JP5959248B2 - 細胞間相互作用を検出する方法 - Google Patents
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Description
本発明は、細胞間相互作用を検出する方法に関する。
細胞同士が相互作用する場合、細胞表面に存在する表面抗原を介して行う場合がある。表面抗原を検出する従来の方法として、フローサイトメトリによる方法および免疫組織化学による方法が存在する。これらの方法では、表面抗原に対する特異的な抗体に対して直接的または間接的に色素標識を施したものを用いて表面抗原を検出する。
フローサイトメトリによる方法では、特定の表面抗原を蛍光標識した細胞の懸濁液をサンプルとして用いる。フローセルを通過する細胞に励起光を照射し、個々の細胞の側方散乱および蛍光を検出してヒストグラムを作成し、細胞集団中の特定の性状を有するものの割合を予測する。この方法は、大量且つ高速にサンプル処理することが可能であるものの、表面抗原同士の相互作用による細胞活性および細胞内局在の検出には適さない。
免疫組織化学による方法では、ホルマリン等で固定した培養細胞および組織等を対象とする。表面抗原の細胞または組織における局在を観察する方法としては有効であるものの、表面抗原の密度および活性を検出することは出来ない。また、しばしば、固定操作によるペプチド架橋による抗原のマスキング、表面抗原の破壊および局在変化等が問題となる。
非特許文献１には、細胞間の相互作用を、特定の色素から放射される光として検出する方法が開示されている。この方法では、カルシウムイオン応答性の色素を用いる。細胞間相互作用によって、細胞内へカルシウムイオンが流入し、これに起因して色素が活性化され、光を放射することが可能となる。
Journal of Cell Science, 2001, Vol.114, 1156-1167
本発明の目的は、優れた細胞間相互作用を検出する方法を提供することにある。
本発明に係る細胞間相互作用を検出する方法は、細胞表面に存在する第１タンパク質と、前記第１タンパク質の活性化に起因して活性化される、細胞内に存在する転写因子と、前記活性化された転写因子が結合する転写因子結合配列およびその下流に位置し前記転写因子の結合に起因して発現誘導される第１発光タンパク質の遺伝子を含む核酸とを含む第１細胞を、前記第１タンパク質と相互作用可能であり、細胞表面に存在する第２タンパク質を含む第２細胞に接触させること、および前記第１タンパク質と前記第２タンパク質との相互作用に起因して発現誘導された第１発光タンパク質によって触媒される発光反応において放射される第１光を検出することを含む。
本発明によれば、優れた細胞間相互作用を検出する方法が提供される。
以下、図面を参照して、本発明の実施形態について詳細に説明する。
図１は、本発明に係る細胞間相互作用を検出する方法を概略的に示す図である。
図１（ａ）に示されるように、本発明に係る細胞間相互作用を検出する方法は、第１細胞１と第２細胞４とを接触させることを含む。図１（ａ）には、一例として、シャーレ１０中に存在する複数の第２細胞４ａおよび４ｂに対して、複数の第１細胞１が添加される様子が示されている。第１細胞１は、第１細胞本体２とその表面に存在する第１タンパク質３とから成る。第２細胞としては、第２細胞本体５およびその表面に存在する第２タンパク質６から成る第２細胞４ａと、第２細胞本体５のみから成る第２細胞４ｂとの２種が存在する。
図１（ｂ）に示されるように、本発明に係る細胞間相互作用を検出する方法は、第１細胞１から放射される第１光を検出することを含む。図１（ｂ）では、一例として、第２細胞４ａと接触した第１細胞１ａにおいて、第１細胞本体２から第１光が放射されている様子が示されている。一方、第２細胞４ａと接触できなかった第１細胞１ｂは、第１光を放射していない。
第１細胞は、細胞表面に存在する第１タンパク質と、細胞内に存在する転写因子と、転写因子が結合する転写因子結合配列およびその下流に位置する第１発光タンパク質の遺伝子を含む核酸とを含む。第１細胞は、任意の生細胞であってよく、例えば動物細胞であってよい。第１細胞は、浮遊性の細胞または接着性の細胞であってよい。第１細胞は、第２細胞と相互作用することが既知のものでよく、または未知のものでもよい。
第１細胞の具体的な例は白血球である。白血球の例は、Ｂ細胞、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、マクロファージおよび樹状細胞である。また、第１細胞の別の例は、腫瘍細胞である。
第１タンパク質は、例えば膜タンパク質である。第１タンパク質は、第１細胞において本来発現しているタンパク質であってよく、または第１細胞において強制的に発現されるタンパク質であってよい。
第１タンパク質は、第２タンパク質との相互作用によって活性化される。ここにおける「活性化」とは、エネルギー状態が変化すること、構造が変化すること等を含む。活性化された第１タンパク質は、その下流の細胞内シグナル伝達を介して、転写因子を活性化する。
第１タンパク質の例は、相互作用することが既知である２種の膜タンパク質のうちの一方である。そのような２種の膜タンパク質は、特に、それぞれ異なる細胞の表面に存在した状態で相互作用できる。そのような２種の膜タンパク質の具体的な例は、ＣＤ４０およびＣＤ４０リガンド（ＣＤ１５４）、ＭＨＣおよびＴＣＲ／ＣＤ３複合体、ＣＤ８０およびＣＤ２８、ＬＦＡ−３（ＣＤ５８）およびＬＦＡ−２（ＣＤ２）、並びにＩＣＡＭ−１（ＣＤ５４）およびＬＦＡ−１（ＣＤ１１ａ／ＣＤ１８）である。また、第１タンパク質のその他の具体的な例は、ＣＤ−４、ＶＬＡ−４、ＣＤ４５およびＣＤ４３である。
転写因子は、第１タンパク質の活性化に起因して活性化され、その後、転写因子結合配列に結合する。転写因子は、例えば活性化すると核内移行するものであってよく、または常に核内に存在するものであってよい。転写因子は、第１細胞内において本来発現しているタンパク質であってよく、または第１細胞内に強制的に発現されるものであってよい。転写因子は、第１タンパク質に応じて選択することができる。転写因子の具体的な例は、ＮＦ−κＢ、ＡＰ−１（Ａｃｔｉｖａｔｏｒ ｐｒｏｔｅｉｎ−１）、ＳＴＡＴ（ｓｉｇｎａｌ ｔｒａｎｓｄｕｃｅｒｓ ａｎｄ ａｃｔｉｖａｔｏｒｓ ｏｆ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ）１、３、４、５、６等、ＮＦＡＴ（ｎｕｃｌｅａｒ ｆａｃｔｏｒ ｏｆ ａｃｔｉｖａｔｅｄ Ｔ ｃｅｌｌ）、ＩＲＦ（ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ ｆａｃｔｏｒ）、ｃ−Ｍａｆ、ｃ−ｆｏｓｍおよびＪｕｎである。
転写因子結合配列は、その下流に位置する発光タンパク質の遺伝子の発現を制御する。特に、活性化した転写因子が転写因子結合配列に結合した場合、下流の遺伝子の発現が誘導される。転写因子結合配列は、例えばプロモータまたはエンハンサーである。転写因子結合配列は、転写因子に応じて選択される。転写因子としてＮＦ−κＢを使用する場合、転写因子結合配列は、配列番号１に示される塩基配列である。
転写因子結合配列の下流に位置する遺伝子から発現される発光タンパク質は、発光が生じる化学反応を触媒する酵素である。発光タンパク質の例は、ルシフェラーゼである。ルシフェラーゼの基質となる物質の例は、ルシフェリンである。ＡＴＰの存在下、ルシフェラーゼの触媒作用により、ルシフェリンが化学変化を起こす際に発光する。ルシフェラーゼは、ホタルに由来するものであってよく、またはバクテリアに由来するものであってよい。ルシフェラーゼの具体的な例は、配列番号２に示されるアミノ酸配列を有するものである。
転写因子結合配列および第１発光タンパク質の遺伝子は、第１細胞に含まれる核酸に含まれる。転写因子結合配列と第１発光タンパク質の遺伝子とは、転写因子結合配列に転写因子が結合した際にこの遺伝子の発現誘導が生じるように、この核酸上に配置されている。この核酸は、第１細胞が本来有するゲノム内に組み込まれている。あるいは、この核酸は、第１細胞が保持するベクター内に組み込まれている。この核酸は、既知の方法に基づいて作製し、既知の方法に基づいて第１細胞に導入することができる。
第２細胞は、細胞表面に存在する第２タンパク質を含む。第２細胞は、任意の細胞であってよく、例えば動物の細胞であってよい。第２細胞は、浮遊性の細胞または接着性の細胞であってよい。第１細胞として浮遊性の細胞を使用する場合、第２細胞は接着性の細胞を使用することが好ましい。
第２細胞の具体的な例は、白血球である。白血球の例は、Ｂ細胞、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、マクロファージ、樹状細胞である。また、第２細胞の別の例は、腫瘍細胞である。
第２タンパク質は、例えば膜タンパク質である。第２タンパク質は、第２細胞において本来発現しているタンパク質であってよく、または第２細胞において強制的に発現されるタンパク質であってよい。第２タンパク質は、第１タンパク質と相互作用し、第１タンパク質を活性化する。
第２タンパク質は、例えば、第１タンパク質と相互作用することが既知のものである。第２タンパク質の具体的な例は、上述したような相互作用することが既知である２種の膜タンパク質の一方である。この場合、２種の膜タンパク質のうち、一方を第１タンパク質として使用し、他方を第２タンパク質として使用できる。また、第２タンパク質のその他の具体的な例は、ＣＤ−４、ＶＬＡ−４、ＣＤ４５およびＣＤ４３である。
第１細胞と第２細胞との接触は、既知の方法に基づいて行うことができる。例えば、それぞれの細胞を含む２つの培地を混合することにより、細胞同士の接触を促すことができる。第１細胞として浮遊性の細胞を使用し、第２細胞として接着性の細胞を使用する場合、例えば、底面に第２細胞が接着しているシャーレに対して、第１細胞を含む培養液を添加することで、細胞同士の接触を促すことができる。
第１光の検出は、既知の方法に基づいて行うことができる。例えば、第１細胞を含む培地に対して、第１発光タンパク質に対する基質を添加し、生じた第１光をフォトンカウンターまたは後述するような蛍光顕微鏡を用いて検出する。細胞同士の接触から第１光の検出までの時間といった各種条件は、適宜設定することができる。例えば、細胞同士の接触と第１光の検出との間に基質を添加することもできる。
図２に基づいて、細胞間の相互作用を検出する機構の一例を説明する。図２は、第１細胞内で生じる細胞内シグナル伝達の一例を示す図である。図２に示される第１細胞１は、第１タンパク質として細胞膜７にＣＤ４０を有し、転写因子として細胞内にＮＦ−κＢを含み、ＮＦ−κＢに対する転写因子結合配列とルシフェラーゼ遺伝子とを含む核酸を核８の内部に有している。また、第１細胞１の細胞内には、細胞内シグナル伝達に関与するＩＫＫ、ＩκＢキナーゼおよびＩκＢといったタンパク質が存在している。ＩＫＫへの刺激がない状態では、ＮＦ−ｋＢは細胞質でＩκＢと結合し、活性が抑制されている。一方、第２細胞４は、第２タンパク質として細胞膜７にＣＤ４０リガンド（ＣＤ１５４）が存在している。
第１細胞１と第２細胞４とが接近し、更にそれらの細胞表面にそれぞれ存在するＣＤ４０とＣＤ４０リガンドとが相互作用すると、ＣＤ４０が活性化する。ＣＤ４０の活性化に続き、細胞内に存在するＣＤ４０の下流の分子が順次活性化され、ＩＫＫの活性化により、ＩκＢがリン酸化を受けプロテアソームで分解されるとＮＦ−κＢが核内に移行し、転写因子結合配列に結合する。その結果、ルシフェラーゼ遺伝子の発現が誘導され、第１細胞１内にルシフェラーゼが作られる。ルシフェラーゼは、細胞内において基質であるルシフェリンの化学変化を触媒し、その際にルシフェリンから第１光が放射される。
本発明に係る方法によれば、従来の方法と比較して、優れた細胞間相互作用の検出を行うことができる。本発明に係る方法によれば、例えば、細胞間相互作用を正確に把握し、細胞の応答を正確に解析することができる。
例えば、非特許文献１に示される従来の方法では、細胞間の相互作用を、特定の色素から放射される光として検出する。したがって、この色素を細胞に導入する際に使用される界面活性剤といった化合物に起因する細胞毒性、およびこの色素自体の細胞毒性が細胞に悪影響を及ぼす可能性がある。また、この色素から光を放射させるために、紫外光といった励起光を細胞に照射する必要があり、この励起光の細胞毒性が細胞に悪影響を及ぼす可能性がある。また、放射する光が次第に低下する退色の問題を考慮する必要がある。また、細胞自体の自家蛍光が問題となる場合がある。さらに、この色素はカルシウムイオンに応答して光を放射する活性を獲得するため、自発的な細胞内カルシウム濃度変化がある細胞では適切に細胞間相互作用を検出できない可能性がある。
これに対し、本発明に係る方法では、第１発光タンパク質の遺伝子をトランスフェクション等によって細胞に導入することができ、界面活性剤等の細胞毒性の強い化合物の使用を避けることができる。また、本発明に係る方法では、ルシフェラーゼといった発光タンパク質による化学発光を利用するので、必ずしも励起光を使用する必要が無く、励起光による細胞毒性を回避することができる。また、化学発光を利用することにより、光が退色する問題を回避することができる。また、化学発光を利用することにより、細胞自体の自家蛍光の問題を回避することができる。さらに、第１発光タンパク質の発現にはカルシウムイオンが直接的に関与しないと考えられるため、カルシウムイオンの流入および流出が活発な細胞に対しても本発明に係る方法を適用することができる。
本発明に係る方法は、種々の研究に応用できる。また、本発明に係る方法は、抗腫瘍免疫反応の研究に応用できる。抗腫瘍免疫反応の中心は、キラーＴ細胞が担っている。キラーＴ細胞は表面にＣＤ４０を表出するが、ヘルパーＴ細胞上のＣＤ４０リガンド（ＣＤ１５４）のＣＤ４０への結合が、キラーＴ細胞を活性化し、抗腫瘍活性を増強させる。本発明に係る方法を応用することで、これらの細胞の相互作用の研究の進展が期待できる。さらに、免疫細胞治療への応用も期待できる。免疫細胞治療では、例えば、患者から取得した免疫細胞をインビトロにおいて抗腫瘍活性を増強させ、それを治療に用いる。ここにおいて、本発明に係る方法を、免疫細胞の抗腫瘍活性の評価に用いることができる。
本発明の別の実施形態では、第２細胞は、第１光とは異なる波長の第２光を放射する蛍光タンパク質またはそのような第２光を放射する発光反応を触媒する第２発光タンパク質を細胞内に更に含む。
蛍光タンパク質は、励起光を受けて第２光を放射するタンパク質である。蛍光タンパク質は、例えば緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）およびＤｓＲｅｄである。第２発光タンパク質は、第１発光タンパク質とは異なる発光タンパク質である。第２発光タンパク質は、例えばルシフェラーゼである。第１光の波長と第２光の波長とは、それらを検出する手段によって区別可能な程度に異なっている。蛍光タンパク質または第２発光タンパク質は、第２タンパク質と融合されたものであってもよい。
蛍光タンパク質または第２発光タンパク質の遺伝子を第２細胞に予め導入し、第１細胞と第２細胞との接触および／または第１光の検出の際に蛍光タンパク質または第２発光タンパク質を第２細胞中に発現させることができる。第２光の検出は、第１光の検出と同時に行うことができる。
この実施形態に係る方法によれば、第２光に基づいて第２細胞を確認することが可能となる。それにより、第１細胞と第２細胞との区別が容易となる。
本発明のまた別の実施形態では、光学顕微鏡を使用して、第１細胞と第２細胞との接触の観察および第１光の検出が行われる。
光学顕微鏡は、既知のものであってよい。光学顕微鏡は、第１光を検出するためのフィルタ等を適宜備える。蛍光タンパク質を発現する第２細胞を使用する場合には、光学顕微鏡は、励起光を照射するための光源、励起フィルタ、蛍光フィルタ等を備える。
光学顕微鏡を用いて、細胞同士の接触の様子および第１光の検出を目視することができる。あるいは、細胞同士の接触の様子および第１光の検出を、光学顕微鏡に備え付けた撮像のための装置を用いて撮像することができる。また、第１細胞と第２細胞とが接触している様子を明視野にて確認し、さらに第１細胞から放射される第１光を検出することができる。さらに、第２細胞に第２光を放出するための蛍光タンパク質または第２発光タンパク質を導入している場合には、第２光に基づいて第２細胞の位置を確認することができる。
このように、光学顕微鏡を用いることで、細胞単位で細胞間の相互作用を可視化することが可能となる。また、この実施形態によれば、接触した細胞同士に着目して観察することが可能となる。そのため、接触から第１光の放射までの時間的研究を行うことも可能となる。
本発明の更に別の実施形態によれば、上述のような光学顕微鏡によって得られる画像が経時的に取得される。
この実施形態では、光学顕微鏡は撮像のための装置を備えている。この装置は、光学顕微鏡によって観察される視野の画像を特定のタイミングで取得する。例えば、第１細胞と第２細胞との接触の開始時から、第１細胞から第１光が放射されるときまでの間、一定間隔で画像を取得する。得られた複数の画像から、動画を作製することもできる。
光学顕微鏡によって得られる画像を経時的に取得することにより、細胞の変化を捉えること、およびそのような変化を記録することが容易となる。例えば、形態が変化する細胞を使用する場合には、細胞間相互作用と形態変化との関係を調べることが可能となる。
＜実施例１＞
ＣＤ４０、ＮＦ−κＢおよびルシフェラーゼを強制発現させたマウスミエローマ細胞を第１細胞として用い、ＣＤ４０リガンドを発現する第２細胞との相互作用を可視化した。その詳細を以下に記す。
ＣＤ４０、ＮＦ−κＢおよびルシフェラーゼを強制発現させたマウスミエローマ細胞を第１細胞として用い、ＣＤ４０リガンドを発現する第２細胞との相互作用を可視化した。その詳細を以下に記す。
［１．第１細胞の作製］
系統細胞Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８．６５３細胞（マウスミエローマ細胞、抗体非産生）に対し、ヒトＣＤ４０遺伝子およびネオマイシン耐性遺伝子の配列を含むベクターと、ＴｒａｎｓＬｕｃｅｎｔ ＮＦｋＢ（１） Ｒｅｐｏｒｔｅｒ Ｖｅｃｔｏｒ （Ｐａｎｏｍｉｃｓ）の配列のルシフェラーゼ部分にｐＥｌｕｃ−ｔｅｓｔ（東洋紡）のＥｍｅｒａｌｄ Ｌｕｃ（以下Ｅｌｕｃ）配列部分（配列番号２）を挿入して得られたベクターとを同時に導入した。
系統細胞Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８．６５３細胞（マウスミエローマ細胞、抗体非産生）に対し、ヒトＣＤ４０遺伝子およびネオマイシン耐性遺伝子の配列を含むベクターと、ＴｒａｎｓＬｕｃｅｎｔ ＮＦｋＢ（１） Ｒｅｐｏｒｔｅｒ Ｖｅｃｔｏｒ （Ｐａｎｏｍｉｃｓ）の配列のルシフェラーゼ部分にｐＥｌｕｃ−ｔｅｓｔ（東洋紡）のＥｍｅｒａｌｄ Ｌｕｃ（以下Ｅｌｕｃ）配列部分（配列番号２）を挿入して得られたベクターとを同時に導入した。
その後、Ｇ４１８を用いて、遺伝子導入された細胞を選択的に培養し、細胞クローンを樹立した。
実験に用いる細胞クローンの選択の指標として、ヒトＣＤ４０の発現を免疫組織化学で確認した。さらに、ＮＦ−κＢプロモータ配列およびＥＬｕｃ遺伝子の導入効率を、水溶性リガンド刺激による発光量の増大に基づいて確認した。
［２．第２細胞の作製］
ヒトＣＤ４０リガンド（ＣＤ１５４）とＧＦＰとの融合タンパク質の遺伝子を含むベクターをＣＨＯ細胞に導入した。
ヒトＣＤ４０リガンド（ＣＤ１５４）とＧＦＰとの融合タンパク質の遺伝子を含むベクターをＣＨＯ細胞に導入した。
その細胞を、観察のために、１〜２ｘ１０５／ｍｌｘ０．５ｍｌの細胞密度となるようにガラスボトムディッシュに播種し、単層培養した。
［３．細胞間相互作用の検出］
第２細胞を培養したガラスボトムディッシュを、発光イメージングシステムＬＶ２００（オリンパス株式会社製）にセットした。明視野にて細胞の形態および位置を確認した。ＧＦＰによる光およびルシフェラーゼによる光を検出するための条件を設定した。ガラスボトムディッシュに含まれる第２細胞の単層に対して、第１細胞を含む培養液を重層し、さらに発光基質Ｄ−ｌｕｃｉｆｅｒｉｎを１００ｕＭ程度の濃度で添加した。
第２細胞を培養したガラスボトムディッシュを、発光イメージングシステムＬＶ２００（オリンパス株式会社製）にセットした。明視野にて細胞の形態および位置を確認した。ＧＦＰによる光およびルシフェラーゼによる光を検出するための条件を設定した。ガラスボトムディッシュに含まれる第２細胞の単層に対して、第１細胞を含む培養液を重層し、さらに発光基質Ｄ−ｌｕｃｉｆｅｒｉｎを１００ｕＭ程度の濃度で添加した。
その後、以下に示す順序で、１５分間隔で撮影した。
１．明視野（擬似カラー：グレイ）
２．蛍光（ＧＦＰ）（擬似カラー：緑）（励起フィルタ ＢＰ４７０−４９０、蛍光フィルタ ５１０ＡＦ２３）
３．発光（擬似カラー：赤）
１．明視野（擬似カラー：グレイ）
２．蛍光（ＧＦＰ）（擬似カラー：緑）（励起フィルタ ＢＰ４７０−４９０、蛍光フィルタ ５１０ＡＦ２３）
３．発光（擬似カラー：赤）
このようにしてカラーで撮影された画像をモノクロの写真として図３に示す。取得された順に、画像が（ａ）、（ｂ）および（ｃ）に示される。矢頭で示される細胞は第２細胞であり、矢印で示される細胞は第１細胞である。第２細胞は、緑色の光を放射している様子が観察された。
図３から、第１細胞が第２細胞に対して接近し（図３ａ）、第１細胞と第２細胞とが接触した後（図３ｂ）、第１細胞が黄色の光を放出する様子が観察される（図３ｃ）。
さらに、図４に、第１細胞から放出された光の発光量を経時的に測定した結果を示す（図中「ＣＨＯｇｆｐＣＤ１５４」として示されるグラフ）。比較として、第１細胞を、ＣＤ４０リガンド（ＣＤ１５４）を発現していない第２細胞と接触させた場合に検出される発光量を示す（図中「ＣＨＯ」として示されるグラフ）。また、ＣＨＯと接触した場合に得られる発光量に対する、ＣＨＯｇｆｐＣＤ１５４と接触した場合に得られる発光量の相対値を示す（「ｒｅｌａｔｉｖｅ ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ」として示されるグラフ）。
図４から、第１細胞の発光量は、ＣＤ４０リガンド（ＣＤ１５４）を発現する第２細胞との接触から一定時間経過した後に増大し、さらに一定時間経過した後に低下することがわかる。また、第１細胞の発光量は、ＣＤ４０リガンド（ＣＤ１５４）を発現しない第２細胞と比較して、ＣＤ４０リガンド（ＣＤ１５４）を発現する細胞と接触させた場合に高くなることがわかる。
＜実施例２＞
第１細胞として、Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８．６５３の代わりに、ＰＣ１２（ラット副腎髄質腫瘍（褐色細胞腫）クローン）を使用して、実施例１と同様の実験を行った。
第１細胞として、Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８．６５３の代わりに、ＰＣ１２（ラット副腎髄質腫瘍（褐色細胞腫）クローン）を使用して、実施例１と同様の実験を行った。
その結果、ＰＣ１２を使用した場合でも、第２細胞との接触により、第１細胞からの発光量が増大することが確認された。
なお、Ｋｒｏｎｏｓ（ＡＴＴＯ）を用いて培養ディッシュ全体の発光量を計測した結果、ＰＣ１２を使用した場合、細胞同士の接触から発光量の増大の開始までの時間が約３時間であったのに対し、Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８．６５３を使用した場合、その時間は約４０分であった。
１、１ａおよび１ｂ…第１細胞、２…第１細胞本体、３…第１タンパク質、４、４ａおよび４ｂ…第２細胞、５…第２細胞本体、６…第２タンパク質、７…細胞膜、８…核、１０…シャーレ。
Claims (3)
- 細胞表面に存在する第１タンパク質と、前記第１タンパク質の活性化に起因して活性化される、細胞内に存在する転写因子と、前記活性化された転写因子が結合する転写因子結合配列およびその下流に位置し前記転写因子の結合に起因して発現誘導される第１発光タンパク質の遺伝子を含む核酸とを含む複数の第１細胞を、前記第１タンパク質と相互作用可能であり、細胞表面に存在する第２タンパク質を含む複数の第２細胞に接触させること、
前記第１タンパク質と前記第２タンパク質との相互作用に起因して発現誘導された第１発光タンパク質によって触媒される発光反応において放射される第１光を検出すること、および
光学顕微鏡を使用して、前記第１細胞と前記第２細胞との接触および／または前記第１光の放射を観察することと、前記光学顕微鏡によって得られる画像を経時的に取得することを含む、細胞間相互作用を検出する方法であって、
前記第２細胞は、前記第１光とは異なる波長の第２光を放射する蛍光タンパク質または前記第２光を放射する発光反応を触媒する第２発光タンパク質を細胞内に更に含む、上記方法。 - 前記第２細胞は接着性の細胞であり、浮遊性の第１細胞と混合することで細胞同士の接触を行う請求項１に記載の方法。
- 前記第２細胞は、前記第１光とは異なる波長の第２光を放射する蛍光タンパク質を細胞内に含む請求項１記載の方法。
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