JP5903298B2 - Ｎ−サクシニル−ｄｌ−アミノ酸に対する向上されたｄ体選択性を有する改変型ｄ−サクシニラーゼ - Google Patents

Description

本発明は、医薬品等の中間体の原料となるＤ−アミノ酸の製造に利用できる、Ｎ−サクシニル−Ｄ−アミノ酸を脱サクシニル化してＤ−アミノ酸を生成する活性を有するタンパク質（以下、Ｄ−サクシニラーゼと呼ぶ）に関し、詳しくは、野生型Ｄ−サクシニラーゼをアミノ酸置換することにより、Ｄ体選択性を向上させて、Ｎ−サクシニル−ＤＬ−アミノ酸からＤ−アミノ酸を効率よく生成できるようにした改変型Ｄ−サクシニラーゼ、及びかかる改変型Ｄ−サクシニラーゼを使用した効率的なＤ−アミノ酸の製造方法に関する。また、本発明は、かかる改変型Ｄ−サクシニラーゼと、Ｎ−サクシニルアミノ酸ラセマーゼを組み合わせて使用することにより、Ｎ−サクシニル−ＤＬ−アミノ酸からＤ−アミノ酸をさらに効率的に製造する方法に関する。

光学活性アミノ酸は、医薬品、農薬及び食品などの分野で多くの需要があるが、Ｄ−アミノ酸は、光学的に純粋なアミノ酸、特に発酵法などの産物（天然のアミノ酸）として得ることが難しい。従って、Ｄ−アミノ酸を、いかにして効率的に製造するかは、産業上重要な課題となっている。

この課題に対して、本発明者らは、既に、Ｎ−サクシニルアミノ酸のラセミ体（Ｎ−サクシニル−ＤＬ−アミノ酸）を合成し、このラセミ体中のＤ体（Ｎ−サクシニル−Ｄ−アミノ酸）をＤ−サクシニラーゼでＤ体選択的に加水分解することによりＤ−アミノ酸を得る方法を提案した（特許文献１）。また、Ｄ−サクシニラーゼに加えてＮ−サクシニルアミノ酸ラセマーゼを使用することにより、Ｄ−サクシニラーゼに対して反応せずに系中に残存したＬ体（Ｎ−サクシニル−Ｌ−アミノ酸）をラセミ化し、生じたラセミ体を再度原料として使用することにより、Ｄ−アミノ酸の収率を向上させる方法も提案した（特許文献１参照）。

特許文献１で使用したＤ−サクシニラーゼは、Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ属（クプリアビダス属）の細菌が生産する野生型のＤ−サクシニラーゼである。これらの野生型のＤ−サクシニラーゼは、Ｎ−サクシニル−Ｄ−アミノ酸を加水分解する活性がかなり高いが、本発明者らがさらに研究を進めたところ、これらの野生型のＤ−サクシニラーゼは、原料基質となるＮ−サクシニル−ＤＬ−アミノ酸の立体を完全に認識できないこと、すなわち、野生型のＤ−サクシニラーゼをＮ−サクシニルアミノ酸のラセミ体に作用させた場合、Ｄ体だけでなくＬ体とも反応して、Ｄ−アミノ酸だけでなくＬ−アミノ酸もわずかに生成してしまうことが判明した。従って、特許文献１の方法を効率的に実施するためには、そこで使用する野生型のＤ−サクシニラーゼをさらに改良してＤ体選択性を向上させることが望ましいと考えられた。

特願２０１０−１４８７９５号

本発明は、かかる従来技術の現状に鑑み創案されたものであり、その目的は、野生型のＤ−サクシニラーゼをさらに改良してＤ体選択性を向上させることにより、Ｄ−アミノ酸をさらに効率的に製造することができるようにすることにある。

本発明者らは、上記目標を達成するために鋭意検討した結果、Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ属由来の細胞株であるＣｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ ｓｐ.Ｐ４−１０−Ｃ（クプリアビダス・エスピー．Ｐ４−１０−Ｃ）株の生産するＤ−サクシニラーゼのアミノ酸配列において、特定の部位が反応基質の立体認識に関与すること、そして、これらの特定の部位のアミノ酸残基を別の特定のアミノ酸残基に置換することにより、Ｄ−サクシニラーゼのＤ体選択性を著しく向上させることができることを見出した。また、近縁種のＣｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ ｍｅｔａｌｌｉｄｕｒａｎｓ（クプリアビダス・メタリデュランス）のＤ−サクシニラーゼにおいても、Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ ｓｐ．Ｐ４−１０−Ｃ株と同等の部位における同様のアミノ酸残基置換により、Ｄ体選択性を著しく向上することができることを見出した。

本発明は、上記の見地に基づいて完成されたものであり、以下の（１）〜（１３）を要旨とするものである。
（１）下記（Ａ）又は（Ｂ）のアミノ酸配列からなることを特徴とするタンパク質。
（Ａ）配列番号２に示すアミノ酸配列において、下記（ａ）〜（ｋ）から選択される少なくとも１個のアミノ酸残基の置換を有するアミノ酸配列
（ａ）７２位のグルタミン残基のアルギニン残基への置換
（ｂ）１８１位のグリシン残基のトリプトファン残基、リジン残基、アルギニン残基、アスパラギン酸又はグルタミン酸残基への置換
（ｃ）１８２位のロイシン残基のトリプトファン残基、セリン残基、システイン残基、チロシン残基、リジン残基、アルギニン残基、アスパラギン酸残基、グルタミン酸残基又はプロリン残基への置換
（ｄ）１８３位のスレオニン残基のプロリン残基、ロイシン残基又はアスパラギン残基への置換
（ｅ）１８４位のロイシン残基のプロリン残基への置換
（ｆ）１８５位のアスパラギン残基のプロリン残基、フェニルアラニン残基、セリン残基又はアスパラギン酸残基への置換
（ｇ）３０５位のアルギニン残基のスレオニン残基、アラニン残基、グリシン残基、ヒスチジン残基、グルタミン残基、セリン残基、アスパラギン残基又はバリン残基への置換
（ｈ）３４８位のロイシン残基のイソロイシン残基、グルタミン酸残基、プロリン残基、メチオニン残基、トリプトファン残基、セリン残基、スレオニン残基、システイン残基、リジン残基、ヒスチジン残基又はグルタミン残基への置換
（ｉ）３５１位のフェニルアラニン残基のロイシン残基、イソロイシン残基、メチオニン残基、アスパラギン残基又はグルタミン残基への置換
（ｊ）４６１位のアスパラギン残基のイソロイシン残基、フェニルアラニン残基、スレオニン残基、リジン残基又はアルギニン残基への置換
（ｋ）５３９位のグリシン残基のプロリン残基、バリン残基、メチオニン残基、スレオニン残基又はアスパラギン残基への置換
（Ｂ）上記（Ａ）のアミノ酸配列において、７２位、１８１〜１８５位、３０５位、３４８位、３５１位、４６１位、及び５３９位以外の箇所に、１若しくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、付加および／または逆位を有するアミノ酸配列であって、Ｎ−サクシニル−ＤＬ−アミノ酸に対してＤ体選択的に作用してＤ−アミノ酸を生成する活性を有するタンパク質をコードするアミノ酸配列。
（２）（１）の（Ａ）のアミノ酸配列が、配列番号２に示すアミノ酸配列において、１８２位のロイシン残基のグルタミン酸残基への置換、及び３４８位のロイシン残基のイソロイシン残基への置換を有するアミノ酸配列であることを特徴とする（１）に記載のタンパク質。
（３）下記（Ａ）又は（Ｂ）の塩基配列からなることを特徴とする遺伝子。
（Ａ）配列番号１に示す塩基配列において、下記（ａ）〜（ｋ）から選択される少なくとも１個の塩基配列の置換を有する塩基配列
（ａ）２１４〜２１６位の塩基配列ｃａａの、ｃｇｔ、ｃｇｃ、ｃｇａ、ｃｇｇ、ａｇａ又はａｇｇへの置換
（ｂ）５４１〜５４３位の塩基配列ｇｇｃの、ｔｇｇ、ａａａ、ａａｇ、ｃｇｔ、ｃｇｃ、ｃｇａ、ｃｇｇ、ａｇａ、ａｇｇ、ｇａｔ、ｇａｃ、ｇａａ又はｇａｇへの置換
（ｃ）５４４〜５４６位の塩基配列ｃｔｇの、ｔｇｇ、ｔｃｔ、ｔｃｃ、ｔｃａ、ｔｃｇ、ａｇｔ、ａｇｃ、ｔｇｔ、ｔｇｃ、ｔａｔ、ｔａｃ、ａａａ、ａａｇ、ｃｇｔ、ｃｇｃ、ｃｇａ、ｃｇｇ、ａｇａ、ａｇｇ、ｇａｔ、ｇａｃ、ｇａａ、ｇａｇ、ｃｃｔ、ｃｃｃ、ｃｃａ又はｃｃｇへの置換
（ｄ）５４７〜５４９位の塩基配列ａｃｇの、ｃｃｔ、ｃｃｃ、ｃｃａ、ｃｃｇ、ｔｔａ、ｔｔｇ、ｃｔｔ、ｃｔｃ、ｃｔａ、ｃｔｇ、ａａｔ又はａａｃへの置換
（ｅ）５５０〜５５２位の塩基配列ｃｔｇの、ｃｃｔ、ｃｃｃ、ｃｃａ又はｃｃｇへの置換
（ｆ）５５３〜５５５位の塩基配列ａａｔの、ｃｃｔ、ｃｃｃ、ｃｃａ、ｃｃｇ、ｔｔｔ、ｔｔｃ、ｔｃｔ、ｔｃｃ、ｔｃａ、ｔｃｇ、ａｇｔ、ａｇｃ、ｇａｔ又はｇａｃへの置換
（ｇ）９１３〜９１５位の塩基配列ｃｇｇの、ａｃｔ、ａｃｃ、ａｃａ、ａｃｇ、ｇｃｔ、ｇｃｃ、ｇｃａ、ｇｃｇ、ｇｇｔ、ｇｇｃ、ｇｇａ、ｇｇｇ、ｃａｔ、ｃａｃ、ｃａａ、ｃａｇ、ｔｃｔ、ｔｃｃ、ｔｃａ、ｔｃｇ、ａｇｔ、ａｇｃ、ａａｔ、ａａｃ、ｇｔｔ、ｇｔｃ、ｇｔａ又はｇｔｇへの置換
（ｈ）１０４２〜１０４４位の塩基配列ｃｔｇの、ａｔｔ、ａｔｃ、ａｔａ、ｇａａ、ｇａｇ、ｃｃｔ、ｃｃｃ、ｃｃａ、ｃｃｇ、ａｔｇ、ｔｇｇ、ｔｃｔ、ｔｃｃ、ｔｃａ、ｔｃｇ、ａｇｔ、ａｇｃ、ａｃｔ、ａｃｃ、ａｃａ、ａｃｇ、ｔｇｔ、ｔｇｃ、ａａａ、ａａｇ、ｃａｔ、ｃａｃ、ｃａａ又はｃａｇへの置換
（ｉ）１０５１〜１０５３位の塩基配列ｔｔｃの、ｔｔａ、ｔｔｇ、ｃｔｔ、ｃｔｃ、ｃｔａ、ｃｔｇ、ａｔｔ、ａｔｃ、ａｔａ、ａｔｇ、ａａｔ、ａａｃ、ｃａａ又はｃａｇへの置換
（ｊ）１３８１〜１３８３位の塩基配列ａａｃの、ａｔｔ、ａｔｃ、ａｔａ、ｔｔｔ、ｔｔｃ、ａｃｔ、ａｃｃ、ａｃａ、ａｃｇ、ａａａ、ａａｇ、ｃｇｔ、ｃｇｃ、ｃｇａ、ｃｇｇ、ａｇａ又はａｇｇへの置換
（ｋ）１６１５〜１６１７位の塩基配列ｇｇｃの、ｃｃｔ、ｃｃｃ、ｃｃａ、ｃｃｇ、ｇｔｔ、ｇｔｃ、ｇｔａ、ｇｔｇ、ａｔｇ、ａｃｔ、ａｃｃ、ａｃａ、ａｃｇ、ａａｔ又はａａｃへの置換
（Ｂ）上記（Ａ）の（ａ）〜（ｋ）から選択される塩基配列の置換を有し、かつ、（Ａ）の塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列であって、Ｎ−サクシニル−ＤＬ−アミノ酸に対してＤ体選択的に作用してＤ−アミノ酸を生成する活性を有するタンパク質をコードする塩基配列。
（４）（３）の（Ａ）の塩基配列が、配列番号１に示す塩基配列において、５４４〜５４６位の塩基配列ｃｔｇの、ｇａａ又はｇａｇへの置換、及び１０４２〜１０４４位の塩基配列ｃｔｇの、ａｔｔ，ａｔｃ又はａｔａへの置換を有する塩基配列であることを特徴とする（３）に記載の遺伝子。
（５）下記（Ａ）又は（Ｂ）のアミノ酸配列からなることを特徴とするタンパク質。
（Ａ）配列番号４に示すアミノ酸配列において、下記（ａ）〜（ｅ）から選択される少なくとも１個のアミノ酸残基の置換を有するアミノ酸配列
（ａ）１７７位のロイシン残基のアルギニン残基への置換
（ｂ）１８０位のアスパラギン残基のアスパラギン酸残基への置換
（ｃ）３４４位のロイシン残基のプロリン残基への置換
（ｄ）３４７位のフェニルアラニン残基のイソロイシン残基への置換
（ｅ）４５７位のアスパラギン残基のイソロイシン残基への置換
（Ｂ）上記（Ａ）のアミノ酸配列において、１７７位、１８０位、３４４位、３４７位、及び４５７位以外の箇所に、１若しくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、付加および／または逆位を有するアミノ酸配列であって、Ｎ−サクシニル−ＤＬ−アミノ酸に対してＤ体選択的に作用してＤ−アミノ酸を生成する活性を有するタンパク質をコードするアミノ酸配列。
（６）下記（Ａ）又は（Ｂ）の塩基配列からなることを特徴とする遺伝子。
（Ａ）配列番号３に示す塩基配列において、下記（ａ）〜（ｅ）から選択される少なくとも１個の塩基配列の置換を有する塩基配列
（ａ）５２９〜５３１位の塩基配列ｃｔｇの、ｃｇｔ、ｃｇｃ、ｃｇａ、ｃｇｇ、ａｇａ又はａｇｇへの置換
（ｂ）５３８〜５４０位の塩基配列ａａｃの、ｇａｔ又はｇａｃへの置換
（ｃ）１０３０〜１０３２位の塩基配列ｃｔｇの、ｃｃｔ、ｃｃｃ、ｃｃａ又はｃｃｇへの置換
（ｄ）１０３９〜１０４１位の塩基配列ｔｔｃの、ａｔｔ、ａｔｃ又はａｔａへの置換
（ｅ）１３６９〜１３７１位の塩基配列ａａｔの、ａｔｔ、ａｔｃ又はａｔａへの置換
（Ｂ）上記（Ａ）の（ａ）〜（ｅ）から選択される塩基配列の置換を有し、かつ、（Ａ）の塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列であって、Ｎ−サクシニル−ＤＬ−アミノ酸に対してＤ体選択的に作用してＤ−アミノ酸を生成する活性を有するタンパク質をコードする塩基配列。
（７）配列番号２と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列において、配列番号２の７２位、１８１〜１８５位、３０５位、３４８位、３５１位、４６１位、及び５３９位のうちのいずれかと同等な位置のアミノ酸残基が、（１）の（Ａ）に示すアミノ酸残基に置換されているアミノ酸配列からなるタンパク質であって、Ｎ−サクシニル−ＤＬ−アミノ酸に対してＤ体選択的に作用してＤ−アミノ酸を生成する活性を有することを特徴とするタンパク質。
（８）（７）に記載のタンパク質をコードすることを特徴とする遺伝子。
（９）配列番号４と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列において、配列番号４の１７７位、１８０位、３４４位、３４７位、及び４５７位のうちのいずれかと同等な位置のアミノ酸残基が、（３）の（Ａ）に示すアミノ酸残基に置換されているアミノ酸配列からなるタンパク質であって、Ｎ−サクシニル−ＤＬ−アミノ酸に対してＤ体選択的に作用してＤ−アミノ酸を生成する活性を有することを特徴とするタンパク質。
（１０）（９）に記載のタンパク質をコードすることを特徴とする遺伝子。
（１１）（３），（４），（６），（８）又は（１０）に記載の遺伝子をベクターに挿入して組換えベクターを調製し、この組換えベクターで宿主細胞を形質転換して形質転換体を調製し、この形質転換体を培養する工程を含むことを特徴とする（１），（２），（５），（７）又は（９）に記載のタンパク質の製造方法。
（１２）（１），（２），（５），（７）又は（９）に記載のタンパク質を用いてＮ−サクシニル−ＤＬ−アミノ酸中のＮ−サクシニル−Ｄ−アミノ酸を特異的に加水分解する工程を含むことを特徴とするＤ−アミノ酸の製造方法。
（１３）Ｎ−サクシニルアミノ酸ラセマーゼを用いてＮ−サクシニル−Ｌ−アミノ酸をラセミ化してＮ−サクシニル−Ｄ−アミノ酸を生成させる工程をさらに含むことを特徴とする（１２）に記載の方法。

本発明の改変型Ｄ−サクシニラーゼは、野生型Ｄ−サクシニラーゼのアミノ酸配列の特定の部位のアミノ酸残基が別の特定のアミノ酸残基に置換されているので、野生型Ｄ−サクシニラーゼと比較してＤ体選択性が著しく向上している。従って、本発明の改変型Ｄ−サクシニラーゼを使用すれば、医薬品等の中間体の原料として有用なＤ−アミノ酸をさらに効率良く製造することができる。

図１は、Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ ｓｐ．Ｐ４−１０−Ｃ株の生産するＤ−サクシニラーゼの電気泳動法による電気泳動像を示す図である。 図２は、改変型Ｄ−サクシニラーゼのスクリーニング方法を示す図である。 図３は、Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ属由来Ｄ−サクシニラーゼのアミノ酸配列のアライメント結果を示す図である。

本発明は、野生型Ｄ−サクシニラーゼを特定の部位でアミノ酸置換することにより、野生型Ｄ−サクシニラーゼと比較してＤ体選択性が著しく向上した改変型Ｄ−サクシニラーゼを提供するものである。本発明において、改変のベースとする野生型Ｄ−サクシニラーゼは、主にＣｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ属の２種類の細菌（Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ ｓｐ．Ｐ４−１０−Ｃ株及びＣｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ ｍｅｔａｌｌｉｄｕｒａｎｓ）のＤ−サクシニラーゼである。以下、各改変型Ｄ−サクシニラーゼについて説明する。

本発明の第１の側面は、Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ ｓｐ．Ｐ４−１０−Ｃ株のＤ−サクシニラーゼをベースとした改変型Ｄ−サクシニラーゼに関する。即ち、本発明の第１の側面によれば、（Ａ）配列番号２に示すアミノ酸配列において、下記（ａ）〜（ｋ）から選択される少なくとも１個のアミノ酸残基の置換を有するアミノ酸配列からなることを特徴とするタンパク質が提供される。
（ａ）７２位のグルタミン残基のアルギニン残基への置換
（ｂ）１８１位のグリシン残基のトリプトファン残基、リジン残基、アルギニン残基、アスパラギン酸又はグルタミン酸残基への置換
（ｃ）１８２位のロイシン残基のトリプトファン残基、セリン残基、システイン残基、チロシン残基、リジン残基、アルギニン残基、アスパラギン酸残基、グルタミン酸残基又はプロリン残基への置換
（ｄ）１８３位のスレオニン残基のプロリン残基、ロイシン残基又はアスパラギン残基への置換
（ｅ）１８４位のロイシン残基のプロリン残基への置換
（ｆ）１８５位のアスパラギン残基のプロリン残基、フェニルアラニン残基、セリン残基又はアスパラギン酸残基への置換
（ｇ）３０５位のアルギニン残基のスレオニン残基、アラニン残基、グリシン残基、ヒスチジン残基、グルタミン残基、セリン残基、アスパラギン酸残基又はバリン残基への置換
（ｈ）３４８位のロイシン残基のグルタミン酸残基、プロリン残基、メチオニン残基、トリプトファン残基、セリン残基、スレオニン残基、システイン残基、リジン残基、ヒスチジン残基又はグルタミン残基への置換
（ｉ）３５１位のフェニルアラニン残基のロイシン残基、イソロイシン残基、メチオニン残基、アスパラギン残基又はグルタミン残基への置換
（ｊ）４６１位のアスパラギン残基のイソロイシン残基、フェニルアラニン残基、スレオニン残基、リジン残基又はアルギニン残基への置換
（ｋ）５３９位のグリシン残基のプロリン残基、バリン残基、メチオニン残基、スレオニン残基又はアスパラギン残基への置換
配列番号２は、Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ ｓｐ．Ｐ４−１０−Ｃ株のＤ−サクシニラーゼのアミノ酸配列である。

好ましい実施態様によれば、上記（Ａ）のタンパク質は、配列番号２に示すアミノ酸配列において、１８２位のロイシン残基のグルタミン酸残基への置換、及び３４８位のロイシン残基のイソロイシン残基への置換を有するアミノ酸配列からなる。これは、Ｌ１８２Ｅ＋Ｌ３４８Ｉの二重変異体に相当する。後述の実施例に示す通り、Ｌ３４８Ｉの単変異のみでは、Ｄ体選択性の向上効果は見られないが、Ｌ１８２Ｅの単変異と組み合わせることにより、相乗効果が発揮され、Ｄ体選択性をさらに向上させることができる。

上記（Ａ）のタンパク質は、Ｎ−サクシニル−ＤＬ−アミノ酸に対してＤ体選択的に作用してＤ−アミノ酸を生成する活性を有するという特徴を有する。

ここで、「Ｄ体選択的に作用する」とは、野生型のＤ−サクシニラーゼと比較して、Ｎ−サクシニル−Ｌ−アミノ酸（Ｌ体）よりもＮ−サクシニル−Ｄ−アミノ酸（Ｄ体）に反応しやすい性質のことを総じて称し、これは「Ｄ体選択性が向上している」と同義である。具体的には、「Ｄ体選択的に作用する」とは、Ｄ体に対するＬ体の分解比率（Ｌ／Ｄ）が野生型のＤ−サクシニラーゼより低いことを意味する。Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ ｓｐ．Ｐ４−１０−ＣのＤ−サクシニラーゼをベースとした改変型Ｄ−サクシニラーゼの場合、基質として、例えばＮ−サクシニルトリプトファンを用いたときは、実施例２に記載の方法に従ってＮ−サクシニル−Ｌ−トリプトファン、Ｎ−サクシニル−Ｄ−トリプトファン、それぞれの基質に対して、Ｌ体を４、Ｄ体を１、すなわちＬ：Ｄ＝４：１の比率のタンパク量で反応させたときのＤ体に対するＬ体の分解比率（Ｌ／Ｄ）が０．９１未満であることを意味する。Ｄ体に対するＬ体の分解比率（Ｌ／Ｄ）は０．５以下であることが好ましく、０．３以下であることがさらに好ましい。また、基質として、Ｎ−サクシニルフェニルアラニンを用いたときは、実施例２に記載の方法に従ってＮ−サクシニル−Ｌ−フェニルアラニン、Ｎ−サクシニル−Ｄ−フェニルアラニン、それぞれの基質に対して、Ｌ体を４、Ｄ体を１、すなわちＬ：Ｄ＝４：１の比率のタンパク量で反応させたときのＤ体に対するＬ体の分解比率（Ｌ／Ｄ）が０．６９未満であることを意味する。Ｄ体に対するＬ体の分解比率（Ｌ／Ｄ）は０．４以下であることが好ましく、０．２以下であることがさらに好ましい。また、基質として、Ｎ−サクシニルビフェニルアラニンを用いたときは、実施例３に記載の方法に従ってＮ−サクシニル−ＤＬ−ビフェニルアラニンのラセミ体に対し、反応させたときのＤ体に対するＬ体の分解比率（Ｌ／Ｄ）が０．０９未満であることを意味する。Ｄ体に対するＬ体の分解比率（Ｌ／Ｄ）は０．０５以下であることが好ましく、０．０２以下であることがさらに好ましい。また、後述するＣｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ ｍｅｔａｌｌｉｄｕｒａｎｓのＤ−サクシニラーゼをベースとした改変型Ｄ−サクシニラーゼの場合、基質として、Ｎ−サクシニルトリプトファンを用いたときは、実施例２に記載の方法に従ってＮ−サクシニル−Ｌ−トリプトファン、Ｎ−サクシニル−Ｄ−トリプトファン、それぞれの基質に対して、Ｌ体を４、Ｌ体を１、すなわちＬ：Ｄ＝４：１の比率のタンパク量で反応させたときのＤ体に対するＬ体の分解比率（Ｌ／Ｄ）が０．５４未満であることを意味する。Ｄ体に対するＬ体の分解比率（Ｌ／Ｄ）は０．３以下であることが好ましく、０．１以下であることがさらに好ましい。
なお、実用上の観点からは、Ｄ体に対するＬ体の分解比率だけではなく、Ｌ体分解率及びＤ体分解率それぞれの値も考慮すべきである。具体的には、Ｌ体分解率が１２％以下であることが好ましく、Ｌ体分解率が１２％以下でかつＤ体分解率が２５％以上であることがさらに好ましく、Ｌ体分解率が０％でかつＤ体分解率が２５％以上であることが特に好ましい。

本発明における立体選択性の評価は、実施例に示した通りであるが、基質濃度や酵素量、反応温度、反応時間、反応ｐＨなどの反応条件によっては、数値が変動する場合もある。

なお、上記のＤ体選択性の説明において、Ｎ−サクシニル−ＤＬ−トリプトファン、Ｎ−サクシニル−ＤＬ−フェニルアラニン及びＮ−サクシニル−ＤＬ−ビフェニルアラニンに対するＤ体選択性に言及したが、本発明の改変型Ｄ−サクシニラーゼは、これらの特定のＮ−サクシニル−ＤＬ−アミノ酸だけでなく、下記一般式（Ｉ）に示す任意のＮ−サクシニル−ＤＬ−アミノ酸に対しても同様にＤ体選択性を有する。
（一般式（Ｉ）中、Ｒは、置換基を有してもよい炭素数４〜２０のアリール基、または置換基を有してもよい炭素数５〜２０のアラルキル基を示す。）
上記Ｒにおける置換基を有していてもよい炭素数６〜２０のアリール基としては、フェニル基、４−ヒドロキシフェニル基などが挙げられる。置換基としては、アミノ基、ヒドロキシル基、ニトロ基、シアノ基、カルボキシル基、アルキル基、アラルキル基、アリール基、アルカノイル基、アルケニル基、アルキニル基、アルコキシル基、又はハロゲン原子等が挙げられる。また、置換基を有していてもよい炭素数７〜２０のアラルキル基としては、特に限定されず、例えば、ベンジル基、インドリルメチル基、４−フェニルベンジル基、４−ヒドロキシベンジル基等が挙げられる。

従来公知の野生型Ｄ−サクシニラーゼは、Ｄ−アミノ酸の前駆体であるＮ−サクシニル−ＤＬ−アミノ酸の光学異性を厳密には区別できず、Ｌ体にもわずかに作用して、Ｄ−アミノ酸のみならず、Ｌ−アミノ酸も生じてしまう。しかし、本発明の改変型Ｄ−サクシニラーゼは、野生型Ｄ−サクシニラーゼの一部のアミノ酸残基を置換することにより立体選択性を変化させて、Ｎ−サクシニル−ＤＬ−アミノ酸に対してＤ体選択的に作用するよう改変を加えているので、Ｎ−サクシニル−ＤＬ−アミノ酸からＤ−アミノ酸を選択的に生成することができる。

また、本発明の第１の側面によれば、上記（Ａ）のタンパク質に対応する遺伝子である、以下の遺伝子も提供される。
（Ａ）配列番号１に示す塩基配列において、下記（ａ）〜（ｋ）から選択される少なくとも１個の塩基配列の置換を有する塩基配列からなることを特徴とする遺伝子
（ａ）２１４〜２１６位の塩基配列ｃａａの、ｃｇｔ、ｃｇｃ、ｃｇａ、ｃｇｇ、ａｇａ又はａｇｇへの置換
（ｂ）５４１〜５４３位の塩基配列ｇｇｃの、ｔｇｇ、ａａａ、ａａｇ、ｃｇｔ、ｃｇｃ、ｃｇａ、ｃｇｇ、ａｇａ、ａｇｇ、ｇａｔ、ｇａｃ、ｇａａ又はｇａｇへの置換
（ｃ）５４４〜５４６位の塩基配列ｃｔｇの、ｔｇｇ、ｔｃｔ、ｔｃｃ、ｔｃａ、ｔｃｇ、ａｇｔ、ａｇｃ、ｔｇｔ、ｔｇｃ、ｔａｔ、ｔａｃ、ａａａ、ａａｇ、ｃｇｔ、ｃｇｃ、ｃｇａ、ｃｇｇ、ａｇａ、ａｇｇ、ｇａｔ、ｇａｃ、ｇａａ、ｇａｇ、ｃｃｔ、ｃｃｃ、ｃｃａ又はｃｃｇへの置換
（ｄ）５４７〜５４９位の塩基配列ａｃｇの、ｃｃｔ、ｃｃｃ、ｃｃａ、ｃｃｇ、ｔｔａ、ｔｔｇ、ｃｔｔ、ｃｔｃ、ｃｔａ、ｃｔｇ、ａａｔ又はａａｃへの置換
（ｅ）５５０〜５５２位の塩基配列ｃｔｇの、ｃｃｔ、ｃｃｃ、ｃｃａ又はｃｃｇへの置換
（ｆ）５５３〜５５５位の塩基配列ａａｔの、ｃｃｔ、ｃｃｃ、ｃｃａ、ｃｃｇ、ｔｔｔ、ｔｔｃ、ｔｃｔ、ｔｃｃ、ｔｃａ、ｔｃｇ、ａｇｔ、ａｇｃ、ｇａｔ又はｇａｃへの置換
（ｇ）９１３〜９１５位の塩基配列ｃｇｇの、ａｃｔ、ａｃｃ、ａｃａ、ａｃｇ、ｇｃｔ、ｇｃｃ、ｇｃａ、ｇｃｇ、ｇｇｔ、ｇｇｃ、ｇｇａ、ｇｇｇ、ｃａｔ、ｃａｃ、ｃａａ、ｃａｇ、ｔｃｔ、ｔｃｃ、ｔｃａ、ｔｃｇ、ａｇｔ、ａｇｃ、ａａｔ、ａａｃ、ｇｔｔ、ｇｔｃ、ｇｔａ又はｇｔｇへの置換
（ｈ）１０４２〜１０４４位の塩基配列ｃｔｇの、ｇａａ、ｇａｇ、ｃｃｔ、ｃｃｃ、ｃｃａ、ｃｃｇ、ａｔｇ、ｔｇｇ、ｔｃｔ、ｔｃｃ、ｔｃａ、ｔｃｇ、ａｇｔ、ａｇｃ、ａｃｔ、ａｃｃ、ａｃａ、ａｃｇ、ｔｇｔ、ｔｇｃ、ａａａ、ａａｇ、ｃａｔ、ｃａｃ、ｃａａ又はｃａｇへの置換
（ｉ）１０５１〜１０５３位の塩基配列ｔｔｃの、ｔｔａ、ｔｔｇ、ｃｔｔ、ｃｔｃ、ｃｔａ、ｃｔｇ、ａｔｔ、ａｔｃ、ａｔａ、ａｔｇ、ａａｔ、ａａｃ、ｃａａ又はｃａｇへの置換
（ｊ）１３８１〜１３８３位の塩基配列ａａｃの、ａｔｔ、ａｔｃ、ａｔａ、ｔｔｔ、ｔｔｃ、ａｃｔ、ａｃｃ、ａｃａ、ａｃｇ、ａａａ、ａａｇ、ｃｇｔ、ｃｇｃ、ｃｇａ、ｃｇｇ、ａｇａ又はａｇｇへの置換
（ｋ）１６１５〜１６１７位の塩基配列ｇｇｃの、ｃｃｔ、ｃｃｃ、ｃｃａ、ｃｃｇ、ｇｔｔ、ｇｔｃ、ｇｔａ、ｇｔｇ、ａｔｇ、ａｃｔ、ａｃｃ、ａｃａ、ａｃｇ、ａａｔ又はａａｃへの置換
配列番号１は、Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ ｓｐ．Ｐ４−１０−Ｃ株のＤ−サクシニラーゼの塩基配列である。

好ましい実施態様によれば、上記（Ａ）のタンパク質に対応する遺伝子は、配列番号１に示す塩基配列において、５４４〜５４６位の塩基配列ｃｔｇの、ｇａａ又はｇａｇへの置換、及び１０４２〜１０４４位の塩基配列ｃｔｇの、ａｔｔ，ａｔｃ又はａｔａへの置換を有する塩基配列からなる。これは、Ｌ１８２Ｅ＋Ｌ３４８Ｉの二重変異体に相当する遺伝子である。

本発明の第１の側面の改変型Ｄ−サクシニラーゼのタンパク質は、上記（Ａ）のものに限定されず、（Ｂ）（Ａ）のアミノ酸配列において、７２位、１８１〜１８５位、３０５位、３４８位、３５１位、４６１位、及び５３９位以外の箇所に、１若しくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、付加および／または逆位を有するアミノ酸配列であって、Ｎ−サクシニル−ＤＬ−アミノ酸に対してＤ体選択的に作用してＤ−アミノ酸を生成する活性を有するタンパク質をコードするアミノ酸配列からなることを特徴とするタンパク質も含む。また、本発明の第１の側面の改変型Ｄ−サクシニラーゼの遺伝子は、上記（Ａ）のものに限定されず、（Ｂ）（Ａ）の塩基配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列であって、Ｎ−サクシニル−ＤＬ−アミノ酸に対してＤ体選択的に作用してＤ−アミノ酸を生成する活性を有するタンパク質をコードする塩基配列からなることを特徴とする遺伝子も含む。これは、タンパク質をコードする遺伝子の塩基配列の一部に変異が生じたり、またその結果としてタンパク質のアミノ酸配列の一部に変異が生じても、機能的には同等のタンパク質であることが多いからである。また、本発明の改変型Ｄ−サクシニラーゼの遺伝子を、由来生物以外の宿主生物（大腸菌など）に組込んで本発明の改変型Ｄ−サクシニラーゼを発現させる場合、発現効率向上のため、宿主生物のコドンユーセージに合わせて塩基配列を変更することもあるからである。

ここで、「１若しくは数個」とは、アミノ酸残基のタンパク質の立体構造や、Ｄ−サクシニラーゼ活性及びＮ−サクシニル−ＤＬ−アミノ酸に対するＤ体選択性を大きく損なわない範囲のものであり、具体的には、１〜５０個、好ましくは１〜３０個、より好ましくは１〜２０個、さらに好ましくは１〜１０個である。ただし、配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、付加及び／又は逆位を含むアミノ酸配列の場合には、３７℃、ｐＨ７．０の条件下で配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質の３％以上、好ましくは１０％以上、より好ましくは３０％以上、さらに好ましくは５０％以上、特に好ましくは７０％以上のＤ−サクシニラーゼ活性を保持していることが望ましい。

また、「ストリンジェントな条件」とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。この条件を明確に数値化することは困難であるが、一例を示せば、相同性が高いＤＮＡ同士、例えば８５％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上の相同性を有するＤＮＡ同士がハイブリダイズし、それより相同性が低いＤＮＡ同士がハイブリダイズしない条件（ここでいう相同性（ｈｏｍｏｌｏｇｙ）は、比較する配列間において一致する塩基の数が最大となるような並べ方にして演算された値であることが望ましい）、あるいは通常のサザンハイブリダイゼーションの洗いの条件である３７℃、０．１×ＳＳＣ、０．１％ ＳＤＳ、好ましくは６０℃、０．１×ＳＳＣ、０．１％ ＳＤＳ、さらに好ましくは６５℃、０．１×ＳＳＣ、０．１％ ＳＤＳに相当するに相当する塩濃度でハイブリダイズする条件が挙げられる。ただし、配列表の配列番号１に記載の塩基配列と相補的な塩基配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列の場合には、３７℃、ｐＨ７．０の条件下で配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質の３％以上、好ましくは１０％以上、より好ましくは３０％以上、さらに好ましくは５０％以上、特に好ましくは７０％以上のＤ−サクシニラーゼ活性を保持していることが望ましい。

本発明の第１の側面のタンパク質及びその遺伝子は、例えばＴｒａｎｓｆｏｒｍｅｒＭｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ；Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ製、ＥＸＯＩＩＩ／Ｍｕｎｇ Ｂｅａｎ Ｄｅｌｅｔｉｏｎ Ｋｉｔ；Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ製、ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ Ｓｉｔｅ Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ；Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ製、ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ；東洋紡製などの市販のキットやＰＣＲ法を利用して配列番号１に記載の塩基配列を改変することによって得ることができる。得られた遺伝子によってコードされるタンパク質の活性は、例えば、得られた遺伝子を大腸菌に導入して形質転換体を作成し、この形質転換体を培養して酵素タンパク質を生成させ、この形質転換体、この形質転換体の菌体破砕液もしくは精製した酵素タンパク質をＮ−サクシニル−ＤＬ−アミノ酸に添加してＤ体に対するＬ体の分解比率を実施例に記載の方法で測定することによって確認することができる。

本発明の第２の側面は、Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ ｍｅｔａｌｌｉｄｕｒａｎｓのＤ−サクシニラーゼをベースとした改変型Ｄ−サクシニラーゼに関する。即ち、本発明の第２の側面によれば、（Ａ）配列番号４に示すアミノ酸配列において、下記（ａ）〜（ｅ）から選択される少なくとも１個のアミノ酸残基の置換を有するアミノ酸配列からなることを特徴とするタンパク質が提供される。
（ａ）１７７位のロイシン残基のアルギニン残基への置換
（ｂ）１８０位のアスパラギン残基のアスパラギン酸残基への置換
（ｃ）３４４位のロイシン残基のプロリン残基への置換
（ｄ）３４７位のフェニルアラニン残基のイソロイシン残基への置換
（ｅ）４５７位のアスパラギン残基のイソロイシン残基への置換
配列番号４は、Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ ｍｅｔａｌｌｉｄｕｒａｎｓのＤ−サクシニラーゼのアミノ酸配列である。

上記（Ａ）のタンパク質は、Ｎ−サクシニル−ＤＬ−アミノ酸に対してＤ体選択的に作用してＤ−アミノ酸を生成する活性を有するという特徴を有する。「Ｄ体選択的に作用する」の定義などは、第１の側面と同様であるので、説明を省略する。

また、本発明の第２の側面によれば、上記（Ａ）のタンパク質に対応する遺伝子である、以下の遺伝子も提供される。
（Ａ）配列番号３に示す塩基配列において、下記（ａ）〜（ｅ）から選択される少なくとも１個の塩基配列の置換を有する塩基配列からなることを特徴とする遺伝子
（ａ）５２９〜５３１位の塩基配列ｃｔｇの、ｃｇｔ、ｃｇｃ、ｃｇａ、ｃｇｇ、ａｇａ又はａｇｇへの置換
（ｂ）５３８〜５４０位の塩基配列ａａｃの、ｇａｔ又はｇａｃへの置換
（ｃ）１０３０〜１０３２位の塩基配列ｃｔｇの、ｃｃｔ、ｃｃｃ、ｃｃａ又はｃｃｇへの置換
（ｄ）１０３９〜１０４１位の塩基配列ｔｔｃの、ａｔｔ、ａｔｃ又はａｔａへの置換
（ｅ）１３６９〜１３７１位の塩基配列ａａｔの、ａｔｔ、ａｔｃ又はａｔａへの置換
配列番号３は、Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ ｍｅｔａｌｌｉｄｕｒａｎｓのＤ−サクシニラーゼの塩基配列である。

本発明の第２の側面の改変型Ｄ−サクシニラーゼのタンパク質は、上記（Ａ）のものに限定されず、（Ｂ）（Ａ）のアミノ酸配列において、１７７位、１８０位、３４４位、３４７位、及び４５７位以外の箇所に、１若しくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、付加および／または逆位を有するアミノ酸配列であって、Ｎ−サクシニル−ＤＬ−アミノ酸に対してＤ体選択的に作用してＤ−アミノ酸を生成する活性を有するタンパク質をコードするアミノ酸配列からなることを特徴とするタンパク質も含む。また、本発明の第２の側面の改変型Ｄ−サクシニラーゼの遺伝子は、上記（Ａ）のものに限定されず、（Ｂ）（Ａ）の塩基配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列であって、Ｎ−サクシニル−ＤＬ−アミノ酸に対してＤ体選択的に作用してＤ−アミノ酸を生成する活性を有するタンパク質をコードする塩基配列からなることを特徴とする遺伝子も含む。「１若しくは数個」及び「ストリンジェントな条件」の定義など、並びに第２の側面のタンパク質及びその遺伝子の作成方法や活性確認方法は、第１の側面と同様であるので、説明を省略する。

以上、Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ ｓｐ．Ｐ４−１０−Ｃ株のＤ−サクシニラーゼ及びＣｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ ｍｅｔａｌｌｉｄｕｒａｎｓのＤ−サクシニラーゼをベースとした改変型Ｄ−サクシニラーゼについて説明したが、本発明の改変型Ｄ−サクシニラーゼはこれらの細菌のＤ−サクシニラーゼをベースとしたものに限定されず、Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ属の他の細菌を含む近縁種のＤ−サクシニラーゼをベースとしたものも含む。

Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ ｓｐ．Ｐ４−１０−Ｃ株のＤ−サクシニラーゼとＣｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ ｍｅｔａｌｌｉｄｕｒａｎｓのＤ−サクシニラーゼは、７５％の相同性しか有さないが、実施例で示すように、Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ ｓｐ．Ｐ４−１０−Ｃ株のＤ−サクシニラーゼのアミノ酸配列において立体選択性に関与することが今回見出されたアミノ酸残基は全て、Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ ｍｅｔａｌｌｉｄｕｒａｎｓのＤ−サクシニラーゼのアミノ酸配列でも保存されている。また、実際に、Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ ｍｅｔａｌｌｉｄｕｒａｎｓのＤ−サクシニラーゼにおいても、これらの保存アミノ酸残基を、Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ ｓｐ．Ｐ４−１０−Ｃ株のＤ−サクシニラーゼベースの改変型Ｄ−サクシニラーゼと同様にアミノ酸置換することによって、Ｄ体選択性が向上することが確認されている。さらに、立体選択性に関与するアミノ酸残基は全て、Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ ｓｐ．Ｐ４−１０−Ｃ株とＣｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ ｍｅｔａｌｌｉｄｕｒａｎｓの間だけではなく、Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ ｓｐ．Ｐ４−１０−Ｃ株とＣｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ属の他の細菌との間でも保存されている。これらのことから、Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ ｓｐ．Ｐ４−１０−Ｃ株のＤ−サクシニラーゼ及びＣｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ ｍｅｔａｌｌｉｄｕｒａｎｓのＤ−サクシニラーゼに限らず、Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ ｓｐ．Ｐ４−１０−Ｃ株又はＣｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ ｍｅｔａｌｌｉｄｕｒａｎｓの近縁種のＤ−サクシニラーゼにおいて、Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ ｓｐ．Ｐ４−１０−Ｃ株又はＣｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ ｍｅｔａｌｌｉｄｕｒａｎｓのＤ−サクシニラーゼのアミノ酸配列中の立体選択性に関与するアミノ酸残基と同等な位置のアミノ酸残基をアミノ酸置換することによって、Ｄ体選択性が向上するものと考えられる。

従って、本発明の第３の側面は、Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ ｓｐ．Ｐ４−１０−Ｃ株の近縁種のＤ−サクシニラーゼをベースとした改変型Ｄ−サクシニラーゼ及びその遺伝子に関する。即ち、本発明の第３の側面によれば、配列番号２と７０％以上の相同性を有するアミノ酸配列において、配列番号２の７２位、１８１〜１８５位、３０５位、３４８位、３５１位、４６１位、及び５３９位のうちのいずれかと同等な位置のアミノ酸残基が、本発明の第１の側面のタンパク質（Ａ）に示すアミノ酸残基に置換されているアミノ酸配列からなるタンパク質であって、Ｎ−サクシニル−ＤＬ−アミノ酸に対してＤ体選択的に作用してＤ−アミノ酸を生成する活性を有することを特徴とするタンパク質、及びこのタンパク質をコードすることを特徴とする遺伝子が提供される。

本発明の第３の側面の改変型Ｄ−サクシニラーゼは、Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ ｓｐ．Ｐ４−１０−Ｃ株のＤ−サクシニラーゼのアミノ酸配列である配列番号２と７０％以上、好ましくは７４％以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上、特に好ましくは９５％以上の相同性を有するＤ−サクシニラーゼをベースとする。このような相同性レベルを有するアミノ酸配列は、公知のアミノ酸配列のデータベースに基づく相同性検索や、Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ ｓｐ．Ｐ４−１０−Ｃ株のＤ−サクシニラーゼの遺伝子のＤＮＡ断片をプローブとしたハイブリダイゼーションにより得ることができる。例えば、相同性検索により得られるアミノ酸配列としては、Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ ｎｅｃａｔｏｒ及びＣｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ ｔａｉｗａｎｅｎｓｉｓのＤ−サクシニラーゼのアミノ酸配列が挙げられる。これらのアミノ酸配列は、ＮＣＢＩ（ｈｔｔｐ：／／ｂｌａｓｔ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）に公開されている。なお、ＮＣＢＩでは、これらのアミノ酸配列は、Ｄ−サクシニラーゼの配列ではなくペニシリンＧアシラーゼ又はペニシリンＧアミダーゼの配列としてそれぞれ登録されている。また、プローブハイブリダイゼーションの場合は、以下に示すようなＣｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ属の細菌から、該当する相同性レベルのＤ−サクシニラーゼのアミノ酸配列を得ることができる可能性が高い。
Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ ｏｘａｌａｔｉｃｕｓ；
Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ ｇｉｌａｒｄｉｉ；
Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ ｂａｓｉｌｅｎｓｉｓ；
Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ ｃａｍｐｉｎｅｎｓｉｓ；
Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ ｐａｕｃｕｌｕｓ；
Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ ｐｉｎａｔｕｂｏｎｅｎｓｉｓ；
Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ ｒｅｓｐｉｒａｃｕｌｉ；
Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ ｓｐ。
なお、上述のＣｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ属の細菌の中には、Ｒａｌｓｔｏｎｉａ（ラルストニア）属の細菌として文献に表記されているものもあるが、Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ属が正式な属名として一般的に使用されてきている。これらの細菌の学術名は、将来の再分類により、統一又は変更される可能性がある。

本発明の第３の側面において、改変のベースとするＤ−サクシニラーゼは、Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ ｓｐ．Ｐ４−１０−Ｃ株の近縁種からの野生型Ｄ−サクシニラーゼに限定されず、これらの野生型Ｄ−サクシニラーゼに何らかの変異を生じさせたものも、配列番号２と７０％以上の相同性を有する限り、改変のベースとして使用することができる。

本発明の第３の側面において、改変は、これらのベースとするＤ−サクシニラーゼのアミノ酸配列中の、配列番号２の７２位、１８１〜１８５位、３０５位、３４８位、３５１位、４６１位、及び５３９位のうちのいずれかと同等な位置のアミノ酸残基を、本発明の第１の側面の改変型Ｄ−サクシニラーゼと同じアミノ酸残基に置換することによって行われる。ここで、「配列番号２の７２位、１８１〜１８５位、３０５位、３４８位、３５１位、４６１位、及び５３９位のうちのいずれかと同等な位置」は、ベースとするＤ−サクシニラーゼのアミノ酸配列を配列番号２のアミノ酸配列とアラインメントさせることによって特定することができる。アラインメントは、Ｂｌａｓｔなどの公知のアルゴリズムに基づく市販のアミノ酸配列解析ソフトを使用して容易に行うことができる。例えば、先に例示したＣｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ属の細菌のうち、Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ ｎｅｃａｔｏｒ及びＣｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ ｔａｉｗａｎｅｎｓｉｓのＤ−サクシニラーゼのアミノ酸配列の場合、配列番号２のアミノ酸配列とのアラインメント結果は、図３に示す通りであり、図３中の網掛けされた位置のアミノ酸残基が「配列番号２の７２位、１８１〜１８５位、３０５位、３４８位、３５１位、４６１位、及び５３９位のうちのいずれかと同等な位置」のアミノ酸残基に相当する。アミノ酸置換は、例えばＴｒａｎｓｆｏｒｍｅｒＭｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ；Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ製、ＥＸＯＩＩＩ／Ｍｕｎｇ Ｂｅａｎ Ｄｅｌｅｔｉｏｎ Ｋｉｔ；Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ製、ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ Ｓｉｔｅ Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ；Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ製、ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ；東洋紡製などの市販のキットやＰＣＲ法を利用して、ベースとするＤ−サクシニラーゼのアミノ酸配列に相当する塩基配列を部位特異的に変異させることによって行うことができる。得られた遺伝子によってコードされるタンパク質の活性は、例えば、得られた遺伝子を大腸菌に導入して形質転換体を作成し、この形質転換体を培養して酵素タンパク質を生成させ、この形質転換体、この形質転換体の菌体破砕液もしくは精製した酵素タンパク質をＮ−サクシニル−ＤＬアミノ酸に添加してＤ体に対するＬ体の分解比率を実施例に記載の方法で測定することによって確認することができる。

また、本発明の第４の側面は、Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ ｍｅｔａｌｌｉｄｕｒａｎｓの近縁種のＤ−サクシニラーゼをベースとした改変型Ｄ−サクシニラーゼ及びその遺伝子に関する。即ち、本発明の第４の側面によれば、配列番号４と７０％以上の相同性を有するアミノ酸配列において、配列番号４の１７７位、１８０位、３４４位、３４７位、及び４５７位のうちのいずれかと同等な位置のアミノ酸残基が、本発明の第２の側面のタンパク質（Ａ）に示すアミノ酸残基に置換されているアミノ酸配列からなるタンパク質であって、Ｎ−サクシニル−ＤＬ−アミノ酸に対してＤ体選択的に作用してＤ−アミノ酸を生成する活性を有することを特徴とするタンパク質、及びこのタンパク質をコードすることを特徴とする遺伝子が提供される。

本発明の第４の側面の改変型Ｄ−サクシニラーゼは、Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ ｍｅｔａｌｌｉｄｕｒａｎｓのＤ−サクシニラーゼのアミノ酸配列である配列番号４と７０％以上、好ましくは７４％以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上、特に好ましくは９５％以上の相同性を有するＤ−サクシニラーゼをベースとする。このような相同性レベルを有するアミノ酸配列は、公知のアミノ酸配列のデータベースに基づく相同性検索や、Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ ｍｅｔａｌｌｉｄｕｒａｎｓのＤ−サクシニラーゼの遺伝子のＤＮＡ断片をプローブとしたハイブリダイゼーションにより得ることができ、具体的なアミノ酸配列としては、本発明の第３の側面で例示したものと同様のものが例示される。
本発明の第４の側面において、改変のベースとするＤ−サクシニラーゼは、Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ ｍｅｔａｌｌｉｄｕｒａｎｓの近縁種からの野生型Ｄ−サクシニラーゼに限定されず、これらの野生型Ｄ−サクシニラーゼに何らかの変異を生じさせたものも、配列番号４と７０％以上の相同性を有する限り、改変のベースとして使用することができる。
本発明の第４の側面において、改変は、これらのベースとするＤ−サクシニラーゼのアミノ酸配列中の、配列番号４の１７７位、１８０位、３４４位、３４７位、及び４５７位のうちのいずれかと同等な位置のアミノ酸残基を、本発明の第２の側面の改変型Ｄ−サクシニラーゼと同じアミノ酸残基に置換することによって行われる。ここで、「配列番号４の１７７位、１８０位、３４４位、３４７位、及び４５７位のうちのいずれかと同等な位置」は、ベースとするＤ−サクシニラーゼのアミノ酸配列を配列番号４のアミノ酸配列とアラインメントさせることによって特定することができる。アラインメントは、Ｂｌａｓｔなどの公知のアルゴリズムに基づく市販のアミノ酸配列解析ソフトを使用して容易に行うことができる。例えば、先に例示したＣｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ属の細菌のうち、Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ ｎｅｃａｔｏｒ及びＣｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ ｔａｉｗａｎｅｎｓｉｓのＤ−サクシニラーゼのアミノ酸配列の場合、配列番号４のアミノ酸配列とのアラインメント結果は、図３に示す通りであり、図３中の網掛けされた位置のアミノ酸残基が「配列番号４の１７７位、１８０位、３４４位、３４７位、及び４５７位のうちのいずれかと同等な位置」のアミノ酸残基に相当する。アミノ酸置換の方法、及び得られたタンパク質の活性の確認方法は、第３の側面と同様であるので、説明を省略する。

次に、本発明の改変型Ｄ−サクシニラーゼの製造方法について説明する。本発明の改変型Ｄ−サクシニラーゼは、その遺伝子を適当なベクターに挿入して組換えベクターを調製し、この組換えベクターで適当な宿主細胞を形質転換して形質転換体を調製し、この形質転換体を培養することによって容易に製造することができる。

ベクターとしては、原核および／または真核細胞の各種宿主細胞内で複製保持または自律増殖できるものであれば特に限定されず、プラスミドベクターおよびファージベクター、ウィルスベクター等が包含される。組換えベクターの調製は、常法に従って行えばよく、例えば、これらのベクターに、本発明の改変型Ｄ−サクシニラーゼの遺伝子を適当な制限酵素およびリガーゼ、あるいは必要に応じてさらにリンカーもしくはアダプターＤＮＡを用いて連結することにより容易に行うことができる。また、Ｔａｑポリメラーゼのように増幅末端に一塩基を付加するようなＤＮＡポリメラーゼを用いて増幅作製した遺伝子断片であれば、ＴＡクローニングによるベクターへの接続も可能である。

また、宿主細胞としては、従来公知のものが使用可能であり、組換え発現系が確立しているものであれば特に制限されないが、好ましくは大腸菌、枯草菌、放線菌、麹菌、酵母といった微生物ならびに昆虫細胞、動物細胞、高等植物などが挙げられ、より好ましくは微生物が挙げられ、特に好ましくは大腸菌（例えば、Ｋ１２株、Ｂ株など）が挙げられる。形質転換体の調製は、常法に従って行えばよい。

得られた形質転換体を、その宿主細胞に応じた適当な培養条件で一定期間培養すれば、組込まれた遺伝子から本発明の改変型Ｄ−サクシニラーゼが発現されて、形質転換体中に蓄積する。

形質転換体中に蓄積した本発明の改変型Ｄ−サクシニラーゼは、未精製のまま用いることができるが、精製したものを使用しても良い。この精製方法としては、従来公知のものが使用可能であり、例えば、培養後の形質転換体あるいはその培養物を適当な緩衝液中でホモジナイズし、超音波処理や界面活性剤処理等により細胞抽出液を得、そこからタンパク質の分離精製に常套的に利用される分離技術を適宜組み合わせることにより行うことができる。このような分離技術としては、塩析、溶媒沈澱法等の溶解度の差を利用する方法、透析、限外濾過、ゲル濾過、非変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）、ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）などの分子量の差を利用する方法、イオン交換クロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーなどの荷電を利用する方法、アフィニティークロマトグラフィーなどの特異的親和性を利用する方法、逆相高速液体クロマトグラフィーなどの疎水性の差を利用する方法、等電点電気泳動などの等電点の差を利用する方法などが挙げられるが、これらに限定されない。

次に、本発明の改変型Ｄ−サクシニラーゼを用いてＤ−アミノ酸を製造する方法について説明する。本発明によるＤ−アミノ酸は、本発明の改変型Ｄ−サクシニラーゼを用いてＮ−サクシニル−ＤＬ−アミノ酸（ラセミ体）中のＮ−サクシニル−Ｄ−アミノ酸（Ｄ体）を特異的に加水分解する工程によって製造される。

この工程は、具体的には、適当な溶液中に、本発明の改変型Ｄ−サクシニラーゼと原料のＮ−サクシニル−ＤＬ−アミノ酸を溶解させて反応液を調製し、この反応液を適当な条件で反応させることによって行うことができる。

使用する溶液は、蒸留水でもよいが、必要により、リン酸塩やトリスなどの緩衝剤を使用してもよい。緩衝剤を使用する場合、その濃度は２０〜２００ｍＭであることが好ましく、ｐＨは６〜８であることが好ましい。

本発明の改変型Ｄ−サクシニラーゼは、反応液中１０〜３０００ｍｇ／Ｌ（１００〜３００００Ｕ／Ｌ）の濃度で使用されることが好ましい。

本発明の改変型Ｄ−サクシニラーゼと反応させるＮ−サクシニル−ＤＬ−アミノ酸は、種々の公知の方法によって合成することができ、例えばＳａｋａｉ Ａ．ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２００６，４５（１４），４４５５−６２に記載の方法によって合成することができる。原料のＤＬ−アミノ酸の種類は、製造したいＤ−アミノ酸の種類に応じて適宜選択すればよく、天然に存在する２０種のアミノ酸およびビフェニルアラニン、シクロヘキシルグリシン、４−ブロモフェニルアラニンなどの非天然アミノ酸およびその誘導体であることができる。反応液中のＮ−サクシニル−ＤＬ−アミノ酸の濃度は、特に限定されないが、一般的に１重量％〜３０重量％である。

本発明のＤ−アミノ酸の製造方法では、反応液を反応させる温度は、本発明の改変型Ｄ−サクシニラーゼが十分作用する温度であれば特に限定されないが、一般的には５〜６０℃が好ましく、１０〜５５℃がより好ましく、３０〜５０℃がさらに好ましい。また、反応時のｐＨは、本発明の改変型Ｄ−サクシニラーゼが十分作用するｐＨであれば特に限定されないが、一般的にはｐＨ５〜１０が好ましく、ｐＨ６〜９がより好ましい。反応時間は、特に限定されないが、一般的に１〜１２０時間程度、好ましくは１〜７２時間程度、さらに好ましくは１〜２４時間程度である。反応時間は、製造したいＤ−アミノ酸の種類と所望の収量、収率、使用する酵素や基質の量、量比、反応温度や反応ｐＨなどを考慮し、実験的に適宜選択することができる。

なお、本発明のＤ−アミノ酸の製造方法で使用する改変型Ｄ−サクシニラーゼは、精製されたものや未精製のもの（粗酵素液など）に限定されず、形質転換体中に含まれた状態のものであってもよい。この場合は、形質転換体を反応系に添加して、形質転換体を培養させながら同時に反応を進行させるか、又は予め培養された形質転換体を反応系に添加すればよい。

好ましくは、本発明のＤ−アミノ酸の製造方法は、Ｎ−サクシニルアミノ酸ラセマーゼを用いてＮ−サクシニル−Ｌ−アミノ酸をラセミ化してＮ−サクシニル−Ｄ−アミノ酸を生成させる工程をさらに含む。本発明の改変型Ｄ−サクシニラーゼは、Ｎ−サクシニル−ＤＬ−アミノ酸（ラセミ体）中のＮ−サクシニル−Ｄ−アミノ酸を主に加水分解するため、このままではラセミ体のうち、Ｎ−サクシニル−Ｌ−アミノ酸の多くが無駄になってしまう。そこで、Ｎ−サクシニルアミノ酸ラセマーゼを用いてＮ−サクシニル−Ｌ−アミノ酸をラセミ化してＮ−サクシニル−Ｄ−アミノ酸を生成させてやれば、残ったＮ−サクシニル−Ｌ−アミノ酸もＤ−アミノ酸に変換することができる。

Ｎ−サクシニルアミノ酸ラセマーゼは、Ｎ−サクシニルアミノ酸のＬ体をＤ体に変換する反応とＤ体をＬ体に変換する反応の両方を触媒してその比率をほぼ等しく（ラセミ化）する酵素である。本発明の製造方法で使用するＮ−サクシニルアミノ酸ラセマーゼは、Ｎ−サクシニルアミノ酸をラセミ化することができれば特に限定されず、特開２００７−８２５３４号公報に記載されたＮ−アシルアミノ酸ラセマーゼや特開２００８−６１６４２号公報に記載されたＮ−アシルアミノ酸ラセマーゼなどの従来公知のものを使用することができる。

Ｎ−サクシニルアミノ酸ラセマーゼを用いてＮ−サクシニル−Ｄ−アミノ酸をラセミ化する反応は、例えば以下の条件でＮ−サクシニルアミノ酸、Ｎ−サクシニルアミノ酸ラセマーゼおよび緩衝剤を含む反応溶液中で混合することにより行なう。反応温度は、使用するＮ−サクシニルアミノ酸ラセマーゼが十分作用する温度であれば特に限定されないが、一般的には２５〜７０℃が好ましく、３７〜６０℃がより好ましい。反応時のｐＨは、使用するＮ−サクシニルアミノ酸ラセマーゼが十分作用するｐＨであれば特に限定されないが、一般的にはｐＨ５〜９が好ましく、ｐＨ６〜８がより好ましい。Ｎ−サクシニルアミノ酸ラセマーゼは、反応液中５０〜１５０００ｍｇ／Ｌ（５０００〜１５０００００Ｕ／Ｌ）の濃度で使用されることが好ましい。Ｎ−サクシニルアミノ酸ラセマーゼは、２価の金属イオンを０．１ｍＭ〜１Ｍ（好ましくは０．１〜１ｍＭ）の終濃度で添加することにより、活性が著しく向上する。添加する２価の金属イオンとしては、Ｍｎ^２＋，Ｃｏ^２＋，Ｍｇ^２＋，Ｆｅ^２＋およびＮｉ^２＋が挙げられる。Ｎ−サクシニルアミノ酸ラセマーゼの反応に用いる緩衝剤は、Ｄ−サクシニラーゼの反応に用いる緩衝剤と同様のものが使用できる。なお、特開２００７−８２５３４号に記載のＮ−アシルアミノ酸ラセマーゼは、その後の研究により、Ｎ−サクシニルアミノ酸をより好適な基質とするＮ−サクシニルアミノ酸ラセマーゼであることが判明している。従って、特開２００７−８２５３４号に記載のＮ−アシルアミノ酸ラセマーゼは、本発明のＤ−サクシニラーゼと組合せて使用することができる。

前述のＮ−サクシニルアミノ酸ラセマーゼによるラセミ化反応とＤ−サクシニラーゼによる加水分解反応は、別々に行なうことも可能であるが、同時に行なわれることが好ましい。同時に行われる場合、微視的に見ると、まずＮ−サクシニル−ＤＬ−アミノ酸のうちＤ体が本発明のＤ−サクシニラーゼにより加水分解（脱サクシニル化）され、目的のＤ−アミノ酸が生成する。基質のＤ体が消費されるとラセミ状態が解消されるため、Ｎ−サクシニルアミノ酸ラセマーゼはＬ体をＤ体に変換する反応をより促進する。Ｎ−サクシニルアミノ酸ラセマーゼにより生成したＮ−サクシニル−Ｄ−アミノ酸は、本発明のＤ−サクシニラーゼにより順次Ｄ−アミノ酸へと分解される。この繰返しにより、理論的にはほぼすべてのＮ−サクシニル−ＤＬ−アミノ酸をＤ−アミノ酸に変換することができる。ラセミ化反応および加水分解反応を同時に行う場合の反応条件は、Ｎ−サクシニルアミノ酸ラセマーゼおよび本発明のＤ−サクシニラーゼが活性を発揮する条件の範囲内であれば特に限定しないが、基質濃度１重量％〜３０重量％、ｐＨ６〜８、温度４０〜５０℃で行うことが好ましい。ラセミ化反応および加水分解反応に要する時間は、原料として用いるＮ−サクシニル−ＤＬ−アミノ酸が、所望する量のＤ−アミノ酸へと変換し得るまでの時間であれば特に制限されず、仕込み量によっても異なるが、一般的に１日〜７日程度である。

以下、本発明を実施例により、具体的に説明するが、本発明の範囲は下記の実施例に限定されることはない。

本実施例において、Ｎ−サクシニルトリプトファン、Ｎ−サクシニルフェニルアラニン、Ｎ−サクシニルビフェニルアラニンの定量は、特に記載がない場合は、目的に応じて、以下の分析条件で定量した。

Ｎ−サクシニル−Ｄ−アミノ酸又はＮ−サクシニル−Ｌ−アミノ酸などの光学活性体を定量する場合は、ジーエルサイエンス社製「Ｉｎｅｒｔｓｉｌ ＯＤＳ−３」（５μｍ、４．６×１００ｍｍ）を利用した高速液体クロマトグラフィーにより行った。

Ｎ−サクシニルトリプトファンの分析
移動相：ｐＨ２．３リン酸水溶液／アセトニトリル＝７５／２５
流速：０．７ｍｌ／ｍｉｎ
カラム温度：４０℃
検出：ＵＶ２８０ｎｍ

Ｎ−サクシニルフェニルアラニンの分析
移動相：ｐＨ２．３リン酸水溶液／アセトニトリル＝７５／２５
流速：０．７ｍｌ／ｍｉｎ
カラム温度：４０℃
検出：ＵＶ２１０ｎｍ

Ｎ−サクシニルビフェニルアラニンの分析
移動相：ｐＨ２．３リン酸水溶液／アセトニトリル＝７５／２５
流速：１．５ｍｌ／ｍｉｎ
カラム温度：４０℃
検出：ＵＶ２５４ｎｍ

また、光学純度を測定する際には、ダイセル化学工業株式会社製光学分割カラム「ＣＨＩＲＡＬＰＡＫ ＱＮ−ＡＸ」（５μｍ、４．６×１５０ｍｍ）により行った。分析条件は以下に示した通りである。

Ｎ−サクシニルトリプトファン、Ｎ−サクシニルフェニルアラニン及びＮ−サクシニルビフェニルアラニンの分析
移動相：メタノール／０．２Ｍ酢酸＝９０／１０（Ｖ／Ｖ）アンモニアでｐＨ７．０
に調製
流速：１．０ｍｌ／ｍｉｎ
カラム温度：３５℃
検出：ＵＶ２１０ｎｍ

また、Ｎ−サクシニルアミノ酸が加水分解（脱サクシニル化）されて生成する遊離体のＤ−アミノ酸及びＬ−アミノ酸を定量する際は、ダイセル化学工業株式会社製光学分割カラム「ＣＲＯＷＮＰＡＫ ＣＲ（＋）」（５μｍ、４．０×１５０ｍｍ）により行った。分析条件は以下に示した通りである。

ＤＬ−トリプトファンの分析
移動相：過塩素酸水溶液（ｐＨ２．０）／メタノール＝９０／１０
流速：０．７ｍｌ／ｍｉｎ
カラム温度：１５℃
検出：ＵＶ２８０ｎｍ

ＤＬ−フェニルアラニンの分析
移動相：過塩素酸水溶液（ｐＨ２．０）
流速：１．２ｍｌ／ｍｉｎ
カラム温度：１５℃
検出：ＵＶ２１０ｎｍ

ＤＬ−ビフェニルアラニンの分析
移動相：過塩素酸水溶液（ｐＨ２．０）／メタノール＝８５／１５
流速：１．５ｍｌ／ｍｉｎ
カラム温度：５０℃
検出：ＵＶ２５４ｎｍ

本発明におけるＤ−サクシニラーゼの活性は、以下のＤ−アミノ酸オキシダーゼ法により測定することができる。
＜試薬＞
１４ｍＭ Ｎ−サクシニル−Ｄ−バリン
２．５（Ｕ／ｍＬ） ペルオキシダーゼ（東洋紡製ＰＥＯ−３０２）
１．５ｍＭ ４−アミノアンチピリン（第一化学薬品製）
２．４ｍＭ ＴＯＯＳ（同人化学研究所製）
６．０（Ｕ／ｍＬ） Ｄ−アミノ酸オキシダーゼ（バイオザイム製ＤＯＸ２）
を含む２５ｍＭリン酸緩衝溶液を反応試薬とする。
なお、Ｎ−サクシニル−Ｄ−トリプトファンに対する酵素活性を測定する際には、１４ｍＭ Ｎ−サクシニル−Ｄ−バリンの代わりに、３３ｍＭ Ｎ−サクシニル−Ｄ−トリプトファンを使用した。
Ｎ−サクシニル−Ｄ−バリンの合成は以下のようにして行った。Ｄ−バリン（ナカライテスク製、４．７ｇ）と無水コハク酸（ナカライテスク製、４．０ｇ）を４０ｍＬの酢酸（ナカライテスク製）に溶解した。溶液を５０〜６０℃に加熱し、溶媒を揮発させて結晶化した。次に、結晶化した白い沈殿を集めて、酢酸エチル２０ｍＬとメタノール２０ｍＬの混合液にて再結晶化した。沈殿を乳鉢で破砕し、乾燥させ、Ｎ−サクシニル−Ｄ−バリンを得た。詳細はＳａｋａｉ Ａ．ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２００６，４５（１４），４４５５−６２に記載されている。
＜測定条件＞
反応試薬３．０ｍＬを３７℃で５分間予備加温する。酵素溶液０．１ｍＬを添加しゆるやかに混和後、水を対照に３７℃に制御された分光光度計で、５５５ｎｍの吸光度変化を５分記録し、直線部分から１分間あたりの吸光度変化（ΔＯＤ_ＴＥＳＴ）を測定する。盲検は、酵素溶液の代わりに酵素を溶解する溶液を試薬混液に加えて同様に１分間あたりの吸光度変化（ΔＯＤ_{ＢＬＡＮＫ}）を測定する。これらの値から次の式に従ってＤ−サクシニラーゼ活性を求める。ここでＤ−サクシニラーゼ活性における１単位（Ｕ）とは、上記条件下で１分間に１マイクロモルのＤ−アミノ酸を生成する酵素量として定義する。

活性（Ｕ／ｍＬ）＝
｛（ΔＯＤ_ＴＥＳＴ−ΔＯＤ_{ＢＬＡＮＫ}）×３．１×希釈倍率｝／｛３１．０×１／２×０．１×１．０｝

なお、式中の３．１は反応試薬＋酵素溶液の液量（ｍＬ）、３１．０は本活性測定条件におけるミリモル分子吸光係数（ｃｍ^２／マイクロモル）、１／２は酵素反応で生成したＨ_２Ｏ_２の１分子から形成するＱｕｉｎｏｎｅｉｍｉｎｅ色素が１／２分子であることによる係数、０．１は酵素溶液の液量（ｍＬ）、１．０はセルの光路長（ｃｍ）を示す。

また、Ｎ−サクシニルアミノ酸ラセマーゼの活性測定は、以下に述べる方法で行った。
ＨＥＰＥＳ（１．０Ｍ／ｐＨ７．９）を１０μｌ（終濃度１００ｍＭ）、酢酸コバルトを１μｌ（終濃度０．１ｍＭ）滅菌蒸留水を４９μｌを混和し、この溶液に酵素液１０μｌを加え、この反応液に、基質となるＮ−サクシニル−Ｄ−フェニルアラニン溶液を３０μｌ（終濃度６０ｍＭ）を加えて３０℃で反応を行い、適当な時間で移動相（メタノール／０．２Ｍ酢酸＝９０／１０（Ｖ／Ｖ）アンモニアでｐＨ７．０に調製したもの）により反応停止させた。生成したＮ−サクシニル−Ｌ−フェニルアラニンを高速液体クロマトグラフィーにより定量し、酵素活性を算出する。酵素活性はＮ−サクシニル−Ｄ−フェニルアラニンからＮ−サクシニル−Ｌ−フェニルアラニンが１分間に１μｍｏｌｅ生成された場合を１ｕｎｉｔ（Ｕ）と定義した。

参考例１ Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ ｓｐ．Ｐ４−１０−Ｃ株由来Ｄ−サクシニラーゼ遺伝子（以下、Ｐ４ＤＳＡ遺伝子と称する）のクローニング
（１）野生型Ｄ−サクシニラーゼの精製
Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ ｓｐ．Ｐ４−１０−Ｃ株（日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１ 中央第６の独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センターに受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−１１３８７として２０１１年６月２８日に国際寄託済）を、普通ブイヨン“栄研”１．８％に、粉末酵母エキスＤ−３ ０．２％（和光純薬工業（株）製、Ｃｏｄｅ：３９０−００５３１）、カザミノ酸「ダイゴ」０．１％（和光純薬工業（株）製、Ｃｏｄｅ：３９２−００６５５）、リン酸水素二カリウム０．３％、及びグルコース０．２％を添加したｐＨ７．５の培地で培養した。具体的には、５００ｍＬフラスコに上記培地２００ｍＬを加えオートクレーブ滅菌した培地２７本を用い、３５℃、１５０ｒ／ｍｉｎ、回転攪拌で２日間培養した。培養終了時の濁度（ＡＢＳ６６０ｎｍ）は２．７であり、ｐＨは８．６であった。培養後、冷却遠心分離機（日立工機（株）製）を用い、８０００ｒ／ｍｉｎで３０分間遠心分離を行い、集菌した。集菌した菌体を、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ（ｐＨ７．５）緩衝液で洗浄した後、再度遠心分離し、菌体を３６ｇ得た。取得菌体量の約３倍の２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ（ｐＨ７．５）緩衝液１００ｍＬで懸濁後、氷冷下の超音波細胞破砕装置 ＢＤ−１（東湘電気（株）製）を用い、５分サイクルで１０回超音波破砕を行った。破砕後、高速冷却遠心機（日立工機（株）製）で８０００ｒ／ｍｉｎ、４℃、６０分間遠心分離し、上清液１７８ｍＬを得た。これを粗酵素液とした。なお、本菌株は培養時にＮ−サクシニル−Ｄ−フェニルアラニンを添加しなくともＤ−サクシニラーゼを産生した。粗酵素液を透析チューブに詰め、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ（ｐＨ７．５）１．２Ｍ硫酸アンモニウム含有緩衝液中に投入し、低温室内（４℃）で攪拌を行いながら、数回緩衝液を交換し、一昼夜透析を行った。透析終了後、高速冷却遠心機（日立工機（株）製）で４０００ｒ／ｍｉｎ、４℃、３０分間遠心分離し、上清液１００ｍＬを得た。この上清液１００ｍＬを、予め２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ（ｐＨ７．５）１．２Ｍ硫酸アンモニウム含有緩衝液で平衡化したＢｕｔｙｌ−ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ ６５０Ｍカラム（東ソー（株）製）（３．２ｃｍφ×２０ｃｍ）に供して目的酵素を吸着させ、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ（ｐＨ７．５）１．２Ｍ硫酸アンモニウム含有緩衝液と２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ（ｐＨ７．５）緩衝液を総量２０００ｍＬ用い、直線濃度勾配法で酵素を溶出し、Ｄ−サクシニラーゼ活性のある画分を回収した。Ｂｕｔｙｌ−ＴＯＹＯＰＥＡＲＬで得られた活性画分を７０％硫酸アンモニウム飽和にて濃縮し、遠心分離１０，０００ｒ／ｍｉｎ、４℃、６０分間にて沈殿を回収した。回収した硫安沈殿を、５ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）で透析した。この透析した酵素液３３ｍＬを、予め５ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）で平衡化したＭａｃｒｏ−Ｐｒｅｐ ＣＨＴ ＴｙｐｅＩ（ＢＩＯ−ＲＡＤ社製）ハイドロキシアパタイトカラム（１．６ｃｍφ×２０ｃｍ）に吸着させた。次に、５ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）と３００ｍＭ リン酸緩衝液（ｐＨ７．２）を総量１５０ｍＬ用いて直線濃度勾配法で酵素を溶出し、Ｄ−サクシニラーゼ活性のある画分を回収した。Ｍａｃｒｏ−Ｐｒｅｐ ＣＨＴ ＴｙｐｅＩにより得られた活性画分１３０ｍＬを、ビバスピン ２０（ザルトリウス（株）製）分画分子量１００００の限外ろ過膜を用いて、２０ｍＬに濃縮した。回収した濃縮液を、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ（ｐＨ７．５）酸緩衝液で透析した。この透析液を、予め２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ（ｐＨ７．５）緩衝液で平衡化したＨｉ Ｔｒａｐ Ｑ Ｆ．Ｆ．カラム５ｍＬ（ＧＥヘルスケア バイオサイエンス社製）に供し、続いて２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ（ｐＨ７．５）と２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ（ｐＨ７．５）０．３Ｍ塩化ナトリウム酸緩衝液を総量２００ｍＬ用いて直線濃度勾配法で酵素を溶出し、Ｄ−サクシニラーゼ活性のある画分を回収した。Ｄ−サクシニラーゼ活性が確認された画分の少量を定法のＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）分析に供し、不純蛋白質が混在しない画分を回収し、新規Ｄ−サクシニラーゼを得た。精製後の電気泳動結果を図１に示す。

（２）部分アミノ酸配列の取得
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ後に該酵素に相当するバンドをアクリルアミドゲル上からＰＶＤＦ膜（Ｂｉｏ−Ｒａｄ：シーケ−ブロットＰＶＤＦメンブレン）に転写し、Ｎ末端アミノ酸配列分析、及び内部アミノ酸配列分析を行い、約６０ｋＤａのバンドから内部アミノ酸配列；ＳＮＮＷＶＩＡＧＳＲＴＳＴＧＲ、約２３ｋＤａのバンドからＮ末端アミノ酸配列；ＡＰＰＴＤＲＹＡＡＰＧＬＥＫＰと内部アミノ酸配列；ＭＡＲＤＦＧＰＡＹＶＤＧＤＲＲを得た。

（３）染色体ＤＮＡの調製
培養液５０ｍＬの菌体を遠心分離操作に供し、ゲノム抽出キット（東洋紡：Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ）を用いて、そのプロトコールに従ってゲノム精製を行った。しかし、本キットで精製したゲノムＤＮＡでは全長配列のクローニングのためのＰＣＲ反応において、長鎖のＤＮＡ断片を増幅させることができなかった。ＰＣＲ条件を検討しても改善は見られなかったため、これはゲノムＤＮＡの純度に問題があると考え、「ｃｕｒｒｅｎｔ ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ ｍｏｌｕｃｕｌａｒ ｂｉｏｌｏｇｙ」に記載されている公知の方法に基づいて、再びゲノムＤＮＡの抽出を行った。まず、５０ｍＬの培地で培養し、集菌した菌体をＴＥ（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、２０ｍＭ ＥＤＴＡ）に懸濁して洗浄し、遠心分離操作により菌体を回収した後、再びこの菌体を１１．３ｍＬのＴＥに懸濁した。さらに、この懸濁液に０．０６ｍｌの２０ｍｇ／ｍＬプロテイナーゼＫ溶液、０．６ｍＬの１０％ＳＤＳ溶液を加えた後、３７℃で１時間インキュベートした。インキュベート後、２ｍＬの５Ｍ ＮａＣｌ溶液を加えて十分に攪拌し、１．６ｍＬのＣＴＡＢ／ＮａＣｌ溶液（１０％ ＣＴＡＢ／０．７Ｍ ＮａＣｌ）を混合し、６５℃で１０分間インキュベートした。インキュベート後、等量の２５／２４／１＝フェノール／クロロホルム／イソアミルアルコール溶液で除タンパクを行った。通常の細菌であれば、この工程で水層に濁りは見られないが、本菌においては濁りが残っていた。そこで、もう一度、等量の２５／２４／１＝フェノール／クロロホルム／イソアミルアルコール溶液で除タンパクを行った。これにより、濁りが完全に除去されたので、続いて、分離した水層に対して等量の２４／１＝クロロホルム／イソアミルアルコールを加えて混合し、水層を回収した。これと等量のイソプロパノールを加えてＤＮＡを沈殿させ、回収した。沈殿したＤＮＡを０．５ｍＬのＴＥに溶解した後、５μｌの１０ｍｇ／ｍＬ ＲＮａｓｅを加えて、３７℃で一晩反応させた。反応後、等量の２５／２４／１＝フェノール／クロロホルム／イソアミルアルコール溶液で除タンパクを行い、２４／１＝クロロホルム／イソアミルアルコールを加えて攪拌し、水層を回収した。この操作をさらに２回行った後に得られた水層に終濃度０．４Ｍとなるように３Ｍ酢酸ナトリウム溶液（ｐＨ５．２）を加え、さらに２倍容のエタノールを加えた。沈殿となって生じたＤＮＡを回収し、７０％エタノールで洗浄、乾燥させ、１ｍＬのＴＥに溶解させた。

（４）Ｐ４ＤＳＡ遺伝子の全長配列取得
上記（２）で同定したアミノ酸配列をもとに縮重プライマーを合成し（表１の配列番号５、６）、Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ ｓｐ．Ｐ４−１０−Ｃから、上記（３）で抽出したゲノムＤＮＡを鋳型として、ＤＮＡポリメラーゼＫＯＤ−Ｐｌｕｓ（東洋紡製）を用いて推奨する条件のもとＰＣＲを行った。該ＰＣＲで増幅されたＰＣＲ産物をクローニングキットＴａｒｇｅｔ Ｃｌｏｎｅ−Ｐｌｕｓ（東洋紡製）を用いて、そのプロトコールに従って操作を行い、ベクターｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔにクローニングし、エシェリヒア・コリー（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）ＤＨ５α株コンピテントセル（東洋紡製）に形質転換し、該形質転換体を取得した。該形質転換体をＬＢ培地で培養し、プラスミドを抽出し、ＢｉｇＤｙｅ（商標登録）Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ ｖ３．１ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）により遺伝子配列を確認し、部分配列５７５ｂｐを取得した。さらに、全長配列を取得するために以下のような操作を行った。ＴＡＫＡＲＡ ＬＡ ＰＣＲ Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（タカラバイオ製）を用いて、そのプロトコールに従って操作を行い、既知配列からＣ末端方向へのＤＮＡ断片を増幅させることに成功し、開始コドンを含むＮ末端から既知の部分遺伝子配列までの塩基配列を決定した。しかしながら、上記キットではＣ末端側の塩基配列を決定することができなかったため、既知の塩基配列に基づき、遺伝子の外側方向に向けた２種類のプライマー（表１の配列番号７、８）を新たに設計した。このプライマーを用い、先に得たＤＮＡを鋳型にＩｎｖｅｒｓｅ ＰＣＲ法を行った。これにより、既に取得した部分遺伝子より外側の遺伝子部分を含むＤＮＡ断片を取得し、Ｃ末端配列を決定した。続いて、酵素のＮ末端より上流と推定される部分にＮｄｅＩの切断部位を結合させた配列を有するＤＮＡプライマー（表１の配列番号９）とＣ末端より下流と推定される部分にＥｃｏＲＩの切断部位を結合させた配列を有するＤＮＡプライマー（表１の配列番号１０）を用いて、この配列の間のＤＮＡを先に得たＤＮＡを鋳型にしたＰＣＲにより増幅することでサクシニラーゼ遺伝子の全長を含むＤＮＡ断片を取得した。得られたＤＮＡ断片の塩基配列を解析し、Ｄ−サクシニラーゼ遺伝子の全長が含まれていることを確認し、そのアミノ酸配列を推定した。得られた塩基配列及びアミノ酸配列をそれぞれ、配列表の配列番号１及び２に示す。

（５）取得できたＰ４ＤＳＡの塩基配列
上記（４）で得られたＣｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ ｓｐ．Ｐ４−１０−Ｃ株由来Ｄ−サクシニラーゼ遺伝子をＮＣＢＩ−ＢＬＡＳＴ（ｈｔｔｐ：／／ｂｌａｓｔ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／Ｂｌａｓｔ．ｃｇｉ）により検索すると、Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ ｍｅｌａｌｌｉｄｕｒａｎｓ ＣＨ３４のｐｅｐｔｉｄａｓｅ Ｓ４５，ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ ａｍｉｄａｓｅ（ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ Ｎｏ．ＹＰ＿５８７７６３）として登録されている遺伝子と７６％の相同性を示した。このｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ ａｍｉｄａｓｅが属しているｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ ａｃｙｌａｓｅファミリーは、ペニシリンＧやセファロスポリンＣ等を加水分解する酵素であり、このような酵素がＮ−サクシニル−Ｄ−アミノ酸を加水分解することを推定することは困難であり、機能から予測してホモロジー検索により本遺伝子を取得することは不可能に近いものであった。

参考例２ Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ ｍｅｔａｌｌｉｄｕｒａｎｓ株由来Ｄ−サクシニラーゼ遺伝子（以下、ＣｍＤＳＡ遺伝子と称する）のクローニング
また、Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ ｓｐ．Ｐ４−１０−Ｃの近縁種であるＣｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ ｍｅｔａｌｌｉｄｕｒａｎｓ由来のＤ−サクシニラーゼのクローニングも行った。

（１）ＣｍＤＳＡのクローニング
独立行政法人製品評価技術基盤機構よりＣｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ ｍｅｔａｌｌｉｄｕｒａｎｓ（ＮＢＲＣ番号１０１２７２）の菌株を取得し、液体培地で培養した。培養して得た菌体から、ゲノム抽出キット（東洋紡：Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ）によりゲノムを抽出した。遺伝子特異的プライマーを合成し（表７の配列番号４３、４４）、得られたゲノムを鋳型にＤＮＡポリメラーゼＫＯＤ−Ｐｌｕｓ（東洋紡製）を用いたＰＣＲにより遺伝子を取得した。クローニングキットＴａｒｇｅｔ Ｃｌｏｎｅ−Ｐｌｕｓ（東洋紡製）を用いて、そのプロトコールに従って操作を行い、ベクターｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔにクローニングし、組換え発現プラスミドｐＣｍＤＳＡを取得した。ｐＣｍＤＳＡをエシェリヒア・コリー（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）ＤＨ５α株コンピテントセル（東洋紡製）に形質転換し、該形質転換体を取得した。該形質転換体をＬＢ培地で培養し、プラスミドを抽出し、ＢｉｇＤｙｅ（商標登録）Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ ｖ３．１ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）により遺伝子配列を確認し、アミノ酸配列を推定した。得られた塩基配列及びアミノ酸配列をそれぞれ、配列表の配列番号３及び４に示す。

参考例３ Ｐ４ＤＳＡ遺伝子発現プラスミドの構築
参考例１で得られたＤ−サクシニラーゼ遺伝子のＮ末端、Ｃ末端部分にそれぞれ制限酵素ＮｄｅＩ及びＥｃｏＲＩの切断部位を結合させた配列を有するプライマー（表１の配列番号９、１０）を用いて、この間のＤＮＡを参考例１で得たゲノムＤＮＡを鋳型にしたＰＣＲにより増幅することで、オープンリーディングフレームを含むＤＮＡ断片を取得した。このＤＮＡ断片を制限酵素ＮｄｅＩとＥｃｏＲＩで切断し、同酵素で切断したベクタープラスミドｐＢＳＫと混合し、混合液と等量のライゲーション試薬（東洋紡製ラーゲーションハイ）を加えてインキュベーションすることにより、ライゲーションを実施した。このようにライゲーションしたＤＮＡをエシェリヒア・コリーＤＨ５α株コンピテントセル（東洋紡績製コンピテントハイＤＨ５α）に当製品に添付のプロトコールに従ってそれぞれ形質転換し、該形質転換体を取得した。このようにしてＤ−サクシニラーゼ遺伝子を大量に発現できるように設計されたｐＢＳＫＰ４ＤＳＡを取得した。

参考例４ Ｐ４ＤＳＡ発現Ｅ．ｃｏｌｉの作製
参考例３で構築したプラスミド、ｐＢＳＫＰ４ＤＳＡをエシェリヒア・コリーＤＨ５α株コンピテントセル（東洋紡績製コンピテントハイＤＨ５α）に当製品に添付のプロトコールに従ってそれぞれ形質転換し、該形質転換体を取得した。

参考例５ Ｎ−サクシニルアミノ酸ラセマーゼの調製
特開２００７−８２５３４号公報の実施例に記載の方法で、Ｃｈｌｏｒｏｆｌｅｘｕｓ ａｕｒａｎｔｉａｃｕｓ（クロロフレクス・アウランチアクス）由来のＮ−サクシニルアミノ酸ラセマーゼを調製し、２５．６（ＫＵ／ｍＬ）、１００（ｍｇ／ｍＬ）の精製酵素標品を得た。

実施例１ 改変型Ｐ４ＤＳＡの調製
（１）改変型Ｐ４ＤＳＡ遺伝子を含む発現プラスミドの作成
参考例１で得られたｐＢＳＫＰ４ＤＳＡのＰ４ＤＳＡ遺伝子全長を増幅するよう設計したプライマーを用いて、Ｐ４ＤＳＡ遺伝子に変異が生じるよう、クロンテック社製、Ｄｉｖｅｒｓｉｆｙ ＰＣＲ Ｒａｎｄｏｍ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ ＫｉｔでＰＣＲ反応を実施した。続いて、反応液を制限酵素ＮｄｅＩとＥｃｏＲＩで処理後、アガロースゲル電気泳動に供し、ランダムな変異を生じたＰ４ＤＳＡ遺伝子のＮｄｅＩ＋ＥｃｏＲＩ断片をゲルから回収した。また、ｐＢＳＫＰ４ＤＳＡを制限酵素ＮｄｅＩとＥｃｏＲＩで処理し、同様にしてｐＢＳＫＰ４ＤＳＡのベクターＮｄｅＩとＥｃｏＲＩ断片を回収した。最後に、ランダムな変異を生じたＰ４ＤＳＡ遺伝子のＮｄｅＩ＋ＥｃｏＲＩ断片とｐＢＳＫＰ４ＤＳＡのＮｄｅＩ＋ＥｃｏＲＩベクター断片とをライゲーションし、ランダムな変異を有するＰ４ＤＳＡ遺伝子が挿入されたｐＢＳＫＰ４ＤＳＡのプラスミド集団を作成した。

（２）Ｄ体選択的に作用する改変型Ｄ−サクシニラーゼのスクリーニング
（１）で調製したｐＢＳＫＰ４ＤＳＡのプラスミド集団を用いて、エシェリヒア・コリーＤＨ５α株コンピテントセル（東洋紡績製コンピテントハイＤＨ５α）に、当製品に添付のプロトコールに従ってそれぞれ形質転換を行った。そうして得られたコロニー、約５，０００株をＬＢ培地（アンピシリン５０μｇ／ｍＬを含む）にそれぞれ接種し、３７℃で１６時間振とう培養した。その培養液から遠心分離により調製した菌体を、Ｎ−サクシニル−Ｄ−トリプトファン溶液（２５ｍＭ ＫＰＢ（ｐＨ７．０）、１００ｍＭ Ｎ−サクシニル−Ｄ−トリプトファン）及びＮ−サクシニル−Ｌ−トリプトファン溶液（２５ｍＭ ＫＰＢ（ｐＨ７．０）、１００ｍＭ Ｎ−サクシニル−Ｌ−トリプトファン）とそれぞれ混合し、３７℃で１６時間反応させた。その反応液の一部をＴＬＣプレート（Ｍｅｒｃｋ社製）に供し、ｎ−ブタノール：酢酸：水（３：１：１、ｖ／ｖ）からなる展開溶媒で展開し、ニンヒドリンスプレーにより、Ｄ−トリプトファン、Ｌ−トリプトファンを検出し、Ｄ−トリプトファンのスポットに対するＬ−トリプトファンのスポットの割合が野生型よりも小さい、即ち、野生型Ｐ４ＤＳＡと比較して、Ｄ体に反応しやすい変異株を選抜した。結果の一例を図２に示す。図２中、変異株２や変異株３が望ましい変異体であり、このような変異体を選抜した。そして、立体選択性が向上した変異株よりプラスミドを抽出し、Ｐ４ＤＳＡ遺伝子全塩基配列を確認し、変異箇所を同定した。その結果、７２番目、１７６番目、１８１〜１８５番目、２８６番目、３０５番目、３４８番目、３５１番目、３８８番目、４６１番目、５１８番目及び５３９番目のアミノ酸残基が立体選択性向上に寄与している部位として候補に挙がった。

（３）改変型プラスミドの構築（置換アミノ酸の至適化）
（１）で得た変異株の中には、複数のアミノ酸変異をもつ変異株もあったため、また、置換するアミノ酸の種類を検討するために、部位特異的（Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）に変異させた改変型ＤＳＡ発現プラスミドを作成した。部位特異的変異の作製には、ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社製ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔを使用した。また、変異させる際には、置換アミノ酸の至適化も行うため、（２）で立体選択性向上に寄与していると推測された７２番目、１８１〜１８５番目、３０５番目、３４８番目、３５１番目、４６１番目及び５３９番目のアミノ酸残基それぞれを２０種のアミノ酸に置換するように、かつ、２本鎖ＤＮＡのそれぞれの鎖に相補的になるように設計した合成オリゴＤＮＡプライマーをそれぞれ合成した（配列番号１１〜４２）。なお、一部の合成オリゴＤＮＡプライマーは、置換されるアミノ酸が１種類になるように、合成した。変異導入に使用した合成オリゴＤＮＡプライマーの配列を表２に示す。

改変型酵素の名称は、「野生型酵素のアミノ酸配列中のアミノ酸残基→残基番号→置換したアミノ酸残基」の順に表記する。例えば、Ｌ１８２Ｒ改変型酵素は野生型酵素のアミノ酸配列中の１８２番目のＬｅｕ（Ｌ）残基をＡｒｇ（Ｒ）残基に置換した改変型酵素であることを意味する。なお、表２中のＬ１８２ＸのＸとは、２０種類のアミノ酸のうちの任意のアミノ酸を意味するものである。

これらのプライマーを使用し、上記キットの方法に従い、参考例１にて採取した野生型Ｐ４ＤＳＡ発現プラスミドｐＢＳＫＰ４ＤＳＡを鋳型として、改変型プラスミドを作製した。例えば、Ｌ１８２Ｒの作製にあたっては、ｐＢＳＫＰ４ＤＳＡを鋳型として、配列番号１７及び１８のプライマーを用いて、以下のＰＣＲ条件で改変型Ｐ４ＤＳＡ発現プラスミドを増幅した。
９８℃ １０秒
６０℃ ３０秒
６８℃ ６分 × ２５サイクル

次に、メチル化ＤＮＡを認識して切断する制限酵素ＤｐｎＩ処理によって鋳型ｐＢＳＫＰ４ＤＳＡを切断し、得られた反応液でＥ．ｃｏｌｉ ＤＨ５αを形質転換した。形質転換体からプラスミドを回収して塩基配列を決定し、正しく変異が導入されていることを確認すると共に、コードしているアミノ酸残基を確認した。

（４）改変型Ｐ４ＤＳＡ発現Ｅ．ｃｏｌｉの作製及び粗酵素液の調製
改変型Ｐ４ＤＳＡ遺伝子搭載プラスミドを持つ大腸菌形質転換体をＬＢ培地３ｍｌ（アンピシリン５０μｇ／ｍＬを含む）に接種し、３７℃で１６時間振とう培養した。その培養液から遠心分離により調製した菌体を超音波破砕し、その遠心後の上清を改変型Ｐ４ＤＳＡの粗酵素液とした。

実施例２ 改変型Ｐ４ＤＳＡを用いたＮ−サクシニルトリプトファン及びＮ−サクシニルフェニルアラニンに対する立体選択性の評価
実施例１で調製した粗酵素液を用いて、Ｎ−サクシニルトリプトファン及びＮ−サクシニルフェニルアラニンに対する立体選択性の評価を行った。具体的には、以下の組成のＮ−サクシニル−Ｄ−アミノ酸溶液及びＮ−サクシニル−Ｌ−アミノ酸溶液のそれぞれに対して粗酵素液を添加した。
Ｎ−サクシニル−Ｄ−トリプトファン溶液：２５ｍＭ ＫＰＢ（ｐＨ７．０）、１％ Ｎ−サクシニル−Ｄ−トリプトファン
Ｎ−サクシニル−Ｌ−トリプトファン溶液：２５ｍＭ ＫＰＢ（ｐＨ７．０）、１％ Ｎ−サクシニル−Ｌ−トリプトファン
Ｎ−サクシニル−Ｄ−フェニルアラニン溶液：２５ｍＭ ＫＰＢ（ｐＨ７．０）、１％ Ｎ−サクシニル−Ｄ−フェニルアラニン
Ｎ−サクシニル−Ｌ−フェニルアラニン溶液：２５ｍＭ ＫＰＢ（ｐＨ７．０）、１％ Ｎ−サクシニル−Ｌ−フェニルアラニン
得られた反応液を４０℃で１６時間インキュベートした後に、残存する基質濃度から分解率及びＤ体に対するＬ体の分解比率（Ｌ／Ｄ）を算出した。なお、改変型Ｐ４ＤＳＡは、Ｌ体に対する反応性がかなり低下しており、基質の減少量を定量する方法では、識別しづらかったため、Ｌ体を４、Ｄ体を１、すなわちＬ：Ｄ＝４：１のタンパク質比率で反応させた。また、酵素タンパク質濃度は、Ｌ体の反応の場合は最終酵素タンパク質濃度が２．０ｍｇ／ｍｌになるように調節し、Ｄ体の反応の場合は最終酵素タンパク質濃度が０．５ｍｇ／ｍｌになるように調節した。その結果を表３に示す。

その結果、実施例１（１）では、複数の箇所にアミノ酸置換が起こることもあり、どの変異が立体選択性に寄与しているのか分からない変異体もあったために、Ｒ１７６ＨやＶ２８６Ａなどの立体選択性の向上の寄与していない改変体も見られたが、表３に示したように、多くの改変型Ｐ４ＤＳＡにおいて、Ｎ−サクシニルトリプトファン及びＮ−サクシニルフェニルアラニンに対して共に、Ｄ体選択的に作用していることが確認できた。特に、Ｎ−サクシニルトリプトファンに対しては、Ｇ１８１Ｅ、Ｌ１８２Ｗ、Ｌ１８２Ｙ、Ｌ１８２Ｋ、Ｌ１８２Ｒ、Ｌ１８２Ｅ、Ｎ１８５Ｆ、Ｒ３０５Ａ、Ｒ３０５Ｇ、Ｒ３０５Ｈ、Ｒ３０５Ｑ、Ｒ３０５Ｓ、Ｒ３０５Ｎ、Ｌ３４８Ｅ、Ｌ３４８Ｗ、Ｌ３４８Ｔ、Ｆ３５１Ｉ、Ｇ５３９Ｖ及びＧ５３９Ｍ、Ｎ−サクシニルフェニルアラニンに対しては、Ｇ１８１Ｗ、Ｇ１８１Ｄ、Ｇ１８１Ｅ、Ｌ１８２Ｒ、Ｒ３０５Ａ、Ｒ３０５Ｇ、Ｒ３０５Ｓ、Ｌ３４８Ｅ及びＬ３４８Ｗにおいて、基質の減少量では検出限界以下（表中では、０．０）となるまでに、Ｌ体に対する反応性が低下し、野生型と比べて顕著にＤ体選択的に作用していることが確認できた。

実施例３ 改変型Ｐ４ＤＳＡを用いたＮ−サクシニルビフェニルアラニンに対する立体選択性の評価
次に、実施例２でＮ−サクシニルトリプトファン及びＮ−サクシニルフェニルアラニンに対する立体選択性に関与していることが明らかとなった改変型Ｐ４ＤＳＡについて、他の芳香族アミノ酸に対してもＤ体選択的に作用するかどうかを確認した。他の芳香族アミノ酸としては、非天然型アミノ酸の一種であるＮ−サクシニルビフェニルアラニンを選択し、実施例１で調製した粗酵素液を用いて、実施例２と同様の手順で、Ｎ−サクシニルビフェニルアラニンに対する立体選択性の評価を行った。ただし、本実施例３では、以下に示すようなラセミ体溶液を反応基質として使用した。
Ｎ−サクシニル−ＤＬ−ビフェニルアラニン反応溶液：２５ｍＭ ＫＰＢ（ｐＨ７．０）、２％ Ｎ−サクシニル−ＤＬ−ビフェニルアラニン

反応液を４０℃で１６時間インキュベートした後に、残存する基質濃度から分解率及びＤ体に対するＬ体の分解比率（Ｌ／Ｄ）を算出した。なお、Ｎ−サクシニル−ＤＬ−ビフェニルアラニンについては、基質にラセミ体を利用したため、Ｄ体とＬ体を同タンパク量で反応させたことになる。また、酵素タンパク質濃度は、最終酵素タンパク質濃度が１．０ｍｇ／ｍｌになるように調節した。その結果を表４に示す。

その結果、評価した全ての改変型Ｐ４ＤＳＡにおいて、Ｎ−サクシニル−ＤＬ−ビフェニルアラニンに対してもＤ体選択的に作用していることが確認できた。実施例２及び３に示す結果は、本発明の改変型Ｐ４ＤＳＡはＮ−サクシニルトリプトファン、Ｎ−サクシニルフェニルアラニン及びＮ−サクシニルビフェニルアラニンのみに対してＤ体選択的に作用するのではなく、その他の芳香族アミノ酸や、置換基を有する非天然型の芳香族アミノ酸を含む任意のアミノ酸を構成アミノ酸とするＮ−サクシニル−ＤＬ−アミノ酸に対しても、Ｄ体選択的に作用することを示唆するものである。

実施例４ 改変型Ｐ４ＤＳＡ並びにＣｈｌｏｒｏｆｌｅｘｕｓ ａｕｒａｎｔｉａｃｕｓ由来のＮ−サクシニルアミノ酸ラセマーゼを用いたＮ−サクシニル−ＤＬ−トリプトファンからＤ−トリプトファン、Ｎ−サクシニル−ＤＬ−フェニルアラニンからのＤ−フェニルアラニン及びＮ−サクシニル−ＤＬ−ビフェニルアラニンからＤ−ビフェニルアラニンの合成
（１）
改変型Ｐ４ＤＳＡ（Ｌ１８２Ｅ、Ｌ１８２Ｐ、Ｒ３０５Ｎ）の調製
実施例１で得られた改変型Ｐ４ＤＳＡ（Ｌ１８２Ｅ、Ｌ１８２Ｐ、Ｒ３０５Ｎ）を発現する大腸菌形質転換体のコロニーを、試験管に入った５ｍＬのＬＢ培地（アンピシリン５０μｇ／ｍＬを含む）にそれぞれ植菌し、振とう数１８０ｒｐｍ、３０℃で１６時間培養し、種培養液とした。この種培養液を、５００ｍＬの坂口フラスコに入った６０ｍＬのＴＢ培地（アンピシリン５０μｇ／ｍＬを含む）に接種し、振とう数３１０ｒｐｍ、３０℃で１８時間培養した。培養終了時の濁度（Ａｂｓ６６０ｎｍ）は、１５．０、１６．２、１５．５であった。続いて、得られた菌体を遠心分離にて集菌し、２５ｍＭリン酸緩衝溶液（ｐＨ７．０）に懸濁し、氷冷下で超音波細胞破砕装置を用いて破砕した。その後、６５℃で１時間、熱処理を行い、その後、一般的な方法で脱塩処理を行い、アミノ酸合成用の酵素サンプル（Ｌ１８２Ｅ：２７．９ｍｇ／ｍＬ、５．２Ｕ／ｍＬ、Ｌ１８２Ｐ：７．３ｍｇ／ｍＬ、１．８Ｕ／ｍＬ、Ｒ３０５Ｎ：２８．５ｍｇ／ｍＬ、４．３Ｕ／ｍＬ）を調製した。なお、酵素活性の基質には、Ｎ−サクシニル−Ｄ−トリプトファンを用いた。

（２）各種Ｎ−サクシニルアミノ酸との反応及び分析
５％Ｎ−サクシニル−ＤＬ−トリプトファン水溶液（ｐＨ７．５）５ｍＬ、５％Ｎ−サクシニル−ＤＬ−フェニルアラニン水溶液（ｐＨ７．５）５ｍＬ、５％Ｎ−サクシニル−ＤＬ−ビフェニルアラニン水溶液（ｐＨ７．５）５ｍＬをそれぞれ基質として用い、塩化コバルト水溶液を終濃度１ｍＭとなるようにそれぞれ添加後、上記（１）で調製した改変型ＤＳＡ（Ｌ１８２Ｅ、Ｌ１８２Ｐ、Ｒ３０５Ｎ）の酵素液（０．１６Ｕ、０．２Ｕ、０．０８Ｕ）をそれぞれの基質に加え、さらに参考例５で調製したＣｈｌｏｒｏｆｌｅｘｕｓ ａｕｒａｎｔｉａｃｕｓ株由来のＮ−サクシニルアミノ酸ラセマーゼ溶液２５ｍｇ（６４００Ｕ）をそれぞれに対して加え、４５℃で３日間反応させた。また、一方でコントロールとして、ＰＣＴ／ＪＰ２０１１／０６４９４３の実施例に記載の方法で調製した野生型ＤＳＡ酵素液を用い、同様に反応させ、変換率及びＤ−アミノ酸の光学純度を算出した。変換率は、上記記載のジーエルサイエンス社製「Ｉｎｅｒｔｓｉｌ ＯＤＳ−３」（５μｍ、４．６×１００ｍｍ）を利用した高速液体クロマトグラフィーで酵素反応前と反応後の基質のピーク面積値を測定することによって算出した。光学純度は、上記記載のダイセル化学工業株式会社製光学分割カラム「ＣＲＯＷＮＰＡＫ ＣＲ（＋）」（５μｍ、４．０×１５０ｍｍ）で生成した遊離体のアミノ酸の光学純度を測定することによって算出した。結果を表５〜７に示す。

表５〜７に示すように、Ｄ−トリプトファン合成における反応３日目の変換率は、野生型ＤＳＡ、Ｌ１８２Ｅ，Ｌ１８２Ｐ、Ｒ３０５Ｎの順に、８３％、８７％、８６％、８９％であり、Ｄ−フェニルアラニン合成における反応３日目の変換率は、野生型ＤＳＡ、Ｌ１８２Ｅ，Ｌ１８２Ｐ、Ｒ３０５Ｎの順に、８１％、８４％、８３％、８４％であり、Ｄ−ビフェニルアラニン合成における反応３日目の変換率は、野生型ＤＳＡ、Ｌ１８２Ｅ，Ｌ１８２Ｐ、Ｒ３０５Ｎの順に、９６％、９１％、９６％、９１％であり、いずれも問題なく反応が進んだ。また、表５〜７に示すように、いずれの改変型ＤＳＡにおいても、芳香族アミノ酸によって構成されるＮ−サクシニル−ＤＬ−アミノ酸を基質とした場合、野生型ＤＳＡを使用する場合と比較して、高純度の芳香族Ｄ−アミノ酸を製造できることを確認した。特に、Ｌ１８２Ｅを使用して、Ｄ−トリプトファン、Ｄ−ビフェニルアラニンを製造した場合にそれぞれ９９．６％ｅｅ、９９．２％ｅｅ、Ｌ１８２Ｐを使用して、Ｄ−ビフェニルアラニンを製造した場合に９９．３％ｅｅ、Ｒ３０５Ｎを使用して、Ｄ−トリプトファンを製造した場合に、９９．６％ｅｅという高い光学純度に達した。また、Ｌ１８２Ｐは、実施例２で挙げられている改変型ＤＳＡの中では、Ｎ−サクシニルトリプトファンに対するＬ／Ｄ比が０．１３と比較的大きい値を示しているが、本実施例が示すようにＬ１８２Ｐを使用した場合のＤ−トリプトファンの光学純度が９８．６％ｅｅに達したということは、表３に記載のその他の改変型ＤＳＡも、それ相当の改変効果があることを示唆する。

実施例５ 二重変異改変型Ｐ４ＤＳＡ（Ｌ１８２Ｅ＋Ｌ３４８Ｉ）並びにＣｈｌｏｒｏｆｌｅｘｕｓ ａｕｒａｎｔｉａｃｕｓ由来のＮ−サクシニルアミノ酸ラセマーゼを用いたＮ−サクシニル−ＤＬ−トリプトファンからのＤ−トリプトファン、Ｎ−サクシニル−ＤＬ−フェニルアラニンからのＤ−フェニルアラニン及びＮ−サクシニル−ＤＬ−ビフェニルアラニンからのＤ−ビフェニルアラニンの合成
（１）二重変異改変型プラスミドの構築
二重変異改変体を発現するプラスミドを作製するために、実施例１で得られた改変型Ｐ４ＤＳＡ（Ｌ１８２Ｅ）を含む発現プラスミドを鋳型とし、上記に記載の方法でＰＣＲ反応を実施し、１８２番目のロイシンがグルタミン酸に置換され、かつ、３４８番目のロイシンがイソロイシンに置換された二重変異改変型Ｐ４ＤＳＡ（Ｌ１８２Ｅ＋Ｌ３４８Ｉ）を含む発現プラスミドを構築した。

（２）二重変異改変型Ｐ４ＤＳＡ（Ｌ１８２Ｅ＋Ｌ３４８Ｉ）の調製
（１）で得られた二重変異改変型Ｐ４ＤＳＡ（Ｌ１８２Ｅ＋Ｌ３４８I）を発現する大腸菌形質転換体のコロニーを、試験管に入った５ｍＬのＬＢ培地（アンピシリン５０μｇ／ｍＬを含む）に植菌し、振とう数１８０ｒｐｍ、３０℃で１６時間培養し、種培養液とした。この種培養液を、５００ｍＬの坂口フラスコに入った６０ｍＬのＴＢ培地（アンピシリン５０μｇ／ｍＬを含む）に接種し、振とう数３１０ｒｐｍ、３０℃で１８時間培養した。培養終了時の濁度（Ａｂｓ６６０ｎｍ）は１５．６であった。続いて、得られた菌体を遠心分離で集菌し、２５ｍＭリン酸緩衝溶液（ｐＨ７．５）に懸濁し、氷冷下で超音波細胞破砕装置を用いて破砕した。その後、５５℃で３時間、熱処理を行い、その後、０．４５飽和になるように硫酸アンモニウムを徐々に添加し、目的のタンパク質を沈殿させた。その後、上清を取り除き、２５ｍＭリン酸緩衝溶液（ｐＨ７．５）を加えて、沈殿を再溶解させ、一般的な脱塩処理を行った後、２５ｍＭリン酸緩衝溶液（ｐＨ７．５）で平衡化した５ｍＬのＤＥＡＥセファロースＦａｓｔ Ｆｌｏｗ（ＧＥヘルスケア製）カラムにかけ、素通り画分を回収した。このようにして、アミノ酸合成用の酵素サンプル（Ｌ１８２Ｅ＋Ｌ３４８Ｉ：７．０ｍｇ／ｍＬ、１１．４Ｕ／ｍＬ）を調製した。なお、酵素活性の基質には、Ｎ−サクシニル−Ｄ−トリプトファンを用いた。

（３）Ｎ−サクシニル−ＤＬ−トリプトファンからのＤ−トリプトファンの調製
５％Ｎ−サクシニル−ＤＬ−トリプトファン水溶液（ｐＨ７．５）５ｍＬを基質として用い、塩化コバルト水溶液を終濃度１ｍＭとなるように添加後、上記（２）で調製した二重変異改変型ＤＳＡ（Ｌ１８２Ｅ＋Ｌ３４８Ｉ）の酵素液０．０５ｍｇと参考例５で調製したＣｈｌｏｒｏｆｌｅｘｕｓ ａｕｒａｎｔｉａｃｕｓ株由来のＮ−サクシニルアミノ酸ラセマーゼ溶液２．５ｍｇを添加し、４５℃で３日間反応させた。また、一方でコントロールとして、ＰＣＴ／ＪＰ２０１１／０６４９４３の実施例に記載の方法で調製した野生型ＤＳＡ酵素液０．０２５ｍｇと参考例５で調製したＣｈｌｏｒｏｆｌｅｘｕｓ ａｕｒａｎｔｉａｃｕｓ株由来のＮ−サクシニルアミノ酸ラセマーゼ溶液２．５ｍｇを添加し、４５℃で３日間反応させ、変換率及びＤ−アミノ酸の光学純度を算出した。変換率は、上記記載のジーエルサイエンス社製「Ｉｎｅｒｔｓｉｌ ＯＤＳ−３」（５μｍ、４．６×１００ｍｍ）を利用した高速液体クロマトグラフィーで酵素反応前と反応後の基質のピーク面積値を測定することによって算出した。光学純度は、上記記載のダイセル化学工業株式会社製光学分割カラム「ＣＲＯＷＮＰＡＫ ＣＲ（＋）」（５μｍ、４．０×１５０ｍｍ）で生成した遊離体のアミノ酸の光学純度を測定することによって算出した。結果を表８に示す。なお、表８には、比較のため、表５のＬ１８２Ｅの単変異のデータを併記している。

表８に示すように、反応３日目にはいずれも８０％以上に達した。また、反応３日目のＤ−トリプトファンの光学純度は、野生型は９６．１％ｅｅであるのに対し、Ｌ１８２Ｅの単変異改変型は９９．６％ｅｅであり、Ｌ１８２Ｅ＋Ｌ３４８Ｉの二重変異改変型は９９．７％ｅｅであり、いずれの改変型も光学純度が野生型と比較して顕著に向上しており、特に二重変異改変型は、単変異改変型よりさらに光学純度が向上していた。本発明のＤ−サクシニラーゼは、工業規模でのＤ−アミノ酸の製造に使用されるため、製造されるＤ−アミノ酸の光学純度がわずかでも向上するということは、製造コストの低下をもたらす顕著な向上であるといえる。また、データには示さないが、Ｌ３４８Ｉの単変異のみでは、野生型と比較して選択性向上の効果は見られず、Ｌ１８２Ｅと組み合わせることで、相乗的な立体選択性向上への寄与が確認された。

（４）Ｎ−サクシニル−ＤＬ−フェニルアラニンからのＤ−フェニルアラニンの調製
５％Ｎ−サクシニル−ＤＬ−フェニルアラニン水溶液（ｐＨ７．５）５ｍＬを基質として用い、塩化コバルト水溶液を終濃度１ｍＭとなるように添加後、上記（２）で調製した二重変異改変型ＤＳＡ（Ｌ１８２Ｅ＋Ｌ３４８Ｉ）の酵素液０．０７５ｍｇと参考例５で調製したＣｈｌｏｒｏｆｌｅｘｕｓ ａｕｒａｎｔｉａｃｕｓ株由来のＮ−サクシニルアミノ酸ラセマーゼ溶液２．５ｍｇを添加し、４５℃で３日間反応させた。また、一方でコントロールとして、ＰＣＴ／ＪＰ２０１１／０６４９４３の実施例に記載の方法で調製した野生型ＤＳＡ酵素液０．０２５ｍｇと参考例５で調製したＣｈｌｏｒｏｆｌｅｘｕｓ ａｕｒａｎｔｉａｃｕｓ株由来のＮ−サクシニルアミノ酸ラセマーゼ溶液２．５ｍｇを添加し、４５℃で３日間反応させ、変換率及びＤ−アミノ酸の光学純度を算出した。変換率は、上記記載のジーエルサイエンス社製「Ｉｎｅｒｔｓｉｌ ＯＤＳ−３」（５μｍ、４．６×１００ｍｍ）を利用した高速液体クロマトグラフィーで酵素反応前と反応後の基質のピーク面積値を測定することによって算出した。光学純度は、上記記載のダイセル化学工業株式会社製光学分割カラム「ＣＲＯＷＮＰＡＫ ＣＲ（＋）」（５μｍ、４．０×１５０ｍｍ）で生成した遊離体のアミノ酸の光学純度を測定することによって算出した。結果を表９に示す。なお、表９には、比較のため、表６のＬ１８２Ｅの単変異のデータを併記している。

表９に示すように、反応３日目にはいずれも８０％以上に達した。また、反応３日目のＤ−フェニルアラニンの光学純度は、野生型は９３．６％ｅｅであるのに対し、Ｌ１８２Ｅの単変異改変型は９８．８％ｅｅであり、Ｌ１８２Ｅ＋Ｌ３４８Ｉの二重変異改変型は９９．４％ｅｅであり、いずれの改変型も光学純度が野生型と比較して顕著に向上しており、特に二重変異改変型は、単変異改変型よりさらに光学純度が向上していた。本発明のＤ−サクシニラーゼは、工業規模でのＤ−アミノ酸の製造に使用されるため、製造されるＤ−アミノ酸の光学純度がわずかでも向上するということは、製造コストの低下をもたらす顕著な向上であるといえる。また、データには示さないが、Ｌ３４８Ｉの単変異のみでは、野生型と比較して選択性向上の効果は見られず、Ｌ１８２Ｅと組み合わせることで、相乗的な立体選択性向上への寄与が確認された。

（５）Ｎ−サクシニル−ＤＬ−ビフェニルアラニンからのＤ−ビフェニルアラニンの調製
５％Ｎ−サクシニル−ＤＬ−ビフェニルアラニン水溶液（ｐＨ７．５）５ｍＬを基質として用い、塩化コバルト水溶液を終濃度１ｍＭとなるように添加後、上記（２）で調製した二重変異改変型ＤＳＡ（Ｌ１８２Ｅ＋Ｌ３４８Ｉ）の酵素液０．０５ｍｇと参考例５で調製したＣｈｌｏｒｏｆｌｅｘｕｓ ａｕｒａｎｔｉａｃｕｓ株由来のＮ−サクシニルアミノ酸ラセマーゼ溶液２５ｍｇを添加し、４５℃で３日間反応させた。また、一方でコントロールとして、ＰＣＴ／ＪＰ２０１１／０６４９４３の実施例に記載の方法で調製した野生型ＤＳＡ酵素液０．０２５ｍｇと参考例５で調製したＣｈｌｏｒｏｆｌｅｘｕｓ ａｕｒａｎｔｉａｃｕｓ株由来のＮ−サクシニルアミノ酸ラセマーゼ溶液２５ｍｇを添加し、４５℃で３日間反応させ、変換率及びＤ−アミノ酸の光学純度を算出した。変換率は、上記記載のジーエルサイエンス社製「Ｉｎｅｒｔｓｉｌ ＯＤＳ−３」（５μｍ、４．６×１００ｍｍ）を利用した高速液体クロマトグラフィーで酵素反応前と反応後の基質のピーク面積値を測定することによって算出した。光学純度は、上記記載のダイセル化学工業株式会社製光学分割カラム「ＣＲＯＷＮＰＡＫ ＣＲ（＋）」（５μｍ、４．０×１５０ｍｍ）で生成した遊離体のアミノ酸の光学純度を測定することによって算出した。結果を表１０に示す。なお、表１０には、比較のため、表７のＬ１８２Ｅの単変異のデータを併記している。

表１０に示すように、反応３日目にはいずれも９０％以上に達した。また、反応３日目のＤ−ビフェニルアラニンの光学純度は、野生型は８８．３％ｅｅであるのに対し、Ｌ１８２Ｅの単変異改変型は９９．２％ｅｅであり、Ｌ１８２Ｅ＋Ｌ３４８Ｉの二重変異改変型は９９．４％ｅｅであり、いずれの改変型も光学純度が野生型と比較して顕著に向上しており、特に二重変異改変型は、単変異改変型よりさらに光学純度が向上していた。本発明のＤ−サクシニラーゼは、工業規模でのＤ−アミノ酸の製造に使用されるため、製造されるＤ−アミノ酸の光学純度がわずかでも向上するということは、製造コストの低下をもたらす顕著な向上であるといえる。また、データには示さないが、Ｌ３４８Ｉの単変異のみでは、野生型と比較して選択性向上の効果は見られず、Ｌ１８２Ｅと組み合わせることで、相乗的な立体選択性向上への寄与が確認された。

実施例６ Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ ｓｐ．Ｐ４−１０−Ｃ株由来Ｄ−サクシニラーゼと近縁種のＤ−サクシニラーゼにおけるアミノ酸配列の相同性比較
Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ ｓｐ．Ｐ４−１０−Ｃ株由来のＤ−サクシニラーゼにおいて明らかとなった立体選択性に関与するアミノ酸残基が、その他のＣｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ属細菌のＤ−サクシニラーゼにおいて、保存されているかどうかを調べるために、Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ ｓｐ．Ｐ４−１０−Ｃ、Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ ｍｅｔａｌｌｉｄｕｒａｎｓ、Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ ｎｅｃａｔｏｒ及びＣｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ ｔａｉｗａｎｅｎｓｉｓのＤ−サクシニラーゼのアミノ酸配列の相同性比較を行った。なお、Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ ｓｐ．Ｐ４−１０−ＣとＣｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ ｍｅｔａｌｌｉｄｕｒａｎｓについては、参考例１及び２で明らかにしたアミノ酸配列を、Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ ｎｅｃａｔｏｒとＣｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ ｔａｉｗａｎｅｎｓｉｓについては、ＮＣＢＩ（ｈｔｔｐ：／／ｂｌａｓｔ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ）に公開されているアミノ酸配列を用いた。詳しくはＣｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ ｎｅｃａｔｏｒについては、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ Ｇ ａｃｙｌａｓｅ（ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ Ｎｏ．ＹＰ＿８４２０１１）として登録されているアミノ酸配列を、Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ ｔａｉｗａｎｅｎｓｉｓについては、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ Ｇ ａｍｉｄａｓｅｐｒｅｃｕｒｓｏｒ（ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ Ｎｏ．ＹＰ＿００２００８８４３）として登録されているアミノ酸配列を用いた。また、アミノ酸配列解析ソフトは、ＧＥＮＥＴＹＸ ＣＯＲＰＯＲＡＴＩＯＮから販売されているＧＥＮＥＴＹＸ ＷＩＮ Ｖｅｒｓｉｏｎ ６．１のものを使用した。結果を図３に示す。その結果、Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ ｓｐ．Ｐ４−１０−Ｃ株由来のＤ−サクシニラーゼで明らかになった立体選択性に関与しているアミノ酸残基の全てが、比較した全てのＣｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ属細菌のＤ−サクシニラーゼで保存されていることが明らかになった。なお、これらの４種のＣｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ属細菌のＤ−サクシニラーゼの相同性は、以下の表１１に示すように７５％〜９３％であった。

実施例７ 改変型Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ ｍｅｔａｌｌｉｄｕｒａｎｓ由来Ｄ−サクシニラーゼ（以下、ＣｍＤＳＡ遺伝子と称する）の調製
そこで、実施例６のアミノ酸配列のアライメント結果に基づき、近縁種においても、Ｐ４ＤＳＡの立体選択性に関与する７２位、１８１〜１８５位、３０５位、３４８位、３５１位、４６１位、５３９位に同等な部位をアミノ酸置換することにより、Ｎ−サクシニル−ＤＬ−アミノ酸に対して、Ｄ体選択的に作用するようになるということを示すために、近縁種の一種であるＣｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ ｍｅｔａｌｌｉｄｕｒａｎｓの改変型ＣｍＤＳＡを作成し、立体選択性を評価することにした。
（１）改変型ＣｍＤＳＡ遺伝子発現プラスミドの構築
実施例１（３）に記載した方法と同様の方法で改変型ＣｍＤＳＡ遺伝子発現プラスミドを構築した。作製した改変型酵素と変異導入に使用した合成オリゴＤＮＡプライマーの配列を表１２に示す。

（２）ＣｍＤＳＡ及び改変型ＣｍＤＳＡの調製
実施例１（４）に記載した方法と同様の方法で、ＣｍＤＳＡ及び改変型ＣｍＤＳＡの粗酵素液を調製した。

実施例８ 改変型ＣｍＤＳＡを用いたＮ−サクシニルトリプトファンに対する立体選択性の評価
実施例７で調製した粗酵素液を用いて、実施例１と同様の条件及び手順で、Ｎ−サクシニルトリプトファンに対する立体選択性の評価を行った。その結果を表１３に示す。

その結果、全ての改変型ＣｍＤＳＡにおいて、Ｄ体選択的に作用していることが確認された。すなわち、Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ ｓｐ．Ｐ４−１０−Ｃ株由来Ｄ−サクシニラーゼの立体選択性に関与する７２位、１８１〜１８５位、３０５位、３４８位、３５１位、４６１位及び５３９位は、本菌株のみならず、近縁種のＤ−サクシニラーゼにおいても、それぞれの部位に同等な部位をアミノ酸置換することにより、Ｄ体選択性を向上させることができる部位であることが示唆された。

本発明の改変型Ｄ−サクシニラーゼは、野生型Ｄ−サクシニラーゼと比較してＤ体選択性が著しく向上しているので、医薬品等の中間体の原料として有用なＤ−アミノ酸を効率良く製造するために有用である。

配列番号５〜５４は、実施例に記載した設計ポリヌクレオチドの配列である。

Claims (13)

1. 下記（Ａ）又は（Ｂ）のアミノ酸配列からなることを特徴とするタンパク質。
   （Ａ）配列番号２に示すアミノ酸配列において、下記（ａ）〜（ｋ）から選択される少なくとも１個のアミノ酸残基の置換を有するアミノ酸配列
   （ａ）７２位のグルタミン残基のアルギニン残基への置換
   （ｂ）１８１位のグリシン残基のトリプトファン残基、リジン残基、アルギニン残基、アスパラギン酸又はグルタミン酸残基への置換
   （ｃ）１８２位のロイシン残基のトリプトファン残基、セリン残基、システイン残基、チロシン残基、リジン残基、アルギニン残基、アスパラギン酸残基、グルタミン酸残基又はプロリン残基への置換
   （ｄ）１８３位のスレオニン残基のプロリン残基、ロイシン残基又はアスパラギン残基への置換
   （ｅ）１８４位のロイシン残基のプロリン残基への置換
   （ｆ）１８５位のアスパラギン残基のプロリン残基、フェニルアラニン残基、セリン残基又はアスパラギン酸残基への置換
   （ｇ）３０５位のアルギニン残基のスレオニン残基、アラニン残基、グリシン残基、ヒスチジン残基、グルタミン残基、セリン残基、アスパラギン残基又はバリン残基への置換
   （ｈ）３４８位のロイシン残基のイソロイシン残基、グルタミン酸残基、プロリン残基、メチオニン残基、トリプトファン残基、セリン残基、スレオニン残基、システイン残基、リジン残基、ヒスチジン残基又はグルタミン残基への置換
   （ｉ）３５１位のフェニルアラニン残基のロイシン残基、イソロイシン残基、メチオニン残基、アスパラギン残基又はグルタミン残基への置換
   （ｊ）４６１位のアスパラギン残基のイソロイシン残基、フェニルアラニン残基、スレオニン残基、リジン残基又はアルギニン残基への置換
   （ｋ）５３９位のグリシン残基のプロリン残基、バリン残基、メチオニン残基、スレオニン残基又はアスパラギン残基への置換
   （Ｂ）上記（Ａ）のアミノ酸配列において、７２位、１８１〜１８５位、３０５位、３４８位、３５１位、４６１位、及び５３９位以外の箇所に、１若しくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、付加および／または逆位を有するアミノ酸配列であって、Ｎ−サクシニル−ＤＬ−アミノ酸に対してＤ体選択的に作用してＤ−アミノ酸を生成する活性を有するタンパク質をコードするアミノ酸配列。
2. 請求項１の（Ａ）のアミノ酸配列が、配列番号２に示すアミノ酸配列において、１８２位のロイシン残基のグルタミン酸残基への置換、及び３４８位のロイシン残基のイソロイシン残基への置換を有するアミノ酸配列であることを特徴とする請求項１に記載のタンパク質。
3. 下記（Ａ）又は（Ｂ）の塩基配列からなることを特徴とする遺伝子。
   （Ａ）配列番号１に示す塩基配列において、下記（ａ）〜（ｋ）から選択される少なくとも１個の塩基配列の置換を有する塩基配列
   （ａ）２１４〜２１６位の塩基配列ｃａａの、ｃｇｔ、ｃｇｃ、ｃｇａ、ｃｇｇ、ａｇａ又はａｇｇへの置換
   （ｂ）５４１〜５４３位の塩基配列ｇｇｃの、ｔｇｇ、ａａａ、ａａｇ、ｃｇｔ、ｃｇｃ、ｃｇａ、ｃｇｇ、ａｇａ、ａｇｇ、ｇａｔ、ｇａｃ、ｇａａ又はｇａｇへの置換
   （ｃ）５４４〜５４６位の塩基配列ｃｔｇの、ｔｇｇ、ｔｃｔ、ｔｃｃ、ｔｃａ、ｔｃｇ、ａｇｔ、ａｇｃ、ｔｇｔ、ｔｇｃ、ｔａｔ、ｔａｃ、ａａａ、ａａｇ、ｃｇｔ、ｃｇｃ、ｃｇａ、ｃｇｇ、ａｇａ、ａｇｇ、ｇａｔ、ｇａｃ、ｇａａ、ｇａｇ、ｃｃｔ、ｃｃｃ、ｃｃａ又はｃｃｇへの置換
   （ｄ）５４７〜５４９位の塩基配列ａｃｇの、ｃｃｔ、ｃｃｃ、ｃｃａ、ｃｃｇ、ｔｔａ、ｔｔｇ、ｃｔｔ、ｃｔｃ、ｃｔａ、ｃｔｇ、ａａｔ又はａａｃへの置換
   （ｅ）５５０〜５５２位の塩基配列ｃｔｇの、ｃｃｔ、ｃｃｃ、ｃｃａ又はｃｃｇへの置換
   （ｆ）５５３〜５５５位の塩基配列ａａｔの、ｃｃｔ、ｃｃｃ、ｃｃａ、ｃｃｇ、ｔｔｔ、ｔｔｃ、ｔｃｔ、ｔｃｃ、ｔｃａ、ｔｃｇ、ａｇｔ、ａｇｃ、ｇａｔ又はｇａｃへの置換
   （ｇ）９１３〜９１５位の塩基配列ｃｇｇの、ａｃｔ、ａｃｃ、ａｃａ、ａｃｇ、ｇｃｔ、ｇｃｃ、ｇｃａ、ｇｃｇ、ｇｇｔ、ｇｇｃ、ｇｇａ、ｇｇｇ、ｃａｔ、ｃａｃ、ｃａａ、ｃａｇ、ｔｃｔ、ｔｃｃ、ｔｃａ、ｔｃｇ、ａｇｔ、ａｇｃ、ａａｔ、ａａｃ、ｇｔｔ、ｇｔｃ、ｇｔａ又はｇｔｇへの置換
   （ｈ）１０４２〜１０４４位の塩基配列ｃｔｇの、ａｔｔ、ａｔｃ、ａｔａ、ｇａａ、ｇａｇ、ｃｃｔ、ｃｃｃ、ｃｃａ、ｃｃｇ、ａｔｇ、ｔｇｇ、ｔｃｔ、ｔｃｃ、ｔｃａ、ｔｃｇ、ａｇｔ、ａｇｃ、ａｃｔ、ａｃｃ、ａｃａ、ａｃｇ、ｔｇｔ、ｔｇｃ、ａａａ、ａａｇ、ｃａｔ、ｃａｃ、ｃａａ又はｃａｇへの置換
   （ｉ）１０５１〜１０５３位の塩基配列ｔｔｃの、ｔｔａ、ｔｔｇ、ｃｔｔ、ｃｔｃ、ｃｔａ、ｃｔｇ、ａｔｔ、ａｔｃ、ａｔａ、ａｔｇ、ａａｔ、ａａｃ、ｃａａ又はｃａｇへの置換
   （ｊ）１３８１〜１３８３位の塩基配列ａａｃの、ａｔｔ、ａｔｃ、ａｔａ、ｔｔｔ、ｔｔｃ、ａｃｔ、ａｃｃ、ａｃａ、ａｃｇ、ａａａ、ａａｇ、ｃｇｔ、ｃｇｃ、ｃｇａ、ｃｇｇ、ａｇａ又はａｇｇへの置換
   （ｋ）１６１５〜１６１７位の塩基配列ｇｇｃの、ｃｃｔ、ｃｃｃ、ｃｃａ、ｃｃｇ、ｇｔｔ、ｇｔｃ、ｇｔａ、ｇｔｇ、ａｔｇ、ａｃｔ、ａｃｃ、ａｃａ、ａｃｇ、ａａｔ又はａａｃへの置換
   （Ｂ）上記（Ａ）の（ａ）〜（ｋ）から選択される塩基配列の置換を有し、かつ、（Ａ）の塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列であって、Ｎ−サクシニル−ＤＬ−アミノ酸に対してＤ体選択的に作用してＤ−アミノ酸を生成する活性を有するタンパク質をコードする塩基配列。
4. 請求項３の（Ａ）の塩基配列が、配列番号１に示す塩基配列において、５４４〜５４６位の塩基配列ｃｔｇの、ｇａａ又はｇａｇへの置換、及び１０４２〜１０４４位の塩基配列ｃｔｇの、ａｔｔ，ａｔｃ又はａｔａへの置換を有する塩基配列であることを特徴とする請求項３に記載の遺伝子。
5. 下記（Ａ）又は（Ｂ）のアミノ酸配列からなることを特徴とするタンパク質。
   （Ａ）配列番号４に示すアミノ酸配列において、下記（ａ）〜（ｅ）から選択される少なくとも１個のアミノ酸残基の置換を有するアミノ酸配列
   （ａ）１７７位のロイシン残基のアルギニン残基への置換
   （ｂ）１８０位のアスパラギン残基のアスパラギン酸残基への置換
   （ｃ）３４４位のロイシン残基のプロリン残基への置換
   （ｄ）３４７位のフェニルアラニン残基のイソロイシン残基への置換
   （ｅ）４５７位のアスパラギン残基のイソロイシン残基への置換
   （Ｂ）上記（Ａ）のアミノ酸配列において、１７７位、１８０位、３４４位、３４７位、及び４５７位以外の箇所に、１若しくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、付加および／または逆位を有するアミノ酸配列であって、Ｎ−サクシニル−ＤＬ−アミノ酸に対してＤ体選択的に作用してＤ−アミノ酸を生成する活性を有するタンパク質をコードするアミノ酸配列。
6. 下記（Ａ）又は（Ｂ）の塩基配列からなることを特徴とする遺伝子。
   （Ａ）配列番号３に示す塩基配列において、下記（ａ）〜（ｅ）から選択される少なくとも１個の塩基配列の置換を有する塩基配列
   （ａ）５２９〜５３１位の塩基配列ｃｔｇの、ｃｇｔ、ｃｇｃ、ｃｇａ、ｃｇｇ、ａｇａ又はａｇｇへの置換
   （ｂ）５３８〜５４０位の塩基配列ａａｃの、ｇａｔ又はｇａｃへの置換
   （ｃ）１０３０〜１０３２位の塩基配列ｃｔｇの、ｃｃｔ、ｃｃｃ、ｃｃａ又はｃｃｇへの置換
   （ｄ）１０３９〜１０４１位の塩基配列ｔｔｃの、ａｔｔ、ａｔｃ又はａｔａへの置換
   （ｅ）１３６９〜１３７１位の塩基配列ａａｔの、ａｔｔ、ａｔｃ又はａｔａへの置換
   （Ｂ）上記（Ａ）の（ａ）〜（ｅ）から選択される塩基配列の置換を有し、かつ、（Ａ）の塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列であって、Ｎ−サクシニル−ＤＬ−アミノ酸に対してＤ体選択的に作用してＤ−アミノ酸を生成する活性を有するタンパク質をコードする塩基配列。
7. 配列番号２と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列において、配列番号２の７２位、１８１〜１８５位、３０５位、３４８位、３５１位、４６１位、及び５３９位のうちのいずれかと同等な位置のアミノ酸残基が、請求項１の（Ａ）に示すアミノ酸残基に置換されているアミノ酸配列からなるタンパク質であって、Ｎ−サクシニル−ＤＬ−アミノ酸に対してＤ体選択的に作用してＤ−アミノ酸を生成する活性を有することを特徴とするタンパク質。
8. 請求項７に記載のタンパク質をコードすることを特徴とする遺伝子。
9. 配列番号４と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列において、配列番号４の１７７位、１８０位、３４４位、３４７位、及び４５７位のうちのいずれかと同等な位置のアミノ酸残基が、請求項３の（Ａ）に示すアミノ酸残基に置換されているアミノ酸配列からなるタンパク質であって、Ｎ−サクシニル−ＤＬ−アミノ酸に対してＤ体選択的に作用してＤ−アミノ酸を生成する活性を有することを特徴とするタンパク質。
10. 請求項９に記載のタンパク質をコードすることを特徴とする遺伝子。
11. 請求項３，４，６，８又は１０に記載の遺伝子をベクターに挿入して組換えベクターを調製し、この組換えベクターで宿主細胞を形質転換して形質転換体を調製し、この形質転換体を培養する工程を含むことを特徴とする請求項１，２，５，７又は９に記載のタンパク質の製造方法。
12. 請求項１，２，５，７又は９に記載のタンパク質を用いてＮ−サクシニル−ＤＬ−アミノ酸中のＮ−サクシニル−Ｄ−アミノ酸を特異的に加水分解する工程を含むことを特徴とするＤ−アミノ酸の製造方法。
13. Ｎ−サクシニルアミノ酸ラセマーゼを用いてＮ−サクシニル−Ｌ−アミノ酸をラセミ化してＮ−サクシニル−Ｄ−アミノ酸を生成させる工程をさらに含むことを特徴とする請求項１２に記載の方法。