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JP6004594B2 - 可溶性メディエーター - Google Patents

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Description

発明の分野
本開示は、全体として、T細胞活性化を抑制できる細胞集団および可溶性メディエーター、ならびにエフェクターT細胞の機能によって媒介される疾患または状態の治療などにおけるT細胞活性化を抑制するためのこのような細胞集団および可溶性メディエーターの使用に関する。本開示はまた、エフェクターT細胞の機能によって媒介される疾患または状態に対する対象の易罹患性を示すマーカーの存在を対象において検出する方法にも関する。
発明の背景
調節性T細胞(Treg細胞;サプレッサーT細胞としても公知)は、免疫恒常性を維持し、自己免疫疾患を防ぐのに役立つ、T細胞の亜集団である(Sakaguchi et al., 2008; Shevach, 2006; Vignali et al., 2008)。Treg細胞に対する関心は、転写因子FoxP3によってプログラムされているプロトタイプのCD4+CD25+Treg細胞に主に集中している(Fontenot et al., 2003; Hori et al., 2003)。休止状態の多特異性集団において、これらのTreg細胞は、他のT細胞の活性化、増殖、および機能を抑制する胸腺由来「天然」細胞および誘導された「適応」細胞の両方としてマウスにおいて特徴付けられている(Sakaguchi et al., 2008; Shevach, 2006)。しかし、ヒト血液においては、CD4+Treg細胞をFoxP3発現によって区別することは、それほど信頼性がない(Roncarolo and Gregori, 2008; Allan et al., 2007; Gavin et al., 2006)。すなわち、ナイーブ細胞またはメモリー細胞のいずれかのマーカーを有するCD4+T細胞は、FoxP3をそれぞれ低発現および高発現するにもかかわらず、同様のサプレッサー機能を有することが示された(Miyara et al., 2009)。IL-7受容体であるCD127の発現低下のようなヒトCD4+CD25+FoxP3+Treg細胞の他の表面マーカー(Liu et al., 2006; Seddiki et al., 2006)は、Treg細胞に特異的ではない。
特異的細胞表面マーカーが不足していることとは別に、CD4+CD25+FoxP3+Treg細胞による抑制の根拠を成すメカニズムは、依然として議論の的になっている。マウスにおいて、エクスビボでの抑制は、細胞間接触を必要とすることが示されているが、多数のメカニズムに帰されている(Vignali et al., 2008; Shevach, 2009; Sakaguchi et al., 2009);類似のヒトTreg細胞の機能については分かっていることがさらに少ない。さらに、提唱されているサプレッサー機能メカニズムが異なるCD4+Treg細胞およびCD8+Treg細胞の両方の他のタイプも、様々な組織部位または疾患との関連で説明されている(Vignali et al., 2008)。
自己抗原の投与によって誘導されるTreg細胞は、ある種の動物モデルにおいていくつかの自己免疫疾患を防ぐことが示されている(von Herrath and Harrison, 2003にその総説がある)。例えば、1型糖尿病(T1D)の非肥満糖尿病(NOD)マウスモデルにおいて、インスリンなどの膵島自己抗原(Bergerot et al., 1994)もしくはグルタミン酸デカルボキシラーゼ65(GAD65)(Tisch et al., 1999)の投与によって誘導されたCD4+Treg細胞、またはプロインスリン(Every et al., 2006)もしくは推定上の膵島抗原(Tang et al., 2004)によって誘導されたCD4+Treg細胞の移入が、自己免疫性糖尿病を防ぐことが示されている。しかし、これらのモデルにおいて、Treg細胞は、休止状態の多特異性集団において研究されており、特定の抗原に宿主が応答している間には研究されていない。最近、プロインスリン特異的ヒトCD4+T細胞クローンおよびGAD65特異的ヒトCD4+T細胞クローンが作製され、インビトロでのそれらのサプレッサー機能に基づいてTregクローンが区別された(Dromey et al., 2011)。細胞表面膜アンカー型糖タンパク質CD52は、これらの増殖させたCD4+Tregクローンにおいて上方調節されていることが示された。しかし、免疫抑制のメカニズムの特徴はこれまでに明らかにされていない。
本発明者らは、Treg細胞抑制の可溶性メディエーターを同定した。したがって、本開示は、
(i) 可溶性CD52糖タンパク質、
(ii) 第1のタンパク質としての可溶性CD52糖タンパク質および第2のタンパク質を含む、融合タンパク質;
(iii) 成分(i)の可溶性CD52糖タンパク質のペプチド部分または成分(ii)の融合タンパク質のペプチド部分をコードする、ポリヌクレオチド;
(iv) 成分(iii)のポリヌクレオチドを含むベクター;
(v) 成分(iii)のポリヌクレオチドまたは成分(iv)のベクターを含む、単離された細胞;
(vi) 可溶性CD52糖タンパク質を産生することができる、単離されたCD52hi細胞;
(vii) 可溶性CD52糖タンパク質を産生することができる複数のCD52hi細胞を含む、単離された細胞集団;
(viii)成分(vi)の細胞または成分(vii)の細胞集団を含む細胞培養物から単離された、可溶性CD52糖タンパク質を含む細胞培養培地またはその画分;ならびに
(ix) 細胞による可溶性CD52糖タンパク質の発現レベルを上昇させることができる作用物質;
のうちのいずれか1つまたは複数
ならびに薬学的に許容される担体
を含む、薬学的組成物を提供する。
好ましい態様において、可溶性CD52糖タンパク質は、
Figure 0006004594
のうちのいずれか1つまたは複数のアミノ酸配列と少なくとも60％同一であるアミノ酸配列および糖質を含む。より好ましくは、糖タンパク質は、SEQ ID NO: 3、4、5、6、または7で特定されるアミノ酸配列のうちのいずれか1つまたは複数と少なくとも65％、少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％同一であるか、または100％同一であるアミノ酸配列を含む。
1つの例において、糖タンパク質は、ヒト可溶性CD52断片に相当するSEQ ID NO: 3のアミノ酸配列と少なくとも60％、少なくとも65％、少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％同一であるか、または100％同一であるアミノ酸配列を含む。
好ましくは、可溶性CD52糖タンパク質、融合タンパク質、ポリヌクレオチド、ベクター、細胞、細胞集団、細胞培養培地、および作用物質のうちのいずれか1つまたは複数が、エフェクターT細胞の機能および/または免疫応答を抑制するのに十分な量で存在する。
さらなる態様において、可溶性CD52糖タンパク質、融合タンパク質、ポリヌクレオチド、ベクター、細胞、細胞集団、細胞培養培地、および作用物質は、免疫応答の抑制によって少なくとも1つの抗原（例えば自己抗原）に対する寛容性がもたらされるのに十分な量で存在する。
別の態様において、可溶性CD52糖タンパク質、融合タンパク質、細胞、細胞集団、細胞培養培地、および作用物質のうちのいずれか1つまたは複数は、エフェクターT細胞の機能を抑制することができ、かつ/または自己抗原に対する免疫応答などの免疫応答を軽減することができる。
ある態様において、組成物は、可溶性CD52糖タンパク質、融合タンパク質、細胞培養培地、または作用物質のうちの1つまたは複数を含み、粘膜投与および/または経皮投与用に製剤化される。
さらなる態様において、組成物は、インスリンおよび/または自己抗原をさらに含む。
本開示はまた、第1のタンパク質としての可溶性CD52糖タンパク質および第2のタンパク質を含む融合タンパク質も提供する。
好ましくは、融合タンパク質の可溶性CD52糖タンパク質は、SEQ ID NO: 3、4、5、6、または7で特定されるアミノ酸配列のうちのいずれか1つまたは複数と少なくとも60％、少なくとも65％、少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％同一であるか、または100％同一であるアミノ酸配列を含む。
好ましくは、融合タンパク質は、エフェクターT細胞の機能を抑制することができ、かつ/または自己抗原に対する免疫応答などの免疫応答を軽減することができる。ある態様において、融合タンパク質は、少なくとも1つの抗原（例えば自己抗原）に対する寛容性がもたらされる程度まで、免疫応答を軽減する。
第2のタンパク質は、可溶性CD52糖タンパク質の安定性および/もしくは溶解性を増大させること、組換え法による可溶性CD52糖タンパク質の作製プロセスをより良くすること、または可溶性CD52糖タンパク質の治療的効果を高めることができる任意のタンパク質であってよい。1つの例において、第2のタンパク質は、Fcなどの抗体断片を含んでよい。
好ましくは、融合タンパク質は可溶性である。
本開示はまた、本明細書において開示する融合タンパク質をコードする単離されたポリヌクレオチドまたは組換えポリヌクレオチドも提供する。
本開示はまた、本明細書において開示するポリヌクレオチドを含むベクターも提供する。
本開示はまた、本明細書において開示するポリヌクレオチドおよび/またはベクターを含む単離された細胞も提供する。細胞は、哺乳動物細胞であってよい。1つの例において、細胞はHEK293T細胞である。別の例において、細胞はDaudi Bリンパ芽球細胞である。
さらに、本開示は、グリコシル化を可能にする条件下で、本明細書において開示するポリヌクレオチドまたはベクターを発現させる段階を含む、融合タンパク質を作製する方法も提供する。
ある態様において、グリコシル化を可能にする条件は、哺乳動物細胞などの宿主細胞において融合タンパク質を発現させることを含む。
本開示はまた、エフェクターT細胞の機能を抑制するため、かつ/または自己抗原に対する免疫応答などの免疫応答を軽減するための、以下のうちのいずれか1つまたは複数の使用も提供する:
(i) 可溶性CD52糖タンパク質、
(ii) 第1のタンパク質としての可溶性CD52糖タンパク質および第2のタンパク質を含む、融合タンパク質;
(iii) 成分(i)の可溶性CD52糖タンパク質のペプチド部分または成分(ii)の融合タンパク質のペプチド部分をコードする、ポリヌクレオチド;
(iv) 成分(iii)のポリヌクレオチドを含むベクター;
(v) 成分(iii)のポリヌクレオチドまたは成分(iv)のベクターを含む、単離された細胞;
(vi) 可溶性CD52糖タンパク質を産生することができる、単離されたCD52hi細胞;
(vii) 可溶性CD52糖タンパク質を産生することができる複数のCD52hi細胞を含む、単離された細胞集団;
(viii)成分(vi)の細胞または成分(vii)の細胞集団を含む細胞培養物から単離された、可溶性CD52糖タンパク質を含む細胞培養培地またはその画分;
(ix) 細胞による可溶性CD52糖タンパク質の発現レベルを上昇させることができる作用物質;ならびに
(x) 本発明の薬学的組成物。
本開示はまた、エフェクターT細胞の機能によって媒介される疾患もしくは状態、炎症または敗血症を対象において治療または予防する方法であって、以下のうちのいずれか1つまたは複数の治療的有効量を対象に投与する段階を含む、方法も提供する:
(i) 可溶性CD52糖タンパク質、
(ii) 第1のタンパク質としての可溶性CD52糖タンパク質および第2のタンパク質を含む、融合タンパク質;
(iii) 成分(i)の可溶性CD52糖タンパク質のペプチド部分または成分(ii)の融合タンパク質のペプチド部分をコードする、ポリヌクレオチド;
(iv) 成分(iii)のポリヌクレオチドを含むベクター;
(v) 成分(iii)のポリヌクレオチドまたは成分(iv)のベクターを含む、単離された細胞;
(vi) 可溶性CD52糖タンパク質を産生することができる、単離されたCD52hi細胞;
(vii) 可溶性CD52糖タンパク質を産生することができる複数のCD52hi細胞を含む、単離された細胞集団;
(viii)成分(vi)の細胞または成分(vii)の細胞集団を含む細胞培養物から単離された、可溶性CD52糖タンパク質を含む細胞培養培地またはその画分;
(ix) 細胞による可溶性CD52糖タンパク質の発現レベルを上昇させることができる作用物質;ならびに
(x) 本発明の薬学的組成物。
ある態様において、可溶性CD52糖タンパク質、融合タンパク質、細胞培養培地、作用物質、または組成物は、粘膜部位または経皮部位に投与される。
本開示はまた、エフェクターT細胞の機能によって媒介される疾患もしくは状態、炎症または敗血症の治療または予防において使用するための、以下のうちのいずれか1つまたは複数も提供する:
(i) 可溶性CD52糖タンパク質、
(ii) 第1のタンパク質としての可溶性CD52糖タンパク質および第2のタンパク質を含む、融合タンパク質;
(iii) 成分(i)の可溶性CD52糖タンパク質のペプチド部分または成分(ii)の融合タンパク質のペプチド部分をコードする、ポリヌクレオチド;
(iv) 成分(iii)のポリヌクレオチドを含むベクター;
(v) 成分(iii)のポリヌクレオチドまたは成分(iv)のベクターを含む、単離された細胞;
(vi) 可溶性CD52糖タンパク質を産生することができる、単離されたCD52hi細胞;
(vii) 可溶性CD52糖タンパク質を産生することができる複数のCD52hi細胞を含む、単離された細胞集団;
(viii)成分(vi)の細胞または成分(vii)の細胞集団を含む細胞培養物から単離された、可溶性CD52糖タンパク質を含む細胞培養培地またはその画分;
(ix) 細胞による可溶性CD52糖タンパク質の発現レベルを上昇させることができる作用物質;ならびに
(x) 本発明の薬学的組成物。
さらに、本開示は、エフェクターT細胞の機能によって媒介される疾患もしくは状態、炎症または敗血症を治療または予防するための医薬の製造における、以下のうちのいずれか1つまたは複数の使用も提供する:
(i) 可溶性CD52糖タンパク質、
(ii) 第1のタンパク質としての可溶性CD52糖タンパク質および第2のタンパク質を含む、融合タンパク質;
(iii) 成分(i)の可溶性CD52糖タンパク質のペプチド部分または成分(ii)の融合タンパク質のペプチド部分をコードする、ポリヌクレオチド;
(iv) 成分(iii)のポリヌクレオチドを含むベクター;
(v) 成分(iii)のポリヌクレオチドまたは成分(iv)のベクターを含む、単離された細胞;
(vi) 可溶性CD52糖タンパク質を産生することができる、単離されたCD52hi細胞;
(vii) 可溶性CD52糖タンパク質を産生することができる複数のCD52hi細胞を含む、単離された細胞集団;
(viii)成分(vi)の細胞または成分(vii)の細胞集団を含む細胞培養物から単離された、可溶性CD52糖タンパク質を含む細胞培養培地またはその画分;
(ix) 細胞による可溶性CD52糖タンパク質の発現レベルを上昇させることができる作用物質;ならびに
(x) 本発明の薬学的組成物。
ある態様において、医薬は、粘膜部位または経皮部位に投与するために製剤化される。
1つの例において、エフェクターT細胞の機能によって媒介される疾患は、I型糖尿病または関節リウマチなどの自己免疫疾患である。別の例において、エフェクターT細胞の機能によって媒介される状態は、同種移植拒絶または移植片対宿主反応である。
本開示はまた、エフェクターT細胞の機能によって媒介される疾患もしくは状態、炎症または敗血症の発症に対する対象の易罹患性を診断する方法であって、
対象から得られた試料中の可溶性CD52糖タンパク質のレベルを検出する段階;および
対象から得られた試料中で検出された可溶性CD52糖タンパク質のレベルを、1名または複数名の健常者から決定された基準レベルと比較する段階を含み、
対象から得られた試料中で検出された可溶性CD52糖タンパク質のレベルが基準レベルと比べて低い場合、エフェクターT細胞の機能によって媒介される疾患もしくは状態、炎症または敗血症の発症に対する対象の易罹患性が高まっていることが示される、方法も提供する。
本開示はまた、エフェクターT細胞の機能によって媒介される疾患もしくは状態、炎症または敗血症の発症に対する対象の易罹患性を診断する方法であって、
対象から得られた試料中のCD52hi細胞の出現率を検出する段階;および
対象から得られた試料中で検出されたCD52hi細胞の出現率を、1名または複数名の健常者から決定された基準レベルと比較する段階を含み、
対象から得られた試料中で検出されたCD52hi細胞の出現率が基準レベルと比べて低い場合、エフェクターT細胞の機能によって媒介される疾患もしくは状態、炎症または敗血症の発症に対する対象の易罹患性が高まっていることが示される、方法も提供する。
本開示はまた、エフェクターT細胞の機能によって媒介される疾患もしくは状態、炎症または敗血症の発症に対する対象の易罹患性を診断する方法であって、
対象から得られた試料中のCD52hi細胞の活性を検出する段階;および
対象から得られた試料中で検出されたCD52hi細胞の活性を、1名または複数名の健常者から決定された基準レベルと比較する段階を含み、
対象から得られた試料中で検出されたCD52hi細胞の活性が基準レベルと比べて低下している場合、エフェクターT細胞の機能によって媒介される疾患もしくは状態、炎症または敗血症の発症に対する対象の易罹患性が高まっていることが示される、方法も提供する。
1つの例において、CD52hi細胞の出現率は、試料中の膜結合型CD52のレベルを検出することによって、試料中のCD52タンパク質の発現レベルを検出することによって、かつ/または試料中のCD52 mRNAの発現レベルを検出することによって、測定される。
ある態様において、試料は、抗原が投与された対象から得られる。
別の態様において、試料は、対象の局部的な疾患部位から得られる。
本開示はまた、薬物スクリーニング試験への登録に対する対象の適性を判定する方法であって、本発明の方法を実施する段階、および基準試料よりも対象の可溶性CD52糖タンパク質のレベルが低いか、CD52hi細胞の出現率が低いか、またはCD52hi細胞の活性が低下している場合、その対象は薬物スクリーニング試験への登録により適していると認定する段階を含む、方法も提供する。例えば、薬物スクリーニング試験は、抗糖尿病薬スクリーニング試験である。
さらに、本開示はまた、可溶性CD52糖タンパク質のエフェクターT細胞抑制機能および/または免疫応答抑制機能を模倣することができる作用物質を同定する方法であって、試験物質がエフェクターT細胞の機能および/または免疫応答を抑制するかどうかを判定する段階を含む、方法も提供する。
本開示はまた、エフェクターT細胞の機能によって媒介される疾患もしくは状態、炎症または敗血症を治療または予防するための潜在的な治療剤を同定する方法であって、試験物質をCD52hi細胞またはCD52hi細胞集団と接触させる段階、ならびにその細胞もしくは細胞集団によって産生された可溶性CD52糖タンパク質のレベル、CD52hi細胞の出現率、および/またはCD52hi細胞の活性のうちのいずれか1つまたは複数を検出する段階、ならびに可溶性CD52糖タンパク質のレベル、CD52hi細胞の出現率、および/またはCD52hi細胞の活性が試験物質との接触後に高くなっている場合、エフェクターT細胞の機能によって媒介される疾患もしくは状態、炎症または敗血症を治療または予防するための潜在的な治療剤として試験物質を同定する段階を含む、方法も提供する。
本明細書において説明する任意の態様の特徴は、別段の記載が特に無い限り、必要な変更を加えて、他の任意の態様に適用されるとみなされるものとする。
本開示は、単に例証のみを目的としたものである本明細書において説明する特定の態様によって範囲を限定されるべきではない。機能的に等価な製品、組成物、および方法は、本明細書において説明するように、明らかに本発明の範囲内にある。
本明細書を通して、別段の記載が特に無い限り、または文脈において別段の指示が無い限り、単一の段階、組成物、段階群、または組成物群への言及は、1つおよび複数(すなわち、1つまたは複数)のそれらの段階、組成物、段階群、または組成物群を包含するとみなされるものとする。
[本発明1001]
以下のうちのいずれか1つまたは複数と、薬学的に許容される担体とを含む、薬学的組成物：
(i) 可溶性CD52糖タンパク質、
(ii) 第1のタンパク質としての可溶性CD52糖タンパク質および第2のタンパク質を含む、融合タンパク質;
(iii) 成分(i)の可溶性CD52糖タンパク質のペプチド部分または成分(ii)の融合タンパク質のペプチド部分をコードする、ポリヌクレオチド;
(iv) 成分(iii)のポリヌクレオチドを含むベクター;
(v) 成分(iii)のポリヌクレオチドまたは成分(iv)のベクターを含む、単離された細胞;
(vi) 可溶性CD52糖タンパク質を産生することができる、単離されたCD52 hi 細胞;
(vii) 可溶性CD52糖タンパク質を産生することができる複数のCD52 hi 細胞を含む、単離された細胞集団;
(viii)成分(vi)の細胞または成分(vii)の細胞集団を含む細胞培養物から単離された、可溶性CD52糖タンパク質を含む細胞培養培地またはその画分;ならびに
(ix) 細胞による可溶性CD52糖タンパク質の発現レベルを上昇させることができる作用物質。
[本発明1002]
前記可溶性CD52糖タンパク質が、
Figure 0006004594
のうちのいずれか1つまたは複数のアミノ酸配列と少なくとも60％同一であるアミノ酸配列および糖質を含む、本発明1001の薬学的組成物。
[本発明1003]
前記糖タンパク質が、SEQ ID NO: 3、4、5、6、または7で特定されるアミノ酸配列のうちのいずれか1つまたは複数と少なくとも65％、少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％同一であるか、または100％同一であるアミノ酸配列を含む、本発明1001の薬学的組成物。
[本発明1004]
前記可溶性CD52糖タンパク質、融合タンパク質、ポリヌクレオチド、ベクター、細胞、細胞集団、細胞培養培地、および作用物質のうちのいずれか1つまたは複数が、エフェクターT細胞の機能および/または免疫応答を抑制するのに十分な量で存在する、前記本発明のいずれかの薬学的組成物。
[本発明1005]
前記可溶性CD52糖タンパク質の糖質部分が、そのアミノ酸配列中にアスパラギン残基、セリン残基、トレオニン残基、チロシン残基、ヒドロキシリジン残基、ヒドロキシプロリン残基、ホスホセリン残基、またはトリプトファン残基が存在する場合、1つまたは複数の該残基に結合している、前記本発明のいずれかの薬学的組成物。
[本発明1006]
前記可溶性CD52糖タンパク質の糖質部分が、SEQ ID NO: 3のアスパラギン(N)残基に結合している、前記本発明のいずれかの薬学的組成物。
[本発明1007]
前記可溶性CD52糖タンパク質の糖質部分が、宿主リンパ球または宿主生殖器細胞などの宿主細胞中の可溶性CD52糖タンパク質の細胞外部分に結合することが公知である任意の糖質である、前記本発明のいずれかの薬学的組成物。
[本発明1008]
前記可溶性CD52糖タンパク質の糖質部分が、末端にシアル酸が付加されていてもよい1つまたは複数の二分岐型、三分岐型、または四分岐型の糖を含む、前記本発明のいずれかの薬学的組成物。
[本発明1009]
前記可溶性CD52糖タンパク質、融合タンパク質、細胞、細胞集団、細胞培養培地、および作用物質のうちのいずれか1つまたは複数が、エフェクターT細胞の機能を抑制することができ、かつ/または免疫応答を軽減することができる、前記本発明のいずれかの薬学的組成物。
[本発明1010]
前記免疫応答が、自己抗原に対する免疫応答である、本発明1009の薬学的組成物。
[本発明1011]
前記融合タンパク質が、抗体断片を含む第2のタンパク質を含む、前記本発明のいずれかの薬学的組成物。
[本発明1012]
前記抗体断片がFcである、本発明1011の薬学的組成物。
[本発明1013]
前記可溶性CD52糖タンパク質、融合タンパク質、細胞培養培地、または作用物質のうちの1つまたは複数を含み、かつ粘膜投与および/または経皮投与用に製剤化されている、前記本発明のいずれかの薬学的組成物。
[本発明1014]
インスリンおよび/または自己抗原をさらに含む、前記本発明のいずれかの薬学的組成物。
[本発明1015]
第1のタンパク質としての可溶性CD52糖タンパク質および第2のタンパク質を含む、融合タンパク質。
[本発明1016]
前記可溶性CD52糖タンパク質が、SEQ ID NO: 3、4、5、6、または7で特定されるアミノ酸配列のうちのいずれか1つまたは複数と少なくとも60％、少なくとも65％、少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％同一であるか、または100％同一であるアミノ酸配列を含む、本発明1015の融合タンパク質。
[本発明1017]
前記可溶性CD52糖タンパク質の糖質部分が、そのアミノ酸配列中にアスパラギン残基、セリン残基、トレオニン残基、チロシン残基、ヒドロキシリジン残基、ヒドロキシプロリン残基、ホスホセリン残基、またはトリプトファン残基が存在する場合、1つまたは複数の該残基に結合している、本発明1015または本発明1016の融合タンパク質。
[本発明1018]
前記可溶性CD52糖タンパク質の糖質部分が、SEQ ID NO: 3のアスパラギン(N)残基に結合している、本発明1015〜1017のいずれかの融合タンパク質。
[本発明1019]
前記可溶性CD52糖タンパク質の糖質部分が、宿主リンパ球または宿主生殖器細胞などの宿主細胞中の可溶性CD52糖タンパク質の細胞外部分に結合することが公知である任意の糖質である、本発明1015〜1018のいずれかの融合タンパク質。
[本発明1020]
前記可溶性CD52糖タンパク質の糖質部分が、末端にシアル酸が付加されていてもよい1つまたは複数の二分岐型、三分岐型、または四分岐型の糖を含む、本発明1015〜1019のいずれかの融合タンパク質。
[本発明1021]
エフェクターT細胞の機能を抑制することができ、かつ/または免疫応答を軽減することができる、本発明1015〜1020のいずれかの融合タンパク質。
[本発明1022]
前記免疫応答が、自己抗原に対する免疫応答である、本発明1021の融合タンパク質。
[本発明1023]
前記第2のタンパク質が抗体断片を含む、本発明1015〜1022のいずれかの融合タンパク質。
[本発明1024]
前記抗体断片がFcである、本発明1023の融合タンパク質。
[本発明1025]
本発明1015〜1024のいずれかの融合タンパク質をコードする、単離されたポリヌクレオチドまたは組換えポリヌクレオチド。
[本発明1026]
本発明1025のポリヌクレオチドを含むベクター。
[本発明1027]
本発明1025のポリヌクレオチドまたは本発明1026のベクターを含む、単離された細胞。
[本発明1028]
グリコシル化を可能にする条件下で、本発明1025のポリヌクレオチドまたは本発明1026のベクターを発現させる段階を含む、本発明1015〜1024のいずれかの融合タンパク質を作製する方法。
[本発明1029]
グリコシル化を可能にする前記条件が、哺乳動物細胞などの宿主細胞において前記融合タンパク質を発現させることを含む、本発明1028の方法。
[本発明1030]
エフェクターT細胞の機能を抑制するため、かつ/または自己抗原に対する免疫応答などの免疫応答を軽減するための、以下のうちのいずれか1つまたは複数の使用:
(i) 可溶性CD52糖タンパク質、
(ii) 第1のタンパク質としての可溶性CD52糖タンパク質および第2のタンパク質を含む、融合タンパク質;
(iii) 成分(i)の可溶性CD52糖タンパク質のペプチド部分または成分(ii)の融合タンパク質のペプチド部分をコードする、ポリヌクレオチド;
(iv) 成分(iii)のポリヌクレオチドを含むベクター;
(v) 成分(iii)のポリヌクレオチドまたは成分(iv)のベクターを含む、単離された細胞;
(vi) 可溶性CD52糖タンパク質を産生することができる、単離されたCD52 hi 細胞;
(vii) 可溶性CD52糖タンパク質を産生することができる複数のCD52 hi 細胞を含む、単離された細胞集団;
(viii)成分(vi)の細胞または成分(vii)の細胞集団を含む細胞培養物から単離された、可溶性CD52糖タンパク質を含む細胞培養培地またはその画分;
(ix) 細胞による可溶性CD52糖タンパク質の発現レベルを上昇させることができる作用物質;ならびに
(x) 本発明1001〜1014のいずれかの薬学的組成物。
[本発明1031]
エフェクターT細胞の機能によって媒介される疾患もしくは状態、炎症または敗血症を対象において治療または予防する方法であって、以下のうちのいずれか1つまたは複数の治療的有効量を該対象に投与する段階を含む、前記方法:
(i) 可溶性CD52糖タンパク質、
(ii) 第1のタンパク質としての可溶性CD52糖タンパク質および第2のタンパク質を含む、融合タンパク質;
(iii) 成分(i)の可溶性CD52糖タンパク質のペプチド部分または成分(ii)の融合タンパク質のペプチド部分をコードする、ポリヌクレオチド;
(iv) 成分(iii)のポリヌクレオチドを含むベクター;
(v) 成分(iii)のポリヌクレオチドまたは成分(iv)のベクターを含む、単離された細胞;
(vi) 可溶性CD52糖タンパク質を産生することができる、単離されたCD52 hi 細胞;
(vii) 可溶性CD52糖タンパク質を産生することができる複数のCD52 hi 細胞を含む、単離された細胞集団;
(viii)成分(vi)の細胞または成分(vii)の細胞集団を含む細胞培養物から単離された、可溶性CD52糖タンパク質を含む細胞培養培地またはその画分;
(ix) 細胞による可溶性CD52糖タンパク質の発現レベルを上昇させることができる作用物質;ならびに
(x) 本発明1001〜1014のいずれかの薬学的組成物。
[本発明1032]
エフェクターT細胞の機能によって媒介される疾患もしくは状態、炎症または敗血症の治療または予防において使用するための、以下のうちのいずれか1つまたは複数:
(i) 可溶性CD52糖タンパク質、
(ii) 第1のタンパク質としての可溶性CD52糖タンパク質および第2のタンパク質を含む、融合タンパク質;
(iii) 成分(i)の可溶性CD52糖タンパク質のペプチド部分または成分(ii)の融合タンパク質のペプチド部分をコードする、ポリヌクレオチド;
(iv) 成分(iii)のポリヌクレオチドを含むベクター;
(v) 成分(iii)のポリヌクレオチドまたは成分(iv)のベクターを含む、単離された細胞;
(vi) 可溶性CD52糖タンパク質を産生することができる、単離されたCD52 hi 細胞;
(vii) 可溶性CD52糖タンパク質を産生することができる複数のCD52 hi 細胞を含む、単離された細胞集団;
(viii)成分(vi)の細胞または成分(vii)の細胞集団を含む細胞培養物から単離された、可溶性CD52糖タンパク質を含む細胞培養培地またはその画分;
(ix) 細胞による可溶性CD52糖タンパク質の発現レベルを上昇させることができる作用物質;ならびに
(x) 本発明1001〜1014のいずれかの薬学的組成物。
[本発明1033]
エフェクターT細胞の機能によって媒介される疾患もしくは状態、炎症または敗血症を治療または予防するための医薬の製造における、以下のうちのいずれか1つまたは複数の使用:
(i) 可溶性CD52糖タンパク質、
(ii) 第1のタンパク質としての可溶性CD52糖タンパク質および第2のタンパク質を含む、融合タンパク質;
(iii) 成分(i)の可溶性CD52糖タンパク質のペプチド部分または成分(ii)の融合タンパク質のペプチド部分をコードする、ポリヌクレオチド;
(iv) 成分(iii)のポリヌクレオチドを含むベクター;
(v) 成分(iii)のポリヌクレオチドまたは成分(iv)のベクターを含む、単離された細胞;
(vi) 可溶性CD52糖タンパク質を産生することができる、単離されたCD52 hi 細胞;
(vii) 可溶性CD52糖タンパク質を産生することができる複数のCD52 hi 細胞を含む、単離された細胞集団;
(viii)成分(vi)の細胞または成分(vii)の細胞集団を含む細胞培養物から単離された、可溶性CD52糖タンパク質を含む細胞培養培地またはその画分;
(ix) 細胞による可溶性CD52糖タンパク質の発現レベルを上昇させることができる作用物質;ならびに
(x) 本発明1001〜1014のいずれかの薬学的組成物。
[本発明1034]
エフェクターT細胞の機能によって媒介される前記疾患が、I型糖尿病または関節リウマチなどの自己免疫疾患である、本発明1031の方法、本発明1032の可溶性CD52糖タンパク質、融合タンパク質、ポリヌクレオチド、ベクター、細胞、細胞集団、細胞培養培地、作用物質、もしくは薬学的組成物、または本発明1033の使用。
[本発明1035]
エフェクターT細胞の機能によって媒介される前記状態が、同種移植拒絶または移植片対宿主反応である、本発明1031の方法、本発明1032の可溶性CD52糖タンパク質、融合タンパク質、ポリヌクレオチド、ベクター、細胞、細胞集団、細胞培養培地、作用物質、もしくは薬学的組成物、または本発明1033の使用。
[本発明1036]
前記可溶性CD52糖タンパク質、融合タンパク質、細胞培養培地、作用物質、または組成物が粘膜部位または経皮部位に投与される、本発明1031の方法、または本発明1032の可溶性CD52糖タンパク質、融合タンパク質、細胞培養培地、作用物質、もしくは薬学的組成物。
[本発明1037]
前記医薬が粘膜部位または経皮部位に投与するために製剤化されている、本発明1033の使用。
[本発明1038]
エフェクターT細胞の機能によって媒介される疾患もしくは状態、炎症または敗血症の発症に対する対象の易罹患性を診断する方法であって、
該対象から得られた試料中の可溶性CD52糖タンパク質のレベルを検出する段階;および
該対象から得られた試料中で検出された可溶性CD52糖タンパク質のレベルを、1名または複数名の健常者から決定された基準レベルと比較する段階
を含み、
該対象から得られた試料中で検出された可溶性CD52糖タンパク質のレベルが基準レベルと比べて低い場合、エフェクターT細胞の機能によって媒介される疾患もしくは状態、炎症または敗血症の発症に対する該対象の易罹患性が高まっていることが示される、前記方法。
[本発明1039]
エフェクターT細胞の機能によって媒介される疾患もしくは状態、炎症または敗血症の発症に対する対象の易罹患性を診断する方法であって、
対象から得られた試料中のCD52 hi 細胞の出現率を検出する段階;および
該対象から得られた試料中で検出されたCD52 hi 細胞の出現率を、1名または複数名の健常者から決定された基準レベルと比較する段階
を含み、
該対象から得られた試料中で検出されたCD52 hi 細胞の出現率が基準レベルと比べて低い場合、エフェクターT細胞の機能によって媒介される疾患もしくは状態、炎症または敗血症の発症に対する該対象の易罹患性が高まっていることが示される、前記方法。
[本発明1040]
エフェクターT細胞の機能によって媒介される疾患もしくは状態、炎症または敗血症の発症に対する対象の易罹患性を診断する方法であって、
対象から得られた試料中のCD52 hi 細胞の活性を検出する段階;および
該対象から得られた試料中で検出されたCD52 hi 細胞の活性を、1名または複数名の健常者から決定された基準レベルと比較する段階
を含み、
該対象から得られた試料中で検出されたCD52 hi 細胞の活性が基準レベルと比べて低下している場合、エフェクターT細胞の機能によって媒介される疾患もしくは状態、炎症または敗血症の発症に対する該対象の易罹患性が高まっていることが示される、前記方法。
[本発明1041]
CD52 hi 細胞の出現率が、前記試料中の膜結合型CD52のレベルを検出することによって、該試料中のCD52タンパク質の発現レベルを検出することによって、および/または該試料中のCD52 mRNAの発現レベルを検出することによって検出される、本発明1039の方法。
[本発明1042]
前記試料が、抗原が投与された対象から得られる、本発明1038〜1041のいずれかの方法。
[本発明1043]
前記試料が、前記対象の局部的な疾患部位から得られる、本発明1038〜1042のいずれかの方法。
[本発明1044]
薬物スクリーニング試験への登録に対する対象の適性を判定する方法であって、本発明1036〜1041のいずれかの方法を実施する段階、および、基準試料よりも、該対象の可溶性CD52糖タンパク質のレベルが低いか、CD52 hi 細胞の出現率が低いか、またはCD52 hi 細胞の活性が低下している場合、該対象は薬物スクリーニング試験への登録により適していると認定する段階を含む、前記方法。
[本発明1045]
前記薬物スクリーニング試験が抗糖尿病薬スクリーニング試験である、本発明1044の方法。
[本発明1046]
可溶性CD52糖タンパク質のエフェクターT細胞抑制機能および/または免疫応答抑制機能を模倣することができる作用物質を同定する方法であって、試験物質がエフェクターT細胞の機能および/または免疫応答を抑制するかどうかを判定する段階を含む、前記方法。
[本発明1047]
エフェクターT細胞の機能によって媒介される疾患もしくは状態、炎症または敗血症を治療または予防するための潜在的な治療剤を同定する方法であって、試験物質をCD52 hi 細胞またはCD52 hi 細胞集団と接触させる段階、ならびに該細胞もしくは細胞集団によって産生された可溶性CD52糖タンパク質のレベル、CD52 hi 細胞の出現率、および/またはCD52 hi 細胞の活性のうちのいずれか1つまたは複数を検出する段階、ならびに可溶性CD52糖タンパク質のレベル、CD52 hi 細胞の出現率、および/またはCD52 hi 細胞の活性が該試験物質との接触後に高くなっている場合、エフェクターT細胞の機能によって媒介される疾患もしくは状態、炎症または敗血症を治療または予防するための潜在的な治療剤として該試験物質を同定する段階を含む、前記方法。
以下の非限定的な実施例を用いて、かつ添付図面を参照して、以下に本発明を説明する。
GAD65特異的CD4+サプレッサーT細胞クローンは、より高いCD52発現を示す。(A)自己由来サプレッサークローンの存在下でのGAD65特異的T細胞クローンの増殖。使用したGAD65は、ヒト組換えグルタミン酸デカルボキシラーゼ65であった。一定数(25,000個)のGAD65特異的非Tregクローン(3.19)細胞を、GAD65および抗原提示細胞としての放射線照射済PBMC(100,000個)の存在下または非存在下で、漸増数の自己由来GAD65特異的Tregクローン(1.4)と同時培養した。72時間後に、3Hチミジン取込みを測定した。結果(三つ組の平均値±標準誤差)は、以前に説明されているように(Dromey et al., 2011)、自己由来サプレッサークローンおよび非サプレッサークローンの複数のペアを代表している。(B)活性化されたGAD65特異的サプレッサークローンの方が、より高いCD52発現を示す。プレートに結合させた抗CD3抗体による一晩の刺激後の自己由来GAD65特異的サプレッサー(実線) クローンおよび非サプレッサー(点線)クローンによるCD52発現のフローサイトメトリーヒストグラム。アイソタイプ対照抗体による染色を灰色で示している。結果は、3個体に由来する3つのクローンペアを代表している。 CD52の高発現は、抗原によって活性化されたサプレッサー機能を有する血液CD4+T細胞のマーカーである。(A)GAD65によって活性化され選別されたCD52hiCD4+細胞またはCD52loCD4+細胞の存在下で破傷風トキソイド(TT)によって再活性化された、TTによって刺激されFACS選別されたCD4+T細胞の増殖。CFSE標識したPBMCをGAD65またはTTのいずれかと7日間インキュベーションすることによって、活性化されたCD4+細胞を生じさせた(A1)。次いで、GAD65によって活性化されたCD52hiCD4+T細胞およびCD52loCD4+T細胞、ならびにTTによって活性化されたCD4+T細胞をFACSによって単離した。GAD65の存在下では、TTによって再活性化された細胞の増殖は、GAD65によって活性化されたCD52hiCD4+細胞によって抑制される。3日間の培養の最後の16時間の間、3Hチミジン取込みを測定した(A2)。結果(三つ組の平均値±標準誤差)は、5個体に由来する細胞を用いた独立した実験を代表している。 CD52の高発現は、抗原によって活性化されたサプレッサー機能を有する血液CD4+T細胞のマーカーである。(B)GAD65の非存在下または存在下での、GAD65によって活性化され選別されたCD4+T細胞によるIFN-γ分泌。CFSE標識したPBMCをGAD65と共に7日間インキュベートし、CD52hiCD4+T細胞およびCD52loCD4+T細胞に選別した。選別した細胞(5,000個)を、放射線照射済PBMC(20,000個)と共にELISpotプレートにおいてインキュベートした。結果(三つ組の平均値＋標準誤差)は、5個体に由来する細胞を用いた独立した複数の実験を代表している。 CD52の高発現は、抗原によって活性化されたサプレッサー機能を有する血液CD4+T細胞のマーカーである。(C)TT±IL-2(10U/ml)の非存在下または存在下での、TTによって活性化され選別されたCD4+T細胞によるIFN-γ分泌。CD52hiCD4+集団およびCD52loCD4+集団を、TTによって活性化されたCFSE標識PBMCから選別したことを除いて、(B)と同様。結果は、三つ組の平均値＋標準誤差である。 CD52の高発現は、抗原によって活性化されたサプレッサー機能を有する血液CD4+T細胞のマーカーである。(D)CFSE標識およびGAD65の非存在下または存在下での7日間のインキュベーションの前にCD52hiCD4+細胞またはCD52loCD4+細胞のいずれかをFACSによって最初に枯渇させたPBMCの増殖。結果は、2つの実験の代表である。 CD4+CD52hiT細胞は、休止状態のCD4+CD25+T細胞に由来しない。PBMCからCD25hi細胞を最初に枯渇させた後の、TTの非存在下(白い棒)または存在下(黒い棒)における、TTによって活性化され選別されたCD4+T細胞によるIFN-γ分泌。 抗原によって活性化されたCD52hiCD4+T細胞は、従来のCD4+CD25+Treg細胞のマーカーによっては区別されない。PBMCをTTと7日間インキュベーションした後の、分裂したCD52hiCD4+T細胞(黒い線)およびCD52loCD4+T細胞(灰色の線)における(A)CD25、(B)FoxP3、(C)表面CTLA-4および(D)細胞内CTLA-4、(E)GITR、(F)CD127、(G)CD24、ならびに(H)CD59の発現のフローサイトメトリー解析(Flow cytometric expression)。アイソタイプ対照抗体による染色は、灰色に塗って(grey fill)示している。結果は、5個体を代表している。 CD52遺伝子発現は、CD52loCD4+T細胞と比べてCD52hiCD4+T細胞の方が高レベルである。CD52loCD4+T細胞と比べた、CD52hiCD4+T細胞における遺伝子発現。GAD65による活性化後7日目に、3個体から選別されたCFSE標識したCD52hiCD4+T細胞およびCD52loCD4+T細胞から抽出された三つ組のRNA試料において定量的RT-PCRを実施した。結果は、中央値+四分位範囲として表している。 CD24発現は、サプレッサー機能を有するCD52hiCD4+T細胞を正確に表さない(delineate)。TTによって刺激され選別されたCD52部分集団およびCD24部分集団の存在下でTTによって再刺激された、TTによって活性化され選別されたCD52loCD4+T細胞によるIFN-γ分泌。結果は、三つ組の平均値＋標準誤差である。 細胞間接触は、CD52hiCD4+T細胞による抑制に必要とされていない。 可溶性CD52の放出が、CD52hiCD4+T細胞による抑制の原因である。(A)GAD65によって活性化され、その後、GAD65によって再活性化されたCD52hiCD4+T細胞またはCD52loCD4+T細胞によって馴化された培地のイムノブロッティング。CFSE標識したPBMCをGAD65と共に7日間インキュベートし、CD52hiCD4+T細胞およびCD52loCD4+T細胞に選別した。選別した細胞をGAD65で再活性化し、24時間後に培地を採取した。培地を10倍に濃縮し、SDS-PAGEによって分画し、PDVF膜に移し、CD52に対するウサギポリクローナル抗体でブロットした。ネイティブの可溶性CD52のおよその分子量を表示している。 可溶性CD52の放出が、CD52hiCD4+T細胞による抑制の原因である。(B)TTによって活性化されたPBMC+/-ホスホリパーゼC阻害剤U73122によって馴化された培地のイムノブロッティング。CFSE標識したPBMCをTTと共にインキュベートし、1時間後に採取した培地を(A)と同様にして処理した。 可溶性CD52の放出が、CD52hiCD4+T細胞による抑制の原因である。(C)TTによって活性化されたCD52hiCD4+T細胞による抑制に対するホスホリパーゼC阻害剤の影響。CFSE標識したPBMCをTTと共に7日間インキュベートし、CD52hiCD4+T細胞およびCD52loCD4+T細胞に選別し、次いでそれらを放射線照射済PBMC(20,000個)およびTT±ホスホリパーゼC阻害剤U73122と共にELISpotプレート中で一緒に(各5,000個)インキュベートした。結果は、三つ組の平均値＋標準誤差である。TTの不在下では、U73122の影響はなかった。 可溶性CD52の放出が、CD52hiCD4+T細胞による抑制の原因である。(D)TTによって活性化されたCD52hiCD4+T細胞による抑制に対する、CD52の糖質部分に対する抗体の影響。ELISpotアッセイ法において細胞をTTおよび10μg/mlの抗CD52(CF1D12)モノクローナル抗体またはアイソタイプ対照(IgG3)モノクローナル抗体のいずれかの存在下または非存在下で(with or without)インキュベートしたことを除いて、手順は(C)と同様であった。結果(平均値±標準誤差)は、3つの独立した実験を代表している。 Daudi細胞によって産生された可溶性CD52は、T細胞増殖およびエフェクター機能を直接的に抑制する。(A)細胞株によって馴化された培地のイムノブロッティング。培地を10倍に濃縮し、SDS-PAGEによって分画し、PDVF膜に移し、CD52に対するウサギポリクローナル抗体でブロットした。(B)Daudi細胞馴化培地によるT細胞増殖の抑制。TTおよび抗CD52抗体(CF1D12)またはアイソタイプ対照抗体(10μg/mL)のいずれかを含む20％Daudi細胞馴化培地を含有するIMDM中で、PBMC(細胞200,000個)を7日間培養した。可溶性CD52を枯渇させるために、ウサギ抗CD52ポリクローナル抗体(1μg/ml培地)と共にDaudi培地を一晩インキュベートし、続いて、プロテインGセファロースを用いて4℃で1時間、沈降させた。結果(平均値±標準誤差)は、3つの独立した実験を代表している。 レンチウイルスベクターにおいて発現させるためのDNA構築物。SigP=シグナルペプチド;ECD=細胞外ドメイン;Strep2=特に人工的に作製されたストレプトアビジンであるStrep-Tactinに結合するアミノ酸8個をコードする精製タグ。 可溶性CD52融合タンパク質は、T細胞の増殖およびエフェクター機能を直接的に抑制する。組換えCD52-FcによるT細胞増殖の抑制。表示された濃度の組換えCD52-Fcタンパク質またはFcタンパク質対照タンパク質の存在下で、200μl丸底ウェルにおいて4倍の数の放射線照射済PBMCと共に、PBMC(200,000個)をTTと共に7日間培養した(A)。 可溶性CD52融合タンパク質は、T細胞の増殖およびエフェクター機能を直接的に抑制する。組換えCD52-FcによるT細胞増殖の抑制。表示された濃度の組換えCD52-Fcタンパク質またはFcタンパク質対照タンパク質の存在下で、200μl丸底ウェルにおいて4倍の数の放射線照射済PBMCと共に、精製されたCD4+T細胞(20,000個)を抗CD3抗体(100ng/ml)および抗CD28抗体(200ng/ml)と共に48時間培養した(B)。インキュベーションの最後の16時間の間、3Hチミジン取込みを測定した。結果(三つ組の平均値±標準誤差)は、6つの独立した実験を代表している。 可溶性CD52融合タンパク質は、T細胞の増殖およびエフェクター機能を直接的に抑制する。(C)組換えCD52-Fcによるサイトカイン分泌の抑制。(C)では、TT±3.3μΜ CD52-Fcタンパク質またはFcタンパク質で活性化したPBMCの培地を48時間のインキュベーション後にサンプリングし、マルチプレックスビーズアレイによってサイトカインについて分析した。 可溶性CD52融合タンパク質は、T細胞の増殖およびエフェクター機能を直接的に抑制する。(D)N結合型糖質の切断後の、CD52-Fcによる抑制の減弱。37℃で1時間、PBS 20μl中PNGアーゼF(1,000単位)の存在下または非存在下でCD52-Fc(20μg)をインキュベートし、75℃で10分間加熱することによって反応を終結させた。TTおよび処理されたCD52-Fcまたは処理されていないCD52-Fc(最終濃度2.5μΜ)と共に37℃で7日間、PBMCをインキュベートし、次いで、(C)と同様にして3Hチミジン取込みを測定した。上のパネルは、PNGアーゼF処理後のCD52-Fcのサイズの減少をSDS-PAGEおよびクーマシー染色によって測定した結果を示す。 Siglec-10に結合するCD52糖質が、可溶性CD52エフェクター機能に必要とされる。(A)CD52-Fc±ノイラミニダーゼ処理によるT細胞活性化の抑制。わずか20μlに溶かしたノイラミニダーゼ(1単位)または担体緩衝液と共に37℃で30分間、CD52-Fc(3.3μM)をインキュベートした。次いで、37℃で1時間、TT±ノイラミニダーゼで処理されたCD52-Fcまたは処理されていないCD52-Fc(最終濃度0.33μM)と共に48ウェルプレート中でPBMCをインキュベートした後、非接着細胞をELISpotプレートに移し、24時間後に37℃でIFN-γスポットを発色させた。 Siglec-10に結合するCD52糖質が、可溶性CD52エフェクター機能に必要とされる。(B)T細胞活性化後のヒトT細胞におけるSiglec-10発現。PBMCをTTまたは可溶性抗CD3抗体と共に4日間インキュベーションした後のCD4+T細胞におけるSiglec-10発現のフローサイトメトリーヒストグラム。 Siglec-10に結合するCD52糖質が、可溶性CD52エフェクター機能に必要とされる。(C)抗Siglec-10抗体と同時にインキュベートした場合の、CD52-FcによるT細胞機能の抑制。TTおよびCD52-Fc(3.4μM)ならびにSiglec-10の細胞外ドメインに対する様々な濃度のアフィニティー精製済みヤギ抗体またはFc(0.34μM)±抗体と共に、ELISpotプレートにおいてPBMCをインキュベートし、その後、IFN-γスポットを発色させるために24時間、非接着細胞をELISpotプレートに移した。 Siglec-10に結合するCD52糖質が、可溶性CD52エフェクター機能に必要とされる。(D)可溶性組換えSiglec-10-Fcと同時にインキュベートした場合の、CD52-FcによるT細胞機能の抑制。TTおよびCD52-Fc(3.4μM)ならびに様々な濃度の組換えSiglec-10-Fcと共に、48ウェルプレートにおいてPBMCをインキュベートし、その後、IFN-γスポットを発色させるために24時間、非接着細胞をELISpotプレートに移した。 Siglec-10に結合するCD52糖質が、可溶性CD52エフェクター機能に必要とされる。(E)Siglec-10を遮断するとCD52-FcによるT細胞抑制が低減するが、他のSiglecを遮断してもT細胞抑制は低減しない。図に示したように、CD52-FcまたはFc(各3.4μM)および抗ヒトSiglec抗体(各10μg/ml)または組換えヒトSiglec2-Fc(20μg/ml)と一緒に、三つ組のELISpotプレートウェルにおいてTTと共に37℃でCD4+T細胞(20,000個)をインキュベートした。20時間後、ウェルを洗浄し、IFN-γスポットを発色させた。 CD52-Fcは、精製された血液樹状細胞のT細胞刺激能力に影響を及ぼさない。FACS選別したヒト血液CD1b/c+DCをCD52-Fcタンパク質またはFcタンパク質と共にプレインキュベートし、2回洗浄し、同種異系のCFSE標識したCD4+T細胞と6日間同時培養した。CFSEloとして確認される分裂したCD4+T細胞の出現率をフローサイトメトリーによって測定した。結果は、異なるドナーを用いた2つの独立した実験を代表している。CD304+形質細胞様DCおよびCD14+単球についても、同様の結果が得られた(データ不掲載)。 CD52hi枯渇脾細胞の移入は、NOD.SCIDマウスにおける糖尿病の急速な発症を誘導する。CD52hi細胞を枯渇させるか、または模擬的に(sham)枯渇させた野生型NODマウスに由来する全脾細胞を、(A)8週齢のRIP.B7/NOD.SCIDマウス(2×106細胞)および(B)放射線照射(750ラド)した8週齢の雄NODマウス(1.2×107細胞)に静脈内注射した。Diastix(Bayer)を用いて毎週2回尿中グルコースを測定することによってマウスをモニターし、連続した日に血中グルコース測定値が14mMを上回った場合、糖尿病であると確認した。結果は、各細胞集団の移入後の生存率(％)の推移を示す。 CD52hi枯渇CD3+T細胞は、放射線照射されたNODマウスにおける糖尿病の発症を加速する。放射線照射(750ラド)した8週齢の雄NODマウスに、10週齢の非糖尿病雌NODマウスに由来する1.2×107個の脾細胞またはCD3+CD52hi枯渇脾細胞を注射した。Diastix(Bayer)を用いて毎週2回尿中グルコースを測定することによってマウスをモニターし、連続した日に血中グルコース測定値が14mMを上回った場合、糖尿病であると確認した。結果は、(A)各細胞集団の移入後の生存率(％)の推移および(B)4週間後のインスリン炎スコア(n=4/群)を示す。 GAD65による刺激に応答して生じるCD52hiCD4+T細胞の出現率は、1型糖尿病において減少する。(A)GAD65および(B)TTに応答してPBMCから増殖したCD52hiCD4+T細胞の比率を次のカテゴリーの個体について示している:前臨床(Pre)T1D−1型糖尿病のリスクを有する;T1D−1型糖尿病に罹患;健常−病気に罹患していないHLA DR3および/またはHLA DR4の若年成人;T2D−2型糖尿病。横棒は、各群の中央値である。図に示した分散分析の全P値は、クラスカル・ワリス検定によって決定した;次いで、ダンの多重比較検定により、健常者またはT2Dと比べた前臨床T1DおよびT1Dの両方の有意な差が明らかになった(P<0.05)。 GAD65に応答して生じたCD52hiCD4+細胞による抑制は、前臨床T1Dにおいて弱まる。抗原の非存在下(白)または存在下(黒)における、TTまたはGAD65によって活性化され選別されたCD4+T細胞によるIFN-γ分泌。結果(三つ組の平均値＋標準誤差)は、1型糖尿病のリスクがある膵島細胞自己抗体を有する個体6名に由来する細胞を用いた実験を代表している。 CD52-Fcによる治療によって、少し前に糖尿病を発症したNODマウスの高血糖が回復する。尿中グルコースを毎週試験することによって雌NODマウスの血糖値をモニターし、尿試験が陽性のマウスにおいて血中グルコース濃度が14mMを上回った場合、糖尿病と診断した。高血糖が確認され次第、CD52-FcまたはFcのいずれか20μgを1日おきに6回、マウスに腹腔内投与し、次いで、毎週2回、血中グルコース濃度をモニターした。CD52-Fc(A)またはFc対照(B)のいずれかを与えられたマウスのペア2組の結果を示している。 エクスビボでhCD52-FcまたはFcで処理した脾細胞を糖尿病NODマウスから移入した後の、NOD.SCIDマウスにおける糖尿病の発症。組換えヒトCD52 Fcで処理した糖尿病NOD脾細胞またはFcで処理した糖尿病NOD脾細胞をNOD.SCIDマウスに注射した。雌糖尿病マウス由来の脾細胞を単離し、組換えhCD52-Fcタンパク質またはFcタンパク質のいずれかと共に「CD52緩衝液」中でインキュベートした。細胞を再懸濁し、雄NOD.SCIDマウスに注射した(1群当たり6匹;実施例18の方法を参照されたい)。 ヒトCD52-Fcは、マウス卵白アルブミ(Ova)特異的TCRトランスジェニックCD4(OT-II)T細胞の増殖を抑制する。5％FCSおよび表示した濃度のovaタンパク質もしくはovaペプチド、または抗CD3抗体(クローン2C-11)、および組換えヒトCD52-Fcタンパク質またはFcタンパク質を含有するRPMI-1640培地200ml中、丸底96ウェルプレートにおいて、10週齢の雌OT-IIマウスに由来する脾細胞(1×105個)を3日間インキュベートした。培養の最後の16時間の間、3Hチミジン取込みを測定した。結果は、三つ組の平均値±標準誤差である。 ELISAによるヒト精液試料中のCD52の同定。精液試料の段階希釈物(n=26)中の可溶性CD52に関する450nmの吸光度を示す。 精液に由来するCD52は、ヒトT細胞増殖を抑制する。破傷風トキソイド(TT、5Lfu/ml)に応答したCFSE色素希釈から算出されるT細胞増殖(細胞分裂指標; CDI)に対する影響を、免疫除去を行っていない、または対照IgG(「Octagam」)もしくは抗CD52 IgG(Campath)を用いて除去を行った(depleted)2種の精液試料(希釈率1:20)に関して示している。 破傷風トキソイドに対するT細胞増殖(CFSE色素希釈):精液±CD52阻止抗体の影響。破傷風トキソイド(TT、5Lfu/ml)に応答したT細胞増殖(CDI、CFSE色素希釈から算出される)に対する影響を、精液試料(1:20)±阻止抗体CF1D12(20μg/ml)について示す。 hCD52-Fcは、LPSに応答したTHP1細胞によるIL-1β分泌を抑制する。LPSの存在下で、様々な用量のCD52-FcまたはFc対照と共にTHP-1細胞をインキュベートし、培地を採取し、IL-1βの濃度をELISAによって測定した。 hCD52-Fcは、Pam3CSKに応答したTHP1細胞によるIL-1β分泌を抑制する。TLR-2作動薬Pam3CSKの存在下で、様々な用量のCD52-FcまたはFc対照と共にTHP-1細胞をインキュベートし、培地を採取し、IL-1βの濃度をELISAによって測定した。 hCD52-Fc(50μg/ml)は、分化したTHP1細胞によるアラムに応答したIL-1β分泌を抑制する。ホルボール-12-ミリスタート-13-アセタート(PMA)を用いてTHP-1細胞を分化させ、洗浄し、CD52-FcまたはFc対照と共にインキュベートした。培地を採取し、IL-1βの濃度をELISAによって測定した。 mCD52-Fcは、一連の先天性免疫刺激に応答したマウス骨髄由来樹状細胞によるIL-1βの分泌を抑制する。C57/B6マウスに由来する骨髄由来樹状細胞(BMDC)を、LPS、CPG、またはリステリア・モノサイトゲネス(Listeria monocytogenes)の存在下でマウスCD52-FcまたはPBS(対照)と共にインキュベートし、LPSでプライミングし、次いで、公知のインフラマソーム作動薬である尿酸モノナトリウム(MSU)、アラム、およびナイジェリシンを用いて刺激した。培地中のサイトカイン濃度を、マルチプレックスサイトカインアレイアッセイ法によって測定した。 A.ウレアファシエンス(ureafaciens)ノイラミニダーゼによって処理すると、LPSによって誘導されたTHP-1細胞によるIL-1β産生に対するmCD52-Fcの抑制効果が無効になる。THP-1細胞を、LPSの存在下で、ノイラミニダーゼで処理したmCD52-Fcまたは反応緩衝液で処理したmCD52-Fcと共にインキュベートした。培地を採取し、IL-1βの濃度をELISAによって測定した。 PNGアーゼ-Fで処理してN結合型オリゴ糖を除去すると、LPSによって誘導されたTHP-1細胞によるIL-1β分泌に対するhCD52-Fcの抑制効果が無効になる。N結合型オリゴ糖を除去するためのPNGアーゼ-Fを用いてまたは用いないで処理したヒトCD52-Fc(300μg)を、LPSの存在下でTHP-1細胞を処理するのに使用した。培地を採取し、IL-1βの濃度をELISAによって測定した。
配列表の説明
SEQ ID NO: 1 ヒトCD52 mRNA転写物(NCBI参照配列: NM_001803.2)
SEQ ID NO: 2 ヒトCD52のアミノ酸配列
SEQ ID NO: 3 ヒトCD52の12アミノ酸可溶性ペプチド
SEQ ID NO: 4 オルソロガスなサル可溶性CD52ペプチド
SEQ ID NO: 5 オルソロガスなマウス可溶性CD52ペプチド
SEQ ID NO: 6 オルソロガスなラット可溶性CD52ペプチド
SEQ ID NO: 7 オルソロガスなイヌ可溶性CD52ペプチド
SEQ ID NO: 8 CD52 Fプライマー
SEQ ID NO: 9 CD52 Rプライマー
SEQ ID NO: 10 FOXP3 Fプライマー
SEQ ID NO: 11 FOXP3 Rプライマー
SEQ ID NO: 12 CTLA-4 Fプライマー
SEQ ID NO: 13 CTLA-4 Rプライマー
SEQ ID NO: 14 GITR Fプライマー
SEQ ID NO: 15 GITR Rプライマー
SEQ ID NO: 16 CD127 Fプライマー
SEQ ID NO: 17 CD127 Rプライマー
SEQ ID NO: 18 IL-2αフォワードプライマー
SEQ ID NO: 19 IL-2αリバースプライマー
SEQ ID NO: 20 IL-27βフォワードプライマー
SEQ ID NO: 21 IL-27βリバースプライマー
SEQ ID NO: 22 IL-12αフォワードプライマー
SEQ ID NO: 23 IL-12αリバースプライマー
SEQ ID NO: 24 1F1プライマー
SEQ ID NO: 25 1R1プライマー
SEQ ID NO: 26 1F2プライマー
SEQ ID NO: 27 1R2プライマー
SEQ ID NO: 28 2Fプライマー
SEQ ID NO: 29 2R1プライマー
SEQ ID NO: 30 2R2プライマー
SEQ ID NO: 31 CD52フォワードプライマー
SEQ ID NO: 32 CD52リバースプライマー
SEQ ID NO: 33 IL-2フォワードプライマー
SEQ ID NO: 34 IL-2リバースプライマー
SEQ ID NO: 35 IL-4フォワードプライマー
SEQ ID NO: 36 IL-4リバースプライマー
SEQ ID NO: 37 IL-10フォワードプライマー
SEQ ID NO: 38 IL-10リバースプライマー
SEQ ID NO: 39 IL-13フォワードプライマー
SEQ ID NO: 40 IL-13リバースプライマー
SEQ ID NO: 41 FoxP3フォワードプライマー
SEQ ID NO: 42 FoxP3リバースプライマー
SEQ ID NO: 43 CD127フォワードプライマー
SEQ ID NO: 44 CD127リバースプライマー
SEQ ID NO: 45 CTLA-4フォワードプライマー
SEQ ID NO: 46 CTLA-4リバースプライマー
SEQ ID NO: 47 FASLGフォワードプライマー
SEQ ID NO: 48 FASLGリバースプライマー
SEQ ID NO: 49 TGFb1フォワードプライマー
SEQ ID NO: 50 TGFb1リバースプライマー
SEQ ID NO: 51 TGFb2フォワードプライマー
SEQ ID NO: 52 TGFb2リバースプライマー
SEQ ID NO: 53 IFNgフォワードプライマー
SEQ ID NO: 54 IFNgリバースプライマー
SEQ ID NO: 55 IL-12αフォワードプライマー
SEQ ID NO: 56 IL-12αリバースプライマー
SEQ ID NO: 57 Ebi3フォワードプライマー
SEQ ID NO: 58 Ebi3リバースプライマー
SEQ ID NO: 59 RARAフォワードプライマー
SEQ ID NO: 60 RARAリバースプライマー
SEQ ID NO: 61 GITRフォワードプライマー
SEQ ID NO: 62 GITRリバースプライマー
SEQ ID NO: 63 GRANZMBフォワードプライマー
SEQ ID NO: 64 GRANZMBリバースプライマー
SEQ ID NO: 65 ALDH1A2フォワードプライマー
SEQ ID NO: 66 ALDH1A2リバースプライマー
SEQ ID NO: 67 ACTINフォワードプライマー
SEQ ID NO: 68 ACTINリバースプライマー
SEQ ID NO: 69 ヒトSiglec-10タンパク質配列(GenBankアクセッション番号AF310233.1)
発明の詳細な説明
全般的な技術および定義
特に他に規定されない限り、本明細書において使用される技術用語および科学用語はすべて、(例えば、細胞培養、分子遺伝学、免疫学、免疫組織化学、タンパク質化学、および生化学)の当業者によって通常理解されるのと同じ意味を有するとみなされるものとする。
別段の定めが無い限り、本発明で使用される組換えタンパク質、細胞培養、および免疫学的技術は、当業者に周知の標準手順である。このような技術は、J. Perbal, A Practical Guide to Molecular Cloning, John Wiley and Sons(1984)、J. Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbour Laboratory Press(1989)、T.A. Brown(editor)、Essential Molecular Biology: A Practical Approach, Volumes 1 and 2, IRL Press(1991)、D.M. Glover and B.D. Hames(editors), DNA Cloning: A Practical Approach, Volumes 1-4, IRL Press(1995 and 1996)、およびF.M. Ausubel et al.,(editors), Current Protocols in Molecular Biology, Greene Pub. Associates and Wiley-Interscience(1988、現在までの更新すべてを含む)、Ed Harlow and David Lane(editors) Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbour Laboratory,(1988)、ならびにJ.E. Coligan et al.(editors) Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons(現在までの更新すべてを含む)などの出典の文献の全体にわたって記載され説明されている。
「および/または(and/or)」、例えば「Xおよび/またはY(X and/or Y)」という用語は、「XおよびY」または「XまたはY」のいずれかを意味すると理解されるものであり、両方の意味またはいずれかの意味に明確な裏付けを提供するとみなされるものとする。
本明細書において使用される場合、「約」という用語は、反対の記載が無い限り、指定された値の+/-20％、より好ましくは+/-10％、より好ましくは+/-5％を意味する。不確かさを回避するために、指定された値の前の「約」という用語は、指定されたまさにその値自体もまた包含すると解釈されるべきである(例えば、「約10」は、まさしく10も包含する)。
本明細書全体を通して、「含む(comprise)」という単語、または「含む(comprises)」もしくは「含む(comprising)」などの変形は、記載した要素、整数、もしくは段階、または要素、整数、もしくは段階の群を包含するが、いかなる他の要素、整数、および段階も、ならびに要素、整数、および段階の群も除外しないことを意味するものと理解される。
本明細書において使用される場合、「免疫応答」という用語は、当技術分野における通常の意味を有し、体液性免疫および細胞性免疫の両方を含む。免疫応答は、T細胞活性化、B細胞活性化、ナチュラルキラー細胞活性化、抗原提示細胞(例えば、B細胞、DC、単球、および/またはマクロファージ)の活性化、サイトカイン産生、ケモカイン産生、特異的細胞表面マーカーの発現、特に、共刺激分子の発現のうちの1つまたは複数によって媒介され得る。好ましい態様において、本発明の方法を用いて抑制される免疫応答は、少なくとも、エフェクターT細胞の機能であり、この細胞型の生存、活性、および/または増殖を低減させることによる。別の好ましい態様において、本発明の方法を用いて抑制される免疫応答は、単球、マクロファージ、または樹状細胞のうちの少なくとも1つまたは複数の機能であり、これらの細胞型のうちの1つまたは複数の生存、活性、および/または増殖を低減させることによる。さらに好ましい態様において、免疫応答は、自己抗原などの抗原に対する寛容性を誘導する程度まで抑制される。
本明細書において使用される場合、「寛容性」とは、ある対象が普通は反応する特定の抗原または抗原群に対して免疫不応答性である状態を意味する。免疫寛容性は、免疫反応を抑制する条件下で達成され、単に免疫応答がないことではない。
本明細書において使用される場合、「治療すること(treating)」、「治療する(treat)」、または「治療(treatment)」という用語は、疾患の少なくとも1つの症状を軽減するか、またはなくすのに十分である治療的有効量の作用物質を投与することを含む。
本明細書において使用される場合、「予防すること(preventing)」、「予防する(prevent)」、または「予防(prevention)」という用語は、疾患の少なくとも1つの症状の発現を予防するのに十分である治療的有効量の作用物質を投与することを含む。
本明細書において使用される場合、「抑制すること(suppressing)」という用語は、任意の定量化できる量だけ低減させることを含む。
本明細書において使用される場合、「対象」という用語は、動物、例えば、哺乳動物を意味する。好ましい態様において、対象は、哺乳動物、例えばヒトである。他の好ましい態様は、ウマ、ウシ、ヒツジ、およびヤギなどの家畜動物、ならびにイヌおよびネコなどの伴侶動物を含む。
本明細書において使用される場合、「宿主」という用語は、任意の手段によって可溶性CD52が単離され得るか、または可溶性CD52が産生され得る、任意の生物を意味する。宿主は、生物全体であってよく、またはそれに由来する細胞であってもよい。宿主は、動物、例えば哺乳動物であってよい。好ましい態様において、宿主は、哺乳動物、例えばヒトである。他の好ましい宿主には、マウス、ラット、サル、ハムスター、モルモット、ウサギ、および可溶性CD52が単離され得るか、または可溶性CD52が産生され得る適切な宿主として役立ち得る任意の動物または細胞が含まれる。
本明細書において使用される場合、「連結された(linked)」、「結合された(attached)」、「結合された(conjugated)」、「結合された(boound)」、「結合された(coupled)」といった用語またはそれらの変形は、1つの実体を別の実体に任意の期間連結する、任意の形態の共有結合または非共有結合を意味するために広く使用される。
可溶性CD52
本開示は、可溶性CD52糖タンパク質断片による、エフェクターT細胞、単球、および樹状細胞などの免疫細胞の抑制を初めて説明する。CD52は、リンパ球を枯渇させるために治療的に使用される補体結合CAMPATHモノクローナル抗体の標的として当初は認識された、大半のリンパ系細胞上に存在する表面グリコシルホスファチジルイノシトール(GPI)アンカー型糖タンパク質である(Treumann et al., 1995; Xia et al., 1991; Hale, 2001)。ヒトCD52遺伝子のmRNA転写物はSEQ ID NO: 1に示しており、翻訳されたアミノ酸配列はSEQ ID NO: 2に示している。GPIアンカーによってつなぎ留められた成熟CD52は、わずか12個のアミノ酸およびアスパラギン(N)に結合した末端糖質を含む。
別段の記載が無い限り、「可溶性CD52糖タンパク質」、「可溶性CD52」、「可溶性糖タンパク質」、およびそれらの変形は、本明細書において同義的に使用される。
膜アンカー型CD52は、(例えば酵素的に)切断されて、アミノ酸配列
Figure 0006004594
を含む可溶性ペプチド断片を放出し得る。本明細書において開示する可溶性CD52糖タンパク質は、SEQ ID NO: 3のアミノ酸配列と少なくとも60％同一、または他の公知のオルソロガスなCD52可溶性断片配列のアミノ酸配列と少なくとも60％同一のアミノ酸配列を含み得る。したがって、可溶性CD52ペプチド断片のオルソロガス配列は、本開示に包含される。このような配列には、サル配列
Figure 0006004594
、マウス配列
Figure 0006004594
、ラット配列
Figure 0006004594
、イヌ配列
Figure 0006004594
、ならびに公知のCD52ポリペプチド配列およびCD52ポリヌクレオチド配列から容易に同定可能である他のオルソロガス配列が含まれるがそれらに限定されるわけではない。
本明細書において開示するアミノ酸配列またはポリヌクレオチド配列のいずれかに対する同一性の割合は、当技術分野において公知の方法によって決定され得る。例えば、アミノ酸配列およびポリヌクレオチド配列は、手動で、またはBLAST(Basic Local Alignment Search Tool; Altschul et al., 1993);www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/も参照されたい)、Clustalアライメント法(Higgins and Sharp, 1989)、および他のものなどのアルゴリズム(当業者によって理解されるように、具体的な配列比較それぞれに適切なパラメーターを選択することができる)を使用するコンピューターベースの配列比較および同定ツールを用いることによって、比較することができる。本明細書において開示する糖タンパク質のペプチド部分のアミノ酸配列は、SEQ ID NO: 3、4、5、6、または7で特定されるアミノ酸配列のうちのいずれか1つまたは複数と少なくとも65％、少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％同一であるか、または99％同一であり得る。例えば、本明細書において開示する糖タンパク質のペプチド部分のアミノ酸配列は、SEQ ID NO: 3、4、5、6、または7で特定されるアミノ酸配列のうちのいずれか1つと100％同一であり得る。
単離された可溶性CD52糖タンパク質は、本発明の薬学的組成物を作製するのに使用され得る。「単離された」という用語は、本明細書において、薬学的組成物に利用するのに適した形態で存在するように可溶性CD52糖タンパク質を単離することを定義するために使用される。したがって、本明細書において開示する糖タンパク質は、その糖タンパク質を薬学的組成物として後で製剤化するのに必要とされる程度まで、宿主細胞または流体もしくは発現系の他の成分から単離される。したがって、単離された糖タンパク質は、糖タンパク質の薬学的効果を妨げる可能性がある宿主細胞の他の成分(例えば、タンパク質)を実質的に含まない形態で提供される。したがって、単離された糖タンパク質は、天然では糖タンパク質が結合している物質、例えば、他の糖タンパク質、ポリペプチド、または核酸(天然の環境、またはインビトロもしくはインビボで実施される組換えDNA技術によって調製がなされる場合は糖タンパク質が調製される環境(例えば細胞培養)において、糖タンパク質と一緒に存在する)を含まなくてよいか、または実質的に含まなくてよい。可溶性糖タンパク質は、当技術分野において公知の方法によって、宿主細胞または流体もしくは発現系から単離することができる。
本明細書において、「可溶性」という用語は、細胞膜に結合していないペプチドまたは糖タンパク質を定義するのに使用される。可溶性ペプチドまたは可溶性糖タンパク質は、任意の溶媒または流体、例えば体液中で自由に動くことができてよい。例えば、可溶性ペプチドまたは可溶性糖タンパク質は、血液中を循環することができてよい。
糖質は、可溶性CD52ペプチド断片に結合した任意の糖質部分であってよい。例えば、糖質は、宿主中のCD52タンパク質の細胞外部分に結合することが認められる任意の糖質部分であってよい。したがって、糖質は、宿主中で起こることが公知であるグリコシル化反応によってCD52タンパク質の細胞外部分に結合することができる任意の糖質であってよい。
Schroter et al.(1999)で説明されているもののような、天然に存在するCD52糖タンパク質上に存在する糖質部分は、公知の方法によって同定することができる。このような糖質部分は、CD52を発現する任意の宿主細胞、特にCD4+T細胞もしくはCD8+T細胞などのリンパ球、単球、または精子細胞もしくは精巣上体管細胞などの生殖器細胞中に存在するCD52糖タンパク質から同定され得る。よって、糖質部分の正確な構造は、質量分析法(例えば、マトリックス支援レーザー脱離イオン化−飛行時間型質量分析法(MALDI-TOF))、Mono-Q陰イオン交換クロマトグラフィー、高pH陰イオン交換クロマトグラフィー(HPAEC-PAD)、メチル化分析、エンド-β-ガラクトシターゼ消化、および他の方法などの方法を適用することによって決定することができる。N-グリカンは、ペプチド-N4-(N-アセチル-β-D-グルコサミニル)アスパラギンアミダーゼF(フラボバクテリウム・メニンゴセプチカム(Flavobacterium meningosepticum)由来の「PNGアーゼF」、大腸菌(Escherichia coli)由来の組換え体;Rocheなどの商業的供給業者から入手可能)などの公知の切断酵素を用いて、天然に存在するCD52糖タンパク質から分離され得る。N-グリカンは、C8逆相クロマトグラフィーなどの公知のクロマトグラフィー法を用いて、さらに特性を決定するために単離することができる。1つの例において、糖質は、1つまたは複数の二分岐型、三分岐型、または四分岐型の糖を含んでよく、これらの糖は末端にシアル酸が付加されていてもよい。例えば、糖質は、1つまたは複数の四分岐型の糖を含んでよい。糖は、分枝状または非分枝状であってよい。糖は、近位のフコースを含んでよい。すなわち、糖質は、フコシル化されていてもよい。糖は、1つまたは複数のN-アセチルラクトサミンリピートを含んでよい。すなわち、糖は、ポリラクトサミン単位を含んでよい。さらに、糖はマンノースコアを含んでよい。
糖質は、Treumann et al.(1995)に記載されている構造のうちのいずれか1つまたは複数を有してよい。すなわち、例えば、糖質は以下の構造のうちのいずれかを有してよい:
Figure 0006004594
したがって、糖質は、1つまたは複数のシアル酸を含んでよい。1つまたは複数のシアル酸は、糖質の任意の部分に位置してよい。例えば、1つまたは複数のシアル酸は、末端シアル酸であってよい。1つの特定の例において、糖質は、末端α2-6シアル酸を含む場合がある。したがって、糖質は、1つまたは複数の表面α2-6-シアリルラクトース基を含み得る。1つまたは複数のシアル酸は、N-アセチルグルコサミンとβ1-4結合したガラクトースに結合していてもよい。
本開示は、可溶性CD52糖タンパク質が、細胞質内免疫受容体抑制性チロシンモチーフ(ITIM)を2つ有する細胞表面トランス膜受容体でありかつ免疫グロブリンスーパーファミリーメンバーであるシアル酸結合Ig様レクチン-10(Siglec-10)への結合を少なくともある程度は介して、その抑制効果を発揮することを実証する(Munday et al., 2001; Crocker et al., 2007)。したがって、本明細書において開示する可溶性糖タンパク質は、Siglec-10に結合することができ得る。例えば、本明細書において開示する可溶性糖タンパク質は、Siglec-10に結合することができる糖質部分を含み得る。1つの例において、糖質部分は、Siglec-10に結合することができる1つまたは複数の表面α2-6-シアリルラクトース基または表面α2-3-シアリルラクトース基を含む。あるいは、糖質部分は、Siglec-10に結合することができる他の任意の表面基を含んでもよい。
本明細書において開示する可溶性糖タンパク質は、任意の種に由来するSiglec-10に結合することができてよい。例えば、本明細書において開示する可溶性糖タンパク質は、任意の哺乳動物種に由来するSiglec-10に結合することができてよい。好ましくは、本明細書において開示する可溶性糖タンパク質は、ヒトSiglec-10に結合することができる。ヒトSiglec-10のポリペプチド配列は、Munday et al.(2001)、GenBankアクセッション番号AF310233.1、およびSEQ ID NO: 69において定義されている。
本明細書において開示する可溶性糖タンパク質は、Siglec-10受容体を介してシグナル伝達を実施することができ得る。したがって、本明細書において開示する可溶性糖タンパク質は、Siglec-10受容体を介してシグナル伝達を実施するのに十分な任意の程度まで、Siglec-10に結合することができ得る。したがって、Siglec-10への結合の正確なレベルは、様々であり得る。所与の糖タンパク質がSiglec-10に結合できるかどうかを判定するための方法、および所与の糖タンパク質がSiglec-10受容体を介してシグナル伝達を実施できるかどうかを判定するための方法は、当技術分野において公知である。
本明細書において開示する糖タンパク質が含み得るN結合型CD52糖質のさらなる例は、宿主のリンパ球CD52糖タンパク質または生殖器細胞CD52糖タンパク質に由来するか、または由来し得るものである。
ヒトCD52の細胞外タンパク質部分に連結することが公知である多くの天然に存在する糖質部分の複雑な性質、およびさまざまなグリコシル化パターンに起因し得るこれらの構造体の多くの変形が原因で、本明細書において開示する糖タンパク質中に存在する糖質部分の厳密な性質は変化し得ることが理解されるであろう。上述したように、天然に存在するCD52糖タンパク質に由来する特定の糖質部分を正確に同定する方法が利用可能である。さらに、さまざまなグリコシル化条件下でCD52を発現させることによって、CD52の可溶性ペプチド断片にいくつかの異なる糖質部分を付加することもできる。例えば、本明細書において開示する可溶性糖タンパク質は、宿主リンパ球細胞、単球、または宿主生殖器細胞(例えば精子細胞もしくは精巣上体管細胞)または精液において発現され得るか、かつ/またはこれらから単離され得、したがって、様々な糖質基を結果として含み得る。本発明者らは、ヒト精液中に存在する可溶性CD52が、Daudi B細胞などのリンパ球から放出される可溶性CD52と同様に、T細胞機能および/または免疫応答を抑制することができることを示した。可溶性糖タンパク質上に代替形態の糖質を提供するために、異なるグリコシル化条件を提供する代替の宿主細胞を可溶性CD52の発現用に選択してよい。
糖質は、自身に結合した糖質部分を有することができるペプチド中のいずれか1つまたは複数のアミノ酸に結合していてもよい。例えば、当該糖質は、アミノ酸配列中の1つまたは複数のアスパラギン残基、セリン残基、トレオニン残基、チロシン残基、ヒドロキシリジン残基、ヒドロキシプロリン残基、ホスホセリン残基、またはトリプトファン残基に結合していてもよい（これらの残基がアミノ酸配列中に存在する場合）。1つの例において、当該糖質は、SEQ ID NO: 3に記載したアミノ酸配列と少なくとも60％、少なくとも65％、少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％同一であるか、または100％同一である配列を有するペプチド部分中のアスパラギン(N)残基に結合している。
本開示はまた、本明細書において開示する糖タンパク質の変種、変異体、生物学的に活性な断片、改変物、類似体、および/または誘導体も提供する。このような化合物は、本明細書において開示する方法のいずれかを含む方法を用いて、本明細書において開示するポリペプチドの構造および/または機能を再現する化合物をスクリーニングすることによって同定することができる。
可溶性CD52の機能
本明細書において開示する糖タンパク質は、好ましくは、リンパ球(T細胞など)および単球を含む免疫細胞の活性(「機能」)を抑制することができる。例えば、本明細書において開示する糖タンパク質は、エフェクターT細胞、単球、マクロファージ、および樹状細胞の機能のうちの1つまたは複数を抑制することができる。エフェクターT細胞、単球、マクロファージ、および樹状細胞、ならびにそれらの機能は、当業者に公知であると考えられる。
T細胞は、当技術分野において公知の1種または複数種のT細胞マーカーのいずれかの存在に基づいて容易に同定することができる。本明細書において開示する糖タンパク質は、抗原チャレンジに応答したT細胞増殖を低減させることができるか、かつ/または(IFN-γ、IL-2、IL-10、IL-17、G-CSF、TNF-α、および活性化T細胞によって分泌されることが公知である他のサイトカインのうちの任意の1種または複数種の産生などの)T細胞サイトカイン産生を低減させることができる。例えば、可溶性CD52は、T細胞によるIFN-γ産生を低減させることができる。
別の例において、可溶性CD52は、単球、マクロファージ、および樹状細胞によるIL-1β分泌を低減させることができる。
したがって、本明細書において開示する糖タンパク質は、宿主の免疫応答を軽減することができる。本発明者らは、本明細書において開示する糖タンパク質が、任意の抗原を用いたチャレンジに応答したエフェクターT細胞の機能を低下させることができることを示した。抑制機能は、チャレンジで使用される個々の抗原に依存しない。したがって、本明細書において開示する糖タンパク質は、任意の抗原に対する免疫応答を軽減することができる。1つの例において、抗原は自己抗原である。
(限定されるわけではないが)本明細書の例において説明するもののような、T細胞機能および/または免疫応答の抑制を測定する任意の公知の方法を使用することができる。したがって、これらの方法は、エフェクターT細胞、単球、マクロファージ、および樹状細胞のうちの1つもしくは複数の増殖に対する、ならびに/またはIFN-γ、IL-2、IL-10、IL-17、G-CSF、TNF-α、および活性化されたT細胞、単球、マクロファージ、もしくは樹状細胞によって分泌されることが公知である他のサイトカインのうちの任意の1種または複数種の産生に対する、本明細書において開示する糖タンパク質の影響を測定することを含み得る。
融合タンパク質
本明細書において開示するCD52糖タンパク質のペプチド部分は、例えば、融合タンパク質として第2のタンパク質に結合していてもよい。第2のタンパク質は、糖タンパク質の安定性および/もしくは溶解性を増大させること、組換え法による糖タンパク質の作製プロセスをより良くすること、または糖タンパク質の治療的効果を高めることができる任意のタンパク質であってよい。したがって、第2のタンパク質は、本明細書において開示する糖タンパク質の半減期を延長させることができ得る。
第2のタンパク質は、任意の適切な長さのものでよい。1つの態様において、第2のタンパク質は、比較的短くてよい。例えば、第2のタンパク質は、1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、またはそれより多いアミノ酸のいずれかからなってよい。第2のタンパク質は、少なくとも1個、少なくとも2個、少なくとも3個、少なくとも4個、少なくとも5個、少なくとも6個、少なくとも7個、少なくとも8個、少なくとも9個、または少なくとも10個のアミノ酸を含んでよい。また、第2のタンパク質は、10個より多いアミノ酸を含んでもよい。例えば、第2のタンパク質は、少なくとも10個、少なくとも15個、少なくとも20個、少なくとも25個、少なくとも30個、または少なくとも50個のアミノ酸を含んでよい。
1つの例において、第2のタンパク質は抗体断片である。適切な抗体断片には、免疫系を活性化することができる任意の抗体断片が含まれる。抗体断片は、結晶性断片(Fc)領域(単一のポリペプチドであり得る)またはFc領域に由来するいずれか1つもしくは複数の重鎖定常ドメイン(例えば、CHドメイン2、3、および/もしくは4)であってよい。1つの例において、第2のタンパク質はFc断片である。
別の例において、第2のタンパク質は、精製タグであってよい。精製タグの多くの例が公知であり、(非限定的に)Hisタグ、T7タグ、FLAGタグ、Sタグ、HAタグ、c-Mycタグ、DHFR、キチン結合ドメイン、カルモジュリン結合ドメイン、セルロース結合ドメイン、およびStrep2タグ(Strep-Tactin、すなわち特に人工的に作製されたストレプトアビジンに結合する8個のアミノ酸をコードする精製タグ(Schmidt and Skerra, 2007))などが含まれる。
第2のタンパク質は、発現されたタンパク質の可溶性を高め得る。このようなタンパク質には、(非限定的に)NusA、チオレドキシン、低分子ユビキチン様修飾因子(SUMO)、ユビキチン、および当技術分野において公知であるその他のものが含まれる。
第2のタンパク質は、精製方法を向上させるだけでなく、発現されたタンパク質の可溶性を高め得る。このようなタンパク質には、(非限定的に)GST、MBP、T7遺伝子10、および当技術分野において公知であるその他のものが含まれる。
精製タグは、産生後に融合タンパク質から任意で除去されてもよい。融合タンパク質から精製タグを除去する適切な方法は、使用される個々の精製タグによって変わると考えられる。一般に、このような方法は当技術分野において公知である。
本明細書において開示する融合タンパク質は、前述の任意の第2のタンパク質のうちの1つまたは複数を任意の組合せで含んでよい。したがって、融合タンパク質は、(Fcなどの)抗体断片および(Strep2タグなどの)精製タグを含んでよい。
ポリヌクレオチド
本開示はさらに、可溶性CD52糖タンパク質または融合タンパク質のタンパク質成分をコードする、単離されたポリヌクレオチドまたは組換えポリヌクレオチドも提供する。このようなポリヌクレオチドの配列は、本明細書において説明するCD52タンパク質および可溶性CD52ペプチド断片ならびに融合タンパク質内に含まれる第2のタンパク質のアミノ酸配列から導き出すことができる。本明細書において開示するポリヌクレオチドはまた、完全長CD52タンパク質(例えば、その成熟型またはその前駆体であってよい)をコードしてもよい。
「単離されたポリペプチド」という用語は、天然の状態では結合しているかまたは連結しているポリヌクレオチド配列からおおむね分離されているポリヌクレオチドを意味するものとする。好ましくは、自然の状態では結合している他の成分を、単離されたポリペプチドの少なくとも60％が含まず、より好ましくは少なくとも75％が含まず、およびより好ましくは少なくとも90％が含まない。さらに、「ポリヌクレオチド」という用語は、「核酸分子」、「遺伝子」、および「mRNA」という用語と同義的に本明細書において使用される。
ポリヌクレオチドという文脈における「組換え」という用語は、天然の状態と比べて変化した量で細胞中または無細胞発現系中に存在する場合のポリヌクレオチドを意味する。1つの態様において、細胞は、そのポリヌクレオチドを天然には含まない細胞である。しかし、細胞は、非内在性ポリヌクレオチドを含む細胞であってよく、この結果、コードされるポリペプチドが変化した量、好ましくは増加した量で産生される。本発明の組換えポリヌクレオチドには、それが存在するトランスジェニック(組換え)細胞または無細胞発現系の他の成分から分離されていないポリヌクレオチド、およびそのような細胞または無細胞系中で産生されるポリヌクレオチドであって、続いて精製されて少なくともいくつかの他の成分が除かれるポリヌクレオチドが含まれる。
「ポリヌクレオチド」とは、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、またはその任意の断片を意味する。これは、ゲノム由来または合成由来のDNAまたはRNAでよく、二本鎖または一本鎖でよく、本明細書において定義する特定の活性を果たすために糖質、脂質、タンパク質、または他の物質と組み合わせられてよい。
本明細書において開示するポリヌクレオチドは、(CD52またはその可溶性断片をコードするゲノムポリヌクレオチドなどの)天然に存在する分子と比べた場合、ヌクレオチド残基の欠失、挿入、または置換といった1つまたは複数の変異を有する場合がある。変異体は、天然に存在するもの(すなわち、天然供給源から単離される)か、または合成によるもの(例えば、部位特異的変異誘発もしくはHarayama(1998)によって大まかに説明されているDNAシャッフリング技術を実施することによって作製される)のいずれかであってよい。したがって、本発明のポリヌクレオチドは、天然に存在するか、または組換えのいずれかであり得ることが明らかである。
ポリヌクレオチドの個々の配列は、ペプチド配列から決定することができる。遺伝コードの重複性があるため、様々な配列が、同じペプチドをコードするために使用され得る。さらに、ポリヌクレオチド配列は、特定の宿主細胞における発現を増大させるために特異的に改変してもよい。このようなプロセスは、「コドン最適化」として当技術分野において周知である。したがって、本明細書において開示するポリヌクレオチドは、宿主細胞における発現を増大させるようにコドン最適化されてよい。
ベクター
本明細書において開示するポリヌクレオチドは、糖タンパク質または融合タンパク質のタンパク質成分の発現を促進するために、ヌクレオチドベクター中に挿入することができる。したがって、本開示は、本明細書において開示する糖タンパク質または本明細書において開示する融合タンパク質のタンパク質成分をコードするポリヌクレオチドを含むベクターを提供する。ベクターは、RNAまたはDNAのいずれか、原核性または真核性のいずれかであることができ、(US5,792,294で説明されているような)トランスポゾン、ウイルス、またはプラスミドであってよい。
好ましくは、糖タンパク質または融合タンパク質のタンパク質成分をコードするポリヌクレオチドは、適切な条件下でペプチドを発現できるプロモーターに機能的に連結されている。本明細書において使用される「機能的に連結される」とは、2つ以上の核酸(例えばDNA)セグメントの間の機能的関係を意味する。典型的には、これは、転写配列に対する転写調節エレメントの機能的関係を意味する。例えば、プロモーターは、適切な細胞または無細胞発現系においてコード配列の転写を刺激または調節する場合、本明細書において定義するポリヌクレオチドなどのコード配列に機能的に連結されている。通常、転写配列に機能的に連結しているプロモーター転写調節エレメントは、転写配列と物理的に隣接している。すなわち、これらはシス作用性である。しかし、エンハンサーなどの一部の転写調節エレメントは、それらが転写を増大させるコード配列と物理的に連続していなくてもよく、極めて近くに位置していなくてもよい。
ベクターは、好ましくは発現ベクターである。本明細書において使用される場合、発現ベクターは、宿主細胞を形質転換することができ、かつ指定されたポリヌクレオチド分子の発現をもたらすことができるDNAベクターまたはRNAベクターである。好ましくは、発現ベクターは、宿主細胞内で複製することもできる。発現ベクターは、原核性または真核性のいずれかであることができ、典型的にはウイルスまたはプラスミドである。本明細書において開示する発現ベクターには、本明細書において開示する組換え細胞において(動物細胞における場合を含む)または適切な無細胞発現系において機能する(すなわち、遺伝子発現を指示する)任意のベクターが含まれる。
特に、本明細書において開示する発現ベクターは、調節配列、例えば、転写制御配列、翻訳制御配列、複製起点、および組換え細胞または無細胞発現系と適合性があり、かつ本明細書において開示するポリヌクレオチド分子の発現を制御する他の調節配列を含んでよい。特に、本明細書において開示するベクターは、転写制御配列を含んでよい。転写制御配列は、転写の開始、延長、および集結を制御する配列である。特に重要な転写制御配列は、プロモーター配列、エンハンサー配列、オペレーター配列、およびリプレッサー配列など転写開始を制御するものである。適切な転写制御配列には、本明細書において説明する組換え細胞または無細胞発現系のうちの少なくとも1つにおいて機能できる任意の転写制御配列が含まれる。様々なこのような転写制御配列が、当業者には公知である。
本明細書において開示するベクターはまた、(a)発現されたタンパク質またはペプチドがペプチドを産生する細胞から分泌されるのを可能にする分泌シグナル(すなわち、シグナルセグメント核酸配列)、および/または(b)本明細書において融合タンパク質として開示するペプチドの発現をもたらす融合配列も含んでよい。適切なシグナルセグメントの例には、本明細書において開示する糖タンパク質または融合タンパク質の分泌を指示することができる任意のシグナルセグメントが含まれる。ベクターはまた、本明細書において開示するペプチドをコードする核酸配列の周囲および/または内部に、介在配列および/または非翻訳配列を含んでよい。
ポリヌクレオチドまたはベクターは、本明細書において開示する糖タンパク質または融合タンパク質を産生させるために、宿主細胞または無細胞発現系において発現させることができる。このような発現は、例えば、哺乳動物細胞、バキュロウイルス発現系、真菌発現系(発現されたタンパク質のグリコシル化を可能にするように選択され得る)において実施され得る。
宿主細胞は、本明細書において開示する糖タンパク質または融合タンパク質を産生することができる任意の細胞であることができる。したがって、1つの例において、宿主細胞は、本明細書において開示する糖タンパク質のタンパク質成分のグリコシル化を可能にすることができる。適切な宿主細胞は、当業者によって容易に同定されることができ、例えば、哺乳動物細胞などの動物細胞が含まれる。1つの例において、宿主細胞は、CHO細胞、骨髄腫細胞(マウス骨髄腫NS-O細胞もしくはSP2-O細胞など)またはHEK293T細胞である。別の例において、宿主細胞はDaudi Bリンパ芽球細胞である(Hu et al., 2009)。
さらに、ポリヌクレオチドまたはベクターは、対象に投与するために宿主細胞中に導入することもできる。したがって、本明細書において開示する薬学的組成物は、本明細書において開示するポリヌクレオチドまたはベクターを含む細胞を含み得る。この細胞は、単離された細胞であってよい。この細胞は、好ましくは組換え細胞である。したがって、この細胞は、好ましくは、本明細書において開示するポリヌクレオチドまたはベクターでトランスフェクトされている。対象に投与するのに適した任意の宿主細胞が使用され得る。1つの例において、この細胞は、治療される対象から得られた細胞であってよい。すなわち、この細胞は自己由来細胞であってよい。したがって、1つまたは複数の細胞が、ある対象から得られてよく、本明細書において開示するポリヌクレオチドまたはベクターが対象の細胞中に導入されてよく、次いで、その細胞が同じ対象に投与されてよい。1つの例において、この細胞は、リンパ球、例えばCD4+T細胞などのT細胞であってよい。この点に関して、ある対象から適切な細胞試料を採取するための方法は、当技術分野において公知であると考えられる。使用される細胞がリンパ球である場合、この方法にはリンパ球除去が含まれ得る。他の適切な宿主細胞も同様に使用することができ、それらは治療される対象に必ずしも由来しなくてもよい。細胞におけるポリヌクレオチドまたはベクターの発現は、好ましくは、本明細書において開示する糖タンパク質の産生および/または分泌をもたらす。
宿主細胞へのポリヌクレオチドの形質転換は、当技術分野において公知である任意の適切な方法によって達成することができる。形質転換技術には、トランスフェクション、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、リポフェクション、および吸着が含まれるが、それらに限定されるわけではない。組換え細胞は、単細胞のままであってもよく、または増殖して組織、器官、もしくは多細胞生物になってもよい。本明細書において開示する形質転換されたポリヌクレオチド分子は、染色体外のままでもよく、またはそれらが発現される能力が保持されるような形式で、形質転換された(すなわち組換え)細胞の染色体内の1つもしくは複数の部位に組み込まれてもよい。
形質転換するのに適切な宿主細胞には、本明細書において開示するポリヌクレオチドを用いて形質転換できる任意の細胞が含まれる。宿主細胞は、本発明のポリペプチドを内因的に(すなわち、自然に)産生することができてもよく、または本明細書において開示する少なくとも1つのポリヌクレオチド分子を用いて形質転換された後に、そのようなポリペプチドを産生することができるようにされてもよい。
組換えDNA技術は、例えば、宿主細胞内でのポリヌクレオチド分子のコピー数、それらのポリヌクレオチド分子が転写される効率、結果として生じる転写物が翻訳される効率、および翻訳後修飾の効率を操作することによって、形質転換されるポリヌクレオチド分子の発現を改善するために使用することができる。本明細書において開示するポリヌクレオチド分子の発現を増大させるのに有用な組換え技術には、高コピー数プラスミドにポリヌクレオチド分子を機能的に連結すること、1つまたは複数の宿主細胞染色体中にポリヌクレオチド分子を組み込むこと、プラスミドへのベクター安定配列の付加、転写制御シグナル(例えば、プロモーター、オペレーター、エンハンサー)の置換または改変、翻訳制御シグナル(例えば、リボソーム結合部位、シャイン・ダルガノ配列)の置換または改変、本明細書において開示するポリヌクレオチド分子を宿主細胞のコドン使用頻度に対応するように改変すること、および転写物を不安定化する配列を欠失させることが含まれるが、それらに限定されるわけではない。
宿主細胞は、糖タンパク質または融合タンパク質を産生させるのに有効な条件下で培養されてよい。宿主細胞中で発現された後、糖タンパク質または融合タンパク質は、当技術分野において公知である従来法によって単離することができる。したがって、1つの態様において、本明細書において説明する単離された糖タンパク質または融合タンパク質は、糖タンパク質または融合タンパク質を産生させるのに有効な条件下で糖タンパク質または融合タンパク質を発現することができる細胞を培養し、糖タンパク質または融合タンパク質を単離することによって作製される。有効な培養条件には、糖タンパク質または融合タンパク質の産生を可能にする、特にグリコシル化を可能にする、有効な培地条件、バイオリアクター条件、温度条件、pH条件、および酸素条件が含まれるが、それらに限定されるわけではない。有効な培地とは、細胞が培養されて本明細書において開示する糖タンパク質または融合タンパク質が産生される任意の培地を意味する。典型的には、このような培地は、同化可能な炭素、窒素、およびリン酸供給源、ならびに適切な塩、無機塩類、金属、およびビタミンなどの他の栄養素を有する水性媒体を含む。宿主細胞は、通常の発酵バイオリアクター、振盪フラスコ、試験管、マイクロタイターディッシュ、およびペトリ皿中で培養され得る。培養は、組換え細胞にとって適切な温度、pH、および酸素含有量のもとで実施され得る。このような培養条件は、当業者の専門知識の範囲内である。
本明細書において開示するポリヌクレオチドの発現に適した任意の無細胞発現系もまた、使用され得る。適切な無細胞発現系には、糖タンパク質または融合タンパク質のタンパク質成分のグリコシル化を可能にするものが含まれる。当業者は、このような条件を決定することができる。
本明細書において開示する糖タンパク質はまた、単離された宿主細胞においてCD52の発現を誘導し、宿主細胞によって産生された可溶性CD52糖タンパク質を単離することによって作製することもできる。したがって、糖タンパク質は、可溶性CD52を天然に産生する細胞を用いて作製され得る。適切な細胞は、当業者が同定することができ、(非限定的に)リンパ球、生殖器領域の細胞(精子細胞など)、Daudi Bリンパ芽球細胞(Hu et al., 2009)、およびK562細胞などが含まれる。可溶性CD52を天然に産生することができるその他の細胞株は、可溶性CD52分泌に関してスクリーニングすることによって同定することができる。したがって、癌細胞を、可溶性CD52を分泌する能力に関してスクリーニングすることができる。
可溶性CD52を天然に産生する単離された宿主細胞から本明細書において開示する糖タンパク質を作製する方法は、より高レベルの可溶性CD52を産生するように宿主細胞を刺激する段階を含んでよい。これは、例えば、宿主細胞を抗原と接触させることによって実現することができる。任意の抗原が使用され得る。1つの例において、抗原は、GAD65などの自己抗原である。別の例において、抗原は破傷風トキソイドである。
可溶性CD52を天然に産生する単離された宿主細胞から本明細書において開示する糖タンパク質を作製する方法はまた、CD52を天然に発現する細胞を選択する段階、および膜結合型CD52の細胞外部分を切断できる酵素に細胞を接触させて可溶性CD52を遊離させる段階も含んでよい。適切な酵素は当技術分野において公知であり、ホスホリパーゼCなどのホスホリパーゼが含まれる。
本明細書において説明する方法は、所望の量の可溶性CD52を産生させるのに十分な規模の単離された細胞または細胞集団において実施することができる。
CD52hi細胞
本開示はまた、高レベルのCD52発現を示す単離された細胞および細胞集団も提供する。「高」とは、CD52の発現レベルが、所与の細胞集団におけるCD52発現レベルと比べて相対的に高いことを意味する。所与の細胞集団は、例えば、リンパ球集団であってよい。リンパ球集団は、Treg細胞および非Treg細胞を含んでよい。さらに、リンパ球集団は、リンパ球活性を刺激するために、抗原と接触させられてもよい。あるいは、細胞集団は、精子細胞などの生殖器の細胞であってもよい。一方、CD52lo細胞は、所与の細胞集団と比べて相対的に低レベルのCD52を提示する。
1つの例において、細胞は、その細胞におけるCD52の発現レベルが細胞集団のCD52発現レベルの上位1％、5％、10％、20％、30％、40％、または50％の範囲内である場合、CD52hi細胞であると判定され得る。好ましくは、CD52hi細胞は、細胞集団において観察されるCD52発現の上位10％内の発現レベルを有する。
1つの例において、細胞は、その細胞におけるCD52の発現レベルが細胞集団のCD52発現レベルの下位1％、5％、10％、20％、30％、40％、または50％の範囲内である場合、CD52lo細胞であると判定され得る。好ましくは、CD52lo細胞は、細胞集団において観察されるCD52発現の下位10％内の発現レベルを有する。
CD52hi細胞は、それが同定される元の細胞集団から単離されてよい。あるいは、CD52hi細胞の集団は、CD52hi細胞が同定される最初の細胞集団から単離されてもよい。このようにして、本明細書において開示する細胞集団は、CD52hi細胞を得るために濃縮されてよい。
したがって、本開示は、複数のCD52hi細胞を含む単離された細胞集団を提供する。CD52hi細胞は、濃縮された細胞集団全体の少なくとも15％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、または95％を構成し得る。
本明細書において開示する単離されたCD52hi細胞およびCD52hi細胞集団は、本明細書において開示する可溶性CD52糖タンパク質を産生することができる。
これらの単離された細胞および細胞集団は、1種または複数種のその他の細胞マーカーの存在によってさらに明確にされ得る。1つの例において、CD52hi細胞は、CD4+CD52hi細胞である。あるいは、CD52hi細胞はCD8+CD52hi細胞である。これらの細胞を特徴付けるその他のマーカーには、糖質コルチコイド誘導性腫瘍壊死因子受容体関連タンパク質(GITR)、CD127、Fasリガンド(FasLまたはCD95L)、スフィンゴシン-1-リン酸(S1PR)、GPIアンカー型糖タンパク質CD24、CD25、FoxP3、CTLA-4、および他のマーカーのうちの任意の1種または複数種が任意の組合せで含まれる。本発明者らは、GITR、CD127、FasL、S1PR、およびCD24の発現レベルがCD52lo細胞と比べてCD52hiTreg細胞において高い場合があることを見い出した。したがって、これらのマーカーは、本明細書において説明するCD52hi細胞またはCD52hi細胞集団をさらに明確にするために使用することができる。
さらに、所与の細胞の機能を用いて、本明細書において説明するCD52hi細胞またはCD52hi細胞集団を明確にすることもできる。例えば、本明細書において説明するようにCD52を発現する細胞がエフェクターT細胞の機能を低下させる能力を利用して、CD52hi細胞またはCD52hi細胞集団を同定することができる。
細胞培養培地
本明細書において説明するCD52hi細胞またはCD52hi細胞集団は、本明細書において開示する可溶性糖タンパク質を含む培地を生じるように、培養され得る。適切な培養条件は、当業者には明らかであると考えられる。細胞を抗原と接触させることによるものを含む任意の適切な方法によって、可溶性CD52の発現レベルを上昇させるように培養細胞をさらに誘導することができる。
エクスビボ細胞処理
本発明はまた、以下のうちのいずれか1つまたは複数によってエクスビボで処理された細胞、好ましくは免疫細胞、および薬学的に許容される担体を含む、薬学的組成物も提供する:
(i) 可溶性CD52糖タンパク質、
(ii) 第1のタンパク質としての可溶性CD52糖タンパク質および第2のタンパク質を含む、融合タンパク質;
(iii) 成分(i)の可溶性CD52糖タンパク質のペプチド部分または成分(ii)の融合タンパク質のペプチド部分をコードする、ポリヌクレオチド;
(iv) 成分(iii)のポリヌクレオチドを含むベクター;
(v) 成分(iii)のポリヌクレオチドまたは成分(iv)のベクターを含む、単離された細胞;
(vi) 可溶性CD52糖タンパク質を産生することができる、単離されたCD52hi細胞;
(vii) 可溶性CD52糖タンパク質を産生することができる複数のCD52hi細胞を含む、単離された細胞集団;
(viii)成分(vi)の細胞または成分(vii)の細胞集団を含む細胞培養物から単離された、可溶性CD52糖タンパク質を含む細胞培養培地またはその画分;ならびに
(ix) 細胞による可溶性CD52糖タンパク質の発現レベルを上昇させることができる作用物質。
この組成物の細胞は、例えば、全血またはその細胞分画、例えば末梢血単核球(PBMC)であってよい。
このようなエクスビボで処理された細胞は、例えば、エフェクターT細胞の機能によって媒介される疾患もしくは状態、炎症または敗血症を治療または予防するために、本発明において使用され得る。
1つの態様において、これらの細胞は、投与される対象に対して自己由来である。別の態様において、細胞は、同種異系である。
薬学的組成物
本開示は、本明細書において説明する可溶性CD52糖タンパク質、融合タンパク質、ポリヌクレオチド、ベクター、細胞、細胞集団、および細胞培地のうちのいずれか1つまたは複数、ならびに細胞におけるCD52の発現レベルを上昇させることができる任意の作用物質、ならびに薬学的に許容される担体を含む、薬学的組成物を提供する。
薬学的に許容される担体には、哺乳動物および少なくとも好ましくはヒトなどの動物への投与に使用するのに適した担体が含まれる。1つの例において、「薬学的に許容される」という用語は、連邦または州政府の規制機関によって承認されていること、あるいは、動物、より具体的にはヒトで使用するために米国薬局方または他の一般的に認識されている薬局方に収載されていることを意味する。「担体」という用語は、治療剤が一緒に投与される希釈剤、賦形剤、またはビヒクルを意味する。このような薬学的担体は、ピーナッツ油、ダイズ油、鉱物油、およびゴマ油など石油、動物、植物、または合成由来のものを含む、水および油などの滅菌済み液体であってよい。
治療的組成物は、適切な純度を有する所望の化合物を任意選択の薬学的に許容される担体、賦形剤、または安定化剤と混合することにより(Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th edition, Osol, A. ed.(1980))、凍結乾燥製剤、水性液剤、または水性懸濁剤の形態で調製することができる。許容される担体、賦形剤、または安定化剤は、使用される投与量および濃度において受領者に非毒性であることが好ましく、Tris、HEPES、PIPES、リン酸、クエン酸、および他の有機酸などの緩衝剤;アスコルビン酸およびメチオニンを含む抗酸化剤;保存剤(オクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロリド;塩化ヘキサメトニウム;塩化ベンザルコニウム;塩化ベンゼトニウム;フェノール、ブチルアルコールもしくはベンジルアルコール;メチルパラベンもしくはプロピルパラベンなどのアルキルパラベン;カテコール;レソルシノール;シクロヘキサノール;3-ペンタノール;およびm-クレゾールなど);低分子量(約10残基未満の)ポリペプチド;血清アルブミン、ゼラチン、もしくは免疫グロブリンなどのタンパク質;ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー;グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、もしくはリジンなどのアミノ酸;単糖類、二糖類、および他の糖質(グルコース、マンノース、もしくはデキストリンを含む);スクロース、マンニトール、トレハロース、もしくはソルビトールなどの糖;ナトリウムなどの塩を形成する対イオン;ならびに/またはTWEEN(商標)、PLURONICS(商標)、もしくはポリエチレングリコール(PEG)などの非イオン系界面活性剤が含まれる。このような担体のその他の例には、イオン交換体、アルミナ、ステアリン酸アルミニウム、レシチン、血清タンパク質、例えばヒト血清アルブミン、緩衝物質、例えばグリシン、ソルビン酸、ソルビン酸カリウム、飽和植物脂肪酸の部分グリセリド混合物、水、塩、または電解質、例えば、硫酸プロタミン、リン酸水素二ナトリウム、リン酸水素カリウム、塩化ナトリウム、コロイドシリカ、三ケイ酸マグネシウム、ポリビニルピロリドン、およびセルロースベースの物質が含まれる。
本明細書において開示する薬学的組成物は、意図される投与経路に適合するように製剤化される。投与経路の例には、非経口(例えば、静脈内、皮内、皮下、筋肉内、腹腔内、くも膜下腔内)、粘膜(例えば、経口、直腸、鼻腔内、口腔内、膣、呼吸器官)、腸内(例えば、錠剤、カプセル剤、またはドロップなどによって経口的に、直腸に)、および経皮(局所的、例えば、皮膚上、吸入、鼻腔内、点眼薬、膣)が含まれる。非経口、皮内、腸内、または皮下適用のために使用される液剤または懸濁剤は、次の成分を含むことができる:注射用水、生理食塩水、不揮発性油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコール、または他の合成溶媒などの無菌希釈剤;ベンジンアルコールまたはメチルパラベンなどの抗菌剤;アスコルビン酸または重亜硫酸ナトリウムなどの抗酸化剤;エチレンジアミン四酢酸などのキレート剤;酢酸、クエン酸、またはリン酸などの緩衝剤;および塩化ナトリウムまたはデキストロースなど張性を調整するための作用物質。pHは、塩酸または水酸化ナトリウムなどの酸または塩基を用いて調整することができる。非経口製剤は、ガラス製またはプラスチック製のアンプル、使い捨てシリンジ、または複数回投与用バイアル中に封入することができる。
経皮送達は、患者の皮膚に長期間にわたって治療剤を曝露することによって遂行される。経皮パッチには、身体への薬学的物質の制御された送達を実現するというさらなる利点がある(例えば、Transdermal and Topical Drug Delivery: From Theory to Clinical Practice, Williams(ed), Pharmaceutical Press, UK(2003); Transdermal Drug Delivery: Developmental Issues and Research Initiatives, Hadgraft and Guy(eds.), Marcel Dekker, Inc.,(1989)を参照されたい)。例えば、単純な粘着性パッチは、裏当て材料およびアクリラート接着剤から作製することができる。治療剤および任意の促進物質(enhancer)が、接着剤流し込み溶液(adhesive casting solution)中に配合され、完全に混合させられる。この溶液が裏当て材料上へ直接流し込まれ、流し込み溶媒がオーブン中で蒸発させられて、接着剤フィルムが残る。剥離ライナーを貼り付けて、この系を完成させることができる。
あるいは、ポリウレタンマトリックスパッチを使用して、治療剤を送達することもできる。このパッチの層は、裏当て、ポリウレタン薬物/エンハンサーマトリックス、膜、接着剤、および剥離ライナーを含む。ポリウレタンマトリックスは、室温硬化性ポリウレタンプレポリマーを用いて調製される。水、アルコール、および複合物をプレポリマーに添加すると、裏当て材料のみに直接流し込める(can be directly cast only the backing material)粘着性の堅いエラストマーが形成される。
本発明のさらなる態様は、ヒドロゲルマトリックスパッチを利用する。典型的には、ヒドロゲルマトリックスは、アルコール、水、薬物、およびいくつかの親水性ポリマーを含む。このヒドロゲルマトリックスは、経皮パッチの裏当てと接着剤層の間に組み込まれてよい。
受動的送達系の場合、放出速度は通常、リザーバーと皮膚との間に配置された膜によって、一体化した器具(device)からの拡散によって、または送達系において速度制御バリアとして作用する皮膚自体によって制御される(US4,816,258;同4,927,408;同4,904,475;同4,588,580、同4,788,062を参照されたい)。送達速度は、膜の性質にある程度依存すると考えられる。例えば、体内の膜を通過する送達速度は通常、皮膚バリアを通過する場合よりも速い。
適切な浸透性膜材料は、所望の透過性の程度、複合物の性質、およびこの器具を構築することに関連して機構的に考慮すべき事柄に基づいて選択され得る。例示的な透過性膜材料には、ポリジメチルシロキサン(シリコーンゴム)、エチレン酢酸ビニルコポリマー(EVA)、ポリウレタン、ポリウレタン-ポリエーテルコポリマー、ポリエチレン、ポリアミド、ポリ塩化ビニル(PVC)、ポリプロピレン、ポリカーボネート、ポリテトラフルオロエチレン(PTFE)、セルロース系材料(例えば、三酢酸セルロースおよび硝酸/酢酸セルロース)、ならびにヒドロゲル(例えば、2-ヒドロキシエチルメタクリラート(HEMA))など多種多様な天然ポリマーおよび合成ポリマーが含まれる。
所望の器具の特徴に応じて、治療的製品の他の慣習的な成分などの他の品目を器具に含めてもよい。例えば、本発明による組成物は、1種または複数種の保存剤または静菌剤、例えば、メチルヒドロキシベンゾアート、プロピルヒドロキシベンゾアート、クロロクレゾール、および塩化ベンザルコニウムなども含んでよい。これらの薬学的組成物はまた、抗菌剤、特に抗生物質、麻酔薬、鎮痛薬、および鎮痒剤など他の有効成分も含んでよい。
本発明の別の態様は、薬学的組成物の局所的送達を提供する。この治療レジメは、薬学的物質の全身投与または局部的治療法、すなわち病理学的組織もしくは罹病組織に直接的な治療法のいずれかに適している。局所用製剤は、薬学的物質-化学的改質剤(modifier)複合体を、局所用の乾燥製剤、液体製剤、クリーム製剤、およびエアロゾル製剤中で一般に使用される従来の薬学的希釈剤および担体と混合することによって調製することができる。例えば、軟膏剤およびクリーム剤は、適切な増粘剤および/またはゲル化剤を追加することにより、水性基剤または油性基剤を用いて製剤化することができる。このような基剤には、液体パラフィンまたは植物油(例えば、ピーナッツ油もしくはヒマシ油)などの水および/または油が含まれ得る。基剤の性質に応じて使用され得る増粘剤には、軟パラフィン、ステアリン酸アルミニウム、セトステアリルアルコール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、羊毛脂、水添ラノリン、および蜜ろうなどが含まれる。ローション剤は、水性基剤または油性基剤を用いて製剤化することができ、通常、次のうちの1種または複数種も含むと考えられる:安定化剤、乳化剤、分散化剤、懸濁化剤、増粘剤、着色剤、および香料など。散剤は、任意の適切な粉末基剤、例えば、タルク、ラクトース、およびデンプンなどの助けを借りて形成され得る。ドロップは、1種または複数種の分散化剤、懸濁化剤、および可溶化剤なども含む水性基剤または非水性基剤を用いて製剤化することができる。
局所投与用の剤形には、散剤、スプレー剤、軟膏剤、パスタ剤、クリーム剤、ローション剤、ゲル剤、液剤、パッチ、および吸入剤が含まれる。活性化合物は、無菌条件下で、薬学的に許容される担体と、および必要とされる場合がある任意の保存剤、緩衝剤、または噴射剤と混合され得る。軟膏剤、パスタ剤、クリーム剤、およびゲル剤はまた、動物性脂肪および植物性脂肪、油、ワックス、パラフィン、デンプン、トラガカント、セルロース誘導体、ポリエチレングリコール、シリコーン、ベントナイト、タルク、および酸化亜鉛、またはそれらの混合物などの賦形剤も含んでよい。散剤およびスプレー剤はまた、ラクトース、タルク、水酸化アルミニウム、ケイ酸カルシウム、およびポリアミド粉末、またはこれらの物質の混合物などの賦形剤を含むことができる。スプレー剤は、クロロフルオロ炭化水素ならびに揮発性の非置換炭化水素、例えばブタンおよびプロパンなど通例の噴射剤をさらに含むことができる。
粘膜(例えば、胃腸管、舌下、口腔内、鼻、肺、膣、角膜、および眼の膜)薬物送達により、活性物質が効率的に体循環に移行し、肝臓および腸壁フローラによる即時の代謝を低減させる(例えば、Lee, 2001; Song et al., 2004; Hearnden et al., 2012を参照されたい)。経粘膜薬物剤形(例えば、錠剤、坐剤、軟膏剤、ゲル剤、膏薬、クリーム剤、膣坐剤、膜剤(membrane)、および散剤)は、典型的には、粘膜と接触した状態に保たれ、急速に分解および/または溶解して、ただちに全身に吸収される。
口腔内膜または舌下膜に送達する場合、典型的には、ロゼンジ、錠剤、またはカプセル剤などの経口製剤が使用される。これらの製剤を製造する方法は当技術分野において公知であり、限定されるわけではないが、予め製造された錠剤への薬学的物質(harmaceutical agent)-化学的改質剤複合体の添加;(US4,806,356に記載されているような)不活性な増量剤、結合剤、および薬学的物質-化学的改質剤複合体またはその複合体を含有する物質のいずれかの低温圧縮(cold compression)、ならびにカプセル化が含まれる。
通常、経口組成物は、不活性な希釈剤または食用に適した担体を含む。これらは、ゼラチンカプセル剤中に封入するか、または圧縮して錠剤にすることができる。経口的な治療的投与をするために、活性化合物は賦形剤と混合され、錠剤、トローチ剤、またはカプセル剤の形態で使用される。経口組成物はまた、口内洗剤として使用するための流動性担体を用いて調製され、その際、流動性担体中の化合物は経口的に適用され、うがいをして吐き出されるか、または飲み込まれる。薬学的に適合性のある結合剤および/または補助物質(adjuvant material)を、組成物の一部分として含めることができる。錠剤、丸剤、カプセル剤、およびトローチ剤などは、次の成分または性質が類似した化合物のいずれかを含むことができる:微結晶性セルロース、トラガカントゴム、もしくはゼラチンなどの結合剤;デンプンもしくはラクトースなどの賦形剤、アルギン酸、プリモゲル(Primogel)、もしくはトウモロコシデンプンなどの崩壊剤;ステアリン酸マグネシウムもしくはステロテス(Sterotes)などの滑沢剤;コロイド状二酸化ケイ素などの流動促進剤;スクロースもしくはサッカリンなどの甘味剤;またはペパーミント、サリチル酸メチル、もしくはオレンジ香料などの矯味剤。
別の経口製剤は、例えばUS4,940,587において説明されているような、セルロース誘導体であるヒドロキシプロピルセルロースなどの接着剤と共に口腔粘膜に適用することができるものである。この口腔内接着性製剤は、口腔内粘膜に適用された場合、口の中へおよび口腔内粘膜を通して薬学的物質-化学的改質剤複合体を制御放出することを可能にする。
鼻の膜および/または肺の膜に送達する場合、典型的には、エアロゾル製剤が使用される。「エアロゾル」という用語は、細気管支または鼻腔中に吸入されることができる、薬学的物質-化学的改質剤複合体の気体によって運ばれる任意の懸濁相を含む。具体的には、エアロゾルは、定量吸入器もしくはネブライザー、またはミストスプレーにおいて作製され得るような、本発明の化合物の液滴の気体によって運ばれる懸濁物を含む。また、エアロゾルは、吸入によって吸入器具から送達され得る、空気または他のキャリアガス中に懸濁された薬学的物質-化学的改質剤複合体の乾燥粉末組成物も含む。
粘膜投与または経皮投与の場合、浸透すべきバリアに対して適切な浸透剤を製剤中で使用することができる。このような浸透剤は、一般に当技術分野において公知であり、例えば、粘膜投与の場合は界面活性剤、胆汁酸塩、およびフシジン酸誘導体が含まれる。
注射用途に適した薬学的組成物には、無菌の水溶液(水溶性である場合)または分散液、および無菌の注射液剤または注射分散剤を用時調製するための無菌粉末が含まれる。静脈内投与の場合、適切な担体には、生理食塩水、静菌水、Cremophor(商標)(BASF, Parsippany, N.J.)、またはリン酸緩衝化生理食塩水(PBS)が含まれる。いずれの場合も、組成物は、無菌でなければならず、容易に注入できる程度に流動性であるべきである。これは製造および保存時の条件下で安定でなければならず、かつ細菌および真菌などの微生物の汚染活動から保護されなければならない。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール(例えば、グリセロール、プロピレングリコール、および液状ポリエチレン(polyetheylene)グリコールなど)、ならびにそれらの適切な混合物を含む溶媒または分散媒である。適切な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティング材料の使用によって、分散系の場合は必要とされる粒径の維持によって、および界面活性剤の使用によって、維持される。微生物活動の防止は、様々な抗菌剤および抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、およびアスコルビン酸などによって実現され得る。多くの場合、等張化剤、例えば、糖、多価アルコール、例えば、マンニトール、ソルビトール、塩化ナトリウムを組成物中に含むことが好ましい。注射用組成物の持続吸収は、吸収を遅延させる作用物質、例えばモノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンを組成物中に含めることによって実現される。
無菌注射液剤は、必要に応じて、適切な溶媒中の必要量の活性化合物を前述の成分の1種または組合せと混合し、続いてろ過滅菌することによって調製され得る。一般に、分散剤は、基本となる分散媒体および上記に列挙したもののうちの必要な他の成分を含む無菌ビヒクル中に活性化合物を混合することによって調製される。無菌注射液剤を調製するための無菌粉末の場合、好ましい調製方法は、活性成分および任意の付加的な所望の成分の粉末を、予め滅菌ろ過したその溶液から生じさせる、真空乾燥および凍結乾燥である。
薬学的に許容されるビヒクルは、副作用を引き起こさず、かつ例えば、活性化合物の投与を容易にすること、体内での有効期間(life)を長くすることおよび/または有効性を高めること、溶液への溶解性を高めること、あるいは保存性を高めることを可能にする、薬学的組成物中に入る化合物または化合物の組合せを呼ぶと理解される。これらの薬学的に許容されるビヒクルは周知であり、選択される活性化合物の性質および投与様式に基づいて当業者が適応させると考えられる。
インビボ投与に使用される薬学的組成物は、無菌であるべきである。これは、凍結乾燥および再構成の前または後に滅菌ろ過膜に通すろ過によって、容易に達成される。組成物は、全身に投与される場合、凍結乾燥形態で、または溶液中で保存されてよい。凍結乾燥形態である場合、典型的には、使用時に適切な希釈剤を用いて再構成するための他の成分と組み合わせて製剤化される。液体製剤の例は、皮下注射用に1回量バイアルに詰められた、保存処置がなされていない無菌の清澄な無色液剤である。
一般に、薬学的組成物は、無菌取出口を有する容器、例えば、皮下注射針によって貫通可能な栓を有する静注液バッグまたはバイアル中に入れられる。好ましくは、組成物は、例えば静注もしくは輸注として非経口的に投与されるか、または体腔中に投与される。
本明細書において開示する薬学的組成物は、エフェクターT細胞の機能および/または免疫応答を抑制することが公知であるその他の治療剤をさらに含んでよい。
1つの態様において、組成物はインスリンをさらに含む。
別の態様において、組成物は自己抗原をさらに含む。本発明の組成物中で有用な自己抗原の例には、表1に挙げるものが含まれるが、それらに限定されるわけではない(Lernmark, 2001)。
（表１）ヒト自己免疫障害に関連付けられている自己抗体によって認識される、組換え自己抗原または精製された自己抗原
Figure 0006004594
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治療方法
本明細書において説明する可溶性CD52糖タンパク質、融合タンパク質、ポリヌクレオチド、ベクター、細胞、細胞集団、細胞培地、および薬学的組成物、ならびに細胞におけるCD52の発現レベルを上昇させることができる任意の作用物質は、エフェクターT細胞の機能、炎症または敗血症を抑制するのに使用され得る。したがって、本明細書において説明する可溶性CD52糖タンパク質、融合タンパク質、ポリヌクレオチド、ベクター、細胞、細胞集団、細胞培地、および薬学的組成物、ならびに細胞におけるCD52の発現レベルを上昇させることができる任意の作用物質は、炎症または敗血症を含む、エフェクターT細胞の機能によって媒介される任意の疾患または状態を治療するのに使用され得る。
1つの例において、エフェクターT細胞によってもたらされる疾患または状態は、自己免疫疾患、同種移植拒絶、移植片対宿主反応、またはアレルギー性疾患であってよい。「自己免疫疾患」という用語は、身体が自身の組織の何らかの成分に対する免疫原性(すなわち免疫系)応答を引き起こす、任意の疾患を意味する。自己免疫疾患は、主に1つの器官が影響を受けるもの(例えば、溶血性貧血および抗免疫甲状腺炎)および自己免疫疾患プロセスが多数の組織を通って拡散される疾患(例えば全身性エリテマトーデス)に分類することができる。自己免疫疾患は、(限定されるわけではないが)、インスリン依存性糖尿病(または1型糖尿病)、インスリン自己免疫症候群、関節リウマチ、乾癬性関節炎、慢性ライム関節炎、狼瘡、多発性硬化症、クローン病、潰瘍性大腸炎を含む炎症性腸疾患、セリアック病、自己免疫性甲状腺疾患、自己免疫性心筋炎、自己免疫性肝炎、天疱瘡、抗尿細管基底膜疾患(anti-tubular basement membrane disease)(腎臓)、家族性拡張型心筋症、グッドパスチャー症候群、シェーグレン症候群、重症筋無力症、多内分泌腺不全、白斑、末梢神経障害、自己免疫性多発性内分泌腺症候群I型、急性糸球体腎炎、成人発症型の特発性副甲状腺機能低下症(AOIH)、全頭脱毛症、橋本甲状腺炎、グレーブス病、アジソン病、慢性ベリリウム症候群、強直性脊椎炎、若年性皮膚筋炎、多発性軟骨炎、強皮症、限局性腸炎、遠位回腸炎、肉芽腫性腸炎、限局性回腸炎、および末端回腸炎、筋萎縮性側索硬化症、強直性脊椎炎、自己免疫性再生不良性貧血、自己免疫性溶血性貧血、ベーチェット病、セリアック病、慢性活動性肝炎、CREST症候群、皮膚筋炎、拡張型心筋症、好酸球増多筋痛症候群、後天性表皮水疱症(EBA)、巨細胞性動脈炎、グッドパスチャー症候群、ギラン・バレー症候群、ヘモクロマトーシス、ヘノッホ・シェーンライン紫斑病、特発性IgA腎症、インスリン自己免疫性症候群、若年性関節リウマチ、ランバート・イートン症候群、線状IgA皮膚症、心筋炎、ナルコレプシー、壊死性血管炎、新生児狼瘡症候群(NLE)、ネフローゼ症候群、類天疱瘡、天疱瘡、多発性筋炎、原発性硬化性胆管炎、乾癬、急速進行性糸球体腎炎(RPGN)、ライター症候群、スティッフマン症候群、炎症性腸疾患、変形性関節症、ならびに甲状腺炎などのうちのいずれか一つまたは複数であってもよい。1つの例において、自己免疫疾患は1型糖尿病である。別の例において、自己免疫疾患は関節リウマチである。別の例において、状態は、同種移植拒絶または移植片対宿主反応である。したがって、本明細書において開示する方法は、可溶性CD52糖タンパク質、融合タンパク質、ポリヌクレオチド、ベクター、細胞、細胞集団、細胞培地、作用物質、および薬学的組成物のうちのいずれか1つまたは複数を移植レシピエントに投与する段階を含んでよい。
アレルギー性疾患は、(限定されるわけではないが)、食物アレルギー、空中浮遊物質に対するアレルギー(airborne allergy)、チリダニアレルギー、ネコアレルギー、もしくはハチ毒アレルギー、または他のアレルギーのうちのいずれか一つまたは複数であってもよい。
炎症は、物理的作用物質、化学的作用物質、または生物学的作用物質が原因で生じる損傷または異常な刺激に対する応答として起こり得る。炎症反応は、局所的反応および結果として生じる形態的な変化、感染性生物などの有害な物質の破壊または除去、ならびに修復および治癒につながる応答を含み得る。
炎症は、炎症性障害において起こる。「炎症性」という用語は、障害に関して使用される場合、不適切であるか、または通常の様式では消散しない炎症によって引き起こされるか、そのような炎症に起因するか、またはそのような炎症をもたらす、病理学的プロセスを意味する。炎症性障害は、全身性であるか、または特定の組織もしくは器官に局在していてもよい。炎症は、多くの障害(そのうちのいくつかは自己免疫疾患である)で起こることが公知であり、これらの障害には、限定されるわけではないが次のものが含まれる:全身炎症反応(SIRS);アルツハイマー病(ならびに次のものを含む、関連する状態および症状:慢性の神経炎症、膠細胞活性化(glial activation);小膠細胞の増加;老人斑形成);筋萎縮性側索硬化症(ALS)、関節炎(ならびに限定されるわけではないが、次のものを含む、関連する状態および症状:急性関節炎症、抗原誘発関節炎、慢性リンパ球性甲状腺炎に関連する関節炎、コラーゲン誘発関節炎、若年性関節炎、関節リウマチ、変形性関節症、予後(prognosis)関節炎および連鎖球菌誘発関節炎、脊椎関節症、および痛風関節炎)、喘息(ならびに次のものを含む、関連する状態および症状:気管支喘息;慢性閉塞性気道疾患、慢性閉塞性肺疾患、若年性喘息および職業性喘息);循環器系疾患(ならびに次のものを含む、関連する状態および症状:アテローム性動脈硬化症、自己免疫性心筋炎、慢性心臓低酸素症、うっ血性心不全、冠動脈疾患、心筋症、および心臓細胞機能障害(大動脈平滑筋細胞活性化、心臓細胞アポトーシス、および心臓細胞機能の免疫調節を含む);糖尿病(ならびに次のものを含む、関連する状態:自己免疫性糖尿病、インスリン依存性(1型)糖尿病、糖尿病性歯周炎、糖尿病性網膜症、および糖尿病性腎症);胃腸炎症(ならびに次のものを含む、関係する状態および症状:セリアック病、関連する骨減少症、慢性大腸炎、クローン病、炎症性腸疾患、および潰瘍性大腸炎);胃潰瘍;ウイルス肝炎および他のタイプの肝炎などの肝臓炎症、コレステロール胆石、ならびに肝線維症;HIV感染症(ならびに次のものを含む、関連する状態:変性反応、神経変性反応、およびHIV関連ホジキン病);川崎病(ならびに次のものを含む、関連する疾患および状態:皮膚粘膜リンパ節症候群、頸部リンパ節腫脹、冠動脈病変、浮腫、発熱、白血球増加、軽度の貧血、皮膚の剥離、発疹、結膜発赤、血小板増加);腎症(ならびに次のものを含む、関連する疾患および状態:糖尿病性腎症、末期腎疾患、急性および慢性の糸球体腎炎、急性および慢性の間質性腎炎、ループス腎炎、グッドパスチャー症候群、血液透析生存、ならびに腎臓の虚血性再灌流傷害);神経変性疾患または神経病理学的状態(ならびに次のものを含む、関連する疾患および状態:急性神経変性、加齢および神経変性疾患におけるIL-Iの誘導、IL-Iに誘導された視床下部神経細胞の可塑性および慢性のストレス応答性亢進、脊髄症);眼疾患(ならびに次のものを含む、関連する疾患および状態:糖尿病性網膜症、グレーブス眼症、角膜潰瘍を含む角膜の損傷または感染に関連する炎症、およびブドウ膜炎)、骨粗しょう症(ならびに次のものを含む、関連する疾患および状態:歯槽骨、大腿骨、橈骨、椎骨、または手根骨の骨量減少または骨折発生、閉経後の骨量減少、骨折発生、または骨量減少の速度);中耳炎(成人または小児科); 膵炎または膵臓細葉炎(pancreatic acinitis);歯周病(ならびに成人型、早期発症型、および糖尿病性を含む、関連する疾患および状態);肺疾患(慢性肺疾患、慢性副鼻腔炎、ヒアリン膜症、SIDSにおける低酸素症および肺疾患を含む);冠動脈または他の血管移植片の再狭窄;リウマチ(関節リウマチ、リウマチ性アショフ体、リウマチ性疾患、およびリウマチ性心筋炎を含む);慢性リンパ球性甲状腺炎を含む甲状腺炎;尿路感染症(慢性前立腺炎、慢性骨盤痛症候群、および尿石症を含む);免疫学的障害(自己免疫疾患、例えば、円形脱毛症、自己免疫性心筋炎、グレーブス病、グレーブス眼症、硬化性苔癬、多発性硬化症、乾癬、全身性エリテマトーデス、全身性硬化症、甲状腺疾患(例えば、甲状腺腫およびリンパ腫性甲状腺腫(橋本甲状腺炎、リンパ節様甲状腺腫))を含む);肺損傷(急性出血性肺損傷、グッドパスチャー症候群、急性虚血性再灌流)、職業的および環境的な汚染物質によって引き起こされる心筋機能障害(例えば、有毒油症候群珪肺症に対する易罹患性)、放射線外傷、および創傷治癒反応の効率(例えば、火傷または熱傷、慢性創傷、外科的創傷、および脊髄損傷)、敗血症、急性期反応(例えば発熱応答)、全身性炎症反応、急性呼吸困難反応、急性全身性炎症反応、創傷治癒、癒着、免疫炎症反応、神経内分泌反応、熱発生および熱耐性、急性期反応、ストレス応答、疾患感受性、反復動作によるストレス、テニス肘、ならびに疼痛管理および疼痛反応。
治療の方法は、本明細書において説明する可溶性CD52糖タンパク質、融合タンパク質、ポリヌクレオチド、ベクター、細胞、細胞集団、細胞培地、もしくは薬学的組成物のうちのいずれか1つもしくは複数、または細胞におけるCD52の発現レベルを上昇させることができる任意の作用物質の治療的有効量を、それを必要とする対象に投与する段階を含んでよい。
「治療的有効量」は、臨床家によって決定されてよく、年齢、体重、性別、および他の因子などの因子に応じて、患者ごとに異なってよい。
診断方法
可溶性CD52がTreg機能のメディエーターであるという本発明者らの知見に基づいて、本開示は、本明細書において説明するようにエフェクターT細胞によってもたらされる任意の疾患もしくは状態、炎症または敗血症に対する対象の易罹患性を判定する方法も提供する。診断方法は、対象から得られた試料における可溶性CD52のレベル、CD52hi細胞の出現率、およびCD52hi細胞の機能のうちのいずれか1つまたは複数の検出に基づいていてもよい。
可溶性CD52のレベルは、当技術分野において公知である任意の適切な方法によって測定されてよい。例えば、可溶性CD52のレベルは、可溶性CD52に結合する抗体を用いて、イムノアッセイ法によって測定され得る。適切な抗体には、ヒト化ラットモノクローナル抗体CAMPATH-1G、ヒトCD52に対する蛍光標識マウスモノクローナル抗体(例えばCF1D12)、およびCD52に対するウサギポリクローナル抗体(Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA)などが含まれる。
CD52hi細胞の出現率は、例えば、試料中の細胞膜結合型CD52のレベルを検出することによって、試料中のCD52タンパク質の発現レベルを検出することによって、および/または試料中のCD52 mRNAの発現レベルを検出することによって、検出され得る。
CD52hi細胞の機能は、本明細書において開示する方法のいずれかを含む、任意の適切な方法を用いて測定され得る。
診断方法は、対象から得られた任意の適切な試料を用いて実施されてよい。1つの例において、試料は、ヒト対象などの哺乳動物対象から得られ、例えば、末梢血単核球(PBMC)、白血球フェレーシス血液製剤またはアフェレーシス血液製剤、骨髄、臍帯血、肝臓、胸腺、組織生検材料、腫瘍、リンパ節組織、腸管関連リンパ組織、粘膜関連リンパ節組織、脾臓組織、もしくは他の任意のリンパ組織を含むいくつかの供給源に由来しても、または膵臓を含む任意の疾患部位に由来してもよい。好ましい態様において、細胞試料は、対象の末梢血から得た血液試料由来のPBMCに由来する。
診断方法は、抗原と接触させたPBMCを含む試料における可溶性CD52のうちのいずれか1つまたは複数のレベル、CD52hi細胞の出現率、およびCD52hi細胞の機能を検出する段階を含んでよい。したがって、これらの方法は、試料を抗原と接触させる段階を含んでよい。1つの例において、抗原は自己抗原であってよい。
本明細書において開示する診断方法の1つの具体的な応用において、可溶性CD52のレベル、CD52hi細胞の出現率、および/またはCD52hi細胞の機能は、ある対象が薬物スクリーニング試験への登録に対して適性であるかを確認するために測定され得る。したがって、ある対象が、低レベルの可溶性CD52糖タンパク質、CD52hi細胞の低い出現率、および/またはCD52hi細胞の機能低下を示す場合、その対象は、本明細書において説明するように、エフェクターT細胞によってもたらされる任意の疾患もしくは状態、炎症、または敗血症の治療において使用されることが意図される薬物のスクリーニング試験に含めるのに特に適していると認定され得る。1つの例において、このスクリーニングは、推定上の抗糖尿病薬(特に、抗1型糖尿病薬)を同定するために実施され得る。
本明細書において説明する診断方法は、1名または複数名の健常者から得られた試料から、可溶性CD52、CD52hi細胞の出現率、および/またはCD52hi細胞の機能の基準レベルを決定する段階をさらに含んでよい。あるいは、基準レベルはあらかじめ定められていてもよい。対象から得られた試料中の可溶性CD52、CD52hi細胞の出現率、および/またはCD52hi細胞の機能のレベルを基準レベルと比較することによって、本明細書において説明するように、エフェクターT細胞によってもたらされる任意の疾患もしくは状態、炎症、または敗血症に対する対象の易罹患性を示唆することができる。例えば、対象から得られた試料中の可溶性CD52、CD52hi細胞の出現率、および/またはCD52hi細胞の機能のレベルが基準レベルより低い場合、その対象は、本明細書において説明するように、エフェクターT細胞によってもたらされる疾患もしくは状態、炎症、または敗血症を発症しやすいとみなすことができる。試料のレベルと基準レベルの差が大きいほど、本明細書において説明するように、エフェクターT細胞によってもたらされる疾患もしくは状態、炎症、または敗血症の発症に対する対象の易罹患性が高いことが示唆され得る。エフェクターT細胞によってもたらされる疾患もしくは状態、炎症、または敗血症を対象が発症するリスクの上昇を示唆する厳密な値は、当業者によって理解されるように、診断される個々の疾患または状態、診断に使用される試料、基準レベルを準備するのに使用される健常個体の集団、および他の因子を含むいくつかの因子に応じて変動することが認識されるであろう。
本開示はまた、エフェクターT細胞の機能および/または免疫応答を抑制することができる作用物質をスクリーニングする方法であって、本明細書において説明する細胞または細胞集団(例えば、CD52hi細胞またはCD52hi細胞集団)を試験物質と接触させる段階、および可溶性CD52のレベル、CD52hi細胞の出現率、および/またはCD52hi細胞の機能をその後に検出する段階を含み、試験物質との接触後に、可溶性CD52糖タンパク質のレベルが高くなっている場合、CD52hi細胞の出現率が高くなっている場合、および/またはCD52hi細胞の機能が増強されている場合、その試験物質が、エフェクターT細胞の機能および/または免疫応答を抑制することができる作用物質として使用するのに潜在的に適している可能性があることが示唆される、方法も提供する。
別の態様において、本開示はまた、可溶性CD52糖タンパク質のエフェクターT細胞抑制機能および/または免疫系抑制機能を模倣することができる作用物質を同定する方法であって、本明細書において説明する細胞または細胞集団(例えば、CD52hi細胞またはCD52hi細胞集団)を試験物質と接触させる段階、および可溶性CD52のレベル、CD52hi細胞の出現率、および/またはCD52hi細胞の機能をその後に検出する段階を含み、試験物質との接触後に、可溶性CD52糖タンパク質のレベルが低くなっている場合、CD52hi細胞の出現率が低くなっている場合、および/またはCD52hi細胞の機能が低下している場合、その試験物質が、可溶性CD52糖タンパク質のエフェクターT細胞抑制機能および/または免疫系抑制機能を模倣することができることが示唆される、方法も提供する。
以下の非限定的な実施例を参照して、本発明を以下にさらに説明する。
実験手順
血液ドナー
ヘパリンナトリウムチューブに抜き取られた静脈血は、インフォームドコンセントおよびヒト研究倫理委員会(Human Research Ethics Committee)の許可を得て、健康な若年成人5名(男性3名、女性2名)およびT1Dのリスクを有する若年成人男性1名(全員がGAD65に対する血液T細胞応答を有することが公知である)から得た。ドナーは全員、破傷風トキソイドに対するワクチン接種を受けていた。フィコール/ハイパック(Amersham Pharmacia Biotech AB, Uppsala, Sweden)を用いて末梢血単核球(PBMC)を単離し、ヒト等張リン酸緩衝化生理食塩水(PBS)中で2回洗浄し、5％熱失活プールヒト血清、100mM非必須アミノ酸、2mMグルタミン、および5×10-5M 2-メルカプトエタノールを含有するイスコフ改変ダルベッコ培地(Gibco, Melbourne, Australia)(完全イスコフ改変ダルベッコ培地[IMDM])に再懸濁した。
抗体および他の試薬
試薬および供給業者は次のとおりであった:ヒトCD52(クローンCF1D12)およびCD24(クローンSN3)(Caltag)、FoxP3、GITR、ICOS、CD25、CD127、ならびにヒトSiglec-10(クローン5G6)(Biolegend, San Diego, CA, USA)に対する蛍光標識マウスモノクローナル抗体;マウスIgG3(Caltag);CD52に対するウサギポリクローナル抗体(Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA);HRP結合型ウマ抗ウサギIgGおよび抗マウスIgG(Cell Signaling, Arundal, QLD, Australia);ECL試薬(GE Healthcare, Rydalmere, NSW, Australia)、CD52に対するヒト化ラットモノクローナル抗体(CAMPATH-1G)(Bayer Healthcare, Pymble, NSW, Australia)、ヒトIFN-γに対するマウスモノクローナル抗体(Mabtech, Sydney, NSW, Australia)およびIL-10Raに対するマウスモノクローナル抗体(クローン37607)、ヤギ抗ヒトTGF-βRIIならびにヒトSiglec-10および組換えヒトSiglec-10-Fcに対するアフィニティー精製ヤギ抗体(R&D Systems, Minneapolis, MN); IL-2(NCIBRB Preclinical Repository, Rockville, MD);合成ヒトCD52ペプチド(GL Biochem, Shanghai);インドメタシン、ニトロ-L-アルギニンメチルエステル、1-メチル-dl-トリプトファン、SCH58261(アデノシンA2A受容体拮抗薬)(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA);カルボキシフルオレセイン二酢酸スクシンイミジルエステル(CFSE)(Molecular Probes, Eugene, OR, USA);ノイラミニダーゼ(ウェルチ菌(C. perfringens)V型)(Sigma-Aldrich, Castle Hill, Australia);3Hチミジン(ICN, Sydney, Australia);0.4μm Corning Costarトランスウェル(Crown Scientific, Minto, NSW, Australia);プロテインGおよびプロテインAセファロース(WEHI Monoclonal Lab, Bundoora, Victoria Australia)、ホスホリパーゼC阻害剤(U7322)およびホスホリパーゼD阻害剤(1,10-フェナントロリン)(Sigma-Aldrich Pty. Ltd. NSW, Australia)、ホスホリパーゼC(Molecular Probes, Eugene, OR, USA)、PNGアーゼF(New England Biolabs, Ipswich, MA, USA)、Strep-Tactinセファロース(IBA GmbH Gottingen, Germany)。破傷風トキソイド(TT)は、CSL(Parkville, Victoria, Australia)によって寛大にも提供された。文献に記載されているようにして(Bach et al., 1997)バキュロウイルス(Baculovirus)において作製され精製された組換え GAD65を、Dr Peter Van Endert, Hopital Necker, Parisから購入した。リムルスライセートアッセイ法(Bio Whittaker, Walkerville, MD, USA)によって測定したGAD65原液のエンドトキシン濃度は、1.2EU/mg/mlであった。TTおよびGAD65は、別段の定めが無い限り、それぞれ10ライアンズフロキュレーション単位(Lyons flocculating unit)(LFU)/mlおよび5μg/mlの濃度で使用した。サイトカインおよび可溶性IL-2受容体α(CD25)は、Milliplex MAPビーズアレイ(Abacus ALS, Brisbane, Australia)を用いて媒体中で分析した。
統計学的解析
反復実験の結果(replicates)を平均値±標準誤差として表した。群間の有意性は、Macintosh用のGraphPad Prismバージョン3.0cx(GraphPad Software Inc., San Diego, CA)を用いて、対応のない(両側)スチューデントのt検定によって判定した。
実施例1:GAD65特異的CD4 + T細胞クローンの解析
方法
文献に記載されているようにして(Dromey et al., 2011)、前もって作製しGAD65特異的サプレッサー機能についてスクリーニングしておいたGAD65特異的CD4+T細胞クローンを解凍し、培養した。最初に、サプレッサークローンおよび非サプレッサークローンを、固相抗体のアレイ(Medsaic Ptd Ltd, Sydney, Australia)に対する表面マーカーを指標としてスクリーニングした(Belov et al., 2003)。クローン(1×106個)を培養物から直接採取し、休止時またはプレートに結合させた抗CD3(5μg/ml)で24時間刺激した後に解析した。フローサイトメトリーによって表現型解析するために、氷上で、適切な濃度の標識抗体で細胞を染色した。細胞内FoxP3および細胞内CTLA-4に関する染色を組み合わせた。
結果
CD抗体アレイを用いて、自己由来のサプレッサークローンおよび非サプレッサークローンのペアを表面表現型の差異についてスクリーニングしたところ、活性化されたサプレッサークローンの方が一貫してCD52を高発現していることが見出されることが明らかになり、この結果はフローサイトメトリーによって確認された(図1を参照されたい)。したがって、CD52をTreg細胞の潜在的マーカーとして同定した。
実施例2:血液CD4 + CD52 hi T細胞の解析
方法
カルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステル(CFSE)で染色したPBMCを、6レプリケート(replicate)ずつ、2×105個/200μlの濃度で、GAD65またはTTの存在下または非存在下、96ウェル丸底プレートにおいてIMDM中で培養した。7日後、レプリケートを集め、0.1％BSA-PBS中で洗浄し、抗ヒトCD4-PE抗体、抗ヒトCD4-PECy7抗体、または抗ヒトCD4-APC抗体、および抗ヒトCD52-PE抗体(クローンCF1D12)を用いて氷上で染色した。文献に記載されているようにして(Dromey et al., 2011)、GAD65に応答して分裂を経ていた生存能力がある(ヨウ化プロピジウム陰性)CFSEdimCD4+細胞を、FACSAria(BD Biosciences, North Ryde, NSW, Australia)を用いてCD52発現が最も高い画分から最も低い画分に選別し、単細胞をクローニングした。続いて、GAD65またはTTに応答して、未分裂のCD4+細胞においてCD52発現の上位10％および下位10％にそれぞれ相当するCD52hi集団およびCD52lo 集団を、さらに調査するために選別した。生じたGAD65特異的サプレッサークローンの大多数が、CD52+細胞の上位10％に由来するため、これらのカットオフ値を選んだ(表1を参照されたい)。
連続した4週間に渡って同じドナーから得たPBMCを用いた場合、GAD65に応答したCD52hiとCD52loの比のアッセイ間変動係数は21.8％であった。休止状態のPBMCをCD4+CD52hiおよびCD4+CD52lo細胞に選別し、また、選別せずに対照としても回収した。別途の実験において、CFSE標識に先立って、AutoMACS選択(Miltenyi Biotec)によってPBMCからCD25+細胞を枯渇させた;アイソタイプを一致させたモノクローナル抗体を、対照「枯渇」として使用した。
GAD65またはTTによって活性化されたCD52hiCD4+細胞およびCD52loCD4+細胞の機能を2つの方法で解析した。1つめの方法では、選別したCD52hi細胞またはCD52lo細胞を、TTによって活性化されるCD4+T細胞と1:1の比(1×104個/ウェル)で96ウェルプレートのウェル6つ中で同時培養した。各ウェルは、APCとしての放射線照射済み自己由来PBMC 5×104個およびTTによって活性化される自己由来CD4+T細胞の増殖を刺激するためのTTも含んだ。6つのウェルのうちの3つにGAD65を添加して、選別された細胞を再刺激した。対照として、放射線照射済みPBMCも、GAD65の存在下または非存在下で培養した。48時間後、3Hチミジン(37kBq)を各ウェルに添加し、16時間後に細胞を採取した。2つめの方法では、選別したCD52hiCD4+細胞またはCD52loCD4+細胞(それぞれ5〜20,000個)を、予め結合させた抗IFN-γ抗体を含む96ウェルELISpotプレート(Millipore PVDF MultiScreen HTS)において6ウェル1組で、単独または1:1の比で組み合わせて培養した。また、各ウェルは、4倍の数の放射線照射済自己由来PBMCもAPCとして含んだ。6つのウェルのうちの3つにGAD65またはTTを添加して、選別された細胞を再刺激した。24時間後、洗浄によって細胞を除去し、ビオチン標識二次抗体、続いてストレプトアビジン-アルカリホスファターゼおよびBCIP/NBT色試薬とインキュベーションすることによってスポットを発色させた。結果は、IFN-γスポット/CD4+細胞5,000個として表した。
結果
GAD65特異的サプレッサークローンの大多数(22/29、76％)が、CD52発現が最も強い(上位10％)、GAD65によって活性化されたCD4+T細胞に由来することが判明した(表1)。したがって、サプレッサークローンは、クローニング条件の人為的結果(artefact)ではなく、初代血液CD52hiCD4+T細胞に由来すると思われる。
（表１）CD52発現に基づいて分画された、GAD65によって活性化されたCD4+T細胞に由来するサプレッサークローン*
Figure 0006004594
*GAD65反応性T細胞を有することが公知である健常個体に由来するPBMCをCFSEで標識し、GAD65と共に7日間インキュベートした。以前の文献に記載されているようにして(Dromey et al., 2011)、各CD52+画分から、分裂を経ていた生存能力がある(ヨウ化プロピジウム陰性)CFSEdimCD4+単細胞240個を、FACSによって96ウェルプレートのウェルに選別し、クローニングした。
†未分裂のCD4+T細胞におけるCD52発現に対応する。
GAD65特異的CD4+サプレッサークローンの大多数が、未分裂のCD4+細胞における上位10％に対応するCD52発現を示す分裂細胞に由来していたため、活性化後のCD52hiCD4+集団を定義するのにこの閾値が使用され得る。GAD65によって再活性化した場合、選別されたCD52hiCD4+細胞は、自己由来のTT特異的CD4+T細胞の増殖を抑制したが、CD52loCD4+細胞は抑制しなかった(図2A)。抑制がCD52hi細胞に特異的であり選択方法に起因しないことを確実にするために、GAD65によって活性化されたCD4+細胞を、他の2種のGPIアンカー型糖タンパク質、すなわちCD24およびCD59の高発現に関して、ならびにCD62L、HLA-DR、CD80、およびICOSに関して選別したが、これらの集団は、TT特異的T細胞の増殖を抑制しなかった(データ不掲載)。
また、GAD65による再活性化後に選別されたCD52hiCD4+T細胞とCD52loCD4+T細胞の機能の差を、ELISpotアッセイ法によって実証した。IFN-γを分泌する細胞比率はCD52lo細胞よりもCD52hi細胞の方が低く、CD52lo細胞にCD52hi細胞を加えると、再活性化に応答したIFN-γ分泌細胞の数は減少した(図2BのCD52hi+CD52lo細胞(p<0.002)をCD52lo+CD52lo細胞(p<0.0002)と比較されたい)。抑制は、GAD65によって活性化されたCD52hiCD4+T細胞に特有ではなく、破傷風トキソイド(TT)を活性化抗原として使用した場合にも観察された(図2C)。TTに対するT細胞応答の方が強かったため、その後の研究ではTTを抗原として主に使用した。低濃度のIL-2(10U/ml)を補充すると、再活性化に応答したCD52hiIFN-γ分泌細胞およびCD52loIFN-γ分泌細胞の両方の数が増加したが、CD52hi細胞による抑制は変化しなかった(図2C)。活性化されていない多特異性PBMCから選別されたCD52hiCD4+細胞は、GAD65またはTTによって活性化されたT細胞の弱い、通常は有意な抑制を示した(データ不掲載)。しかし、抗原活性化後、サプレッサーCD52hiCD4+細胞は既存のCD52hiCD4+細胞に由来する可能性が高かった。休止状態のPBMCからこれらの細胞を枯渇させると、残存T細胞のGAD65に対する応答が増大したことがその理由である(図2D)。
実施例3:CD52 hi CD4 + T細胞は、CD4 + CD25 + Treg細胞と異なる
方法
PBMCを抗CD25α抗体で標識し、AutoMACSカラムを用いてCD25hi細胞を枯渇させた(アイソタイプ対照抗体「枯渇」と比べて84％)。次いで、細胞をCFSEで標識し、TTと共に7日間インキュベートした後、TTによって再活性化されたCD52hi細胞およびCD52lo細胞に選別し、ELISpotアッセイ法によって解析した。
結果
CD25hi細胞の枯渇後、TTに応答した分裂CD52hiCD4+細胞の比率は上昇した(対照枯渇の11.8％に対して18.1％)が、TTによる再活性後のそれらのサプレッサー機能は不変のままであった(図3)。したがって、サプレッサーCD52hiCD4+細胞は、CD4+CD25+T細胞集団に由来しないと思われる。
実施例4: CD52 hi CD4 + T細胞の表現型解析
方法
PBMCをTTと7日間インキュベーションした後の、分裂したCD52hiCD4+T細胞(黒い線)およびCD52loCD4+T細胞(灰色の線)における(A)CD25α、(B)FoxP3、(C)表面CTLA-4および(D)細胞内CTLA-4、(E)GITR、(F)CD127、(G)CD24、ならびに(H)CD59の発現のフローサイトメトリー解析。アイソタイプ対照抗体による染色は、灰色に塗って示している。結果は、5個体を代表している。
結果
CD4+CD25+Treg細胞は、CD25、FoxP3、CTLA-4、および糖質コルチコイド誘導性腫瘍壊死因子受容体関連タンパク質(GITR)を高発現し(Sakaguchi et al., 2008; Shevach, 2006)、CD127を低発現する(Seddiki et al., 2006; Liu et al., 2006)。一方、GITRの高発現を除いては、CD52hiCD4+T細胞は、CD52loCD4+T細胞と比べて、CD25、FoxP3、およびCTLA-4の発現は同様であり、CD127の発現は一貫して高かった(図4)。CD52に構造が関係しているGPIアンカー型糖タンパク質CD24(Tone et al., 1999)の発現は、CD52hiCD4+T細胞において強かったが、GPIアンカー型のCD59(図4)およびCD73も、ならびにCD103、CD40、β7インテグリン、ICOS、およびPD-1も、そうではなかった(データ不掲載)。したがって、CD52hiCD4+T細胞は、ヒトCD4+CD25+Treg細胞を定義するのに使用されるマーカーの発現を特徴とせず、抗原による活性化を背景として検出されるサプレッサー細胞の新規な集団であり、T細胞分裂時のT細胞恒常性にそれらが寄与することが暗示される。
実施例5:CD52 hi CD4 + T細胞の遺伝子発現解析
方法
CD52遺伝子およびCD52hiCD4+T細胞において発現が増大していることが見出されるタンパク質の遺伝子の発現を、定量的リアルタイムRT-PCRによって調査した。GAD65による活性化後7日目に、CFSE標識したCD52hiCD4+T細胞およびCD52loCD4+T細胞を3個体から選別した。RNAeasy Mini Kit(Qiagen, Melbourne, Australia)を用いて、細胞から全RNAを抽出し、RNアーゼフリーDNアーゼ(Qiagen)で処理し、Agilent 2100 Bioanalyserを用いて定量した。反応1回あたり10ngのRNAから、cDNAを逆転写した。PrimerExpressソフトウェアを用いて設計され、Sigma-Aldrich(Castle Hill, NSW, Australia)によって合成されたPCR用プライマーは次のとおりであった:
Figure 0006004594
Power SYBR Green PCR Master Mixは、Applied Biosystemsから入手した。cDNAの3つ組の試料を、製造業者のプロトコールに従ってABI Prism 7900装置における40サイクルの増幅に供した。内在性β-アクチン発現に対して標準化されたmRNA発現は、ABI User Bulletin 2(docs.appliedbiosystems.com/pebiodocs/04303859.pdf)中で説明されているようにして、式2-ΔΔCtに従う比較限界閾値(comparative critical threshold)(Ct)法によって定量した。
結果
フローサイトメトリー発現解析と一致して、CD52、CD127、およびGITRの転写物は、CD52lo細胞よりもCD52hi細胞において多かった(図5)。
実施例6:CD52 hi 細胞による抑制は、CD24の発現レベルの影響を受けない
方法
構造が関係しているGPIアンカー型糖タンパク質CD24の発現を解析するために、CFSE標識したPBMCをTTと共に7日間インキュベートし、CD52hiCD24loCD4+T細胞、CD52hiCD24hiCD4+T細胞、CD52loCD24loCD4+T細胞、およびCD52loCD24hiCD4+T細胞に選別した。各集団(細胞5,000個)を、選別されたCD52loレスポンダー細胞(5,000個)および放射線照射照射済PBMC(20,000個)と共にインキュベートし、ELISpotアッセイ法によって解析した。結果は、三つ組の平均値＋標準誤差である。
結果
CD52に構造が関係しているGPIアンカー型糖タンパク質CD24(Tone et al, 1999)の発現は、CD52hiCD4+T細胞において強かった。抗原によって活性化されたCD24hiCD4+T細胞は、CD52hiCD4+T細胞とは異なり、抑制性ではなかったが、CD24が、サプレッサー機能を有するCD52hiCD4+T細胞をよりうまく表すか判定することが重要であった。TTによって活性化されたPBMCを、CD52発現およびCD24発現の両方に基づいて、4つの異なるCD4+集団に選別し、次いで、TTによる再活性化後のサプレッサー機能を試験した。これにより、CD52hi細胞による抑制がCD24発現の影響を受けないことが明らかになった(図6)。
実施例7:CD52 hi Treg機能は、細胞間接触を必要としない
方法
一緒にされるかまたは半透性の0.4μmトランスウェルによって分離され、TTによって再活性化された、TTによって活性化され選別されたCD52hiCD4+細胞およびCD52loCD4+細胞による3Hチミジン取込み(cpm)。CFSE標識したPBMCをTTと共に7日間インキュベートし、CD52hiCD4+細胞およびCD52loCD4+細胞に選別した。選別された細胞(各100,000個)を、48ウェルプレートにおいて、両方の区画が放射線照射済PBMCおよびTTを含むトランスウェルの存在下で、放射線照射済自己由来PBMC(400,000個)およびTTと共にインキュベートした。下側区画中の細胞による3Hチミジン取込みを48時間後に測定した。
結果
抗原によって活性化されたCD52hiCD4+T細胞のサプレッサー機能は、細胞間接触がなくても、トランスウェルを超えて保持されていた(図7)。したがって、本開示は、CD52hiCD4+Treg抑制が、可溶性メディエーターによって少なくともある程度は媒介されていることを実証する。Vignali et al.(2008)において考察されているように、阻害性サイトカインが、Treg抑制の推定される可溶性メディエーターとして以前に調査されているが、結果は決定的ではなく、Tregサプレッサー機能には細胞間接触が不可欠であるという一般的認識のままであった。本明細書において開示する結果から、CD52hiCD4+T細胞が、レスポンダーT細胞の機能に必要とされる可溶性因子を除去するか、またはレスポンダーT細胞を抑制する可溶性因子を産生することが示唆された。
実施例8:CD52 hi Treg機能におけるIL-2の解析
方法
IL-2の役割を、発現レベルを測定するための定量的リアルタイムRT-PCRの使用を含むいくつかの実験において調査した。定量的RT-PCR解析では、RNAeasy Mini Kit(Qiagen, Melbourne, Australia)を用いて細胞から全RNAを抽出し、RNアーゼフリーDNアーゼ(Qiagen) で処理し、Agilent 2100 Bioanalyserを用いて定量した。反応1回あたり10ngのRNAから、cDNAを逆転写した。PrimerExpressソフトウェアを用いて設計され、Sigma-Aldrich(Castle Hill, NSW, Australia)によって合成されたPCR用プライマーは次のとおりであった:
Figure 0006004594
Power SYBR Green PCR Master Mixは、Applied Biosystemsから入手した。cDNAを、製造業者のプロトコールに従ってABI Prism 7900装置における40サイクルの増幅に供した。内在性β-アクチン発現に対して標準化されたmRNA発現は、ABI User Bulletin 2(docs.appliedbiosystems.com/pebiodocs/04303859.pdf)中で説明されているようにして、式2-ΔΔCtに従う比較限界閾値(Ct)法によって定量した。
結果
CD52hiCD4+T細胞によるIL-2の消費または分解は、次のいくつかの理由から、抑制のメカニズムである見込みは低いとみなした:i)外因性IL-2は抑制に打ち勝たなかった(図2C);ii)定量的RT-PCRにより、IL-2遺伝子発現がCD52hi細胞において実際に高いことが明らかにされた;すなわち、GAD65による再活性化の24時間後に、CD52hi細胞におけるIL-2α mRNAの発現のCD52lo細胞に対する相対比は1.54±0.15(平均値±標準誤差、n=3)であった;iii)CD52hi細胞の培地中のIL-2濃度は、CD52lo細胞の場合より高く、休止中(89.5±4.82pg/ml対64.9±3.10pg/ml)とGAD65による再活性化後(138.7±4.16pg/ml対82.4±1.78pg/ml)のいずれの場合もそうであった (平均値±標準誤差、n=3;P=0.02、クラスカル・ワリス検定);iv)IL-2が測定された培地において、可溶性IL-2受容体α(CD25)は検出不可能であった(データ不掲載)。したがって、IL-2の除去は、CD52hiTreg抑制のメカニズムである見込みは低いと考えられた。
実施例9:CD52 hi Treg機能の他の推定されるメディエーターの解析
次いで、Treg抑制は、CD4+Treg細胞による抑制をもたらすことが報告されている因子の作用または産生を阻止する作用物質の存在下では不変であることが判明した(Sakaguchi et al., 2008, 2009; Shevach, 2006, 2009; Vignali et al., 2008)。これらには、単独または組み合わせ(各10μg/ml)のIL-10RαまたはTGF-βRIIに対する中和性モノクローナル抗体、シクロオキシゲナーゼ-2(COX-2)阻害剤インドメタシン(20μM)(プロスタグランジンE2産生を阻止する)、汎(pan)一酸化窒素合成酵素阻害剤N(G)-モノメチル-L-アルギニン(800μM)(一酸化窒素産生を阻止する)、インドールアミン-2,3-ジオキシゲナーゼ(IDO)阻害剤1-メチル-dl-トリプトファン(200μM)(阻害性トリプトファン代謝産物の産生を阻止する)、およびアデノシンA2A受容体拮抗薬SCH58261(20μM)(アデノシンの作用を阻止する)が含まれた(データ不掲載)。最近、新規なサプレッサーサイトカインであるIL-35、すなわちIL-27β(EBi3)サブユニットおよびIL-12α(p35)サブユニットのヘテロ二量体が、CD4+CD25+Treg細胞(抑制のために、細胞間接触も必要とした)によって分泌されることが示された(Collison et al., 2007)。IL-35またはその受容体に対する抗体が入手不可能であったため、IL-35を直接測定することができなかった。しかし、GAD65による再活性後24時間目に、IL-27β mRNAおよびIL-12α mRNAの発現が、CD52loCD4+細胞よりもCD52hiCD4+細胞において少なかった(0.423±0.188対1.38±0.224;平均値±標準誤差、n=3)ことから、IL-35がCD52hiCD4+T細胞による抑制の原因である見込みは低いことが示唆された。
実施例10:可溶性CD52は、CD52 hi Treg抑制のメディエーターである
方法
CFSE標識したPBMCをGAD65と共に7日間インキュベートし、CD52hiCD4+T細胞およびCD52loCD4+T細胞に選別した。選別した細胞をGAD65で再活性化し、24時間後に培地を採取した。培地を10倍に濃縮し、SDS-PAGEによって分画し、PDVF膜に移し、培地中の可溶性CD52の存在を検出するために、CD52に対するウサギポリクローナル抗体でブロットした。
次いで、ホスホリパーゼC阻害剤U73122を、可溶性CD52産生の潜在的阻害剤として解析した。CFSE標識したPBMCをTTと共に7日間インキュベートし、CD52hiCD4+T細胞に選別した。選別した細胞をTTで再活性化し、24時間後に培地を採取し、上記のようにイムノブロッティングに供した。別途、CFSE標識したPBMCをTTと共に7日間インキュベートし、CD52hiCD4+T細胞およびCD52loCD4+T細胞に選別し、次いでそれらを放射線照射済 PBMC(20,000個)およびTT±ホスホリパーゼC阻害剤U73122と共にELISpotプレート中で一緒に(各5,000個)インキュベートした。結果は、三つ組の平均値＋標準誤差である。
さらに、CD52の糖質部分に対する抗体を、TTによって活性化されたCD52hiCD4+T細胞による抑制の別の潜在的阻害剤として解析した。ELISpotアッセイ法において細胞をTTおよび10μg/mlの抗CD52モノクローナル抗体(CF1D12)またはアイソタイプ対照モノクローナル抗体(IgG3)のいずれかの存在下または非存在下でインキュベートしたことを除いて、手順は、ホスホリパーゼC阻害剤U73122に関して前述したとおりであった。結果(平均値±標準誤差)は、3つの独立した実験を代表している。
結果
イムノブロッティングにより、GAD65に応答して分裂していたCD52hiCD4+T細胞の培地中にCD52が存在し、GAD65による再活性化後に量が増加していることが明らかにされた(図8A)。同じ結果が、TTを抗原として使用した場合に見出され、TTによる再活性化前にホスホリパーゼC阻害剤U73122を添加すると、培地中のCD52の量が減少した(図8B)。さらに、ホスホリパーゼCの阻害により、CD52hiCD4+T細胞による抑制が用量依存的に取り消された(reversed)(図8C)。CD52ペプチドの末端糖質と相互に作用するモノクローナル抗体CF1D12(Hale, 2001)は、CD52loCD4+T細胞のCD52hiによる抑制を妨げた(図8D)。総合すると、これらの知見から、CD52hiCD4+T細胞による抑制は、抗原刺激に応答したホスホリパーゼ切断によって放出される可溶性CD52に起因することが示唆された。
実施例11:可溶性CD52エフェクター機能のさらなる解析
ネイティブの可溶性CD52のより豊富な供給源を検討するにあたって、いくつかの細胞株、例えば、PIGY遺伝子産物の不足が原因でGPI生合成に欠陥があるDaudi Bリンパ芽球細胞株(Hu et al., 2009)から自発的にCD52が放出される可能性があると仮定した。
方法
選別されたCD4+CD52hi細胞およびCD4+CD52lo細胞の培地を、GAD65またはTTによる細胞の再活性後24時間目に採取した。細胞株(Daudi、Raji、Jurkat、およびK562)の培地を採取し、凍結乾燥によって10倍に濃縮した。試料をSDSPAGEによって分画し、PVDF膜に移した。5％脱脂乳を用いてブロッキングした後、膜をCD52に対するウサギポリクローナル抗体(1ug/mL)と共にインキュベートし、洗浄し、ヤギ抗ウサギIgG-西洋ワサビペルオキシダーゼ抗体と共にインキュベートし、高感度ケミルミネッセンス法によって可視化した。
別途、TTおよび抗CD52抗体(CF1D12)またはアイソタイプ対照抗体(10μg/mL)のいずれかを添加した20％Daudi細胞馴化培地を含有するIMDM中で、PBMC(細胞200,000個)を7日間培養した。可溶性CD52を枯渇させるために、ウサギ抗CD52ポリクローナル抗体(1μg/ml培地)と共にDaudi培地を一晩インキュベートし、続いて、プロテインGセファロースを用いて4℃で1時間、沈降させた。結果(平均値±標準誤差)は、3つの独立した実験を代表している。
結果
いくつかの細胞株のスクリーニングにより、Daudi細胞およびK562細胞の培養培地中にCD52が存在することが明らかになった(図9A)。Daudi培地は、TTによって活性化されるPBMC増殖を抑制し、CF1D12抗体またはCD52の免疫除去(イムノブロッティングによって確認)のいずれかによって抑制が取り消されたことから(図9B)、T細胞抑制は培地中のCD52の寄与によることが実証された。培地を100,000×gで30分間遠心分離しても抑制は影響を受けなかったため、CD52は可溶性であり、エキソソーム中にも膜粒子中にも存在していなかった(データ不掲載)。
実施例12:CD52-Fcを用いた可溶性CD52エフェクター機能の再現
方法
可溶性CD52の免疫抑制機能をさらに調査するために、成熟した細胞表面CD52を、免疫グロブリンGのFc断片および精製用のC末端Strepタグ配列とインフレームの融合タンパク質としてレンチウイルスベクター中でクローニングした。Fcのみの構築物を対照としてクローニングした。構築物をDaudi細胞中で安定に、またはHEK293T細胞中で一過性に発現させ、ストレプトアクチン(Streptactin)樹脂からデスチオビオチンを用いて溶出させることによって、可溶性組換えタンパク質を培地から精製した。
融合タンパク質をコードするDNAを構築するためのスキームを図10に示す。CD52のシグナルペプチド(SigP)配列に結合された変異ヒトIgG1 Fc断片(Armour et al., 2003)をPCRによって作製した。これは、SigPおよびFc断片の間に可撓性GGSGGリンカーならびにPrecissionプロテアーゼおよび第Xa因子プロテアーゼに対する2つの切断部位、ならびにFc断片の末端に精製用のStrepタグII配列(Schmidt and Skerra, 2007)を含んだ。図10で指定したように、Fc構築物を作製しクローニングするために使用したプライマーは、
Figure 0006004594
であった。
Fc断片に結合されたCD52のSigPおよび細胞外ドメイン(ECD)を含むCD52-Fc構築物をPCRによって作製した。使用したプライマーは、2F、2R1、1F2、および1R2であった。PCR産物をBamHI/EcoRIで消化し、FTGWレンチウイルスベクターに連結した(Herold MJ et al., 2008)。また、配列決定によってクローンを確認した。3種のヘルパープラスミド(pMDLRRE、pRSV-REV、およびpVSV-g)と共にベクターDNA 10ugを用いた、6cmシャーレに播種したHEK293T細胞のCaPO4によるトランスフェクションによって、レンチウイルス粒子を作製した。トランスフェクション後48時間目に、ウイルスを含む細胞培養培地を採取し、0.45μmフィルターを通過させた。1ミリリットルを用いて、10％FCS、100mM非必須アミノ酸、2mMグルタミン、および5×10-5M 2-メルカプトエタノールを添加したDME培地において増殖させたDaudi細胞1×106個に形質導入した。細胞内染色およびフローサイトメトリーによって、タンパク質を最も高発現した細胞をスクリーニングした。製造業者の取扱い説明書に従って、ストレプトアクチン樹脂における一段階アフィニティークロマトグラフィーおよび100mM Tris-HCl、150mM NaCl、1mM EDTA、pH8.0中2.5mMデスチオビオチンを用いた溶出によって、CD52-Fcタンパク質またはFc対照タンパク質を培地から精製した。透析後、SDS-PAGEによって、予測されたサイズの単一のクーマシーブルー染色バンドが明らかになり、その特異性がウェスタンブロット法によって確認された。
組換えFc融合タンパク質の効果に関するアッセイ法
完全IMDM培地(5％の熱失活させたプールヒト血清を含む)中のPBMC(2×105細胞/ウェル)または精製CD4+T細胞(5×104細胞/ウェル)を、5％CO2大気中、37℃で最長7日間、10Lfu/ml のTTおよび様々な濃度のCD52-Fcタンパク質またはFcタンパク質の存在下または非存在下、丸底96ウェルプレートにおいて合計体積200μlでインキュベートした。3Hチミジン(1 μCi/ウェル)を添加し、さらに18時間後に細胞を回収し、DNA中に取り込まれた放射能をシンチレーション計数によって測定した。48時間のインキュベーション後に、サイトカインの分析のために培地をサンプリングした。文献に記載されているようにして(Mittag et al., 2011)、樹状細胞(DC)をPBMCから単離した。手短に言えば、まず、細胞系マーカー(lineage marker)(CD3、CD19、CD56)に対する抗体で標識した細胞を磁性ビーズによって除去して、PBMCからDCを濃縮する。次いで、HLA-DR、CD11c、CD1b/c、CD304、およびCD14に対する蛍光性抗体で細胞を染色し、流動選別(flow sorted)して、CD1b/c+HLA-DR+CD11c+従来DC、CD304+HLA-DR+CD11c形質細胞様DC、およびCD14+CD16-CD11c+単球を精製した。精製したDCを3.3μMのCD52-Fcタンパク質またはFcタンパク質と共に37℃で30分間プレインキュベートし、2回洗浄した。次いで、それらを96丸底ウェルプレート中の細胞6000個/ウェルから段階的に希釈し、異なるドナーから単離されたCFSE標識CD4+T細胞(5×104個/ウェル)と共にインキュベートした。6日後、フローサイトメトリーによって測定される分裂CFSElo細胞の出現率として、同種異系T細胞応答を測定した。
前述したように、表示された濃度の組換えCD52-Fcタンパク質またはFcタンパク質対照タンパク質の存在下で、200μl丸底ウェルにおいて4倍の数の放射線照射済PBMCと共に、PBMC(200,000個)をTTと共に7日間培養し、精製されたCD4+T細胞(20,000個)を抗CD3抗体(100ng/ml)および抗CD28抗体(200ng/ml)と共に48時間培養した。インキュベーションの最後の16時間の間、3Hチミジン取込みを測定した。結果(三つ組の平均値±標準誤差)は、6つの独立した実験を代表している。
TT±3.3μΜ CD52-Fcタンパク質またはFcタンパク質で活性化したPBMCの培地を48時間のインキュベーション後にサンプリングし、マルチプレックスビーズアレイによってサイトカインについて分析した。
N結合型糖質を切断するために、37℃で一晩、PBS 20μl中、PNGアーゼF(1,000単位)の存在下または非存在下でCD52-Fc(20μg)をインキュベートし、75℃で10分間加熱することによって反応を終結させた。具体的には、PNGアーゼFは、アスパラギン結合型オリゴ糖のアスパラギン残基のすぐ隣の2つのN-アセチルグルコサミンサブユニットの間を切断して、1つのN-アセチルグルコサミン残基がアスパラギン上に残っている切断型糖質を生じさせる。TTおよび処理されたCD52-Fcまたは処理されていないCD52-Fc(最終2.5μΜ)と共に37℃で7日間、PBMCをインキュベートし、次いで、前述したようにして3Hチミジン取込みを測定した。
結果
PBMCの場合、TTに対するT細胞の増殖性応答は、CD52-Fcによって用量依存的に抑制され(図11A)、CD52-Fcは、様々なT細胞系統の特徴を示すサイトカインの分泌を抑制した(図11C)。CD52-Fcは、抗CD3抗体によるT細胞受容体架橋および抗CD28抗体による同時刺激に応答した、精製されたCD4+T細胞の増殖を抑制したため、T細胞機能に対するCD52-Fcの作用は直接的であった(図11B)。CD52-FcがT細胞抑制のために抗原提示細胞を必要しないという証拠は、精製された樹状細胞をCD52-Fcに曝露しても同種異系T細胞応答を誘発する能力は影響を受けなかったことを示すことによって得られた(図13)。
図に示すように(図8D)、ネイティブCD52による抑制をCF1D12抗体が阻止できることから、抑制がCD52の糖質部分によってもたらされ得ることが暗示された。組換えCD52-Fcにおけるその役割を検討するために、N結合型糖質をエンドグリコシダーゼPNGアーゼFによって切断した。これにより、糖質の損失から予測されたとおり、CD52-Fcの分子量が約48kDaから約30kDaに減少し、その抑制効果も低下した(図11D)ことから、可溶性CD52の抑制効果をもたらす際の糖質部分の役割が裏付けられた。
実施例13:CD52糖質機能のさらなる解析
方法
T細胞抑制をもたらす際のCD52糖質部分の役割をさらに調査するために、供給業者によって推奨されるとおり、わずか20μlに溶かしたノイラミニダーゼ(1単位)または担体緩衝液と共に37℃で30分間、CD52-Fc(3.3μM)をインキュベートした。次いで、TT±ノイラミニダーゼで処理されたCD52-Fcまたは処理されていないCD52-Fc(最終濃度3.4μM)と共にELISpotプレートにおいてPBMCをインキュベートし、24時間後に37℃でIFN-γスポットを発色させた。
別途、TTおよびCD52-Fc(3.4μM)ならびにSiglec-10の細胞外ドメインに対する様々な濃度のアフィニティー精製済みヤギ抗体、もしくはFc(3.4μM)±抗体、または様々な濃度の組換えSiglec-10-Fcと共に、ELISpotプレートにおいてPBMCをインキュベートし、その後、非接着細胞をELISpotプレートに移し、24時間後、IFN-γスポットを発色させた。
可溶性CD52がSiglec-10以外のSiglec受容体を介して作用し得る可能性を調査するために、図12Eに示すように、CD52-FcまたはFc(各3.4μM)および抗ヒトSiglec抗体(各10μg/ml)または組換えヒトSiglec2-Fc(20μg/ml)と一緒に、三つ組のELISpotプレートウェルにおいてTTと共に37℃でCD4+T細胞(20,000個)をインキュベートした。20時間後、ウェルを洗浄し、IFN-γスポットを発色させた。
結果
末端シアル酸を除去するノイラミニダーゼで処理すると、CD52-Fcによる抑制が弱まった(図12A)。CD52糖質の複雑なポリラクトサミン構造は、N-アセチルグルコサミンとβ1-4結合しているガラクトースを修飾するα2-6シアル酸、ことによるとα2-3シアル酸で終わると提唱されている(Treumann et al., 1995)。このシアロシド配列は、ヒトシアル酸結合Ig様レクチン-10(Siglec-10)、すなわち2つの細胞質免疫受容体抑制性チロシンモチーフ(ITIM)を有する細胞表面トランス膜受容体かつ免疫グロブリンスーパーファミリーメンバーによって認識される(Munday et al., 2001; Crocker et al., 2007)。Siglec-10はマウスT細胞では検出されておらず(Crocker et al., 2007)、いくつかの他のSiglecはヒトT細胞上で発現されない(Nguyen et al., 2006)が、本発明者らは、Siglec-10がヒトCD4+T細胞上で発現され、活性化によって上方調節されることを発見した(図12B)。特に、CD52-FcによるT細胞機能の抑制は、Siglec-10の細胞外ドメインに対する抗体(図12C、12E)または可溶性組換えSiglec-10-Fc(図12D)のいずれかによって弱まった。同じ濃度のSiglec-10-Fcもまた、CD52hiCD4+T細胞による抑制を弱めた(データ不掲載)ことから、組換えCD52およびネイティブCD52のどちらもSiglec-10を認識することが示唆された。Siglec-10以外の他のSiglecに対する抗体または組換えヒトSiglec2-Fcを用いた場合、CD52-FcによるT細胞抑制は、同じくらいまで弱まらなかった。これらの知見は、CD52による抑制が、少なくともある程度、Siglec-10との相互作用によって説明され得ることを示す。
実施例14:CD52 hi T細胞は、自己免疫疾患から保護する
材料および方法
マウス
C57/Bl6マウス、NODLtマウス、およびRIP.B7/ NODSCIDマウスは、Walter and Eliza Hall Institute of Medical Researchで飼育および管理された。OVAに特異的なクラスI拘束性TCRトランスジェニックマウス(Hogquist et al., 1993)およびOVAに特異的なクラスII拘束性TCRトランスジェニックマウス(Barnden et al., 1998)が以前に説明されている。Foxp3GFPレポーターマウスはDr Yifan Zhangによって提供された。
試薬、抗体、およびフローサイトメトリー
細胞を、10％FCS、1:100 GIBCO(商標)GlutaMAX(商標)-I Supplement(Invitrogen)、1:1000 2-メルカプトエタノール(Sigma)、1:100 NEAA(gibco)を添加したRPMI培地中で培養した。モノクローナル抗CD52抗体は、MBL Internationalから、クローンBTG-2、PE結合したものまたは非標識のものを入手した。Santa Cruz Biotechnology, Incから入手したポリクローナル抗CD52抗体(sc27555)をウェスタンブロット解析に使用した。抗CD4モノクローナル抗体(L3T4、クローンGK1.5)および抗CD8aモノクローナル抗体(Ly-2、クローン53-6.7)は eBiosciencesから入手した。抗CD25(クローン3c7)はBioLegendから入手した。CD3-FITC抗体、FoxP3染色キットは、eBioscienceから入手した。抗CD3モノクローナル抗体(クローン2c11)、抗CD28モノクローナル抗体(クローン37.51)、およびアイソタイプ対照モノクローナル抗体は、WEHI Monoclonal Antibody Labから得た。FACS Divaソフトウェアと共にFACSAriaを用いて、フローサイトメトリー解析を実施した。MoFlowセルソーター(Cytomation, Fort Collins, CO)を用いて細胞を選別した。
細胞の単離
脾臓を採取し、70μmメッシュを通過させ、赤血球溶解緩衝液で処理し、洗浄した。細胞を活性化するために、プレートに結合させた抗CD3(2μg/ml)および可溶性抗CD28(1μg/ml)のもとで脾細胞を3日間培養した。OTI脾細胞またはOTII脾細胞を0.5μg/ml OTIペプチドまたは5μg/ml OTIIペプチドと共に4日間インキュベートした後、解析した。細胞選別実験のために、C57/Bl6マウス、OTIマウスもしくはOTIIマウス、NODLtマウス、またはFoxp3-GFPマウスに由来する未処理の脾細胞または活性化された脾細胞を、CD3-FITC(eBioscience)、CD4-APC(eBioscience)、CD8-APC(eBisoscience)、および CD52-PE(MBL International)のいずれかで標識した。標識された細胞をMoFlow Cytometerを用いて分離した。純度は約95％であった。単離した細胞を、RNA精製、T細胞増殖アッセイ法、またはインビボ実験のいずれかに使用した。
増殖アッセイ法
選別した未処理または活性化されたCD4+CD52hiT細胞またはCD8+CD52hiT細胞(2×104個、トランスウェル実験では1×105個)を、1:1の比のCD4+CD52loT細胞またはCD8+CD52loT細胞と共に培養し、1μg/ml可溶性抗CD3(2c11)および(8×104個、トランスウェル実験では4×105個の)放射線照射済T細胞枯渇APC(照射線量2000ラド)で刺激した。0.4μmのトランスウェル(Corning、ポリカルボナート膜トランスウェル挿入物 カタログ番号3413)を細胞の間に挟まれるように置いた。阻止実験では、15μg/ml抗CD52(ラットIgG2a、MBL International)またはアイソタイプ対照を添加した。96ウェル丸底プレートに入れた10％ウシ胎児血清を含む最終体積200μlのRPMI培地中で、増殖アッセイ法を72時間実施した。実験の最後の10時間の間に1μCi/ウェル[3H]チミジンを添加し、シンチレーション計数によってチミジン取込みを測定した。別法として、CFSE標識したレスポンダー細胞を、増殖の読み取り値(readout)として使用した。未処理の脾細胞またはCD4+CD52loT細胞もしくはCD8+CD52lo T細胞を、細胞数10×106個/mlで温PBS+0.1％BSA中に再懸濁した。5μM CFSEを添加し、すぐに再懸濁させた。37℃で5分間、細胞をインキュベートした後、少なくとも10％のBSA またはFCSを含む冷たい緩衝液で3回洗浄した。CFSE標識したレスポンダー細胞を最長で7日間、CD4+CD52hiT細胞またはCD8+CD52hiT細胞(および追加の対照)と共にインキュベートし、FACS Ariaを用いて解析した。
2色アッセイ法
製造業者の推奨に従って、CD4+CD52hiT細胞またはCD8+CD52hiT細胞を細胞分裂マーカーPKH.26(Sigma)で染色した。簡単に説明すると、最高1×107個の細胞をDiluent C(キットによって提供される)中に再懸濁し、室温で4分間、2μM PKH.26と混合した。少なくとも10％のFCSを含む緩衝液で細胞を3回洗浄した。前述したように、応答しているCD4+CD52loT細胞またはCD8+CD52loT細胞をCFSEで染色した。単独で、または一緒に、細胞を4〜6日間培養した。
リアルタイムRT-PCR
Qiagen社製のRNeasyキットを用いて、選別したT細胞から全RNAを調製した。製造業者の推奨に従って、オリゴdTプライマー(Qiagen、0.4μg/μl)およびM-MLV逆転写酵素(4000U、Applied Biosystems)を用いてcDNAを合成した。Quantitect SYBR Green PCR Kit(Qiagen、カタログ番号204143)および様々な遺伝子の100〜150bp断片を増幅するように最適化された特異的プライマーを用いて、ABI PRISM 7900サイクラー(Applied Biosystems)においてリアルタイムRT-PCRを実施した。増幅曲線の直線部分に閾値を設定し、閾値に到達するのに必要なサイクル数を全遺伝子について算出した。参照遺伝子(b-アクチンまたはRPS9)に対して標準化することによって、相対的なmRNA発現を決定した。
プライマー配列は以下のとおりである。
Figure 0006004594
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CD52hiを枯渇させた脾細胞のNODレシピエントへの養子移入
CD52hiを枯渇させた全脾細胞、またはCD3+CD52hiT細胞、CD4+CD52hiT細胞、もしくはCD8+CD52hiT細胞を枯渇させた脾細胞をレシピエントマウスに静脈内注射した。レシピエントマウスは、放射線照射された雄NODマウス(8週齢の雄NODマウス、照射線量750ラド、1〜1.2×107個の細胞を移入する4時間前)または8週齢のRIP.B7/NOD.SCIDマウス(2×106個の細胞を受け取る)のいずれかであった。Bayer社製のDiastixを用いて週に3回尿中グルコースを測定することにより、マウスの糖尿病の徴候をモニターした。尿中グルコースが20mMを超えた場合は、血中グルコースを測定する。血中グルコース測定値が連続して20mMグルコースを上回っている場合、マウスを糖尿病と判断する。
インスリン炎スコア
細胞の養子移入後4週目に、マウスを犠死させた。膵臓を採取し、ブアン液中で一晩固定し、次いで、70％エタノールに移した。固定した膵臓をパラフィンブロック中に包埋し、少なくとも150μmの間隔を空けて最低12個の8μm切片を切り取った。ヘマトキシリン-エオシンでこれらの切片を染色し、2名の研究者が別々に光学顕微鏡でインスリン炎の発病率および重症度を評価した。各マウスに由来する最低10個の膵島を観察し、単核細胞浸潤の程度を次の格付を用いて採点した:0=浸潤なし;1=管周囲の浸潤;2=膵島周囲の浸潤;3=膵島内の浸潤;4=β細胞破壊。
結果
8週齢NODマウスに由来するCD52hiを枯渇させた脾臓リンパ球をNOD.scidマウスに移入すると、糖尿病の急速な発症が起こる;枯渇させていない細胞は効果を示さなかった(図14)。CD52hiを枯渇させたCD3+T細胞を移入すると、糖尿病の発症が加速されたが、全リンパ球CD52hi細胞の枯渇ほど効率的ではなかった(図15)。したがって、CD52hiリンパ球によって自己免疫性糖尿病から保護されることが示された。
実施例15:GAD65による刺激に応答して生じるCD52 hi CD4 + T細胞の出現率は、1型糖尿病において減少する
方法
CFSEで染色したPBMCをGAD65またはTTと共に7日間培養した後、フローサイトメトリー解析によってCD52hiCD4+T細胞出現率を測定した。
結果
1型糖尿病に罹患している個体および1型糖尿病のリスクを有する個体では、GAD65に応答したCD52hiCD4+T細胞は健常個体より少ないが、TTの場合はそうではない(図16)。横棒は、各群の中央値である。分散分析の全P値は、クラスカル・ワリス検定によって決定した;次いで、ダンの多重比較検定により、健常者またはT2Dと比べて前臨床T1DおよびT1Dの両方の有意な差が明らかになった(P<0.05)。
実施例16:GAD65に応答して生じたCD52 hi CD4 + 細胞によるT細胞抑制は、前臨床1型糖尿病において弱まる
方法
本明細書において説明する方法に従って、1型糖尿病のリスクがある膵島細胞自己抗体を有する個体に由来するCFSE標識したPBMCをGAD65と共に7日間インキュベートし、CD52hiCD4+T細胞およびCD52loCD4+T細胞に選別した。選別した細胞(5,000個)を、放射線照射済PBMC(20,000個)と共にELISpotプレートにおいてインキュベートした。
結果
図17に示したように、GAD65に応答して生じたCD52hiCD4+細胞のサプレッサー機能は、TTに応答して生じたCD52hiCD4+細胞のサプレッサー機能と比較すると弱まっている。結果は、リスクを有する対象6名を代表している。したがって、CD52hiCD4+細胞サプレッサー機能は、前臨床T1Dにおいて弱まっている。
実施例17:可溶性CD52は、NODマウスの血糖値を劇的に低下させる。
方法
尿中グルコースを毎週試験することによって雌NODマウスをモニターし、尿試験が陽性のマウスにおいて血中グルコース濃度が14mMを上回った場合、糖尿病と診断した。高血糖が確認され次第、CD52-FcまたはFcのいずれか20μgを1日おきに6回、マウスに腹腔内投与し、次いで、毎週2回、血中グルコース濃度をモニターした。
結果
可溶性CD52-Fcは血糖値を低下させることが示された(図18)。図に示したように、CD52-Fcの投与は、血糖値を低下させる迅速かつ顕著な効果を有したことから、1型糖尿病などの自己免疫疾患を治療するための治療薬として可溶性CD52が適することが実証された。
実施例18:エクスビボでhCD52-FcまたはFcで処理した脾細胞を糖尿病NODマウスから移入した後の、NOD.SCIDマウスにおける糖尿病の発症
方法
rhCD52 Fcで処理した糖尿病NOD脾細胞またはFcで処理した糖尿病NOD脾細胞5×106個をNOD.SCIDマウスに注射した。雌糖尿病マウス由来の脾細胞を単離し、50ug/mlの組換えヒトCD52-Fcタンパク質またはFcタンパク質のいずれかと共に「CD52緩衝液」(トリス緩衝生理食塩水+2mMのMgCl2、CaCl2、およびMnCl2+5mMグルコース+1％マウス血清)中で1.5時間インキュベートした。細胞をPBS中に再懸濁し、細胞1×107個を雄NOD.SCIDマウスに注射した(1群当たり12匹)。
結果
糖尿病NODマウス由来脾細胞をエクスビボでCD52-Fcで処理すると、処理した脾細胞を移植されたNOD.SCIDマウスの糖尿病なしの生存率が上昇した(図19)。これは、1型糖尿病などの自己免疫疾患を治療するための可溶性CD52の治療適用途のさらに別の証拠である。
実施例19:ヒトCD52-FcはマウスOT-II細胞を抑制する
方法
CD4 T細胞の約半分は卵白アルブミンに特異的であり、したがってT細胞応答が強く予測可能であるため、マウス卵白アルブミン(Ova)特異的TCRトランスジェニックCD4(OT-II)T細胞は、免疫抑制を試験するための好都合なモデルである。5％FCSおよび図20に表示した濃度のovaタンパク質もしくはovaペプチド、または抗CD3抗体(クローン2C-11)、および組換えヒトCD52-Fcタンパク質またはFcタンパク質を含有するRPMI-1640培地200ml中で、丸底96ウェルプレートにおいて、10週齢の雌OT-IIマウスに由来する脾細胞(1×105個)を3日間インキュベートした。培養の最後の16時間の間、3Hチミジン取込みを測定した。結果は、三つ組の平均値±標準誤差である。
結果
図20に示したように、CD52-Fcは、ovaタンパク質またはovaペプチドによる刺激に応答したT細胞増殖を用量依存的に有意に低減させたことから、自己免疫疾患を治療するにあたっての可溶性CD52の潜在的治療能力のさらなる証拠が提供された。
実施例20:精液由来可溶性CD52は、ヒトT細胞増殖を抑制する
方法
以下のELISAプロトコールを用いて、ヒト精液試料中のCD52を同定した。最初に、精液(SF)を500gで5分間遠心分離して精子をペレット状にし、上清を顕微鏡で検査して確認した。抗ヒトCD52抗体(Biolegend 338202番)を捕捉物質(PBS中1:100、50μl/ウェル、一晩;4℃)として使用した。PBS-0.01％Tween中で3回、続いてPBS中で3回、ウェルを洗浄した。5％BSA/PBS(BSA Sigma A7906)の溶液を使用して、ウェルをブロックした(200μl/ウェル、室温(RT)で1時間)。前述したようにして洗浄を実施した。対照として、空のウェルを含めた。精液試料を5％BSA/PBS中で希釈し、50μl/ウェルを加えた。室温で3時間、ウェル中で試料をインキュベートした。前述したようにして洗浄を実施した。検出のために、Campath mAb-HRPを5％BSA/PBS中で1:1000希釈して使用した(100μl/ウェル;室温で1時間)。前述したようにして洗浄を実施した。3,3',5,5'-テトラメチルベンジジン(TMB)を添加し、プレートを450nmで読み取った。
以下のプロトコールに従って、CD52免疫除去を実施した。プロテインG-セファロース200μlをエッペンドルフチューブ2本に等分し、続いてPBS 1mlで2回洗浄し、上清を廃棄した。一方のエッペンドルフにCampath mAb 5mgを加え、他方に「Octagam」(プールしたヒト免疫グロブリン)5mgを加えた。4℃で1.5時間、これらのチューブを回転させ、続いてPBS各1mlで3回洗浄した。上清を廃棄した。PBS 500μlを加え、よく混ぜ、各試料について、エッペンドルフチューブ5本に均等に試料を分けた。CampathおよびOctagamを含むチューブを回転させ、上清を廃棄した。精液試料を適切なチューブに加え(5種類の異なる精液試料)、すなわち精液160μl+PBS 160μlとし、続いて4℃で一晩回転させた。チューブを回転させ、1:20の希釈率で(1:2に既に希釈されていたため、1:10希釈してアッセイ法へ)T細胞アッセイ法で使用するために上清を回収した。
健常ドナー由来PBMCにおける抗原(TT)に応答したT細胞増殖をCFSE色素希釈によって測定した(Mannering et al., 2003)。CFSE標識した細胞(2×105個/ウェル、100μl)を、培地のみまたはTT±CF1D12抗CD52mAb(最終濃度20μg/ml)と共に96ウェル丸底プレートにおいて、6ウェル1組で培養した。後者は0時間または20時間のいずれかの時点で添加した。可溶性CD52に対する受容体であるSiglec-10が活性化によって上方調節されることが示されていたため、後者の時間はT細胞の活性化の開始を可能にするためのものであった(図12B)。未染色の細胞も含め、フローサイトメーターの補正(compensations)を設定するために使用した。抗原非存在下での未分裂CFSEbrightCD4+細胞20,000個当たりの分裂CFSEdimCD4+細胞数に対する、抗原存在下での未分裂CFSEbrightCD4+細胞20,000個当たりの分裂CFSEdimCD4+細胞数の比率として、細胞分裂指標(CDI)を算出した。
結果
図21は、段階希釈した26種の精液試料中の可溶性CD52の存在を示す。通常、精液は、高レベルの可溶性CD52を含み、数回の対数希釈を通して滴定濃度がなくなる(titer out)。
図22に示したように、抗原(TT)のみを用いた場合、T細胞増殖が劇的に増加した(図22の「精液なし」の棒を参照されたい)。しかし、この効果は、精液の存在下で有意に低下した(図22の精液試料1番および15番の「TT」を参照されたい)。抗CD52抗体Campathを用いてCD52を1回免疫除去すると、精液の阻害効果がある程度取り消された(図22の精液試料1番および15番の「Campath+TT」の棒を参照されたい)。免疫除去した対照IgG試料を用いた場合は、有意な逆転は認められなかった。
図23に示したように、抗原(TT)のみを用いた場合、T細胞増殖が劇的に増加した(図23の「精液なし」の棒を参照されたい)。抗CD52抗体CF1D12を添加すると、T細胞増殖がさらに増加した。しかし、精液の存在下では、T細胞増殖は劇的に減少した(図23の精液試料14番、20番、および22番の「TT」を参照されたい)。したがって、精液により、刺激されず減少する抗原刺激増殖が増加する。抗CD52抗体CF1D12の添加により、精液の阻害効果がある程度取り消された。
したがって、精液に由来する可溶性CD52は、リンパ球に由来する可溶性CD52と同じ抑制効果をエフェクターT細胞の機能に対して実現したことから(本実施例においてT細胞増殖によって例示する)、代替の糖質部分が、本明細書において開示する可溶性糖タンパク質上にその阻害機能を減らすことなく存在し得ることが実証された。
実施例21:単球に対するCD52-Fcの影響
方法および結果
THP-1細胞(ヒト急性単球性白血病細胞株)を、10％FCS、2mMグルタミン、および50μM 2-メルカプトエタノールを添加したRPMI-1640培地中で増殖させた。5％熱失活プールヒト血清、100mM非必須アミノ酸、2mMグルタミン、および50μM 2-メルカプトエタノールを含有するIMDM(IP5培地)中に5％CO2下、37℃、2×10 5個/ウェルの密度で細胞を播種した。
LPS(100ng/ml)の存在下で24時間、様々な用量のCD52-FcまたはFc対照と共に細胞をインキュベートした。培地を採取し、IL-1βの濃度をELISAによって測定した。この実験の結果は、図24にまとめて示している。
さらなる実験において、TLR-2作動薬Pam3CSK(100ng/ml)の存在下で24時間、様々な用量のCD52-FcまたはFc対照と共に細胞をインキュベートした。次いで、培地を採取し、IL-1βの濃度をELISAによって測定した。この実験の結果は、図25にまとめて示している。
また、500nMホルボール-12-ミリスタート-13-アセタート(PMA)を用いて3時間、THP-1細胞を分化させた。次いで、これらの細胞を洗浄し、IP-5培地に2×105個/ウェルの密度で播種し、5％CO2下、37℃で一晩、インキュベートした。翌朝、培地を交換し、アラム(100μg/ml)の存在下で16時間、CD52-FcまたはFc対照(50μg/ml)と共に細胞をインキュベートした。培地を採取し、IL-1βの濃度をELISAによって測定した。この実験の結果は、図26にまとめて示している。
10週齢C57/B6マウスに由来する骨髄を、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子(10ng/ml)を含む(in)KDS-RPMI培地-10％FCSにおいて7日間分化させた。骨髄由来樹状細胞(BMDC)を採取し、洗浄し、96ウェルプレートに2×104個/ウェルの密度で播種した。LPS(800ng/ml)、CPG(0.8pM)、またはリステリア・モノサイトゲネス(8×106/ウェル)の存在下で、40μg/mlマウスCD52-FcまたはPBS(対照)と共に細胞をインキュベートした。さらに、LPS(100ng/ml)で3時間、細胞をプライミングし、次いで、公知のインフラマソーム作動薬である尿酸モノナトリウム(MSU)(150μg/ml)、アラム(150μg/ml)、およびナイジェリシン(1μM)を用いて刺激した。24時間後、培地を採取し、サイトカイン濃度をマルチプレックスサイトカインアレイアッセイ法によって測定した。IL-1βを用いたこの実験の結果は、図27にまとめて示している。IL-1α、TNF-α、MCP-1、IL-6、IL-9、およびIL-12についても同様の結果が得られた(データ不掲載)。
マウスCD52-Fc(250μg)をアースロバクター・ウレアファシエンス(Arthrobacter ureafaciens)由来ノイラミニダーゼ(2単位)または反応緩衝液(250mMリン酸ナトリウム、pH 6.0)と共に37℃で一晩インキュベートし、75℃で5分間加熱することによって、反応を終結させた。THP-1細胞を、LPS(100ng/ml)の存在下で24時間、ノイラミニダーゼで処理したmCD52-Fcまたは反応緩衝液で処理したmCD52-Fc(最終濃度12.5μg/ml)と共にインキュベートした。培地を採取し、IL-1βの濃度をELISAによって測定した。この実験の結果は、図28にまとめて示している。
製造業者(BioLabs Inc.)の取扱い説明書に従って、マウスCD52-Fc(300μg)を同じ条件下でPNGアーゼFを用いて、または用いずに処理した。CD52-Fcの分子量の減少を伴うN結合型オリゴ糖切除をSDS-PAGEおよびクーマシーブルー染色によって確認した。次いで、純粋な滅菌水に対する透析によってタンパク質溶液を脱塩した。IP5培地に2×105個/ウェルの密度でTHP-1細胞を播種し、100ng/ml LPSの存在下で24時間、処理したCD52-Fc(最終濃度30μg/ml)またはグリコシル化CD52-Fcと共にインキュベートした。培地を採取し、IL-1βの濃度をELISAによって測定した。この実験の結果は、図29にまとめて示している。
考察
一連の炎症性刺激に応答して、CD52-Fcは用量依存的に、ヒトTHP1単球株およびマウス骨髄由来樹状細胞によるIL-1β分泌を抑制した。さらに、T細胞について示したように、CD52-Fcのこの抑制効果はそのオリゴ糖部分に依存する。ノイラミニダーゼでCD52-Fcを事前に処理して末端シアル酸を除去することによって、またはPNGアーゼ-FによってN結合型オリゴ糖それ自体を除去した場合、この効果が取り消されたことがその理由である。これらの知見から、T細胞に関して示したCD52-Fcの抑制効果は、先天性免疫に関与する他の細胞型にも及び、やはりT細胞と同様に、Siglec受容体によっておそらく媒介されることが実証される。
個々の態様において示すように、大まかに説明した本発明の精神からも範囲からも逸脱することなく、多数の変更および/または修正を本発明に加えてよいことが当業者に認識されるであろう。したがって、本発明の態様は、あらゆる点で、例示的であり限定的ではないとみなされるべきである。
本出願は、2011年11月15日に出願されたUS61/560,254および2012年9月26日に出願されたUS61/705,633の優先権を主張し、両方の文献の内容全体が参照により本明細書に組み入れられる。
本明細書において考察および/または参照される刊行物はすべて、その全体が本明細書に組み入れられる。
本明細書に含まれた文献、行為、材料、装置、または物品などに関するいかなる考察も、本発明の背景を提供するためのものであるにすぎない。考察は、これらの内容のいずれかまたはすべてが、先行技術の基礎の一部を形成するものである、または本出願の各請求項の優先権日より以前に存在した本発明に関連する分野で共通の一般知識であったことを認めるものとみなすべきではない。
参考文献
Figure 0006004594
Figure 0006004594

Claims (22)

  1. 以下のうちのいずれか1つまたは複数と、薬学的に許容される担体とを含む、エフェクターT細胞の機能を抑制するため、かつ/または自己抗原に対する免疫応答などの免疫応答を軽減するための、薬学的組成物：
    (i) 可溶性CD52糖タンパク質、
    (ii) 第1のタンパク質としての可溶性CD52糖タンパク質および第2のタンパク質を含む、融合タンパク質;
    (iii) 成分(i)の可溶性CD52糖タンパク質のペプチド部分または成分(ii)の融合タンパク質のペプチド部分をコードする、ポリヌクレオチド;
    (iv) 成分(iii)のポリヌクレオチドを含むベクター;
    (v) 成分(iii)のポリヌクレオチドまたは成分(iv)のベクターを含む、単離された細胞;
    (vi) 可溶性CD52糖タンパク質を産生することができる、単離されたCD52hi細胞;
    (vii) 可溶性CD52糖タンパク質を産生することができる複数のCD52hi細胞を含む、単離された細胞集団;ならびに
    (viii)成分(vi)の細胞または成分(vii)の細胞集団を含む細胞培養物から単離された、可溶性CD52糖タンパク質を含む細胞培養培地またはその画分。
  2. 前記可溶性CD52糖タンパク質が、
    GQNDTSQTSSPS (SEQ ID NO: 3), SQNATSQSSPS (SEQ ID NO: 4), GQATTAASGTNKNSTSTKKTPLKS (SEQ ID NO: 5), GQNSTAVTTPANKAATTAAATTKAAATTATKTTTAVRKTPGKPPKA (SEQ ID NO: 6) または GNSTTPRMTTKKVKSATPA (SEQ ID NO:7)
    のうちのいずれか1つまたは複数のアミノ酸配列と少なくとも90％同一であるアミノ酸配列および糖質を含む、請求項1に記載の薬学的組成物。
  3. 前記糖タンパク質が、SEQ ID NO: 3、4、5、6、または7で特定されるアミノ酸配列のうちのいずれか1つまたは複数と少なくとも90％、少なくとも95％同一であるか、または100％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項1に記載の薬学的組成物。
  4. 前記可溶性CD52糖タンパク質、融合タンパク質、ポリヌクレオチド、ベクター、細胞、細胞集団、細胞培養培地、および作用物質のうちのいずれか1つまたは複数が、エフェクターT細胞の機能および/または免疫応答を抑制するのに十分な量で存在する、請求項1〜3のいずれか一項に記載の薬学的組成物。
  5. 前記可溶性CD52糖タンパク質の糖質部分が、そのアミノ酸配列中にアスパラギン残基、セリン残基、トレオニン残基、チロシン残基、ヒドロキシリジン残基、ヒドロキシプロリン残基、ホスホセリン残基、またはトリプトファン残基が存在する場合、1つまたは複数の該残基に結合している、請求項1〜4のいずれか一項に記載の薬学的組成物。
  6. 前記可溶性CD52糖タンパク質の糖質部分が、SEQ ID NO: 3のアスパラギン(N)残基に結合している、請求項1〜5のいずれか一項に記載の薬学的組成物。
  7. 前記可溶性CD52糖タンパク質の糖質部分が、宿主リンパ球または宿主生殖器細胞などの宿主細胞中の可溶性CD52糖タンパク質の細胞外部分に結合することが公知である任意の糖質である、請求項1〜6のいずれか一項に記載の薬学的組成物。
  8. 前記可溶性CD52糖タンパク質の糖質部分が、末端にシアル酸が付加されていてもよい1つまたは複数の二分岐型、三分岐型、または四分岐型の糖を含む、請求項1〜7のいずれか一項に記載の薬学的組成物。
  9. 前記可溶性CD52糖タンパク質、融合タンパク質、細胞、細胞集団、細胞培養培地、および作用物質のうちのいずれか1つまたは複数が、エフェクターT細胞の機能を抑制することができ、かつ/または免疫応答を軽減することができる、請求項1〜8のいずれか一項に記載の薬学的組成物。
  10. 前記免疫応答が、自己抗原に対する免疫応答である、請求項9に記載の薬学的組成物。
  11. 前記融合タンパク質が、抗体断片を含む第2のタンパク質を含む、請求項1〜10のいずれか一項に記載の薬学的組成物。
  12. 前記抗体断片がFcである、請求項11に記載の薬学的組成物。
  13. 前記可溶性CD52糖タンパク質、融合タンパク質、または細胞培養培地のうちの1つまたは複数を含み、かつ粘膜投与および/または経皮投与用に製剤化されている、請求項1〜12のいずれか一項に記載の薬学的組成物。
  14. インスリンおよび/または自己抗原をさらに含む、請求項1〜13のいずれか一項に記載の薬学的組成物。
  15. エフェクターT細胞の機能によって媒介される疾患もしくは状態、炎症または敗血症を治療または予防するための、請求項1〜14のいずれか一項に記載の薬学的組成物。
  16. エフェクターT細胞の機能によって媒介される疾患もしくは状態、炎症または敗血症を治療または予防するための医薬の製造における、以下のうちのいずれか1つまたは複数の使用:
    (i) 可溶性CD52糖タンパク質、
    (ii) 第1のタンパク質としての可溶性CD52糖タンパク質および第2のタンパク質を含む、融合タンパク質;
    (iii) 成分(i)の可溶性CD52糖タンパク質のペプチド部分または成分(ii)の融合タンパク質のペプチド部分をコードする、ポリヌクレオチド;
    (iv) 成分(iii)のポリヌクレオチドを含むベクター;
    (v) 成分(iii)のポリヌクレオチドまたは成分(iv)のベクターを含む、単離された細胞;
    (vi) 可溶性CD52糖タンパク質を産生することができる、単離されたCD52hi細胞;
    (vii) 可溶性CD52糖タンパク質を産生することができる複数のCD52hi細胞を含む、単離された細胞集団;
    (viii)成分(vi)の細胞または成分(vii)の細胞集団を含む細胞培養物から単離された、可溶性CD52糖タンパク質を含む細胞培養培地またはその画分;ならびに
    (x) 請求項1〜14のいずれか一項に記載の薬学的組成物。
  17. エフェクターT細胞の機能によって媒介される前記疾患が、I型糖尿病または関節リウマチなどの自己免疫疾患である、請求項15に記載の薬学的組成物。
  18. エフェクターT細胞の機能によって媒介される前記疾患が、I型糖尿病または関節リウマチなどの自己免疫疾患である、請求項16に記載の使用。
  19. エフェクターT細胞の機能によって媒介される前記状態が、同種移植拒絶または移植片対宿主反応である、請求項15に記載の薬学的組成物。
  20. エフェクターT細胞の機能によって媒介される前記状態が、同種移植拒絶または移植片対宿主反応である、請求項16に記載の使用。
  21. 前記可溶性CD52糖タンパク質、融合タンパク質、細胞培養培地、または組成物が粘膜部位または経皮部位に投与されることを特徴とする、請求項15に記載の薬学的組成物。
  22. 前記医薬が粘膜部位または経皮部位に投与するために製剤化されている、請求項16に記載の使用。
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