JP5958948B1

JP5958948B1 - ｐ２１活性化キナーゼ阻害剤

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Publication number: JP5958948B1
Application number: JP2015561819A
Authority: JP
Inventors: 真吉多和田; ガオクェンビンウェン; 望平良
Original assignee: BIOSYSTEM CONSULTING LIMITED COMPANY
Current assignee: BIOSYSTEM CONSULTING LIMITED COMPANY
Priority date: 2014-12-26
Filing date: 2014-12-26
Publication date: 2016-08-02
Anticipated expiration: 2034-12-26
Also published as: JPWO2016103450A1; US20170349548A1; WO2016103450A1

Abstract

本発明は、ｐ２１活性化キナーゼに対し優れた阻害作用を有する阻害剤を提供することを課題とする。当該課題を解決した本発明は、デヒドロカワイン化合物及びその誘導体、ミモシン及びその誘導体並びにククルビタシン化合物よりなる群から選ばれた１種又は２種以上の化合物を有効成分として含有することを特徴とするｐ２１活性化キナーゼ１阻害剤である。

Description

本発明は、ｐ２１活性化キナーゼ１阻害剤に関し、更に詳細には、熱帯・亜熱帯植物に含まれるデヒドロカワイン化合物、ミモシン、ククルビタシン化合物又はその誘導体を有効成分とし、腫瘍の形成などに関与するｐ２１活性化キナーゼ１に対して優れた阻害作用を有するｐ２１活性化キナーゼ阻害剤に関する。

ｐ２１活性化プロテインキナーゼ（ＰＡＫｓ）ファミリーは、ＲＡＣ／ＣＤＣ４２依存性セリン/スレオニンキナーゼに属し、哺乳動物では６種（ＰＡＫ１〜６）に分類される。これらの中で、ＰＡＫ２およびＰＡＫ４は胚の発達において不可欠であるが、ＰＡＫ１は、胚形成のために必須ではなく、ＰＡＫ１欠損マウスは健康に生育し、線虫のＰＡＫ１欠損変異体は、野生型よりも寿命が長い（非特許文献１、２）。

一方、ＰＡＫ１は、固形腫瘍の増殖やその転移、固形腫瘍の成長に必要な血管形成に必須であることが知られている。ＰＡＫ１の過剰活性化や過剰発現は、癌や２型糖尿病、高血圧、アルツハイマーなどの疾患を引き起こす（非特許文献１、２）。ＰＡＫ１は、正常細胞の増殖に必須ではないので、従来の抗癌剤とは異なり、ＰＡＫ１を阻害しても副作用を引き起こさない。したがって、選択的な低分子化合物のＰＡＫ１阻害剤は、種々のＰＡＫ１依存性疾患及び障害の治療に有用である。これまで最も強力なＰＡＫ１特異的阻害剤としてＦＲＡＸ４８６とＦＲＡＸ５９６が知られているが、これらは細胞透過性や水溶性・生物学的利用能が低いという問題があった（非特許文献３）。

沖縄の人々はアジアの中で最も長い健康寿命を享受してきた。亜熱帯〜熱帯地域に分布し、沖縄で広く分布しているギンネム、ゲットウ、ゴーヤ等の植物は、種々の生理活性を有することが明らかにされており、沖縄の人々の健康に寄与してきたことが考えられる。しかし、これらの植物が、ＰＡＫ１阻害活性を有することについてはこれまで知られていなかった。

Dummler B, Ohshiro K, Kumar R, Field J. Pak protein kinases and their role in cancer. Cancer Metastasis Rev. 2009; 28:51-63. Maruta H. Herbal therapeutics that block the oncogenic kinase PAK1: A practical approach towards PAK1-dependent diseases and longevity. Phytother. Res. 2014; 28:656-672. Dolan BM, Duron SG, Campbell DA, Vollrath B, Rao BSS, Ko HY, Lin GG, Govindarajan A, Choi SY, Tonegawa S. Rescue of fragile X syndrome phenotypes in Fmr1 KO mice by the small-molecule PAK inhibitor FRAX486. PNAS. 2013; 110:5671-5676.

本発明の課題は、ｐ２１活性化キナーゼ１（ＰＡＫ１）に対し優れた阻害活性を有する阻害剤を提供することである。

本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を行った結果、ゲットウやギンネム（ギンゴウカン）、ゴーヤなどの熱帯・亜熱帯植物中に含まれる特定の化合物及びその誘導体は、ＰＡＫ１に対し優れた阻害活性を示すことを見出し、本発明を完成するに至った。

すなわち本発明は、デヒドロカワイン化合物及びその誘導体、ミモシン及びその誘導体並びにククルビタシン化合物よりなる群から選ばれた１種又は２種以上の化合物を有効成分として含有することを特徴とするｐ２１活性化キナーゼ１阻害剤である。

本発明の阻害剤は、ｐ２１活性化キナーゼ１（ＰＡＫ１）に対し優れた阻害活性を示すとともに水溶性で生物学的利用能が高い。したがって、ＰＡＫ１が関連する癌や２型糖尿病、高血圧、アルツハイマー、認知症等の疾患に対し優れた治療・予防効果を有する。またＰＡＫ１は、固形腫瘍の増殖やその転移、血管形成等に関与するため、抗腫瘍剤として優れた効果を示す。さらにＰＡＫ１は正常細胞に必須ではなく、これを阻害しても副作用が生じ難いため、本発明の阻害剤は安全性の高いものである。

ミモシンテトラペプチドの反応スキームを示す図である。

本発明では、デヒドロカワイン化合物及びその誘導体、ミモシン及びその誘導体並びにククルビタシン化合物よりなる群から選ばれた１種又は２種以上の化合物を有効成分として用いる。

（デヒドロカワイン化合物及びその誘導体）
デヒドロカワイン化合物としては、下記式（１）で表される化合物が例示される。

式中、Ｒ^１は水酸基又はメトキシ基を示し、Ｒ^２は水酸基、メトキシ基又は水素原子を示す。また点線は結合の存在又は不存在を示す。

本発明で用いられる式（１）の化合物として、下記式（１ａ）で表される５，６−デヒドロカワイン（以下、「ＤＫ」と略称することがある）、下記式（１ｂ）で表されるジヒドロ−５，６−デヒドロカワイン（以下、「ＤＤＫ」と略称することがある）が挙げられる。

またデヒドロカワイン化合物の誘導体として、５，６−デヒドロカワインの代謝物であるヒスピジン（6-(3,4-dihydroxystyryl)-4-methoxy-2H-pyran-2-one；（１ｃ））及びその誘導体Ｈ１（6-(3,4-dimethoxystyryl)-4-methoxy-2H-pyran-2-one；（１ｄ））、Ｈ２（6-(3,4-dimethoxyphenethyl)-4-methoxy-2H-pyran-2-one；（１ｅ））、Ｈ３（6-(3,4-dihydroxyphenethyl)-4-methoxy-2H-pyran-2-one；（１ｆ））を例示することができる。

これらのデヒドロカワイン化合物又はその誘導体の中でも、ヒスピジン及びその誘導体Ｈ１〜Ｈ３は、ＰＡＫ１阻害活性が特に優れるため好適に用いられる。

上記ＤＫ、ＤＤＫは、例えば、以下の方法によりゲットウ抽出物から単離精製することができる。

ゲットウ（月桃；Alpinia zerumbet）は、ショウガ科ハナミョウガ属（アルピニア属）の多年草で、熱帯から亜熱帯アジアに分布し、日本では沖縄県から九州南部に分布する。ゲットウは、その６つの組織（根茎、茎、葉、花、果皮、種子）のいずれの組織を使用しても良いが、根茎を抽出原料とすることが好ましい。この抽出原料は、好ましくは、風乾した後、適切な大きさに細断ないし粉砕し、次の抽出工程において使用する。

抽出工程では、上記のように準備した抽出原料に対し、その５〜１００質量倍の抽出溶媒を加えた後、２０分ないし２４時間程度抽出を行う。抽出に用いる抽出溶媒としては、水や、エタノール等の低級アルコール、アセトン、酢酸エチル等の溶媒、あるいはこれらの混液等の溶媒（以下、「水性溶媒」ということがある）が好ましい。上記水性溶媒のうち、混液としては、例えば、１０〜９６％程度の、任意の割合のエタノール−水混液のような混合溶媒であっても良い。抽出温度は、５０〜１００℃程度が好ましく、抽出中、必要により連続あるいは間欠的に攪拌すればよい。このようにして得られたゲットウ抽出物からカラムクロマトグラフィーを用いた勾配溶離等によりＤＫおよびＤＤＫを単離精製することができる。ＤＫ及びＤＤＫは有機合成によって製造することもできる。

一方、ヒスピジンは、例えば、ＤＫからウサギ肝臓のミクロソームの酵素CYP2C9によって変換することによって得られる。また、ヒスピジン誘導体Ｈ１は、例えば、ヒスピジンをジアゾメタンなど公知のアルキル化剤を作用させることによって得ることができる。Ｈ２は、パラジウム炭素などの触媒を用いた水素化還元反応などによってＨ１から製造される。Ｈ３も同様に水素化還元反応によりヒスピジンから得ることができる。これらの反応スキームを下記に示す。

（ミモシン及びその誘導体）
ミモシン（β−［Ｎ−（３−ヒドロキシ−４−ピリドン）］−α−アミノプロピオン酸）は、ピリジン環の窒素原子に結合したアラニン側鎖を有する非タンパク質アミノ酸である（下記式（２ａ））。ミモシン誘導体としては、下記式（２ｂ）で表されるミモシノール、下記式（２）で表されるミモシンテトラペプチドが例示される。

上記式（２）のミモシン誘導体は、ミモシンにトリペプチドが結合したテトラペプチドである。

上記式（２）中、Ｘ^１〜Ｘ^３は、アミノ酸残基であれば特に制限なく、例えば、アラニン（Ａｌａ；Ａ）、アルギニン（Ａｒｇ；Ｒ）、アスパラギン（Ａｓｎ；Ｎ）、アスパラギン酸（Ａｓｐ；Ｄ）システイン（Ｃｙｓ；Ｃ）、グルタミン（Ｇｌｎ；Ｑ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ；Ｅ）、グリシン（Ｇｌｙ；Ｇ）、ヒスチジン（Ｈｉｓ；Ｈ）、イソロイシン（Ｉｌｅ；Ｉ）、ロイシン（Ｌｅｕ；Ｌ）、リシン（Ｌｙｓ；Ｋ）、メチオニン（Ｍｅｔ；Ｍ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ；Ｆ）、プロリン（Ｐｒｏ；Ｐ）、セリン（Ｓｅｒ；Ｓ）、トレオニン（Ｔｈｒ；Ｔ）、トリプトファン（Ｔｒｐ；Ｗ）、チロシン（Ｔｙｒ；Ｙ）、バリン（Ｖａｌ；Ｖ）などが例示され、これらは互いに独立して、同一であっても異なっていてもよい。これらのうち、チロシン（Ｔｙｒ；Ｙ）、トリプトファン（Ｔｒｐ；Ｗ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ；Ｆ）がＰＡＫ１阻害活性に優れたものとなるため好ましい。

基Ｘ^１〜Ｘ^３を構成するアミノ酸に光学異性体が存在する場合は、Ｄ体であってもＬ体であってもよいが、Ｌ体であることが好ましい。Ｘ^３はＮ末端側でミモシンとアミド結合している。

これらの中でも、基Ｘ^３−Ｘ^２−Ｘ^１が、Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ｔｙｒ（ＦＦＹ）、Ｐｈｅ−Ｔｙｒ−Ｔｙｒ（ＦＹＹ）及びＰｈｅ−Ｔｒｐ−Ｔｙｒ（ＦＷＹ）よりなる群から選ばれるトリペプチド残基は、ＰＡＫ１阻害活性に優れるため好適である。基Ｘ^３−Ｘ^２−Ｘ^１が、Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ｔｙｒ（ＦＦＹ）、Ｐｈｅ−Ｔｙｒ−Ｔｙｒ（ＦＹＹ）、Ｐｈｅ−Ｔｒｐ−Ｔｙｒ（ＦＷＹ）であるミモシンテトラペプチドは、下記式で表される（２ｃ；ＭＦＦＹ、２ｄ；ＭＦＹＹ、２ｅ；ＭＦＷＹ）。

また本発明に用いる好適なミモシン誘導体は下記式（２'）

で表すこともできる。

上記一般式（２）中、Ｒ^３〜Ｒ^５は、４−ヒドロキシベンジル基、３−インドリルメチル基及びベンジル基よりなる群から選ばれる基を示し、これらは互いに独立して、同一であっても異なっていてもよい。

これらの中でもＲ^３は４−ヒドロキシベンジル基が好ましい。また、Ｒ^４は、４−ヒドロキシベンジル基、３−インドリルメチル基及びベンジル基よりなる群から選ばれたものであることが好適である。Ｒ^５はベンジル基が好適である。

また上記式（２）中、Ｒ^３、Ｒ^４、Ｒ^５の結合する炭素が不斉炭素となる場合、ｘ、ｙ、ｚはそれぞれの絶対配置（ＳまたはＲ）を示す符号を表わす。本発明に用いるミモシン誘導体には、エナンチオマー、ジアステレオマーおよびラセミ体を含むこれらの混合物が包含されるが、ｘ、ｙ、ｚが全て（Ｓ）の立体配置であることが好ましい。

ミモシン、ミモシノール、上記式（２）または（２'）で示されるミモシンテトラペプチドは、例えば以下の方法によって製造することができる。

ミモシンはギンネムやミモザのような熱帯・亜熱帯植物に含まれる。このギンネムは、ネムノキ科ギンゴウカン属の常緑低木で、熱帯から亜熱帯アジアに分布し、日本では沖縄県から九州南部に分布する。

このギンネムの葉からミモシンを得るには、まず、ギンネムの葉、好ましくは新鮮な若葉を、好ましくは細切ないし細断して抽出原料とする。

次いで、上記のように準備した抽出原料に対し、適量の水を加熱し、得られた熱水で抽出する。この熱水抽出は、７０℃以上、好ましくは７５℃ないし沸騰状態の熱水で行うことができるが、ミモシン分解酵素を失活させ、純度の高いミモシンを得るためには、沸騰水（１００℃程度）の熱水を用いることが特に好ましい。また、抽出時間は、５ないし３０分程度であり、特に１０分間程度煮沸抽出を行うことが好ましい。抽出に用いる抽出溶媒としては、蒸留水が好ましく、また、抽出中、必要により連続あるいは間欠的に攪拌することが望ましい。

このギンネム葉抽出液中に、強陽イオン交換樹脂を加えて、ミモシンを含む被吸着成分を吸着させる。次いで、このイオン交換樹脂を、水や、水−エタノール混液で洗浄した後、アンモニア水中等に浸漬し、ミモシンをイオン交換樹脂から溶出させる。この溶出液を必要により活性炭処理した後、濃縮処理し、低温で放置することによりミモシン塩が析出してくるので、これを集めることでミモシンが得られる。得られたミモシンは必要に応じて再結晶等の手段により精製してもよい。

このようにして得られたミモシンに、例えば下記反応スキームのように、トリス（トリエチルシリル）シリルトリフレートを反応させて、ミモシントリス（トリエチルシリル）シリルエステル（スーパーシリルエステル）を得て、これを水素化ホウ素ナトリウム等を用いて還元することにより、ミモシノールを得ることができる。

またミモシンに、ペプチド固相合成法などの公知のペプチド合成法を用いてアミノ酸を結合させることによりミモシンテトラペプチドを得ることができる。

ミモシンおよびアミノ酸は、アミノ基を、９−フルオレニルメチルオキシカルボニル基（Ｆｍｏｃ）やｔ−ブチルオキシカルボニル基（Ｂｏｃ）などの保護基で保護することが好ましい。

ペプチド結合を形成するための縮合剤としては、例えば、ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣ）、Ｎ，Ｎ−ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）等が挙げられる。また、これらの縮合剤をＮ−ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）と混合して用いることもできる。

ペプチドまたはアミノ酸のアミノ末端アミノ基の保護基であるＢｏｃおよびＦｍｏｃは、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）、ピペリジンなどにより除去することができる。

また、ペプチド固相合成樹脂としては、Ｗａｎｇ樹脂などを用いることができる。ペプチドをペプチド固相合成樹脂より脱離させるにあたっては、例えば、ＴＦＡなどが用いられる。

本発明に用いるミモシン誘導体を製造するためのＦｍｏｃ固相合成法による反応スキームを図１に示す。このスキームにおいては、Ｎ−（９−フルオレニルメトキシカルボニルオキシ)コハク酸イミド（Ｆｍｏｃ−ＯＳｕ）のＦｍｏｃ基をミモシンに結合してＦｍｏｃ−ミモシンを調製し、これとＦｍｏｃ−アミノ酸を用いて形成させたトリペプチドを結合させることによって、ミモシンテトラペプチドを形成させている。以下、より具体的に説明する。

（Ｆｍｏｃ−ミモシンの調製）
ミモシンおよび炭酸ナトリウムをジオキサンを含有する蒸留水に溶解し、この溶液にＦｍｏｃ−ＯＳｕを添加し、室温で一晩インキュベートする。次いで、炭酸ナトリウム溶液を添加し、攪拌した後、この溶液をろ過し、次いで酢酸エチルで洗浄して、未反応のＦｍｏｃ−ＯＳｕ、副産物である９−フルオレニルメタノールおよび９−メチレンフルオレンを除去する。氷浴中で、塩酸を用いて水画分のｐＨを４程度にまで下げることによって、Ｆｍｏｃ−ミモシンの結晶が析出する。

（ミモシンテトラペプチドの固相合成）
Ｆｍｏｃ−アミノ酸（Ｆｍｏｃ−Ｘ_１−ＯＨ）のジメチルアセトアミド溶液に、１−ヒドロキシ−１Ｈ−ベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）およびＮ，Ｎ’−ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣ）を添加し、攪拌する。この溶液にＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）中で膨張させたＷａｎｇ樹脂を添加し、攪拌する（図１Ａ参照）。この樹脂をろ過し、ジクロロメタン、イソプロピルアルコールおよびメタノールで洗浄し、真空条件下で乾燥する。ＤＭＦ中にて２５％ピぺリジン（試薬ａ）によりＦｍｏｃの脱保護を行った後、次のアミノ酸（Ｆｍｏｃ−Ｘ_２−ＯＨ）を、試薬ｂ（Ｆｍｏｃアミノ酸、ＨＯＢt、ＨＢＴＵおよびＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ）の混合物）に結合させ、さらに攪拌する（図１Ｂ参照）。このジペプチドに、同様にして、Ｆｍｏｃアミノ酸（Ｆｍｏｃ−Ｘ_３−ＯＨ）を結合させてトリペプチドを形成する。さらに同様にして上記で調製したＦｍｏｃ−ミモシンを加えて結合させた後、９５％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ；試薬ｋ)で攪拌する（図１Ｃ参照）。この樹脂をろ過し、ＴＦＡで洗浄した後、得られたろ液から氷冷されたジエチルエーテルで沈殿を生じさせることによって、ミモシンテトラペプチドが得られる。

（ククルビタシン化合物）
ククルビタシン化合物としては、ククルビタシンＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉなどが含まれるが、このうち、下記式（３）で表されるククルビタシンＩがＰＡＫ１阻害活性に優れることから好適に用いられる。

ククルビタシン化合物は、ニガウリ（Momordica charantia）などのウリ科（Cucurbitaceae）に属する植物から、例えば、以下のようにして単離精製することができる。

ニガウリは、沖縄ではゴーヤと呼ばれ、従来から種子やわたを除いた果実部が食用に供されている。ゴーヤの各部位を、好ましくは、風乾した後、適切な大きさに細断ないし粉砕して抽出原料とする。この抽出原料に対し、１〜２０質量倍の抽出溶媒を加えた後、１〜２０時間程度抽出を行う。抽出に用いる抽出溶媒としては、上記水性溶媒が好適である。抽出温度は、５０〜１００℃程度が好ましい。このようにして得られたニガウリ抽出物からカラムクロマトグラフィー、分取薄層クロマトグラフィー等公知の分離精製方法を用いることにより、ククロビタシン化合物を単離することができる。また有機合成によって製造されたものを用いてもよい。

以上のようにして得られたデヒドロカワイン化合物及びその誘導体、ミモシン及びその誘導体並びにククルビタシン化合物は、そのまま、あるいは必要に応じ、高速液体クロマトグラフィーなど公知の方法によって精製した後、ｐ２１活性化キナーゼ１（ＰＡＫ１）阻害剤として利用することができる。

また上記のようにして調製されるゲットウ抽出物、ギンネム抽出物、ニガウリ抽出物にはデヒドロカワイン化合物、ミモシン等の活性成分が含まれていることから、本発明ではこれらの植物抽出物をｐ２１活性化キナーゼ１（ＰＡＫ１）阻害剤の有効成分として使用することもできる。

本発明のｐ２１活性化キナーゼ１（ＰＡＫ１）阻害剤の調製は、治療有効量の上記有効成分を、製薬上許容される任意成分、例えば、慣用の賦形剤、結合剤、滑沢剤、水性溶剤、油性溶剤、乳化剤、懸濁化剤、保存剤、安定剤等と組み合わせ、混合することにより行うことができる。

本発明のｐ２１活性化キナーゼ１（ＰＡＫ１）阻害剤は、経口でも非経口でも投与することができる。経口投与による場合は、通常の経口投与製剤、例えば、錠剤、散剤、顆粒剤、カプセル剤等の固形剤；水剤；油性懸濁剤；又はシロップ剤もしくはエリキシル剤等の液剤のいずれかの剤形としても用いることができる。非経口投与による場合には、水性又は油性懸濁注射剤、点鼻液として用いることができる。

本発明のｐ２１活性化キナーゼ１（ＰＡＫ１）阻害剤は、有効成分、投与方法、患者の年齢、体重、状態および疾患の種類によっても異なるが、通常、経口投与の場合、成人1日あたり通常約１０〜２００ｍｇ、好ましくは１０〜５０ｍｇ、より好ましくは、約１０〜２０ｍｇ程度であり、これを必要に応じて数回に分け投与すれば良い。また、非経口投与の場合は、成人１日あたり通常約１０〜５００ｍｇ、好ましくは１０〜２０ｍｇ、好ましくは、約５〜１０mgを投与すれば良い。

本発明のｐ２１活性化キナーゼ１（ＰＡＫ１）阻害剤は、ＰＡＫ１が関与する疾患又は症状を治療、予防又は改善することができる。このような疾患又は症状としては、例えば、癌、２型糖尿病、高血圧、アルツハイマー、認知症等が挙げられる。またＰＡＫ１は、固形腫瘍の増殖やその転移、血管形成等に関与するため、抗腫瘍剤として使用できる。

次に実施例等を挙げ、本発明を更に詳しく説明するが、本発明はこれら実施例等に何ら制約されるものではない。

製造例１
ＤＫおよびＤＤＫの調製：
琉球大学（沖縄県中頭郡西原町千原１）のキャンパスにてゲットウ（Alpinia zerumbet）を採取した。ゲットウ２ｋｇに水１０Ｌを加え、約２０分間煮沸した。抽出液を室温で冷却後、吸引濾過によって濾過した（アズワン社製、 Shaking Baths SB-20）。ろ液を４０℃、真空下で１Ｌまで濃縮し、ヘキサンで抽出した（３×５００ｍＬ）。有機層を真空下で蒸発乾固させた。乾燥後の粗抽出物を水中で煮沸した後濾過した。残渣をＨＬＰＣで分離精製し、ＤＫを得た。ろ液を４℃に冷却して結晶化させ、結晶をＨＰＬＣで分離精製してＤＤＫを得た。ＤＫとＤＤＫの精製において、移動相には、０．１％酢酸水溶液（溶媒Ａ）と０．１％酢酸メタノール溶液（溶媒Ｂ）を使用する勾配溶出を採用した。勾配溶出の条件は、１〜１０分の間は、溶媒Ａと溶媒Ｂの１：１混液を用いる定組成溶離、１０〜２０分の間は、溶媒Ｂが５０〜１００％に変化する直線勾配、２０〜３０分の間は、溶媒Ｂが１００％の定組成溶離、３０〜３５分の間は、溶媒Ｂが１００〜５０％に変化する直線勾配とした。流速は０．８ｍｌ／ｍｉｎ、吸光波長は２８０ｎｍとした。

製造例２
ヒスピジン誘導体（Ｈ１−３）の調製：
ヒスピジン３ｍｇを０．６ｍＬのメタノール：ＣＨ_２Ｃｌ_２（１：５）溶液に溶解した。この溶液を０℃に冷却し、ジアゾメタンＣＨ_２Ｃｌ_２溶液０．５ｍｌを加えた。混合物を４℃で一晩保存した。溶媒を留去し、残留物をＰＴＬＣで精製し、淡黄色粉末（２ｍｇ、６７％収率）を得た。化合物Ｈ１（３．５ｍｇ）はＭｅＯＨ：ＣＨＣｌ_３（１：１）溶液０．８２ｍＬに溶解し、Ｐｄ／Ｃ（０．６５ｍｇ）１０％存在下で２時間撹拌した。混合物を濾過し、溶媒を真空下で除去した。カラムクロマトグラフィーによる精製により、白色固体（３ｍｇ、８５％）として化合物Ｈ２を得た。同様の手順によりヒスピジンからＨ３を調製した。以下に得られたヒスピジン誘導体の^１Ｈスペクトルデータを示す。なお、^１Ｈスペクトルは、Ｄ_２ＯのＪＥＯＬＪＮＭ−ＥＣＡ４００（ＪＥＯＬ、日本)で記録した。また、ケミカルシフトは、ＴＭＳに関連づけられたｐｐｍ（δ）で表した。

（ヒスピジン誘導体Ｈ１）
^１ＨＮＭＲ（ＣＤＣｌ_３，４００ＭＨｚ）δ：
7.43(d,1H,CH),7.07(dd,1H,CH),7.00(d,1H,CH),6.85(d,1H,CH),6.43(d,1H,CH),5.89(d,1H,CH),5.46(d,1H,CH),3.91(s,3H,OCH₃),3.89(s,3H,OCH₃),3.81(s,3H,OCH₃).
（ヒスピジン誘導体Ｈ２）
^１ＨＮＭＲ（ＣＤＣｌ_３，４００ＭＨｚ）δ：
6.77(d,1H,CH),6.69(dd,1H,CH),6.66(d,1H,CH),5.69(d,1H,CH),5.40(d,1H,CH),3.84(s,3H,OCH₃),3.83(s,3H,OCH₃),3.76(s,3H,OCH₃),2.91(m,2H,CH2),2.71(m,2H,CH2).
（ヒスピジン誘導体Ｈ３）
^１ＨＮＭＲ（ＤＭＳＯ，４００ＭＨｚ）δ：
7.29(d,1H,CH),7.20(dd,1H,CH),6.76(d,1H,CH),6.11(d,1H,CH),5.26(d,1H,CH),3.34(m,2H,CH2),2.99(m,2H,CH2).

製造例３
ミモシンの調製：
琉球大学農学部周辺で採取したギンネムの葉１．５ｋｇを、５Ｌの水で１０分間煮沸した。抽出液を冷却後、吸引濾過によって濾過し（アズワン社製、 Shaking Baths SB-20）、ろ液にイオン交換樹脂（アンバーライトＩＲ１２０プラス（Ｈ））２ｋｇを添加した。この抽出液・樹脂混合物を３０分間撹拌した後一晩放置した。このイオン交換樹脂を蒸留水で５〜６回すすぎ、クロロフィルを取り除くために８０％のエタノール５Ｌを滴下した。この樹脂を２Ｎ水酸化アンモニウム６Ｌで溶出して粗ミモシンを得た。この溶出物を４０℃、減圧下で３００ｍＬまで濃縮し、ｐＨを６Ｎ塩酸で４．５〜５．０に調節し、冷凍庫に一晩置いて結晶化させた。得られた結晶を５ＮＮａＯＨを用いてｐＨ９．０とした後、これに６ＮＨＣｌを加えてｐＨ４．５〜５．０とすることで再結晶させ、さらに４℃で放置することで精製ミモシンを得た。ミモシンは−２０℃で保管した。

製造例４
ミモシノールの調製：
トリフルオロメチルスルホン酸(１８７μＬ、２ｍｍｏｌ)ＣＨ_２Ｃｌ_２溶液３.４ｍＬを、２５ｍＬ容の丸底フラスコに取り、これを室温で撹拌した。次いで、トリス（トリエチルシリル）シラン(６１８μＬ、２ｍｍｏｌ)溶液を滴加し、この混合物を溶液が透明になるまで３時間、室温で撹拌した。ミモシン(０.４ｇ、２ｍｍｏｌ)を、前記丸底フラスコ中に取り、次いでイミダゾール(０.１５ｇ、２.２ｍｍｏｌ)を含む、３.４ｍｌのＤＭＦ−ＣＨ_２Ｃｌ_２混液（１：１）を加えた。反応フラスコを０℃に冷却し、トリス（トリエチルシリル）シリルトリフレートを滴加した。滴下終了後、反応物を２時間室温下で撹拌し、ろ過した。ろ液から溶媒を留去することで、ミモシントリス（トリエチルシリル）シリルエステル（以下、「ミモシンエステル」ということがある）が得られた。

水素化ホウ素ナトリウム(ＮａＢＨ_４；０.２８ｇ、７.２ｍｍｏｌ)を含む５０％エタノール溶液３ｍLに、ミモシンエステルを含む５０％エタノール溶液３ｍＬを加えた。室温下、得られた混合物を５.５時間還流し、次いで溶媒のエタノールを減圧下留去した。得られた水溶液を、酢酸エチル(３×２０ｍＬ)で抽出し、抽出液を合せ、これを飽和塩化ナトリウム溶液で洗浄した後、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、濃縮して無色の結晶としてミモシノール３５２ｍｇ（収率９５％)を得た。以下に得られたミモシノールの^１Ｈスペクトルデータを示す。
（ミモシノール）
¹Ｈ−ＮＭＲ（Ｄ_２Ｏ,４００ＭＨｚ）δ：
7.93(s,1H,CH),7.28(s,1H,CH),3.02-2.86(d,2H,CH),2.08-1.91(s,2H,CH2),1.58-1.54(m,2H,CH2),1.22-1.11(m,1H,CH).

製造例５
ミモシン誘導体の調製（ＭＦＦＹ）：
Ｆｍｏｃ固相合成法により、ミモシン（Ｍ）にトリペプチドを結合してテトラペプチドの合成を行った。ハイペップ研究所から入手したＦｍｏｃ−アミノ酸を用いて、最初の結合は、チロシン（Ｙ）で行い、次にフェニルアラニン（Ｆ）を結合してジペプチドを形成し、さらに、フェニルアラニン（Ｆ）を結合してトリペプチドを形成した。形成されたジペプチドを別途調製したＦｍｏｃ−ミモシンと結合してミモシンテトラペプチドを得た。より具体的な製法を以下に示す。

（Ｆｍｏｃ−ミモシンの調製）
５ｇのミモシンおよび５．５ｇの炭酸ナトリウムを７５ｍＬのジオキサンを含有する蒸留水７５ｍＬに溶解した。この溶液に１２．５ｇのＮ−（９−フルオレニルメトキシカルボニルオキシ)コハク酸イミド（Ｆｍｏｃ−ＯＳｕ）を添加し、この混合液を室温で一晩インキュベートした。次に、３００ｍＬの炭酸ナトリウム溶液（０．１Ｍ）を添加し、さらにマグネチックスターラー（３００ｒｐｍ）で５時間、２５℃で攪拌した。得られた溶液（４５０ｍＬ）をろ過し、酢酸エチル（１５０ｍＬ）で洗浄して未反応のＦｍｏｃ−ＯＳｕ、副産物である９−フルオレニルメタノールおよび９−メチレンフルオレンを除去した。氷浴中で、６Ｎ塩酸を用いて水画分のｐＨを４に下げ、Ｆｍｏｃ−ミモシンを結晶として得た。これをろ過し、真空条件下で乾燥した（収量７．１０８ｇ）。

（ミモシンテトラペプチドの固相合成）
Ｆｍｏｃ−Ｌ−チロシン１．６ｍｍｏｌのジメチルアセトアミド溶液５ｍＬに、１−ヒドロキシ−１Ｈ−ベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）１．６ｍｍｏｌおよびＮ，Ｎ’−ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣ）１．６ｍｍｏｌを添加し、１０分間攪拌した。この溶液にＤＭＦ中で膨張させたＷａｎｇ樹脂１ｇを添加し、反応混合物を１７時間攪拌した（図１Ａ参照）。この樹脂をろ過し、ジクロロメタン、イソプロピルアルコールおよびメタノールで洗浄し、真空条件下で乾燥した。ＤＭＦ中にて３０分間、２５％ピぺリジン（試薬ａ）によりＦｍｏｃの脱保護を行った後、次のアミノ酸Ｆｍｏｃ−Ｌ−フェニルアラニンを、樹脂混合溶液（Ｆｍｏｃアミノ酸：ＨＯＢt：ＨＢＴＵ：Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ）＝４：３：３．６：８；試薬ｂ）に結合させた。この反応混合物をさらに１時間攪拌した（図１Ｂ参照）。

結合の完全性を調べるために、ニンヒドリン試験を行った。ＨＯＢｔ：酢酸：ＤＩＥＡ：ＤＭＦ（０．８：１９：９：４００）混合液を樹脂１ｇあたり２０ｍＬ用いて、未結合のＦｍｏｃ−Ｌ−トリプトファンをアセチル基で保護した。
次に上記と同様にして、テトラペプチドを形成するために、Ｆｍｏｃ−Ｌ−フェニルアラニンをジペプチドに結合した。さらに上記で調製したＦｍｏｃ−ミモシンを加え、同様にして結合させた後、この樹脂を、１時間、９５％のトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ；試薬ｋ)でゆっくり攪拌した（図１Ｃ参照）。この樹脂をろ過した後、ＴＦＡで洗浄し、得られたろ過液から、氷冷されたジエチルエーテルで沈殿を生じさせた。得られた沈殿をろ過し、ジエチルエーテルで３回洗浄した後、真空条件下で乾燥して目的のミモシンテトラペプチドを得た（Ｍ−ＦＦＹ）。得られた粗ペプチドは白色固体であり、収量は８０．２ｍｇであった。この粗ペプチドをさらに下記条件の液体クロマトグラフィーによって精製した。
ＬＣ−ＭＳ（ＥＳＩ−）ｍ/ｚ：６９３．２（［Ｍ−Ｈ］^＋）

（ＨＰＬＣ条件）
カラム：ＣａｄｅｎｚａＣＤ−Ｃ１８カラム（２０×１００ｍｍ；３μｍ）
移動相：０．１％トリフルオロ酢酸／ＣＨ_３ＣＮ（１．５／８．５）
流量：５ｍＬ／分

製造例６
ミモシン誘導体の調製（ＭＦＹＹ）：
２番目に結合させるＦｍｏｃアミノ酸としてＦｍｏｃ−Ｌ−チロシン（Ｙ）、３番目に結合させるＦｍｏｃアミノ酸としてＦｍｏｃ−Ｌ−フェニルアラニン（Ｆ）を用いた以外は製造例１と同様にしてミモチンテトラペプチド（Ｍ−ＦＹＹ）を得た（収量６５．７ｍｇ）。
ＬＣ−ＭＳ（ＥＳＩ−）ｍ/ｚ：６７０．１（［Ｍ−Ｈ］^＋）

製造例７
ミモシン誘導体の調製（ＭＦＷＹ）：
２番目に結合させるＦｍｏｃアミノ酸としてＦｍｏｃ−Ｌ−トリプトファン（Ｗ）、３番目に結合させるＦｍｏｃアミノ酸としてＦｍｏｃ−Ｌ−フェニルアラニン（Ｆ）を用いた以外は製造例１と同様にしてミモチンテトラペプチド（Ｍ−ＦＷＹ）を得た（収量７１．５ｍｇ）。
ＬＣ−ＭＳ（ＥＳＩ−）ｍ/ｚ：６５４．２（［Ｍ−Ｈ］^＋）

実施例１
デヒドロカワイン化合物、ミモシン又はそれらの誘導体、ククルビタシンＩのＰＡＫ阻害活性を測定した。ＰＡＫ１阻害活性は、ADP-GloTM kinase assay kit (V4479,Promega, Madison, WI)を用いて行った。反応濃度２５ｎｇのヒトＰＡＫ１（１０μＬ）を各濃度の試験化合物５μＬと１０分間インキュベートした。反応開始にあたって、2.5 X ATP/substrate mix （１０μＬ）を添加し、４０分間インキュベートした。反応は、ADP-Glo reagent ２５μＬを添加して停止させた。さらにKinase detection reagent５０μＬを加え、ＡＤＰからＡＴＰへの変換と新たに合成されたＡＴＰによる発光反応をおこなった。３０分間のインキュベーション後、各ウェルの発光量をマイクロプレートリーダー（MTP-880Lab、Corona）によって、０．５秒の積分時間で測定した。ブランクウェルには、試験化合物と酵素以外の全ての成分を添加した。すべての手順は室温下で行った。阻害率は阻害剤を添加しなかった対照のキナーゼ活性に対する値として求めた。各試験化合物のＩＣ_５０を表１に示す。なおクエルセチン、レスベラトロール、クルクミンについても同様にしてＩＣ_５０を求めた。

表１に示すとおり、試験化合物はいずれもＰＡＫ１阻害活性を示した。ミモシン、ミモシノールのＩＣ_５０はそれぞれ３７および３０μＭであったのに対し、ＤＫとＤＤＫは、１７、１０μＭであり、ミモシンとミモシノールより著しく強いＰＡＫ１阻害活性を示した。さらに、ＤＫの代謝物であるヒスピジンが強力なＰＡＫ１阻害活性（ＩＣ_５０＝５．７μＭ）を示した。この値はクルクミンとほぼ同等（ＩＣ_５０＝７．０μＭ）であり、レスベラトロールよりも明らかに強い（ＩＣ_５０＝１５μＭ）。このことから、ＤＫとＤＤＫのＣ−５位のメトキシ基がＰＡＫ１阻害活性に寄与している可能性が示唆された。

ＤＫは生体内で、ＤＫそれ自身及び酵素ＣＹＰ２Ｃ９によって変換されたヒスピジンとしてＰＡＫ１阻害剤として作用していると考えられる。ＤＫのＰＡＫ１阻害活性は、その代謝物であるヒスピジンよりも弱い。従って、ＤＫまたはＤＤＫのベンゼン環に２つのＯＨ基が結合することが、ＰＡＫ１阻害活性の増強に寄与している可能性が高い。

ＰＡＫ１阻害活性を高めることを目的として合成したヒスピジン誘導体Ｈ１〜Ｈ３はいずれもヒスピジンよりも高いＰＡＫ１阻害活性を示した。
ミモシンテトラペプチドも高いＰＡＫ１阻害活性も示した。特にＭＦＦＹとＭＦＷＹのＩＣ_５０は、それぞれ０．１３と０．６０μＭであり、ナノモル濃度のレベルでＰＡＫ１を阻害した。

本発明の阻害剤は、優れたＰＡＫ１阻害活性を示すため、ＰＡＫ１が関連する癌、２型糖尿病などの疾患を治療・予防する医薬等として利用可能なものである。

Claims

デヒドロカワイン化合物及びその誘導体、ミモシン及びその誘導体並びにククルビタシン化合物よりなる群から選ばれた１種又は２種以上の化合物を有効成分として含有し、デヒドロカワイン化合物及びその誘導体が、５，６−デヒドロカワイン、ジヒドロ−５,６−デヒドロカワイン、ヒスピジン、6-(3,4-dimethoxystyryl)-4-methoxy-2H-pyran-2-one、6-(3,4-dimethoxyphenethyl)-4-methoxy-2H-pyran-2-one、および6-(3,4-dihydroxyphenethyl)-4-methoxy-2H-pyran-2-oneよりなる群から選ばれる１種又は２種以上であり、ミモシン及びその誘導体が、ミモシン、ミモシノール及び下記式（２）
［式１］

（式（２）中、基Ｘ ^３ −Ｘ ^２ −Ｘ ^１が、Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ｔｙｒ、Ｐｈｅ−Ｔｙｒ−Ｔｙｒ及びＰｈｅ−Ｔｒｐ−Ｔｙｒよりなる群から選ばれるトリペプチド残基を示す）
で表されるミモシンテトラペプチドよりなる群から選ばれる１種又は２種以上であり、ククルビタシン化合物がククルビタシンIであるｐ２１活性化キナーゼ阻害剤。
請求項１記載のｐ２１活性化キナーゼ阻害剤を有効成分として含有する抗腫瘍剤。
請求項１記載のｐ２１活性化キナーゼ阻害剤を有効成分として含有する糖尿病の予防・治療剤。
請求項１記載のｐ２１活性化キナーゼ阻害剤を有効成分として含有する高血圧の予防・治療剤。
請求項１記載のｐ２１活性化キナーゼ阻害剤を有効成分として含有するアルツハイマー病の予防・治療剤。