試薬と４−アミノアンチピリンの双方を加えると、時間経過に伴う試薬ブランク吸光度の上昇と、カタラーゼ等の酵素の失活を引き起こす可能性が考えられた。

そこで、反応液Ｉ、ＩＩにおける発色試薬の組合せをさらに詳細に検討し、最適化するため、下記表３に示す６種類の酵素試薬を調製し（(1)〜(6)）、加速試験を実施した。酵素および発色試薬の濃度は参考例と同様とし、新トリンダー試薬はＴＯＯＳを使用した。

溶液状酵素試薬は、調製後、等量ずつポリプロピレン遠沈管に分注し、加速試験として３７℃で保存した。保存開始後０日目、１週目および４週目に検体測定を実施した。検体および標準液は分注して−８０℃保存して随時使用した。

なお、Ｌ−グルタミン５００ｍｇ／Ｌ付近の直線性を確実にするために、試料液量を２０μＬにして測定を行った。酵素試薬量、反応時間、測定吸光度は参考例と同様とした。

《測定結果と考察》
各試験における吸光度の測定結果を表４に示した。Ｌ−グルタミン溶液の吸光度について、「（１）４−ＡＡ＋（２）ＴＯＯＳ」では３７℃４週保存で値の低下がみられたが、「（３）ＴＯＯＳ＋（４）４−ＡＡ」では、３７℃４週でもＤａｙ０と同程度の吸光度を示した。「（５）４−ＡＡ、ＴＯＯＳ＋（６）無」では、Ｌ−グルタミン溶液のＤａｙ０と比較して３７℃１週間保存でＬ−グルタミン５００ｍｇ／Ｌの吸光度が大幅に低下し、３７℃４週では全ての検体で発色しなくなった。

したがって、「（３）ＴＯＯＳ＋（４）４−ＡＡ」の組み合わせが最も良好な結果を示した。

以上の結果を総合すると、反応液Ｉに新トリンダー試薬、反応液ＩＩにカプラー化合物を添加した「（３）ＴＯＯＳ＋（４）４−ＡＡ」の組み合わせのみにおいて、非常に高い安定性を示す結果が得られたことから、この組み合わせが最適であることが明らかになった。

（実施例２）安定性試験１
下記表５に示す組成の溶液状酵素試薬を調製し、酵素試薬の安定性を確認するために、温度負荷３７℃での加速試験を実施した。調製した酵素試薬を等量ずつポリプロピレン製チューブに分注し、冷蔵保存用と３７℃保存用に分けて保存し、保存開始後０日目、４週目、１０週目に各酵素試薬を用いて検体測定を実施した。

なお、標準液はＬ−グルタミン１００ｍｇ／Ｌ水溶液、Ｌ−グルタミン検体は２０ｍｇ／Ｌ、１０００ｍｇ／Ｌ水溶液を使用し、Ｌ−グルタミン酸の測り込み確認用検体としてＬ−グルタミン酸１０００ｍｇ／Ｌ水溶液を使用した。検体および標準液は分注して−８０℃保存して随時使用した。

《測定方法・反応液量・反応時間》
９６ウェル丸底アッセイプレート（ＩＷＡＫＩ）の各ウェルに、試料４μＬと反応液Ｉを９０μＬ入れ、１０分間反応させた。その後、さらに反応液ＩＩを９０μＬ加え、２０分間反応させた後、プレートリーダー（ＴＥＣＡＮＩｎｆｉｎｉｔｅ）で５５５ｎｍの吸光度測定を行った。Ｌ−グルタミン濃度１０〜１５００ｍｇ／Ｌで検量線が一次式となるような試料の液量として、本試験では、試料量を４μＬとした。

《測定結果と考察》
測定結果を下表６に示す。３７℃保存で１０週間保存した酵素試薬による測定において、グルタミン測定時の吸光度およびＬ−グルタミン測定値はＤａｙ０値±１０％以内に収まっており、値は安定していると判断された。また、Ｌ−グルタミン酸の測り込みも検出されなかった。さらに、Ｌ-グルタミン０ｍｇ／Ｌ（試薬ｂｌａｎｋ）の吸光度は０．０１未満であった。すなわち、酵素試薬は３７℃で１０週間保存しても安定性を保ったと考えられた。

（実施例３）各種新トリンダー試薬の検討
各種新トリンダー試薬における安定性の差を検討するため、下記表７に示す組成の溶液状酵素試薬を調製した。また反応液Ｉ（１）〜（６）には新トリンダー試薬として、表８に示す各種試薬をそれぞれ終濃度０．８（μｍｏｌ／ｍＬ）となるよう添加した。新トリンダー試薬としては、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３−メチルアニリン・ナトリウム塩（ＴＯＯＳ）、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３−メトキシアニリン（ＡＤＯＳ）、Ｎ−(２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル)−３，５−ジメトキシアニリン(ＨＤＡＯＳ)、Ｎ−エチル−Ｎ−スルホプロピル−３−メトキシアニリン（ＡＤＰＳ）、Ｎ−エチル−Ｎ−スルホプロピルアニリン（ＡＬＰＳ）、Ｎ−エチル−Ｎ−スルホプロピル−３−メチルアニリン(ＴＯＰＳ)を用いた。

上記酵素試薬の安定性を確認するために、温度負荷３７℃での加速試験を実施した。調製した酵素試薬を等量ずつチューブに分注し、３７℃で保存し、保存開始後０日目、６週目に各酵素試薬を用いて検体測定を実施した。

《測定方法・反応液量・反応時間》
測定では、試料２０μＬに反応液Ｉ７００μＬを添加し、１０分間反応させた。その後、反応液ＩＩを７００μＬ添加し、１０分間反応させた後、吸光度測定を行った。測定ＯＤは各新トリンダー試薬の種類に応じ、表８に示した通りの値とした。

測定試料としては、測定時の濃度が表９に示した値となるよう、Ｌ−グルタミンおよび／またはＬ−グルタミン酸をそれぞれ添加して用いた。

《測定結果と考察》
下記表１０は、各新トリンダー試薬を用いて検体（ａ）〜（ｄ）を測定したときの吸光度の値を示す。新トリンダー試薬として、ＴＯＯＳ、ＡＤＯＳ、ＨＤＡＯＳ、ＡＤＰＳ、ＡＬＰＳ、ＴＯＰＳは、酵素を溶液保存するＬ−グルタミン測定キットに使用するのに適しており、とくにＴＯＯＳとＡＬＰＳが感度良く測定できることが判明した。

（実施例４）安定性試験２
表１１に示す組成の溶液状酵素試薬を調製し、酵素試薬の長期保存安定性を確認するために、冷蔵条件での長期安定性試験を実施した。酵素試薬を等量ずつポリプロピレン製チューブに分注し、保存開始後０日（Ｄａｙ０）、６ヶ月、９ヶ月、１２ヶ月に検体測定を実施した。

なお、検体はＬ−グルタミン０ｍｇ／Ｌ水溶液として精製水、標準液としてＬ−グルタミン１００ｍｇ／Ｌ水溶液、Ｌ−グルタミン検体は１５ｍｇ／Ｌ水溶液、１５０ｍｇ／Ｌ水溶液、１５００ｍｇ／Ｌ水溶液を使用し、Ｌ−グルタミン酸の測り込み確認用検体としてＬ−グルタミン酸１５００ｍｇ／Ｌ水溶液を使用した。標準液は凍結乾燥して冷蔵保存し、使用時に精製水で溶解して使用した。Ｌ−グルタミン検体は分注して−８０℃保存して随時使用した。

《測定方法・反応液量・反応時間》
96ウェル丸底アッセイプレート（IWAKI）の各ウェルに、試料４μＬと反応液Ｉを９０μＬ入れ、１０分間反応させた。その後、さらに反応液ＩＩを９０μＬ加え、２０分間反応させた後、プレートリーダー（TECAN Infinite）で５５５ｎｍの吸光度測定を行った。Ｌ−グルタミン濃度１０〜１５００ｍｇ／Ｌで検量線が一次式となるような試料の液量として、本試験では、試料量を４μＬとした。

《測定結果と考察》
保管０日目（Ｄａｙ０）、６ヶ月、９ヶ月、１２ヶ月経過後の各時点での吸光度と測定値を表１３に示した。１２ヶ月まで保存した酵素試薬による測定において、標準液および検体の吸光度はＤａｙ０とほぼ同等の値を示し、Ｌ−グルタミン測定値はＤａｙ０値±１０％以内に収まっており、値は安定していると判断された。また、Ｌ−グルタミン酸１５００ｍｇ／Ｌ水溶液の測定値は０ｍｇ／Ｌ付近を示しており、Ｌ−グルタミン酸の測り込みは完全に抑制されていた。さらに、Ｌ−グルタミン０ｍｇ／Ｌ水溶液の吸光度に経時的な上昇などの異常はみられず、試薬ブランク吸光度は低値を保っていた。以上の結果から、酵素試薬は冷蔵で１２ヶ月保存しても安定性を保ったと考えられた。

Claims

下記（Ａ）及び（Ｂ）を含有する、試料中のＬ−グルタミン測定キット。
（Ａ）Ｌ−グルタミン酸オキシダーゼ、カタラーゼ、及び新トリンダー試薬を含む反応液Ｉ、
（Ｂ）Ｌ−グルタミナーゼ、ペルオキシダーゼ、カタラーゼ失活剤、及びカプラー化合物を含む反応液ＩＩ。
新トリンダー試薬が、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３−メチルアニリン・ナトリウム塩（ＴＯＯＳ）、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３−メトキシアニリン（ＡＤＯＳ）、Ｎ−(２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル)−３，５−ジメトキシアニリン(ＨＤＡＯＳ)、Ｎ−エチル−Ｎ−スルホプロピル−３−メトキシアニリン（ＡＤＰＳ）、Ｎ−エチル−Ｎ−スルホプロピルアニリン（ＡＬＰＳ）、Ｎ−エチル−Ｎ−スルホプロピル−３−メチルアニリン(ＴＯＰＳ)から成る群より選ばれるものである、請求項１記載の測定キット。
カプラー化合物が４−アミノアンチピリンである、請求項１又は２に記載の測定キット。
試料に対して、反応液Ｉ及び反応液ＩＩをこの順に試薬を添加し、反応を行うための、請求項１〜３のいずれか１項に記載の測定キット。
３７℃で１０週間保管した反応液Ｉ及び反応液ＩＩをこの順にグルタミンを所定濃度含む溶液に添加したときの吸光度が、保管０日目の反応液Ｉ及び反応液ＩＩをこの順に前記溶液と同一のグルタミン溶液に添加した吸光度の値に対して±１０％以内であるような、請求項１〜４のいずれか１項に記載の測定キット。
下記（１）〜（３）の工程を含む、試料中のＬ−グルタミンの測定法であって、反応液ＩがＬ−グルタミン酸オキシダーゼ、カタラーゼ、新トリンダー試薬を含み、および反応液ＩＩがＬ−グルタミナーゼ、ペルオキシダーゼ、カタラーゼ失活剤、カプラー化合物を含むことを特徴とする、Ｌ−グルタミンの測定方法。
（１）試料に反応液Ｉを添加する工程、
（２）上記工程（１）で反応液Ｉを添加した試料に、反応液ＩＩをさらに添加することにより、Ｌ−グルタミンをＬ−グルタミン酸に変換させ、さらにこれを分解し、過酸化水素を生じせしめ、当該過酸化水素と発色剤、ペルオキシダーゼの反応により発色を生じせしめる工程、
（３）生じた発色の程度を、吸光度によって測定する工程。