JP6017259B2

JP6017259B2 - エンドセリン作用抑制剤

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Publication number: JP6017259B2
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Inventors: 大樹村瀬; 剛史大場
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Description

本発明は、エンドセリン作用抑制剤、並びにそれを用いた美白剤及び血管収縮抑制剤に関する。

エンドセリンは、内皮細胞由来のペプチドホルモンで、受容体を通して種々の細胞や組織に作用する。例えば、血管平滑筋細胞等において細胞内カルシウム濃度上昇を引き起こし、血管収縮作用を有することが知られている（非特許文献１、２）。このようなエンドセリンの作用を抑制しうる物質は血管収縮の抑制に有用である。
また、近年、エンドセリンが表皮メラノサイト（メラニン細胞）に対し細胞内カルシウム濃度上昇を促し、細胞内のシグナル伝達系を介して細胞増殖を促進するとともに、メラニン合成の律速酵素であるチロシナーゼの活性を増強することが報告されている（非特許文献３参照）。また、エンドセリンは表皮角化細胞（ケラチノサイト）が産生するメラノサイト活性化因子の１つであること（非特許文献４）、紫外線誘導性色素沈着や老人性色素斑形成の重要な要因であることが報告されている（非特許文献５、６）。このようなエンドセリンの生体作用から、エンドセリンの作用を抑制しうる物質は、メラニン生成や色素沈着等の改善や予防にも有用であると考えられる。

Hirata Y. et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 154(1988), pp. 868-875 Yanagisawa M. et al., Nature, Vol. 332, 31 March 1988, No. 6163, pp. 411-415 Yada et al., J. Biol. Chem., 266(1991), pp. 18352-18357 Imokawa et al., J. Biol. Chem., 267(1992), pp. 24675-24680 Imokawa et al., J. Invest. Dermatol., 105(1995), pp. 32-37 Kadono et al., J. Invest. Dermatol., 116(2001), pp. 571-577

本発明は、エンドセリンの作用を効果的に抑制するエンドセリン作用抑制剤を提供することを課題とする。また、本発明は、当該エンドセリン作用抑制剤を用いた美白剤及び血管収縮抑制剤を提供することを課題とする。

本発明者等は上記課題に鑑み、エンドセリンの作用を抑制する新規物質を探求すべく鋭意検討を行った。その結果、ヒッコリー・バーク、ホロピト、ライフ・エバーラスティング・フラワー、及びジャマイカン・ドッグウッドの抽出物が、エンドセリンの作用を抑制することを見出した。さらには、これらの抽出物が、エンドセリンの作用によって引き起こされるメラノサイト内のカルシウム（イオン）濃度上昇を抑制することも見出し、該抽出物が新規の美白成分として有用であるとの知見を得た。本発明はこれらの知見に基づいて完成するに至ったものである。

すなわち、本発明は、ヒッコリー・バーク（Carya alba）、ホロピト（Pseudowintera colorata）、ライフ・エバーラスティング・フラワー（Helichrysum stoechas）、及びジャマイカン・ドッグウッド（Piscidia erythrina）からなる群より選ばれる少なくとも１種の抽出物を有効成分として含有するエンドセリン作用抑制剤に関する。
また、本発明は、ヒッコリー・バーク（Carya alba）、ホロピト（Pseudowintera colorata）、及びライフ・エバーラスティング・フラワー（Helichrysum stoechas）からなる群より選ばれる少なくとも１種の抽出物を有効成分として含有する美白剤に関する。さらに、本発明は、ヒッコリー・バーク（Carya alba）、ホロピト（Pseudowintera colorata）、ライフ・エバーラスティング・フラワー（Helichrysum stoechas）、及びジャマイカン・ドッグウッド（Piscidia erythrina）からなる群より選ばれる少なくとも１種の抽出物を有効成分として含有する血管収縮抑制剤に関する。

本発明のエンドセリン作用抑制剤は、優れたエンドセリン作用抑制効果を奏する。
また、本発明のエンドセリン作用抑制剤は当該作用により、エンドセリンによって起こるメラノサイト内のカルシウム濃度上昇を効果的に抑制し、メラニン生成を抑制することができる。そのため、本発明のエンドセリン作用抑制剤は、美白剤として好適に用いることができる。
さらに、本発明のエンドセリン作用抑制剤は、エンドセリンによって起こる血管収縮を抑制しうるため、血管収縮抑制剤としても好適に用いることができる。

実施例１の参考例において、ジャーマンカミツレ抽出物を添加した系での細胞内カルシウム濃度上昇率（相対値％）を示す図である。

以下、本発明を詳細に説明する。
本発明のエンドセリン作用抑制剤、美白剤及び血管収縮抑制剤は、ヒッコリー・バーク（Carya alba）、ホロピト（Pseudowintera colorata）、ライフ・エバーラスティング・フラワー（Helichrysum stoechas）、及びジャマイカン・ドッグウッド（Piscidia erythrina）からなる群より選ばれる少なくとも１種の抽出物を有効成分として含有する。後述の実施例で実証するように、これらの抽出物は優れたエンドセリン作用抑制効果を有する。

本発明の有効成分として用いられる各植物抽出物について説明する。
ヒッコリー・バークはクルミ科（Juglandaceae）ペカン属（Carya）の植物で、学名はCarya albaであり、別名Mockernut hickory，Carya tomentosa，Shag-Bark Hickory等とも呼ばれている。
ホロピトはシキミモドキ科（Winteraceae）の植物で、学名はPseudowintera colorataであり、別名Mountain horopitoとも呼ばれている。
ライフ・エバーラスティング・フラワーはキク科（Asteraceae）ムギワラギク属の植物で、学名はHelichrysum stoechasである。
ジャマイカン・ドッグウッドはマメ科（Leguminosae）の植物で、学名はPiscidia erythrinaであり、別名fishpoison tree，fish fuddleとも呼ばれている。

本発明において用いる抽出物を得るためには、ヒッコリー・バーク、ホロピト、ライフ・エバーラスティング・フラワー、及びジャマイカン・ドッグウッドの植物体の任意の部分が使用可能である。例えば、上記植物の全木、全草、又は任意の部位（根、根茎、幹、枝、茎、葉、樹皮、樹液、樹脂、花、果実、種子、果皮、莢、芽、花穂、心材等）を用いることができ、各部位を複数組み合わせて用いてもよい。また、これらの植物を基原植物として得られた生薬を抽出原料として用いてもよい。
好ましくは、以下の部位を抽出に用いる。
ヒッコリー・バークの抽出物を得るためには、前記植物の樹皮を用いるのが好ましい。
ホロピトの抽出物を得るためには、前記植物の葉を用いるのが好ましい。
ライフ・エバーラスティング・フラワーの抽出物を得るためには、前記植物の花部、又は全草を用いるのが好ましい。
ジャマイカン・ドッグウッドの抽出物を得るためには、前記植物の樹皮を用いるのが好ましい。

本発明に用いるヒッコリー・バーク、ホロピト、ライフ・エバーラスティング・フラワー、及びジャマイカン・ドッグウッドの抽出物の製造方法については特に限定はなく、上記植物を通常の方法で抽出することにより抽出物を得ることができる。具体的には、上記植物を乾燥させた乾燥物、その粉砕物等を圧搾抽出することにより得られる搾汁、水蒸気蒸留物、各種抽出溶剤による粗抽出物、粗抽出物を分配又はカラムクロマトなどの各種クロマトグラフィーなどで精製して得られた抽出物画分などを本発明における抽出物として用いることができる。
上記植物は生のままで抽出に供することも可能であるが、より抽出効率を高めるために、乾燥、細断、粉砕などの工程を加えることも好ましい。また、本発明においては、上記の抽出物、水蒸気蒸留物、圧搾物等を、いずれかを単独で、又は２種以上を組み合わせて使用してもよい。

本発明においては、上記植物を乾燥させた乾燥物又はその粉砕物から、抽出溶剤を用いて得られた抽出物を用いることがより好ましい。
抽出溶剤としては、極性溶剤、非極性溶剤のいずれも使用することができ、これらを混合して用いることもできる。例えば、水；メタノール、エタノール、プロパノール、ブタノール等のアルコール類；エチレングリコール、プロピレングリコール、グリセリン、ブチレングリコール等の多価アルコール類；アセトン、メチルエチルケトン等のケトン類；酢酸メチル、酢酸エチル等のエステル類；テトラヒドロフラン、ジエチルエーテル等の鎖状及び環状エーテル類；ポリエチレングリコール等のポリエーテル類；ジクロロメタン、クロロホルム、四塩化炭素等のハロゲン化炭化水素類；ヘキサン、シクロヘキサン、石油エーテル等の炭化水素類；ベンゼン、トルエン等の芳香族炭化水素類；ピリジン類；超臨界二酸化炭素；油脂、ワックス、その他オイル等が挙げられる。あるいは、上記溶剤の２種以上を組み合わせた混合物を、抽出溶剤として用いることができる。このうち、水、アルコール類、水−アルコール混合液、プロピレングリコール、グリセリン、ブチレングリコール、水−多価アルコール類の混合液を用いるのが好ましく、エタノール水溶液を用いるのがより好ましい。

本発明で用いられる抽出物を得るための抽出条件については、使用する溶剤によって異なり特に制限はないが、例えば水、アルコール類又は水−アルコール混合液、プロピレングリコール、ブチレングリコールにより抽出する場合、植物１質量部に対して１質量部以上５０質量部以下の溶剤を用いることが好ましい。抽出は、好ましくは３℃以上、より好ましくは２０℃以上、好ましくは１００℃以下、より好ましくは８０℃以下、さらに好ましくは４０℃以下の温度で、好ましくは１時間以上（より好ましくは１日以上）、数週間以下（より好ましくは３０日間以下）浸漬又は加熱還流するのが好ましい。また、抽出効率を上げる為、併せて攪拌を行ったり、溶媒中でホモジナイズ処理を行ってもよい。

上記溶媒で抽出して得られた抽出物はそのまま使用してもよいが、さらに適当な分離手段、例えばゲル濾過、クロマトグラフィー、精密蒸留等により活性の高い画分を分画して用いることもできる。本発明において抽出物とは、このようにして得られた各種抽出物、その希釈液、その濃縮液、その精製物又はそれらの乾燥末を包含するものである。

後述の実施例で実証しているように、ヒッコリー・バーク、ホロピト、ライフ・エバーラスティング・フラワー、及びジャマイカン・ドッグウッドの抽出物は、エンドセリンによるメラノサイトのカルシウム濃度上昇を効果的に抑制することができる。
前述のように、エンドセリンはメラノサイトに対して働きメラニン生成に関与し、エンドセリンの作用抑制はメラニンの生成抑制にもつながる。そのため、これらの抽出物は美白剤として好適に用いることができる。なお、本発明において「美白（作用）」とは、メラニン色素の生成を抑え、余分なメラニンのない本来の透明な肌色に戻すこと、または皮膚の黒化若しくはシミ・ソバカス等の色素沈着を防止、抑制することを意味する。
また、エンドセリンの作用抑制は、エンドセリンの有する血管収縮作用の抑制につながるため、これらの抽出物は血管収縮抑制剤としても用いることができる。

本発明のエンドセリン作用抑制剤、美白剤又は血管収縮抑制剤は、有効成分としてヒッコリー・バーク、ホロピト、ライフ・エバーラスティング・フラワー、ジャマイカン・ドッグウッドの抽出物を単独で用いてもよく、また２種以上混合して用いてもよい。
また、本発明のエンドセリン作用抑制剤、美白剤又は血管収縮抑制剤は、有効成分であるこれらの植物抽出物のみを含有するものであってもよいし、他の成分を含有するものであってもよい。

有効成分以外の他の成分は、剤の形態や用途等に応じて適宜選択できる。例えば、剤として成形しやすいよう、酸化チタン、炭酸カルシウム、蒸留水、乳糖、デンプン等の適当な液体または固体の賦形剤または増量剤を加えてもよい。また、美白用途に用いる場合は、他の薬効成分（その他の美白剤、保湿剤など）、酸化防止剤、紫外線吸収剤、界面活性剤、増粘剤、色材種等を加えてもよい。
剤に他の成分を配合して組成物とする場合、有効成分である上記植物抽出物の含有量は特に制限されないが、上記抽出物が剤中に固形分濃度（固形分換算）で、０．００００１質量％以上含まれることが好ましく、０．０００１質量％以上含まれることがより好ましく、０．００１質量％以上含まれることがさらに好ましく、０．０１質量％以上含まれることが特に好ましい。また、上記抽出物が剤中に固形分濃度で、５０質量％以下含まれることが好ましく、２５質量％以下含まれることがより好ましく、１０質量％以下含まれることがさらに好ましく、５質量％以下含まれることが特に好ましい。より具体的な含有量は、０．００００１〜５０質量％が好ましく、０．０００１〜２５質量％がより好ましく、０．００１〜１０質量％がさらに好ましく、０．０１〜５質量％が特に好ましい。

本発明のエンドセリン作用抑制剤、美白剤及び血管収縮抑制剤は、種々の形態で使用することができる。例えば、化粧料等の皮膚外用剤の形態で使用することができる他、医薬品としてヒトや動物に投与する形態で使用することもできる。また、各種の飲食品、ペットフード等に有効成分として配合してもよい。美白剤として用いる場合は、皮膚外用剤の形態、或いは食品等に配合した形態とすることが好ましい。他方、血管収縮抑制剤として用いる場合には、医薬品の形態、或いは食品等に配合した形態とすることが好ましい。

ここで、「皮膚外用剤」とは、皮膚化粧料、外用医薬品、外用医薬部外品等として皮膚に適用されるものを意味し、その剤型も水溶液系、可溶化系、乳化系、粉末系、ゲル系、軟膏系、クリーム、水−油２層系、水−油−粉末３層系など、幅広い形態をとり得る。例えば、洗顔料、化粧水、乳液、クリーム、ジェル、エッセンス（美容液）、パック、マスク、ファンデーション、軟膏、シート状製品等の形態が挙げられる。
皮膚外用剤の形態で使用する場合には、有効成分である上記植物抽出物の他、通常の皮膚外用剤に用いられる成分、例えば界面活性剤、油性物質、高分子化合物、防腐剤、前記以外の薬効成分、紛体、紫外線吸収剤、色素、香料、乳化安定剤、pH調整剤等を適宜配合できる。
皮膚外用剤中の有効成分である上記植物抽出物の含有量は特に制限されないが、上記抽出物が剤中に固形分濃度で、０．００００１質量％以上含まれることが好ましく、０．０００１質量％以上含まれることがより好ましく、０．００１質量％以上含まれることがさらに好ましい。また、上記抽出物が剤中に固形分濃度で、１０質量％以下含まれることが好ましく、５質量％以下含まれることがより好ましい。より具体的な含有量は、０．００００１〜１０質量％が好ましく、０．０００１〜１０質量％がより好ましく、０．００１〜５質量％がさらに好ましい。
また、上記植物抽出物を含有する皮膚外用剤の使用量は、有効成分の含有量により異なるが、例えばクリーム状、軟膏状の場合、皮膚面１ｃｍ^２当たり０．１μｇ以上が好ましく、５μｇ以下が好ましい。液状製剤の場合、同じく０．１μｇ以上が好ましく、１０μｇ以下使用するのが好ましい。

医薬品の形態で使用する場合は、例えば、錠剤、被覆錠剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤等の経口用固形製剤や、内服液剤、シロップ剤等の経口用液体製剤とすることができる。
なお、経口用固形製剤を調製する場合は、有効成分である上記植物抽出物と、賦形剤、必要に応じて結合剤、崩壊剤、滑沢剤、希釈剤、浸透圧調整剤、ｐＨ調整剤、乳化剤、防腐剤、安定剤、酸化防止剤、着色剤、紫外線吸収剤、保湿剤、増粘剤、光沢剤、矯味剤、矯臭剤等とを混合した後、常法により錠剤、被覆錠剤、顆粒剤、散剤、カプセル等を製造することができる。また、経口用液体製剤を調製する場合は、有効成分である上記植物抽出物と、矯味剤、緩衝剤、安定化剤等とを混合した後、常法により内服液剤、シロップ剤等を製造することができる。
飲食品やペットフード等に配合して使用する場合は、一般飲食品の他、エンドセリンの作用により発症し、エンドセリンの作用抑制が治療に有効な症状の予防若しくは改善をコンセプトとし、必要に応じてその旨を表示した美容食品、病者用食品、栄養機能食品又は特定保健用食品等の機能性飲食品の形態とすることができる。

医薬品の形態で使用する場合、有効成分である上記植物抽出物が医薬品中に固形分濃度で、０．００００１質量％以上含まれることが好ましく、０．０００１質量％以上含まれることがより好ましく、０．００１質量％以上含まれることがさらに好ましい。また、上記抽出物が医薬品中に固形分濃度で、１０質量％以下含まれることが好ましく、５質量％以下含まれることがより好ましい。より具体的な含有量は、０．００００１〜１０質量％が好ましく、０．０００１〜１０質量％がより好ましく、０．００１〜５質量％がさらに好ましい。
飲食品やペットフード等に配合する場合は、有効成分である上記植物抽出物が固形分濃度で、０．００００１質量％以上含まれることが好ましく、０．０００１質量％以上含まれることがより好ましく、０．００１質量％以上含まれることがさらに好ましい。また、上記抽出物が固形分濃度で、１０質量％以下含まれることが好ましく、５質量％以下含まれることがより好ましい。より具体的な含有量は、０．００００１〜１０質量％が好ましく、０．０００１〜１０質量％がより好ましく、０．００１〜５質量％がさらに好ましい。
また、これらの医薬品や食品等の投与又は摂取量は、個体の状態、体重、性別、年齢、又はその他の要因に従って変動し得るものであるが、目安として、１日最大１０ｇ以下である。

上述した実施形態に関し、本発明はさらに以下のエンドセリン作用抑制剤、美白剤、血管収縮抑制剤、方法及び用途を開示する。

＜１＞ヒッコリー・バーク、ホロピト、ライフ・エバーラスティング・フラワー、及びジャマイカン・ドッグウッドからなる群より選ばれる少なくとも１種の抽出物を有効成分として含有するエンドセリン作用抑制剤。
＜２＞前記有効成分の含有量が固形分換算で０．００００１質量％以上５０質量％以下である、前記＜１＞項記載のエンドセリン作用抑制剤。
＜３＞ヒッコリー・バーク、ホロピト、ライフ・エバーラスティング・フラワー、及びジャマイカン・ドッグウッドからなる群より選ばれる少なくとも１種の抽出物を、エンドセリン作用抑制剤として使用する方法。
＜４＞エンドセリン作用抑制剤としての、ヒッコリー・バーク、ホロピト、ライフ・エバーラスティング・フラワー、及びジャマイカン・ドッグウッドからなる群より選ばれる少なくとも１種の抽出物の使用。
＜５＞エンドセリン作用抑制のための、ヒッコリー・バーク、ホロピト、ライフ・エバーラスティング・フラワー、及びジャマイカン・ドッグウッドからなる群より選ばれる少なくとも１種の抽出物の非医薬的な使用。
＜６＞エンドセリン作用抑制剤の製造のための、ヒッコリー・バーク、ホロピト、ライフ・エバーラスティング・フラワー、及びジャマイカン・ドッグウッドからなる群より選ばれる少なくとも１種の抽出物の使用。
＜７＞エンドセリン作用抑制のために用いる、ヒッコリー・バーク、ホロピト、ライフ・エバーラスティング・フラワー、及びジャマイカン・ドッグウッドからなる群より選ばれる少なくとも１種の抽出物。
＜８＞ヒッコリー・バーク、ホロピト、ライフ・エバーラスティング・フラワー、及びジャマイカン・ドッグウッドからなる群より選ばれる少なくとも１種の抽出物を投与又は皮膚に適用することを含む、エンドセリン作用を抑制する方法。
＜９＞前記エンドセリン作用抑制剤中の、前記植物抽出物の含有量が固形分換算で０．００００１質量％以上５０質量％以下である、前記＜３＞、＜４＞及び＜６＞のいずれか１項記載の方法又は使用。

＜１０＞ヒッコリー・バーク、ホロピト、及びライフ・エバーラスティング・フラワーからなる群より選ばれる少なくとも１種の抽出物を有効成分として含有する美白剤。
＜１１＞前記有効成分の含有量が固形分換算で０．００００１質量％以上５０質量％以下である、前記＜１＞項記載の美白剤。
＜１２＞ヒッコリー・バーク、ホロピト、及びライフ・エバーラスティング・フラワーからなる群より選ばれる少なくとも１種の抽出物を、美白剤として使用する方法。
＜１３＞美白剤としての、ヒッコリー・バーク、ホロピト、及びライフ・エバーラスティング・フラワーからなる群より選ばれる少なくとも１種の抽出物の使用。
＜１４＞美白のための、ヒッコリー・バーク、ホロピト、及びライフ・エバーラスティング・フラワーからなる群より選ばれる少なくとも１種の抽出物の非医薬的な使用。
＜１５＞美白剤の製造のための、ヒッコリー・バーク、ホロピト、及びライフ・エバーラスティング・フラワーからなる群より選ばれる少なくとも１種の抽出物の使用。
＜１６＞美白のために用いる、ヒッコリー・バーク、ホロピト、及びライフ・エバーラスティング・フラワーからなる群より選ばれる少なくとも１種の抽出物。
＜１７＞ヒッコリー・バーク、ホロピト、及びライフ・エバーラスティング・フラワーからなる群より選ばれる少なくとも１種の抽出物を投与又は皮膚に適用することを含む、美白方法。
＜１８＞前記美白剤中の、前記植物抽出物の含有量が固形分換算で０．００００１質量％以上５０質量％以下である、前記＜１２＞、＜１３＞及び＜１５＞のいずれか１項記載の方法又は使用。

＜１９＞ヒッコリー・バーク、ホロピト、ライフ・エバーラスティング・フラワー、及びジャマイカン・ドッグウッドからなる群より選ばれる少なくとも１種の抽出物を有効成分として含有する血管収縮抑制剤。
＜２０＞前記有効成分の含有量が固形分換算で０．００００１質量％以上５０質量％以下である、前記＜１＞項記載の血管収縮抑制剤。
＜２１＞ヒッコリー・バーク、ホロピト、ライフ・エバーラスティング・フラワー、及びジャマイカン・ドッグウッドからなる群より選ばれる少なくとも１種の抽出物を、血管収縮抑制剤として使用する方法。
＜２２＞血管収縮抑制剤としての、ヒッコリー・バーク、ホロピト、ライフ・エバーラスティング・フラワー、及びジャマイカン・ドッグウッドからなる群より選ばれる少なくとも１種の抽出物の使用。
＜２３＞血管収縮抑制のための、ヒッコリー・バーク、ホロピト、ライフ・エバーラスティング・フラワー、及びジャマイカン・ドッグウッドからなる群より選ばれる少なくとも１種の抽出物の非医薬的な使用。
＜２４＞血管収縮抑制剤の製造のための、ヒッコリー・バーク、ホロピト、ライフ・エバーラスティング・フラワー、及びジャマイカン・ドッグウッドからなる群より選ばれる少なくとも１種の抽出物の使用。
＜２５＞血管収縮抑制のために用いる、ヒッコリー・バーク、ホロピト、ライフ・エバーラスティング・フラワー、及びジャマイカン・ドッグウッドからなる群より選ばれる少なくとも１種の抽出物。
＜２６＞ヒッコリー・バーク、ホロピト、ライフ・エバーラスティング・フラワー、及びジャマイカン・ドッグウッドからなる群より選ばれる少なくとも１種の抽出物を投与又は皮膚に適用することを含む、血管収縮を抑制する方法。
＜２７＞前記血管収縮抑制剤中の、前記植物抽出物の含有量が固形分換算で０．００００１質量％以上５０質量％以下である、前記＜２１＞、＜２２＞及び＜２４＞のいずれか１項記載の方法又は使用。

以下、本発明を実施例に基づきさらに詳細に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。

製造例１．ヒッコリー・バーク（Carya alba）抽出物の調製
（１）５０％エタノール抽出物の調製
ヒッコリー・バークの樹皮（新和物産（株）より入手）５０ｇに５０％エタノール溶液５００ｍＬを加えて室温で１５日間抽出し、ろ過後、減圧下で溶媒を留去し、ヒッコリー・バークの抽出物２．７６ｇを得た。得られた抽出物を５０％エタノール溶液に溶解し、濃度１％（ｗ／ｖ）溶液を調製して後述の評価に供した。

（２）９５％エタノール抽出物の調製
ヒッコリー・バークの樹皮（新和物産（株）より入手）５０ｇに９５％エタノール溶液５００ｍＬを加えて室温で１５日間抽出し、ろ過後、減圧下で溶媒を留去し、ヒッコリー・バークの抽出物２．１０ｇを得た。得られた抽出物を９５％エタノール溶液に溶解し、濃度１％（ｗ／ｖ）溶液を調製して後述の評価に供した。

製造例２．ホロピト（Pseudowintera colorata）抽出物の調製
（１）５０％エタノール抽出物の調製
ホロピトの葉（新和物産（株）より入手）５０ｇに５０％エタノール溶液５００ｍＬを加えて室温で１５日間抽出し、ろ過後、減圧下で溶媒を留去し、ホロピトの抽出物５．４１ｇを得た。得られた抽出物を５０％エタノール溶液に溶解し、濃度１％（ｗ／ｖ）溶液を調製して後述の評価に供した。

（２）９５％エタノール抽出物の調製
ホロピトの葉（新和物産（株）より入手）５０ｇに９５％エタノール溶液５００ｍＬを加えて室温で１５日間抽出し、ろ過後、減圧下で溶媒を留去し、ホロピトの抽出物４．５４ｇを得た。得られた抽出物を９５％エタノール溶液に溶解し、濃度１％（ｗ／ｖ）溶液を調製して後述の評価に供した。

製造例３．ライフ・エバーラスティング・フラワー（Helichrysum stoechas）抽出物の調製
（１）５０％エタノール抽出物の調製
ライフ・エバーラスティング・フラワーの花部（新和物産（株）より入手）５０ｇに５０％エタノール溶液５００ｍＬを加えて室温で１５日間抽出し、ろ過後、減圧下で溶媒を留去し、ライフ・エバーラスティング・フラワーの抽出物３．８７ｇを得た。得られた抽出物を５０％エタノール溶液に溶解し、濃度１％（ｗ／ｖ）溶液を調製して後述の評価に供した。

（２）９５％エタノール抽出物の調製
ライフ・エバーラスティング・フラワーの花部（新和物産（株）より入手）５０ｇに９５％エタノール溶液５００ｍＬを加えて室温で１５日間抽出し、ろ過後、減圧下で溶媒を留去し、ライフ・エバーラスティング・フラワーの抽出物２．２３ｇを得た。得られた抽出物を９５％エタノール溶液に溶解し、濃度１％（ｗ／ｖ）溶液を調製して後述の評価に供した。

製造例４．ジャマイカン・ドッグウッド（Piscidia erythrina）抽出物の調製
（１）５０％エタノール抽出物の調製
ジャマイカン・ドッグウッドの樹皮（新和物産（株）より入手）５０ｇに５０％エタノール溶液５００ｍＬを加えて室温で１５日間抽出し、ろ過後、減圧下で溶媒を留去し、ジャマイカン・ドッグウッドの抽出物１．８３ｇを得た。得られた抽出物を５０％エタノール溶液に溶解し、濃度１％（ｗ／ｖ）溶液を調製して後述の評価に供した。

（２）９５％エタノール抽出物の調製
ジャマイカン・ドッグウッドの樹皮（新和物産（株）より入手）５０ｇに９５％エタノール溶液５００ｍＬを加えて室温で１５日間抽出し、ろ過後、減圧下で溶媒を留去し、ジャマイカン・ドッグウッドの抽出物０．３０ｇを得た。得られた抽出物を９５％エタノール溶液に溶解し、濃度１％（ｗ／ｖ）溶液を調製して後述の評価に供した。

参考例１．ジャーマンカミツレ抽出物の調製
ジャーマンカミツレ（和名：カミツレ、新和物産（株）より入手）の花部４０ｇへ、５０％エタノール含有水溶液４００ｍＬを加え、室温で１４日間抽出後、濾過し、ジャーマンカミツレ抽出物（２２１ｍＬ）を得た（蒸発残分２．６３％）。

実施例１エンドセリン作用抑制効果の検証
上記製造例で調製した各抽出物について、下記の評価系を用いてエンドセリン作用抑制効果を検証した。
（１）評価系
正常ヒト新生児表皮由来メラノサイト（ＮＨＥＭｓ；クラボウ社）を、蛍光検出用の９６穴プレートに３×１０^４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ（２００μＬ／ｗｅｌｌ）で播種し、５％ＣＯ_２下にて３７℃で培養した。培地には、ＰＭＡ（−）の増殖用添加剤（ＨＭＧＳ）を含むＭｅｄｉｕｍ２５４を用いた。
３日間培養後、培養プレートからデカントで培地を除去し、細胞内Ｃａ^２＋＋測定試薬Ｆｌｕｏ４−ＡＭを含むアッセイバッファーに置換し、３７℃で１時間インキュベートした。次に、ＦＤＳＳ（Functional Drug Screening System）機器において測定開始２０秒後に所定濃度の上記抽出物を１分間前処理した後、リガンドであるエンドセリン（ＥＴ−１、終濃度１００ｎＭ）を添加し、Ｆｌｕｏ−４ＡＭの蛍光をＥｘ．４８０ｎｍ／Ｅｍ．５４０ｎｍの測定波長で測定開始から５分後まで経時的に検出した。
コントロールにおけるＦｌｕｏ４−ＡＭの蛍光増加比（Ｍａｘｒａｔｉｏ−Ｍｉｎｒａｔｉｏ）を１００とした場合の相対値（％）で、各抽出物の細胞内カルシウム（カルシウムイオン）濃度上昇率（％）を算出し、エンドセリン作用抑制効果を評価した。なお、コントロールとして、エタノール又は１０〜９５ｖ／ｖ％の含水エタノール溶液を終濃度０．１〜０．５ｖ／ｖ％で添加したものを用いた。

（２）参考例：ジャーマンカミツレ抽出物の評価
ポジティブコントロールとして、上記参考例１で調製したジャーマンカミツレ抽出物（蒸発残分２．６３％、５０％ＥｔＯＨ溶媒）を用いた。ジャーマンカミツレエキスはエンドセリンの作用によるメラノサイトのＣａ濃度上昇を抑制し、メラニン産生を抑制することが知られている。
ジャーマンカミツレエキスを、０．５ｖ／ｖ％及び１．０ｖ／ｖ％の終濃度で前処理して上記評価系に供し、エンドセリン刺激によるカルシウム（Ｃａ）濃度上昇率を算出した（Ｎ＝６）。結果を図１に示す。
図１から明らかなように、ジャーマンカミツレエキスを添加した系では、濃度依存的なＣａ濃度上昇抑制作用が確認された。特に濃度が１ｖ／ｖ％の系では、２０％以上もＣａ濃度上昇が抑制され、優れたエンドセリン抑制作用が確認された。

（３）本発明の抽出物の評価
上記製造例１〜４にて調製した各抽出物（蒸発残分１ｗ／ｖ％）を、０．２％又は０．５％（ｖ／ｖ）の終濃度で前処理して上記評価系に供し、エンドセリン刺激によるＣａ濃度上昇率を算出した（Ｎ＝６）。結果を表１に示す。

表１から明らかなように、ヒッコリー・バーク、ホロピト、ライフ・エバーラスティング・フラワー、ジャマイカン・ドッグウッドの抽出物を添加した系ではいずれも、エンドセリン刺激による細胞内Ｃａ濃度上昇が抑制されていた。すなわち、本発明で用いるヒッコリー・バーク、ホロピト、ライフ・エバーラスティング・フラワー、ジャマイカン・ドッグウッドの抽出物は、細胞内Ｃａ濃度上昇を抑制するという優れたエンドセリン抑制作用を有していた。

Claims

ヒッコリー・バーク（Carya alba）、ホロピト（Pseudowintera colorata）、及びライフ・エバーラスティング・フラワー（Helichrysum stoechas）からなる群より選ばれる少なくとも１種の抽出物を有効成分として含有するエンドセリン作用抑制剤。
ヒッコリー・バーク（Carya alba）、ホロピト（Pseudowintera colorata）、及びライフ・エバーラスティング・フラワー（Helichrysum stoechas）からなる群より選ばれる少なくとも１種の抽出物を有効成分として含有する美白剤。