JP5882834B2 - Biomolecule detection element and method for producing biomolecule detection element - Google Patents
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Description
本発明は、目的とする生体分子を検出する生体分子検出素子および生体分子検出素子の製造方法に関する。 The present invention relates to a method for producing a raw body molecular detection element contact and biomolecule detecting element for detecting a biomolecule of interest.
生体分子検出方法には、検出対象となる標的生体分子を選択的に認識する生体分子検出分子を用い、生体分子検出分子と標的生体分子である例えばタンパク質との結合によって起こる分子構造の変化や反応物質の生成などの化学現象を、光や電気などの信号に変換して検出する方法がある。この方法で用いられる生体分子検出分子としては、生体由来の分子（核酸，アミノ酸，抗体，核酸，脂質，糖鎖，イオンチャネルなど）がある。標的生体分子と生体分子検出分子との結合によって起こる生体分子検出分子の特異的な構造変化を利用することで、標的生体分子との高い選択性を確保することができる。 In the biomolecule detection method, a biomolecule detection molecule that selectively recognizes a target biomolecule to be detected is used, and a change in molecular structure or reaction caused by binding of the biomolecule detection molecule to a target biomolecule, such as a protein. There is a method for detecting a chemical phenomenon such as generation of a substance by converting it into a signal such as light or electricity. Biomolecule detection molecules used in this method include biological molecules (nucleic acid, amino acid, antibody, nucleic acid, lipid, sugar chain, ion channel, etc.). By utilizing the specific structural change of the biomolecule detection molecule caused by the binding between the target biomolecule and the biomolecule detection molecule, high selectivity with the target biomolecule can be ensured.
構造変化を利用した生体分子検出分子の例として、標的生体分子との結合により構造変化するアプタマー（標的生体分子に特異的に結合する核酸またはペプチドから構成されるリガンド）を用いることができる。アプタマーは、一般的に、特定の標的生体分子との結合によってある特定の構造へと変化することが知られている、さらに、配列設計により、構造変化後のアプタマーの構造を精密に設計できることも知られている。アプタマーの標的生体分子としては、多岐にわたる生体分子が開示されており、例えば、各種タンパク質，酵素，ペプチド，抗体，レセプター，ホルモン，アミノ酸，抗生物質、また、その他の種々の化合物などが報告されている（非特許文献１参照）。 As an example of a biomolecule detection molecule using structural change, an aptamer (ligand composed of a nucleic acid or a peptide that specifically binds to the target biomolecule) whose structure is changed by binding to the target biomolecule can be used. Aptamers are generally known to change to a specific structure by binding to a specific target biomolecule. Furthermore, the structure of aptamers after structural changes can be precisely designed by sequence design. Are known. A variety of biomolecules have been disclosed as aptamer target biomolecules. For example, various proteins, enzymes, peptides, antibodies, receptors, hormones, amino acids, antibiotics, and other various compounds have been reported. (See Non-Patent Document 1).
アプタマーを利用した生体分子検出法においては、アプタマーの構造変化を検出可能な信号に変換する手法として、アプタマーの予め設計した部位に種々のシグナル分子を修飾（付加）することが有用である。シグナル分子を修飾したアプタマーが標的生体分子との複合体を形成すると、シグナル分子とセンサ感部となる物質との距離が変化して出力される信号が変化するため、検出可能な信号変化として検知することが可能となる。ここで用いられるシグナル分子は、検出方法によって異なる。例えば、蛍光検出を用いる場合、シグナル分子としては各種の蛍光分子を用い、センサ感部には酸化グラフェンなどの蛍光クエンチャー（励起エネルギー吸収物質）を用いることができる（非特許文献２参照）。 In a biomolecule detection method using an aptamer, it is useful to modify (add) various signal molecules to a predesigned site of the aptamer as a technique for converting a structural change of the aptamer into a detectable signal. When an aptamer modified with a signal molecule forms a complex with a target biomolecule, the distance between the signal molecule and the substance that acts as the sensor changes, and the output signal changes. It becomes possible to do. The signal molecule used here varies depending on the detection method. For example, when fluorescence detection is used, various fluorescent molecules can be used as the signal molecule, and a fluorescent quencher (excitation energy absorbing substance) such as graphene oxide can be used for the sensor sensitive part (see Non-Patent Document 2).
蛍光分子は、センサ感部との距離が遠くなると、センサ感部によるクエンチング効率が低下する。この状態は、例えば、蛍光顕微鏡などを用いることで観察（検出）できる。蛍光分子をシグナル分子として用いる構成では、標的生体分子とアプタマーとの複合体形成による、蛍光分子とセンサ感部とが離間したことによる発光強度の増加を用いて検出を行う（非特許文献３参照）。このため、標的生体分子を検出する前の初期段階では、アプタマーに修飾されている（結合している）蛍光分子を可能な範囲でセンサ感部の近傍に配置し、クエンチング効率が最大となっていることが望ましい。一方で、アプタマーが標的生体分子と複合体を形成した後は、クエンチングが起こらない距離に蛍光分子がセンサ感部から遠ざかることが望ましい。 As the distance between the fluorescent molecule and the sensor sensitive part increases, the quenching efficiency of the sensor sensitive part decreases. This state can be observed (detected) by using, for example, a fluorescence microscope. In the configuration using a fluorescent molecule as a signal molecule, detection is performed using an increase in emission intensity due to the separation of the fluorescent molecule and the sensor sensitive part due to the formation of a complex between the target biomolecule and the aptamer (see Non-Patent Document 3). ). For this reason, in the initial stage before the detection of the target biomolecule, the fluorescent molecule modified (bound) to the aptamer is arranged as close as possible to the sensor-sensing part to maximize the quenching efficiency. It is desirable that On the other hand, after the aptamer forms a complex with the target biomolecule, it is desirable that the fluorescent molecule is moved away from the sensor sensitive part at a distance where quenching does not occur.
上述したように、アプタマーを利用した生体分子検出法においては、シグナル分子が結合しているアプタマーが、標的生体分子との複合体を形成したことにより、シグナル分子とセンサ感部となる物質との距離が変化することで、検出信号に変化を生じさせている。従って、シグナル分子とセンサ感部となる物質との距離の制御が重要である。 As described above, in the biomolecule detection method using the aptamer, the aptamer to which the signal molecule is bound forms a complex with the target biomolecule, so that the signal molecule and the substance that becomes the sensor sensitive part As the distance changes, the detection signal is changed. Therefore, it is important to control the distance between the signal molecule and the substance serving as the sensor sensitive part.
ところで、このシグナル分子（蛍光分子）による信号（発光）変化の検出は、センサ感部の箇所（センサ感部表面）で行うことが重要となる。しかしながら、アプタマーは、対象となる生体分子と複合体を形成したことにより、センサ感部より大きく離間する場合が発生する。この場合、例えば、アプタマーに結合している蛍光分子は発光することになるが、この発光を、センサ感部の箇所で検出することができなくなる。例えば、基板表面で起こる現象を検出するチップ型のデバイスの上で、上述した生体分子検出法を実現使用とする場合、シグナル分子が結合しているアプタマー（生体分子検出分子）が、センサ感部より大きく離間すると、アプタマーがデバイス上にない状態となる場合があり、これでは、検出をすることができない。 By the way, it is important to detect a change in signal (luminescence) by this signal molecule (fluorescent molecule) at the position of the sensor sensitive part (the surface of the sensor sensitive part). However, the aptamer may be separated from the sensor sensitive part by forming a complex with the target biomolecule. In this case, for example, the fluorescent molecule bonded to the aptamer emits light, but this light emission cannot be detected at the sensor sensitive part. For example, when the above-described biomolecule detection method is implemented on a chip-type device that detects a phenomenon that occurs on the substrate surface, an aptamer (biomolecule detection molecule) to which a signal molecule is bonded is detected by the sensor sensitive part. If the distance is larger, the aptamer may not be present on the device, which cannot be detected.
本発明は、以上のような問題点を解消するためになされたものであり、センサ感部の箇所において、シグナル分子による信号が検出できるようにすることを目的とする。 The present invention has been made to solve the above-described problems, and an object of the present invention is to make it possible to detect a signal by a signal molecule at a position of a sensor sensitive part.
本発明に係る生体分子検出素子は、検出対象の生体分子と特異的に結合するアプタマーと、アプタマーの一端に結合し、出力される信号がセンサ感部との距離に対応して変化するシグナル分子と、アプタマーの他端に結合してアプタマーとセンサ感部とを接着する接着分子とを備える。 The biomolecule detection element according to the present invention includes an aptamer that specifically binds to a biomolecule to be detected, a signal molecule that binds to one end of the aptamer, and an output signal changes in accordance with the distance from the sensor sensing part. And an adhesion molecule that binds to the other end of the aptamer and bonds the aptamer and the sensor sensing part.
上記生体分子検出素子において、接着分子は、ピレンが骨格に含まれていればよい。例えば、接着分子は、ピレンブタジエン酸であればよい。 In the biomolecule detection element , the adhesion molecule only needs to contain pyrene in the skeleton. For example, the adhesion molecule may be pyrene butadiene acid.
上記生体分子検出素子において、シグナル分子は、アプタマーに結合可能な蛍光色素分子であり、信号は、蛍光であればよい。 In the biomolecule detection element , the signal molecule is a fluorescent dye molecule that can bind to the aptamer, and the signal may be fluorescence.
上記生体分子検出素子は、接着分子で接着しているセンサ感部を備え、センサ感部は、酸化グラフェンから構成されている。 The biomolecule detecting element is provided with a sensor sensitive portion which is adhered by adhesion molecules, sensor sensitive unit, that consists graphene oxide.
また、本発明に係る生体分子検出素子の製造方法は、検出対象の生体分子と特異的に結合するアプタマーを作製する第１工程と、出力される信号がセンサ感部との距離に対応して変化するシグナル分子をアプタマーの一端に結合させる第２工程と、アプタマーとセンサ感部とを接着する接着分子をアプタマーの他端に結合させる第３工程と、アプタマーの接着分子を、センサ感部の表面に接着させる第４工程とを備え、センサ感部は、酸化グラフェンから構成する。 Further, the method for producing a biomolecule detection element according to the present invention includes a first step of producing an aptamer that specifically binds to a biomolecule to be detected, and an output signal corresponding to a distance from the sensor sensing portion. A second step of binding a changing signal molecule to one end of the aptamer, a third step of binding an adhesive molecule that bonds the aptamer and the sensor sensitive part to the other end of the aptamer, and an aptamer adhesive molecule to the sensor sensitive part. and a fourth step of adhering to the surface, the sensor sensitive portion, that make up the graphene oxide.
以上説明したことにより、本発明によれば、センサ感部の箇所において、シグナル分子による信号が検出できるようになるという優れた効果が得られる。 As described above, according to the present invention, it is possible to obtain an excellent effect that a signal by a signal molecule can be detected at a sensor sensitive part.
以下、本発明の実施の形態について図を参照して説明する。図１は、本発明の実施の形態における生体分子検出素子の構成を示す構成図である。この生体分子検出素子は、生体分子検出分子１００とセンサ感部１１１とから構成されている。 Hereinafter, embodiments of the present invention will be described with reference to the drawings. FIG. 1 is a configuration diagram showing a configuration of a biomolecule detection element according to an embodiment of the present invention. This biomolecule detection element is composed of a biomolecule detection molecule 100 and a sensor sensing part 111.
生体分子検出分子１００は、検出対象の生体分子と特異的に結合するアプタマー１０１と、アプタマー１０１の一端に結合し、出力される信号がセンサ感部１１１との距離に対応して変化するシグナル分子１０２と、アプタマー１０１の他端に結合してアプタマー１０１とセンサ感部１１１とを接着する接着分子１０３とを備える。なお、「アプタマー」は、検出対象の生体分子と特異的に結合する部分のことを示すものとする。 The biomolecule detection molecule 100 includes an aptamer 101 that specifically binds to a biomolecule to be detected, a signal molecule that binds to one end of the aptamer 101, and an output signal changes according to the distance from the sensor sensing unit 111. 102 and an adhesion molecule 103 that bonds to the other end of the aptamer 101 to bond the aptamer 101 and the sensor sensing part 111. The “aptamer” indicates a part that specifically binds to a biomolecule to be detected.
シグナル分子１０２は、アプタマーを用いた生体分子検出でよく用いられる蛍光分子（蛍光色素分子）であればよい。また、この場合、センサ感部１１１は、酸化グラフェンなどの蛍光クエンチャーであればよい。また、シグナル分子１０２は、フェロセンなどの電気化学的に活性な分子であってもよい。この場合、センサ感部１１１は、導電物質から構成すればよく、グラフェンなどの炭素材料でもよく、金属から構成してもよい。この構成とすることで、シグナル分子１０２とセンサ感部１１１との距離の変化が、電気信号の変化として検出できる。 The signal molecule 102 may be a fluorescent molecule (fluorescent dye molecule) often used in biomolecule detection using an aptamer. In this case, the sensor sensing unit 111 may be a fluorescent quencher such as graphene oxide. The signal molecule 102 may be an electrochemically active molecule such as ferrocene. In this case, the sensor sensing unit 111 may be made of a conductive material, may be made of a carbon material such as graphene, or may be made of a metal. With this configuration, a change in the distance between the signal molecule 102 and the sensor sensing unit 111 can be detected as a change in the electrical signal.
また、接着分子１０３は、センサ感部１１１に物理吸着する分子から構成すればよい。例えば、センサ感部１１１が、酸化グラフェンなどの炭素材料から構成されている場合、ピレンが骨格に含まれている分子であればよい。ピレンが骨格に含まれている分子であれば、炭素材料に吸着（接着）させることができる。また、接着分子１０３は、センサ感部１１１に化学的に結合する分子であってもよい。例えば、センサ感部１１１がＡｕから構成されている場合、接着分子１０３は、チオール基を有する分子であればよい。 Further, the adhesion molecule 103 may be composed of a molecule that physically adsorbs to the sensor sensitive part 111. For example, when the sensor sensitive part 111 is comprised from carbon materials, such as a graphene oxide, what is necessary is just a molecule | numerator in which pyrene is contained in frame | skeleton. If pyrene is a molecule contained in the skeleton, it can be adsorbed (adhered) to the carbon material. Further, the adhesion molecule 103 may be a molecule that is chemically bonded to the sensor sensitive part 111. For example, when the sensor sensitive part 111 is made of Au, the adhesion molecule 103 may be a molecule having a thiol group.
本実施の形態における生体分子検出素子によれば、図２に示すように、アプタマー１０１が検出対象の生体分子２０１との複合体を形成した場合も、アプタマー１０１は接着分子１０３によりセンサ感部１１１に接着しているので、生体分子検出分子１００が、センサ感部１１１より脱離することがない。この結果、上述したように複合体が形成される状態となっても、シグナル分子１０２より出力される信号は、センサ感部１１１の箇所で検出可能であり、シグナル分子１０２とセンサ感部１１１との距離の変化によって生じる検出信号は、センサ感部１１１表面近くで検出することができる。このため、例えば、基板表面の化学現象を検出するチップ型のデバイスの上で、生体分子検出分子１００を用いた生体分子の検出が可能となる。 According to the biomolecule detection element in the present embodiment, as shown in FIG. 2, even when the aptamer 101 forms a complex with the biomolecule 201 to be detected, the aptamer 101 is detected by the sensor molecule 111 by the adhesion molecule 103. Therefore, the biomolecule detection molecule 100 is not detached from the sensor sensing part 111. As a result, even if a complex is formed as described above, the signal output from the signal molecule 102 can be detected at the sensor sensitive part 111, and the signal molecule 102, the sensor sensitive part 111, The detection signal generated by the change in the distance can be detected near the surface of the sensor sensing unit 111. Therefore, for example, it is possible to detect a biomolecule using the biomolecule detection molecule 100 on a chip-type device that detects a chemical phenomenon on the substrate surface.
以下、より詳細に説明する。シグナル分子および接着分子をアプタマーに化学結合する方法としては、アプタマーの片方の末端にアミノ基などを導入し、ここにシグナル分子または接着分子に導入したカルボキシル基もしくはＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル部位を反応させて化学結合を形成する方法が好ましい。 This will be described in more detail below. As a method of chemically binding the signal molecule and the adhesion molecule to the aptamer, an amino group or the like is introduced at one end of the aptamer, and the carboxyl group or N-hydroxysuccinimide ester site introduced into the signal molecule or the adhesion molecule is reacted therewith. The method of forming a chemical bond is preferable.
また、センサ感部表面に上記のアプタマーを接着させる方法としては、種々の方法が可能である。例えば、図３に示すように、ステップＳ３０１で、センサ感部を作製し、ステップＳ３０２で作製したセンサ感部をチップとなる基板に固定した後、ステップＳ３０３で、センサ感部の表面に、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル部位を有する接着分子を接着（吸着）させる。一方で、ステップＳ３０４で、アプタマーを合成し、ステップＳ３０５で、合成したアプタマーの一方の末端にシグナル分子を結合させ、他方の末端にアミノ基（接着分子結合部位）を導入する。 Various methods can be used as a method for adhering the aptamer to the surface of the sensor sensitive part. For example, as shown in FIG. 3, in step S <b> 301, a sensor sensitive part is manufactured, and after the sensor sensitive part prepared in step S <b> 302 is fixed to a substrate serving as a chip, N is formed on the surface of the sensor sensitive part in step S <b> 303. -Adhesion (adsorption) of an adhesion molecule having a hydroxysuccinimide ester moiety. On the other hand, in step S304, an aptamer is synthesized. In step S305, a signal molecule is bound to one end of the synthesized aptamer, and an amino group (adhesion molecule binding site) is introduced to the other end.
これらの後、ステップＳ３０６で、シグナル分子が結合してアミノ基が導入されたアプタマーのアミノ基の部分を、センサ感部表面に吸着している接着分子に結合させればよい。一方の末端に蛍光色素分子などが結合し、かつ他方の末端にアミノ基が導入されているアプタマーは、核酸やペプチドのカスタム合成を行う試薬メーカーなどから入手可能である。 Thereafter, in step S306, the amino group portion of the aptamer to which the signal molecule is bonded and the amino group is introduced may be bonded to the adhesion molecule adsorbed on the surface of the sensor sensitive part. Aptamers in which a fluorescent dye molecule or the like is bonded to one end and an amino group is introduced to the other end can be obtained from a reagent manufacturer that performs custom synthesis of nucleic acids and peptides.
また、図４に示すように、ステップＳ４０１で、センサ感部を作製し、ステップＳ３０２で作製したセンサ感部をチップとなる基板に固定する。一方で、ステップＳ４０３で、アプタマーを合成し、ステップＳ４０４で、合成したアプタマーの一方の末端にシグナル分子を結合させ、他方の末端に接着分子を結合させる。これらの後、ステップＳ４０５で、シグナル分子および接着分子が結合したアプタマーの接着分子を、センサ感部表面に接着（吸着）させればよい。 Also, as shown in FIG. 4, in step S401, a sensor sensitive part is prepared, and the sensor sensitive part prepared in step S302 is fixed to a substrate serving as a chip. On the other hand, in step S403, an aptamer is synthesized, and in step S404, a signal molecule is bound to one end of the synthesized aptamer, and an adhesion molecule is bound to the other end. Thereafter, in step S405, the aptamer adhesion molecule to which the signal molecule and the adhesion molecule are bonded may be adhered (adsorbed) to the surface of the sensor sensitive part.
センサ感部表面に接着させるアプタマー（生体分子検出分子）の密度の制御は、固定時間，アプタマーの濃度，反応温度などを制御することで達成される。また、この密度は、水晶発振子マイクロバランス（ＱＣＭ）法、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）法、Ｘ線光電子分光（ＸＰＳ）法、原子間力顕微鏡（ＡＦＭ）法など種々の分析方法により確認可能である。 Control of the density of the aptamer (biomolecule detection molecule) adhered to the surface of the sensor sensitive part is achieved by controlling the fixing time, the aptamer concentration, the reaction temperature, and the like. This density can be confirmed by various analysis methods such as quartz crystal microbalance (QCM) method, surface plasmon resonance (SPR) method, X-ray photoelectron spectroscopy (XPS) method, and atomic force microscope (AFM) method. is there.
また、生体分子検出分子がセンサ感部に接着している生体分子検出素子を固定する基板としては、ガラス基板，石英基板、シリコン基板などを用いることができる。なお、これらの基板に、金属膜などが蒸着されていてもよい。 In addition, a glass substrate, a quartz substrate, a silicon substrate, or the like can be used as a substrate for fixing the biomolecule detection element in which the biomolecule detection molecule is bonded to the sensor sensitive part. Note that a metal film or the like may be deposited on these substrates.
生体分子検出素子を固定した生体分子検出チップでは、試料溶液を直接検出部に滴下してもよい。また、流路を搭載することによって、生体分子検出素子が固定されている検出部に試料溶液を導入してもよい。流路には様々な材料が適用可能であり、流路の作製には、種々の方法があげられるが、ポリジメチルシロキサンなどの高分子樹脂を、鋳型を用いて作製する方法が好ましい。ポリスチレンなどの樹脂を用いて、射出成型法などで作製してもよい。さらに、ガラス板，石英板，アクリル板などを、ミリング法を用いて加工することで成形してもよい。 In the biomolecule detection chip to which the biomolecule detection element is fixed, the sample solution may be dropped directly on the detection unit. In addition, the sample solution may be introduced into the detection unit on which the biomolecule detection element is fixed by mounting a flow path. Various materials can be applied to the flow path, and various methods can be used to manufacture the flow path, but a method of manufacturing a polymer resin such as polydimethylsiloxane using a mold is preferable. You may produce by injection molding etc. using resin, such as polystyrene. Furthermore, you may shape | mold by processing a glass plate, a quartz plate, an acrylic board etc. using the milling method.
流路の幅は、１００μｍ〜１０００μｍ程度、流路の高さは１０μｍ〜５００μｍ程度、流路の長さは１ｍｍ〜１０ｍｍ程度が望ましい。この寸法とした流路では、毛管現象を利用して溶液を簡単に送液することが可能であり、ポンプなどの外部の駆動力を使う必要がない。また、複数本の流路を並列させる場合は、異なる流路からの液漏れを回避するため、隣り合う流路の間隔は１０μｍ以上が望ましい。 The width of the flow path is preferably about 100 μm to 1000 μm, the height of the flow path is about 10 μm to 500 μm, and the length of the flow path is preferably about 1 mm to 10 mm. In the channel having this dimension, it is possible to easily send the solution by utilizing the capillary phenomenon, and it is not necessary to use an external driving force such as a pump. When a plurality of flow paths are arranged in parallel, the interval between adjacent flow paths is preferably 10 μm or more in order to avoid liquid leakage from different flow paths.
以下、実施例を用いて説明する。 Hereinafter, description will be made using examples.
［実施例１］
はじめに、実施例１について説明する。実施例１では、シグナル分子とセンサ感部の組み合わせとして蛍光分子と酸化グラフェンを用いた場合について説明する。
[Example 1]
First, Example 1 will be described. In Example 1, a case where a fluorescent molecule and graphene oxide are used as a combination of a signal molecule and a sensor sensitive part will be described.
酸化グラフェンは、例えばグラファイトを化学的に酸化することで形成したものである。より詳細に説明すると、まず、ボールミルで粉砕した天然グラファイト（１ｇ）と濃硫酸（３４．５ｍｌ）とを混合し、撹拌しながらこの混合物中に硝酸ナトリウム（０．７５ｇ）を加える。これらの混合物を氷冷下におき、さらに、過マンガン酸カリウム（４．５ｇ）を徐々に加え、撹拌を２時間継続する。この後、混合物を室温に戻し、さらに、５日間撹拌を続ける。この結果、濃灰色の生成物が得られる。 Graphene oxide is formed, for example, by chemically oxidizing graphite. More specifically, first, natural graphite (1 g) crushed by a ball mill and concentrated sulfuric acid (34.5 ml) are mixed, and sodium nitrate (0.75 g) is added to the mixture while stirring. These mixtures are placed under ice cooling, and potassium permanganate (4.5 g) is gradually added, and stirring is continued for 2 hours. After this, the mixture is allowed to return to room temperature and stirring is continued for a further 5 days. This results in a dark gray product.
次に、得られた生成物に、５％希硫酸（１００ｍｌ）、過酸化水素水（３ｍｌ）を加え撹拌して液状とした後、これをさらに過剰量の硫酸（３％）と過酸化水素水（０．５％）との混合溶液中に加え、遠心分離により沈殿物を分取する。引き続き、沈殿物に純水を加えて分散し、遠心分離により沈殿物を分取する。これらのことにより、最終生成物として、濃褐色の油状物質として酸化グラフェンが得られる。 Next, 5% dilute sulfuric acid (100 ml) and aqueous hydrogen peroxide (3 ml) were added to the resulting product and stirred to form a liquid, and this was further mixed with excess sulfuric acid (3%) and hydrogen peroxide. It is added to a mixed solution with water (0.5%), and the precipitate is collected by centrifugation. Subsequently, pure water is added to the precipitate for dispersion, and the precipitate is collected by centrifugation. These results in graphene oxide as a dark brown oily substance as the final product.
以上のようにして得られた酸化グラフェンを、純水に加えて撹拌することで、炭素材料（酸化グラフェン）が分散した分散水溶液（均一分散水溶液）が得られる。この分散水溶液中には、大きさが約１μｍから１００μｍ四方の様々な酸化グラフェンの小片が混在している。得られた分散水溶液は、茶褐色となる。この分散水溶液中に分散している物質は、原子間力顕微鏡観察およびラマン分光分析から、単層〜３層の酸化グラフェンの小片（膜片）が主要成分であることが確認されている。 The graphene oxide obtained as described above is added to pure water and stirred to obtain a dispersed aqueous solution (uniformly dispersed aqueous solution) in which a carbon material (graphene oxide) is dispersed. In this dispersed aqueous solution, small pieces of various graphene oxides having a size of about 1 μm to 100 μm square are mixed. The obtained dispersion aqueous solution becomes brown. It is confirmed from atomic force microscope observation and Raman spectroscopic analysis that the substance dispersed in this dispersed aqueous solution is mainly composed of single-layer to three-layer graphene oxide pieces (film pieces).
次いで、この酸化グラフェンが分散した水溶液を、親水処理した基板の上に塗布する。基板に塗布する方法としては、例えば、スピンコート法、キャスト法があげられる。基板には、ガラス基板，石英基板，もしくはシリコン基板などを用いることができる。分散水溶液中の酸化グラフェンの小片は、速やかにガラス基板，石英基板，もしくはシリコン基板表面上に吸着するため、余分な酸化グラフェン分散水溶液を水洗により除去してもよい。この塗布により、単層〜３層程度の酸化グラフェンの小片からなる層が均一に形成できる。また、分散水溶液における酸化グラフェンの濃度は、０．０１〜１ｗｔ％程度とすればよい。 Next, the aqueous solution in which the graphene oxide is dispersed is applied onto a hydrophilically treated substrate. Examples of the method of applying to the substrate include a spin coating method and a casting method. As the substrate, a glass substrate, a quartz substrate, a silicon substrate, or the like can be used. Since the small pieces of graphene oxide in the aqueous dispersion quickly adsorb on the surface of the glass substrate, quartz substrate, or silicon substrate, the excess aqueous graphene oxide dispersion may be removed by washing with water. By this coating, a layer composed of small pieces of graphene oxide of about 1 to 3 layers can be formed uniformly. Further, the concentration of graphene oxide in the dispersed aqueous solution may be about 0.01 to 1 wt%.
次に、接着分子を導入するため、ピレンブタジエン酸のＣＯＯＨ基をスクシンイミドで活性化したピレンブタジエン酸スクシンイミドエステルの０．５ｍＭジメチルホルムアミド溶液を、酸化グラフェンを固定した基板に滴下し、室温で１時間静置し、酸化グラフェン表面に吸着させる。これをジメチルホルムアミドで洗浄し、この後、風乾する。 Next, in order to introduce an adhesion molecule, a 0.5 mM dimethylformamide solution of pyrenebutadiene acid succinimide ester in which the COOH group of pyrenebutadiene acid is activated with succinimide is dropped on a substrate on which graphene oxide is fixed, and is allowed to stand at room temperature for 1 hour. Let stand and adsorb on the surface of graphene oxide. This is washed with dimethylformamide and then air dried.
次いで、予め３’末端に蛍光色素分子（シグナル分子）を結合させ、５’末端にアミノ基を結合させたアプタマーの水溶液（１００μＭ）を基板に滴下する。次いで、これらを室温（２３℃程度）で１時間静置し、酸化グラフェンに吸着しているピレンブタジエン酸のＣＯＯＨ基と、アプタマーの５’末端に結合させたアミノ基とを反応させ、ペプチド結合を介して結合する。これを、超純水で洗浄し、風乾する。これらのことにより、接着分子であるピレンブタジエン酸とシグナル分子である蛍光色素分子の両者が結合されているアプタマーが、酸化グラフェン表面に固定される。これらの結果、本発明の生体分子検出素子を固定した検出用チップが得られる。 Next, an aqueous solution (100 μM) of an aptamer in which a fluorescent dye molecule (signal molecule) is bonded to the 3 ′ end in advance and an amino group is bonded to the 5 ′ end is dropped onto the substrate. Next, these are allowed to stand at room temperature (about 23 ° C.) for 1 hour, and the COOH group of pyrene butadiene acid adsorbed on graphene oxide is reacted with the amino group bonded to the 5 ′ end of the aptamer to form a peptide bond. Join through. This is washed with ultrapure water and air-dried. By these things, the aptamer to which both the pyrene butadiene acid which is an adhesion molecule and the fluorescent dye molecule which is a signal molecule are bonded is fixed to the graphene oxide surface. As a result, a detection chip to which the biomolecule detection element of the present invention is fixed is obtained.
アプタマーとしては、例えばトロンビンに特異的に結合する配列とした、５’−ＧＧＴＴＧＧＴＧＴＧＧＴＴＧＧ−３’（非特許文献１参照）を用いることができる。また３’末端には、蛍光色素分子として、６−ｃａｒｂｏｘｙｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ（ＦＡＭ）を結合させることができる。このように作製した検出用チップにおいて、酸化グラフェン表面に接着分子が接着している状態は、ＡＦＭ法などの分析方法によって確認できる。 As the aptamer, for example, 5′-GGTTGGTGTGGTTG-3 ′ (see Non-Patent Document 1) having a sequence that specifically binds to thrombin can be used. Furthermore, 6-carbofluorescein (FAM) can be bound to the 3 'end as a fluorescent dye molecule. In the detection chip thus manufactured, the state where the adhesion molecule is adhered to the surface of the graphene oxide can be confirmed by an analysis method such as an AFM method.
なお、比較のためには、上記アプタマーの３’末端にＦＡＭを結合させ、５’末端には何も結合させていない生体分子検出分子を用いればよい。この比較のための生体分子検出分子の水溶液（１００μＭ）を、酸化グラフェンを固定した１０ｍｍ四方の酸化膜付きシリコン基板に滴下し、室温で１時間静置する。これにより、酸化グラフェン表面に、接着分子を用いずに、生体分子検出分子を配置した基板が得られる（従来）。この場合、生体分子検出分子が、酸化グラフェンに物理吸着によってある程度固定されているものと考えられる。この状態は、ＡＦＭ法などの分析方法によって確認できる。 For comparison, a biomolecule detection molecule in which FAM is bound to the 3 'end of the aptamer and nothing is bound to the 5' end may be used. An aqueous solution (100 μM) of a biomolecule detection molecule for comparison is dropped onto a 10 mm square silicon substrate with an oxide film on which graphene oxide is fixed, and left at room temperature for 1 hour. Thereby, the board | substrate which has arrange | positioned the biomolecule detection molecule on the graphene oxide surface without using an adhesion molecule is obtained (conventional). In this case, it is considered that the biomolecule detection molecule is fixed to the graphene oxide to some extent by physical adsorption. This state can be confirmed by an analysis method such as an AFM method.
以上の工程によって作製した本発明による生体分子検出チップおよび比較対象の比較チップを、共焦点レーザー蛍光顕微鏡を用いて観察した。まず超純水を滴下して酸化グラフェン表面の蛍光像を測定した。酸化グラフェン表面には、アプタマーと結合しているＦＡＭが配置されているが、本発明によるチップおよび比較のチップの両者とも、蛍光強度は非常に微弱であった。ＦＡＭと酸化グラフェンの距離が近いため、エネルギー移動によってＦＡＭが消光（クエンチング）していることを示している。 The biomolecule detection chip according to the present invention produced by the above steps and the comparison target comparison chip were observed using a confocal laser fluorescence microscope. First, ultrapure water was dropped to measure a fluorescent image on the surface of graphene oxide. On the graphene oxide surface, FAM bonded to the aptamer is arranged, but both the chip according to the present invention and the comparative chip had very weak fluorescence intensity. Since the distance between FAM and graphene oxide is short, it indicates that FAM is quenched (quenched) by energy transfer.
次いで、蛍光像を観察しながら、１００ユニット／ｍｌのトロンビン水溶液を滴下した。トロンビンは、検出対象の生体分子であり、上述したアプタマーと特異的に結合する。本発明によるチップにおいては、滴下後から酸化グラフェンが固定されている検出部の蛍光強度の増加が観測され、図５に示すように、約２〜３分後に強度が最大となり、徐々に強度が弱くなることが観測された。図５の（ａ）に示すトロンビン水溶液滴下直後は、図６の（ａ）に示すように、検出部において、あまり発光は確認されないが、図５の（ｂ）に示す２分後は、図６の（ｂ）に示すように、明確に発光が確認された。なお、図６は、蛍光顕微鏡観察像を示す写真である。これらの結果は、アプタマーとトロンビンとが選択的に結合したことにより、アプタマーの立体構造が変化し、これによりアプタマーに結合しているＦＡＭが、酸化グラフェンへのエネルギー移動を起こさない程度に離間して発光したことで説明できる。 Subsequently, 100 unit / ml thrombin aqueous solution was dripped, observing a fluorescence image. Thrombin is a biomolecule to be detected and specifically binds to the aptamer described above. In the chip according to the present invention, an increase in the fluorescence intensity of the detection part to which the graphene oxide is fixed is observed after dropping, and the intensity becomes maximum after about 2 to 3 minutes as shown in FIG. A weakening was observed. Immediately after dropping the thrombin aqueous solution shown in FIG. 5 (a), as shown in FIG. 6 (a), the detection part does not emit much light, but after 2 minutes shown in FIG. As shown in 6 (b), light emission was clearly confirmed. FIG. 6 is a photograph showing a fluorescence microscope observation image. These results indicate that the aptamer and thrombin are selectively bound to change the three-dimensional structure of the aptamer, so that the FAM bound to the aptamer is separated to the extent that energy transfer to graphene oxide does not occur. This can be explained by emitting light.
蛍光強度の増加は、基板上の酸化グラフェンが固定されている部分でのみ観測されていることから、ＦＡＭと結合しているアプタマーは、トロンビンに選択的に結合した後も酸化グラフェンから脱離していないことが示された。トロンビンに選択的に結合した生体分子検出分子が、酸化グラフェン上に存在していることは、反応後のチップをＡＦＭで観測することによっても、確認可能である。 Since the increase in fluorescence intensity is observed only in the portion where the graphene oxide is fixed on the substrate, the aptamer bonded to FAM is detached from the graphene oxide even after selectively binding to thrombin. Not shown. The presence of biomolecule detection molecules selectively bonded to thrombin on graphene oxide can also be confirmed by observing the chip after reaction with AFM.
一方、比較チップにおいては、トロンビン滴下後においても、酸化グラフェンが固定されている検出分の蛍光強度の増加は観測されなかった。しかし、酸化グラフェンが固定されていない部分も含めて、全体的にわずかに蛍光強度が増加した。これは、アプタマーとトロンビンとが選択的に結合したことにより、比較の生体分子検出分が、酸化グラフェンから脱離して周囲の溶液中へ拡散し、ＦＡＭの発光が観測されたことで説明できる。比較の生体分子検出分が酸化グラフェンから脱離して酸化グラフェン上に存在していないことおよび、トロンビンが吸着していないことは、反応後のチップをＡＦＭで観測することによっても、確認可能である。 On the other hand, in the comparative chip, even after thrombin dropping, an increase in the fluorescence intensity corresponding to the detected amount of graphene oxide immobilized was not observed. However, the fluorescence intensity slightly increased as a whole including a portion where graphene oxide was not fixed. This can be explained by the fact that aptamer and thrombin are selectively bound, so that the detected biomolecule is desorbed from graphene oxide and diffuses into the surrounding solution, and FAM emission is observed. It can be confirmed by observing the chip after the reaction by AFM that the comparative biomolecule detection part is desorbed from the graphene oxide and is not present on the graphene oxide and that thrombin is not adsorbed. .
以上から、実施例１によれば、本発明を用いて、アプタマーが対象とする生体分子と複合体を形成した後も、生体分子検出分子がセンサ感部である酸化グラフェンの上に存在し、蛍光色素分子が生体分子検出分子と共に、酸化グラフェンから完全に脱離してしまう問題を回避できる。また、蛍光色素分子と酸化グラフェン表面との距離の変化によって生じる検出信号は、酸化グラフェンを固定した基板表面で検出することが可能となるという本発明の効果が示された。これにより、本発明による生体分子検出チップが実現可能なことが示された。 From the above, according to Example 1, using the present invention, even after the aptamer forms a complex with the target biomolecule, the biomolecule detection molecule exists on the graphene oxide that is the sensor sensitive part, The problem that the fluorescent dye molecule is completely detached from the graphene oxide together with the biomolecule detection molecule can be avoided. In addition, the effect of the present invention was shown that a detection signal generated by a change in the distance between the fluorescent dye molecule and the graphene oxide surface can be detected on the substrate surface on which the graphene oxide is fixed. Thus, it was shown that the biomolecule detection chip according to the present invention can be realized.
［実施例２］
次に、実施例２について説明する。上述した実施例１と同様に酸化グラフェンが分散した水溶液を合成する。基板には、親水処理した厚さ約０．１５ｍｍで１８ｍｍ四方のガラス板を用い、実施例１と同様に、スピンコート法を用いて酸化グラフェンを固定する。
[Example 2]
Next, Example 2 will be described. An aqueous solution in which graphene oxide is dispersed is synthesized in the same manner as in Example 1 described above. As a substrate, a glass plate having a thickness of about 0.15 mm and a size of 18 mm square is used for the substrate, and graphene oxide is fixed using a spin coating method in the same manner as in Example 1.
次に、予め３’末端に蛍光色素分子を結合させ、５’末端にアミノ基を結合させたアプタマー（生体分子検出分子）を用意する。水溶液（１００μＭ）として用意する。このアプタマーに接着分子を結合させるため、ピレンブタジエン酸（接着分子）のＣＯＯＨ基をスクシンイミドで活性化したピレンブタジエン酸スクシンイミドエステルの０．５ｍＭジメチルホルムアミド溶液を上記水溶液に混合し、室温で１時間静置する。 Next, an aptamer (biomolecule detection molecule) is prepared in which a fluorescent dye molecule is bonded to the 3 'end in advance and an amino group is bonded to the 5' end. Prepare as an aqueous solution (100 μM). In order to bond an adhesion molecule to this aptamer, a 0.5 mM dimethylformamide solution of pyrenebutadiene acid succinimide ester in which the COOH group of pyrenebutadiene acid (adhesion molecule) is activated with succinimide is mixed with the above aqueous solution, and the mixture is allowed to stand at room temperature for 1 hour. Put.
このようにして、溶液中で、アプタマーの５’末端のアミノ基とピレンブタジエン酸のＣＯＯＨ基とを反応させ、ペプチド結合を介してこれらを結合する。このように接着分子を結合させたアプタマーの溶液を、酸化グラフェンを固定した基板に滴下し、室温で１時間静置し、酸化グラフェン表面に吸着（接着）させる。アプタマーの他端（５’末端）に結合した接着分子であるピレンブタジエン酸が、酸化グラフェンに吸着する。これを超純水で洗浄、風乾する。これにより、酸化グラフェン表面に、接着分子であるピレンブタジエン酸とシグナル分子である蛍光色素分子の両者が結合されているアプタマーが固定される。アプタマーおよび蛍光色素分子は、実施例１と同様のものを用いればよい。 In this way, the amino group at the 5 'end of the aptamer is reacted with the COOH group of pyrene butadiene acid in a solution, and these are bonded via a peptide bond. The aptamer solution to which the adhesion molecules are bonded in this manner is dropped onto a substrate on which graphene oxide is fixed, and is allowed to stand at room temperature for 1 hour to be adsorbed (adhered) to the surface of graphene oxide. Pyrenebutadiene acid, which is an adhesion molecule bonded to the other end (5 ′ end) of the aptamer, is adsorbed to graphene oxide. This is washed with ultrapure water and air-dried. As a result, the aptamer in which both the pyrene butadiene acid as the adhesion molecule and the fluorescent dye molecule as the signal molecule are bonded to the surface of the graphene oxide is fixed. The aptamer and the fluorescent dye molecule may be the same as those in Example 1.
次いで、ポリジメチルシロキサン樹脂を材料とし、幅５００μｍ，高さ１００μｍ，長さ１０ｍｍの形状に、鋳型を用いて成形して流路を作製する。流路の両端には、試料溶液を導入するため、直径８００μｍの貫通孔が設けられている。この流路を、上述の基板に密着させて搭載する。これらのことにより、本発明による生体分子検出素子を固定した検出用チップを得る。 Next, using a polydimethylsiloxane resin as a material, a flow path is formed by molding into a shape having a width of 500 μm, a height of 100 μm, and a length of 10 mm using a mold. A through hole having a diameter of 800 μm is provided at both ends of the flow path for introducing the sample solution. This flow path is mounted in close contact with the above-described substrate. By these things, the chip | tip for a detection which fixed the biomolecule detection element by this invention is obtained.
以上の工程によって作製した本発明による生体分子検出チップを、実施例１と同様に、共焦点レーザー蛍光顕微鏡を用いて観察した。まず超純水を流路片側の貫通孔に滴下し、毛管現象を用いて流路に導入し、流路の内部と外部が同一視野内に観測される位置において、酸化グラフェン表面の蛍光像を測定した。酸化グラフェン表面には、アプタマーと結合しているＦＡＭが配置されているが、図７に示すように、流路の内部と外部とも、蛍光強度は非常に微弱であった。ＦＡＭと酸化グラフェンの距離が近いため、エネルギー移動によってＦＡＭが消光していることを示している。 The biomolecule detection chip according to the present invention produced by the above steps was observed using a confocal laser fluorescence microscope as in Example 1. First, ultrapure water is dropped into the through hole on one side of the flow channel, introduced into the flow channel using capillary action, and a fluorescent image of the graphene oxide surface is observed at a position where the inside and outside of the flow channel are observed within the same field of view. It was measured. On the graphene oxide surface, FAM bonded to the aptamer is arranged, but as shown in FIG. 7, the fluorescence intensity was very weak both inside and outside the channel. Since the distance between FAM and graphene oxide is short, it indicates that FAM is quenched by energy transfer.
次いで、蛍光像を観察しながら、１００ユニット／ｍｌのトロンビン水溶液を流路片側の貫通孔に滴下し、毛管現象を用いて流路に導入した。流路内部では、図７に示すように、滴下後から酸化グラフェンが固定されている検出部のみで蛍光強度の増加が観測された。これは、アプタマーとトロンビンとが選択的に結合したことにより、アプタマーの立体構造が変化し、これによりアプタマーに結合しているＦＡＭが、酸化グラフェンへのエネルギー移動を起こさない程度に遠い距離に移動して発光したことで説明できる。蛍光強度の増加は、基板上の酸化グラフェンが固定されている検出部でのみ観測されていることから、ＦＡＭと結合しているアプタマーは、トロンビンと選択的に結合した後も酸化グラフェンの上に配置されて酸化グラフェンから脱離していないことが示された。 Next, while observing the fluorescent image, 100 unit / ml thrombin aqueous solution was dropped into the through hole on one side of the flow channel and introduced into the flow channel using capillary action. In the flow channel, as shown in FIG. 7, an increase in fluorescence intensity was observed only in the detection part to which graphene oxide was fixed after dropping. This is because the three-dimensional structure of the aptamer changes due to the selective binding of the aptamer and thrombin, so that the FAM bound to the aptamer moves far enough to prevent energy transfer to graphene oxide. This can be explained by emitting light. Since the increase in fluorescence intensity is observed only in the detection part where the graphene oxide on the substrate is fixed, the aptamer bound to FAM remains on the graphene oxide even after selectively binding to thrombin. It was shown that it was not detached from the graphene oxide.
以上から、実施例２によれば、アプタマーに固定したシグナル分子が、センサ感部から完全に脱離してしまう問題を回避でき、シグナル分子とセンサ感部との距離の変化によって生じる検出信号は、センサ感部の表面近くで検出することが可能となるという本発明の効果が示された。これにより、本発明による生体分子検出チップが実現可能なことが示された。 From the above, according to Example 2, it is possible to avoid the problem that the signal molecule fixed to the aptamer is completely detached from the sensor sensitive part, and the detection signal generated by the change in the distance between the signal molecule and the sensor sensitive part is: The effect of the present invention that it is possible to detect near the surface of the sensor-sensing portion was shown. Thus, it was shown that the biomolecule detection chip according to the present invention can be realized.
さらに、図７にも示したように、流路の外部では、蛍光強度の増加は観測されなかった。流路内部および外部の両方で、観測開始後から徐々に蛍光強度が弱くなることが観測されたが、これば観測のための励起光によって蛍光色素分子が劣化するためである。流路の内部と外部が同一視野内に観測される位置で蛍光像を測定することにより、反応による応答信号（流路内部）と、参照信号（流路外部）における蛍光色素分子の劣化や経時変化は同等の条件となる。以上から、本発明における生体分子検出チップを用いれば、蛍光色素分子の劣化や経時変化の影響を相殺し、正味の応答の差を精度よく測定することが可能になるという効果が得られることが示された。 Furthermore, as shown in FIG. 7, no increase in fluorescence intensity was observed outside the flow path. It has been observed that the fluorescence intensity gradually decreases after the start of observation both inside and outside the flow path, because this is because the fluorescent dye molecules deteriorate due to the excitation light for observation. By measuring the fluorescence image at a position where the inside and outside of the flow channel are observed within the same field of view, the degradation of the fluorescent dye molecules in the response signal due to the reaction (inside the flow channel) and the reference signal (outside the flow channel) The change is an equivalent condition. As described above, the use of the biomolecule detection chip in the present invention can provide an effect that it is possible to accurately measure the difference in net response by offsetting the influence of deterioration and change with time of the fluorescent dye molecule. Indicated.
以上に説明したように、本発明によれば、一端にセンサ分子が結合したアプタマーの他端に接着分子を結合させ、接着分子でセンサ感部に接着するようにしたので、センサ感部の箇所において、シグナル分子による信号が確実に検出できるようになる。 As described above, according to the present invention, the adhesive molecule is bonded to the other end of the aptamer having the sensor molecule bonded to one end, and the adhesive molecule is bonded to the sensor sensitive portion. Thus, it becomes possible to reliably detect the signal by the signal molecule.
また、接着分子により接着することで、接着分子により生体分子検出分子がセンサ感部に強く固定されるようになるので、加熱などの処理を行っても生体分子検出分子が、センサ感部より脱離することが抑制できる。例えば、生体分子検出素子を検出に用いる前に、９５℃×５分程度の加熱処理が可能となる。この加熱処理により、アプタマーの構造は自由度が高くなるため、エネルギー的に安定な構造に変化させることが可能となる。この加熱を行ってから室温程度に戻したときに、エネルギー的に安定な本来の構造のままアプタマーが固まるので、検出対象の生体分子との特異的な結合をしやすい構造となり、検出の効率を向上させることができる。 In addition, since the biomolecule detection molecule is strongly fixed to the sensor sensitive part by the adhesion molecule by adhering with the adhesive molecule, the biomolecule detection molecule is detached from the sensor sensitive part even if a treatment such as heating is performed. Separation can be suppressed. For example, a heat treatment of about 95 ° C. × 5 minutes can be performed before using the biomolecule detection element for detection. By this heat treatment, the aptamer structure has a high degree of freedom and can be changed to an energy stable structure. When this heating is performed and the temperature is returned to room temperature, the aptamer solidifies in its original structure that is stable in terms of energy, so that it becomes a structure that is easy to specifically bind to the biomolecule to be detected, and the detection efficiency is improved. Can be improved.
また、上述したように耐熱性が向上するので、検出対象の生体分子の検出などを行ったとで、例えば、９５℃×５分程度の加熱処理を行うと、結合している検出対象の生体分子を分離することができ、再度、生体分子検出分子（生体分子検出素子）を検出に用いることが可能となる。 In addition, since the heat resistance is improved as described above, the detection target biomolecule is detected. For example, when the heat treatment is performed at 95 ° C. for about 5 minutes, the detection target biomolecule is bound. And the biomolecule detection molecule (biomolecule detection element) can be used again for detection.
なお、本発明は以上に説明した実施の形態に限定されるものではなく、本発明の技術的思想内で、当分野において通常の知識を有する者により、多くの変形および組み合わせが実施可能であることは明白である。例えば、アプタマーは、核酸から構成したものに限らず、ペプチドから構成されたものであってもよい。また、シグナル分子や接着分子が結合しているアプタマーの端部に、更に、核酸やペプチドが配列した分子が結合していてもよい。 The present invention is not limited to the embodiment described above, and many modifications and combinations can be implemented by those having ordinary knowledge in the art within the technical idea of the present invention. It is obvious. For example, the aptamer is not limited to a nucleic acid, but may be a peptide. Further, a molecule in which a nucleic acid or a peptide is arranged may be further bonded to the end of the aptamer to which a signal molecule or an adhesion molecule is bonded.
また、接着分子は、ピレンブタジエン酸などピレンが骨格に含まれているものに限らず、例えば、ベンゼンおよび多環芳香族分子（ナフタレン，アントラセン，テトラセン，ペンタセン，フェナントレン，ピレン，ペリレン，コロネン）などであってもよい。また、接着分子をアプタマーと結合させる官能基（分子）は、ブタジエン酸に限るものではなく、「−ＣＯＯＨ」および「−（ＣＨ2）nＣＯＯＨ」であってもよい。なお、ｎは、好ましくは２〜１０の範囲がよい。 Adhesion molecules are not limited to those containing pyrene in the skeleton such as pyrene butadiene acid, and examples thereof include benzene and polycyclic aromatic molecules (naphthalene, anthracene, tetracene, pentacene, phenanthrene, pyrene, perylene, coronene), etc. It may be. The functional group (molecule) that binds the adhesion molecule to the aptamer is not limited to butadiene acid, and may be “—COOH” and “— (CH 2 ) n COOH”. Note that n is preferably in the range of 2 to 10.
１００…生体分子検出分子、１０１…アプタマー、１０２…シグナル分子、１０３…接着分子、１１１…センサ感部。 DESCRIPTION OF SYMBOLS 100 ... Biomolecule detection molecule, 101 ... Aptamer, 102 ... Signal molecule, 103 ... Adhesion molecule, 111 ... Sensor sensitive part.
Claims (5)
前記アプタマーの一端に結合し、出力される信号がセンサ感部との距離に対応して変化するシグナル分子と、
前記アプタマーの他端に結合して前記アプタマーと前記センサ感部とを接着する接着分子と
を備える生体分子検出分子と、
前記生体分子検出分子が前記接着分子で接着している前記センサ感部と
を備え、
前記センサ感部は、酸化グラフェンから構成されていることを特徴とする生体分子検出素子。 An aptamer that specifically binds to the biomolecule to be detected;
A signal molecule that binds to one end of the aptamer and changes the output signal corresponding to the distance from the sensor sensing part,
Raw molecule detection molecules Ru and an adhesion molecule for bonding the the aptamer and the sensor sensitive portion attached to the other end of the aptamer,
The sensor sensitive part to which the biomolecule detection molecule is bonded with the adhesive molecule ,
The sensor sensitive part, biomolecule detecting element characterized that you have been composed of graphene oxide.
前記接着分子は、ピレンが骨格に含まれていることを特徴とする生体分子検出素子。 The biomolecule detection element according to claim 1, wherein
The biomolecule detection element , wherein the adhesion molecule contains pyrene in a skeleton.
前記接着分子は、ピレンブタジエン酸であることを特徴とする生体分子検出素子。 The biomolecule detection element according to claim 2,
The biomolecule detection element , wherein the adhesion molecule is pyrene butadiene acid.
前記シグナル分子は、前記アプタマーに結合可能な蛍光色素分子であり、前記信号は、蛍光であることを特徴とする生体分子検出素子。 In the biomolecule detection element of any one of Claims 1-3,
The biomolecule detection element , wherein the signal molecule is a fluorescent dye molecule capable of binding to the aptamer, and the signal is fluorescence.
出力される信号がセンサ感部との距離に対応して変化するシグナル分子を前記アプタマーの一端に結合させる第２工程と、
前記アプタマーと前記センサ感部とを接着する接着分子を前記アプタマーの他端に結合させる第３工程と、
前記アプタマーの前記接着分子を、前記センサ感部の表面に接着させる第４工程と
を備え、
前記センサ感部は、酸化グラフェンから構成する
ことを特徴とする生体分子検出素子の製造方法。 A first step of producing an aptamer that specifically binds to a biomolecule to be detected;
A second step of binding a signal molecule whose output signal changes corresponding to the distance from the sensor sensing part to one end of the aptamer;
A third step of bonding an adhesion molecule that bonds the aptamer and the sensor sensing part to the other end of the aptamer ;
A fourth step of adhering the adhesion molecule of the aptamer to the surface of the sensor sensitive part ,
The method for producing a biomolecule detection element , wherein the sensor sensitive part is made of graphene oxide .
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