JP5965481B2 - 皮膚ｔ細胞リンパ腫（ｃｔｃｌ）の診断用マイクロｒｎａプロファイリング - Google Patents

Description

本発明は、癌診断の分野に関するものである。特に、本発明は、皮膚Ｔ細胞リンパ腫（ＣＴＣＬ）の皮膚サンプルから、非悪性（炎症性）皮膚サンプルを識別することを可能にするマイクロＲＮＡ発現シグナチュアに関するものである。

皮膚Ｔ細胞リンパ腫（ＣＴＣＬ）は皮膚の最も頻出する原発性リンパ腫であり、菌状息肉腫（ＭＦ）が、新規症例のおよそ６０％を占める最も広く認められる臨床形態である（非特許文献１）。

ＭＦは、数年続くことがある初期の疾患期には、皮膚炎または乾癬等の炎症性疾患に似た平らな紅斑性の皮膚パッチとして現れる。後期には、ＭＦ病斑が徐々に、プラークおよび顕在的な腫瘍を形成し、そしてリンパ節および内臓器官にまで伝播する虞がある。この疾患の初期の皮膚病斑は、正常な表現型を示す多量のＴ細胞および悪性の表現型を示すＴ細胞の小集団を含む、多数の炎症性細胞を含む。

浸潤物は主に、ある程度悪性Ｔ細胞を制御するらしい非悪性のＴヘルパー１（Ｔｈ１）細胞、調節Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）および細胞障害性ＣＤ８^＋Ｔ細胞からなる（非特許文献２；非特許文献３）。悪性Ｔ細胞は通常、成熟したＣＤ４^＋記憶Ｔ細胞の表現型を示し、一般にクローン起源のものである（非特許文献４）。悪性表現型のＴ細胞は表皮向性によって特徴付けられ、優先的に皮膚の上部に存在するが、正常な表現型のＴ細胞は主に真皮のより下方の部において検出される。ランゲルハンス細胞の樹状突起に付着したＴ細胞の集合である表皮Ｔ細胞は時折、ポートリエ微小膿瘍のパターンで見つかる。疾患の進行中に、表皮向性は、悪性の浸潤Ｔ細胞の増大と、非悪性の浸潤Ｔ細胞の減少とに付随して、徐々に失われる。

ＣＴＣＬの病因は十分に理解されていないままであり、職業的被曝、感染性薬剤および遺伝的突然変異が病因要素として提唱されているが、因果関係の証拠は提供されていない（非特許文献５）。その代わりに、転写因子およびシグナル変換の調節因子の異常な発現および機能が、ＣＴＣＬの特徴である。従って、シグナル分子およびサイトカインの機能不全調節が、悪性トランスフォーメーションにおいて重要な役割を果たしており、そして、異常遺伝子のメチル化およびヒストンの脱アセチル化等の後成的な修飾が、ＣＴＣＬの病因に明らかに関与していると仮定されている（非特許文献６；非特許文献７）。

皮膚炎または乾癬等の良性炎症性疾患と臨床的および組織学的にかなり類似するために、早期診断は困難である。皮膚生検からの決定的な診断は、ポートリエ膿瘍による、回旋状のリンパ球、帯状の上真皮浸潤物、および表皮の浸潤の存在を必要とするが、これらの特徴の全てが初期に存在しないことが多く、組織像は多くの場合解釈するのが困難である。いずれもＣＴＣＬに特異的でない、低ＣＤ７および中間ＣＤ４の発現、ならびにＴ細胞受容体クローナリティ等の代用マーカによって、組織学的試験が補充されることがある。さらに、これらの方法は多くの時間および労力を要するものであり、決定的な疾患マーカも存在しない。従って、決定的な診断は、経験豊かな病理学者による長時間にわたる複数の生検のレビューを必要とすることがある。このため、患者はしばしば、長時間確信がないままにされ、そして様々な種類の効果のない治療を受ける。

マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡまたはｍｉＲ）は、そのターゲットｍＲＮＡとの塩基対合により遺伝子発現の転写後調節因子として機能する、短い内在性ＲＮＡの豊富なクラスである。具体的には、ｍｉＲＮＡは、ｍＲＮＡの翻訳を防止し、かつ／またはターゲットｍＲＮＡの分解を媒介する。ｍｉＲＮＡは、より長い内在性ヘアピン転写産物から処理される１９〜２５のヌクレオチド（ｎｔ）ＲＮＡである（非特許文献８）。現在まで、Ｓａｎｇｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，ＵＫによって主催された２００８年４月のｍｉＲＮＡレジストリデータベースリリース１１．０によれば、ヒト、蠕虫、ショウジョウバエおよび植物において、６０００を超えるｍｉＲＮＡが識別されている。

いくつかのｍｉＲＮＡが示差的に発現されており、そして癌の発病にもおそらく関与していることを最近のデータは示している（非特許文献９）^１２。従って、ＣＴＣＬの白血病性変異形であるセザリー症候群（ＳＳ）の患者から得られる悪性Ｔ細胞において、ｍｉＲ−２１発現は、上方調節されて、アポトーシスの調節に関与しているようである。これらの知見は、癌の進行および転移においてｍｉＲＮＡが重要な役割を果たしている他の癌研究と一致している。特定のｍｉＲＮＡがオンコ遺伝子および腫瘍サプレッサとして機能し得ることから、特定のｍｉＲＮＡは確かに悪性トランスフォーメーションに直接的に関与している（非特許文献１０）。

ＣＴＣＬの早期診断は、治療上のオプションおよび予後の決定に関して重要な結果をもたらす。残念ながら、良性の炎症性皮膚疾患と臨床的、病理学的、および組織学的にかなり類似するために、ＣＴＣＬの早期診断は困難であると判明した。従って、局所的化学療法または光療法等の確立された治療法による標的治療を可能とするであろう早期の、かつ正確な悪性診断が必要とされている。

国際公開第２０１０／０８５９６６号パンフレット

Ｔｒａｕｔｉｎｇｅｒ Ｆ，Ｋｎｏｂｌｅｒ Ｒ，Ｗｉｌｌｅｍｚｅ Ｒ，ｅｔ ａｌ．Ｅｏｒｔｃ ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ ｒｅｃｏｍｍｅｎｄａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ ｍｙｃｏｓｉｓ ｆｕｎｇｏｉｄｅｓ／ｓｅｚａｒｙ ｓｙｎｄｒｏｍｅ．Ｅｕｒｏｐｅａｎ ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｃａｎｃｅｒ．２００６；４２：１０１４−３０． Ｌｅｅ ＢＮ，Ｄｕｖｉｃ Ｍ，Ｔａｎｇ ＣＫ，ｅｔ ａｌ．Ｄｙｓｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｔｙｐｅ １ ａｎｄ ｔｙｐｅ ２ ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ ｂｙ ｔ ｃｅｌｌｓ ｏｆ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｃｕｔａｎｅｏｕｓ ｔ−ｃｅｌｌ ｌｙｍｐｈｏｍａ．Ｃｌｉｎｉｃａｌ ａｎｄ ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ．１９９９；６：７９−８４． Ｇｊｅｒｄｒｕｍ ＬＭ，Ｗｏｅｔｍａｎｎ ａ，Ｏｄｕｍ Ｎ，ｅｔ ａｌ．Ｆｏｘｐ３＋ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ ｔ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ｃｕｔａｎｅｏｕｓ ｔ−ｃｅｌｌ ｌｙｍｐｈｏｍａｓ：ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ｄｉｓｅａｓｅ ｓｔａｇｅ ａｎｄ ｓｕｒｖｉｖａｌ．Ｌｅｕｋｅｍｉａ ２００７；２１：２５１２−８． Ｒｏｓｅｎ ＳＴ，Ｑｕｅｒｆｅｌｄ Ｃ．Ｐｒｉｍａｒｙ ｃｕｔａｎｅｏｕｓ ｔ−ｃｅｌｌ ｌｙｍｐｈｏｍａｓ．Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ／ｔｈｅ Ｅｄｕｃａｔｉｏｎ Ｐｒｏｇｒａｍ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｏｆ Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ．Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｏｆ Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ．Ｅｄｕｃａｔｉｏｎ Ｐｒｏｇｒａｍ．２００６；３２３−３０，５１３． Ｄｅｒｅｕｒｅ Ｏ，Ｌｅｖｉ Ｅ，Ｖｏｎｄｅｒｈｅｉｄ ＥＣ，Ｋａｄｉｎ ＭＥ．Ｉｎｆｒｅｑｕｅｎｔ ｆａｓ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｂｕｔ ｎｏ ｂａｘ ｏｒ ｐ５３ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｉｎ ｅａｒｌｙ ｍｙｃｏｓｉｓ ｆｕｎｇｏｉｄｅｓ：ａ ｐｏｓｓｉｂｌｅ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｆｏｒ ｔｈｅ ａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｍａｌｉｇｎａｎｔ ｔ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ ｉｎ ｔｈｅ ｓｋｉｎ．Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｖｅ ｄｅｒｍａｔｏｌｏｇｙ．２００２；１１８：９４９−５６． Ｄｏｏｒｎ Ｒ ｖａｎ，Ｋｅｓｔｅｒ ＭＳ ｖａｎ，Ｄｉｊｋｍａｎ Ｒ，ｅｔ ａｌ．Ｏｎｃｏｇｅｎｏｍｉｃ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｍｙｃｏｓｉｓ ｆｕｎｇｏｉｄｅｓ ｒｅｖｅａｌｓ ｍａｊｏｒ ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓ ｗｉｔｈ ｓｅｚａｒｙ ｓｙｎｄｒｏｍｅ．Ｂｌｏｏｄ．２００９；１１３：１２７−３６． Ｇｉｒａｒｄｉ Ｍ，Ｈｅａｌｄ ＰＷ，Ｗｉｌｓｏｎ ＬＤ．Ｔｈｅ ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ ｏｆ ｍｙｃｏｓｉｓ ｆｕｎｇｏｉｄｅｓ．Ｔｈｅ Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｍｅｄｉｃｉｎｅ．２００４；３５０：１９７８−８８． Ａｍｂｒｏｓ（２００３）ＲＮＡ ９，２７７−２７９ Ｇａｒｚｏｎ Ｒ，Ｃａｌｉｎ Ｇ ａ，Ｃｒｏｃｅ ＣＭ．Ｍｉｃｒｏｒｎａｓ ｉｎ ｃａｎｃｅｒ．Ａｎｎｕａｌ ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ ｍｅｄｉｃｉｎｅ．２００９；６０：１６７−７９． Ｋｒｅｊｓｇａａｒｄ Ｔ，Ｖｅｔｔｅｒ−Ｋａｕｃｚｏｋ ＣＳ，Ｗｏｅｔｍａｎｎ Ａ，ｅｔ ａｌ．Ｅｃｔｏｐｉｃ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ Ｂ−ｌｙｍｐｈｏｉｄ ｋｉｎａｓｅ ｉｎ ｃｕｔａｎｅｏｕｓ Ｔ−ｃｅｌｌ ｌｙｍｐｈｏｍａ．Ｂｌｏｏｄ．２００９；１１３：５８９６−９０４． Ｏｌｓｅｎ Ｅ，Ｖｏｎｄｅｒｈｅｉｄ Ｅ，Ｐｉｍｐｉｎｅｌｌｉ Ｎ，ｅｔ ａｌ．Ｒｅｖｉｓｉｏｎｓ ｔｏ ｔｈｅ ｓｔａｇｉｎｇ ａｎｄ ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｙｃｏｓｉｓ ｆｕｎｇｏｉｄｅｓ ａｎｄ ｓｅｚａｒｙ ｓｙｎｄｒｏｍｅ：ａ ｐｒｏｐｏｓａｌ ｏｆ ｔｈｅ ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ ｃｕｔａｎｅｏｕｓ ｌｙｍｐｈｏｍａｓ（ｉｓｃｌ） ａｎｄ ｔｈｅ ｃｕｔａｎｅｏｕｓ ｌｙｍｐｈｏｍａ ｔａｓｋ ｆｏｒｃｅ ｏｆ ｔｈｅ ｅｕｒｏｐｅａｎ ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ ｃａ．Ｂｌｏｏｄ．２００７；１１０：１７１３−２２． Ｗｉｌｌｅｍｚｅ Ｒ，Ｊａｆｆｅ ＥＳ，Ｂｕｒｇ Ｇ，ｅｔ ａｌ．Ｗｈｏ−ｅｏｒｔｃ ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｆｏｒ ｃｕｔａｎｅｏｕｓ ｌｙｍｐｈｏｍａｓ．Ｂｌｏｏｄ．２００５；１０５：３７６８−８５． Ｆｏｓｓ ＦＭ，Ｚｉｎｚａｎｉ ＰＬ，Ｖｏｓｅ ＪＭ，ｅｔ ａｌ．Ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ｔ−ｃｅｌｌ ｌｙｍｐｈｏｍａ．Ｂｌｏｏｄ．２０１１；． Ｂｕｒｇ Ｇ，Ｋｅｍｐｆ Ｗ，Ｃｏｚｚｉｏ Ａ，ｅｔ ａｌ．Ｗｈｏ／ｅｏｒｔｃ ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｕｔａｎｅｏｕｓ ｌｙｍｐｈｏｍａｓ ２００５：ｈｉｓｔｏｌｏｇｉｃａｌ ａｎｄ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｓｐｅｃｔｓ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｃｕｔａｎｅｏｕｓ ｐａｔｈｏｌｏｇｙ．２００５；３２：６４７−７４． Ｆｉｔｓ Ｌ ｖａｎ ｄｅｒ，Ｋｅｓｔｅｒ ＭＳ ｖａｎ，Ｑｉｎ Ｙ，ｅｔ ａｌ．Ｍｉｃｒｏｒｎａ−２１ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｃｄ４＋ ｔ ｃｅｌｌｓ ｉｓ ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｂｙ ｓｔａｔ３ ａｎｄ ｉｓ ｐａｔｈｏｌｏｇｉｃａｌｌｙ ｉｎｖｏｌｖｅｄ ｉｎ ｓｅｚａｒｙ ｓｙｎｄｒｏｍｅ．Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｖｅ ｄｅｒｍａｔｏｌｏｇｙ．２０１１；１３１：７６２−８． Ｋｅｓｔｅｒ ＭＳ ｖａｎ，Ｂａｌｌａｂｉｏ Ｅ，Ｂｅｎｎｅｒ ＭＦ，ｅｔ ａｌ．Ｍｉｒｎａ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ ｏｆ ｍｙｃｏｓｉｓ ｆｕｎｇｏｉｄｅｓ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｏｎｃｏｌｏｇｙ．２０１１；５，２７３−８０． Ｒｉｔｃｈｉｅ ＭＥ，Ｓｉｌｖｅｒ Ｊ，Ｏｓｈｌａｃｋ Ａ，ｅｔ ａｌ．Ａ ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ ｂａｃｋｇｒｏｕｎｄ ｃｏｒｒｅｃｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ ｔｗｏ−ｃｏｌｏｕｒ ｍｉｃｒｏａｒｒａｙｓ．Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ．２００７；２３：２７００−７． Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ ＷＳ，Ｇｒｏｓｓｅ Ｅ，Ｓｈｙｕ ＭＪ．Ｌｏｃａｌ ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ ｍｏｄｅｌｓ．Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ Ｍｏｄｅｌｓ ｉｎ Ｓ．１９９２；３０９−３７６． Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄ Ｎ，Ａｈａｒｏｎｏｖ Ｒ，Ｍｅｉｒｉ Ｅ，ｅｔ ａｌ．Ｍｉｃｒｏｒｎａｓ ａｃｃｕｒａｔｅｌｙ ｉｄｅｎｔｉｆｙ ｃａｎｃｅｒ ｔｉｓｓｕｅ ｏｒｉｇｉｎ．Ｎａｔｕｒｅ ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．２００８；２６：４６２−９． Ｔｉｂｓｈｉｒａｎｉ ＲＪ，Ｅｆｒｏｎ Ｂ．Ｐｒｅ−ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ ａｎｄ ｉｎｆｅｒｅｎｃｅ ｉｎ ｍｉｃｒｏａｒｒａｙｓ．Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｉｎ ｇｅｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｉｏｌｏｇｙ．２００２；１：Ａｒｔｉｃｌｅ １． Ｖａｎｄｅｓｏｍｐｅｌｅ Ｊ，Ｄｅ Ｐｒｅｔｅｒ Ｋ，Ｐａｔｔｙｎ Ｆ，ｅｔ ａｌ．Ａｃｃｕｒａｔｅ ｎｏｒｍａｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ｒｔ−ｐｃｒ ｄａｔａ ｂｙ ｇｅｏｍｅｔｒｉｃ ａｖｅｒａｇｉｎｇ ｏｆ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｉｎｔｅｒｎａｌ ｃｏｎｔｒｏｌ ｇｅｎｅｓ．Ｇｅｎｏｍｅ ｂｉｏｌｏｇｙ．２００２；３：ＲＥＳＥＡＲＣＨ００３４． Ｃｈｅｎ Ｊ，Ｏｄｅｎｉｋｅ Ｏ，Ｒｏｗｌｅｙ ＪＤ．Ｌｅｕｋａｅｍｏｇｅｎｅｓｉｓ：ｍｏｒｅ ｔｈａｎ ｍｕｔａｎｔ ｇｅｎｅｓ．Ｎａｔｕｒｅ ｒｅｖｉｅｗｓ．Ｃａｎｃｅｒ．２０１０；１０：２３−３６． Ｂａｌｌａｂｉｏ Ｅ，Ｍｉｔｃｈｅｌｌ Ｔ，Ｋｅｓｔｅｒ ＭＳ ｖａｎ，ｅｔ ａｌ．Ｍｉｃｒｏｒｎａ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｓｅｚａｒｙ ｓｙｎｄｒｏｍｅ：ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ，ｆｕｎｃｔｉｏｎ，ａｎｄ ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ．Ｂｌｏｏｄ．２０１０；１１６：１１０５−１３． Ｈｏｌｓｔ ＬＭ，Ｋａｃｚｋｏｗｓｋｉ Ｂ，Ｇｎｉａｄｅｃｋｉ Ｒ．Ｒｅｐｒｏｄｕｃｉｂｌｅ ｐａｔｔｅｒｎ ｏｆ ｍｉｃｒｏｒｎａ ｉｎ ｎｏｒｍａｌ ｈｕｍａｎ ｓｋｉｎ．Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ｄｅｒｍａｔｏｌｏｇｙ．２０１０；１９：ｅ２０１−５． Ｎａｒｄｕｃｃｉ ＭＧ，Ａｒｃｅｌｌｉ Ｄ，Ｐｉｃｃｈｉｏ ＭＣ，ｅｔ ａｌ．Ｍｉｃｒｏｒｎａ ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ ｒｅｖｅａｌｓ ｔｈａｔ ｍｉｒ−２１，ｍｉｒ４８６ ａｎｄ ｍｉｒ−２１４ ａｒｅ ｕｐｒｅｇｕｌａｔｅｄ ａｎｄ ｉｎｖｏｌｖｅｄ ｉｎ ｃｅｌｌ ｓｕｒｖｉｖａｌ ｉｎ ｓｅｚａｒｙ ｓｙｎｄｒｏｍｅ．Ｃｅｌｌ ｄｅａｔｈ ＆ ｄｉｓｅａｓｅ．２０１１；２：ｅｌ５１． Ｄｕｄａ，Ｐｅｔｅｒ Ｅ．Ｈａｒｔ，Ｄａｖｉｄ Ｇ．Ｓｔｏｒｋ，「Ｐａｔｔｅｒｎ Ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ」，Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，２ｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ，２００１，ｐａｇｅｓ ３６−３９ Ｊａｍｅｓ Ｃａｒｐｅｎｔｅｒ ａｎｄ Ｊｏｈｎ Ｂｉｔｈｅｌｌ（２０００）「Ｂｏｏｔｓｔｒａｐ ｃｏｎｆｉｄｅｎｃｅ ｉｎｔｅｒｖａｌｓ：ｗｈｅｎ，ｗｈｉｃｈ，ｗｈａｔ？ Ａ ｐｒａｃｔｉｃａｌ ｇｕｉｄｅ ｆｏｒ ｍｅｄｉｃａｌ ｓｔａｔｉｓｔｉｃｉａｎｓ」．Ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ ｉｎ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ １９，１１４１−１１６４． Ｂｕｓｔｉｎ ＳＡ，Ｎｏｌａｎ Ｔ．Ｐｉｔｆａｌｌｓ ｏｆ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ ｒｅｖｅｒｓｅ−ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ．２００４；１５：１５５−６６． Ｂｕｓｔｉｎ，Ｓ．Ａ．（ｅｄ．）Ａ−Ｚ ｏｆ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ＰＣＲ，ＩＵＬ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｓｅｒｉｅｓ ５（２００４）８８２頁

本発明は、悪性の、または良性の皮膚試料の高速かつ正確な分類を可能にする診断ｍｉＲＮＡクラシファイヤーに基づく方法を提供するものである。

従って、本発明は、炎症性皮膚疾患の個体由来の試験皮膚細胞サンプルを皮膚リンパ腫に分類する方法であって：ｍｉＲ−１５５およびｍｉＲ−３２６の少なくとも１つ、ならびにｍｉＲ−２０３およびｍｉＲ−２０５の少なくとも１つのマイクロＲＮＡの発現レベルを検出することと、前記マイクロＲＮＡの発現レベルを含むデータセットに基づいて、前記試験細胞サンプルの臨床スコア（Ｓ）を計算することと、前記試験細胞サンプルを、前記臨床スコアの値に基づいて、皮膚リンパ腫か否かに分類することとを含む方法に関するものである。

定義
本発明の詳細な実施形態に関する説明の前に、本発明の主な態様および実施形態に関する具体的な用語の定義が与えられる。

用語「皮膚リンパ腫」、「皮膚Ｔ細胞リンパ腫」、「菌状息肉腫」および「セザリー症候群」は、ＷＨＯ−ＥＯＲＴＣガイドラインの記載に従って用いられている（非特許文献１１；非特許文献１２；非特許文献１３；非特許文献１４）。

用語「ｍｉＲ」、「ｍｉＲＮＡ」および「マイクロＲＮＡ」は同義的に用いられ、内因性遺伝子に由来する約１８から２５ヌクレオチド（ｎｔ）の長い非コーディングＲＮＡのクラスを指す。これらは、プレ−ｍｉＲと呼ばれるより長い（およそ７５ｎｔ）ヘアピン様前駆体から処理される。マイクロＲＮＡは、ｍｉＲＮＰと呼ばれる複合体にまとまり、アンチセンス相補性によってターゲットを認識する。マイクロＲＮＡがターゲットに１００％一致する、すなわち、相補性が完全である場合、ターゲットｍＲＮＡは切断され、ｍｉＲはｓｉＲＮＡのように機能する。一致が不完全である、すなわち、相補性が部分的である場合、ターゲットｍＲＮＡの翻訳は阻止される。

本明細書中で用いられるように、用語「ｌｅｔ−７ｂ」、「ｍｉＲ−１０３」、「ｍｉＲ−１５５」、「ｍｉＲ−１８４」、「ｍｉＲ−１９１」、「ｍｉＲ−２０３」、「ｍｉＲ−２０５」、「ｍｉＲ−２４」、「ｍｉＲ−２９９−５ｐ」、「ｍｉＲ−３２６」、「ｍｉＲ−３４ｂ」、「ｍｉＲ−４２３−５ｐ」、「ｍｉＲ−６６３ｂ」、「ｍｉＲ−７１１」、または「ｍｉＲ−７１８」は、Ｓａｎｇｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，ＵＫによって主催されたｍｉＲレジストリデータベースリリース１２．０以降において見られるヒトｍｉＲ配列、および動物の同等物を指す。ｍｉＲ−７１１およびｍｉＲ−７１８を除いて、全ｍｉＲは、一般に接頭辞「ｈｓａ−」で言及されるヒトｍｉＲ配列であり、例えば、ｈｓａ−ｍｉＲ−１５５は、ヒトｍｉＲ−１５５を指す。ｍｉＲ−７１１およびｍｉＲ−７１８は、レジストリデータベースリリース１４．０まで公表されなかった。

本明細書中で用いられるように、用語「ｍｉＲのレベルを検出する」は、前記ｍｉＲの定量化を指す。定量化の１つのやり方が実施例において記載されており、すなわちｑＲＴ−ＰＣＲである。しかしながら、他の多くのやり方で、例えば、アレイ、ノザンブロット、ドットブロット、ＲＮアーゼプロテクションアッセイ、定量質量分光法、またはＴａｑＭａｎアッセイもしくは実施例で用いられるＵｎｉＲＴアッセイ等の種々の定量ＰＣＲベースの方法によって、ｍｉＲは定量化され得る。

本明細書中で用いられる用語「発現」は、細胞内でのＲＮＡ分子の転写および／または蓄積を指す。

本文脈において、用語「ｍｉＲの発現レベル」および「ｍｉＲのレベル」は、サンプル中で検出される「特定のｍｉＲの量」の測定値として同義的に用いられる。「特定のｍｉＲの量」は、絶対的測定値または相対的測定値のいずれかで表されてよく、量的な方法および質的な方法の双方によって得られる値を指す。「特定のｍｉＲの量」の特に好ましい測定値の１つが、実施例に記載のリアルタイムｑＲＴ−ＰＣＲによって得られるクロッシングポイント（Ｃｐ）値である。「特定のｍｉＲの量」の別の好ましい測定値が、同様に実施例に記載のリアルタイムｑＲＴ−ＰＣＲによって得られる「閾サイクル値（Ｃｔ）」値である。「特定のｍｉＲの量」のＣｐおよびＣｔ測定値は、おおよそ同じ測定値をもたらす。非特許文献２９参照。ＣｐかＣｔかの選択はほとんど、アッセイが関連する、かつ実行される機械の選択の問題である。Ｒｏｃｈｅ ＬＣソフトウェアを用いるＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（登録商標）４８０ Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍにおいて増幅が実行される場合、特定のｍｉＲの量はＣｐによって表される。備え付けのソフトウェアを用いるＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ ７９００ＨＴ ３８４ウェル装置において増幅が実行される場合、特定のｍｉＲの量はＣｔによって表される。

用語「レベル」は、言及されるｍｉＲの相対量および絶対量を示す。

用語「Ｑ−ＰＣＲ」または「ｑ−ＰＣＲ」は、定量ポリメラーゼ連鎖反応を指す。Ｑ−ＰＣＲは、試験サンプルにおいて特定のＤＮＡ（およびＲＮＡ）種の量を定量化する高感度な方法である。ＲＮＡが逆転写されることを、ＰＣＲ技術によるＲＮＡの定量化が要求するので、特定のＲＮＡを定量化するのに定量ＰＣＲが用いられるのを示すことは時折、「ｑＲＴ−ＰＣＲ」または「ＲＴ−Ｑ−ＰＣＲ」と呼ばれる。Ｑ−ＰＣＲおよびｑＲＴ−ＰＣＲ技術の完全な論説が、非特許文献２９に見られることができ、参照により本明細書に組み込まれる。

「ＵｎｉＲＴ」は、新規なＱ−ＰＣＲ法である。この方法は、実施例４、および特許文献１に記載されている。

発明の詳細な説明
本研究において、悪性（ＣＴＣＬ）と、乾癬、アトピー性皮膚炎および接触性皮膚炎等の良性の炎症性皮膚疾患とを区別する潜在的能力を有するｍｉＲＮＡの初期スクリーニング用のマイクロアレイを発明者らは用いた。９０人の患者の最初の訓練セット、５８人の患者の試験セット、および５０人の患者の独立コホートを含む合計１９８人の患者において、良性症状と悪性症状とを高い精度（＞９０％）で見分けた、５つのｍｉＲＮＡ（ｍｉＲ−２０３、ｍｉＲ−２０５、ｍｉＲ−３２６、ｍｉＲ−６６３ｂおよびｍｉＲ−７１１）が識別された。実施例１、図１。重要なことに、１０３人の患者由来のＲＮＡサンプルに対するｑＲＴ−ＰＣＲを用いて、５つのｍｉＲＮＡ中４つ（ｍｉＲ−２０３、ｍｉＲ−２０５、ｍｉＲ−３２６およびｍｉＲ−６６３ｂ）の発現パターンが確かめられた。従って、本発明の一実施形態は、炎症性皮膚疾患の個体由来の試験皮膚細胞サンプルを皮膚リンパ腫に分類する方法であって、試験皮膚細胞サンプルにおける、例えばｍｉＲ−３２６、ｍｉＲ−２０３、ｍｉＲ−２０５およびｍｉＲ−６６３ｂを含むｍｉＲの選択マイクロＲＮＡ（ｍｉＲ）の発現レベルを検出することと、前記マイクロＲＮＡの発現レベルを含むデータセットに基づいて、試験細胞サンプルの臨床スコア（Ｓ）を計算することと、臨床スコアの値に基づいて、試験細胞サンプルを皮膚リンパ腫か否かに分類することとを含む方法である。

ＣＴＣＬ患者のサブ集団に関する最近の研究は、ｍｉＲ−１５５が、セザリー症候群（ＳＳ）患者および進行型（腫瘍病期）菌状息肉腫（ＭＦ）患者のそれぞれにおいて示差的に発現されると識別した（非特許文献１５；非特許文献１６）。興味深いことに、発明者らは、ｍｉＲ−１５５発現データをｑＲＴ−ＰＣＲ技術によってしか確かめることができなかった。しかしながら、ｍｉＲ−１５５に関して、発明者らは、非特許文献１６の知見を確認し、かつ拡張することができた。さらに、ｍｉＲ−１５５がＣＴＣＬにおいて最も著しく示差的に発現されるマイクロＲＮＡの１つであることを、発明者らのｑＲＴ−ＰＣＲ結果は示した。

従って、本発明の一実施形態は、試験細胞サンプルの臨床スコア（Ｓ）を計算するために、マイクロＲＮＡであるｍｉＲ−１５５、ｍｉＲ−３２６、ｍｉＲ−２０３、ｍｉＲ−２０５およびｍｉＲ−６６３ｂのレベルが検出され、かつ用いられる方法である。

ｑＲＴ−ＰＣＲデータについて最近接収縮重心アルゴリズムを用いて、ｍｉＲＮＡの最も判別可能なセットとして、ｍｉＲ−１５５、ｍｉＲ−２０３およびｍｉＲ−２０５が識別された。実施例３参照。従って、本発明の好ましい一実施形態において、試験細胞サンプルの臨床スコア（Ｓ）を計算するために、ｍｉＲ−１５５、ならびにｍｉＲ−２０３およびｍｉＲ−２０５の少なくとも１つのレベルが検出され、かつ用いられる。

また、示差的な発現が、ｍｉＲ−２０３、ｍｉＲ−２０５、およびｍｉＲ−３２６について、Ｐ値が１０^−１１未満ではっきり確かめられたことを、実施例３、図３Ｂは示している。従って、本発明の好ましい一実施形態において、試験細胞サンプルの臨床スコア（Ｓ）を計算するために、マイクロＲＮＡであるｍｉＲ−３２６、ならびにｍｉＲ−２０３およびｍｉＲ−２０５の少なくとも１つのレベルが検出され、かつ用いられる。

皮膚リンパ腫生検において、ｍｉＲ−１５５およびｍｉＲ−３２６が最も上方調節された２つのｍｉＲであるので、本発明のさらに好ましい実施形態は、ｍｉＲ−３２６、ならびにｍｉＲ−２０３およびｍｉＲ−２０５の少なくとも１つのレベルを検出し、かつこのデータを用いて、試験細胞サンプルの臨床スコア（Ｓ）を計算することを含む方法である。

本方法のさらなる実施形態において、試験細胞サンプルの臨床スコア（Ｓ）を計算するために、マイクロＲＮＡであるｍｉＲ−１５５、ｍｉＲ−３２６、ｍｉＲ−２０３およびｍｉＲ−２０５のレベルが検出され、かつ用いられる。

皮膚Ｔ細胞リンパ腫（ＣＴＣＬ）は、皮膚で最も頻出する原発性リンパ腫であり、従って、本発明のさらに好ましい実施形態は、良性の試験皮膚サンプルと試験皮膚サンプルとを区別するために用いられ、かつ皮膚リンパ腫が皮膚Ｔ細胞リンパ腫（ＣＴＣＬ）である方法である。

本発明によれば、臨床スコア（Ｓ）は、いくつかの異なるやり方で計算されてよい。重要なことに、ｍｉＲ−１５５のｑＲＴ−ＰＣＲによって判定されたクロッシングポイント値（Ｃｐ）と、ｍｉＲ−２０３およびｍｉＲ−２０５の平均Ｃｐとの差としてスコアが計算される場合、スコアは、非常に高い感度、特異性および分類精度（９５％）で、ＣＴＣＬの患者を良性皮膚疾患から区別することがわかった。実施例３および図７参照。

従って、一実施形態において、臨床スコアは、ｍｉＲ−１５５の発現レベルと、ｍｉＲ−２０３および／またはｍｉＲ−２０５の平均発現レベルとの比として計算される。

実施例３（図３Ｂ）において見られるように、示差的な発現が、ｍｉＲ−２０３、ｍｉＲ−２０５およびｍｉＲ−３２６について、Ｐ値が１０^−１３未満ではっきり確かめられた。従って、別の実施形態において、臨床スコアは、ｍｉＲ−３２６の発現レベルと、ｍｉＲ−２０３および／またはｍｉＲ−２０５の平均発現レベルとの比として計算される。

またさらなる実施形態において、臨床スコアは、ｍｉＲ−２０３および／またはｍｉＲ−２０５の平均発現レベルに対する、ｍｉＲ−１５５およびｍｉＲ−３２６の発現レベルの比として計算される。

ｍｉＲは、いくつかのやり方で、例えばアレイ、ノザンブロット、ドットブロット、ＲＮアーゼプロテクションアッセイ、定量質量分光法、または種々の定量ＰＣＲベースの技術によって、定量化されてよい。

ＰＣＲ技術において用いられる酵素は、ほとんどの場合、温度耐性ＤＮＡポリメラーゼであるので、ＤＮＡポリメラーゼが機能するのに不可欠なＤＮＡテンプレートを与えるために、ＰＣＲにかけられる前に、ＲＮＡは逆転写酵素の作用によってＤＮＡ相補体がコピーされる。本方法の後のステップで、ＤＮＡコピー（多くの場合、ｃＤＮＡと呼ばれる）が定量ＰＣＲ（ｑ−ＰＣＲ）にかけられる。サンプル中のＲＮＡを逆転写した後、ｑ−ＰＣＲによって定量化する集合的な方法は、定量逆転写ポリメラーゼ連鎖反応または「ｑＲＴ−ＰＣＲ」と呼ばれる。Ｑ−ＰＣＲおよびｑＲＴ−ＰＣＲ技術の完全な論説が、非特許文献２９に見られることができ、参照により組み込まれる。

今日、マイクロＲＮＡを定量化するのに最も飛びぬけて高感度であり、特異的であり、かつ便利な技術は、ｑＲＴ−ＰＣＲ技術である。従って、本方法の最も好ましい実施形態において、マイクロＲＮＡの発現レベルは、ｑＲＴ−ＰＣＲによって判定される。ｑＲＴ−ＰＣＲ法の好ましい例として、実施例４に記載されるＵｎｉＲＴ法がある。しかしながら、実施例６、図６に記載されるＡＢＩ Ｔａｑｍａｎ ｑＲＴ−ＰＣＲアッセイを用いて、同様の結果が得られた。

例えば、比率：

または

は全て、Ｓの有用なエスティメータであり、典型的なリアルタイムＱ−ＰＣＲ装置からの読出しは、多くの場合、いわゆるＣｐ（クロッシングポイント）値または閾サイクル値（Ｃｔ）値であり、双方ともリアルタイムｑＲＴ−ＰＣＲによって得られ得る。Ｃｔ値およびＣｐ値の双方は、以下の関係によって、例えば特定のｍｉＲのレベルと関連している：
（線形）ｍｉＲｘの発現レベル〜２^{−Ｃｐ（ｍｉＲｘ）}
式中、Ｃｐ（ｍｉＲｘ）は、ｍｉＲｘと呼ばれるある具体的なｍｉＲを特異的に検出した、リアルタイムＱ−ＰＣＲ装置からのＣｐ読出しを示す。実施例５は、このようなアッセイを詳細に記載する。

従って、Ｃｐ値がｍｉＲ−レベルの数量詞として用いられる場合、発現：

は、以下に等しい：
＋Ｃｐ（ｍｉＲ １５５）−Ｃｐ（ｍｉＲ ２０３）／２−Ｃｐ（ｍｉＲ ２０５）／２

なお、サンプル中のｍｉＲが少ないほど、クロッシングポイントまたは閾サイクルに達する前に走らせるべきサイクルが多くなる。すなわち、Ｃｐ（またはＣｔ）値が大きいほど、サンプル中に存在するｍｉＲは少ない。

皮膚の皮膚リンパ腫、特に皮膚Ｔ細胞リンパ腫（ＣＴＣＬ）が、正常な、または良性の皮膚でのレベルと比較した場合の、ｍｉＲ−１５５（そして、ｍｉＲ−３２６）の発現レベルの増大、ならびにｍｉＲ−２０３およびｍｉＲ−２０５の発現の減少によって特徴付けられることを理解したことで、臨床スコアＳの多様なエスティメータを見積もることが可能となる。データの最適線形モデルを生成するために、ロジスティック回帰が広く使われている方法である。例えば、臨床スコアＳは、以下のように計算されてよい：
Ｓ＝Ｘ^＊Ｃ（ｍｉＲ−１５５）＋Ｙ^＊Ｃ（ｍｉＲ−２０５）＋Ｚ^＊Ｃ（ｍｉＲ−２０３）
式中、「Ｃ」は、閾サイクル値（Ｃｔ）またはクロッシングポイント値（Ｃｐ）であり、Ｘ、ＹおよびＺは、線形回帰によって決定される係数であるが、分類エラーを最小にするために、Ｘ＋Ｙ＋Ｚ＝０であるという制約がある。

同様に、臨床スコアＳは：Ｓ＝Ｘ^＊Ｃ（ｍｉＲ−３２６）＋Ｙ^＊Ｃ（ｍｉＲ−２０５）＋Ｚ^＊Ｃ（ｍｉＲ−２０３）のように計算されてよく、式中、「Ｃ」は、閾サイクル値（Ｃｔ）またはクロッシングポイント値（Ｃｐ）であり、Ｘ、ＹおよびＺは、線形回帰によって決定される係数であるが、分類エラーを最小にするために、Ｘ＋Ｙ＋Ｚ＝０であるという制約がある。

または、より一般的な条件で表すと、臨床スコアは：Ｓ＝Ｘ^＊Ｃ（ｍｉＲ−１５５）＋Ｙ^＊Ｃ（ｍｉＲ−３２６）＋Ｚ^＊Ｃ（ｍｉＲ−６６３ｂ）＋Ｗ^＊Ｃ（ｍｉＲ−２０３）＋Ｑ^＊Ｃ（ｍｉＲ−２０５）のように計算されてよく、式中、「Ｃ」は、閾サイクル値（Ｃｔ）またはクロッシングポイント値（Ｃｐ）であり、Ｘ、Ｙ、Ｚ、ＷおよびＱは、線形回帰によって決定される係数であるが、分類エラーを最小にするために、Ｘ＋Ｙ＋Ｚ＋Ｗ＋Ｑ＝０であるという制約がある。

実施例３において明示され、そして図４において示されるように、特に有用な１つのエスティメータが、Ｓ＝Ｃ（ｍｉＲ−１５５）−Ｃ（ｍｉＲ−２０５）／２−Ｃ（ｍｉＲ−２０３）／２であり、式中、「Ｃ」は、閾サイクル値（Ｃｔ）またはクロッシングポイント値（Ｃｐ）である。従って、本発明の最も好ましい実施形態は、臨床スコアＳが、Ｓ＝Ｃ（ｍｉＲ−１５５）−Ｃ（ｍｉＲ−２０５）／２−Ｃ（ｍｉＲ−２０３）／２のように計算され、式中、「Ｃ」は、閾サイクル値（Ｃｔ）である。

臨床スコアのためのこのエスティメータを用いて、閾値を見積もることが可能である。実施例３および図４Ａ参照。

従って、本発明の一実施形態において、臨床スコアＳは、Ｓ＝Ｃ（ｍｉＲ−１５５）−Ｃ（ｍｉＲ−２０５）／２−Ｃ（ｍｉＲ−２０３）／２のように計算され、式中、「Ｃ」は、クロッシングポイント値（Ｃｐ）であり、臨床スコア「Ｓ」が、約６．５よりも低い、特に６．０よりも低い場合、試験皮膚細胞サンプルが皮膚Ｔ細胞リンパ腫であることを試験は示し、臨床スコア「Ｓ」が、約６．５よりも高い、特に約７．０よりも高い場合、試験皮膚細胞サンプルが良性であることを試験は示す。

同じ原則に関して、臨床スコアは：Ｓ＝Ｃ（ｍｉＲ−３２６）−Ｃ（ｍｉＲ−２０５）／２−Ｃ（ｍｉＲ−２０３）／２のように計算されてよく、式中、「Ｃ」は、閾サイクル値（Ｃｔ）またはクロッシングポイント値（Ｃｐ）であり、または、Ｓ＝Ｃ（ｍｉＲ−１５５）／３＋Ｃ（ｍｉＲ−３２６）／３＋Ｃ（ｍｉＲ−６６３ｂ）／３−Ｃ（ｍｉＲ−２０５）／２−Ｃ（ｍｉＲ−２０３）／２でも同様であり、式中、「Ｃ」は、閾サイクル値（Ｃｔ）またはクロッシングポイント値（Ｃｐ）である。

高度に有意なｍｉＲＮＡの訓練セットにおける発現プロフィールである。発明者らは、９０サンプルの訓練セットにおいてｔ検定により６８８のｍｉＲＮＡのマイクロアレイ測定値を分析し、ＣＴＣＬの対象のサンプルと良性の炎症性皮膚疾患または健康な個体（ＢＤＮ）の対象のサンプルとの発現差を見出した。高度に有意であり（ボンフェローニ補正Ｐ＜０．００１）、かつ強い差（少なくとも５０％の変化）を示した２７のｍｉＲＮＡがヒートマップに示されている。サンプルが列で、ｍｉＲＮＡが行で配置されており、双方ともノード間のユークリッド距離を用いて平均結合法により階層的にクラスタリングされている。黒色から白色へのシェイドが、相対的発現の増大を示し；黒色のシェイドが、発現の低下を示し；灰色がメディアン発現を示す。最も有意に誘導または抑制された上位５つのマイクロＲＮＡが太字で示されている。 ＣＴＣＬおよびＢＤＮの分類である。図２Ａは、最近接収縮重心（ＮＳＣ）アルゴリズムによって識別された５つのマイクロＲＮＡプロフィールに基づく、訓練セットにおけるＣＴＣＬの対象由来のサンプル（薄い灰色）およびのＢＤＮ対象由来のサンプル（濃い灰色）の主成分分析（ＰＣＡ）プロットである。パーセンテージは、その成分によって説明されるパーセント分散を示す。図２Ｂは、ＮＳＣアルゴリズムを用いた訓練セットにおける分類性能である。フィッシャーの正確確率検定を用いてＰ値が計算された。図２Ｃは、訓練セットから識別された５つのマイクロＲＮＡプロフィールに基づく、試験セットにおけるサンプルのＰＣＡプロットである。図２Ｄは、訓練ＮＳＣアルゴリズムを用いた試験セットにおける分類性能である。 マイクロアレイおよびｑＲＴ−ＰＣＲによって測定されたクラシファイヤーｍｉＲＮＡ発現である。各マイクロＲＮＡについて、患者タイプ（それぞれＣＴＣＬおよびＢＤＮ）に従って発現がグループ化されており、各グループ内でｘ軸上に少し分散させたのは、全測定値をより良好に視覚化できるためである。ｔ検定を用いてＰ値が計算された。図３Ａは、マイクロアレイによって測定された発現である。図３Ｂは、ｑＲＴ−ＰＣＲによって測定された発現である。 ＣＴＣＬの患者および良性の皮膚疾患の患者由来のサンプルのｑＲＴ−ＰＣＲベースの分類である。図４Ａは、各サンプルについて計算されたＣｐベースのサンプルスコア（Ｓ）である。このスコアの値の増大に従って患者が順序付けられている。実線は、ＣＴＣＬの患者（薄い灰色）と良性の皮膚疾患の患者（濃い灰色）とのカットオフを示す。点線は、低い信頼領域のカットオフを示す。図４Ｂは、（Ａ）において規定されたカットオフを用いた分類性能を示す。フィッシャーの正確確率検定を用いてＰ値が計算された。図４Ｃは、サンプルのサンプルスコアに対する種々のカットオフ値について、感度および特異性を示す受信者オペレータ特性曲線（ＲＯＣ）である。図４Ｄは、ＣＴＣＬの患者および良性の皮膚疾患の患者由来のサンプルにおける分類で用いられた３つのマイクロＲＮＡの相対的発現である。誤差棒は、±１標準偏差を示す。ｄＣｐ（またはΔＣｐ）値は、ΔＣｐ＝Ｃｐ，リファレンス（＝コントロール）−Ｃｐ，観察として計算される。 種々の病期の菌状息肉腫（ＭＦ）疾患の患者由来のサンプルのｑＲＴ−ＰＣＲベースの分類である。図５Ａは、図４のように各サンプルについて計算されたＣｐベースのサンプルスコア（Ｓ）である。臨床病期（Ｉ〜ＩＶ）に従って患者が順序付けられ、実線は、各病期における平均サンプルスコアを示す。サンプルスコアが６．５２未満の患者がＣＴＣＬに分類されている（図４と比較）。 ２ステップＵｎｉＲＴプロトコルである。一例としてマイクロＲＮＡのｑＲＴ−ＰＣＲについての原理であり、本方法によって分析され得るＲＮＡは、他の任意の小ＲＮＡ分子、またはｍＲＮＡでもよい。ステップＩは、サンプル中に存在する全マイクロＲＮＡのための１チューブ反応である。ステップ２は、特定のマイクロＲＮＡ用のフォワードおよびリバースプライマーペアを用いるマイクロＲＮＡ特異的ｑＰＣＲである。楕円は、フォワードおよびリバースプライマー中へのロックド核酸（ＬＮＡ）の挿入を示す。本方法が実際に実行される場合、サンプル中に存在するｍｉＲＮＡは第１に、アデニン残基をＲＮＡ分子の３’−末端に付加するポリ（Ａ）ポリメラーゼ（配列番号４７）を用いて、ポリＡテール化される。第２に、３’−末端がＶＮ、またはＶＮＮ縮重モチーフ、および５’−末端がテールであるポリ−Ｔ−コアヌクレオチド配列を有する伸長プライマー（配列番号４８）が、ポリ−Ａテール化ｍｉＲＮＡに、伸長プライマーのＶＮ−、または−ポリ−Ｔ−配列（Ｎ＝Ｃ、Ｇ、ＡおよびＴ；Ｖ＝Ｃ、ＧおよびＡ）とのハイブリダイゼーションによりアニールされる。このプライマーは、ユニバーサルＲＴプライマーと呼ばれることがある。その後、伸長プライマーは、テンプレートとしてｍｉＲを用いる逆転写反応において伸長される。これらの反応は全て１チューブ反応で実行される。生じた一次伸長産物は、伸長プライマーと、サンプル中の全ｍｉＲＮＡに相補的なｃＤＮＡである新たに合成されたＤＮＡとで構成される。次のステップでは、ｍｉＲＮＡ特異的ＰＣＲが実行される。ｍｉＲＮＡ特異的フォワードプライマーが、新たに合成されたｃＤＮＡの３’−末端にアニールされ、そして、テンプレートとして一次伸長産物を用いるＤＮＡ重合反応においてフォワードプライマーを伸長することによって、上流鎖の合成が実行される。続いて、ｍｉＲＮＡ特異的３’−末端配列、ポリ−Ｔ−ストレッチ、および５’−末端テールで構成されるｍｉＲＮＡ特異的リバースプライマー（配列番号４９）が上流鎖にハイブリダイズされて、リバースプライマーの伸長によって下流鎖が合成される。 クラシファイヤーのマイクロＲＮＡについてｑＲＴ−ＰＣＲにより測定された発現である。各マイクロＲＮＡについて、患者タイプ（それぞれＢＤＮおよびＣＴＣＬ）に従って発現がグループ化されている。各グループ内でｘ軸上に少し分散させたのは、全測定値をより良好に視覚化できるためである。

実験
［マイクロアレイデータ前処理］
共変量としてバックグラウンド強度を用い、正規分布および指数分布のコンボリューションをフォアグラウンド強度へ適合させることによって、プローブシグナルがバックグラウンド補正された（非特許文献１７）。各プローブについて４つの技術的反復スポットが組み合わされて、信頼できるスポットの対数ベースの２平均をとることによって、１つのシグナルを生成した。与えられたプローブについて４つ全ての反復が信頼できないと判断されれば、そのプローブはさらなる分析から除外された。リファレンスデータベクトルＲが、全サンプル中の各プローブのメディアンシグナルとして計算された。サンプルデータベクトルＳによって表される、与えられたサンプルにおける全プローブシグナルについて、局所的に重み付けされた多項回帰によって曲線Ｆが決定されて、ＳとＲとの最適合致を与えた（非特許文献１８）。これから、関数Ｆで変換することによって、正規化されたサンプルベクトルＭが計算された。Ｍ＝Ｆ（Ｓ）であった。このようにして、全サンプルは、リファレンスＲに対して正規化された。この正規化手順はほとんど、非特許文献１９において概説されているものに従っている。離れたデータポイント（シグナル単位あたり１５プローブ未満の、まばらにサンプリングされた強度領域におけるプローブ）は、この方法によって信頼なく調整されたとみなされ、さらなる分析の前に除外された。

［クラシファイヤー統計］
発現レベルの有意差が、非対比両側ｔ検定によって評価された。最近接収縮重心分類を用いてクラス予測がなされた（非特許文献２０）。手短に言うと、各クラスにおける各マイクロＲＮＡの平均発現が、そのマイクロＲＮＡについてのクラス内標準偏差で割られたものとして、標準化重心が各クラスについて算出される。続いて、これらのクラス重心のそれぞれに対して、新たなサンプルのマイクロＲＮＡ発現プロフィールが比較され、重心がユークリッド距離で最も近いクラスが、その新たなサンプルについて予測されるクラスである。訓練セットに関して、１０倍の交差検証を通して決定される誤分類エラーを最小にする閾量により、全クラスについて、クラス重心を全体の重心の方へ収縮させることによって、アルゴリズムは訓練される。

［実施例１］
マイクロアレイを用いたｍｉＲＮＡの発現プロファイリング
マイクロアレイ分析が用いられて、１４８人分の、ホルマリン固定され、かつパラフィン包埋された生検のｍｉＲＮＡプロファイリングを実行した。これらのサンプルのうち、６３人分は種々の形態のＣＴＣＬの患者由来であり、８５人分は良性の炎症性皮膚疾患の患者または健康な個体（ＢＤＮ）由来であった（表１）。

リンパ腫患者由来の生検が、１９７９〜２００４年の期間にサンプリングされ、Ｒｉｇｓｈｏｓｐｉｔａｌｅｔ、Ｂｉｓｐｅｂｊｅｒｇ Ｈｏｓｐｉｔａｌ、Ａａｌｂｏｒｇ ＳｙｇｅｈｕｓおよびＨｅｒｌｅｖ Ｈｏｓｐｉｔａｌの病理部のアーカイブから集められた。全リンパ腫症例から、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ３０、ＣＤ５６、ＴｌＡ−１およびグランザイムＢの染色を最低限使用する組織学および免疫組織化学によって、組織サンプルがレビューされた。続いてサンプルは、ＷＨＯ−ＥＯＲＴＣ（非特許文献１１；非特許文献１２；非特許文献１３；非特許文献１４）ガイドラインに従って分類され、そしてコホートの臨床特性がレビューされ、最終診断を確定した。良性の皮膚疾患の患者および健康なコントロール由来の生検が、Ｇｃｎｔｏｆｔｅ Ｈｏｓｐｉｔａｌの皮膚−アレルギー部、Ｂｉｓｐｅｂｊｅｒｇ Ｈｏｓｐｉｔａｌの皮膚部、Ｒｉｇｓｈｏｓｐｉｔａｌｅｔの病理部での、そして、臨床試験の一部としてＬＥＯ Ｐｈａｒｍａ Ａ／Ｓでの、インフォームドコンセントの後に集められ、地元の倫理委員会（Ｈ−Ｂ−２００９−０４５およびＨ−ｌ−２００９−１１１）およびＤａｔａ Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ Ａｇｅｎｃｙ（Ｄａｔａｔｉｌｓｙｎｅｔ Ｊ．ＮＲ．２０１０−４１−４３０３）によって承認された。

ＲｅｃｏｖｅｒＡｌｌ Ｔｏｔａｌ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ／Ａｍｂｉｏｎ，ＵＳＡ）を用いて、メーカのガイドラインに従い、６つの１０μｍの組織切片から全ＲＮＡが単離された。全ＲＮＡの量および質が、分光光度計（Ｎａｎｏｄｒｏｐ ＮＤ−１０００）によってチェックされた。

ｍｉＲＣＵＲＹ ＬＮＡ Ａｒｒａｙパワーラベリングキット（Ｅｘｉｑｏｎ，Ｄｅｎｍａｒｋ）を用いて、各サンプルからの１００ｎｇの全ＲＮＡが、Ｈｙ３蛍光色素で標識された。技術的変動を最小にするために、全サンプルが、同じ日に同じマスターミックスにより標識された。Ｈｙ３−標識サンプルは、Ｓａｎｇｅｒ ＩｎｓｔｉｔｕｔｅのｍｉＲＢＡＳＥバージョン１５．０に登録されている全ヒトｍｉＲＮＡをターゲットにする捕捉プローブを含むｍｉＲＣＵＲＹ ＬＮＡアレイ（ｖ１１．０）（Ｅｘｉｑｏｎ，Ｄｅｎｍａｒｋ）にハイブリダイズされた。Ｔｅｃａｎ ＨＳ４８００ハイブリダイゼーションステーション（Ｔｅｃａｎ．Ａｕｓｔｒｉａ）を用いて、メーカの仕様書に従い、ハイブリダイゼーションが５６℃で一晩実行された。全アレイを一気にハイブリダイズすることができなかったので、ハイブリダイゼーションプロセスにおける日々の変動を最小にするように、サンプルが５つのバッチにランダムに分配された。ハイブリダイゼーション後、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｇ２５６５ＢＡ Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ Ｓｃａｎｎｅｒ Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．，ＵＳＡ）を用いて、５μｍの解像度でマイクロアレイスライドがスキャンされ、そして、スタンダード設定のＩｍａＧｅｎｅ ８．０ソフトウェア（ＢｉｏＤｉｓｃｏｖｅｒｙ，Ｉｎｃ．，ＵＳＡ）を用いて、生じたＴＩＦＦ画像が分析された。

共変量としてバックグラウンド強度を用い、正規分布および指数分布のコンボリューションをフォアグラウンド強度へ適合させることによって、プローブシグナルがバックグラウンド補正された（非特許文献１７）。各プローブについて４つの技術的反復スポットが組み合わされて、信頼できるスポットの対数ベースの２平均をとることによって、１つのシグナルを生成した。与えられたプローブについて４つ全ての反復が信頼できないと判断されれば、そのプローブはさらなる分析から除外された。リファレンスデータベクトルＲが、全サンプル中の各プローブのメディアンシグナルとして計算された。サンプルデータベクトルＳによって表される、与えられたサンプルにおける全プローブシグナルについて、局所的に重み付けされた多項回帰によって曲線Ｆが決定されて、ＳとＲとの最適合致を与えた（非特許文献１８；非特許文献１９）。これから、関数Ｆで変換することによって、正規化されたサンプルベクトルＭが計算された。Ｍ＝Ｆ（Ｓ）であった。このようにして、全サンプルは、リファレンスＲに対して正規化された。この正規化手順はほとんど、非特許文献１９において概説されているものに従っている。離れたデータポイント（シグナル単位あたり１５プローブ未満の、まばらにサンプリングされた強度領域におけるプローブ）は、この方法によって信頼なく調整されたとみなされ、さらなる分析の前に除外された。

サンプルは、訓練用の３／５（ｎ＝９０）、および試験用の２／５（ｎ＝５８）に分けられ、ＣＴＣＬ対ＢＤＮサンプルの比率は両セットにおいておおよそ等しかった。この分割は、本研究において用いられる５つのマイクロアレイ生産バッチに従っている（表１）。前処理フィルタリング基準をパスした６８８のｍｉＲＮＡのうち、訓練セットの最初の統計分析が、ＣＴＣＬと良性の皮膚疾患および正常な皮膚との間で強い（少なくとも５０％の変化）、かつ高度に有意な（ｔ検定のボンフェローニ補正Ｐ値＜０．００１）差を示す２７のｍｉＲＮＡを識別した（図１）。従って、多くのｍｉＲＮＡの発現レベルは、ＣＴＣＬの患者とＢＤＮの患者との間でかなり異なる。２０９の最も可変的なｍｉＲＮＡに基づく教師なし階層クラスタリングを用いて、ほとんど同じ結果が得られた（データは示されない）。

［実施例２］
ＣＴＣＬ−特異的ｍｉＲＮＡシグナチュアの識別
ＣＴＣＬ特異的シグナチュアを見出すために、発明者らは最近接収縮重心アルゴリズムにより訓練セットを分析した（非特許文献２０）。アレイ分析において識別された２７の高度に有意なｍｉＲＮＡのうち、最も誘導された上位３つ（ｍｉＲ−３２６、ｍｉＲ−６６３ｂ、ｍｉＲ−７１１）および最も抑制された２つ（ｍｉＲ−２０３、ｍｉＲ−２０５）のｍｉＲＮＡが、重心の収縮後の分類に最適なｍｉＲＮＡのセットであることがわかった。

発現レベルの有意差が、非対比両側ｔ検定によって評価された。最近接収縮重心分類を用いてクラス予測がなされた（非特許文献２０）。手短に言うと、各クラスにおける各マイクロＲＮＡの平均発現が、そのマイクロＲＮＡについてのクラス内標準偏差で割られたものとして、標準化重心が各クラスについて算出される。続いて、これらのクラス重心のそれぞれに対して、新たなサンプルのマイクロＲＮＡ発現プロフィールが比較され、重心がユークリッド距離で最も近いクラスが、その新たなサンプルについて予測されるクラスである。訓練セットに関して、１０倍の交差検証を通して決定される誤分類エラーを最小にする閾量により、全クラスについて、クラス重心を全体の重心の方へ収縮させることによって、アルゴリズムは訓練される。

５つの全ｍｉＲＮＡは、ｔ検定によるボンフェローニ補正Ｐ値が＜１０^−８であった。訓練セットにおけるサンプルは、９３％の精度（８４％の感度、および１００％の特異性、フィッシャーの直接確率検定によればＰ＜０．００１）で分類され得た（図２）。５つのｍｉＲＮＡの性能を未知サンプルの分類において評価するために、発明者らは、すでに訓練されたクラシファイヤーを５９人分の試験セットサンプルに用いたところ、９７％の分類精度（９２％の感度、および１００％の特異性、フィッシャーの直接確率検定によればＰ＜０．００１）で分類された（図２Ｃおよび図２Ｄ）。図３Ａは、クラシファイヤーの個々のｍｉＲＮＡの発現を示す。５つのｍｉＲＮＡのそれぞれについて、正規化ｌｏｇ２発現値が、患者タイプ（それぞれＣＴＣＬおよびＢＤＮ）に従ってグループ化されている（図３Ａ）。

次に、発明者らは、１０倍の交差検証によってクラシファイヤーのロバスト性を評価した。各時、訓練セットおよび試験セットとして異なるバッチを選択した（しかし、比率３／５から２／５を保った）。上述のアプローチは、ほとんど全ての場合において、ｍｉＲ−２０３、ｍｉＲ−６６３ｂ、ｍｉＲ−２０５およびｍｉＲ−７１１を識別した（表２）。１つのｍｉＲＮＡ、ｍｉＲ−３２６は、１０分割のうち２つで選択されただけであった。重要なことに、たとえどの分割が選択されたとしても、試験セットにおける分類精度は一貫して９０％を上回っていた（９９％信頼区間で、９０．５％と９５．６％との間にあり、平均で９３．１％であった）（表２）。

［実施例３］
ｑＲＴ−ＰＣＲベースのｍｉＲＮＡクラシファイヤーの識別
診断の目的で、ｑＲＴ−ＰＣＲが、マイクロアレイよりも感度が高く、特異的であり、かつ適用可能である。上述のマイクロアレイ結果を確かめるために、実施例１に記載の１４８サンプルのうちの１０３サンプルのサブセットに対する５−ｍｉＲＮＡシグナチュアのためのｑＲＴ−ＰＣＲにより、発現レベルが測定された。サンプルのサブセットは、ＮａｎｏＤｒｏｐによって測定した高ＲＮＡ含有量に基づいて選択され、訓練セットサンプルおよび試験セットサンプルの双方をカバーした。

ＲｅｃｏｖｅｒＡｌｌ Ｔｏｔａｌ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ／Ａｍｂｉｏｎ，ＵＳＡ）を用いて、メーカのガイドラインに従い、６つの１０μｍの組織切片から全ＲＮＡが単離された。全ＲＮＡの量および質が、分光光度計（Ｎａｎｏｄｒｏｐ ＮＤ−１０００）によってチェックされた。ｍｉＲＣＵＲＹ ＬＮＡ（商標）Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ＲＴマイクロＲＮＡ ＰＣＲ用のプロトコルに従って、ｃＤＮＡが５０×に希釈され、１０μｌのＰＣＲ反応液中でアッセイされた；各マイクロＲＮＡがｑＰＣＲによって一度アッセイされた。逆転写反応からテンプレートを除いているネガティブコントロールが同時に実行され、プロファイリングされた。増幅は、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（登録商標）４８０ Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｒｏｃｈｅ）の３８４ウェルプレートで実行された。Ｃｐの判定（第２誘導法による）および融解曲線分析の双方について、Ｒｏｃｈｅ ＬＣソフトウェアを用いて増幅曲線が分析された。異なる融解曲線について全アッセイが調べられ、アッセイについてＴｍが既知の規格内であることがチェックされた。さらに、アッセイは、データ分析に含まれるために、３Ｃｐがネガティブコントロール未満であり、かつＣｐ＜３９で検出されなければならない。これらの基準をパスしなかったデータは、さらなる分析から一切省略された。

ｍｉＲ−１０３およびｍｉＲ−４２３−５ｐが、サンプル中で最も安定して発現されるリファレンスとして識別され、Ｃｐ，ｒｅｆと表される平均Ｃｐが、ΔＣｐを計算する際の正規化因子として用いられる（非特許文献２１）。具体的には、与えられたｍｉＲＮＡから測定されたＣｐについて、ΔＣｐ（またはｄＣｐ）値は、ΔＣｐ＝Ｃｐ，ｒｅｆ−Ｃｐ，ｏｂｓとして計算される。示差的な発現は、ｍｉＲ−２０３、ｍｉＲ−２０５、およびｍｉＲ−３２６について１０^−１１未満のＰ値で、およびｍｉＲ−６６３ｂについて１０^−７未満のＰ値で、はっきりと確かめられたが（図３Ｂ）、最後に残ったｍｉＲＮＡであるｍｉＲ−７１１は、バックグラウンド蛍光を超えて確実に測定され得なかった。異なるｑＲＴ−ＰＣＲプラットホームを用いた４４人分の患者サンプルに対する独立したシリーズのｑＲＴ−ＰＣＲ実験において、ほとんど同じ結果が得られた（ＴａｑＭａｎデータは示されない）。腫瘍病期ＭＦ由来の皮膚病斑、およびＳＳ患者由来の血液サンプルに関する最近の研究が、ｍｉＲ−１５５、ｍｉＲ−２１、ｍｉＲ−２４、ｍｉＲ−３４ｂ、ｍｉＲ−１９１、ｍｉＲ−４８６、ｍｉＲ−２１４、Ｌｅｔ−７ｂ、および他のｍｉＲＮＡの示差的な発現について報告した（非特許文献２２；非特許文献２３；非特許文献２４；非特許文献２５）。

従って、発明者らは、これらのｍｉＲＮＡについてｑＲＴ−ＰＣＲを実行し、ｍｉＲ−１５５、ｍｉＲ−２４、ｍｉＲ−１９１およびＬｅｔ−７ｂの示差的な発現を確かめた。対照的に、ｍｉＲ−３４ｂは、ｑＲＴ−ＰＣＲ測定において有意性を達成せず、ｍｉＲ−２１は、ＣＴＣＬにおいて増大したが、一部分の乾癬患者でも増大した（データは示されない）。最近接収縮重心アルゴリズムは、最も判別可能なｍｉＲＮＡのセットとして、ｍｉＲ−１５５、ｍｉＲ−２０３およびｍｉＲ−２０５を識別した。等価線形組合せとして最近接重心分類の等式（非特許文献２６）をリライトすることによって、発明者らは：Ｓ＝Ｃｐ（ｍｉＲ−ｌ５５）−Ｃｐ（ｍｉＲ−２０３）／２−Ｃｐ（ｍｉＲ−２０５）／２として簡略化された判別関数、またはサンプルスコアを得た。

受信者オペレータ特性曲線（ＲＯＣ、図４Ｃ）下面積は、９５％の信頼区間で、０．９７２５と０．９９９６との間にあり、０．９８９であった（１００００層別化ブートストラップ反復から計算された。非特許文献２７）。この結果の有意性は、ウィルコクソン順位和検定によって、Ｐ＜２×ｌ０^−１６であると推定された。

発明者らは、サンプルスコア（図４Ａおよび図４Ｂ）およびＲＯＣ曲線（図４Ｃ）の分布を調べることによって閾値を選び、閾値の周辺に低信頼領域を導入した（図４Ａおよび図４Ｂ）。ｍｉＲ−２０３および２０５の発現がＣＴＣＬにおいて減少し（図４Ｄ）、かつｍｉＲ−１５５の発現がＣＴＣＬにおいて増大する（図４Ｄ）につれ、スコアＳは、良性皮膚疾患（図４Ａおよび図４Ｂ）と比較されると、ＣＴＣＬにおいてより小さくなった。１０３人分のサンプルにおいて、このｑＲＴ−ＰＣＲベースの「最小」ｍｉＲＮＡクラシファイヤー（ｍｉＲ−１５５、ｍｉＲ−２０３およびｍｉＲ−２０５）は、図４Ｃ（ドットが、９７％の特異性にて９１％の感度を示す）のＲＯＣグラフによって示されるように、ＣＴＣＬの患者を、良性皮膚病から、９５％の分類精度（Ｐ＜０．００１、図４Ｂ）および高い感度／特異性で区別した。重要なことに、ＭＦ患者は、疾患病期とは独立して、悪性であると分類された（図５）。シグナチュアが、ＭＦの初期の病期と良性のコントロール（ＢＤＮ）とでさえ区別することは、注目すべきである。

発明者らのｍｉＲＮＡクラシファイヤーによって達成される感度および特異性は、現在の手法と比較して、有意な改善を構成するものである。また、曲線下面積（ＡＵＣ）が１に非常に近い高度に有意なＲＯＣ曲線は、これらの分類精度が新たなサンプルにまで広がる可能性を高めている。

［実施例４］
ＵｎｉＲＴ法
この実施例では、定量逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＲＴ−ＰＣＲ）技術の使用による非コーディング小ＲＮＡ分子の増幅および定量化のためのＵｎｉＲＴ法が、手短に記載される。

手短に言えば、図６を参照すると、ＵｎｉＲＴプロトコルは２ステッププロトコルである。ステップ１において、サンプル中に存在するｍｉＲは第１に、アデニン残基をＲＮＡ分子の３’−末端に付加するポリ（Ａ）ポリメラーゼを用いて、ポリＡテール化される。第２に、３’−末端がＶＮ縮重モチーフ、および５’−末端がテールであるポリ−Ｔ−コアヌクレオチド配列を有する伸長プライマーが、ポリ−Ａテール化ｍｉＲに、伸長プライマーのＶＮ−ポリ−Ｔ−配列とのハイブリダイゼーションによりアニールされる。その後、伸長プライマーは、テンプレートとしてｍｉＲを用いる逆転写反応において伸長される。生じた一次伸長産物は、伸長プライマーと、サンプル中のｍｉＲに相補的な、新たに合成されたｃＤＮＡとで構成される。

次のステップであるステップ２では、ｍｉＲ特異的ＰＣＲが実行される。ｍｉＲ特異的フォワードプライマーが、新たに合成されたｃＤＮＡの３’−末端にアニールされ、そして、テンプレートとして一次伸長産物を用いるＤＮＡ重合反応においてフォワードプライマーを伸長することによって、上流鎖の合成が実行される。続いて、ｍｉＲ特異的３’−末端配列、ポリ−Ｔ−ストレッチ、および５’−末端テールで構成されるｍｉＲ特異的リバースプライマーが上流鎖にハイブリダイズされて、リバースプライマーの伸長によって下流鎖が合成される。

ステップ１およびステップ２の双方において、ＬＮＡは、プライマーのそれぞれのターゲットに対する特異的かつ有効なアニーリングを確実にするように補助するものである。

［実施例５］
ＵｎｉＲＴ法によるマイクロＲＮＡの識別
ＵｎｉＲＴ ｑＰＣＲ法（実施例４参照）を用いて、ｌｅｔ−７ｂ、ｍｉＲ−１０３、ｍｉＲ−１５５、ｍｉＲ−１８４、ｍｉＲ−１９１、ｍｉＲ−２０３、ｍｉＲ−２０５、ｍｉＲ−２４、ｍｉＲ−２９９−５ｐ、ｍｉＲ−３２６、ｍｉＲ−３４ｂ、ｍｉＲ−４２３−５ｐ、ｍｉＲ−６６３ｂ、ｍｉＲ−７１１、およびｍｉＲ−７１８のレベルが定量化された。以下、手短に言う。

ＵｎｉＲＴプロトコルのステップ１において、以下の組成物を有する１０μｌのＲＴ反応液あたり、１０ｎｇの全ＲＮＡが用いられた：
反応バッファ（１×反応バッファは；１６７ｍＭのＮａＣｌ、２５ｍＭのＫＣｌ、５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、８ｍＭのＭｇＣｌ_２、３．３３ｍＭのＤＴＴ、０．１ｍＭのＡＴＰ、０．１ｍＭのｄＡＴＰ、０．１ｍＭのｄＣＴＰ、０．１ｍＭのｄＧＴＰ、および０．１ｍＭのｄＴＴＰを含む）
０．５μＭのＲＴ−プライマー（Ｌ２ＴＡ３：５’−ｇｇｔａｃｔａｇｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｔｖｎｎ（配列番号１））（ｖはシトシン、グアニン、およびアデニン残基を示し、ｎはシトシン、グアニン、アデニン、およびチミン残基を示す）
１００ユニットのマローニーマウス白血病ウィルス（Ｍ−ＭｕＬＶ）逆転写酵素（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｐｓｗｉｃｈ ＭＡ）
１ユニットの大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ポリ（Ａ）ポリメラーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｐｓｗｉｃｈ ＭＡ）

ＲＴ反応は、３部ずつ実行した（サンプルあたり３つのＲＴ反応）。
ＲＴ反応液は、４２℃で１時間、９５℃で５分間インキュベートされた。
続いて、ＲＴ反応液は、ｑＰＣＲ分析−ステップ２の前に、水中に５０×希釈された。

ＵｎｉＲＴプロトコルのステップ２において、１μｌの希釈ＲＴ反応液が、提供者によるプロトコルに従って、表の各ｍｉＲ用のＰＣＲプライマーセット（各プライマーの最終濃度は０．３μＭである）、およびＦａｓｔ ｓｔａｒｔ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｍａｓｔｅｒミックス（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ ＧｍｂＨ，Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ）と混合された。

全ｑＰＣＲは、１０μｌの反応容積で、１部走らせた（ＲＴ反応につき１つのｑＰＣＲ反応）。ｑＰＣＲ反応は、Ｒｏｃｈｅ Ｌｉｇｈｔｃｙｃｌｅｒ ４８０ ＩＩ（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ ＧｍｂＨ，Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ）の３８４ウェルプレート中で走らせた。

１つまたは複数のリファレンス遺伝子（非特許文献２８；非特許文献２１）と比較して、特異的ｍｉＲのクロッシングポイント差（ΔＣｐ）として、特定のターゲットｍｉＲの相対的発現比を計算するＣｐ（クロッシングポイント）法を用いて、全リアルタイムＰＣＲデータが分析された。

Ｌｉｇｈｔｃｙｃｌｅｒ ４８０ ＩＩ装置に付随するＬｉｇｈｔｃｙｃｌｅｒ ４８０ソフトウェアリリース１．５．０、バージョン１．５．０．３９を用いて、Ｃｐ値が計算された。

プライマー配列は、天然に存在するヌクレオチドと組み合わせて、ＬＮＡが加えられている（ヌクレオチドの０％〜１３．３％）。ｍｉＲ−７１１およびｍｉＲ−７１８を除いて、全ｍｉＲは、Ｓａｎｇｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，ＵＫ（ｍｉＲ１２＿０）によって主催されたｍｉＲレジストリデータベースリリース１２．０において見られるヒトｍｉＲ配列である。ｍｉＲ−７１１およびｍｉＲ−７１８は、レジストリデータベースリリース１４．０まで公表されなかった。

［実施例６］
ＡＢＩ ＴａｑＭａｎ ｑＲＴ−ＰＣＲアッセイ
皮膚生検サンプルが、皮膚Ｔ細胞リンパ腫の患者、乾癬およびアトピー性皮膚炎を含む良性の皮膚疾患の患者、ならびに健康な対象から得られた。ＦＦＰＥブロックが、ＲＮアーゼフリーの環境において区分された。８つの１０μｍの組織切片がそれぞれ、２本の１．５ｍＬマイクロ遠心チューブ内に入れられ（合計で１６切片）、Ｒｅｃｏｖｅｒ Ａｌｌ Ｔｏｔａｌ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ／Ａｍｂｉｏｎ，ＵＳＡ）を用いて、メーカのガイドラインに従って、全ＲＮＡが抽出された。各サンプルから、ＴａｑＭａｎ Ｍｉｃｒｏ ＲＮＡ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｋｉｔを適当なプライマーと共に用いて（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，ＵＳＡ）、メーカのガイドラインに従って、１５ｎｇの全ＲＮＡがｃＤＮＡに逆転写された。反応あたり５ｎｇのｃＤＮＡの３部がそれぞれ、ＴａｑＭａｎ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ、ならびに関連するプライマーおよびプローブ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，ＵＳＡ）と混合され、標準設定のＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ ７９００ＨＴ ３８４−ウェル装置で走らされた。サイクル閾値（Ｃｔ，プローブシグナルが蛍光バックグラウンドを超える閾値に達するＰＣＲサイクル）が、各ウェルについて判定された。

各プローブについて３つの技術的反復ウェル由来のＣｔの測定が組み合わされて、信頼できるウェルの平均をとることによって、１つのシグナルを生成した。安定して発現される正規化因子の識別を可能にするために、一般的に用いられる５つの小ＲＮＡリファレンス（ＲＮＵ６Ａ、ＲＮＵ６Ｂ、ＲＮＵ１４Ｂ、ＲＮＵ４８およびＳＮＯＲＤ１２）が、注目するマイクロＲＮＡの他に含まれて、全サンプルにわたって、特徴安定性−測定に従って順位付けされた（非特許文献２１）。

２つの小ＲＮＡ、ＲＮＵ６ＢおよびＳＮＯＲＤ１２が、サンプル全体で最も安定して発現されるリファレンスとして識別され、これらの平均Ｃｔが、ΔＣｔを計算する際の正規化因子として用いられた（非特許文献２１）。サンプルが、高ＲＮＡ含有量に基づいて選択され、訓練セットサンプルおよび試験セットサンプルの双方をカバーした。示差的な発現が、ｍｉＲ−２０３、ｍｉＲ−２０５およびｍｉＲ−３２６についてはっきり確かめられた（表４）。

ｍｉＲ−６６３ｂに関して、平均発現は、マイクロアレイおよびｑＲＴ−ＰＣＲ双方の測定について、同方向に変化する（ＣＴＣＬで増大した）が、Ｐ値は、ｑＲＴ−ＰＣＲ測定についてわずか０．００２であり、これは、（試験されたサンプルの数がより少ないことを考慮した場合でさえ）ｍｉＲ−２０３、ｍｉＲ−２０５およびｍｉＲ−３２６についてよりもかなり低い有意性である。ｍｉＲ−６６３ｂについての蛍光増幅プロットは、２つのプラトーを有する二相挙動を示した。これは、ＴａｑＭａｎプライマーおよびプローブが、うまく機能しないことを示している。重要なことに、ｍｉＲ−７１１は、ｑＲＴ−ＰＣＲ測定において有意性を達成しなかった。

文献

Claims (19)

1. 炎症性皮膚疾患の個体由来の試験皮膚細胞サンプルを皮膚リンパ腫に分類する方法であって：
   ｍｉＲ−１５５およびｍｉＲ−３２６の少なくとも１つ、ならびにｍｉＲ−２０３およびｍｉＲ−２０５の少なくとも１つのマイクロＲＮＡの発現レベルをＱ−ＰＣＲ技術によって検出することと、
   前記マイクロＲＮＡの発現レベルを含むデータセットに基づいて、前記試験細胞サンプルの臨床スコア（Ｓ）を計算することと、
   前記試験細胞サンプルを、前記臨床スコアの値に基づいて、皮膚リンパ腫か否かに分類することと
   を含む方法。
2. 前記試験細胞サンプルの臨床スコア（Ｓ）を計算するために、マイクロＲＮＡであるｍｉＲ−１５５、ならびにｍｉＲ−２０３およびｍｉＲ−２０５の少なくとも１つの前記レベルが検出され、かつ用いられる、請求項１に記載の方法。
3. 前記試験細胞サンプルの臨床スコア（Ｓ）を計算するために、マイクロＲＮＡであるｍｉＲ−３２６、ならびにｍｉＲ−２０３およびｍｉＲ−２０５の少なくとも１つの前記レベルが検出され、かつ用いられる、請求項１に記載の方法。
4. 前記試験細胞サンプルの臨床スコア（Ｓ）を計算するために、マイクロＲＮＡであるｍｉＲ−１５５、ｍｉＲ−３２６、ならびにｍｉＲ−２０３およびｍｉＲ−２０５の少なくとも１つの前記レベルが検出され、かつ用いられる、請求項１に記載の方法。
5. 前記試験細胞サンプルの臨床スコア（Ｓ）を計算するために、マイクロＲＮＡであるｍｉＲ−１５５、ｍｉＲ−３２６、ｍｉＲ−２０３およびｍｉＲ−２０５の前記レベルが検出され、かつ用いられる、請求項１に記載の方法。
6. 前記試験細胞サンプルの臨床スコア（Ｓ）を計算するために、マイクロＲＮＡであるｍｉＲ−１５５、ｍｉＲ−３２６、ｍｉＲ−２０３、ｍｉＲ−２０５およびｍｉＲ−６６３−ｂの前記レベルが検出され、かつ用いられる、請求項１に記載の方法。
7. 前記皮膚リンパ腫が皮膚Ｔ細胞リンパ腫（ＣＴＣＬ）である、請求項１〜請求項６のいずれかに記載の方法。
8. 前記臨床スコアが、ｍｉＲ−１５５の発現レベルと、ｍｉＲ−２０３および／またはｍｉＲ−２０５の平均発現レベルとの比として計算される、請求項１〜請求項７のいずれかに記載の方法。
9. 前記臨床スコアが、ｍｉＲ−３２６の発現レベルと、ｍｉＲ−２０３および／またはｍｉＲ−２０５の平均発現レベルとの比として計算される、請求項１〜請求項８のいずれかに記載の方法。
10. 前記臨床スコアが、ｍｉＲ−２０３および／またはｍｉＲ−２０５の平均発現レベルに対する、ｍｉＲ−１５５およびｍｉＲ−３２６の発現レベルの比として計算される、請求項１〜請求項９のいずれかに記載の方法。
11. 前記臨床スコアが、以下のように計算され：
    Ｓ＝Ｘ^＊Ｃ（ｍｉＲ−１５５）＋Ｙ^＊Ｃ（ｍｉＲ−２０５）＋Ｚ^＊Ｃ（ｍｉＲ−２０３）
    式中、「Ｃ」は、閾サイクル値（Ｃｔ）またはクロッシングポイント値（Ｃｐ）であり、Ｘ、ＹおよびＺは、線形回帰によって決定される係数であるが、Ｘ＋Ｙ＋Ｚ＝０であるという制約がある、請求項１〜１０のいずれかに記載の方法。
12. 前記臨床スコアが、以下のように計算され：
    Ｓ＝Ｘ^＊Ｃ（ｍｉＲ−３２６）＋Ｙ^＊Ｃ（ｍｉＲ−２０５）＋Ｚ^＊Ｃ（ｍｉＲ−２０３）
    式中、「Ｃ」は、閾サイクル値（Ｃｔ）またはクロッシングポイント値（Ｃｐ）であり、Ｘ、ＹおよびＺは、線形回帰によって決定される係数であるが、Ｘ＋Ｙ＋Ｚ＝０であるという制約がある、請求項１〜１０のいずれかに記載の方法。
13. 前記臨床スコアが、以下のように計算され：
    Ｓ＝Ｃ（ｍｉＲ−１５５）−Ｃ（ｍｉＲ−２０５）／２−Ｃ（ｍｉＲ−２０３）／２
    式中、「Ｃ」は、閾サイクル値（Ｃｔ）またはクロッシングポイント値（Ｃｐ）である、請求項１〜１０のいずれかに記載の方法。
14. 前記臨床スコアが、以下のように計算され：
    Ｓ＝Ｃ（ｍｉＲ−３２６）−Ｃ（ｍｉＲ−２０５）／２−Ｃ（ｍｉＲ−２０３）／２
    式中、「Ｃ」は、閾サイクル値（Ｃｔ）またはクロッシングポイント値（Ｃｐ）である、請求項１〜１０のいずれかに記載の方法。
15. 前記臨床スコアが、以下のように計算され：
    Ｓ＝Ｃ（ｍｉＲ−１５５）＋Ｃ（ｍｉＲ−３２６）−Ｃ（ｍｉＲ−２０５）−Ｃ（ｍｉＲ−２０３）
    式中、「Ｃ」は、閾サイクル値（Ｃｔ）またはクロッシングポイント値（Ｃｐ）である、請求項１〜１０のいずれかに記載の方法。
16. 前記臨床スコアが、以下のように計算され：
    Ｓ＝Ｃ（ｍｉＲ−１５５）／３＋Ｃ（ｍｉＲ−３２６）／３＋Ｃ（ｍｉＲ−６６３ｂ）／３−Ｃ（ｍｉＲ−２０５）／２−Ｃ（ｍｉＲ−２０３）／２
    式中、「Ｃ」は、閾サイクル値（Ｃｔ）またはクロッシングポイント値（Ｃｐ）である、請求項１〜１０のいずれかに記載の方法。
17. 式中、「Ｃ」は、クロッシングポイント値（Ｃｐ）であり、前記臨床スコア「Ｓ」が、約６．５よりも低い、特に６．０よりも低い場合、前記試験皮膚細胞サンプルが皮膚Ｔ細胞リンパ腫であることを試験は示し、前記臨床スコア「Ｓ」が、約６．５よりも高い、特に約７．０よりも高い場合、前記試験皮膚細胞サンプルが良性であることを試験は示す、請求項１３に記載の方法。
18. 前記臨床スコアが、以下のように計算され：
    Ｓ＝Ｘ^＊Ｃ（ｍｉＲ−１５５）＋Ｙ^＊Ｃ（ｍｉＲ−３２６）＋Ｚ^＊Ｃ（ｍｉＲ−６６３ｂ）＋Ｗ^＊Ｃ（ｍｉＲ−２０３）＋Ｑ^＊Ｃ（ｍｉＲ−２０５）
    式中、「Ｃ」は、閾サイクル値（Ｃｔ）またはクロッシングポイント値（Ｃｐ）であり、Ｘ、Ｙ、Ｚ、ＷおよびＱは、線形回帰によって決定される係数であるが、Ｘ＋Ｙ＋Ｚ＋Ｗ＋Ｑ＝０であるという制約がある、請求項１〜１０のいずれかに記載の方法。
19. 前記Ｑ−ＰＣＲの方法がＵｎｉＲＴである、請求項１〜１８のいずれかに記載の方法。

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