JP5881206B2 - 骨再生材料 - Google Patents

Description

本発明は、骨再生材料に関する。

骨腫瘍の手術、唇顎口蓋裂、粉砕骨折などに伴う骨欠損を有する患者に対しては、通常、骨移植が行われる。骨移植は、脳外科、整形外科、歯科などの領域における手術に伴って生じる骨欠損を修復するために行われる場合もある。

骨移植には、自家骨を用いることが好ましい。しかし、自家骨を用いるには量的な制限があり、自家骨を取り出した後に残る障害などの問題もある。このため、骨移植に用いる骨として、自家骨に代わり得る人工骨の開発が行われている。

人工骨材としては、ハイドロキシアパタイト（Ｃａ_１０（ＰＯ_４）_６（ＯＨ）_２：以下、「ＨＡ」と記載する場合がある）セラミックス、β−第３リン酸カルシウム（β−ＴＣＰ）セラミックスなどが提案されている。

ＨＡの前駆体である第８リン酸カルシウム（Ｃａ_８Ｈ_２（ＰＯ_４）_６・５Ｈ_２Ｏ：以下、「ＯＣＰ」と記載する場合がある）は、ＨＡよりも優れた多くの機能を有する（特許文献１）。例えば、骨伝導能（非特許文献１）、破骨細胞による吸収性（非特許文献２）、用量依存的な骨芽細胞の分化促進（非特許文献３）に優れている。また、ＨＡの前駆体である非晶質リン酸カルシウム（Ｃａ_３（ＰＯ_４）_２・ｎＨ_２Ｏ）（非特許文献４）や第２リン酸カルシウム（第２リン酸カルシウム無水物（ＣａＨＰＯ_４）あるいは第２リン酸カルシウム２水和物（ＣａＨＰＯ_４・２Ｈ_２Ｏ））（特許文献１および非特許文献５）についてもＯＣＰと同様の性質を有することが報告されている。したがって、人工骨材としては、ＨＡよりはむしろ、ＯＣＰなどのＨＡ前駆体に対する期待が大きい。

しかし、ＯＣＰは人工骨材として用いるには非常に脆く、また賦形性が低い。ＯＣＰの賦形性の低さを補う観点から、ＯＣＰと高分子材料との複合体が検討されている。例えば、ＯＣＰの顆粒とコラーゲンとの複合体（以下、「ＯＣＰ／Ｃｏｌ」と記載する場合がある）が知られている（特許文献２）。ＯＣＰ／Ｃｏｌは、ＯＣＰの優れた骨伝導能を促進するが、人工骨材として用いた場合、人工骨成分が周辺の組織に吸収されて人工骨が消失し、これに置き換わりながら骨が再生する過程において、人工骨の消失速度が骨の再生速度よりも遅くなる。これは、生体内でＯＣＰの顆粒が完全には吸収されにくいために生じる性質である。再生骨が人工骨と十分に置換し、骨の欠損が完全に新生骨で満たされることは、この分野で求められているきわめて重要な課題である。

特許第２７８８７２１号公報 特開２００６−１６７４４５号公報

Suzuki O.ら、Tohoku J. Eng. Med.、1991年、第164巻、p.37-50 Imaizumi H.ら、Calcif. Tissue Int.、2006年、第78巻、p.45-54 Anada T.ら、Tissue Eng.、2008年、第14巻、p.965-978 Meyer J.L.ら、Calcif. Tissue Int.、1978年、第25巻、p.59-68 Eidelman N.ら、Calcif. Tissue Int.、1987年、第41巻、p.18-26

本発明の目的は、良好な賦形性および弾性率を有し、かつ新生骨と十分に置換されて、欠損する前の骨と同じ形状を形成し得る、高い骨再生能を有する骨再生材料を提供することである。

本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討した結果、第８リン酸カルシウム微粉末とゼラチンとの複合体が有効であることを見出し、本発明を完成した。

本発明の骨再生材料は、第８リン酸カルシウム微粉末とゼラチンとの複合体を含む。

１つの実施態様では、上記微粉末は、上記ゼラチン１質量部に対して１〜９質量部である。

本発明は、骨再生材料の製造方法を提供し、該方法は、第８リン酸カルシウム微粉末をゼラチン水溶液に分散させた分散液を凍結乾燥する工程を含む。

本発明によれば、良好な賦形性および弾性率を有し、かつ新生骨と十分に置換されて、欠損する前の骨と同じ形状を形成し得る、高い骨再生能を有する骨再生材料を提供することができる。

ＯＣＰ顆粒（Ａ）およびＮａｎｏ−ＯＣＰ（Ｂ）の形状を示す走査型電子顕微鏡写真である。 Ｎａｎｏ−ＯＣＰ／Ｇｅｌディスクの細孔径を示す走査型電子顕微鏡写真である。 ＯＣＰ／ＧｅｌディスクおよびＮａｎｏ−ＯＣＰ／Ｇｅｌディスクの弾性率を示すグラフである。 ラット頭蓋骨の骨欠損部にＮａｎｏ−ＯＣＰ／Ｇｅｌディスク（９０／１０）（Ａ）、Ｎａｎｏ−ＯＣＰ／Ｇｅｌディスク（５０／５０）（Ｂ）およびＯＣＰ／Ｇｅｌディスク（Ｃ）を埋入して再生した頭蓋骨の断面を示すヘマトキシリン・エオシン（ＨＥ）染色の写真である。

本発明の骨再生材料は、微細化した第８リン酸カルシウム（ＯＣＰ）の微粉末（以下、「Ｎａｎｏ−ＯＣＰ」と記載する場合がある）とゼラチンとの複合体（以下、「Ｎａｎｏ−ＯＣＰ／Ｇｅｌ」と記載する場合がある）を含む。

Ｎａｎｏ−ＯＣＰの粒径としては、通常５〜１０００ｎｍ、好ましくは１００〜４００ｎｍである。１０００ｎｍを超えると、Ｎａｎｏ−ＯＣＰの物理化学的溶解性に基づく骨再生材料の生体内吸収性が低下する。

Ｎａｎｏ−ＯＣＰの調製方法としては、特に限定されないが、好ましくはＯＣＰを機械的に粉砕する方法が挙げられる。ＯＣＰとしては、特に限定されず、市販のＯＣＰであってもよいし、例えば、非特許文献１に記載の方法により調製されるものであってもよい。ＯＣＰは、通常、個々の結晶が凝集した顆粒であり、粒経は通常１０〜１０００μｍである。

ＯＣＰを機械的に粉砕する前にＯＣＰの粒径を均一に（整粒）しておくことが好ましい。整粒して得られるＯＣＰ顆粒の粒径は、好ましくは１０〜１０００μｍ、より好ましくは３００〜５００μｍである。

ＯＣＰを機械的に粉砕する手段としては、特に限定されない。例えば、硬組織破砕装置（ビーズショッカー）、ボールミル、解砕機を用いる手段が挙げられる。

ゼラチンとは、変性コラーゲンをいう。ゼラチンとしては、特に限定されず、市販のゼラチンであってもよいし、例えば、コラーゲンを変性して調製されるものであってもよい。変性方法としては、特に限定されない。例えば、コラーゲンを熱処理する方法が挙げられる。

コラーゲンとしては、特に限定されない。例えば、豚、牛の皮膚、骨、腱に由来するコラーゲンが挙げられる。好ましくは、蛋白分解酵素（例えば、ペプシン、プロナーゼ）により可溶化され、テロペプチドが除去された酵素可溶化コラーゲンである。コラーゲンのタイプとしては、特に限定されないが、好ましくはタイプＩ、タイプＩ＋タイプＩＩＩである。コラーゲンは生体由来成分であるので、安全性が高く、特に酵素可溶化コラーゲンがアレルゲン性も低く好ましい。市販のコラーゲンであってもよい。

Ｎａｎｏ−ＯＣＰとゼラチンとの割合としては、特に限定されないが、好ましくはゼラチン１質量部に対してＮａｎｏ−ＯＣＰが１〜９質量部である。ゼラチン１質量部に対してＮａｎｏ−ＯＣＰが１質量部未満であると、骨再生材料の弾性率が劣る。

本発明の骨再生材料は、本発明の効果が阻害されない範囲内で、一般的に骨再生材料に含まれる成分を含んでいてもよい。このような成分としては、例えば、生体吸収性高分子（ポリ乳酸、ポリ乳酸−ポリエチレングリコール共重合体など）、生体吸収性リン酸カルシウム（β−ＴＣＰなど）、生体非吸収性材料（ＨＡセラミックスなど）が挙げられる。

本発明の骨再生材料は、通常１０〜５００μｍ、好ましくは１００〜３００μｍの細孔径を有する。細孔径が１０μｍ未満であると、細孔内への細胞の浸入が阻害されやすく、５００μｍを超えると、骨再生材料の強度が低下する。また、通常０．１〜１．０Ｍｐａ、好ましくは０．２〜０．６Ｍｐａの弾性率を有する。弾性率が０．１ＭＰａ未満であると、骨再生材料の強度が低下するため、骨再生材料からなる成形体の操作性が低下し、１．０Ｍｐａを超えると、骨再生材料からなる成形体を骨欠損部の形状に加工しづらくなる。

本発明の骨再生材料は、Ｎａｎｏ−ＯＣＰをゼラチン水溶液に分散させた分散液を凍結乾燥する工程を含む方法によって製造することができる。

ゼラチン水溶液のゼラチン濃度としては、特に限定されないが、好ましくは０．１〜５％（ｗ／ｖ）、より好ましくは０．５〜４％（ｗ／ｖ）である。ゼラチン水溶液のｐＨとしては、特に限定されないが、好ましくは５〜８である。ゼラチン水溶液は緩衝成分、リン酸イオン、カルシウムイオンを含んでいてもよい。

ゼラチン水溶液に分散させるＮａｎｏ−ＯＣＰとゼラチンとの割合としては、特に限定されないが、好ましくはゼラチン１質量部に対してＮａｎｏ−ＯＣＰが１〜９質量部である。

凍結乾燥条件としては、特に限定されない。予備凍結温度としては、例えば、−１０〜−１９６℃が挙げられ、凍結温度としては、例えば、−４０〜−９０℃が挙げられ、圧力としては、例えば、５０Ｐａ以下が挙げられる。通常１０〜２４時間で凍結乾燥物が得られる。この凍結乾燥物は、Ｎａｎｏ−ＯＣＰ／Ｇｅｌの一態様である。

凍結乾燥物は、さらに熱架橋処理に供してもよい。熱架橋処理により、Ｎａｎｏ−ＯＣＰ／Ｇｅｌの安定性を高めることができる。熱架橋条件としては、特に限定されない。熱架橋処理温度としては、例えば、１００〜２００℃が挙げられ、処理時間としては、通常６〜４８時間が挙げられる。

本発明の骨再生材料は、適宜成形して使用する。成形手段としては、特に限定されない。例えば、骨再生材料を適当な型に入れて固める方法、固める際に圧力を加える方法が挙げられる。成形体の形状としては、特に限定されない。例えば、ディスク、ブロック、シートが挙げられる。ディスクの大きさとしては、特に限定されない。例えば、直径は、通常３〜２０ｍｍ、好ましくは５〜１０ｍｍである。例えば、厚みは、通常０．５〜５ｍｍ、好ましく１〜２ｍｍである。ブロックの大きさとしては、特に限定されない。例えば、長さ５〜１５ｍｍ、幅５〜５０ｍｍ、高さ５〜１００ｍｍ、好ましくは、長さ８〜１２ｍｍ、幅１０〜３０ｍｍ、高さ１０〜５０ｍｍである。

成形体は、骨欠損部の形状に応じて適宜整形され、放射線滅菌、高圧蒸気滅菌などにより滅菌処理後、骨欠損部に埋入される。ただし、高圧蒸気滅菌は、ＯＣＰの結晶相に影響を及ぼすので、その場合は骨欠損の適用部位を考慮する。

以下、実施例を挙げて本発明を説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。

（実施例１）
（Ｎａｎｏ−ＯＣＰ／Ｇｅｌディスクの調製）
ＯＣＰを非特許文献１に記載の方法により調製した。ＯＣＰの沈殿物を乳鉢で粉砕し、粉砕物を篩により１００〜３００μｍの顆粒に整粒した。整粒したＯＣＰ顆粒１００ｍｇを、硬組織破砕装置（安井器械株式会社製、マルチビーズショッカー）を用いて２５００ｒｐｍ×３０秒×１回の条件にて機械的に粉砕した。容器内壁に付着した粉末を乳鉢で粉砕した。このようにして、Ｎａｎｏ−ＯＣＰを調製した。

Ｎａｎｏ−ＯＣＰの形状を確認するために、Ｎａｎｏ−ＯＣＰの表面にカーボンを蒸着させ、次いでその表面を、走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）（日本電子株式会社製、分析電子顕微鏡ＪＳＭ‐６５００Ｆ）を用いて１５ｋＶ加速電圧下にて解析した。結果を図１に示す。

図１から明らかなように、Ｎａｎｏ−ＯＣＰの粒径は、粉砕する前のＯＣＰ顆粒の粒径と比べて著しく小さくなっており、数１０〜数１００ｎｍであった。

次いで、ゼラチン（シグマ社製、Ｔｙｐｅ Ａ Ｇｅｌａｔｉｎ）を蒸留水に溶解して、３％（ｗ／ｖ）のゼラチンを含む水溶液を調製した。このゼラチン溶液５ｍＬに、Ｎａｎｏ−ＯＣＰを表１に記載の割合で各々分散させた。これらのＮａｎｏ−ＯＣＰ／ゼラチン（Ｎａｎｏ−ＯＣＰ／Ｇｅｌ）分散液を超音波にかけて分散性を上げた後、内径９ｍｍの遠沈用樹脂製チューブに充填し、−２５℃にて一晩維持して凍結した。凍結した分散液を−４５℃にて２４時間凍結乾燥した。凍結乾燥物を１３３Ｐａ以下の減圧下、１５０℃にて２４時間維持し、熱架橋した。チューブの先端を切断し、凍結乾燥物を一定体積でチューブ外へ押し出し、ミクロトームナイフを用いて１ｍｍ厚でカッティングしてＮａｎｏ−ＯＣＰ／Ｇｅｌ（９０／１０）ディスクおよびＮａｎｏ−ＯＣＰ／Ｇｅｌ（５０／５０）ディスクを成形した。

（比較例１）
（ＯＣＰ／Ｇｅｌディスクの調製）
ゼラチン（シグマ社製、Ｔｙｐｅ Ａ Ｇｅｌａｔｉｎ）をリン酸緩衝液（リン酸２水素ナトリウム）に溶解して、１％（ｗ／ｖ）のゼラチンを含む水溶液を調製した。このゼラチン溶液５００ｍＬを攪拌しながら７０℃に維持した。この溶液に、０．０８モル／Ｌの酢酸カルシウム水溶液５００ｍＬを７．５分間かけて滴下して混合した。この混合液をさらに７０℃にて数分間静置することにより、ＯＣＰ／ゼラチン（ＯＣＰ／Ｇｅｌ）の沈殿（共沈物）を形成させた。上清を除去し、沈殿の懸濁液を内径９ｍｍの遠沈用樹脂製チューブに充填し、−２５℃にて一晩維持して凍結した。凍結した懸濁液を−４５℃にて２４時間凍結乾燥した。凍結乾燥物を１３３Ｐａ以下の減圧下、１５０℃にて２４時間維持し、熱架橋した。チューブの先端を切断し、凍結乾燥物を一定体積でチューブ外へ押し出し、ミクロトームナイフを用いて１ｍｍ厚でカッティングしてＯＣＰ／Ｇｅｌ（４０／６０）ディスクを成形した。

得られたＯＣＰ／Ｇｅｌディスクを１０ｍＭ塩酸に浸漬してＯＣＰ結晶を溶解し、次いで溶液上清中のカルシウム濃度を測定し、この濃度に基づいてＯＣＰ／Ｇｅｌの組成を決定した。結果を表２に示す。

（評価）
（細孔径）
実施例１で得られた各ディスクの細孔径を水銀圧入式細孔分布測定装置（マルバーン社製、ＰｏｒｅＭａｓｔｅｒ ６０ ＧＴ）にて解析した。結果を図２に示す。

図２から明らかなように、実施例１で得られたＮａｎｏ−ＯＣＰ／Ｇｅｌディスクは、いずれのディスクについても、１０〜５００μｍの細孔径分布を有していた。これらの細孔径は、細胞が浸潤するのに十分な大きさであった。

（弾性率）
実施例１および比較例１で得られた各ディスクの弾性率を万能試験機（株式会社島津製作所製、ＥＺ−Ｌ−５００Ｎ）により測定した。内径９ｍｍ×厚み１ｍｍのディスクを圧縮試験用治具に設置し、一定のクロスヘッドスピードで荷重−変位曲線を測定して、連続性のある曲線部分にて、荷重−変位の値から応力−ひずみの値（応力／ひずみ：弾性率）を計算した。結果を図３に示す。

図３から明らかなように、実施例１で得られたＮａｎｏ−ＯＣＰ／Ｇｅｌディスクは、Ｎａｎｏ−ＯＣＰの割合が増えるに従い、弾性率が上昇し、埋入に耐えうる十分な弾性率であった。これに対して、比較例１で得られたＯＣＰ／Ｇｅｌディスクは、逆にＯＣＰの割合が増えるに従い、弾性率が低下した。

ディスクの賦形性の観点では、Ｎａｎｏ−ＯＣＰまたはＯＣＰの割合が多い方が望ましい。Ｎａｎｏ−ＯＣＰ／Ｇｅｌディスクでは、Ｎａｎｏ−ＯＣＰの割合を増やすことにより、賦形性と弾性率を同時に高めることができるが、ＯＣＰ／Ｇｅｌディスクでは、ＯＣＰの割合によっては賦形性と弾性率を同時に高めることができないことがわかった。

（骨形成）
ジエチルエーテルおよびネンブタールを用いて、ラット（Ｗｉｓｔａｒ、１２週齢、雄性）に全身麻酔を施した。次いで、ラットの頭蓋部皮膚を剃毛し、露出した皮膚およびその下の骨膜をメスで切開した。頭蓋骨正中部に直径９ｍｍの骨欠損部を形成した。次いで、実施例１で得られたＮａｎｏ−ＯＣＰ／Ｇｅｌ（９０／１０）ディスク、Ｎａｎｏ−ＯＣＰ／Ｇｅｌ（５０／５０）ディスクおよび比較例１で得られたＯＣＰ／Ｇｅｌ（４０／６０）を電子線照射（５ｋＧｙ）により滅菌し、骨欠損部に埋入して骨膜および皮膚を縫合した。

埋入から４週間後、ラットから摘出した頭蓋骨の脱灰標本を用いて、ヘマトキシリン・エオシン（ＨＥ）染色により組織学的分析を行った。結果を図４に示す。

図４から明らかなように、実施例１で得られたＮａｎｏ−ＯＣＰ／Ｇｅｌ（５０／５０）ディスクを埋入したラットでは、埋入したディスクが部分的に再生骨と置き換わり、再生骨は、骨欠損部を形成する前の頭蓋骨と類似の形状を有し、かつ母床骨に近い組織構造を呈した（図４Ｂ）。また、Ｎａｎｏ−ＯＣＰ／Ｇｅｌ（９０／１０）ディスクを埋入したラットでは、埋入したディスクの大脳のある硬膜側（円弧の内側）に、これから骨に成熟していくと思われる新生の骨様組織の形成が広範囲で観察された（図４Ａ）。一方、比較例１で得られたＯＣＰ／Ｇｅｌ（４０／６０）ディスクを埋入したラットでは、埋入したディスクの端部に骨欠損断端から形成された骨組織が部分的に観察されたのみである（図４Ｃ）。

本発明の骨再生材料は、良好な賦形性および弾性率を有し、かつ新生骨と十分に置換されて、欠損する前の骨と同じ形状を形成し得る高い骨再生能を有する。したがって、本発明の骨再生材料は、機能障害を伴う骨欠損への適応のみならず、機能障害が顕在化せず看過されることが多かった手術に伴って形成される骨欠損の修復（脳外科、整形外科、歯科領域など）、骨吸収を伴う歯周病、義歯の保持を不安定化させる顎堤の低下などの障害にも適用され得、患者の生活の質（ＱＯＬ）の向上に寄与し得る。

Claims (3)

1. 粒子径が５〜１０００ｎｍの第８リン酸カルシウム微粉末とゼラチンとの複合体を含み、１０〜５００μｍの細孔を有する骨再生材料。
2. 前記微粉末が、前記ゼラチン１質量部に対して１〜９質量部である、請求項１に記載の骨再生材料。
3. 骨再生材料の製造方法であって、粒子径が５〜１０００ｎｍの第８リン酸カルシウム微粉末をゼラチン水溶液に分散させた分散液を凍結乾燥する工程を含む、方法。

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