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JP5805094B2 - 高有効性のケトール酸レダクトイソメラーゼ酵素を用いたイソブタノールの発酵生産 - Google Patents

高有効性のケトール酸レダクトイソメラーゼ酵素を用いたイソブタノールの発酵生産 Download PDF

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Description

関連出願の相互参照
本出願は、２００９年９月２９日に出願された米国仮特許出願第６１／２４６，８４４号の優先権を主張するものであり、その全体が、参照により本明細書に組み込まれる。
本発明は、具体的にはイソブタノール生成のための産業微生物学および発酵の分野に関する。さらに具体的には、ケトール酸レダクトイソメラーゼ（ＫＡＲＩ）酵素は、乳酸菌および酵母におけるイソブタノール生成のエンジニアリングされたイソブタノール生合成経路において有効性が高いことがわかった。
ブタノールは重要な産業化学物質であり、燃料添加剤として、プラスチック産業における原料化学物質として、ならびに食品および香料産業における食品用抽出溶媒として有用である。毎年、１００〜１２０億ポンドのブタノールが石油化学的手段によって生成され、この汎用化学品に対する需要は高まる可能性が高い。
微生物は、ブタノール生合成経路を発現することによってブタノールを生成するようにエンジニアリングされてきた。イソブタノール生合成経路が、特許文献１に開示されている。商業的に実現可能なイソブタノール生成を実現するには、非常に効率的なイソブタノール経路が必要である。この経路の第２のステップは、ケトール酸レダクトイソメラーゼ（ＫＡＲＩ）によって触媒されるステップであり、アセト乳酸をジヒドロキシイソ吉草酸に変換する。活性の高いＫＡＲＩ酵素およびこれらの酵素のイソブタノール生合成経路における使用が、特許文献２に開示されている。
イソブタノール生合成経路についてエンジニアリングされた微生物において、アセト乳酸をジヒドロキシイソ吉草酸に変換するステップを、イソブタノールの生成が最大限になるようにさらに改良する必要が依然としてある。
米国特許出願公開第２００７００９２９５７号明細書 米国特許出願公開第２００８０２６１２３０（Ａ１）号明細書
本発明は、エンジニアリングされたイソブタノール生合成経路を有する宿主細胞においてより多くのイソブタノールが生成されるように、インビボにおけるアセト乳酸からジヒドロキシイソ吉草酸への変換に高い有効性を示すケトール酸レダクトイソメラーゼ（ＫＡＲＩ）酵素を発現する宿主微生物細胞を提供する。高有効性のＫＡＲＩは、ラクトコッカス・ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ）およびストレプトコッカス・ミュータンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｕｔａｎｓ）ＫＡＲＩを含む分子系統分類群に入る。
本発明の一態様において、ケトール酸レダクトイソメラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする少なくとも１つの核酸分子を含む酵母細胞が提供される。ここで、前記ポリペプチドはＫＡＲＩのＳＬＳＬ Ｃｌａｄｅのメンバーである。別の一態様において、酵母細胞は、サッカロミケス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、シゾサッカロミケス（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、ハンゼヌラ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）、クルイベロミセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）、ヤロウイア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）、およびピキア（Ｐｉｃｈｉａ）からなる群から選択される属の酵母のメンバーである。
別の態様において、前記ＳＬＳＬ Ｃｌａｄｅは、スタフィロコッカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）、リステリア（Ｌｉｓｔｅｒｉａ）、エンテロコッカス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）、マクロコッカス（Ｍａｃｒｏｃｏｃｃｕｓ）、ストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、ラクトコッカス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ）、ロイコノストック（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ）、ラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）からなる群から選択される細菌に内在するケトール酸レダクトイソメラーゼからなる。
別の態様において、ケトール酸レダクトイソメラーゼ活性を有するポリペプチドは、配列番号：２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、および２４５からなる群から選択される配列と少なくとも約８０％同一であるアミノ酸配列を有する。
本発明の別の態様は、ケトール酸レダクトイソメラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする少なくとも１つの核酸分子を含むイソブタノール生成微生物細胞であり、ここで前記ポリペプチドはＫＡＲＩのＳＬＳＬ Ｃｌａｄｅのメンバーである。
別の態様において、前記微生物細胞は、エシェリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、エンテロコッカス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）、ラクトコッカス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ）、ラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、ロイコノストック（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ）、オエノコッカス（Ｏｅｎｏｃｏｃｃｕｓ）、ペディオコッカス（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ）、ストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、クロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）、ザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、ペディオコッカス（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ）、アルカリゲネス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）、クレブシエラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）、パエニバチルス（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ）、アルスロバクター（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、およびブレビバクテリウム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）からなる群から選択される属の細菌細胞である。
別の態様において、アセト乳酸をジヒドロキシイソ吉草酸に変換する方法が提供される。前記方法は、
ａ）ケトール酸レダクトイソメラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする少なくとも１つの核酸分子を含む酵母細胞を準備するステップ、ここで前記ポリペプチドはＫＡＲＩのＳＬＳＬ Ｃｌａｄｅのメンバーであるステップと；
ｂ）（ａ）の酵母細胞とアセト乳酸を接触させて、２，３−ジヒドロキシイソ吉草酸が生成されるステップと
を含む。
別の態様において、イソブタノールの生成方法が提供される。前記方法は、
ａ）ケトール酸レダクトイソメラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする少なくとも１つの核酸分子を含む、イソブタノール生合成経路を備える微生物細胞を準備するステップ、ここで前記ポリペプチドは、ＫＡＲＩのＳＬＳＬ Ｃｌａｄｅのメンバーであるステップと；
ｂ）ステップ（ａ）の微生物細胞を、イソブタノールが生成される条件下で増殖させるステップと
を含む。
本明細書では、不活性化されたピルビン酸デカルボキシラーゼ遺伝子を少なくとも１つ有するようにエンジニアリングされ、配列番号：１９８、２０３、２０４、２０８、または２１１からなる群から選択されるプラスミドのコード領域を有するプラスミド、および配列番号：１９８、２０３、２０４、２０８、または２１１からなる群から選択されるプラスミドのコード領域と少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または少なくとも約９９％の同一性を有するコード領域を有するものを含む酵母細胞も提供される。また、少なくとも１つのピルビン酸デカルボキシラーゼ遺伝子を不活性化させるようにエンジニアリングされ、配列番号：１９８、２０３、２０４、２０８、または２１１からなる群から選択されるプラスミドのキメラ遺伝子を有するプラスミド、および配列番号：１９８、２０３、２０４、２０８、または２１１からなる群から選択されるプラスミドのキメラ遺伝子と少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または少なくとも約９９％の同一性を有するキメラ遺伝子を有するものを含む酵母細胞も提供される。また、配列番号：１９８、２０３、２０４、２０８、または２１１の配列を有するプラスミド、および少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または少なくとも約９９％の同一性を有するものも提供される。
本出願の一部分をなす以下の詳細な説明、図面、および添付の配列の説明から、本発明の様々な実施形態をさらに詳しく理解することができる。
異なる３つのイソブタノール生合成経路を示す図である。 ６６７の配列および９５％配列同一性のカットオフを含む、ＫＡＲＩの分子系統樹を示す図である。円の外側の符号は、ＳＬＳＬ Ｃｌａｄｅを示す。 ＫＡＲＩ配列のＳＬＳＬ Ｃｌａｄｅを含む、図２の系統樹の一部分を示す図である。菱形は、ラクトバチルス目（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌａｌｅｓ）のメンバーを示し、丸印は、バチルス目（Ｂａｃｉｌｌａｌｅｓ）のメンバーを示す。各小枝について９５％同一性群を表す種を表に示す。 異なるＫＡＲＩ酵素についてイソブタノール生成酵母の増殖曲線を示すグラフである。ＳＹＫ：単一酵母ＩＬＶ５；ＳＬＫ：単一Ｌ．ラクティスＩｌｖＣ；ＳＰＫ：単一Ｐｆ−５ｉｌｖＣ。 異なるＫＡＲＩ酵素についてイソブタノール生成酵母のイソブタノール力価を示すグラフである。ＳＹＫ：単一酵母ＩＬＶ５；ＳＬＫ：単一Ｌ．ラクティスＩｌｖＣ；ＳＰＫ：単一Ｐｆ−５ｉｌｖＣ。
本出願の一部分をなす以下の詳細な説明および添付の配列の説明から、本発明をさらに詳しく理解することができる。
以下の配列は、３７ Ｃ．Ｆ．Ｒ． １．８２１−１．８２５（「Ｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔｓ ｆｏｒ Ｐａｔｅｎｔ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ Ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ａｎｄ／ｏｒ Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄｉｓｃｌｏｓｕｒｅｓ − ｔｈｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｒｕｌｅｓ」）に従うものであり、Ｗｏｒｌｄ Ｉｎｔｅｌｌｅｃｔｕａｌ Ｐｒｏｐｅｒｔｙ Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ（ＷＩＰＯ） Ｓｔａｎｄａｒｄ ＳＴ．２５ （１９９８）ならびにＥＰＯおよびＰＣＴの配列表要件（Ｒｕｌｅｓ ５．２および４９．５（ａ−ｂｉｓ）、ならびにＳｅｃｔｉｏｎ ２０８およびＡｎｎｅｘ Ｃ ｏｆ ｔｈｅ Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｖｅ Ｉｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎｓ）と一致する。ヌクレオチドおよびアミノ酸配列データに使用される記号およびフォーマットは、３７ Ｃ．Ｆ．Ｒ． §１．８２２に記載の規則に従う。
Figure 0005805094
Figure 0005805094
Figure 0005805094
配列番号：１１０は、プラスミドｐＦＰ９９６の配列である。
配列番号：１１１−１２１、１２３−１２６、１３０、１３１、１３３、１３４、１３
６−１４１、１４３−１４８、１５１−１５４、１５６−１５９、１６１−１６３、１６５、１６６、１６８、１７０−１７３、１７７−１８１、１８６−１９７、１９９−２０２、２０５、２０６、２０９、２１０、２１３−２２２、２２４−２４３は、ＰＣＲおよび配列決定プライマーである。
配列番号：１２２は、ｐｙｒＦの配列である。
配列番号：１２７は、リボソーム結合部位（ＲＢＳ）である。
配列番号：１２８は、プラスミドｐＤＭ２０−ｉｌｖＤ（Ｌ．ラクティス（Ｌ．ｌａｃｔｉｓ））の配列である。
配列番号：１２９は、プラスミドｐＤＭ１の配列である。
配列番号：１３２は、ラクトコッカス・ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ）に由来するＲＢＳおよびｉｌｖＤコード領域を含むＰＣＲ断片の配列である。
配列番号：１３５は、ｓｕｆオペロン（ｓｕｆＣおよびｓｕｆＤの一部分）の５’部分を含む右ホモロジーアームＤＮＡ断片である。
配列番号：１４２は、ネイティブｓｕｆプロモーターおよび上流の配列を含んでｆｅｏＢＡオペロンになる左ホモロジーアームＤＮＡ断片である。
配列番号：１４９は、プラスミドｐＴＮ６の配列である。
配列番号：１５０は、Ｔｎ５ＩＥ−ｌｏｘＰ−ｃｍ−Ｐｓｐａｃ−ｌｏｘＰカセットの配列である。
配列番号：１５５は、Ｐｎｐｒプロモーターである。
配列番号：１６０は、Ｐｎｐｒ−ｔｎｐ融合ＤＮＡ断片である。
配列番号：１６４は、ＰｇｒｏＥプロモーター配列である。
配列番号：１６７は、ｋｉｖＤ（ｏ）コード領域をＲＢＳと共に含むＰＣＲ断片である。
配列番号：１６９は、ＲＢＳおよびｓａｄＢ（ｏ）コード領域を含むＤＮＡ断片である。
配列番号：１７４は、プラスミドｐＦＰ３５２の配列である。
配列番号：１７５は、プラスミドｐＤＭ５の配列である。
配列番号：１７６は、ｌａｃＩ−ＰｇｒｏＥ／ｌａｃＯ断片である。
配列番号：１８２は、プラスミドｐＤＭ５−ＰｌｄｈＬ１−ｉｌｖＣ（Ｌ．ラクティス（Ｌ．ｌａｃｔｉｓ））の配列である。
配列番号：１８３は、Ｌ．プランタルム（Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ）発現に最適化されたＰＦ５−ｉｌｖＣコドンに対するＲＢＳおよびコード領域を含むＤＮＡ断片である。
配列番号：１８４は、プラスミドｐＦＰ９９６−ＰｌｄｈＬ１の配列である。
配列番号：１８５は、ＰｌｄｈＬ１−ｉｌｖＣ（Ｐ．フルオレッセンス（Ｐ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）ＰＦ５）ＤＮＡ断片である。
配列番号：１９８は、プラスミドｐＹＺ０９０の配列である。
配列番号：２０３は、プラスミドｐＬＨ４７５−ＩｌｖＣ（Ｌ．ラクティス（Ｌ．ｌａｃｔｉｓ））の配列である。
配列番号：２０４は、プラスミドｐＹＺ０９１の配列である。
配列番号：２０７は、プラスミドｐＬＨ５３２の配列である。
配列番号：２０８は、プラスミドｐＹＺ０５８の配列である。
配列番号：２１１は、プラスミドｐＹＺ０６７の配列である。
配列番号：２１２は、ｐＵＣ１９−ＵＲＡ３ｒベクターの配列である。
配列番号：２２３は、ｉｌｖＤ−ＦＢＡ１ｔ断片の配列である。
本発明は、イソブタノール生成が改良されるようにエンジニアリングされた組換え宿主微生物細胞に関する。イソブタノールは、化石燃料の代替として使用するのに重要な化合物である。
以下の略語および定義は、本明細書および特許請求の範囲の解釈に使用されることになる。
本明細書では、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、「含んでいる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」、「含んでいる（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「有する（ｈａｓ）」、「有している（ｈａｖｉｎｇ）」、「含む（ｃｏｎｔａｉｎｓ）」、もしくは「含んでいる（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」という用語、またはそれらの他の何らかの変形は、非排他的な包含を網羅するものとする。例えば、一連の要素を含む組成物、混合物、プロセス、方法、物品、または装置は、必ずしもそれらの要素だけに限定されるわけではなく、明示的に列挙されていないまたはこのような組成物、混合物、プロセス、方法、物品、もしくは装置に固有でない他の要素を含むことができる。さらに、別段の明示的記載のない限り、「または」は、包含的またはを意味するが、排他的またはを意味するものではない。例えば、条件ＡまたはＢは、以下のいずれか１つによって満足される：Ａは真であり（または存在する）かつＢは偽であり（または存在しない）、Ａは偽であり（または存在しない）かつＢは真であり（または存在する）、ならびにＡとＢが共に真である（または存在する）。
また、本発明の要素または成分に先行する不定冠詞「ａ」および「ａｎ」は、元素または成分の場合の数（すなわち、出現頻度）に関して非制限的であるものとする。したがって、「ａ」または「ａｎ」は、１つまたは少なくとも１つを含むものと解釈されるべきであり、元素または成分の単数形は、数が明らかに単数であるものとする場合を除いて複数形も包含する。
本明細書では、「発明」または「本発明」という用語は、非限定的な用語であり、特定の発明の任意の単一の実施形態を指すものではなく、本明細書および特許請求の範囲に記載するように可能な実施形態をすべて包含するものである。
本明細書では、本発明の材料または反応物質の使用量を修飾する「約」という用語は、例えば実社会で濃縮物または使用溶液を作製するのに使用される典型的な測定手順および液体取扱い手順；これらの手順における不注意による誤り；組成物の作製または方法の実施に使用する材料の製造、供給源、または純度の差異などによって起こり得る数値量のばらつきを指す。「約」という用語は、特定の初期の混合物によって生ずる組成物の異なる平衡条件のために異なる量も包含する。「約」という用語で修飾されていようがいまいが、特許請求の範囲は、量に対して等価なものを含む。一実施形態において、「約」という用語は、報告された数値の１０％以内、好ましくは報告された数値の５％以内を意味する。
「イソブタノール生合成経路」という用語は、イソブタノールをピルビン酸から生成するための酵素経路を指す。
「ＳＬＳＬ Ｃｌａｄｅ」という用語は、分子系統解析によって同定されたＫＡＲＩ配列の枝を指すものであり、スタフィロコッカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）、リステリア（Ｌｉｓｔｅｒｉａ）、ストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、ラクトコッカス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ）、ロイコノストック（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ）、エンテロコッカス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）、マクロコッカス（Ｍａｃｒｏｃｏｃｃｕｓ）、およびラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）に由来するＫＡＲＩを包含する。図１および２は、それぞれＳＬＳＬ Ｃｌａｄｅと他のＫＡＲＩとの関係およびＳＬＳＬ Ｃｌａｄｅ自体との関係を示す。
「炭素基質」または「発酵性炭素基質」という用語は、本発明の宿主有機体による代謝が可能な炭素源、特に単糖、オリゴ糖、および多糖からなる群から選択される炭素源を指す。
「遺伝子」という用語は、（５’非コード配列）の直前に制御配列および（３’非コード配列）の後にコード配列を場合によっては含む、特定のタンパク質として発現することが可能な核酸断片を指す。「ネイティブ遺伝子」は、それ独自の制御配列を有する自然界に見られる遺伝子を指す。「キメラ遺伝子」はネイティブ遺伝子でなく、自然界で共には見られない制御およびコード配列を含む任意の遺伝子を指す。したがって、キメラ遺伝子は、異なる供給源に由来する制御配列とコード配列、または同じ供給源に由来するが、自然界に見られる様式とは異なる様式で配置された制御配列とコード配列を含んでもよい。「内在性遺伝子」は、有機体のゲノムのその天然の位置におけるネイティブ遺伝子を指す。「外来遺伝子」または「異種性遺伝子」は、宿主有機体に通常は見られないが、遺伝子移入により宿主有機体中に導入され、またはその発現を変更するようになど、そのネイティブ状態から何らかの方式で改変されている遺伝子を指す。外来遺伝子は、非ネイティブ有機体に挿入されたネイティブ遺伝子、またはキメラ遺伝子を含むことができる。「導入遺伝子」は、形質転換手順でゲノムに導入された遺伝子である。
本明細書では、「コード領域」という用語は、特定のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列を指す。「適切な制御配列」は、コード配列の上流（５’非コード配列）、範囲内、または下流（３’非コード配列）に位置し、転写、ＲＮＡプロセシングもしくは安定性、または関連コード配列の翻訳に影響を及ぼすヌクレオチド配列を指す。制御配列は、プロモーター、翻訳リーダー配列、イントロン、ポリアデニル化認識配列、ＲＮＡプロセシング部位、エフェクター結合部位、およびステムループ構造を含むことができる。
「プロモーター」という用語は、コード配列または機能性ＲＮＡの発現を調節することができるＤＮＡ配列を指す。一般に、コード配列は、プロモーター配列に対して３’に位置する。プロモーターは、全体としてネイティブ遺伝子に由来し、または自然界に見られる様々なプロモーターに由来する様々な要素から構成され、またはさらには合成ＤＮＡセグメントを含むものであってもよい。様々なプロモーターは、様々なタイプの組織もしくは細胞において、または様々な発達段階で、または様々な環境もしくは生理的状態に応答して、遺伝子の発現を指示できることを当業者は理解している。大部分のタイプの細胞において大部分の場合に遺伝子の発現を引き起こすプロモーターは、通常「構成プロモーター」と呼ばれる。大部分の場合、制御配列の正確な境界は完全には画定されないので、異なる長さのＤＮＡ断片が、同一のプロモーター活性を有する場合があることもさらに認識される。
「機能的に連結された」という用語は、一方の機能が他方の機能によって影響を受けるような単一核酸断片上の核酸配列の結合を指す。例えば、プロモーターがコード配列の発現をもたらすことができるとき（すなわち、コード配列はプロモーターの転写調節下にあるということ）、プロモーターはそのコード配列と機能的に連結されている。制御配列にコード配列をセンスまたはアンチセンス方向に機能的に連結させることができる。
本明細書では、「発現」という用語は、センスＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の転写および安定な蓄積を指す。発現は、ｍＲＮＡのポリペプチドへの翻訳を意味する場合もある。
本明細書では、「形質転換」という用語は、核酸分子を宿主細胞に移入し、それがプラスミドとして維持され、またはゲノムに組み込まれ得ることを指す。形質転換核酸分子を含む宿主細胞は、「トランスジェニック」または「組換え」または「形質転換」細胞と呼ばれる。
本明細書では、「プラスミド」および「ベクター」という用語は、細胞の中心的代謝の一部分ではない遺伝子を運搬する場合が多く、通常環状二本鎖ＤＮＡ分子の形をとっている染色体外要素を指す。このような要素は、任意の供給源に由来する一本鎖または二本鎖のＤＮＡまたはＲＮＡの自己複製配列、ゲノム組込み配列、線状または環状であり得るファージまたは他のヌクレオチド配列とすることができ、多くのヌクレオチド配列は、選択された遺伝子産物のためのプロモーター断片およびＤＮＡ配列を適切な３’非翻訳配列と共に細胞に導入することができる特徴のある構築物に結合または組み換えられている。
本明細書では、「コドン縮重」という用語は、コード化ポリペプチドのアミノ酸配列に影響を及ぼすことなく、ヌクレオチド配列の変異を可能にする遺伝暗号の性質を指す。当業者は、所与のアミノ酸を特定するのにヌクレオチドコドンを使用する際に、特定の宿主細胞によって示される「コドンバイアス」をよく知っている。したがって、宿主細胞の発現を改善するためのコード領域を合成するとき、コード領域を、そのコドン使用頻度が宿主細胞の好ましいコドン使用頻度に近づくように設計することが望ましい。
様々な宿主の形質転換のための核酸分子のコード領域を指すような「コドン最適化」という用語は、ＤＮＡによってコードされたポリペプチドを変化させることなく、宿主有機体の典型的なコドン使用を反映するような核酸分子のコード領域におけるコドンの変化を指す。
本明細書では、「単離された核酸断片」または「単離された核酸分子」は同義で使用されることにし、合成、非天然、または改変ヌクレオチド塩基を場合によっては含有する一本鎖または二本鎖であるＲＮＡまたはＤＮＡのポリマーを意味することにする。ＤＮＡのポリマーの形態をとる単離された核酸断片は、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、または合成ＤＮＡの１個または複数のセグメントを含んでもよい。
核酸断片は、核酸断片の一本鎖の形態を温度および溶液イオン強度の適切な条件下で他の核酸断片とアニーリングすることができるとき、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、またはＲＮＡ分子など別の核酸断片と「ハイブリダイズ可能」である。ハイブリダイゼーションおよび洗浄条件は周知であり、その例は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ， Ｊ．、Ｆｒｉｔｓｃｈ， Ｅ． Ｆ．およびＭａｎｉａｔｉｓ， Ｔ．、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， 第２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ：Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ （１９８９年）、特に第１１章、表１１．１に記載される（参照により本明細書に全体として組み込まれる）。温度およびイオン強度の条件によって、ハイブリダイゼーションの「ストリンジェンシー」が決まる。ストリンジェンシー条件は、中程度に類似の断片（遠縁関係にある有機体に由来する相同配列など）、高度に類似の断片（近縁関係にある有機体に由来する機能酵素を覆製する遺伝子など）を求めてスクリーニングするように調整することができる。ハイブリダイゼーション後の洗浄操作で、ストリンジェンシー条件が決まる。１組の好ましい条件では、６Ｘ ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳ、室温で１５分間で始め、次いで２Ｘ ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳ、４５℃で３０分間を繰り返し、次いで０．２Ｘ ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳ、５０℃で３０分間を２回繰り返す一連の洗浄操作が用いられる。１組のより好ましいストリンジェントな条件では、より高い温度が用いられ、洗浄操作は、０．２Ｘ ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳによる最後の３０分間の洗浄操作２回の温度を６０℃に上げた点以外は上記と同一である。１組の別の好ましい極めてストリンジェントな条件では、０．１Ｘ ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳによる最後の洗浄操作２回が６５℃で行われる。１組の追加のストリンジェントな条件には、例えば０．１Ｘ ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、６５℃でのハイブリダイゼーション、および２Ｘ ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳと、その後に続く０．１Ｘ ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳによる洗浄操作が含まれる。
ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーによっては塩基間のミスマッチが起こり得るが、ハイブリダイゼーションには、２つの核酸が相補的配列を含むことが必要とされる。核酸をハイブリダイズするのに適切なストリンジェンシーは、当技術分野において周知である変数である核酸の長さおよび相補性の程度によって決まる。２つのヌクレオチド配列間の類似性または相同性の程度が高いほど、それらの配列を有する核酸配列のハイブリッドのＴｍ値が高くなる。核酸ハイブリダイゼーションの（より高いＴｍに対応する）相対的安定性は、以下の順序で低下する：ＲＮＡ：ＲＮＡ、ＤＮＡ：ＲＮＡ、ＤＮＡ：ＤＮＡ。１００ヌクレオチド長を超えるハイブリッドの場合、Ｔｍを算出する数式が導かれている（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、上記９．５０〜９．５１を参照のこと）。より短い核酸、すなわちオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションの場合、ミスマッチの位置がより重要になり、オリゴヌクレオチドの長さによって、その特異性が決まる（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、上記１１．７〜１１．８を参照のこと）。一実施形態において、ハイブリダイズ可能な核酸の長さは、少なくとも約１０ヌクレオチドである。ハイブリダイズ可能な核酸の最小の長さは、好ましくは少なくとも約１５ヌクレオチドであり、より好ましくは、少なくとも約２０ヌクレオチドであり、その長さは、最も好ましくは少なくとも約３０ヌクレオチドである。さらに、当業者は、温度および洗浄溶液の塩濃度を、プローブの長さなどの要因に応じて適宜調整できることを認識するであろう。
「かなりの割合」のアミノ酸またはヌクレオチド配列とは、当業者が手作業によって配列を評価することにより、またはＢＬＡＳＴ （Ａｌｔｓｃｈｕｌ， Ｓ． Ｆ．ら、Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．， ２１５巻：４０３〜４１０頁（１９９３年））などのアルゴリズムを使用したコンピュータ自動化配列比較および同定により、そのポリペプチドまたは遺伝子を推定同定するのに十分量のポリペプチドのアミノ酸配列または遺伝子のヌクレオチド配列を含む割合である。一般に、ポリペプチドまたは核酸配列を既知のタンパク質または遺伝子と相同であると推定同定するためには、１０個以上の一続きの隣接するアミノ酸または３０個以上のヌクレオチドが必要である。さらに、ヌクレオチド配列に関して、２０〜３０個の隣接するヌクレオチドを含む遺伝子特異的オリゴヌクレオチドプローブを、配列依存性の遺伝子同定方法（例えば、サザンハイブリダイゼーション）および単離方法（例えば、細菌コロニーまたはバクテリオファージプラークのインサイチューハイブリダイゼーション）で使用することができる。さらに、プライマーを含む特定の核酸断片を得るために、塩基約１７個の短いオリゴヌクレオチドをＰＣＲで増幅用プライマーとして使用することができる。したがって、「かなりの割合」のヌクレオチド配列は、配列を含む核酸断片を特異的に同定および／または単離するのに十分量の配列を構成する。本明細書は、特定のタンパク質をコードする完全アミノ酸およびヌクレオチド配列を教示する。本明細書に報告される配列の恩恵を受ける当業者は、当業者に公知の目的のために、開示された配列をすべてまたはかなりの割合で今度は使用することができる。したがって、本発明は、添付の配列表に報告する完全配列、および上記に定義したかなりの割合の配列を含む。
「相補的」という用語は、互いにハイブリダイズすることができるヌクレオチド塩基間の関係を説明するのに使用される。例えば、ＤＮＡに関して、アデノシンはチミンに相補的であり、シトシンはグアニンに相補的である。
当技術分野において公知である「同一性（％）」という用語は、配列を比較することによって決定される、２つ以上のポリペプチド配列間または２つ以上のポリヌクレオチド配列間の関係である。当技術分野では、「同一性」は、適宜、このような配列のストリング間のマッチで決定されるポリペプチドまたはポリヌクレオチド配列間の配列関連性の程度も意味する。「同一性」および「類似性」は、１）Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｌｅｓｋ， Ａ． Ｍ．編） Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ：ＮＹ （１９８８年）；２）Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ：Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ａｎｄ Ｇｅｎｏｍｅ Ｐｒｏｊｅｃｔｓ（Ｓｍｉｔｈ， Ｄ． Ｗ．編） Ａｃａｄｅｍｉｃ：ＮＹ （１９９３年）；３）Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄａｔａ， Ｐａｒｔ Ｉ（Ｇｒｉｆｆｉｎ， Ａ． Ｍ．およびＧｒｉｆｆｉｎ， Ｈ． Ｇ．編） Ｈｕｍａｎｉａ：ＮＪ （１９９４年）；４）Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（ｖｏｎ Ｈｅｉｎｊｅ， Ｇ．編） Ａｃａｄｅｍｉｃ （１９８７年）；５）Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐｒｉｍｅｒ（Ｇｒｉｂｓｋｏｖ， Ｍ．およびＤｅｖｅｒｅｕｘ， Ｊ．編） Ｓｔｏｃｋｔｏｎ：ＮＹ（１９９１年）を含めて、公知の方法で容易に算出することができるが、これらに限定されない。
好ましい同一性測定方法は、被検配列間の最高のマッチをもたらすように設計されている。同一性および類似性の測定方法は、一般に利用可能なコンピュータープログラムに体系化されている。配列アラインメントおよび同一性（％）の算出は、ＬＡＳＥＲＧＥＮＥバイオインフォマティクス・コンピューティング・スイートのＭｅｇＡｌｉｇｎ（商標）プログラム（ＤＮＡＳＴＡＲ Ｉｎｃ．、（Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ））を使用して行うことができる。配列のマルチプルアライメントは、Ｃｌｕｓｔａｌ Ｖと呼ばれ（ＨｉｇｇｉｎｓおよびＳｈａｒｐ、ＣＡＢＩＯＳ．、５巻：１５１〜１５３頁（１９８９年）；Ｈｉｇｇｉｎｓ， Ｄ．Ｇ．ら、Ｃｏｍｐｕｔ． Ａｐｐｌ． Ｂｉｏｓｃｉ．、８巻：１８９〜１９１頁（１９９２年）によって記載されている）、ＬＡＳＥＲＧＥＮＥバイオインフォマティクス・コンピューティング・スイートのＭｅｇＡｌｉｇｎ（商標）プログラム（ＤＮＡＳＴＡＲ Ｉｎｃ．）に見られるアライメント方法に対応する「Ｃｌｕｓｔａｌ Ｖアラインメント法」を含めて、アルゴリズムのいくつかの変形を包含する「Ｃｌｕｓｔａｌアラインメント法」を使用して行われる。マルチプルアライメントでは、デフォルト値は、ＧＡＰ ＰＥＮＡＬＴＹ＝１０およびＧＡＰ ＬＥＮＧＴＨ ＰＥＮＡＬＴＹ＝１０に対応する。Ｃｌｕｓｔａｌ方法を使用したタンパク質配列のペアワイズアラインメントおよび同一性（％）算出のデフォルトパラメーターは、ＫＴＵＰＬＥ＝１、ＧＡＰ ＰＥＮＡＬＴＹ＝３、ＷＩＮＤＯＷ＝５、およびＤＩＡＧＯＮＡＬＳ ＳＡＶＥＤ＝５である。核酸では、これらのパラメーターは、ＫＴＵＰＬＥ＝２、ＧＡＰ ＰＥＮＡＬＴＹ＝５、ＷＩＮＤＯＷ＝４、およびＤＩＡＧＯＮＡＬＳ ＳＡＶＥＤ＝４である。Ｃｌｕｓｔａｌ Ｖプログラムを使用した配列のアラインメントを行った後、同じプログラムの「配列距離」表を調べることによって「同一性（％）」を得ることが可能である。さらに、「Ｃｌｕｓｔａｌ Ｗアライメント法」が利用可能であり、Ｃｌｕｓｔａｌ Ｗと呼ばれ（ＨｉｇｇｉｎｓおよびＳｈａｒｐ、ＣＡＢＩＯＳ．、５巻：１５１〜１５３頁（１９８９年）； Ｈｉｇｇｉｎｓ， Ｄ．Ｇ．ら、Ｃｏｍｐｕｔ． Ａｐｐｌ． Ｂｉｏｓｃｉ．、８巻：１８９〜１９１頁（１９９２年）によって記載されている）、ＬＡＳＥＲＧＥＮＥバイオインフォマティクス・コンピューティング・スイートのＭｅｇＡｌｉｇｎ（商標）ｖ６．１プログラム（ＤＮＡＳＴＡＲ Ｉｎｃ．）に見られるアラインメント方法に対応するものである。マルチプルアライメントのデフォルトパラメーター（ＧＡＰ ＰＥＮＡＬＴＹ＝１０、ＧＡＰ ＬＥＮＧＴＨ ＰＥＮＡＬＴＹ＝０．２、Ｄｅｌａｙ Ｄｉｖｅｒｇｅｎ Ｓｅｑｓ（％）＝３０、ＤＮＡ Ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ Ｗｅｉｇｈｔ＝０．５、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｗｅｉｇｈｔ Ｍａｔｒｉｘ＝Ｇｏｎｎｅｔ Ｓｅｒｉｅｓ、ＤＮＡ Ｗｅｉｇｈｔ Ｍａｔｒｉｘ＝ＩＵＢ）。Ｃｌｕｓｔａｌ Ｗプログラムを使用した配列のアラインメントを行った後、同じプログラムの「配列距離」表を調べることによって「同一性（％）」を得ることが可能である。
多くの配列同一性レベルが、ポリペプチドを他の種などから同定するのに有用であり、このようなポリペプチドは、同じまたは同様の機能または活性を有するものであることが当業者にはよく理解されるであろう。同一性（％）の有用な例としては、２４％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％が挙げられるが、これらに限定されるものではなく、あるいは２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％など、２４％から１００％の任意の整数百分率は、本発明を説明するのに有用であり得る。適切な核酸断片は、上記の相同性を有するだけでなく、典型的には少なくとも５０個のアミノ酸、好ましくは少なくとも１００個のアミノ酸、より好ましくは少なくとも１５０個のアミノ酸、さらにより好ましくは少なくとも２００個のアミノ酸、最も好ましくは少なくとも２５０個のアミノ酸を有するポリペプチドをコードする。
「配列解析ソフトウェア」という用語は、ヌクレオチドまたはアミノ酸配列の分析に有用な任意のコンピューターアルゴリズムまたはソフトウェアプログラムを指す。「配列解析ソフトウェア」は、市販されているものがあり、または独自に開発することができる。典型的な配列解析ソフトウェアは、１）ＧＣＧプログラムスイート（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｐａｃｋａｇｅ Ｖｅｒｓｉｏｎ ９．０、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ （ＧＣＧ）、（Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ））；２） ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮ、ＢＬＡＳＴＸ （Ａｌｔｓｃｈｕｌら、Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．、２１５巻：４０３〜４１０頁（１９９０年））；３） ＤＮＡＳＴＡＲ （ＤＮＡＳＴＡＲ， Ｉｎｃ．、（Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ））； ４） Ｓｅｑｕｅｎｃｈｅｒ （Ｇｅｎｅ Ｃｏｄｅｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、（Ａｎｎ Ａｒｂｏｒ， ＭＩ））；５） Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムを組込みＦＡＳＴＡプログラム（Ｗ． Ｒ． Ｐｅａｒｓｏｎ、Ｃｏｍｐｕｔ． Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．、［Ｐｒｏｃ． Ｉｎｔ． Ｓｙｍｐ．］ （１９９４年）、Ｍｅｅｔｉｎｇ Ｄａｔｅ １９９２年、１１１〜２０、編集者：Ｓｕｈａｉ， Ｓａｎｄｏｒ、Ｐｌｅｎｕｍ：Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ）を含むようになるが、これらに限定されるものではない。本出願の文脈において、配列解析ソフトウェアが解析に使用される場合、解析の結果は、別段の指定のない限り記載のプログラムの「デフォルト値」に基づくことになることが理解されよう。本明細書では、「デフォルト値」は、最初に初期化されると、ソフトウェアと共に元々搭載される任意のセットの値またはパラメーターを意味することになる。
ここで使用される標準組換えＤＮＡおよび分子クローニング技法は、当技術分野において周知であり、Ｓａｍｂｒｏｏｋ， Ｊ．、Ｆｒｉｔｓｃｈ， Ｅ． Ｆ．およびＭａｎｉａｔｉｓ， Ｔ．、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ （１９８９年）（以降、「Ｍａｎｉａｔｉｓ」）；ならびにＳｉｌｈａｖｙ， Ｔ． Ｊ．、Ｂｅｎｎａｎ， Ｍ． Ｌ．、およびＥｎｑｕｉｓｔ， Ｌ． Ｗ．、Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ ｗｉｔｈ Ｇｅｎｅ Ｆｕｓｉｏｎｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ （１９８４年）；ならびにＡｕｓｕｂｅｌ， Ｆ． Ｍ．ら、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃ． ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ出版（１９８７年）によって説明されている。ここで使用される追加の方法は、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、１９４巻、Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｙｅａｓｔ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｐａｒｔ Ａ、２００４年、Ｃｈｒｉｓｔｉｎｅ ＧｕｔｈｒｉｅおよびＧｅｒａｌｄ Ｒ． Ｆｉｎｋ（編）、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）に記載されている。
インビボで高効率のＫＡＲＩの発見
米国特許出願公開第２００７００９２９５７号明細書に開示されたイソブタノール生成の生合成経路を、図１に示す。生合成経路のステップを最大限に利用して、イソブタノール生成を最大にすることは望ましい。図１の全経路の第２ステップは、ケトール酸レダクトイソメラーゼ（ＫＡＲＩ）による、アセト乳酸のジヒドロキシイソ吉草酸への変換である。出願人らによって、イソブタノール生合成経路で使用されるとき、酵母および細菌において、イソブタノール生成の、以前に他のＫＡＲＩを使用して得られたレベルを上回る増大を実現するＫＡＲＩが確認された。
発現されたイソブタノール経路のＫＡＲＩとしてラクトコッカス・ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ）ＫＡＲＩ（配列番号：６７のコード配列；配列番号：６８のタンパク質）を発現する酵母において、イソブタノールの生成は、シュードモナス・フルオレッセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）ＫＡＲＩ（配列番号：９１のコード配列；配列番号：８９のタンパク質）または出芽酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＫＡＲＩ（配列番号：９２のコード配列；配列番号：９３のタンパク質）のいずれかを使用したイソブタノール生成より増大していることがわかった。試験状態でのイソブタノール生成は、少なくともほぼ倍増した。一方、Ｌ．ラクティス（Ｌ．ｌａｃｔｉｓ）ＫＡＲＩのインビトロ活性は、Ｐ．フルオレッセンス（Ｐ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）ＫＡＲＩのインビトロ活性を下回るものであった。発現されたイソブタノール経路のＫＡＲＩとして、ラクトコッカス・ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ）（配列番号：６７のコード配列；配列番号：６８のタンパク質）、ストレプトコッカス・ミュータンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｕｔａｎｓ）（配列番号：２７のコード配列；配列番号：２８のタンパク質）、ストレプトコッカス・サーモフィリス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｉｓ）（配列番号：５５のコード配列；配列番号：５６のタンパク質）、またはロイコノストック・メセンテロイデス（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ）（配列番号：３９のコード配列；配列番号：４０のタンパク質）由来のＫＡＲＩを発現するラクトバチルス・プランタルム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ）において、イソブタノールの生成は、シュードモナス・フルオレッセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）ＫＡＲＩ（配列番号：９０のコード配列；配列番号：８９のタンパク質）を使用したイソブタノール生成より増大していることがわかった。試験状態でのイソブタノール生成は、少なくとも３倍増大した。イソブタノール生成の増大量は、宿主株、存在している他のイソブタノール経路酵素、培地、および培養条件などの因子に応じて変わることがある。イソブタノール生成は、シュードモナス・フルオレッセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）ＫＡＲＩを使用したときに比べて、高有効性のＫＡＲＩを使用したときは、細菌類と酵母との両方において少なくともほぼ倍増する。イソブタノール生成は、２倍、３倍、４倍、またはそれ以上増加し得る。
本細胞および方法で使用することができる、イソブタノール生成に有効性が高いＫＡＲＩは、ＫＡＲＩアミノ酸配列の分子系統解析によって同定された群のメンバーであるものである。シュードモナス・フルオレッセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）ＫＡＲＩ Ｐｆ−５（配列番号：８９）のＢＬＡＳＴ解析による公共データベースから収集されたＫＡＲＩ配列について、分子系統解析を行った。ＫＡＲＩ配列から、多重配列アラインメント（ＭＳＡ）を作成し、公的に利用可能なＪａｌｖｉｅｗプログラムの近隣結合法を使用して、ＭＳＡから配列の系統樹を作成した（Ｗａｔｅｒｈｏｕｓｅら、（２００９年）Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ｄｏｉ：１０．１０９３／ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ／ｂｔｐ０３３）。得られた、９５％以上の同一性を有するＫＡＲＩ配列が単一の配列で表わされる系統樹を図２に示す。このＫＡＲＩ配列の解析によって、上記のとおり試験されたラクトコッカス・ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ）（配列番号：６８）、ストレプトコッカス・ミュータンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｕｔａｎｓ）（配列番号：２８）、ストレプトコッカス・サーモフィリス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｉｓ）（配列番号：５６）およびロイコノストック・メセンテロイデス（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ）（配列番号：４０）由来のＫＡＲＩは、ラクトコッカス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ）、ストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、およびロイコノストック（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ）の他の株由来のＫＡＲＩ、ならびにスタフィロコッカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）、リステリア（Ｌｉｓｔｅｒｉａ）、エンテロコッカス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）、マクロコッカス（Ｍａｃｒｏｃｏｃｃｕｓ）、およびラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）種由来のＫＡＲＩをさらに含むＫＡＲＩの詳細に明らかにされた系統枝またはクレードのメンバーすべてであることが明らかになった。したがって、ＫＡＲＩのこのクレードをＳＬＳＬ Ｃｌａｄｅであると同定し、図１に示す。さらに、ＳＬＳＬ Ｃｌａｄｅを含む系統樹の一部分を図３に示す。
ＳＬＳＬ ＣｌａｄｅのメンバーであるいずれのＫＡＲＩも、本細胞および方法で使用することができる。本明細書で同定されたこの系統枝のメンバーとしては、表１に配列番号：２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、および２４５として記載されているものを含めて、スタフィロコッカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）、リステリア（Ｌｉｓｔｅｒｉａ）、ストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、ラクトコッカス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ）、ロイコノストック（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ）、エンテロコッカス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）、マクロコッカス（Ｍａｃｒｏｃｏｃｃｕｓ）、およびラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）という様々な種に由来するＫＡＲＩが挙げられる。これらのＫＡＲＩのコード領域配列は、それぞれ配列番号：１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５、６７、および２４４を有する。表１の配列のいずれかと９９％以上の同一性を有する配列の大部分は記載されていないが、これらも本細胞および方法で使用することができ、上記のバイオインフォマティクス解析を使用して、当業者によって容易に同定される。したがって、表１の配列と少なくとも約９９％の同一性を有する配列は、本細胞で使用することができる。
ＫＡＲＩのＳＬＳＬ ＣＬａｄｅに属する追加のＫＡＲＩは、当業者に周知である文献およびバイオインフォマティクスデータベースで容易に同定することができる。バイオインフォマティクスを使用したコード配列および／またはタンパク質配列の同定は、典型的には本明細書に記載されているものなど、ＫＡＲＩをコードする配列またはコードされたアミノ酸配列に関して公的に利用可能なデータベースの（上記の）ＢＬＡＳＴ検索によって行われる。上記の分子系統解析を使用して、あるＫＡＲＩがＳＬＳＬ Ｃｌａｄｅのメンバーであるかどうかを判断することができる。追加のＫＡＲＩとしては、配列番号：２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、および２４５のＫＡＲＩアミノ酸配列のいずれかと少なくとも約８０〜８５％、８５％〜９０％、９０％〜９５％のアミノ酸配列同一性、または少なくとも約９６％、９７％、９８％、もしくは９９％の配列同一性を有するＳＬＳＬ Ｃｌａｄｅのメンバーであるものが挙げられる。同一性は、ＧＡＰ ＰＥＮＡＬＴＹ＝１０、ＧＡＰ ＬＥＮＧＴＨ ＰＥＮＡＬＴＹ＝０．１、およびタンパク質重量マトリックスのＧｏｎｎｅｔ ２５０シリーズというデフォルトパラメーターを用いたＣｌｕｓｔａｌ Ｗアラインメント法に基づくものである。
さらに、本明細書に記載された配列または当技術分野で列挙されているものを使用して、自然界における他の相同体を同定することができる。例えば、本明細書に記載されるＫＡＲＩをコードする核酸断片をそれぞれ使用して、相同タンパク質をコードする遺伝子を単離することができる。配列依存性プロトコルを用いた相同遺伝子の単離は、当技術分野において周知である。配列依存性プロトコルの例としては、１）核酸ハイブリダイゼーションの方法；２）核酸増幅技術の様々な使用によって例示されるＤＮＡおよびＲＮＡ増幅方法［例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、Ｍｕｌｌｉｓら、米国特許第４，６８３，２０２号明細書；リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、Ｔａｂｏｒ， Ｓ．ら、Ｐｒｏｃ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８２巻：１０７４頁（１９８５年）；または鎖置換増幅（ＳＤＡ）、Ｗａｌｋｅｒら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ．， ８９巻：３９２頁（１９９２年）］；および３）ライブラリー構築および相補性によるスクリーニングの方法が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
酵母および細菌細胞におけるＫＡＲＩ発現
上記のＫＡＲＩはいずれも、酵母または細菌細胞において発現して、アセト乳酸をジヒドロキシイソ吉草酸に変換することができ、イソブタノール生合成経路におけるステップを実現する。宿主細胞とすることができる酵母細胞としては、サッカロミケス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、シゾサッカロミケス（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、ハンゼヌラ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）、クルイベロミセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）、ヤロウイア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）、イサチェンキア（Ｉｓｓａｔｃｈｅｎｋｉａ）、およびピキア（Ｐｉｃｈｉａ）という属に属するものが挙げられるが、これらに限定されるものではない。宿主細胞とすることができる細菌細胞としては、エシェリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、エンテロコッカス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）、ラクトコッカス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ）、ラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、ロイコノストック（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ）、オエノコッカス（Ｏｅｎｏｃｏｃｃｕｓ）、ペディオコッカス（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ）、ストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、クロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）、ザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、ペディオコッカス（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ）、アルカリゲネス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）、クレブシエラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）、パエニバチルス（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ）、アルスロバクター（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、およびブレビバクテリウム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）という属に属するものが挙げられるが、これらに限定されるものではない。ラクトコッカス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ）、ラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、ロイコノストック（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ）、オエノコッカス（Ｏｅｎｏｃｏｃｃｕｓ）、ペディオコッカス（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ）、およびストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）などの乳酸菌（ＬＡＢ）である宿主細胞が特に有用である。
上記のＫＡＲＩコード領域を発現する方法は、当業者に周知である。例えば、酵母における遺伝子発現方法は公知であり、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、１９４巻、Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｙｅａｓｔ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｐａｒｔ Ａ、２００４年、Ｃｈｒｉｓｔｉｎｅ ＧｕｔｈｒｉｅおよびＧｅｒａｌｄ Ｒ． Ｆｉｎｋ（編）、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）などに記載されている。
典型的には、所望のＫＡＲＩのコード領域は、コード領域を標的細胞における発現のためのプロモーターに機能的に連結させることによって、キメラ遺伝子の一部分として構築される。終結制御領域をキメラ発現遺伝子に含むことができ、細菌細胞発現には、リボソーム結合部位を含むことができる。コード領域は、当業者に公知であるようにエンジニアリングされた特定の宿主細胞における発現に最適化されたコドンとすることができる。
酵母における発現に使用することができるプロモーターは、例えば構成プロモーターＦＢＡ１、ＴＤＨ３、ＡＤＨ１、およびＧＰＭ１、ならびに誘導プロモーターＧＡＬ１、ＧＡＬ１０、およびＣＵＰ１である。酵母における発現にキメラ遺伝子コンストラクトで使用することができる好適な転写ターミネーターとしては、ＦＢＡ１ｔ、ＴＤＨ３ｔ、ＧＰＭ１ｔ、ＥＲＧ１０ｔ、ＧＡＬ１ｔ、ＣＹＣ１ｔ、およびＡＤＨ１ｔが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
適切なプロモーター、転写ターミネーター、およびコード領域を大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）−酵母シャトルベクターにクローニングし、酵母細胞に形質転換することができる。これらのベクターによって、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株と酵母株の両方で伝播が可能になる。典型的には、ベクターは、所望の宿主における自律増殖または染色体組込みを可能にする選択マーカーおよび配列を含む。酵母において典型的に使用されるプラスミドは、シャトルベクターｐＲＳ４２３、ｐＲＳ４２４、ｐＲＳ４２５、およびｐＲＳ４２６（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）であり、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）複製開始点（例えば、ｐＭＢ１）、酵母２μ複製開始点、および栄養選択性マーカーを含む。これらの４つのベクター用の選択マーカーは、ＨＩＳ３（ベクターｐＲＳ４２３）、ＴＲＰ１（ベクターｐＲＳ４２４）、ＬＥＵ２（ベクターｐＲＳ４２５）、およびＵＲＡ３（ベクターｐＲＳ４２６）である。キメラ遺伝子を含む発現ベクターの構築は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）において標準分子クローニング技法で、または酵母においてギャップ修復組換え方法で行うことができる。キメラ遺伝子は、プラスミドから発現させてもよく、細胞ゲノムに組み込んでもよい。細菌細胞におけるキメラ遺伝子の発現のためのプロモーターは多数であり、当業者によく知られている。これらには、ｌａｃ、ａｒａ、ｔｅｔ、ｔｒｐ、ｌＰＬ、ｌＰＲ、Ｔ７、ｔａｃ、およびｔｒｃプロモーター（大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、アルカリゲネス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）、およびシュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）における発現に有用）；バチルス・サブティリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、バチルス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、およびパエニバチルス・マセランス（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｍａｃｅｒａｎｓ）における発現に有用なａｍｙ、ａｐｒ、およびｎｐｒプロモーター、ならびに様々なファージプロモーター；ｎｉｓＡ（グラム陽性細菌における発現に有用、Ｅｉｃｈｅｎｂａｕｍら、Ａｐｐｌ． Ｅｎｖｉｒｏｎ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、６４巻（８号）：２７６３〜２７６９頁（１９９８年））；および合成Ｐ１１プロモーター（ラクトバチルス・プランタルム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ）における発現に有用、Ｒｕｄら、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、１５２巻：１０１１〜１０１９頁（２００６年））が含まれるが、これらに限定されるものではない。さらに、Ｌ．プランタルム（Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ）のｌｄｈＬ１およびｆａｂＺ１プロモーターは、ＬＡＢにおけるキメラ遺伝子の発現に有用である。ｆａｂＺ１プロモーターは、（３Ｒ）−ヒドロキシミリストイル−［アシルキャリアータンパク質］デヒドラターゼをコードする第１の遺伝子ｆａｂＺ１を有するオペロンの転写を指図する。
終結制御領域も、好ましい宿主に固有の様々な細菌遺伝子に由来することがある。
種々の細菌細胞の形質転換に有用なベクターは通常のものであり、ＥＰＩＣＥＮＴＲＥ（登録商標）（Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ．（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ（Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）、およびＮｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ， Ｉｎｃ．（Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）などの企業から市販されている。ある種のベクターは、広範囲の宿主細菌において複製することができ、接合により移入させることができる。ｐＲＫ４０４および関連した３つのベクター：ｐＲＫ４３７、ｐＲＫ４４２、ｐＲＫ４４２（Ｈ）のアノテーション付き完全配列が利用可能である。これらの誘導体は、グラム陰性細菌における遺伝子操作のために役立つツールであるとわかった（Ｓｃｏｔｔら、Ｐｌａｓｍｉｄ、５０巻（１号）：７４〜７９頁（２００３年））。ある範囲のグラム陰性細菌において機能することができるプロモーターを有する、広宿主域のＩｎｃ Ｐ４プラスミドＲＳＦ１０１０のいくつかのプラスミド誘導体も利用可能である。プラスミドｐＡＹＣ３６およびｐＡＹＣ３７は、グラム陰性細菌における異種性遺伝子発現が可能になるように、複数のクローニング部位に沿って活性なプロモーターを有する。バチルス・サブティリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）およびラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）の形質転換に有用なベクターのなかには、ｐＡＭβ１およびその誘導体（Ｒｅｎａｕｌｔら、Ｇｅｎｅ、１８３巻：１７５〜１８２頁（１９９６年）；およびＯ’Ｓｕｌｌｉｖａｎら、Ｇｅｎｅ、１３７巻：２２７〜２３１頁（１９９３年））；ｐＭＢＢ１およびｐＭＢＢ１の誘導体であるｐＨＷ８００（Ｗｙｃｋｏｆｆら、Ａｐｐｌ． Ｅｎｖｉｒｏｎ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、６２巻：１４８１〜１４８６頁（１９９６年））；接合プラスミドｐＭＧ１（Ｔａｎｉｍｏｔｏら、Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．、１８４巻：５８００〜５８０４頁（２００２年））；ｐＮＺ９５２０（Ｋｌｅｅｒｅｂｅｚｅｍら、Ａｐｐｌ． Ｅｎｖｉｒｏｎ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、６３巻：４５８１〜４５８４頁（１９９７年））；ｐＡＭ４０１（Ｆｕｊｉｍｏｔｏら、Ａｐｐｌ． Ｅｎｖｉｒｏｎ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、６７巻：１２６２〜１２６７頁（２００１年））；およびｐＡＴ３９２（Ａｒｔｈｕｒら、Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ． Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．、３８巻：１８９９〜１９０３頁（１９９４年））が含まれる。ラクトバチルス・プランタルム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ）由来のプラスミドも複数報告されている（ｖａｎ Ｋｒａｎｅｎｂｕｒｇら、Ａｐｐｌ． Ｅｎｖｉｒｏｎ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、７１巻（３号）：１２２３〜１２３０頁（２００５年））。
電気穿孔や接合など、当技術分野において公知である方法を用いて、ベクターまたはプラスミドを宿主細胞に導入することができる。
イソブタノール生成用の宿主細胞
本明細書に記載されるＫＡＲＩを含めて、イソブタノール生合成経路についてエンジニアリングされた酵母および細菌細胞は、追加の改変を加えてもよい。イソブタノール合成へのフラックスを増大させる改変など、宿主細胞を改良する何らかの改変を行うことができる。
例えば、使用することができる酵母細胞を、少なくとも１つのピルビン酸デカルボキシラーゼ（ＰＤＣ）遺伝子が不活性化され、ｐｄｃ細胞を生成するようにエンジニアリングすることができ、したがってピルビン酸のアセトアルデヒドへの変換が低減され、より多くのピルビン酸がイソブタノール経路に流れることができる。酵母は、ピルビン酸デカルボキシラーゼをコードする１つまたは複数の遺伝子を有することがある。例えば、カンジダ・グラブラタ（Ｃａｎｄｉｄａ ｇｌａｂｒａｔａ）およびシゾサッカロミケス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ）においてはピルビン酸デカルボキシラーゼをコードする遺伝子が１つ存在し、サッカロミケス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）においてはＰＤＣ１、ＰＣＤ５、およびＰＤＣ６遺伝子によってコードされるピルビン酸デカルボキシラーゼのアイソザイムが３つ存在する。使用される酵母細胞が、１つを超える発現された（活性）ＰＤＣ遺伝子を有する場合、活性ＰＤＣ遺伝子はそれぞれ、不活性化され、それによってｐｄｃ細胞を生成する。例えば、出芽酵母（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）において、ＰＤＣ１、ＰＤＣ５、およびＰＤＣ６遺伝子を不活性化することができる。もっとも、ＰＤＣ６など、ＰＤＣ遺伝子が、使用される発酵条件下で活性でない場合は、この遺伝子を不活性化する必要がない。
ピルビン酸デカルボキシラーゼ活性をもたないサッカロミケス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）株がＡＴＣＣからＡｃｃｅｓｓｉｏｎ ＃２０００２７および＃２０００２８で入手可能である。さらに、参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２００９０３０５３６３号明細書および本明細書の実施例１に記載されるように、酵母を、内因性活性ＰＤＣ遺伝子が不活性化されるようにエンジニアリングすることができる。
さらに、使用することができる酵母細胞を、グルコース抑制が低減されるようにエンジニアリングすることができる。クラブトリーポジティブな酵母において起こるグルコース抑制は、高グルコースの存在下に、呼吸代謝および非グルコース炭素源の利用に関与する遺伝子の発現の抑制が起こる現象である（Ｇａｎｃｅｄｏ、（１９９８年）、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏ． Ｒｅｖ．、６２巻：３３４〜３６１頁）。２００９年９月２９日出願の米国仮特許出願第６１／２４６７０９号明細書には、ｐｄｃ表現型およびイソブタノール経路と組み合わせた、グルコース抑制を低減させた酵母細胞は、イソブタノール生成および高グルコースにおける増殖を改善したという知見が開示されている。参照により本明細書に組み込まれる米国仮特許出願第６１／２４６７０９号明細書に記載のように、グルコース抑制を下記などの方法で低減することができる：（１）グルコース抑制効果に関与する転写因子の発現の変更、例えば、Ｈａｐ１転写アクチベーターの発現の増大、またはＭｉｇ１もしくはＭｉｇ２転写リプレッサーの発現の低減、（２）ＳＣＦユビキチン−リガーゼ複合体の構成要素であり、グルコース抑制経路における１次的因子であると思われるＧＲＲ１（グルコース抑制耐性）の発現の低減、（３）ＨＸＴ１、ＨＸＴ２、ＨＸ３、ＨＸＴ４、ＨＸＴ５、ＨＸＴ６、および／またはＨＸＴ７を含めて、ヘキソーストランスポーター遺伝子の不活性化によるグルコース輸送能力の減弱、あるいは（４）内因性ヘキソキナーゼ２遺伝子（ＨＸＫ２）の欠失。上記遺伝子の発現の変更は、本明細書の実施例１に例示するものを含めて、当技術分野において周知である方法でエンジニアリングすることができる。
例えば、参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２０１００１１２６５５号明細書に記載されているように、使用することができる乳酸菌（ＬＡＢ）細胞を、乳酸デヒドロゲナーゼ活性が低減されるようにエンジニアリングすることができ、したがって乳酸のピルビン酸からの生成が低減されて、別の経路へのピルビン酸のフラックスが増大する。ＬＡＢは、乳酸デヒドロゲナーゼをコードする１つまたは複数の遺伝子、典型的には１つ、２つまたは３つの遺伝子を有することができる。例えば、ラクトバチルス・プランタルム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ）は、乳酸デヒドロゲナーゼをコードする３つの遺伝子（ｌｄｈＬ２、ｌｄｈＤ、およびｌｄｈＬ１と呼ばれる）を有する。ラクトコッカス・ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ）は、乳酸デヒドロゲナーゼをコードする１つ遺伝子（ｌｄｈＬと呼ばれる）を有し、ペディオコッカス・ベントサセウス（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ ｐｅｎｔｏｓａｃｅｕｓ）は、ｌｄｈＤおよびｌｄｈＬと呼ばれる２つの遺伝子を有する。１つを超える乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子が、使用される増殖条件下で活性であるとき、これらの活性遺伝子をそれぞれ、本明細書の実施例１のように発現が低減されるように改変することができる。
さらに、参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２０１０００８１１８２号明細書に開示されるように、ＬＡＢ宿主細胞を、Ｆｅ−Ｓクラスター形成タンパク質の発現が増大されるようにエンジニアリングして、イソブタノール経路のＦｅ−Ｓクラスターを必要とするジヒドロキシ酸デヒドラターゼ酵素の活性を改善することができる。例えば、本明細書の実施例２に記載のように、Ｆｅ−Ｓクラスター形成タンパク質をコードする内因性ｓｕｆオペロンの発現を増大させることができる。
本明細書で提供される細胞において有用であり得る追加の改変としては、（参照により本明細書に組み込まれる）米国特許出願公開第２００９０３０５３６３号明細書に記載のように、グリセロール−３−リン酸デヒドロゲナーゼ活性を低減させる改変、（参照により本明細書に組み込まれる）米国特許出願公開第２０１００１２０１０５号明細書に記載のように、Ｅｎｔｎｅｒ−Ｄｏｕｄｏｒｏｆｆ経路または還元当量のバランスを介して炭素フラックスの増大を実現する宿主細胞への改変が挙げられる。酵母ミトコンドリアにおける分枝鎖アミノ酸生合成に関与するある種の酵素の活性を低減させた酵母細胞については、（参照により本明細書に組み込まれる）米国特許出願公開第２０１００１２９８８７号明細書に記載されており、異種タンパク質の活性に補因子としてＦｅ−Ｓクラスターの結合が必要とされるそれらの活性を増大させた酵母株については、（参照により本明細書に組み込まれる）米国特許出願公開第２０１０００８１１７９号明細書に記載されている。他の改変としては、米国仮特許出願第６１／２９０，６３９号明細書に記載されている二重の役割を果たすヘキソキナーゼ活性を有するポリペプチドをコードする内因性ポリヌクレオチドにおける改変、米国仮特許出願第６１／３８０５６３号明細書に記載されているピルビン酸を利用する生合成経路におけるステップを触媒するポリペプチドをコードする少なくとも１つのポリヌクレオチドの組込みが挙げられる（引用されている仮出願は両方とも、参照により本明細書にそれらの全体として組み込まれる）。
さらに、Ｆｅ−Ｓクラスター生合成に影響を及ぼすポリペプチドをコードする内在性遺伝子において少なくとも１つの欠失、突然変異、および／または置換を含む宿主細胞については、（参照により本明細書に組み込まれる）米国仮特許出願第６１／３０５３３３号明細書に記載されており、ホスホケトラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする異種ポリヌクレオチドを含む宿主細胞およびホスホトランスアセチラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする異種ポリヌクレオチドを含む宿主細胞については、米国仮特許出願第６１／３５６３７９号明細書に記載されている。
上記の改変を有する宿主細胞をエンジニアリングする方法は、当技術分野において周知である。遺伝子発現の方法としては、ＫＡＲＩの発現について上述されたものが挙げられる。遺伝子不活性化の方法としては、コードする遺伝子の全部または一部分の欠失、コードされたタンパク質を発現することができないように、コードする遺伝子にＤＮＡ断片を（プロモーターまたはコード領域で）挿入すること、突然変異をコード領域に導入し、機能タンパク質が発現されないように終止コドンまたはフレームシフトを加えること、および１つまたは複数の突然変異をコード領域に導入して、アミノ酸を非機能タンパク質が発現されるように変更することが挙げられるが、これらに限定されるものではない。さらに、発現をアンチセンスＲＮＡまたは干渉ＲＮＡの発現によってブロックすることができ、コサプレッションを生じる構築物を導入することができる。
イソブタノール生成
本明細書に記載されたようにインビボで高有効性であるＫＡＲＩを有する本細胞は、参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２００７００９２９５７（Ａ１）号明細書に開示され、図１に示されるものなどの生合成経路を使用して、イソブタノールを生成する。
米国特許出願公開第２００７００９２９５７（Ａ１）号に記載のように、イソブタノール生合成経路例におけるステップは、
− 例えば、ＥＣ番号２．２．１．６９で知られるアセト乳酸合成酵素（ＡＬＳ）によって触媒されるピルビン酸からアセト乳酸への変換（図１経路ステップａ）；
− 例えば、ＥＣ番号１．１．１．８６で知られるアセトヒドロキシ酸イソメロレダクターゼ、別名ケトール酸レダクトイソメラーゼ（ＫＡＲＩ）によって触媒されるアセト乳酸から２，３−ジヒドロキシイソ吉草酸への変換（図１経路ステップｂ）；
− 例えば、ＥＣ番号４．２．１．９で知られるアセトヒドロキシ酸デヒドラターゼ、別名ジヒドロキシ酸デヒドラターゼ（ＤＨＡＤ）によって触媒される２，３−ジヒドロキシイソ吉草酸からα−ケトイソ吉草酸への変換（図１経路ステップｃ）；
− 例えば、ＥＣ番号４．１．１．７２または４．１．１．１で知られる分枝鎖α−ケト酸デカルボキシラーゼによって触媒されるα−ケトイソ吉草酸からイソブチルアルデヒドへの変換（図１経路ステップｄ）；および
− 例えば、ＥＣ番号１．１．１．２６５で知られるが、他のアルコールデヒドロゲナーゼ（具体的には、ＥＣ １．１．１．１または１．１．１．２）に分類されることもある分枝鎖アルコールデヒドロゲナーゼによって触媒されるイソブチルアルデヒドからイソブタノールへの変換（図１経路ステップｅ）
を含む。
代替経路のステップｆ、ｇ、ｈ、Ｉ、ｊ、およびｋの場合、基質から生成物への変換、およびこれらの反応に関与する酵素は、米国特許出願公開第２００７００９２９５７（Ａ１）号明細書に記載されている。
これらの酵素の発現に使用することができる遺伝子、および追加の２つのイソブタノール経路用の遺伝子については、米国特許出願公開第２００７００９２９５７（Ａ１）号明細書に記載されており、使用することができる追加の遺伝子は、上述されたように当業者に周知のことであるが、文献およびバイオインフォマティクス手法を使用して同定することができる。さらに、そこに記載される配列を使用して、上述されたように当技術分野において周知である配列依存性プロトコルを用いて、相同タンパク質をコードする遺伝子を単離することができる。
例えば、使用することができる代表的ＡＬＳ酵素のなかには、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）のａｌｓＳおよびクレブシエラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）のｂｕｄＢによってコードされるものも含まれる（Ｇｏｌｌｏｐら、Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．、１７２巻（６号）：３４４４〜３４４９頁（１９９０年）；Ｈｏｌｔｚｃｌａｗら、Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．、１２１巻（３号）：９１７〜９２２頁（１９７５年））。バチルス・サブティリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）（ＤＮＡ：配列番号：６９；タンパク質：配列番号：７０）、クレブシエラ・ニューモニアエ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）（ＤＮＡ：配列番号：７２；タンパク質：配列番号：７３）、およびラクトコッカス・ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ）（ＤＮＡ：配列番号：７４；タンパク質：配列番号：７５）由来のＡＬＳ、ならびにラクトバチルス・プランタルム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ）における発現に最適化されたバチルス・サブティリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ａｌｓコード領域（配列番号：７１）が本明細書に記載されている。使用することができる追加のａｌｓコード領域およびコードされたタンパク質としては、スタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）（ＤＮＡ：配列番号：７６；タンパク質：配列番号：７７）、リステリア・モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）（ＤＮＡ：配列番号：７８；タンパク質：配列番号：７９）、ストレプトコッカス・ミュータンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｕｔａｎｓ）（ＤＮＡ：配列番号：８０；タンパク質：配列番号：８１）、ストレプトコッカス・サーモフィルス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）（ＤＮＡ：配列番号：８２；タンパク質：配列番号：８３）、ビブリオ・アングスツム（Ｖｉｂｒｉｏ ａｎｇｕｓｔｕｍ）（ＤＮＡ：配列番号：８４；タンパク質：配列番号：８５）、およびバチルス・セレウス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｅｒｅｕｓ）（ＤＮＡ：配列番号：８６；タンパク質：配列番号：８７）由来のものが挙げられる。ピルビン酸をアセト乳酸に変換する配列番号：７０、７３、７５、７７、７９、８１、８３、８５、または８７を有するもののうちのいずれか１つと少なくとも約８０〜８５％、８５％〜９０％、９０％〜９５％、または少なくとも約９６％、９７％、または９８％の配列同一性を有するアセト乳酸合成酵素をコードするａｌｓ遺伝子を使用することができる。同一性は、ＧＡＰ ＰＥＮＡＬＴＹ＝１０、ＧＡＰ ＬＥＮＧＴＨ ＰＥＮＡＬＴＹ＝０．１、およびタンパク質重量マトリックスのＧｏｎｎｅｔ ２５０シリーズというデフォルトパラメーターを用いたＣｌｕｓｔａｌ Ｗアラインメント法に基づくものである。
さらに、参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２００９０３０５３６３号明細書は、Ｂ．サブティリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＡｌｓＳ配列の１００の最近傍であり、それらのいずれも使用することができるアセト乳酸合成酵素を表す系統樹を提供する。本株で使用することができる追加のＡｌｓ配列は、当業者に周知である文献およびバイオインフォマティクスデータベースで同定することができる。バイオインフォマティクスを使用したコード配列および／またはタンパク質配列の同定は、典型的には本明細書に記載されているものなど、既知のＡｌｓをコードする配列またはコードされたアミノ酸配列に関して公的に利用可能なデータベースの（上記の）ＢＬＡＳＴ検索によって行われる。同定は、以上に指定したＣｌｕｓｔａｌ Ｗアラインメント法に基づいている。さらに、上記のように、本明細書に列挙された配列または当技術分野で列挙されているものを使用して、自然界における他の相同体を同定することができる。
酵母におけるアセト乳酸合成酵素のサイトゾル発現は、アセト乳酸合成酵素タンパク質をコードする配列を含むが、ミトコンドリア標的化シグナル配列を含まない遺伝子で形質転換することによって実現される。酵母における遺伝子発現方法は、当技術分野において公知である（例えば、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、１９４巻、Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｙｅａｓｔ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｐａｒｔ Ａ、２００４年、Ｃｈｒｉｓｔｉｎｅ ＧｕｔｈｒｉｅおよびＧｅｒａｌｄ Ｒ． Ｆｉｎｋ（編）、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡを参照のこと）。キメラ遺伝子（プロモーターおよびターミネーターを含む）を用いた発現、ベクター、クローニング法、および組込み方法は、上述の通りである。
使用することができるＫＡＲＩ酵素は、上述の通りである。追加のＫＡＲＩ酵素があれば、本明細書に記載されるＫＡＲＩ酵素と一緒に使用できることも考えられる。好適なＫＡＲＩ酵素としては、米国特許出願公開第２００８０２６１２３０号明細書、同第２００９０１６３３７６号明細書、および同第２０１００１９７５１９号明細書（これらはすべて、参照により本明細書に組み込まれる）に記載されているものが挙げられる。
例えば、使用することができるＤＨＡＤ酵素は、ラクトコッカス・ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ）（ＤＮＡ：配列番号：９４；タンパク質配列番号：９５）もしくはストレプトコッカス・ミュータンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｕｔａｎｓ）（ＤＮＡ：配列番号：９６；タンパク質配列番号：９７）のｉｌｖＤ遺伝子、または出芽酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）（ＤＮＡ：配列番号：９８；タンパク質配列番号：９９）のＩＬＶ３遺伝子に由来するものとすることができる。使用することができる追加のＤＨＡＤ配列を得るのに使用することができる追加のＤＨＡＤ配列は、参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２０１０００８１１５４号明細書に開示されている。この参考文献には、使用することができる追加のＤＨＡＤ配列を得るための説明も含まれている。
例えば、使用することができる分枝鎖ケト酸デカルボキシラーゼ酵素としては、ラクトコッカス・ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ）（ＤＮＡ：配列番号：１００；タンパク質配列番号：１０１）のｋｉｖＤ遺伝子、ならびにラクトバチルス・プランタルム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ）（配列番号：１０２）における発現に最適化されたコドンであるＬ．ラクティス（Ｌ．ｌａｃｔｉｓ）ｋｉｖＤコード領域、および上述されたようにバイオインフォマティクスを使用して当業者が同定することができる他のものに由来するものが挙げられる。
例えば、使用することができる分枝鎖アルコールデヒドロゲナーゼは、ＥＣ番号１．１．１．２６５で知られるが、他のアルコールデヒドロゲナーゼ（具体的には、ＥＣ １．１．１．１または１．１．１．２）に分類されることもある。これらの酵素は、ＮＡＤＨ（還元型ニコチンアミド−アデニンジヌクレオチド）および／またはＮＡＤＰＨを電子供与体として利用し、使用することができる分枝鎖アルコールデヒドロゲナーゼ酵素およびそれらのコード領域の配列は、米国特許出願公開第２００７００９２９５７（Ａ１）号明細書に記載されている。
さらに、参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２００９０２６９８２３号明細書に開示されている、アクロモバクター・キシロソキシダンス（Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ ｘｙｌｏｓｏｘｉｄａｎｓ）（ＤＮＡ：配列番号：１０３、タンパク質配列番号：１０４）であると同定された細菌の環境単離物から単離された新規ブタノールデヒドロゲナーゼｓａｄＢは、イソブチルアルデヒドをイソブタノールに変換する最後のステップに有用である。Ｌ．プランタルム（Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ）（配列番号：１０５）における発現に最適化されたｓａｄＢコード領域を使用することができる。さらに、ウマ肝臓由来のアルコールデヒドロゲナーゼ（ＨＡＤＨ；出芽酵母（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）における発現に最適化されたコドン；ＤＮＡ：配列番号：１０６；タンパク質配列番号：１０７）、および上述されたようにバイオインフォマティクスを使用して当業者によって容易に同定された他のもの。追加のアルコールデヒドロゲナーゼについては、参照により本明細書に組み込まれる米国仮特許出願第６１／２９０，６３６号明細書に記載されている。
乳酸デヒドロゲナーゼ活性を実質的に含まないＬＡＢ細胞におけるＤＨＡＤの活性の改善は、参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２０１０００８１１８３号明細書に開示された。さらに、鉄−硫黄クラスター形成タンパク質の発現を増大させて、ＤＨＡＤの活性を改善することが、参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２０１０−００８１１８２号明細書に開示されている。
米国特許出願公開第２００７００９２９５７（Ａ１）号明細書には、キメラ遺伝子の構築およびＬＡＢの遺伝子工学が記載されており、開示された生合成経路を使用するイソブタノール生成にはラクトバチルス・プランタルム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ）が例示されている。当業者に周知であるように、経路酵素発現のためのキメラ遺伝子は、細胞中で複製プラスミド上に存在し、または細胞ゲノムに組み込まれることがある。米国特許出願公開第２００７００９２９５７（Ａ１）号明細書には、キメラ遺伝子の構築および酵母の遺伝子工学がさらに記載されており、開示された生合成経路を使用するイソブタノール生成には出芽酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）が例示されている。遺伝子構築および発現についてのさらなる説明は、上記および本明細書の実施例に記載されている。
生成のための増殖
本明細書に開示する細菌および酵母細胞は、イソブタノール生成用の発酵培地で増殖させることができる。最大の生成には、生成宿主として使用される株が、増強されたイソブタノール耐性を有し、および高い炭化水素利用率を有することが好ましい。これらの特性は、突然変異誘発と選択、遺伝子工学によって付与されることもあり、または自然のものであることもある。
細胞は、好適な炭素基質を含有する発酵培地中で増殖される。適切な基質としては、グルコースやフルクトースなどの単糖、ラクトースもしくはスクロースなどのオリゴ糖、デンプンもしくはセルロースなどの多糖、またはそれらの混合物、ならびにチーズホエー透過物、コーンスティープリカー、シュガービート糖蜜、および大麦麦芽などの再生可能なフィードストックの未精製混合物を挙げることができるが、これらに限定されるものではない。他の炭素基質としては、エタノール、ラクタート、スクシナート、またはグリセロールを挙げることができる。さらに、発酵性糖は、例えば参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２００７／００３１９１８（Ａ１）号）明細書に記載されているように、再生可能なセルロースまたはリグノセルロースバイオマスから、前処理および糖化のプロセスを経て誘導することができる。したがって、本発明において利用される炭素の供給源は、多種多様な炭素含有基質を包含することができ、有機体の選択によって限定されるだけになると考えられる。
発酵培地は、適切な炭素源に加えて、イソブタノールの生成にとって必要である培養物の増殖および酵素経路の促進に適した、当業者に公知の適切な鉱物、塩、補因子、緩衝液、および他の成分を含有しなければならない。
培養条件
典型的には、適切な培地中、細菌細胞は、約２５℃から約４０℃の範囲の温度で増殖され、酵母細胞は、約２０℃から約３７℃の範囲の温度で増殖される。好適な増殖培地は、工業的に調製された一般的な培地であり、使用する特定の細胞の増殖に適した培地は、微生物学または発酵科学の当業者には公知であろう。
細菌の場合、発酵に適したｐＨ範囲はｐＨ５．０〜ｐＨ９．０であり、ｐＨ６．０〜ｐＨ８．０が初期条件として好ましい。酵母の場合、発酵に適したｐＨ範囲は、ｐＨ３．０〜ｐＨ７．５であり、ｐＨ４．５〜ｐＨ６．５が初期条件として好ましい。
発酵は、好気性または嫌気性条件下で行うことができ、嫌気性または微好気性条件が好ましい。
イソブタノールの生成は、バッチ、フェドバッチ、または連続プロセスを使用して実施することができること、公知の発酵モードならいずれも適しているはずであることが考えられる。さらに、細胞を基質に全細胞触媒として固定化し、イソブタノール生成の発酵条件にかけることができると考えられる。
イソブタノールの発酵培地からの単離方法
生合成されたイソブタノールは、ＡＢＥ発酵について当技術分野において公知である方法を使用して発酵培地から単離することができる（例えば、Ｄｕｒｒｅ、Ａｐｐｌ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、４９巻：６３９〜６４８頁（１９９８年）、Ｇｒｏｏｔら、Ｐｒｏｃｅｓｓ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．、２７巻：６１〜７５頁（１９９２年）、およびそれらの引用文献を参照のこと）。例えば、固体は、発酵培地から遠心、濾過、デカンテーションなどによって除去することができる。次いで、イソブタノールは、蒸留、共沸蒸留、液液抽出、吸着、ガスストリッピング、膜蒸留、または浸透気化などの方法を使用して発酵培地から単離することができる。
下記の実施例において、本発明をさらに説明する。本発明の好ましい実施形態を示すこれらの実施例は、例として挙げられているだけのものであると理解されたい。上記の考察およびこれらの実施例から、当業者は、本発明の本質的な特徴を確認することができ、その趣旨および範囲から逸脱することなく、本発明を様々な使用および条件に適応させるために本発明の様々な変更および修正を行うことができる。
略語の意味は以下の通りである：「ｓ」は秒を意味し、「ｍｉｎ」は分を意味し、「ｈ」は時間を意味し、「ｐｓｉ」は平方インチ当たりポンドを意味し、「ｎｍ」はナノメートルを意味し、「ｄ」は日を意味し、「μｌ」はマイクロリットルを意味し、「ｍｌ」はミリリットルを意味し、「Ｌ」はリットルを意味し、「ｍｍ」はミリメートルを意味し、「ｎｍ」はナノメートルを意味し、「ｍＭ」はミリモルを意味し、「Ｍ」はモルを意味し、「ｍｍｏｌ」はミリモルを意味し、「μｍｏｌ」はマイクロモルを意味し、「ｇ」はグラムを意味し、「μｇ」はマイクログラムを意味し、「ｎｇ」はナノグラムを意味し、「ＰＣＲ」はポリメラーゼ連鎖反応を意味し、「ＯＤ」は光学密度を意味し、「ＯＤ６００」は６００ｎｍの波長で測定された光学密度を意味し、「ｋＤａ」はキロダルトンを意味し、、「ｇ」は引力定数を意味し、「ｂｐ」は塩基対を意味し、「ｋｂｐ」はキロベース対を意味し、「％ｗ／ｖ」は重量／容量％を意味し、「％ｖ／ｖ」は容量／容量％を意味し、「ｗｔ％」は重量パーセントを意味し、「ＨＰＬＣ」は高速液体クロマトグラフィーを意味し、「ＧＣ」はガスクロマトグラフィーを意味する。
実施例で使用される標準組換えＤＮＡおよび分子クローニング技法は、当技術分野において周知であり、Ｓａｍｂｒｏｏｋ， Ｊ．、Ｆｒｉｔｓｃｈ， Ｅ． Ｆ．およびＭａｎｉａｔｉｓ， Ｔ．、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ； Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ： Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（１９８９年） （Ｍａｎｉａｔｉｓ）、ならびにＴ． Ｊ． Ｓｉｌｈａｖｙ、Ｍ． Ｌ． Ｂｅｎｎａｎ、およびＬ． Ｗ． Ｅｎｑｕｉｓｔ、 Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ ｗｉｔｈ Ｇｅｎｅ Ｆｕｓｉｏｎｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、 Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（１９８４年）、ならびにＡｕｓｕｂｅｌ， Ｆ． Ｍ．ら、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃ． ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ出版（１９８７年）、ならびにＭｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｙｅａｓｔ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、２００５年、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹによって記載されている。
細菌培養物の維持および増殖に適した材料および方法は、当技術分野において周知である。以下の実施例での使用に適した技法は、Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ （Ｐｈｉｌｌｉｐｐ Ｇｅｒｈａｒｄｔ， Ｒ． Ｇ． Ｅ． Ｍｕｒｒａｙ， Ｒａｌｐｈ Ｎ． Ｃｏｓｔｉｌｏｗ， Ｅｕｇｅｎｅ Ｗ． Ｎｅｓｔｅｒ， Ｗｉｌｌｉｓ Ａ． Ｗｏｏｄ， Ｎｏｅｌ Ｒ．
Ｋｒｉｅｇ ａｎｄ Ｇ． Ｂｒｉｇｇｓ Ｐｈｉｌｌｉｐｓ編）， Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ， Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，ＤＣ． （１９９４年））、またはＴｈｏｍａｓ Ｄ． Ｂｒｏｃｋ、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ａ Ｔｅｘｔｂｏｏｋ ｏｆ Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、第２版、Ｓｉｎａｕｅｒ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ， Ｉｎｃ．、Ｓｕｎｄｅｒｌａｎｄ，ＭＡ （１９８９年）に記載のように見ることができる。別段の指定のない限り、細菌細胞の増殖および維持に使用される試薬、制限酵素、および材料はすべて、Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ （Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ，ＷＩ）、ＢＤ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ Ｓｙｓｔｅｍｓ （Ｓｐａｒｋｓ，ＭＤ）、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ （Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）、またはＳｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ （Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）から入手した。微生物株は、別段の注記のない限りＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ （ＡＴＣＣ）、（Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）から入手した。下記の実施例で使用されるオリゴヌクレオチドプライマーを表３に示す。オリゴヌクレオチドプライマーはすべて、Ｓｉｇｍａ−Ｇｅｎｏｓｙｓ（Ｗｏｏｄｌａｎｄｓ， ＴＸ）、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｃｏｒａｌｓｖｉｌｌｅ，ＩＡ）、またはＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）によって合成された。
ＤＮＡ断片を、Ｑｉａｑｕｉｃｋ ＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ Ｉｎｃ．、Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）で精製した。プラスミドＤＮＡを、ＱＩＡｐｒｅｐ Ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ Ｉｎｃ．、Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）で調製した。Ｌ．プランタルム（Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ）ＰＮ０５１２ゲノムＤＮＡを、ＭａｓｔｅｒＰｕｒｅ ＤＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ、Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）で調製した。
合成完全培地は、Ａｍｂｅｒｇ、ＢｕｒｋｅおよびＳｔｒａｔｈｅｒｎ、２００５年、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｙｅａｓｔ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹに記載されている。
形質転換
ラクトバチルス・プランタルム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ）ＰＮ０５１２を、下記の手順で形質転換した：１％グリシン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を含有する ラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｉ）ＭＲＳ培地（Ａｃｃｕｍｅｄｉａ、Ｎｅｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｌａｎｓｉｎｇ、ＭＩ）５ｍｌに、ＰＮ０５１２細胞を播種し、３０℃で一晩増殖させた。１％グリシン含ＭＲＳ培地１００ｍｌに、一晩培養物を０．１のＯＤ６００まで播種し、３０℃で０．７のＯＤ６００まで増殖させた。細胞を、３７００ｘｇで８分間、４℃で収穫し、１ｍＭの冷ＭｇＣｌ２（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）１００ｍｌで洗浄し、３７００ｘｇで８分間、４℃で遠心し、冷３０％ＰＥＧ−１０００（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）１００ｍｌで洗浄し、３７００ｘｇで２０分間、４℃で再び遠心し、次いで１ｍｌの冷３０％ＰＥＧ−１０００に再懸濁した。６０μｌの細胞を、ギャップ１ｍｍの冷エレクトロポレーションキュベット中で、約１００ｎｇのプラスミドＤＮＡと混合し、ＢｉｏＲａｄ Ｇｅｎｅ Ｐｕｌｓｅｒ（Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）で１．７ｋＶ、２５μＦ、および４００Ωにおいて電気穿孔した。５００ｍＭスクロース（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）および１００ｍＭのＭｇＣｌ２を含有するＭＲＳ培地１ｍｌに、細胞を再懸濁し、３０℃で２時間インキュベートし、１または２μｇ／ｍｌのエリスロマイシンを含有するＭＲＳ培地（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）に蒔き、次いでＰａｃｋ−Ａｎａｅｒｏサシェ（三菱ガス化学株式会社、日本、東京）が入っている嫌気性ボックスに入れ、３０℃でインキュベートした。
ＨＰＬＣ方法
発酵副生物組成物の分析は当業者に周知である。例えば、１つの高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）方法は、Ｓｈｏｄｅｘ ＳＨ−１０１１カラムをＳｈｏｄｅｘ ＳＨ−Ｇガードカラム（両方とも、Ｗａｔｅｒｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、（Ｍｉｌｆｏｒｄ，ＭＡ）から入手可能）と共に利用し、屈折率（ＲＩ）で検出した。クロマトグラフ分離は、０．０１Ｍ Ｈ２ＳＯ４を移動相として、流量０．５ｍＬ／分およびカラム温度５０ ℃で使用して実現される。イソブタノール保持時間は約４７．６分である。
実施例１
ｉｌｖＤ組込み型ベクターおよびＰＮ０５１２ΔｌｄｈＤΔｌｄｈＬ１：：ｉｌｖＤＬｌ＋組込み株の構築
この実施例は、ＤＨＡＤの発現のため、Ｌ．プランタルム（Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ）株ＰＮ０５１２ΔｌｄｈＤΔｌｄｈＬ１の染色体へのラクトコッカス・ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ）ｉｌｖＤ遺伝子の組込みを説明する。Ｌ．プランタルム（Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ）ＰＮ０５１２ΔｌｄｈＤΔｌｄｈＬ１の構築は、米国仮特許出願第６１／１００７８６号明細書の実施例１に記載された。この株は、主要な乳酸デヒドロゲナーゼをコードする２つの遺伝子：ｌｄｈＤおよびｌｄｈＬ１について欠失している。この二重欠失体は、ラクトバチルス・プランタルム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ）ＰＮ０５１２（ＡＴＣＣ株 ＃ＰＴＡ−７７２７）において作製された。
２段階相同組換え手順に基づくプロセスを使用して、遺伝子ノックアウトが構築されて、無マーカー遺伝子欠失体が得られた（Ｆｅｒａｉｎら、１９９４年、Ｊ． Ｂａｃｔ．、１７６巻：５９６頁）。この手順では、シャトルベクターｐＦＰ９９６（配列番号：１１０）が利用された。ｐＦＰ９９６は、グラム陽性細菌用のシャトルベクターである。これは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）とグラム陽性細菌において複製することができる。ｐＢＲ３２２（ヌクレオチド＃２６２８から５３２３）およびｐＥ１９４（ヌクレオチド＃４３から２６２７）からの複製開始点を含む。ｐＥ１９４は、本来グラム陽性細菌であるスタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）（ＨｏｒｉｎｏｕｃｈｉおよびＷｅｉｓｂｌｕｍ Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．、（１９８２年）、１５０巻（２号）：８０４〜８１４頁）から単離された小型プラスミドである。ｐＦＰ９９６において、複数のクローニング部位（ヌクレオチド＃１から５０）は、ＥｃｏＲＩ、ＢｇｌＩＩ、ＸｈｏＩ、ＳｍａＩ、ＣｌａＩ、ＫｐｎＩ、およびＨｉｎｄＩＩＩ用の制限部位を含む。抗生物質耐性マーカーは２つ存在する；一方は、アンピシリン耐性のものであり、他方はエリスロマイシン耐性のものである。選択のため、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）における形質転換にはアンピシリンを使用し、Ｌ．プランタルム（Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ）における選択にはエリスロマイシンを使用した。
ＤＮＡの２つのセグメントはそれぞれ、９００から１２００ｂｐの配列を所期の欠失の上流または下流に含むものであるが、プラスミドにクローニングして、２つの遺伝子クロスオーバー用の相同性領域を提供した。細胞を、世代数（３０〜５０）を増加するのに増殖させて、クロスオーバー事象が起こることを可能にした。最初のクロスオーバー（シングルクロスオーバー）では、プラスミドがプラスミド上の２つの相同性領域のうちの１つを介した相同組換えにより染色体に組み込まれた。第２のクロスオーバー（ダブルクロスオーバー）事象では、野生型配列または所期の遺伝子欠失体が得られた。最初の組込み事象を引き起こした配列間のクロスオーバーは野生型配列をもたらし、他の相同性領域間クロスオーバーは所望の欠失体をもたらすはずである。第２のクロスオーバー事象を、抗生物質感受性によりスクリーニングした。シングルおよびダブルのクロスオーバー事象を、ＰＣＲおよびＤＮＡ配列決定により分析した。
ΔｌｄｈＤ
ｌｄｈＤ遺伝子を欠失させるためのノックアウトカセットは、ＥｃｏＲＩ部位を含むＴｏｐ Ｄ Ｆ１（配列番号：１１１）とＴｏｐ Ｄ Ｒ１（配列番号：１１２）のプライマーを有する上流フランキング領域であるＰＮ０５１２ゲノムＤＮＡから増幅させることによって作製した。ｌｄｈＤのコード配列の一部分を含む下流の相同性領域を、Ｂｏｔ Ｄ Ｆ２（配列番号：１１３）とＸｈｏＩ部位を含むＢｏｔ Ｄ Ｒ２（配列番号：１１４）のプライマーで増幅させた。２つの相同性領域を、以下の通りＰＣＲ ＳＯＥにより合わせた。０．９ｋｂｐの上流および下流ＰＣＲ生成物をゲル精製した。ＰＣＲ生成物を、ＰＣＲ反応において等量で混合し、プライマーＴｏｐ Ｄ Ｆ１およびＢｏｔ Ｄ Ｒ２で再増幅させた。１．８ｋｂｐの最終ＰＣＲ生成物をゲル精製し、ＴＯＰＯをｐＣＲ４ＢｌｕｎｔＩＩ−ＴＯＰＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローニングして、ベクターｐＣＲＢｌｕｎｔＩＩ：：ｌｄｈＤを作製した。ｌｄｈＤ遺伝子の内部欠失を保有している組込み型ベクターを作製するために、ｐＦＰ９９６をＥｃｏＲＩおよびＸｈｏＩで消化し、５３１１−ｂｐの断片をゲル精製した。ベクターｐＣＲＢｌｕｎｔＩＩ：：ｌｄｈＤをＥｃｏＲＩおよびＸｈｏＩで消化し、１．８ｋｂｐの断片をゲル精製した。Ｔ４ ＤＮＡリガーゼを使用して、ｌｄｈＤノックアウトカセットとベクターを連結させ、ベクターｐＦＰ９９６：：ｌｄｈＤ ｋｏを得た。
エレクトロコンピテントなラクトバチルス・プランタルム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ）ＰＮ０５１２細胞を調製し、ｐＦＰ９９６：：ｌｄｈＤ ｋｏで形質転換し、１μｇ／ｍｌのエリスロマイシンを含有するＭＲＳに蒔いた。シングルクロスオーバー事象（ｓｃｏ）を得るために、形質転換体を、ＭＲＳ培地中、３７℃で約５０世代継代培養した。増殖した後、単一コロニーについて、一定分量ずつを、１μｇ／ｍｌのエリスロマイシンを含有するＭＲＳ上に蒔いた。プライマーｌｄｈＤ Ｓｅｑ Ｆ１（配列番号：１１５）およびＤチェックＲ（配列番号：１１６）を使用したＰＣＲ増幅により、エリスロマイシン耐性コロニーをスクリーニングして、野生型とｓｃｏ事象を保有するクローンとを識別した。ダブルクロスオーバーを有するクローンを得るために、ｓｃｏ株を、２０ｍＭのＤ，Ｌ−ラクタート含ＭＲＳ培地（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）中、３７℃で約３０世代継代培養し、次いで単一コロニーについて、ラクタート含ＭＲＳ上に蒔いた。コロニーを摘出し、ラクタート含ＭＲＳおよび１μｇ／ｍｌのエリスロマイシンを含有するラクタート含ＭＲＳ上にパッチして、エリスロマイシンに感受性を示すコロニーを見出した。感受性を示すコロニーを、プライマーＤチェックＲ（配列番号：１１６）およびＤチェックＦ３（配列番号：１１１７）を使用したＰＣＲ増幅によりスクリーニングした。野生型コロニーは３．２ｋｂｐの生成物をもたらし、ＰＮ０５１２ΔｌｄｈＤと呼ばれる欠失クローンは２．３ｋｂｐのＰＣＲ生成物をもたらした。
ΔｌｄｈＤΔｌｄｈＬ１
ダブルΔｌｄｈＬ１ΔｌｄｈＤ欠失株を作製するために、ＰＮ０５１２ΔｌｄｈＤ株において、ｌｄｈＬ１遺伝子の欠失を行った。ｌｄｈＬ１遺伝子を欠失させるためのノックアウトカセットを、ＰＮ０５１２ゲノムＤＮＡから増幅させた。ｌｄｈＬ１左ホモロジーアームは、ＢｇｌＩＩ制限部位を含むプライマーｏＢＰ３１（配列番号：１１８）およびＸｈｏＩ制限部位を含むプライマーｏＢＰ３２（配列番号：１１９）を使用して増幅させた。ｌｄｈＬ１右ホモロジーアームは、ＸｈｏＩ制限部位を含むプライマーｏＢＰ３３（配列番号：１２０）およびＸｍａＩ制限部位を含むプライマーｏＢＰ３４（配列番号：１２１）を使用して増幅させた。ｌｄｈＬ１左ホモロジーアームを、ＢｇｌＩＩ／ＸｈｏＩ部位にクローニングし、ｌｄｈＬ１右ホモロジーアームを、ｐＦＰ９９６の誘導体であるｐＦＰ９９６ｐｙｒＦΔｅｒｍのＸｈｏＩ／ＸｍａＩ部位にクローニングした。ｐＦＰ９９６ｐｙｒＦΔｅｒｍは、ｐＦＰ９９６におけるエリスロマイシンコード領域の代わりに、ラクトバチルス・プランタルム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ）ＰＮ０５１２由来のオロチジン−５’−リン酸デカルボキシラーゼをコードするｐｙｒＦ配列（配列番号：１２２）を含む。第２の相同クロスオーバーを単離するために、プラスミド由来のｐｙｒＦ遺伝子は、ΔｐｙｒＦ株における化学物質５−フルオロオロチン酸と一緒に有効的な対抗選択方法として使用することができる。ＸｍａＩ消化の後に、ｌｄｈＬ１ホモロジーアームを含むＸｍａＩ断片を単離し、ｐＦＰ９９６のＸｍａＩ制限部位にクローニングし、９００ｂｐの左相同性領域および１２００ｂｐの右相同性領域が得られ、ベクターｐＦＰ９９６−ｌｄｈＬ１−アームが作製された。
ＰＮ０５１２ΔｌｄｈＤを、ｐＦＰ９９６−ｌｄｈＬ１−アームで形質転換し、ラクタート（２０ｍＭ）およびエリスロマイシン（１μｇ／ｍｌ）を含有するラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｉ）ＭＲＳ培地中、３０℃で約１０世代増殖させた。次いで、形質転換体を、ＭＲＳ＋ラクタート中、非選択的条件下に、一連の播種により３７℃で約５０世代増殖させた後、ラクタートおよびエリスロマイシン（１μｇ／ｍｌ）を含有するＭＲＳ上に培養物を蒔いた。単離物を、染色体特異的プライマーｏＢＰ４９（配列番号：１２３）およびプラスミド特異的プライマーｏＢＰ４２（配列番号：１２４）を使用して、コロニーＰＣＲにより、シングルクロスオーバーについてスクリーニングした。シングルクロスオーバー組込み体を、ラクタート含ＭＲＳ中で、非選択的条件下に３７℃で、一連の播種により約４０世代増殖させた後、培養物をラクタート含ＭＲＳ培地上に蒔いた。単離物をラクタート含ＭＲＳプレートにパッチし、３７℃で増殖し、次いでラクタートおよびエリスロマイシン（１μｇ／ｍｌ）を含むＭＲＳプレート上にパッチした。エリスロマイシン感受性単離物を、染色体特異的プライマーｏＢＰ４９（配列番号：１２３）およびｏＢＰ５６（配列番号：１２５）を使用して、コロニーＰＣＲにより、野生型または欠失第２クロスオーバーの有無についてスクリーニングした。野生型配列は、３５０５ｂｐの生成物をもたらし、欠失配列は、２５４５ｂｐの生成物をもたらした。欠失体は、ＰＣＲ生成物を配列決定することによって確認し、プライマーｏＢＰ４２（配列番号：１２４）およびｏＢＰ５７（配列番号：１２６）を用いたコロニーＰＣＲにより、プラスミドが存在していないことを検査した。
ラクトバチルス・プランタルム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ）ＰＮ０５１２ダブルｌｄｈＤｌｄｈＬ１欠失株をＰＮＰ０００１と称した。ΔｌｄｈＤ欠失体は、ｌｄｈＤ開始コドンがアミノ酸３３２の２７９を経由したその上流に８３ｂｐを含むものであった。ΔｌｄｈＬ１欠失体は、最終アミノ酸を経由したｆＭｅｔを含むものであった。
第２のクロスオーバー事象が野生型配列、または欠失体でなく所期の組込み体をもたらした点以外は、同じ２段階相同組換え手順で、ｐＦＰ９９６シャトルベクターを使用して、ｌｄｈＬ１プロモーターから発現されたＬ．ラクティス（Ｌ．ｌａｃｔｉｓ）ｉｌｖＤコード領域の単一コピーの染色体組込み体が構築されて、上記の無マーカー組込み体を得た。ＤＮＡの２つのセグメントは、配列を所期の組込み部位の上流および下流に含むものであるが、プラスミドにクローニングして、２つの遺伝子クロスオーバーのための相同性領域を提供した。
組込みによって、ｉｌｖＤコード領域がＰＮ０５１２ΔｌｄｈＤΔｌｄｈＬ１株におけるｌｄｈＬ１プロモーターの下流に配置されることになるような、２つの遺伝子クロスオーバー用の相同性領域が提供されるように、２つのＤＮＡセグメント（ホモロジーアーム）を設計した。プラスミドにクローニングした左右のホモロジーアームはそれぞれ、約１２００塩基対であった。左ホモロジーアームは、Ｐｈｕｓｉｏｎ Ｈｉｇｈ−Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘを使用して、ＢｇｌＩＩ制限部位を含むプライマーＢＰ３１（配列番号：１１８）およびＸｈｏＩ制限部位を含むプライマーｏＢＰ３２（配列番号１１９）を用いて、Ｌ．プランタルム（Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ）ＰＮ０５１２ゲノムＤＮＡから増幅させた。右ホモロジーアームは、Ｐｈｕｓｉｏｎ Ｈｉｇｈ−Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘを使用して、ＸｈｏＩ制限部位を含むプライマーｏＢＰ３３（配列番号：１２０）およびＸｍａＩ制限部位を含むプライマーｏＢＰ３４（配列番号：１２１）を用いて、Ｌ．プランタルム（Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ）ＰＮ０５１２ゲノムＤＮＡから増幅させた。左ホモロジーアームをＢｇｌＩＩおよびＸｈｏＩで消化し、右ホモロジーアームをＸｈｏＩおよびＸｍａＩで消化した。２つのホモロジーアームは、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼで連結させて、ｐＦＰ９９６の対応する制限部位になり、適切な制限酵素で消化された後、ベクターｐＦＰ９９６−ｌｄｈＬ１アームが形成される。
ラクトコッカス・ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ）（配列番号：９４）由来のｉｌｖＤコード領域およびリボソーム結合配列（ＲＢＳ；配列番号：１２７）を含むＤＮＡ断片を、ｐＤＭ２０−ｉｌｖＤ（Ｌ．ラクティス（Ｌ．ｌａｃｔｉｓ））（配列番号：１２８）から増幅させた。ｐＤＭ２０−ｉｌｖＤ（Ｌ．ラクティス（Ｌ．ｌａｃｔｉｓ））の構築は、参照により本明細書に組み込まれる米国仮特許出願第６１／１００８０９号明細書に記載された。このプラスミドは、ＰＣＲによるＬ．ラクティス亜種ラクティス（Ｌ．ｌａｃｔｉｓ ｓｕｂｓｐ． ｌａｃｔｉｓ）ＮＣＤＯ２１１８（ＮＣＩＭＢ ７０２１１８）由来のｉｌｖＤコード領域［Ｇｏｄｏｎら、Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．、（１９９２年）、１７４巻：６５８０〜６５８９頁］および５”ＰＣＲプライマーにおいて追加されたリボソーム結合配列（配列番号：１１２７）を含むｐＤＭ２０である。ｐＤＭ２０は、ラクトバチルス・プランタルム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ）ＡＴＣＣ１４９１７プラスミドｐＬＦ１由来の最小ｐＬＦ１レプリコン（約０．７Ｋｂｐ）およびｐｅｍＫ−ｐｅｍＩ毒素−抗毒素（ＴＡ）、ｐＡＣＹＣ１８４由来のＰ１５Ａレプリコン、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）とＬ．プランタルム（Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ）の両方における選択用のクロラムフェニコール耐性マーカー、ならびにＰ３０合成プロモーターを含む改変されたｐＤＭ１（配列番号：１２９）である［Ｒｕｄら、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、（２００６年）１５２巻：１０１１〜１０１９頁］。マルチクローニング部位で置換された、ｌａｃＺ領域に及ぶヌクレオチド３２８１〜３６４６を欠失させることによって、ベクターｐＤＭ１を改変した。Ｐｈｕｓｉｏｎ Ｈｉｇｈ−Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘを用いて、ＸｈｏＩ部位を含むｏＢＰ１２０（配列番号：１１３０）、ならびにＤｒｄＩ、ＰｓｔＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ、およびＢａｍＨＩ部位を含むｏＢＰ１８２（配列番号：１３１）を使用して、ｐＤＭ１由来のＰ３０プロモーターを増幅させた。得られたＰＣＲ生成物およびｐＤＭ１ベクターをＸｈｏＩおよびＤｒｄＩで消化した。これによって、ｌａｃＺおよびＰ３０が脱落する。ＰＣＲ生成物とｐＤＭ１消化の大型断片を連結させて、ベクターｐＤＭ２０を生成した。ここでは、Ｐ３０プロモーターが再挿入され、ＸｈｏＩおよびＤｒｄＩ制限部位によって結合された。
Ｐｈｕｓｉｏｎ Ｈｉｇｈ−Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘを使用して、ｐＤＭ２０−ｉｌｖＤ（Ｌ．ラクティス（Ｌ．ｌａｃｔｉｓ））を鋳型として使用し、ＸｈｏＩ制限部位を含むプライマーｏＢＰ２４６（配列番号：１３３）およびＸｈｏＩ制限部位を含むプライマーｏＢＰ２３７（配列番号：１３４）を用いて、ｉｌｖＤコード領域およびＲＢＳを含むＤＮＡ断片（配列番号：１３２）をＰＣＲにより得た。ＸｈｏＩで消化した後、得られたＰＣＲ生成物とｐＦＰ９９６−ｌｄｈＬ１アームをＴ４ ＤＮＡリガーゼで連結させた。ベクター特異的プライマーｏＢＰ５７（配列番号：１２６）およびｉｌｖＤ特異的プライマーｏＢＰ２３７（配列番号：１３４）を使用して、クローンを、左ホモロジーアームにおけるｌｄｈＬ１プロモーター同じ配向のインサートについて、ＰＣＲによりスクリーニングした。正しく配向されたインサートを有するクローンをｐＦＰ９９６−ｌｄｈＬ１アーム−ｉｌｖＤＬｌと名付けた。
Ｌ．ラクティス（Ｌ．ｌａｃｔｉｓ）ｉｌｖＤード領域の組込みは、Ｌ．プランタルム（Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ）ＰＮ０５１２ΔｌｄｈＤΔｌｄｈＬ１をｐＦＰ９９６−ｌｄｈＬ１アーム−ｉｌｖＤＬｌで形質転換することによって得られた。０．５％グリシン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を含有するラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｉ）ＭＲＳ培地（Ａｃｃｕｍｅｄｉａ、Ｎｅｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｌａｎｓｉｎｇ、ＭＩ）５ｍｌに、ＰＮ０５１２ΔｌｄｈＤΔｌｄｈＬ１を播種し、３０℃で一晩増殖させた。０．５％グリシン含ＭＲＳ培地１００ｍｌに、一晩培養物を０．１のＯＤ６００まで播種し、３０℃で０．７のＯＤ６００まで増殖させた。細胞を、３７００ｘｇで８分間、４℃で収穫し、１ｍＭの冷ＭｇＣｌ２（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）１００ｍｌで洗浄し、３７００ｘｇで８分間、４℃で遠心し、冷３０％ＰＥＧ−１０００（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）１００ｍｌで洗浄し、３７００ｘｇで２０分間、４℃で再び遠心し、次いで１ｍｌの冷３０％ＰＥＧ−１０００に再懸濁した。６０μｌの細胞を、ギャップ１ｍｍの冷エレクトロポレーションキュベット中で、約１００ｎｇのプラスミドＤＮＡと混合し、ＢｉｏＲａｄ Ｇｅｎｅ Ｐｕｌｓｅｒ（Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）で １．７ｋＶ、２５μＦ、および４００Ωにおいて電気穿孔した。５００ｍＭ スクロース（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）および１００ｍＭ ＭｇＣｌ２を含有するＭＲＳ培地１ｍｌに、細胞を再懸濁し、３０℃で２時間インキュベートし、次いで２μｇ／ｍｌのエリスロマイシンを含有するＭＲＳ培地（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）に蒔いた。
ｉｌｖＤ特異的プライマーｏＢＰ２３７（配列番号：１３４）およびｏＢＰ２４６（配列番号：１３３）を使用して、形質転換体をＰＣＲによりスクリーニングした。形質転換体を、エリスロマイシン（１μｇ／ｍｌ）を含有するラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｉ）ＭＲＳ培地中、３０℃で約８世代、次いでラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｉ）ＭＲＳ培地中、一連の播種により３７℃で、約４０世代増殖させた。培養物を、エリスロマイシン（０．５μｇ／ｍｌ）を含有するラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｉ）ＭＲＳ培地上に蒔いた。単離物を、染色体特異的プライマーｏＢＰ４９（配列番号：１２３）およびプラスミド特異的プライマーｏＢＰ４２（配列番号：１２４）を使用して、コロニーＰＣＲにより、シングルクロスオーバーについてスクリーニングした。
シングルクロスオーバー組込み体を、ラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｉ）ＭＲＳ培地中、一連の播種により３７℃で約４３世代増殖させた。培養物をＭＲＳ培地上に蒔いた。コロニーをＭＲＳプレートにパッチし、３７℃で増殖させた。次いで、単離物を、エリスロマイシン（０．５μｇ／ｍｌ）を含有するＭＲＳ培地上にパッチした。エリスロマイシン感受性単離物を、染色体特異的プライマーｏＢＰ４９（配列番号：１２３）およびｏＢＰ５６（配列番号：１２５）を使用して、（コロニー）ＰＣＲにより、野生型または組込み第２クロスオーバーの有無についてスクリーニングした。野生型配列は、２６００ｂｐの生成物をもたらし、組込み配列は、４３００ｂｐの生成物をもたらした。組込み体は、ＰＣＲ生成物を配列決定することによって確認し、同定された組込み株を、ＰＮ０５１２ΔｌｄｈＤΔｌｄｈＬ１：：ｉｌｖＤＬｌ＋と称した。
実施例２
ｓｕｆオペロンプロモーター組込み型ベクターおよびＰＮ０５１２ΔｌｄｈＤΔｌｄｈＬ１：：ｉｌｖＤＬｌ＋ｓｕｆ：：Ｐ５Ｐ４＋組込み株の構築
この実施例は、Ｌ．プランタルム（Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ）ＰＮ０５１２ΔｌｄｈＤΔｌｄｈＬ１：：ｉｌｖＤＬｌ＋の染色体への２つのプロモーターの組込みを説明する。プロモーターをｓｕｆオペロンの上流に組み込んだ。ｓｕｆオペロンの遺伝子産物は、Ｆｅ−Ｓクラスターアセンブリを担うものである。プロモーター組込みによって、内因性Ｆｅ−Ｓクラスターマシナリーの発現が増大した株になる。
上述されたように、シャトルベクターｐＦＰ９９６（配列番号：１１０）を使用して、ｓｕｆオペロン染色体プロモーター組込み体が、２段階相同組換え手順で構築されて、無マーカー組込み体が得られた。
ｓｕｆオペロンプロモーター組込み型ベクターを３段階で構築した。第１のステップにおいて、ｓｕｆオペロンの５’部分（ｓｕｆＣおよびｓｕｆＤの一部分）を含む右ホモロジーアーム断片をｐＦＰ９９６にクローニングした。第２のステップにおいて、合成プロモーターであるＰ５およびＰ４［Ｒｕｄら、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、（２００６年）、１５２巻：１０１１頁］を、右アームの上流に位置するｐＦＰ９９６−右アームクローンにクローニングした。最終のステップにおいて、ネイティブｓｕｆプロモーターおよび上流の配列を含んでｆｅｏＢＡオペロンになる左ホモロジーアーム断片を、Ｐ５Ｐ４プロモーターの上流に位置するｐＦＰ９９６−Ｐ５Ｐ４−右アームクローンにクローニングした。
右ホモロジーアームＤＮＡ断片（配列番号：１３５）は、Ｐｈｕｓｉｏｎ Ｈｉｇｈ−Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘを使用して、ＸｍａＩ制限部位を含むプライマーＡＡ１９９（配列番号：１３６）およびＫｐｎＩ制限部位を含むプライマーＡＡ２００（配列番号：１３７）を用いて、Ｌ．プランタルム（Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ）ＰＮ０５１２ゲノムＤＮＡからＰＣＲ増幅させた。ＸｍａＩおよびＫｐｎＩで消化した後、右ホモロジーアーム ＰＣＲ断片とｐＦＰ９９６をＴ４ ＤＮＡリガーゼで連結させて、ｐＦＰ９９６−ｓｕｆＣＤが形成された。２つの部分相補的プライマー配列を用いて、ＰＣＲを行うことによって、プロモーターであるＰ５およびＰ４を含むＤＮＡ断片を生成した。ＸｈｏＩ部位、Ｐ５プロモーター配列、およびＰ４プロモーター配列の一部分を含むプライマーＡＡ２０３（配列番号：１３８）を、ＸｍａＩ部位およびＰ４プロモーター配列を含むプライマーＡＡ２０４（配列番号：１３９）と組み合わせ、Ｐｈｕｓｉｏｎ Ｈｉｇｈ−Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘを用いて、ＰＣＲを行った。次いで、Ｐｈｕｓｉｏｎ Ｈｉｇｈ−Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘを用いて、得られたＰＣＲ生成物をプライマーＡＡ２０６（配列番号：１４０）およびプライマーＡＡ２０７（配列番号：１４１）で増幅させた。ＸｈｏＩおよびＸｍａＩで消化した後、Ｐ５Ｐ４ ＰＣＲ生成物とｐＦＰ９９６−ｓｕｆＣＤを連結させて、ｐＦＰ９９６−Ｐ５Ｐ４−ｓｕｆＣＤが形成された。左ホモロジーアームＤＮＡ断片（配列番号：１４２）は、Ｐｈｕｓｉｏｎ Ｈｉｇｈ−Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘを使用して、ＥｃｏＲＩ制限部位を含むプライマーＡＡ２０１（配列番号：１４３）およびＸｈｏＩ制限部位を含むプライマーＡＡ２０２（配列番号：１４４）を用いて、Ｌ．プランタルム（Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ）ＰＮ０５１２ゲノムＤＮＡから増幅させた。ＥｃｏＲＩおよびＸｈｏＩで消化した後、左ホモロジーアームとｐＦＰ９９６−Ｐ５Ｐ４−ｓｕｆＣＤ をＴ４ ＤＮＡリガーゼで連結させて、ｐＦＰ９９６−ｆｅｏＢＡ−Ｐ５Ｐ４−ｓｕｆＣＤが形成された。ベクターは配列決定によって確認された。ベクターは、５つの塩基対欠失（ＴＴＧＴＴ）を有し、上流Ｐ５プロモーターにおいて−３５の６量体の一部分を包含するものであった。
上述されたように、ｓｕｆオペロンの上流への合成プロモーター（Ｐ５Ｐ４）の組込み体は、Ｌ．プランタルム（Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ）ＰＮ０５１２ΔｌｄｈＤΔｌｄｈＬ１：：ｉｌｖＤＬｌ＋をｐＦＰ９９６−ｆｅｏＢＡ−Ｐ５Ｐ４−ｓｕｆＣＤで形質転換することによって得られた。形質転換体を、エリスロマイシン（２μｇ／ｍｌ）を含有するラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｉ）ＭＲＳ培地中、３０℃で約２０世代増殖させた。培養物を、エリスロマイシン（０．５μｇ／ｍｌ）を含有するラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｉ）ＭＲＳ培地上に蒔いた。単離物を、染色体特異的プライマーＡＡ２０９（配列番号：１４５）およびプラスミド特異的プライマーＡＡ２１０（配列番号：１４６）を用いて、コロニーＰＣＲにより、シングルクロスオーバーについてスクリーニングした。シングルクロスオーバー組込み体を、ラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｉ）ＭＲＳ培地中、一連の播種により３７℃で約３０世代増殖させた。培養物をＭＲＳ培地上に蒔いた。単離物を、エリスロマイシン感受性についてスクリーニングした。単離物を、Ｐ５特異的プライマーＡＡ２１１（配列番号：１４７）および染色体特異的プライマーｏＢＰ１２６（配列番号：１４８）を使用して、（コロニー）ＰＣＲにより、野生型または組込み第２クロスオーバーの有無についてスクリーニングした。同定された組込み株を、ＰＮ０５１２ΔｌｄｈＤΔｌｄｈＬ１：：ｉｌｖＤＬｌ＋ｓｕｆ：：Ｐ５Ｐ４＋と称した。
実施例３
Ｔｎ５−トランスポゾンベクター（ｐＴＮ６）の構築およびＰｇｒｏＥ−ｋｉｖＤ（ｏ）−ｓａｄＢ（ｏ）カセットの組込みのためのその使用
Ｔｎ５は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）において特徴が十分に明らかにされている細菌トランスポゾンである（Ｊｏｈｎｓｏｎ ＆ Ｒｅｚｎｉｋｏｆｆ、Ｎａｔｕｒｅ、（１９８３年）３０４巻：２８０〜２８２頁）。乳酸菌（ＬＡＢ）のＴｎ５によって媒介される転移系が、参照により本明細書に組み込まれる米国仮特許出願第６１／２４６７１７号明細書に記載された。この実施例では、ＬＡＢの染色体へのランダム遺伝子組込みの送達系としてのＴｎ５−トランスポゾンベクターの使用が、開発された。開発されたＴｎ５−トランスポゾンベクター（ｐＴＮ６）（配列番号：１４９）は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）−Ｌ．プランタルム（Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ）シャトルベクターである。プラスミドｐＴＮ６は、トランスポザーゼ遺伝子（ｔｎｐ）、トランスポザーゼ認識ヌクレオチド 配列Ｔｎ５ＩＥ（１９塩基対内側端部）およびＴｎ５ＯＥ（１９塩基対外側端部）、２つの抗生物質耐性マーカー；一方は、クロラムフェニコール耐性のもの、他方は、エリスロマイシン耐性のもの、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のＰ１５Ａ複製開始点、温度感受性であるＬ．プランタルム（Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ）のｐＥ１９４複製開始点（ＨｏｒｉｎｏｕｃｈｉおよびＷｅｉｓｂｌｕｍ、Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．、（１９８２年）、１５０巻：８０４〜８１４頁）、ならびに２つのｌｏｘＰヌクレオチド配列（３４塩基対）を含む。クロラムフェニコール耐性遺伝子は、Ｃｒｅリコンビナーゼによるその後の切除のためのｌｏｘＰ部位によってフランキングされている。ＢａｍＨＩ、ＮｏｔＩ、ＳｃａＩ、およびＳｐｅＩのための制限部位を含む複数のクローニング部位（ＭＳＣ）は、ｌｏｘＰ部位とＴｎ５ＯＥ部位の間に位置する。クロラムフェニコール耐性遺伝子、２つのｌｏｘＰ部位、およびＭＣＳは、Ｔｎ５ＩＥとＴｎ５ＯＥによってフランキングされている。
Ｔｎ５−トランスポゾンベクターｐＴＮ６を構築するために、第１に、Ｔｎ５ＩＥ、ｌｏｘＰ、クロラムフェニコール耐性遺伝子（ｃｍ）、およびｌｏｘＰを含む１，０４８ｂｐのＴｎ５ＩＥ−ｌｏｘＰ−ｃｍ−ｌｏｘＰカセットが、Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ Ｃｏｒｐ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）によって合成された（配列番号：１５０）。Ｔｎ５ＩＥ−ｌｏｘＰ−ｃｍ−Ｐｓｐａｃ−ｌｏｘＰカセットを、ｐＵＣ５７ベクター（Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ Ｃｏｒｐ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）でクローニングし、プラスミドｐＵＣ５７−Ｔｎ５ＩＥ−ｌｏｘＰ−ｃｍ−ｌｏｘＰを生成した。クロラムフェニコール耐性遺伝子は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）とＬ．プランタルム（Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ）の両方における選択のためにｓｐａｃプロモーターの制御下に発現される（Ｙａｎｓｕｒａ ＆ Ｈｅｎｎｅｒ、（１９８４年）、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．、８１巻：４３９〜４４３頁）。プラスミドｐＵＣ５７−Ｔｎ５ＩＥ−ｌｏｘＰ−ｃｍ−ｌｏｘＰをＮｓｉｌおよびＳａｃＩで消化し、１，０４４ｂｐのＴｎ５ＩＥ−ｌｏｘＰ−ｃｍ−ｌｏｘＰ断片をゲル精製した。プラスミドｐＦＰ９９６（配列番号：１１０）をＮｓｉＩおよびＳａｃＩで消化し、ｐＢＲ３２２およびｐＥ１９４の複製開始点を含む４，４１７ｂｐのｐＦＰ９９６断片をゲル精製した。Ｔｎ５ＩＥ−ｌｏｘＰ−ｃｍ−ｌｏｘＰ断片と４，４１７ｂｐのｐＦＰ９９６断片を連結させて、ｐＴｎＣｍが形成された。
第２に、ｐＴｎＣｍ上のｐＢＲ３２２複製開始点をＰ１５Ａ複製開始点で置換した。プラスミドｐＴｎＣｍをＡａｔＩＩおよびＳａｌＩで消化し、ｐＥ１９４複製開始点およびＴｎ５ＩＥ−ｌｏｘＰ−ｃｍ−ｌｏｘＰカセットを含む２，５２４ｂｐのｐＴｎＣｍ断片をゲル精製した。Ｐｈｕｓｉｏｎ Ｈｉｇｈ−Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）を使用することによって、ＳａｌＩ制限部位および１９ｂｐＴｎ５ＯＥヌクレオチド配列を含むプライマーＴ−Ｐ１５Ａ（ＳａｌＩＴｎ５ＯＥ）（配列番号：１５１）およびＡａｔＩＩ制限部位を含むプライマーＢ−Ｐ１５Ａ（ＡａｔＩＩ）（配列番号：１５２）を用いて、９１３ｂｐのｐ１５Ａ複製開始点を、ｐＡＣＹＣ１８４ ［ＣｈａｎｇおよびＣｏｈｅｎ、Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．、（１９７８年）１３４巻：１１４１〜１１５６頁］からＰＣＲ増幅させた。Ｐ１５Ａ断片は、ＳａｌＩおよびＡａｔＩＩ制限酵素で消化した後、２，５２４ｂｐのｐＴｎＣｍ断片と連結させて、ｐＴＮ５が形成された。
第３に、エリスロマイシン耐性遺伝子（ｅｒｍ）を、ｐＴＮ５上のＨｉｎｄＩＩＩ部位にクローニングした。Ｐｈｕｓｉｏｎ Ｈｉｇｈ−Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘを使用することによって、ＮｓｉＩ制限部位を含むプライマーＴ−ｅｒｍ（ＨｉｎｄＩＩＩ）（配列番号：１５３）およびＮｓｉＩ制限部位を含むプライマーＢ−ｅｒｍ（ＨｉｎｄＩＩＩ）（配列番号：１５４）を用いて、１，１３２ｂｐのエリスロマイシン耐性遺伝子（ｅｒｍ）ＤＮＡ断片を、ベクターｐＦＰ９９６（配列番号：１１０）からＰＣＲ増幅により生成し、ｐＴＮ５上のＨｉｎｄＩＩＩ制限部位にクローニングして、ｐＴＮ５−ｅｒｍが生成された。
最後に、トランスポザーゼをコードするｔｎｐ遺伝子配列を、ＳＯＥ（オーバーラップ伸長によるスプライシング）ＰＣＲにより、ｎｐｒ（バチルス・アミロリクエファシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）由来の中性プロテアーゼ）プロモーター［Ｎａｇａｒａｊａｎら、Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、（１９８４年）、１５９巻：８１１〜８１９頁］に融合し、ｐＴＮ５−ｅｒｍ上のＮｓｉＩ部位にクローニングした。Ｐｈｕｓｉｏｎ Ｈｉｇｈ−Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘを使用することによって、ＮｓｉＩ制限部位を含むＴ−Ｐｎｐｒ（ＮｓｉＩ）（配列番号：１５６）および１７ｂｐの重なり配列を含む Ｂ−Ｐｎｐｒ（ｔｎｐ）（配列番号：１５７）のプライマーセットを用いて、Ｐｎｐｒプロモーター（配列番号：１５５）を含むＤＮＡ断片を、ｐＢＥ８３から ［Ｎａｇａｒａｊａｎら、Ａｐｐｌ Ｅｎｖｉｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、（１９９３年）、５９巻：３８９４〜３８９８頁］からＰＣＲ増幅させた。Ｐｈｕｓｉｏｎ Ｈｉｇｈ−Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘを使用することによって、２１ｂｐの重なり配列を含むＴ−ｔｎｐ（Ｐｎｐｒ）（配列番号：１１５８）およびＮｓｉＩ制限部位を含むＢ−ｔｎｐ（ＮｓｉＩ）（配列番号：１５９）のプライマーセットを用いて、ｔｎｐコード領域（配列番号：１０８）を、ｐＵＴｍＴｎ５−（Ｓｈａｒｐｅら、Ａｐｐｌ Ｅｎｖｉｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、（２００７年）、７３巻：１７２１〜１７２８頁）からＰＣＲ増幅させた。２つの反応のＰＣＲ生成物を混合し、外側プライマー（Ｔ−Ｐｎｐｒ（ＮｓｉＩ）およびＢ−ｔｎｐ（ＮｓｉＩ））を使用して増幅させると、Ｐｎｐｒ−ｔｎｐ融合ＤＮＡ断片（配列番号：１６０）が生成した。プラスミドｐＴＮ５−ｅｒｍをＮｓｉＩで消化し、仔ウシ小腸由来ホスファターゼ（Ｃａｌｆ Ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ）（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，ＭＡ）で処理して、自己連結を防止した。消化されたｐＴＮ５−ｅｒｍベクターとＮｓｉＩで消化させたＰｎｐｒ−ｔｎｐ断片を連結させた。連結混合物を、電気穿孔で大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｔｏｐ１０細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ、Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）に形質転換した。形質転換体を、３７℃で２５μｇ／ｍＬのクロラムフェニコールを含有するＬＢプレート上で選択した。次いで、Ｐｎｐｒ−ｔｎｐカセットの外側プライマーを用いて、形質転換体をコロニーＰＣＲによりスクリーニングし、プライマーｐＴｎＣｍ（７１１）（配列番号：１６１）、ｐＴｎＣｍ（１４２２）（配列番号：１６２）、およびｐＴｎＣｍ（３０２５）（配列番号：１６３）を用いてＤＮＡ配列決定により確認した。得られたプラスミドをｐＴＮ６と名付けた。
このＴｎ５−トランスポゾンベクターｐＴＮ６を、ＰＮ０５１２ΔｌｄｈＤΔｌｄｈＬ１：：ｉｌｖＤＬｌ＋ｓｕｆ：：Ｐ５Ｐ４＋株の染色体へのＰｇｒｏＥ−ｋｉｖＤ（ｏ）−ｓａｄＢ（ｏ）カセットの組込みのためのランダム遺伝子送達系として使用した。Ｐｈｕｓｉｏｎ Ｈｉｇｈ−Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘを使用することによって、ＳａｌＩおよびＫｐｎＩ制限部位を含むＴ−ｇｒｏＥ（ＳａｌＩＫｐｎＩ）（配列番号：１６５）およびＢａｍＨＩ制限部位を含むＢ−ｇｒｏＥ（ＢａｍＨＩ）（配列番号：１６６）のプライマーセットを用いて、ＰｇｒｏＥプロモーターを含むＤＮＡ断片（ＹｕａｎおよびＷｏｎｇ、Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、（１９９５年）１７７巻：５４２７〜５４３３頁）（配列番号：１６４）を、バチルス・サブティリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）のゲノムＤＮＡからＰＣＲ増幅させた。得られた１５４ｂｐのＰｇｒｏＥプロモーター断片は、ＳａｌＩおよびＢａｍＨＩ制限酵素で消化した後、プラスミドｐＴＮ６のＳａｌＩおよびＢａｍＨＩ部位にクローニングし、ｐＴＮ６−ＰｇｒｏＥが形成された。ラクトコッカス・ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ）由来の分枝鎖ケトール酸デカルボキシラーゼをコードするｋｉｖＤ遺伝子のコード領域は、Ｌ．プランタルム（Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ）における発現に最適化されたコドンであった。ＲＢＳを含むｋｉｖＤ（ｏ）と呼ばれる最適化されたコード領域配列（配列番号：９０）は、Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ Ｃｏｒｐ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）によって合成された。ＲＢＳを一緒に含むｋｉｖＤ（ｏ）コード領域（配列番号：１６７）を、ｐＵＣ５７ベクターでクローニングして、プラスミドｐＵＣ５７−ｋｉｖＤ（ｏ）が生成された。プラスミドｐＵＣ５７−ｋｉｖＤ（ｏ）をＢａｍＨＩおよびＮｏｔＩで消化し、１，６４７ｂｐのＲＢＳ−ｋｉｖＤ（ｏ）断片をゲル精製した。ＲＢＳ−ｋｉｖＤ（ｏ）断片を、ｐＴＮ６−ＰｇｒｏＥ上のＢａｍＨＩおよびＮｏｔＩ制限部位にクローニングして、ｐＴＮ６−ＰｇｒｏＥ−ｋｉｖＤ（ｏ）が生成された。プライマーＴ−ｇｒｏＥ（ＳａｌＩＫｐｎＩ）およびｋｉｖＤ（ｏ）Ｒ（配列番号：１６５および１６８）を用いて、正確なクローンをコロニーＰＣＲにより確認し、予想されたサイズの１，８２２ｂｐの断片が生成された。次いで、米国特許出願第１２／４３０３５６号明細書に記載されていた、アクロモバクター・キシロソキシダンス（Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ ｘｙｌｏｓｏｘｉｄａｎｓ）由来の分枝鎖アルコールデヒドロゲナーゼのｓａｄＢ遺伝子コード領域を、ｐＴＮ６−ＰｇｒｏＥ−ｋｉｖＤ（ｏ）のｋｉｖＤ（ｏ）コード領域の下流にクローニングした。Ａ． キシロソキシダンス（Ａ． ｘｙｌｏｓｏｘｉｄａｎｓ）ｓａｄＢコード領域は、Ｌ．プランタルム（Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ）における発現に最適化されたコドンであった。ＲＢＳを含むｓａｄＢ（ｏ）と呼ばれる新しいコード領域（配列番号：１０５）は、Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ Ｃｏｒｐ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）によって合成され、ｐＵＣ５７ベクターでクローニングされ、プラスミドｐＵＣ５７−ｓａｄＢ（ｏ）が生成された。Ｐｈｕｓｉｏｎ Ｈｉｇｈ−Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘを使用することによって、ＮｏｔＩ制限部位を含むＴ−ｓａｄＢ（ｏ）（ＮｏｔＩ）（配列番号：１７０）およびＮｏｔＩ制限部位を含むＢ−ｓａｄＢ（ｏ）（ＮｏｔＩ）（配列番号：１７１）のプライマーセットを用いて、ＲＢＳおよびｓａｄＢ（ｏ）コード領域を含む１，０８９ｂｐのＤＮＡ断片（配列番号：１６９）を、ｐＵＣ５７−ｓａｄＢ（ｏ）からＰＣＲ増幅させた。ＲＢＳ−ｓａｄＢ（ｏ）遺伝子断片は、ＮｏｔＩで消化した後、ｐＴＮ６−ＰｇｒｏＥ−ｋｉｖＤ（ｏ）のＮｏｔＩ制限部位にクローニングして、ｐＴＮ６−ＰｇｒｏＥ−ｋｉｖＤ（ｏ）−ｓａｄＢ（ｏ）が生成された。ｋｉｖＤ（ｏ）１５２９（配列番号：１７２）およびＢ−ｓｐａｃ（ｃｍ）（配列番号：１７３）プライマーを用いて、正確なクローンを、ＤＮＡ配列決定により確認した。この構築においては、ｓａｄＢ（ｏ）およびｋｉｖＤ（ｏ）コード領域が、ＰｇｒｏＥプロモーター由来のオペロンにおいて発現される。
一般方法に記載のように、得られたプラスミドｐＴＮ６−ＰｇｒｏＥ−ｋｉｖＤ（ｏ）−ｓａｄＢ（ｏ）を、電気穿孔によりＰＮ０５１２ΔｌｄｈＤΔｌｄｈＬ１：：ｉｌｖＤＬｌ＋ｓｕｆ：：Ｐ５Ｐ４＋に形質転換した。７．５μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールを補充したラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｉ）ＭＲＳ培地上で、形質転換体を選択した。クロラムフェニコール耐性コロニーを、７．５μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールを含有するラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｉ）ＭＲＳ培地中、許容温度３０℃で、約１０世代増殖させた。培養物を、新鮮なＭＲＳ培地中、１／１００の希釈で播種し、ラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｉ）ＭＲＳ培地中、一連の播種により３７℃で約２０世代増殖させた。培養物を、７．５μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールを含有するラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｉ）ＭＲＳ上に蒔いた。単離物を、１．５μｇ／ｍｌのエリスロマイシンを含有するラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｉ）ＭＲＳプレート上のコロニーを再び画線することにより、トランスポゾンに沿って染色体に組み込まれたＰｇｒｏＥ−ｋｉｖＤ（ｏ）−ｓａｄＢ（ｏ）カセットを含むと推定されたエリスロマイシン感受性コロニーについてスクリーニングした。ｋｉｖＤ（ｏ）配列特異的プライマーＫｉｖＤ（ｏ）１５２９およびｓａｄＢ（ｏ）配列特異的プライマーＢ−ｓａｄＢ（ｏ）（ＮｏｔＩ）を用いて、コロニーＰＣＲにより、トランスポゾンによって媒介された組込み体は、予想されたサイズのＰＣＲ生成物（１，２２０ｂｐ）を生成したことが確認された。
染色体に由来するｌｏｘＰ部位によってフランキングされているクロラムフェニコール耐性マーカーを切除するために、Ｃｒｅリコンビナーゼを発現するヘルパープラスミドｐＦＰ３５２（配列番号：１７４）を、一般方法に記載されたプロトコルに従って、トランスポゾンによって媒介された組込み体に形質転換し、１．５μｇ／ｍｌのエリスロマイシンを含有するラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）ＭＲＳプレート上、３０℃で増殖させた。Ｃｒｅリコンビナーゼは、ｌｏｘＰ部位間での組換えによってクロラムフェニコールマーカーを染色体から切除する。エリスロマイシン耐性形質転換体をＭＲＳ培地に播種し、３７℃で約１０世代増殖させた。培養物を、抗生物質を含まないラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｉ）ＭＲＳ上に蒔き、３０℃で増殖させた。単離物を、１．５μｇ／ｍｌのエリスロマイシンを含有するラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｉ）ＭＲＳプレートとクロラムフェニコール（７．５μｇ／ｍｌ）を含有するラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｉ）ＭＲＳプレートで別々に、コロニーの増殖を試験して、ｐＦＰ３５２の損失およびクロラムフェニコールマーカーの除去を評価することによって、エリスロマイシンとクロラムフェニコールの両方の感受性コロニーについてスクリーニングした。最後に、プライマーＢ−ｇｒｏＥ（ＢａｍＨＩ）を用いて、ゲノムＤＮＡ配列決定により、組込み体を確認した。ＭａｓｔｅｒＰｕｒｅ ＤＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ（登録商標）キット（Ｅｎｐｉｃｅｎｔｒｅ、Ｉｎｃ．、Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を使用して、ゲノムＤＮＡを調製した。ＤＮＡ配列決定の結果によって、ＰｇｒｏＥ−ｋｉｖＤ（ｏ）−ｓａｄＢ（ｏ）カセットを、１，４−α−Ｄ−グルカン鎖のセグメントから同様のグルカン鎖における第一級ヒドロキシ基への移動を触媒するグリコーゲン分枝酵素をコードするｇｌｇＢ遺伝子のコード領域内に挿入したことが示された。得られた組込み体は、ＰＮ０５１２ΔＩｄｈＤΔｌｄｈＬ１：：ｉｌｖＤ（Ｌｌ）ｓｕｆ：：Ｐ５Ｐ４＋ ｇｌｇＢ：：Ｔｎ５−ＰｇｒｏＥ−ｋｉｖＤ（ｏ）−ｓａｄＢ（ｏ）と名付けた。
実施例４
ｐＤＭ５−ＰｌｄｈＬ１−ｉｌｖＣ（Ｌ．ラクティス（Ｌ．ｌａｃｔｉｓ））ベクターの構築
本実施例の目的は、ラクトコッカス・ラクティス亜種ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ ｓｕｂｓｐ． ｌａｃｔｉｓ）ＮＣＤＯ２１１８（ＮＣＩＭＢ ７０２１１８）［Ｇｏｄｏｎら、Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．、（１９９２年）１７４巻：６５８０〜６５８９頁］由来のケトール酸レダクトイソメラーゼのｉｌｖＣコード領域（配列番号：６７）のｐＤＭ５ベクターへのクローニングを説明することである。
ｐＤＭ１のＰ３０プロモーターを、ｌａｃＯオペレーター配列およびｌａｃＩ リプレッサー遺伝子に融合させたＢ．サブティリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ｇｒｏＥプロモーター（ＰｇｒｏＥ）で置換することによって、プラスミドｐＤＭ５（配列番号：１７５）を構築した。プラスミドｐＤＭ１は実施例１に記載されている。プラスミドｐＨＴＯ１（Ｍｏ Ｂｉ Ｔｅｃ、Ｇｏｅｔｔｉｎｇｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）をＳａｃＩで消化し、Ｋｌｅｎｏｗ断片で処理して、平滑末端を作製し、ＢａｍＨＩで消化し、次いで１，５４８ｂｐのｌａｃＩ−ＰｇｒｏＥ／ｌａｃＯ断片（配列番号：１７６）をゲル精製した。ｌａｃＩ−ＰｇｒｏＥ／ｌａｃＯ断片を、Ｐ３０プロモーターの代わりにｐＤＭ１のＫｐｎＩ部位（Ｋｌｅｎｏｗ断片による平滑末端化）およびＢａｍＨＩ部位にクローニングして、ｐＤＭ５が形成された。
ｌｄｈＬ１（ラクトバチルス・プランタルム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ）ＰＮ０５１２由来のＬ−乳酸デヒドロゲナーゼ）プロモーター（ＰｌｄｈＬ１）およびラクトコッカス・ラクティス亜種ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ ｓｕｂｓｐ． ｌａｃｔｉｓ）ＮＣＤＯ２１１８由来のｉｌｖＣコード領域を含むＤＮＡ断片ＰｌｄｈＬ１−ｉｌｖＣ（Ｌ．ラクティス（Ｌ．ｌａｃｔｉｓ））を、ＳＯＥ（オーバーラップ伸長によるスプライシング）ＰＣＲにより生成した。Ｐｈｕｓｉｏｎ Ｈｉｇｈ−Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘを使用することによって、ＮｏｔＩ制限部位を含むＴ−ｌｄｈＬ１（ＮｏｔＩ）（配列番号：１７７）および１９ｂｐの重なり配列を含むＢ−ｌｄｈＬＩ（ＣＬＩ）（配列番号：１７８）のプライマーセットを用いて、ＰｌｄｈＬ１プロモーターを含むＤＮＡ断片を、ラクトバチルス・プランタルム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ）ＰＮ０５１２のゲノムＤＮＡからＰＣＲ増幅させた。Ｐｈｕｓｉｏｎ Ｈｉｇｈ−Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘを使用することによって、１７ｂｐの重なり配列を含むＴ−ＣＬＩ（ｌｄｈ）（配列番号：１７９）およびＰｖｕＩ制限部位を含むＢ−ＣＬＩ（ＰｖｕＩ）（配列番号：１８０）のプライマーセットを用いて、ｉｌｖＣコード領域を、ラクトコッカス・ラクティス亜種ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ ｓｕｂｓｐ． ｌａｃｔｉｓ）ＮＣＤＯ２１１８のゲノムＤＮＡからＰＣＲ増幅させた。２つの断片のＰＣＲ生成物を混合し、外側プライマーＴ−ｌｄｈＬ１（ＮｏｔＩ）およびＢ−ＣＬＩ（ＰｖｕＩ）を使用して増幅させて、ＰｌｄｈＬ１−ｉｌｖＣ（Ｌ．ラクティス（Ｌ．ｌａｃｔｉｓ））融合ＤＮＡ断片が生成された。プラスミドｐＤＭ５をＮｏｔＩおよびＰｖｕＩ制限酵素で消化し、ＮｏｔＩおよびＰｖｕＩ制限酵素で消化した後、ＰｌｄｈＬ１−ｉｌｖＣ（Ｌ．ラクティス（Ｌ．ｌａｃｔｉｓ））カセットと連結させた。連結混合物を、電気穿孔で大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｔｏｐ１０細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ、Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）に形質転換した。形質転換体を、３７℃で２５μｇ／ｍＬのクロラムフェニコールを含有するＬＢプレート上で選択した。次いで、ＰｌｄｈＬ１−ｉｌｖＣ（Ｌ．ラクティス（Ｌ．ｌａｃｔｉｓ））カセットの外側プライマーを用いて、形質転換体をコロニーＰＣＲによりスクリーニングし、Ｔ−ｌｄｈＬ１（ＮｏｔＩ）（配列番号：１７７）およびｐＤＭ（Ｒ）ｎｅｗ（配列番号：１８１）を用いてＤＮＡ配列決定により確認した。得られたプラスミドは、ｐＤＭ５−ＰｌｄｈＬ１−ｉｌｖＣ（Ｌ．ラクティス（Ｌ．ｌａｃｔｉｓ））（配列番号：１８２）と名付けた。
実施例５
ｐＤＭ５−ＰｌｄｈＬ１−ｉｌｖＣ（Ｐ．フルオレッセンス（Ｐ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）５）ベクターの構築
本実施例の目的は、シュードモナス・フルオレッセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）ＰＦ５由来のケトール酸レダクトイソメラーゼのｉｌｖＣコード領域の発現ベクターへのクローニングを説明することである。
Ｐ．フルオレッセンス（Ｐ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）ＰＦ５ ｉｌｖＣコード領域は、主要な宿主としてラクトバチルス・プランタルム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ）における発現に最適化されたコドンであった。ＲＢＳを一緒に含むｉｌｖＣ（Ｐ．フルオレッセンス（Ｐ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）ＰＦ５）またはｉｌｖＣ（Ｐｆ５）と呼ばれるこの最適化されたコード領域（配列番号：１８３）は、Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ Ｃｏｒｐ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）によって合成された。コード領域ｉｌｖＣ（Ｐ．フルオレッセンス（Ｐ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）ＰＦ５）およびＲＢＳ断片を、ｐＵＣ５７ベクターでクローニングし、プラスミドｐＵＣ５７−ｉｌｖＣ（Ｐ．フルオレッセンス（Ｐ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）ＰＦ５）を生成し、次いでＸｈｏＩ−ＫｐｎＩ断片であるｐＦＰ９９６−ＰｌｄｈＬ１（配列番号：１８４）にサブクローニングして、ｐＦＰ９９６−ＰｌｄｈＬ１−ｉｌｖＣ（Ｐ．フルオレッセンス（Ｐ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）ＰＦ５）が形成された。ｐＦＰ９９６−ＰｌｄｈＬ１は、実施例４に記載されたＰｌｄｈＬ１ ＤＮＡ断片を含む。ラクトバチルス・プランタルム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ）ＰＮ０５１２）プロモーター（ＰｌｄｈＬ１）由来のｌｄｈＬ１（Ｌ−乳酸デヒドロゲナーゼおよびシュードモナス・フルオレッセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）ＰＦ５由来のｉｌｖＣコード領域を含むＰｌｄｈＬ１−ｉｌｖＣ（Ｐ．フルオレッセンス（Ｐ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）ＰＦ５）ＤＮＡ断片（配列番号：１８５）は、ＮｏｔＩ制限部位を含むＴ−ｌｄｈＬ１（ＮｏｔＩ）（配列番号：１８６）およびＥｃｏＲＶ制限部位を含むＢ−ＣＰｆ（ｏ）（ＥｃｏＲＶ）（配列番号：１８７）のプライマーセットを用いて、ｐＦＰ９９６−ＰｌｄｈＬ１−ｉｌｖＣ（Ｐ．フルオレッセンス（Ｐ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）ＰＦ５）からＰＣＲにより生成した。１，２９７ｂｐのＰｌｄｈＬ１−ｉｌｖＣ（Ｐ．フルオレッセンス（Ｐ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）ＰＦ５）断片をＮｏｔＩおよびＥｃｏＲＶで消化し、ｐＤＭ１−ｉｌｖＤ（Ｌ．ラクティス（Ｌ．ｌａｃｔｉｓ））のＮｏｔＩ部位およびＰｖｕＩＩ部位に連結させて、ｐＤＭ１−ｉｌｖＤ（Ｌ．ラクティス（Ｌ．ｌａｃｔｉｓ））−ＰｌｄｈＬ１−ｉｌｖＣ（Ｐ．フルオレッセンス（Ｐ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）ＰＦ５）を生成した。ｐＤＭ１−ｉｌｖＤ（Ｌ．ラクティス（Ｌ．ｌａｃｔｉｓ））の構築は、米国仮特許出願第６１／１００８１０号明細書の実施例１に以下の通り記載されている。
プライマー３Ｔ−ｉｌｖＤＬＩ（ＢａｍＨＩ）（配列番号：１８８）および５Ｂ−ｉｌｖＤＬＩ（ＮｏｔＩ）（配列番号：１８９）を用いて、ラクトコッカス・ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ）ｉｌｖＤコード領域（配列番号：９４）を、ラクトコッカス・ラクティス亜種ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ ｓｕｂｓｐ． ｌａｃｔｉｓ）ＮＣＤＯ２１１８ゲノムＤＮＡからＰＣＲ増幅させた。Ｐｕｒｅｇｅｎｅ Ｇｅｎｔｒａ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ；Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）を用いて、Ｌ．ラクティス亜種ラクティス（Ｌ．ｌａｃｔｉｓ ｓｕｂｓｐ． ｌａｃｔｉｓ）ＮＣＤＯ２１１８ゲノムＤＮＡを調製した。１．７ＫｂｐのＬ．ラクティス（Ｌ．ｌａｃｔｉｓ）ｉｌｖＤ ＰＣＲ生成物（ｉｌｖＤＬＩ）をＮｏｔＩで消化し、ＤＮＡポリメラーゼのＫｌｅｎｏｗ断片で処理して、平滑末端を作製した。得られたＬ．ラクティス（Ｌ．ｌａｃｔｉｓ）ｉｌｖＤコード領域断片をＢａｍＨＩで消化し、ＱＩＡＧＥＮゲル抽出キット（ＱＩＡＧＥＮ）を使用して、ゲル精製した。プラスミドｐＤＭ１をＡｐａＬＩで消化し、ＤＮＡポリメラーゼのＫｌｅｎｏｗ断片で処理して、平滑末端を作製し、次いでＢａｍＨＩで消化した。ゲル精製したＬ．ラクティス（Ｌ．ｌａｃｔｉｓ）ｉｌｖＤコード領域断片を、プラスミドｐＤＭ１のＢａｍＨＩおよびＡｐａＬＩ（平滑）部位に連結した。連結混合物を、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｔｏｐ１０細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）に形質転換した。形質転換体を、選択のためにＬＢクロラムフェニコールプレート上に蒔いた。陽性クローンをＳａｌＩ消化によりスクリーニングし、予想されたサイズの５．３Ｋｂｐを有する１断片が得られた。陽性クローンを、ＤＮＡ配列決定によりさらに確認した。正確なクローンは、ｐＤＭ１−ｉｌｖＤ（Ｌ．ラクティス（Ｌ．ｌａｃｔｉｓ））と名付けた。これは、Ｐ３０から発現されたＬ．ラクティス（Ｌ．ｌａｃｔｉｓ）ｉｌｖＤコード領域を有するものである。
ｐＤＭ１−ｉｌｖＤ（Ｌ．ラクティス（Ｌ．ｌａｃｔｉｓ））−ＰｌｄｈＬ１−ｉｌｖＣ（Ｐ．フルオレッセンス（Ｐ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）ＰＦ５）のＰ３０プロモーターを、ｌａｃＯオペレーター配列およびｌａｃＩリプレッサー遺伝子に融合させたＢ．サブティリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ｇｒｏＥプロモーター（ＰｇｒｏＥ）で置換した。プラスミドｐＨＴＯ１（Ｍｏ Ｂｉ Ｔｅｃ、Ｇｏｅｔｔｉｎｇｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）をＳａｃＩで消化し、Ｋｌｅｎｏｗ断片で処理して、平滑末端を作製し、ＢａｍＨＩで消化し、次いで１，５４８ｂｐのｌａｃＩ−ＰｇｒｏＥ／ｌａｃＯ断片（配列番号：１７６）をゲル精製した。ｌａｃＩ−ＰｇｒｏＥ／ｌａｃＯ ＤＮＡ断片を、Ｐ３０プロモーターの代わりにｐＤＭ１−ｉｌｖＤ（Ｌ．ラクティス（Ｌ．ｌａｃｔｉｓ））−ＰｌｄｈＬ１−ｉｌｖＣ（Ｐ．フルオレッセンス（Ｐ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）ＰＦ５）のＫｐｎＩ部位（Ｋｌｅｎｏｗ断片による平滑末端）およびＢａｍＨＩ部位にクローニングして、ｐＤＭ５−ｉｌｖＤ（Ｌ．ラクティス（Ｌ．ｌａｃｔｉｓ））−ＰｌｄｈＬ１−ｉｌｖＣ（Ｐ．フルオレッセンス（Ｐ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）ＰＦ５）が生成された。
ｉｌｖＤ（Ｌ．ラクティス（Ｌ．ｌａｃｔｉｓ））断片を除去するために、ｐＤＭ５−ｉｌｖＤ（Ｌ．ラクティス（Ｌ．ｌａｃｔｉｓ））−ＰｌｄｈＬ１−ｉｌｖＣ（Ｐ．フルオレッセンス（Ｐ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）ＰＦ５）をＮｏｔＩおよびＢａｍＨＩで消化し、ＣＩＰで処理して、平滑末端を作製した。ｐＤＭ５主鎖、ｌｄｈＬ１プロモーター（ＰｌｄｈＬ１）、およびＰ．フルオレッセンス（Ｐ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）ＰＦ５ ｉｌｖＣコード領域を含む６，２０７ｂｐのＤＮＡ断片をゲル精製し、自己連結させ、ｐＤＭ５−ＰｌｄｈＬ１−ｉｌｖＣ（Ｐ．フルオレッセンス（Ｐ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）ＰＦ５）が生成された。
実施例６
ｐＤＭ５−ＰｌｄｈＬ１−ｉｌｖＣ（Ｓ．ミュータンス（Ｓ．ｍｕｔａｎｓ））、ｐＤＭ５−ＰｌｄｈＬ１−ｉｌｖＣ（Ｓ．サーモフィルス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ））、およびｐＤＭ５−ＰｌｄｈＬ１−ｉｌｖＣ（Ｌ．メセンテロイデス（Ｌ．ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ））ベクターの構築
本実施例の目的は、ケトール酸レダクトイソメラーゼ用のストレプトコッカス・ミュータンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｕｔａｎｓ）ＵＡ１５９ ｉｌｖＣコード領域（コード配列番号：２７；タンパク質配列番号：２８）、ケトール酸レダクトイソメラーゼ用のストレプトコッカス・サーモフィルス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）ＬＭＤ−９ ｉｌｖＣコード領域（（コード配列番号：５５；タンパク質配列番号：５６）、およびケトール酸レダクトイソメラーゼ用のロイコノストック・メセンテロイデス亜種メセンテロイデス（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ ｓｕｂｓｐ． ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ）ＡＴＣＣ８２９３ ｉｌｖＣコード領域（コード配列番号：３９；タンパク質配列番号：４０）の発現ベクターへのクローニングを説明することである。
Ｓ．ミュータンス（Ｓ．ｍｕｔａｎｓ）、Ｓ．サーモフィルス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、およびＬ．メセンテロイデス（Ｌ．ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ）ｉｌｖＣコード領域を、実施例４および５のＬ．ラクティス（Ｌ．ｌａｃｔｉｓ）およびＰ．フルオレッセンス（Ｐ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）ＰＦ５ ｉｌｖＣ遺伝子と同じプロモーターの制御下にクローンするために、まずベクターｐＤＭ５−ＰｌｄｈＬ１−ＭＣＳを構築した。Ｐｈｕｓｉｏｎ Ｈｉｇｈ−Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘを使用して、ＮｏｔＩ制限部位を含むプライマーＡＡ２３４（配列番号：１９０）、ならびにマルチクローニング部位（ＭＣＳ）用の複数の制限部位およびＤｒｄＩ制限部位を含むプライマーＡＡ１７９（配列番号：１９１）を用いて、Ｌ．プランタルム（Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ）ＰＮ０５１２ゲノムＤＮＡ由来のｌｄｈＬ１プロモーターを増幅させた。得られたＤＮＡ断片をＮｏｔＩおよびＤｒｄＩで消化した。ベクターｐＤＭ５−ＰｌｄｈＬ１−ｉｌｖＣ（Ｐ．フルオレッセンス（Ｐ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）Ｐｆ５）をＮｏｔＩおよびＤｒｄＩで消化し、より大型の断片（４７１２ｂｐ）をゲル精製して、ＰｌｄｈＬ１−ｉｌｖＣ（Ｐ．フルオレッセンス（Ｐ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）Ｐｆ５）配列を除去した。ゲル精製された断片と消化されたＰｌｄｈＬ１−ＭＣＳ ＰＣＲを連結させて、特異な制限部位ＫａｓＩ、ＰａｃＩ、ＡｖｒＩＩ、ＳａｃＩ、およびＰｍｅＩを有するベクターｐＤＭ５−ＰｌｄｈＬ１−ＭＣＳを作製した。ベクターはＰＣＲおよび配列決定によって確認された。
Ｐｈｕｓｉｏｎ Ｈｉｇｈ−Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘを使用して、ＡｖｒＩＩ制限部位およびリボソーム結合配列を含むプライマーＡＡ２３５（配列番号：１９２）、ならびにＳａｃＩ制限部位を含むプライマーＡＡ２３６（配列番号：１９３）を用いて、Ｓ．ミュータンス（Ｓ．ｍｕｔａｎｓ）ＵＡ１５９ゲノムＤＮＡ由来のストレプトコッカス・ミュータンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｕｔａｎｓ）ＵＡ１５９ ｉｌｖＣコード領域（配列番号：２７）を増幅させた。Ｐｈｕｓｉｏｎ Ｈｉｇｈ−Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘを使用して、ＡｖｒＩＩ制限部位およびリボソーム結合配列を含むプライマーＡＡ２３７（配列番号：１９４）、ならびにＳａｃＩ制限部位を含むプライマーＡＡ２３８（配列番号：：１９５）を用いて、ストレプトコッカス・サーモフィルス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）ＬＭＤ−９（ＡＴＣＣ ＢＡＡ−４９１）ｉｌｖＣコード領域（配列番号：５５）を、コロニーＰＣＲにより増幅させた。Ｐｈｕｓｉｏｎ Ｈｉｇｈ−Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘを使用して、ＡｖｒＩＩ制限部位およびリボソーム結合配列を含むプライマーＡＡ２３９（配列番号：１９６）、ならびにＳａｃＩ制限部位を含むプライマーＡＡ２４０（配列番号：：１９７）を用いて、Ｌ．メセンテロイデス亜種メセンテロイデス（Ｌ．ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ ｓｕｂｓｐ． ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ）ＡＴＣＣ ８２９３ゲノムＤＮＡ由来のロイコノストック・メセンテロイデス亜種メセンテロイデス（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ ｓｕｂｓｐ． ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ）ＡＴＣＣ ８２９３ ｉｌｖＣコード領域（配列番号：３９）を増幅させた。３つのｉｌｖＣ遺伝子をＡｖｒＩＩおよびＳａｃＩで切断し、個別にｐＤＭ５−ＰｌｄｈＬ１−ＭＣＳの対応する制限部位に連結させ、ＡｖｒＩＩおよびＳａｃＩで消化の後、ベクターｐＤＭ５−ＰｌｄｈＬ１−ｉｌｖＣ（Ｓ．ミュータンス（Ｓ．ｍｕｔａｎｓ））、ｐＤＭ５−ＰｌｄｈＬ１−ｉｌｖＣ（Ｓ．サーモフィルス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ））、およびｐＤＭ５−ＰｌｄｈＬ１−ｉｌｖＣ（Ｌ．メセンテロイデス（Ｌ．ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ））が作製された。ベクターはＰＣＲおよび配列決定によって確認された。
実施例７
ベクターｐＤＭ５−ＰｌｄｈＬ１−ｉｌｖＣ（Ｌ．ラクティス（Ｌ．ｌａｃｔｉｓ））、ｐＤＭ５−ＰｌｄｈＬ１−ｉｌｖＣ（Ｓ．ミュータンス（Ｓ．ｍｕｔａｎｓ））、ｐＤＭ５−ＰｌｄｈＬ１−ｉｌｖＣ（Ｓ．サーモフィルス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ））、ｐＤＭ５−ＰｌｄｈＬ１−ｉｌｖＣ（Ｌ．メセンテロイデス（Ｌ．ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ））、またはｐＤＭ５−ＰｌｄｈＬ１−ｉｌｖＣ（Ｐ．フルオレッセンス（Ｐ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）Ｐｆ５）を含むＰＮ０５１２ΔＩｄｈＤΔｌｄｈＬ１：：ｉｌｖＤ（Ｌｌ）ｓｕｆ：：Ｐ５Ｐ４＋ｇｌｇＢ：：Ｔｎ５−ＰｇｒｏＥ−ｋｉｖＤ（ｏ）−ｓａｄＢ（ｏ）を使用したイソブタノールの生成
本実施例の目的は、ベクターｐＤＭ５−ＰｌｄｈＬ１−ｉｌｖＣ（Ｐ．フルオレッセンス（Ｐ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）Ｐｆ５）を含むＰＮ０５１２ΔＩｄｈＤΔｌｄｈＬ１：：ｉｌｖＤ（Ｌｌ）ｓｕｆ：：Ｐ５Ｐ４＋ ｇｌｇＢ：：Ｔｎ５−ＰｇｒｏＥ−ｋｉｖＤ（ｏ）−ｓａｄＢ（ｏ）に比べて、ベクターｐＤＭ５−ＰｌｄｈＬ１−ｉｌｖＣ（Ｌ．ラクティス（Ｌ．ｌａｃｔｉｓ））、ｐＤＭ５−ＰｌｄｈＬ１−ｉｌｖＣ（Ｓ．ミュータンス（Ｓ．ｍｕｔａｎｓ））、ｐＤＭ５−ＰｌｄｈＬ１−ｉｌｖＣ（Ｓ．サーモフィルス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ））、またはｐＤＭ５−ＰｌｄｈＬ１−ｉｌｖＣ（Ｌ．メセンテロイデス（Ｌ．ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ））を含むＰＮ０５１２ΔＩｄｈＤΔｌｄｈＬ１：：ｉｌｖＤ（Ｌｌ）ｓｕｆ：：Ｐ５Ｐ４＋ ｇｌｇＢ：：Ｔｎ５−ＰｇｒｏＥ−ｋｉｖＤ（ｏ）−ｓａｄＢ（ｏ）において、イソブタノールの生成が増大していることを説明することである。
イソブタノール生合成経路の遺伝子を発現させる組換えラクトバチルス・プランタルム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ）を構築するために、ＰＮ０５１２ΔＩｄｈＤΔｌｄｈＬ１：：ｉｌｖＤ（Ｌｌ）ｓｕｆ：：Ｐ５Ｐ４＋ ｇｌｇＢ：：Ｔｎ５−ＰｇｒｏＥ−ｋｉｖＤ（ｏ）−ｓａｄＢ（ｏ）のコンピテント細胞を、一般方法に記載されているように調製し、プラスミドｐＤＭ５−ＰｌｄｈＬ１−ｉｌｖＣ（Ｐ．フルオレッセンス（Ｐ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）Ｐｆ５）、ｐＤＭ５−ＰｌｄｈＬ１−ｉｌｖＣ（Ｌ．ラクティス（Ｌ．ｌａｃｔｉｓ））、ｐＤＭ５−ＰｌｄｈＬ１−ｉｌｖＣ（Ｓ．ミュータンス（Ｓ．ｍｕｔａｎｓ））、ｐＤＭ５−ＰｌｄｈＬ１−ｉｌｖＣ（Ｓ．サーモフィルス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ））、またはｐＤＭ５−ＰｌｄｈＬ１−ｉｌｖＣ（Ｌ．メセンテロイデス（Ｌ．ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ））で形質転換して、それぞれＰＮ０５１２ΔＩｄｈＤΔｌｄｈＬ１：：ｉｌｖＤ（Ｌｌ）ｓｕｆ：：Ｐ５Ｐ４＋ ｇｌｇＢ：：Ｔｎ５−ＰｇｒｏＥ−ｋｉｖＤ（ｏ）−ｓａｄＢ（ｏ）／ ｐＤＭ５−ＰｌｄｈＬ１−ｉｌｖＣ（Ｐ．フルオレッセンス（Ｐ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）Ｐｆ５）、ＰＮ０５１２ΔＩｄｈＤΔｌｄｈＬ１：：ｉｌｖＤ（Ｌｌ）ｓｕｆ：：Ｐ５Ｐ４＋ ｇｌｇＢ：：Ｔｎ５−ＰｇｒｏＥ−ｋｉｖＤ（ｏ）−ｓａｄＢ（ｏ）／ ｐＤＭ５−ＰｌｄｈＬ１−ｉｌｖＣ（Ｌ．ラクティス（Ｌ．ｌａｃｔｉｓ））、ＰＮ０５１２ΔＩｄｈＤΔｌｄｈＬ１：：ｉｌｖＤ（Ｌｌ）ｓｕｆ：：Ｐ５Ｐ４＋ ｇｌｇＢ：：Ｔｎ５−ＰｇｒｏＥ−ｋｉｖＤ（ｏ）−ｓａｄＢ（ｏ）／ ｐＤＭ５−ＰｌｄｈＬ１−ｉｌｖＣ（Ｓ．ミュータンス（Ｓ．ｍｕｔａｎｓ））、ＰＮ０５１２ΔＩｄｈＤΔｌｄｈＬ１：：ｉｌｖＤ（Ｌｌ）ｓｕｆ：：Ｐ５Ｐ４＋ ｇｌｇＢ：：Ｔｎ５−ＰｇｒｏＥ−ｋｉｖＤ（ｏ）−ｓａｄＢ（ｏ）／ ｐＤＭ５−ＰｌｄｈＬ１−ｉｌｖＣ（Ｓ．サーモフィルス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ））、およびＰＮ０５１２ΔＩｄｈＤΔｌｄｈＬ１：：ｉｌｖＤ（Ｌｌ）ｓｕｆ：：Ｐ５Ｐ４＋ ｇｌｇＢ：：Ｔｎ５−ＰｇｒｏＥ−ｋｉｖＤ（ｏ）−ｓａｄＢ（ｏ）／ ｐＤＭ５−ＰｌｄｈＬ１−ｉｌｖＣ（Ｌ．メセンテロイデス（Ｌ．ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ））を得た。イソブタノール経路の第１の酵素であるアセト乳酸合成酵素は、内在性遺伝子からの自然発現により準備した。
ＰＮ０５１２ΔＩｄｈＤΔｌｄｈＬ１：：ｉｌｖＤ（Ｌｌ）ｓｕｆ：：Ｐ５Ｐ４＋ ｇｌｇＢ：：Ｔｎ５−ＰｇｒｏＥ−ｋｉｖＤ（ｏ）−ｓａｄＢ（ｏ）を含むベクターの５つの株ｐＤＭ５−ＰｌｄｈＬ１−ｉｌｖＣ（Ｐ．フルオレッセンス（Ｐ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）Ｐｆ５）、ｐＤＭ５−ＰｌｄｈＬ１−ｉｌｖＣ（Ｌ．ラクティス（Ｌ．ｌａｃｔｉｓ））、ｐＤＭ５−ＰｌｄｈＬ１−ｉｌｖＣ（Ｓ．ミュータンス（Ｓ．ｍｕｔａｎｓ））、ｐＤＭ５−ＰｌｄｈＬ１−ｉｌｖＣ（Ｓ．サーモフィルス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ））、またはｐＤＭ５−ＰｌｄｈＬ１−ｉｌｖＣ（Ｌ．メセンテロイデス（Ｌ．ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ））を、培養試験管中、１０μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールを含有するラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｉ）ＭＲＳ培地に播種し、３０℃で１晩好気培養した。１晩培養物を使用して、１２０ｍｌの血清ビンに、１００ｍＭ ３−モルホリノプロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）ｐＨ７、１０μｇ／ｍｌクロラムフェニコール、４０μＭクエン酸第二鉄、および０．５ｍＭシステインを含有するＭＲＳ培地２０ｍｌを初期ＯＤ６００ ０．３になるまで播種した。培養物を、振盪（１００ＲＰＭ）しながら３７℃で７２時間嫌気増殖させた。培養物の試料を、３７００ｘｇで１０分間、４℃で遠心し、上澄液を、０．２μｍのフィルター（Ｐａｌｌ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ａｎｎ Ａｒｂｏｒ，ＭＩ）に通して濾過した。濾過した上澄液は、カラムＨＰ−Ｉｎｎｏｗａｘ Ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ Ｇｌｙｃｏｌ Ｉｎｎｏｗａｘ Ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ Ｇｌｙｃｏｌ（１９０９１Ｎ−１１３、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ，ＣＡ）および炎イオン化検出を備えたＧＣで分析した。表３の結果は、これら５株についてイソブタノールの生成を示している。ＰＮ０５１２ΔＩｄｈＤΔｌｄｈＬ１：：ｉｌｖＤ（Ｌｌ）ｓｕｆ：：Ｐ５Ｐ４＋ ｇｌｇＢ：：Ｔｎ５−ＰｇｒｏＥ−ｋｉｖＤ（ｏ）−ｓａｄＢ（ｏ）含有ベクターｐＤＭ５−ＰｌｄｈＬ１−ｉｌｖＣ（Ｌ．ラクティス（Ｌ．ｌａｃｔｉｓ））によって生成されたイソブタノールの量は４．９ｍＭであり、これは、ＰＮ０５１２ΔＩｄｈＤΔｌｄｈＬ１：：ｉｌｖＤ（Ｌｌ）ｓｕｆ：：Ｐ５Ｐ４＋ ｇｌｇＢ：：Ｔｎ５−ＰｇｒｏＥ−ｋｉｖＤ（ｏ）−ｓａｄＢ（ｏ）含有ベクターｐＤＭ５−ＰｌｄｈＬ１−ｉｌｖＣ（Ｐ．フルオレッセンス（Ｐ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）Ｐｆ５）によって生成されたイソブタノールレベル（１．０ｍＭ）より約５倍高い。他のＫＡＲＩはそれぞれ、イソブタノール生成がＰｆ５より少なくとも３倍高かった。
Figure 0005805094
実施例８
酵母におけるイソブタノール生成のための様々なＫＡＲＩ酵素の発現
ベクター構築
２つのプラスミドの系を使用して、酵母におけるイソブタノール経路をエンジニアリングした。ケトール酸レダクトイソメラーゼ（ＫＡＲＩ）およびアセト乳酸合成酵素（ＡＬＳ）の発現用の第１のプラスミドを、ｐＹＺ０９０（配列番号：１９８）と称した。ｐＹＺ０９０は、酵母ＣＵＰ１プロモーター（ｎｔ位２〜４４９）から発現されたバチルス・サブティリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）（ｎｔ位４５７〜２１７２）由来のａｌｓＳ遺伝子のコード領域と、その後に続くＡＬＳ発現用のＣＹＣ１ターミネーター（ｎｔ位２１８１〜２４３０）を有するキメラ遺伝子、および酵母ＩＬＶ５プロモーター（２４３３〜３６２６）から発現されたラクトコッカス・ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ）（ｎｔ位３６３４〜４６５６）由来のｉｌｖＣ遺伝子のコード領域と、その後に続くＫＡＲＩ発現用のＩＬＶ５ ターミネーター（ｎｔ位４６８２〜５３０４）を有するキメラ遺伝子が含まれるように構築された。このベクターにおけるＬ．ラクティス（Ｌ．ｌａｃｔｉｓ）ＫＡＲＩコード領域は、ＬＬＫＡＲＩ−ＰｍｅＩ（配列番号：１９９）およびＬＬＫＡＲＩ−ＳｆｉＩ 配列番号：２００）のプライマーセット、ならびにｐＬＨ４７５−ＩｌｖＣ（Ｌｌ）を鋳型として使用して、ＰＣＲにより得られたＤＮＡ断片であった。ｐＬＨ４７５−ＩｌｖＣ（Ｌｌ）を構築するために、実施例４に上述したことであるが、ＩｌｖＣ（Ｌａｃｔｉｓ）−ＦおよびＩｌｖＣ（Ｌａｃｔｉｓ）−Ｒ（配列番号：２０１および２０２）のプライマーセットを用いて、鋳型としてｐＤＭ５−ＰｌｄｈＬ１−ｉｌｖＣ（Ｌ．ラクティス（Ｌ．ｌａｃｔｉｓ））を使用して、ｉｌｖＣ−Ｌｌコード領域を増幅させた。ＰＣＲ生成物をＡｖｒＩＩおよびＳｆｉＩで消化し、ｐＬＨ４７５をベースとしたベクターの対応する部位にクローニングし、コンストラクトｐＬＨ４７５−ＩｌｖＣ（Ｌｌ）（配列番号：２０３）、別名ｐＬＨ４７５−ＩｌｖＣ（Ｌ．ラクティス（Ｌ．ｌａｃｔｉｓ））を作製した。
プラスミドｐＹＺ０９１（配列番号：２０４）は、Ｌ．ラクティス（Ｌ．ｌａｃｔｉｓ）ｉｌｖＣコード領域が、シュードモナス・フルオレッセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ
ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）ｉｌｖＣコード領域（ｉｌｖＣ（Ｐｆ−５）と置換されている点以外、ｐＹＺ０９０と同じである。ＩｌｖＣ（Ｐｆ−５）コード領域は、ｐＩＬＶＣｙ−ＰｍｅＩＩ（配列番号：２０５）およびｐｉｌｖＣｙ−ＳｆｉＩ（配列番号：２０６）のプライマーセットを用いて、ｐＬＨ５３２を鋳型ＤＮＡとして使用してで増幅させた。ｐＬＨ５３２（配列番号：２０７）は、ｐＨＲ８１ベクター（ＡＴＣＣ ＃８７５４１）であり、ＩＬＶ５コード領域（ｎｔ位８１１８〜９１６７）がＦＢＡプロモーター（ｎｔ位７４５４〜８１１０）とＣＹＣ１ターミネーター（ｎｔ位９１７６〜９４２５）との間に位置し、Ｐ．フルオレッセンス（Ｐ． ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ）Ｐｆ−５（ｎｔ位１０１９２〜１１２０８）由来のＩｌｖＣコード領域が、ＩＬＶ５プロモーター（ｎｔ位１１２００〜１２３９０）とＩＬＶ５ターミネーター（ｎｔ位９４３４〜１０１９１）の間に位置する。この遺伝子は、配列番号：２０７の配列ｐＬＨ５３２の逆補体である。Ｐｆ−５コード領域は、出芽酵母（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）における発現に最適化されたコドンであった。
プラスミドｐＹＺ０５８（配列番号：２０８）は、Ｌ．ラクティス（Ｌ．ｌａｃｔｉｓ）ｉｌｖＣコード領域が、出芽酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＩＬＶ５コード領域（ＩＬＶ５（Ｓｃ））で置換されている点以外、ｐＹＺ０９０と同じである。ミトコンドリアシグナルペプチドを含まない出芽酵母（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＩＬＶ５コード領域は、ｐｉｌｖ５−ＰｍｅＩ（配列番号：２０９）およびｐｉｌｖ５−ＳｆｉＩ（配列番号：２１０）のプライマーセットを用いて、ｐＬＨ５３２を鋳型ＤＮＡとして使用して増幅させた。
残部のイソブタノール経路の遺伝子を含む第２のプラスミドは、ｐＹＺ０６７（配列番号：２１１）と称した。このベクターは、下記のキメラ遺伝子が含まれるように構築された：１）酵母ＦＢＡ１プロモーター（ｎｔ位１１６１〜２２５０）から発現されたＣ末端のＬｕｍｉｏタグ（ｎｔ位２２６０〜３９９６）を有するＳ．ミュータンス（Ｓ．ｍｕｔａｎｓ）ＵＡ１５９由来のｉｌｖＤ遺伝子のコード領域と、その後に続くジヒドロキシ酸デヒドラターゼ（ＤＨＡＤ）発現用のＦＢＡ１ターミネーター（ｎｔ位４００５〜４３１７）、２）酵母ＧＰＭ１プロモーター（ｎｔ５８１９〜６５７５）から発現されたウマ肝臓ＡＤＨ（ｎｔ４６８０〜５８０７）のコード領域と、その後に続くアルコールデヒドロゲナーゼ発現用のＡＤＨ１ターミネーター（ｎｔ位４３５６〜４６７１）、および３）酵母ＴＤＨ３プロモーター（ｎｔ位８８３０−９４９３）から発現されたラクトコッカス・ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ）（ｎｔ位７１７５〜８８２１）由来のＫｉｖＤ遺伝子のコード領域と、その後に続くケトイソ吉草酸デカルボキシラーゼ発現用のＴＤＨ３ターミネーター。
イソブタノール生成宿主株
２００９年９月２９日出願の米国仮特許出願第６１／２４６，７０９号明細書に記載されている遺伝子型ＢＹ４７００ ｐｄｃ６：：ＰＧＰＭ１−ｓａｄＢ−ＡＤＨ１ｔ ｐｄｃ１：：ＰＰＤＣ１−ｉｌｖＤ−ＦＢＡ１ｔ Δｈｉｓ３ Δｈｘｋ２ ｐｄｃ５：：ｋａｎＭＸ４を有するＮＹＬＡ８４株を、イソブタノール生成に使用した。この株は、出芽酵母（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）の内因性ＰＤＣ１、ＰＤＣ５、およびＰＤＣ６遺伝子の挿入−不活性化によって構築した。ＰＤＣ１、ＰＤＣ５、およびＰＤＣ６遺伝子は、ピルビン酸デカルボキシラーゼの主要な３つのアイソザイムをコードする。
ｐｄｃ６：：ＰＧＰＭ１−ｓａｄＢ組込みカセットおよびＰＤＣ６欠失の構築：
ｐｄｃ６：：ＰＧＰＭ１−ｓａｄＢ−ＡＤＨ１ｔ−ＵＲＡ３ｒ組込みカセットは、ｐＲＳ４２５：：ＧＰＭ−ｓａｄＢ（上述）由来のＧＰＭ−ｓａｄＢ−ＡＤＨｔセグメント（配列番号：１５６）をｐＵＣ１９−ＵＲＡ３ｒ由来のＵＲＡ３ｒ遺伝子に結合させることによって作製した。ｐＵＣ１９−ＵＲＡ３ｒ（配列番号：２１２）は、インビボでの相同組換えおよびＵＲＡ３マーカーの除去が可能になるように７５ｂｐの相同性反復配列によってフランキングされているｐＲＳ４２６（ＡＴＣＣ ＃７７１０７）由来のＵＲＡ３マーカーを含む。２つのＤＮＡセグメントは、ＳＯＥ ＰＣＲ（Ｈｏｒｔｏｎら、（１９８９年）Ｇｅｎｅ ７７巻：６１〜６８頁によって記載されている）により、鋳型としてｐＲＳ４２５：：ＧＰＭ−ｓａｄＢおよびｐＵＣ１９−ＵＲＡ３ｒプラスミドＤＮＡを使用
して、Ｐｈｕｓｉｏｎ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ Ｉｎｃ．、Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ；カタログ番号Ｆ−５４０Ｓ）、ならびにプライマー１１４１１７−１１Ａから１１４１１７−１１Ｄ（配列番号：２１３、２１４、２１５、および２１６）、および１１４１１７−１３Ａと１１４１１７−１３Ｂ（配列番号：２１７および２１８）を用いて結合させた。
ＳＯＥ ＰＣＲ（１１４１１７−１３Ａおよび１１４１１７−１３Ｂ）の外側プライマーは、それぞれＰＤＣ６プロモーターおよびターミネーターの上流および下流の領域と相同である約５０ｂｐの５’および３’領域を含むものであった。標準遺伝子操作（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｙｅａｓｔ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、２００５年、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ、２０１〜２０２頁）を使用して、完成したカセットＰＣＲ断片をＢＹ４７００（ＡＴＣＣ ＃ ２００８６６）に形質転換し、形質転換体を、ウラシルを含まず、２％グルコースを補充した合成完全培地上に３０℃で維持した。形質転換体は、プライマー１１２５９０−３４Ｇおよび１１２５９０−３４Ｈ（配列番号：２１９および２２０）、ならびに１１２５９０−３４Ｆおよび１１２５９０−４９Ｅ（配列番号：２２１および２２２）を使用して、ＰＣＲによりスクリーニングして、ＰＤＣ６座における組込みとＰＤＣ６コード領域の欠失を検証した。ＵＲＡ３ｒマーカーは、標準プロトコルに従って、２％グルコースおよび５−ＦＯＡを補充した合成完全培地上に３０℃で蒔くことによってリサイクルした。マーカー除去は、コロニーを５−ＦＯＡプレートからＳＤ−ＵＲＡ培地にパッチして、増殖の有無を検証することによって確認した。得られた同定された株は、遺伝子型：ＢＹ４７００ ｐｄｃ６：：ＰＧＰＭ１−ｓａｄＢ−ＡＤＨ１ｔを有するものである。
ｐｄｃ１：：ＰＰＤＣ１−ｉｌｖＤ組込みカセットおよびＰＤＣ１欠失の構築：
ｐｄｃ１：：ＰＰＤＣ１−ｉｌｖＤ−ＦＢＡ１ｔ−ＵＲＡ３ｒ組込みカセットは、ＳＯＥ ＰＣＲ（Ｈｏｒｔｏｎら、（１９８９年）、Ｇｅｎｅ、７７巻：６１〜６８頁によって記載されている）により、鋳型としてｐＬＨ４６８およびｐＵＣ１９−ＵＲＡ３ｒプラスミドＤＮＡを使用して、Ｐｈｕｓｉｏｎ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ Ｉｎｃ．、Ｂｅｖｅｒｌｙ、ＭＡ；カタログ番号Ｆ−５４０Ｓ）およびプライマー１１４１１７−２７Ａから１１４１１７−２７Ｄ（配列番号：２２４、２２５、２２６および２２７）を用いて、ｐＬＨ４６８（上述）由来のｉｌｖＤ−ＦＢＡ１ｔセグメント（配列番号：２２３）をｐＵＣ１９−ＵＲＡ３ｒ由来のＵＲＡ３ｒ遺伝子に結合させることによって作製した。
ＳＯＥ ＰＣＲ（１１４１１７−２７Ａおよび１１４１１７−２７Ｄ）の外側プライマーは、ＰＤＣ１プロモーターの下流およびＰＤＣ１コード配列の下流の領域と相同である約５０ｂｐの５’および３’領域を含むものであった。標準遺伝子操作（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｙｅａｓｔ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、２００５年、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ、２０１〜２０２頁）を使用して、完成したカセットＰＣＲ断片をＢＹ４７００ ｐｄｃ６：：ＰＧＰＭ１−ｓａｄＢ−ＡＤＨ１ｔに形質転換し、形質転換体を、ウラシルを含まず、２％グルコースを補充した合成完全培地上に３０℃で維持した。形質転換体は、プライマー１１４１１７−３６Ｄおよび１３５（配列番号：２２８および２２９）、ならびにプライマー１１２５９０−４９Ｅおよび１１２５９０−３０Ｆ（配列番号：２２２および２３０）を使用して、ＰＣＲによりスクリーニングして、ＰＤＣ１座における組込みおよびＰＤＣ１コード配列の欠失を検証した。ＵＲＡ３ｒマーカーは、標準プロトコルに従って、２％グルコースおよび５−ＦＯＡを補充した合成完全培地上に３０℃で蒔くことによってリサイクルした。マーカー除去は、コロニーを５−ＦＯＡプレートからＳＤ−ＵＲＡ培地にパッチして、増殖の有無を検証することによって確認した。得られた同定された株「ＮＹＬＡ６７」は、遺伝子型：ＢＹ４７００ ｐｄｃ６：：ＰＧＰＭ１−ｓａｄＢ−ＡＤＨ１ｔ ｐｄｃ１：：ＰＰＤＣ１−ｉｌｖＤ−ＦＢＡ１ｔを有するものである。
ＨＩＳ３欠失
内因性ＨＩＳ３コード領域を欠失するために、ｈｉｓ３：：ＵＲＡ３ｒ２カセットをＵＲＡ３ｒ２鋳型ＤＮＡ（配列番号：２３１）からＰＣＲ増幅させた。ＵＲＡ３ｒ２は、インビボでの相同組換えおよびＵＲＡ３マーカーの除去が可能になるように５００ｂｐの相同性反復配列によってフランキングされているｐＲＳ４２６（ＡＴＣＣ ＃７７１０７）由来のＵＲＡ３マーカーを含む。Ｐｈｕｓｉｏｎ ＤＮＡポリメラーゼおよびプライマー１１４１１７−４５Ａおよび１１４１１７−４５Ｂ（配列番号：２３２および２３３）を使用して、ＰＣＲを行い、約２．３ｋｂのＰＣＲ生成物が生成された。各プライマーのＨＩＳ３部分は、ＨＩＳ３プロモーターの上流の５’領域およびコード領域の下流の３’領域に由来するものであった。したがって、ＵＲＡ３ｒ２マーカーの組込みによって、ＨＩＳ３コード領域の置換が起こる。標準遺伝子操作（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｙｅａｓｔ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、２００５年、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ、２０１〜２０２頁）を使用して、ＰＣＲ産物をＮＹＬＡ６７に形質転換し、得られた形質転換体を、ウラシルを含まず、２％グルコースを補充した合成完全培地上で３０℃において選択した。ヒスチジンを含まず、２％グルコースを補充した合成完全培地上で、形質転換体を３０℃でレプリカ平板法にかけることによって正確な組込みが検証されるように、形質転換体をスクリーニングした。ＵＲＡ３ｒマーカーは、標準プロトコルに従って、２％グルコースおよび５−ＦＯＡを補充した合成完全培地上に３０℃で蒔くことによってリサイクルした。マーカー除去は、コロニーを５−ＦＯＡプレートからＳＤ−ＵＲＡ培地にパッチして、増殖の有無を検証することによって確認した。ＮＹＬＡ７３と呼ばれる得られた同定された株は、遺伝子型：ＢＹ４７００ ｐｄｃ６：：ＰＧＰＭ１−ｓａｄＢ−ＡＤＨ１ｔ ｐｄｃ１：：ＰＰＤＣ１−ｉｌｖＤ−ＦＢＡ１ｔ Δｈｉｓ３を有するものである。
ｐｄｃ５：：ｋａｎＭＸ組込みカセットおよびＰＤＣ５欠失の構築：
Ｐｈｕｓｉｏｎ ＤＮＡポリメラーゼならびにプライマーＰＤＣ５：：ＫａｎＭＸＦおよびＰＤＣ５：：ＫａｎＭＸＲ（配列番号：２３４および２３５）を使用して、ｐｄｃ５：：ｋａｎＭＸ４カセットを、株ＹＬＲ１３４Ｗ染色体ＤＮＡ（ＡＴＣＣ Ｎｏ． ４０３４０９１）からＰＣＲ増幅させ、約２．２ｋｂのＰＣＲ生成物が生成された。各プライマーのＰＤＣ５部分は、ＰＤＣ５プロモーターの上流の５’領域およびコード領域の下流の３’領域に由来するものであった。したがって、ｋａｎＭＸ４マーカーの組込みによって、ＰＤＣ５コード領域の置換が起こる。標準遺伝子操作（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｙｅａｓｔ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、２００５年、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ、２０１〜２０２頁）を使用して、ＰＣＲ産物をＮＹＬＡ７３に形質転換し、得られた形質転換体を、１％エタノールおよびジェネテシン（２００μｇ／ｍｌ）を補充したＹＰ培地上で３０℃において選択した。形質転換体は、プライマーＰＤＣ５ｋｏｆｏｒおよびＮ１７５（配列番号：２３６および２３７）を使用して、ＰＣＲによりスクリーニングして、ＰＤＣ座における正確な組込みおよびＰＤＣ５コード領域の置換を検証した。同定された正確な形質転換体は、遺伝子型：ＢＹ４７００ ｐｄｃ６：：ＰＧＰＭ１−ｓａｄＢ−ＡＤＨ１ｔ ｐｄｃ１：：ＰＰＤＣ１−ｉｌｖＤ−ＦＢＡ１ｔ Δｈｉｓ３ ｐｄｃ５：：ｋａｎＭＸ４を有する。株は、ＮＹＬＡ７４と名付けた。
ＨＸＫ２（ヘキソキナーゼＩＩ）の欠失：
Ｐｈｕｓｉｏｎ ＤＮＡポリメラーゼならびにプライマー３８４および３８５（配列番号：２３８および２３９）を使用して、ｈｘｋ２：：ＵＲＡ３ｒカセットを、ＵＲＡ３ｒ２鋳型（上述）からＰＣＲ増幅させ、約２．３ｋｂのＰＣＲ生成物が生成された。各プライマーのＨＸＫ２部分は、ＨＸＫ２プロモーターの上流の５’領域およびコード領域の下流の３’領域に由来するものであった。したがって、ＵＲＡ３ｒ２マーカーの組込みによって、ＨＸＫ２コード領域の置換が起こる。標準遺伝子操作（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｙｅａｓｔ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、２００５年、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ、２０１〜２０２頁）を使用して、ＰＣＲ産物をＮＹＬＡ７３に形質転換し、得られた形質転換体を、ウラシルを含まず、２％グルコースを補充した合成完全培地上で３０℃において選択した。形質転換体は、プライマーＮ８６９およびＮ８７１（配列番号：２４０および２４１）を使用して、ＰＣＲによりスクリーニングして、ＨＸＫ２座における正確な組込みおよびＨＸＫ２コード領域の置換を検証した。ＵＲＡ３ｒ２マーカーは、標準プロトコルに従って、２％グルコースおよび５−ＦＯＡを補充した合成完全培地上に３０℃で蒔くことによってリサイクルした。マーカー除去は、コロニーを５−ＦＯＡプレートからＳＤ −ＵＲＡ培地にパッチして、増殖の有無を検証することによって、またプライマーＮ９４６およびＮ９４７（配列番号：２４２および２４３）を使用して、ＰＣＲによって、正確なマーカー除去を検証することによって確認した。ＮＹＬＡ８３と呼ばれる得られた同定された株は、遺伝子型：ＢＹ４７００ ｐｄｃ６：：ＰＧＰＭ１−ｓａｄＢ−ＡＤＨ１ｔ ｐｄｃ１：：ＰＰＤＣ１−ｉｌｖＤ−ＦＢＡ１ｔ Δｈｉｓ３ Δｈｘｋ２を有するものである。
ｐｄｃ５：：ｋａｎＭＸ組込みカセットおよびＰＤＣ５欠失の構築
ｐｄｃ５：：ｋａｎＭＸ４カセットは、上述のようにＰＣＲ増幅させた。上述のように、ＰＣＲ断片をＮＹＬＡ８３に形質転換し、形質転換体を選択し、スクリーニングした。ＮＹＬＡ８４と呼ばれる同定された正確な形質転換体は、遺伝子型：ＢＹ４７００ ｐｄｃ６：：ＰＧＰＭ１−ｓａｄＢ−ＡＤＨ１ｔ ｐｄｃ１：：ＰＰＤＣ１−ｉｌｖＤ−ＦＢＡ１ｔ Δｈｉｓ３ Δｈｘｋ２ ｐｄｃ５：：ｋａｎＭＸ４を有する。
イソブタノール生成
ＬｉＡｃ／ＰＥＧ法を使用して、プラスミドｐＹＺ０６７をｐＹＺ０９０、ｐＹＺ０９１またはｐＹＺ０５８に沿って、酵母株ＮＹＬＡ８４に形質転換し、形質転換体を、２％グルコースおよび０．１％エタノール（ＳＥＧ）を補充した（ヒスチジンおよびウラシルを含まない）酵母ドロップアウト培地画は言っている酵母寒天培養プレート上で選択した。３０℃で５〜６日後、炭素源として０．１％エタノールおよび２％グルコースを含有する同様の寒天板（ＳＥＧプレート）に、個々のコロニーをパッチし、３０℃で２〜３日間培養し、下記の振盪フラスコ試験を行った。
個々のコロニーのパッチを、まず３ｍｌのＳＥＧ（２％グルコース、０．１％ＥｔＯＨ）培地に播種し、１５０ｒｐｍの回転ドラム中、３０℃で１晩（２０時間）増殖させた。２０ｍｌのＳＥＧ培地が入っている１２５ｍｌのフラスコに、１晩培養物をＯＤ６００ 約０．３になるまで播種し、しっかりと蓋を閉めた。１５０ｒｐｍで振盪しながら、培養物を３０℃で増殖させた。一般方法であるＨＰＬＣによる分析用に、様々な時点でサンプリングを行った。
図４および５に示す結果から、Ｌ．ラクティス（Ｌ．ｌａｃｔｉｓ）由来のＩｌｖＣコード領域を含む酵母株は、シュードモナス・フルオレッセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）由来のｉｌｖＣおよび出芽酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）由来のＩＬＶ５を含む酵母株より、速く増殖し、多くのイソブタノールを生成したことがわかる。
以上、本発明を要約すると下記のとおりである。
１．ケトール酸レダクトイソメラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする少なくとも１つの核酸分子を含む酵母細胞であって、該リペプチドが、ＫＡＲＩのＳＬＳＬクレードのメンバーである、上記酵母細胞。
２．ＳＬＳＬクレードが、スタフィロコッカス、リステリア、エンテロコッカス、マクロコッカス、ストレプトコッカス、ラクトコッカス、ロイコノストック、ラクトバチルスからなる群から選択される細菌に内在するケトール酸レダクトイソメラーゼからなる、上記１に記載の酵母細胞。
３．ケトール酸レダクトイソメラーゼ活性を有するポリペプチドは、配列番号：２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、および２４５からなる群から選択される配列と少なくとも約８０％同一であるアミノ酸配列を有する、上記１に記載の酵母細胞。
４．細胞が、サッカロミセス、シゾサッカロミセス、ハンゼヌラ、カンジダ、クルイベロミセス、ヤロウイア、イサチェンキア、およびピキア（Ｐｉｃｈｉａ）からなる群から選択される属の酵母のメンバーである、上記１に記載の酵母細胞。
５．ケトール酸レダクトイソメラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする少なくとも１つの核酸分子を含むイソブタノール生成微生物細胞であって、該ポリペプチドが、ＫＡＲＩのＳＬＳＬクレードのメンバーである、上記微生物細胞。
６．ＳＬＳＬクレードが、スタフィロコッカス、リステリア、エンテロコッカス、マクロコッカス、ストレプトコッカス、ラクトコッカス、ロイコノストック、ラクトバチルスからなる群から選択される細菌に内在するケトール酸レダクトイソメラーゼからなる、上記５に記載の微生物細胞。
７．ケトール酸レダクトイソメラーゼ活性をコードするポリペプチドが、配列番号：２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、および２４５からなる群から選択される配列と少なくとも約８０％同一であるアミノ酸配列を有する、上記５に記載の微生物細胞。
８．細胞が細菌細胞または酵母細胞である、上記５に記載の宿主微生物細胞。
９．宿主細胞が、エシェリキア、ロドコッカス、シュードモナス、バチルス、エンテロコッカス、ラクトコッカス、ラクトバチルス、ロイコノストック、オエノコッカス、ペディオコッカス、ストレプトコッカス、クロストリジウム、ザイモモナス、サルモネラ、ペディオコッカス、アルカリゲネス、クレブシエラ、パエニバチルス、アルスロバクター、コリネバクテリウム、およびブレビバクテリウムからなる群から選択される属の細菌細胞である、上記８に記載の宿主微生物細胞。
１０．宿主細胞が、サッカロミセス、シゾサッカロミセス、ハンゼヌラ、カンジダ、クルイベロミセス、ヤロウイア、イサチェンキア、およびピキアからなる群から選択される属の酵母細胞である、上記８に記載の宿主微生物細胞。
１１．アセト乳酸をジヒドロキシイソ吉草酸に変換する方法であって、
ａ）ケトール酸レダクトイソメラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする少なくとも１つの核酸分子を含む酵母細胞を備えるステップであって、ここで該ポリペプチドはＫＡＲＩのＳＬＳＬクレードのメンバーである、該ステップと；
ｂ）（ａ）の酵母細胞とアセト乳酸を接触させるステップであって、ここで２，３−ジヒドロキシイソ吉草酸が生産される、該ステップと；を含む、上記方法。
１２．ＳＬＳＬクレードが、スタフィロコッカス、リステリア、エンテロコッカス、マクロコッカス、ストレプトコッカス、ラクトコッカス、ロイコノストック、ラクトバチルスからなる群から選択される細菌に内在するケトール酸レダクトイソメラーゼからなる、上記１１に記載の方法。
１３．イソブタノールを生産する方法であって、
ａ）ケトール酸レダクトイソメラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする少なくとも１つの核酸分子を含む、イソブタノール生合成経路を含む微生物細胞を備えるステップであって、ここで該ポリペプチドは、ＫＡＲＩのＳＬＳＬクレードのメンバーである、該ステップと；
ｂ）ステップ（ａ）の微生物細胞を、イソブタノールが生成される条件下で増殖させるステップと；
を含む、上記方法。
１４．ＳＬＳＬクレードが、スタフィロコッカス、リステリア、エンテロコッカス、マクロコッカス、ストレプトコッカス、ラクトコッカス、ロイコノストック、ラクトバチルスからなる群から選択される細菌に内在するケトール酸レダクトイソメラーゼからなる、上記１３に記載の方法。
１５．ケトール酸レダクトイソメラーゼ活性を有するポリペプチドが、配列番号：２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２
、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、および２４５からなる群から選択される配列と少なくとも約８０％同一であるアミノ酸配列を有する、上記１３に記載の方法。
１６．酵母細胞であって、不活化されたピルビン酸デカルボキシラーゼ遺伝子を少なくとも１つ有するようにエンジニアリングされ、配列番号：１９８、２０３、２０４、２０８、または２１１からなる群から選択されるプラスミドのコード領域と少なくとも約８０％同一性を有するコード領域を有するプラスミドを含む、上記酵母細胞。
１７．酵母細胞であって、不活化されたピルビン酸デカルボキシラーゼ遺伝子を少なくとも１つ有するようにエンジニアリングされ、配列番号：１９８、２０３、２０４、２０８、または２１１からなる群から選択されるプラスミドのキメラ遺伝子と少なくとも約８０％の同一性を有するキメラ遺伝子を有するプラスミドを含む、上記酵母細胞。
１８．配列番号：１９８、２０３、２０４、２０８、または２１１の配列を有するプラスミド。

Claims (11)

  1. ケトール酸レダクトイソメラーゼ（ＫＡＲＩ）活性を有するポリペプチドをコードする少なくとも１つの核酸分子を含む酵母細胞であって、該ＫＡＲＩ活性を有するポリペプチドが、配列番号：２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、および２４５からなる群から選択される配列と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を有し、該酵母細胞が、少なくとも１つの不活性化されたピルビン酸デカルボキシラーゼ（ＰＤＣ）遺伝子を含む、上記酵母細胞。
  2. ケトール酸レダクトイソメラーゼ（ＫＡＲＩ）活性を有するポリペプチドをコードする少なくとも１つの核酸分子を含むイソブタノール生成微生物細胞であって、該ＫＡＲＩ活性を有するポリペプチドが、配列番号：２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、および２４５からなる群から選択される配列と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を有し、該イソブタノール生成微生物細胞が、少なくとも１つの不活性化されたピルビン酸デカルボキシラーゼ（ＰＤＣ）遺伝子を含む、上記微生物細胞。
  3. アセト乳酸をジヒドロキシイソ吉草酸に変換する方法であって、
    ａ）ケトール酸レダクトイソメラーゼ（ＫＡＲＩ）活性を有するポリペプチドをコードする少なくとも１つの核酸分子を含む酵母細胞を備えるステップであって、ここで該ＫＡＲＩ活性を有するポリペプチドが、配列番号：２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、および２４５からなる群から選択される配列と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を有し、該酵母細胞が、少なくとも１つの不活性化されたピルビン酸デカルボキシラーゼ（ＰＤＣ）遺伝子を含む、該ステップと；
    ｂ）（ａ）の酵母細胞とアセト乳酸を接触させるステップであって、ここで２，３−ジヒドロキシイソ吉草酸が生産される、該ステップと；を含む、上記方法。
  4. イソブタノールを生産する方法であって、
    ａ）ケトール酸レダクトイソメラーゼ（ＫＡＲＩ）活性を有するポリペプチドをコードする少なくとも１つの核酸分子を含む、イソブタノール生合成経路を含む微生物細胞を備えるステップであって、ここで該ＫＡＲＩ活性を有するポリペプチドが、配列番号：２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、および２４５からなる群から選択される配列と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を有し、該微生物細胞が、少なくとも１つの不活性化されたピルビン酸デカルボキシラーゼ（ＰＤＣ）遺伝子を含む、該ステップと；
    ｂ）ステップ（ａ）の微生物細胞を、イソブタノールが生成される条件下で増殖させるステップと；
    を含む、上記方法。
  5. 酵母細胞であって、不活化されたピルビン酸デカルボキシラーゼ遺伝子を少なくとも１つ有するようにエンジニアリングされ、配列番号：１９８、２０３、２０４、２０８、または２１１からなる群から選択されるプラスミドのコード領域と少なくとも９０％の同一性を有するコード領域を有するプラスミドを含む、上記酵母細胞。
  6. 酵母細胞であって、不活化されたピルビン酸デカルボキシラーゼ遺伝子を少なくとも１つ有するようにエンジニアリングされ、配列番号：１９８、２０３、２０４、２０８、または２１１からなる群から選択されるプラスミドのキメラ遺伝子と少なくとも９０％の同一性を有するキメラ遺伝子を有するプラスミドを含む、上記酵母細胞。
  7. 配列番号：１９８、２０３、２０４、２０８、または２１１の配列を有するプラスミド。
  8. 酵母細胞が、サッカロミセス、シゾサッカロミセス、ハンゼヌラ、カンジダ、クルイベロミセス、ヤロウイア、イサチェンキア、およびピキア（Ｐｉｃｈｉａ）からなる群から選択される属の酵母のメンバーである、請求項１又は３に記載の酵母細胞。
  9. 細胞が細菌細胞または酵母細胞である、請求項２又は４に記載の宿主微生物細胞。
  10. 宿主細胞が、エシェリキア、ロドコッカス、シュードモナス、バチルス、エンテロコッカス、ラクトコッカス、ラクトバチルス、ロイコノストック、オエノコッカス、ペディオコッカス、ストレプトコッカス、クロストリジウム、ザイモモナス、サルモネラ、ペディオコッカス、アルカリゲネス、クレブシエラ、パエニバチルス、アルスロバクター、コリネバクテリウム、およびブレビバクテリウムからなる群から選択される属の細菌細胞である、請求項９に記載の宿主微生物細胞。
  11. 宿主細胞が、サッカロミセス、シゾサッカロミセス、ハンゼヌラ、カンジダ、クルイベロミセス、ヤロウイア、イサチェンキア、およびピキアからなる群から選択される属の酵母細胞である、請求項９に記載の宿主微生物細胞。
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