JP5788863B2 - 腫瘍開始細胞およびその使用方法 - Google Patents

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関連出願
その全体が本明細書中に参照により組み込まれている、２００９年３月２７日に出願の米国仮出願第６１／１６４，２７２号の優先権が主張されている。

本発明は、一般に、癌幹細胞または腫瘍開始細胞とも呼ばれる腫瘍原性が高い細胞、その単離方法、および前記方法で使用するための腫瘍開始細胞マーカーに関する。より詳細には、本発明は、５Ｔ４発現が高レベルであり（５Ｔ４^高）、場合によりＣＤ２４発現が存在しないまたは低レベルであり（ＣＤ２４^−／低）、ＣＤ４４発現が存在する（ＣＤ４４^＋）、腫瘍開始細胞に関する。開示した腫瘍開始細胞集団は、癌治療のための新規薬物および標的の同定、ならびに既存の抗癌薬の有効性の試験に有用である。

自己複製および分化を調節するシグナル伝達経路は、腫瘍内の細胞の不均質性に寄与する。自己複製および分化の様々な状態が、本質的に異なるレベルのｉｎ ｖｉｖｏ腫瘍原性およびｉｎ ｖｉｔｒｏクローン原性を示す腫瘍部分集団および個々の腫瘍細胞によって明白に示されている。Ｌｏｂｏら、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｃｅｌｌ Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．、２００７、２３：６７５〜６９９、Ｒｅｙａら、Ｎａｔｕｒｅ、２００１、４１４：１０５〜１１１を参照されたい。新しい腫瘍モデルの開発が開始されており、細胞レベルでの腫瘍の不均質性の特徴づけが可能となっている。免疫不全マウスにおける固形腫瘍の移植片は、元の試料の組織学を反映しているが、血清中で培養した細胞系からの異種移植片では再現されない、豊かな構造を示す。規定の無血清培地および／または三次元マトリックス中で癌細胞を培養することで、血清を含む培地中で培養するよりも細胞の生理的特徴が保存される（Ｌｅｅら、Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌ、２００６、９：３９１〜４０３）。腫瘍、異種移植片、および細胞系からの細胞の蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）により、特定の腫瘍部分集団の分子の特徴づけが容易になっている。

多くの腫瘍では、特定の表面マーカーによって定義される細胞は、同じ腫瘍中の他の細胞よりも効率的に腫瘍を形成する。これらの細胞は、多能性腫瘍開始細胞、癌幹細胞、腫瘍開始細胞、および癌開始細胞とも呼ばれる。腫瘍開始細胞は造血系において最初に同定され（ＢｏｎｎｅｔおよびＤｉｃｋ、Ｎａｔ．Ｍｅｄ．、１９９７、３（７）：７３０〜７３７）、それ以降、脳、乳房、結腸、頭頚部、肺、黒色腫、膵臓、および前立腺の腫瘍を含めた固形腫瘍において同定されている。ＶｉｓｖａｄｅｒおよびＬｉｎｄｅｍａｎ、Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｃａｎｃｅｒ、２００８、８：７５５〜７６８およびその中に引用されている参考文献を参照されたい。特定の腫瘍型では、同じ細胞表面マーカーの組を使用して、腫瘍開始細胞を新鮮な腫瘍試料、異種移植片、および細胞系から単離することができる。たとえば、Ａｌ−Ｈａｊｊら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、２００３、１００：３９８３〜３９８８、ＦｉｌｍｏｒｅおよびＫｕｐｅｒｗａｓｓｅｒ、Ｂｒｅａｓｔ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．、２００８、１０：Ｒ２５、Ｈｅｒｍａｎｎら、Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ、２００７、１：３１３〜３２３、Ｍａｔｓｕｉら、Ｂｌｏｏｄ、２００４、１０３：２３３２〜２３３６を参照されたい。いくつかの腫瘍型における腫瘍開始細胞のマーカーであるＣＤ４４は、腫瘍化において直接的な役割を有し、ｐ５３によって抑制されることが最近示された（Ｇｏｄａｒら、Ｃｅｌｌ、２００８、１３４：６２〜７３）。

腫瘍開始細胞は標準の治療に対して耐性を示す。たとえば、腫瘍開始細胞は化学療法を受けた乳癌患者の試料中で高度に濃縮されており、これにより、処置後の疾患の再発の説明が示唆されている（Ｙｕら、Ｃｅｌｌ、２００７、１３１：１１０９〜１１２３）。同様に、膠芽細胞腫中のＣＤ１３３^＋腫瘍開始細胞は、より蔓延しているＣＤ１３３⁻細胞を根絶させた照射に対して耐性があった（Ｂａｏら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．、２００６、６８：６０４３〜６０４８）。したがって、治療の状況において、腫瘍開始細胞の排除は、腫瘍の大部分を標的とするために使用するもの以外の標的化機構を必要とする可能性がある。

癌における長期的な患者の生存を有意に増加させる処置を開発するためには、腫瘍の再発および転移を担う腫瘍開始細胞がこの疾患の重要な治療標的となる。この要求を満たすために、本発明は、新規および既存の抗癌薬の有効性を試験するために使用できる、腫瘍開始細胞の単離および濃縮された集団を提供する。

本発明は、単離および濃縮された腫瘍開始細胞集団を提供する。本発明の一態様では、単離された腫瘍開始細胞集団は、少なくとも９０％の腫瘍開始細胞を含む腫瘍細胞集団に由来し、腫瘍開始細胞は、（ｉ）同じ起源の非腫瘍原性細胞よりも少なくとも２倍高いレベルで５Ｔ４を発現し、（ｉｉ）腫瘍原性であり、（ｉｉｉ）遊走が可能であり、（ｉｖ）自己複製が可能であり、（ｖ）非腫瘍原性細胞を含む腫瘍を生じる。本発明の別の態様では、腫瘍開始細胞および非腫瘍原性細胞を含む腫瘍細胞集団に由来する、濃縮された腫瘍開始細胞集団を提供し、腫瘍開始細胞は、（ｉ）同じ起源の非腫瘍原性細胞よりも少なくとも２倍高いレベルで５Ｔ４を発現し、（ｉｉ）腫瘍原性であり、（ｉｉｉ）遊走が可能であり、（ｉｖ）自己複製が可能であり、（ｖ）非腫瘍原性細胞を含む腫瘍を生じ、（ｖｉ）腫瘍細胞集団と比較して少なくとも２倍濃縮されている。また、単離または濃縮された腫瘍開始集団は、同じ起源の非腫瘍原性細胞よりも少なくとも２倍低いレベルでＣＤ２４を発現していても、および／またはＣＤ４４を発現していてもよい。

また、単離および濃縮された腫瘍開始細胞集団を調製する方法も提供する。たとえば、腫瘍開始細胞集団を単離または濃縮する代表的な方法には、（ａ）細胞の大多数が５Ｔ４を低レベルで発現し、細胞の少数が５Ｔ４を高レベルで発現する、解離した腫瘍細胞を提供するステップと、（ｂ）解離した腫瘍細胞を、５Ｔ４と特異的に結合する薬剤と接触させるステップと、（ｃ）低レベルよりも少なくとも約２倍高い、高レベルの５Ｔ４発現を示す程度まで（ｂ）の薬剤と特異的に結合する細胞を選択するステップとが含まれ、それにより、腫瘍開始細胞集団が単離または濃縮される。場合により、単離または濃縮された、５Ｔ４を発現する腫瘍開始細胞集団を調製する方法には、解離した腫瘍細胞を、ＣＤ４４と特異的に結合する薬剤と接触させるステップと、ＣＤ４４の発現を示す程度まで薬剤と特異的に結合する細胞を選択するステップとの、追加のステップが含まれる。場合により、単離または濃縮された、５Ｔ４を発現する腫瘍開始細胞集団を調製する方法には、解離した腫瘍細胞を、ＣＤ２４と特異的に結合する薬剤と接触させるステップと、同じ起源の非腫瘍原性細胞よりも少なくとも約５倍低い、低レベルのＣＤ２４発現を示す程度まで薬剤と特異的に結合する細胞を選択するステップとも含まれ得る。代替として、腫瘍開始細胞集団は、原発性腫瘍細胞を無血清条件下で培養することによって濃縮することができる。本発明のさらに別の代表的な方法では、５Ｔ４を発現する腫瘍開始細胞集団を単離または濃縮することには、解離した腫瘍細胞を、ＣＤ２４と特異的に結合する薬剤と接触させるステップと、同じ起源の非腫瘍原性細胞よりも少なくとも約５倍高い、高レベルのＣＤ２４発現を示す程度まで薬剤と特異的に結合する細胞を枯渇させるステップとが含まれ得る。

さらに、開示した単離または濃縮された腫瘍開始細胞集団を用いた、抗癌薬または候補抗癌薬の有効性を試験する方法を提供する。たとえば、そのような方法には、（ａ）単離または濃縮された腫瘍開始細胞集団を提供するステップと、（ｂ）腫瘍開始細胞を抗癌薬または候補抗癌薬と接触させるステップと、（ｃ）腫瘍開始細胞を抗癌薬または候補抗癌薬と接触させた後の、腫瘍開始細胞の腫瘍形成能の変化を観察するステップとが含まれ得る。

ＣＤ２４^−／低ＣＤ４４^＋細胞表現型がＨ４６０Ｔ非小細胞肺癌系（ＮＳＣＬＣ）中の腫瘍開始細胞を特徴づけることを示す図である。ＣＤ２４^−／低ＣＤ４４^＋細胞は「ＣＤ２４^−／低」と表示し、ＣＤ２４^高ＣＤ４４^＋細胞は「ＣＤ２４^高」と表示する。ＣＤ２４およびＣＤ４４の発現を用いたフローサイトメトリー分析の結果を示す。フローサイトメトリーならびに抗ＣＤ２４および抗ＣＤ４４抗体を用いた標識によって、明確に区別できるＨ４６０Ｔの集団が明らかとなった。 ＣＤ２４^−／低ＣＤ４４^＋細胞表現型がＨ４６０Ｔ非小細胞肺癌系（ＮＳＣＬＣ）中の腫瘍開始細胞を特徴づけることを示す図である。ＣＤ２４^−／低ＣＤ４４^＋細胞は「ＣＤ２４^−／低」と表示し、ＣＤ２４^高ＣＤ４４^＋細胞は「ＣＤ２４^高」と表示する。ＣＤ２４^−／低ＣＤ４４^＋細胞またはＣＤ２４^高ＣＤ４４^＋細胞の皮下移植を受けたマウスを示す。矢印は移植の部位である。 ＣＤ２４^−／低ＣＤ４４^＋細胞表現型がＨ４６０Ｔ非小細胞肺癌系（ＮＳＣＬＣ）中の腫瘍開始細胞を特徴づけることを示す図である。ＣＤ２４^−／低ＣＤ４４^＋細胞は「ＣＤ２４^−／低」と表示し、ＣＤ２４^高ＣＤ４４^＋細胞は「ＣＤ２４^高」と表示する。図１Ｂの観察の定量分析の結果を示す折れ線グラフである。値は、平均腫瘍測定値±ＳＥＭ（標準誤差）を示す。 ＣＤ２４^−／低ＣＤ４４^＋細胞表現型がＨ４６０Ｔ非小細胞肺癌系（ＮＳＣＬＣ）中の腫瘍開始細胞を特徴づけることを示す図である。ＣＤ２４^−／低ＣＤ４４^＋細胞は「ＣＤ２４^−／低」と表示し、ＣＤ２４^高ＣＤ４４^＋細胞は「ＣＤ２４^高」と表示する。Ｈ４６０Ｔ細胞中のＣＤ４４発現に基づいたＣＤ４４の腫瘍化を示す折れ線グラフである。ＣＤ２４^−／低ＣＤ４４^高およびＣＤ２４^−／低ＣＤ４４^低細胞を選別し、マウス内に皮下移植した。値は、平均腫瘍測定値±ＳＥＭを示す。 ＣＤ２４^−／低ＣＤ４４^＋細胞表現型がＨ４６０Ｔ非小細胞肺癌系（ＮＳＣＬＣ）中の腫瘍開始細胞を特徴づけることを示す図である。ＣＤ２４^−／低ＣＤ４４^＋細胞は「ＣＤ２４^−／低」と表示し、ＣＤ２４^高ＣＤ４４^＋細胞は「ＣＤ２４^高」と表示する。選別した集団のスフェロイドの成長を示す折れ線グラフである。ＦＡＣＳで単離したＣＤ２４^−／低ＣＤ４４＋またはＣＤ２４^高ＣＤ４４^＋細胞を懸濁液中で５日間培養して、スフェロイドの形成を促進した。直径０．２ｍｍのスフェロイドを２４ウェルプレートの個々のウェルに移し、２週間にわたる経時変化を測定した。値は、平均スフェロイド体積±ＳＤ（平均の標準偏差）を示す。 ＣＤ２４^−／低ＣＤ４４^＋細胞表現型がＨ４６０Ｔ非小細胞肺癌系（ＮＳＣＬＣ）中の腫瘍開始細胞を特徴づけることを示す図である。ＣＤ２４^−／低ＣＤ４４^＋細胞は「ＣＤ２４^−／低」と表示し、ＣＤ２４^高ＣＤ４４^＋細胞は「ＣＤ２４^高」と表示する。ｍＴＯＲ阻害剤ＣＣＩ−７７９に対するＣＤ２４^−／低ＣＤ４４^高およびＣＤ２４^−／低ＣＤ４４^低集団の示差的応答を示す折れ線グラフである。 ＣＤ２４^−／低ＣＤ４４^＋細胞表現型がＨ４６０Ｔ非小細胞肺癌系（ＮＳＣＬＣ）中の腫瘍開始細胞を特徴づけることを示す図である。ＣＤ２４^−／低ＣＤ４４^＋細胞は「ＣＤ２４^−／低」と表示し、ＣＤ２４^高ＣＤ４４^＋細胞は「ＣＤ２４^高」と表示する。トランスウェル遊走アッセイの結果を示す棒グラフである。ＣＤ２４^−／低ＣＤ４４^＋細胞は、血清に応答して効率的に遊走した。ＣＤ２４^−／低ＣＤ４４^＋値は、それぞれの実験についてＣＤ２４^高ＣＤ４４^＋に対して正規化した平均細胞数（±ＳＤ（ｎ＝４））を示す。 ＣＤ２４^−／低ＣＤ４４^＋細胞表現型がＨ４６０Ｔ非小細胞肺癌系（ＮＳＣＬＣ）中の腫瘍開始細胞を特徴づけることを示す図である。ＣＤ２４^−／低ＣＤ４４^＋細胞は「ＣＤ２４^−／低」と表示し、ＣＤ２４^高ＣＤ４４^＋細胞は「ＣＤ２４^高」と表示する。フィブロネクチンでコーティングしたスライド上にスフェロイドを置いた７２時間後の、ＣＤ２４^−／低ＣＤ４４^＋スフェロイドのフィブロネクチン上の効率的な遊走を示す顕微鏡写真である。 Ｈ４６０Ｔ中のＣＤ２４^−／低ＣＤ４４^＋細胞の多能性を示す図である。ＣＤ２４^−／低ＣＤ４４^＋細胞を「ＣＤ２４^−／低」と表示し、ＣＤ２４^高ＣＤ４４^＋細胞を「ＣＤ２４^高」と表示する。３週間の培養後の、ＣＤ２４^−／低ＣＤ４４^＋細胞およびＣＤ２４^高ＣＤ４４^＋のフローサイトメトリー分析の結果を示す。ＣＤ２４およびＣＤ４４発現に基づいて明確に区別できる集団が明らかとなる。 Ｈ４６０Ｔ中のＣＤ２４^−／低ＣＤ４４^＋細胞の多能性を示す図である。ＣＤ２４^−／低ＣＤ４４^＋細胞を「ＣＤ２４^−／低」と表示し、ＣＤ２４^高ＣＤ４４^＋細胞を「ＣＤ２４^高」と表示する。選別したＣＤ２４^−／低ＣＤ４４^＋細胞の代表的な腫瘍中のＣＤ２４およびＣＤ４４発現のフローサイトメトリー分析の結果を示す。 Ｈ４６０Ｔ中のＣＤ２４^−／低ＣＤ４４^＋細胞の多能性を示す図である。ＣＤ２４^−／低ＣＤ４４^＋細胞を「ＣＤ２４^−／低」と表示し、ＣＤ２４^高ＣＤ４４^＋細胞を「ＣＤ２４^高」と表示する。単一の選別したＣＤ２４^−／低ＣＤ４４^＋またはＣＤ２４^高ＣＤ４４^＋細胞から確立したクローン系におけるＣＤ２４およびＣＤ４４発現のフローサイトメトリー分析の結果を示す。移行中のＣＤ２４^−／低クローン中のＣＤ２４^高細胞の割合は、クローンに応じて１０〜７０％の範囲であった。それぞれのクローン中のＣＤ２４分布は、培養中で何カ月間も安定していた。 Ｈ４６０Ｔ中のＣＤ２４^−／低ＣＤ４４^＋細胞の多能性を示す図である。ＣＤ２４^−／低ＣＤ４４^＋細胞を「ＣＤ２４^−／低」と表示し、ＣＤ２４^高ＣＤ４４^＋細胞を「ＣＤ２４^高」と表示する。図２Ｃに示したクローン系の腫瘍増殖を示す折れ線グラフである。ＣＤ２４^−／低細胞をＣＤ２４^−／低クローンから選別し、ＣＤ２４^高細胞をＣＤ２４^高クローンから選別した。値は、平均腫瘍測定値±ＳＥＭを示す。Ｔｒは移行中のクローンであり、Ｓｔは安定したクローンである。 Ｈ４６０Ｔ中のＣＤ２４^−／低ＣＤ４４^＋細胞の多能性を示す図である。ＣＤ２４^−／低ＣＤ４４^＋細胞を「ＣＤ２４^−／低」と表示し、ＣＤ２４^高ＣＤ４４^＋細胞を「ＣＤ２４^高」と表示する。移行中のＣＤ２４^−／低クローンからＦＡＣＳで単離したＣＤ２４^−／低およびＣＤ２４^高細胞の腫瘍増殖を示す折れ線グラフである。値は、平均腫瘍測定値±ＳＥＭを示す。 ＣＤ２４発現に基づいて選別したＨ４６０Ｔ細胞の多能性を示す図である。実験設計の模式図である。選別した細胞を２．５μＭのＣＦＳＥ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、米国カリフォルニア州Ｃａｒｌｓｂａｄ）で標識し、十分に洗浄し、その後、別の選別した集団と共に親集団の比（１部のＣＤ２４^−／低ＣＤ４４^＋対３部のＣＤ２４^高ＣＤ４４^＋）で播種した。２．５μＭのＣＦＳＥは、この実験の時間経過にわたってＨ４６０Ｔ細胞の成長に対してわずかな影響しか与えなかった、または影響を与えなかった。３日後、培養物をＣＤ２４について分析し、初期集団をＣＦＳＥに基づいて識別することができた。 ＣＤ２４発現に基づいて選別したＨ４６０Ｔ細胞の多能性を示す図である。個々にまたは組み合わせて培養した、標識したおよび標識していない集団のフローサイトメトリー分析の結果を示す。 ＣＤ２４発現に基づいて選別したＨ４６０Ｔ細胞の多能性を示す図である。図３Ｂに示す反復実験のヒストグラムを示す。ＣＤ２４^−／低ＣＤ４４^＋細胞からＣＤ２４^高ＣＤ４４^＋への移行は、細胞を単独で培養した、またはＣＤ２４^高ＣＤ４４^＋もしくはＣＤ２４^−／低ＣＤ４４^＋細胞と共に同時培養した場合に比較可能であった。ＣＤ２４^高ＣＤ４４^＋細胞を単独で培養した、またはＣＤ２４^−／低ＣＤ４４^＋もしくはＣＤ２４^高ＣＤ４４^＋細胞と共に同時培養した場合に、ＣＤ２４^高ＣＤ４４^＋表現型の安定性が観察された。 ＣＤ２４^−／低が培養したＨＣＣ２４２９細胞中の腫瘍開始細胞を同定することを示す図である。ＣＤ２４発現に基づいたＨＣＣ２４２９のフローサイトメトリー分析の結果を示す。 ＣＤ２４^−／低が培養したＨＣＣ２４２９細胞中の腫瘍開始細胞を同定することを示す図である。ＣＤ２４^−／低ＣＤ４４^＋またはＣＤ２４^高ＣＤ４４^＋ＨＣＣ２４２９集団の示差的腫瘍原性を示す折れ線グラフである。値は、平均腫瘍測定値±ＳＥＭを示す。 ＣＤ２４^−／低が培養したＨＣＣ２４２９細胞中の腫瘍開始細胞を同定することを示す図である。分別の２週間後のＣＤ２４^−／低ＣＤ４４^＋またはＣＤ２４^高ＣＤ４４^＋集団のフローサイトメトリー分析の結果を示す。培養したＣＤ２４^−／低ＣＤ４４^＋細胞はＣＤ２４^高ＣＤ４４^＋へと移行することができるが、ＣＤ２４^高ＣＤ４４^＋はＣＤ２４^−／低ＣＤ４４^＋細胞へと移行しない。 ＣＤ２４^−／低ＣＤ４４^＋およびＣＤ２４^高ＣＤ４４^＋細胞から調製したｍＲＮＡ転写物の３つ組試料とハイブリダイズさせたＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ ＧＥＮＥＣＨＩＰ（登録商標）オリゴヌクレオチドアレイ上のＣＤ２４ ｍＲＮＡレベルを示す棒グラフである。 癌胎児性タンパク質５Ｔ４（ＴＰＢＧ）がＨ４６０Ｔ多能性腫瘍開始細胞中で発現されることを示す図である。ＣＤ２４^−／低ＣＤ４４＋およびＣＤ２４^高ＣＤ４４^＋細胞から調製したｍＲＮＡ転写物とハイブリダイズさせたＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ ＧＥＮＥＣＨＩＰ（登録商標）オリゴヌクレオチドアレイ上の５Ｔ４（ＴＰＢＧ）ｍＲＮＡレベルを示す棒グラフである。値は、３つ組試料の平均±ＳＤを示す。 癌胎児性タンパク質５Ｔ４（ＴＰＢＧ）がＨ４６０Ｔ多能性腫瘍開始細胞中で発現されることを示す図である。培地中で成長させた、またはビヒクルもしくはオールトランス型レチノイン酸で処理したＣＤ２４^−／低ＣＤ４４＋およびＣＤ２４^高ＣＤ４４^＋細胞中の５Ｔ４発現を検出するための、免疫ブロット分析の結果を示す。 未分化および分化した８７４２６初代培養細胞に関連する遺伝子発現プロファイルを示す図である。成長（左）および気液界面での分化（右）を促進する条件下でのＮＳＣＬＣの８７４２６初代培養物の顕微鏡写真を示す。スケールバーは２００μＭである。 未分化および分化した８７４２６初代培養細胞に関連する遺伝子発現プロファイルを示す図である。分化中の示した時点での５Ｔ４発現を検出するための、免疫ブロット分析の結果を示す。 未分化および分化した８７４２６初代培養細胞に関連する遺伝子発現プロファイルを示す図である。成長または分化の条件下で初代培養肺癌細胞から調製したｍＲＮＡ転写物とハイブリダイズさせたＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ ＧＥＮＥＣＨＩＰ（登録商標）オリゴヌクレオチドアレイ上のｍＲＮＡレベルを示す。値は平均±ＳＤを表す。ＦＮ１はフィブロネクチンであり、ＶＩＭはビメンチンである。 未分化および分化した８７４２６初代培養細胞に関連する遺伝子発現プロファイルを示す図である。細胞系培養物（Ｈ４６０Ｔ）および初代培養物（８７４２６Ａ１）の腫瘍モデル中の遺伝子発現を比較するための、遺伝子プロファイリング実験の結果を示す。実施例３を参照されたい。Ｈ４６０Ｔデータ組においてノイズレベルを超える遺伝子の発現の差異を比較した。統計的分析により偽発見率０．００１５が得られた。 未分化および分化した８７４２６初代培養細胞に関連する遺伝子発現プロファイルを示す図である。分化の０、１２、および２４日目における８７４２６細胞の無血清初代培養物中のＣＤ２４およびＣＤ４４のｍＲＮＡレベルを示す棒グラフである。培養物を、細胞を気液界面に曝さずに、ＢＥＢＭ成長培地中で維持したか、または５０ｎＭのレチノイン酸および１ｍＭのＣａＣｌ_２を含有するＣｎＴ−２３培地中で１２および２４日間分化させた。 未分化および分化した８７４２６初代培養細胞に関連する遺伝子発現プロファイルを示す図である。図７Ｄに示した実験の２つ組試料中のＣＤ２４およびＣＤ４４発現の分布を示す。単層培養物としての１２日間の分化後、細胞表面のＣＤ２４発現のレベルが増加し、２４日目まで保持された。ＣＤ４４発現の細胞表面レベルは１２日目までに減少し、２４日間の分化によってさらに低下した。 未分化および分化した８７４２６初代培養細胞に関連する遺伝子発現プロファイルを示す図である。分化の０、１２、および２４日目における８７４２６細胞の無血清初代培養物中の血管形成因子のｍＲＮＡレベルを示す棒グラフである。ｍＲＮＡのレベルは、実施例６に記載の遺伝子発現プロファイリングを用いて決定した。 ＮＳＣＬＣ一次移植異種移植片中の異種５Ｔ４発現を示す図である。３７６２２系からの解離した異種移植片（左パネル）、無血清培地中の３７６２２異種移植片から確立した培養細胞（中央パネル、５週間の培養後に示す）、および無血清培養物の移植した細胞の異種移植片（右パネル）中の５Ｔ４発現のフローサイトメトリー分析を示す。 ＮＳＣＬＣ一次移植異種移植片中の異種５Ｔ４発現を示す表である。解離した３７６２２または６０２５７異種移植片の５Ｔ４^高または５Ｔ４^低細胞を移植した動物における腫瘍発生率を示す（＃１、＃２は反復実験を示す）。 Ｓｏｘ−２がＣＤ２４^−／低細胞の分化を誘発することを示す図である。ＣＤ２４^−／低クローンから調製した転写物とハイブリダイズさせたＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ ＧＥＮＥＣＨＩＰ（登録商標）オリゴヌクレオチドアレイのＳｏｘ−２ ｍＲＮＡレベルを示す棒グラフである。 Ｓｏｘ−２がＣＤ２４^−／低細胞の分化を誘発することを示す図である。Ｓｏｘ−２−Ｆｌａｇ、Ｓｏｘ−１１−Ｆｌａｇ、空のベクター、またはＤＮＡなしで形質移入した安定したＣＤ２４^−／低クローン中のＳｏｘ−２およびＳｏｘ−１１の転写物を検出するための、免疫ブロット分析の結果を示す。細胞を形質移入の２４時間後に収集し、抗Ｆｌａｇ（上部）または抗β−アクチン抗体を用いた免疫ブロットに供した。 Ｓｏｘ−２がＣＤ２４^−／低細胞の分化を誘発することを示す図である。Ｓｏｘ−２−Ｆｌａｇ、Ｓｏｘ−１１−Ｆｌａｇ、空のベクター、またはＤＮＡなしで形質移入した安定したＣＤ２４^−／低クローン中の、３週間培養した後のＣＤ２４のフローサイトメトリー分析の結果を示す。 Ｓｏｘ−２がＣＤ２４^−／低細胞の分化を誘発することを示す図である。それぞれの試料中のＣＤ２４^高細胞のパーセンテージを示す、図９Ｃに示したデータのヒストグラムを示す。 抗５Ｔ４−カリチアマイシンのコンジュゲートに対するＣＤ２４^−／低ＣＤ４４^＋細胞の感度を示す図である。ＣＤ２４^−／低ＣＤ４４^＋細胞を「ＣＤ２４^−／低」と表示し、ＣＤ２４^高ＣＤ４４^＋細胞を「ＣＤ２４^高」と表示する。４日間のＭＴＳアッセイの結果を示す折れ線グラフである。十字線は、遊離カリチアマイシンに対する感度を示す。 抗５Ｔ４−カリチアマイシンのコンジュゲートに対するＣＤ２４^−／低ＣＤ４４^＋細胞の感度を示す図である。ＣＤ２４^−／低ＣＤ４４^＋細胞を「ＣＤ２４^−／低」と表示し、ＣＤ２４^高ＣＤ４４^＋細胞を「ＣＤ２４^高」と表示する。クローン原性アッセイの結果を示す折れ線グラフである。十字線は、遊離カリチアマイシンに対する感度を示す。 Ｈ４６０Ｔ親細胞系よりも高い発現を示したＨ４６０Ｔクローン系２４Ｎ−２６における、５Ｔ４^高および５Ｔ４^低細胞の腫瘍増殖を示す折れ線グラフである。細胞を５Ｔ４発現に基づいて選別し、マウスに皮下移植した。値は、平均腫瘍測定値±ＳＥＭを示す。 抗５Ｔ４抗体−カリチアマイシンのコンジュゲートで処理した一次移植異種移植片の腫瘍体積の退縮を示す図である。菱形はビヒクルであり、四角は抗５Ｔ４−カリチアマイシンのコンジュゲートであり、丸は抗ＣＤ３３−カリチアマイシンのコンジュゲートであり、三角形はシスプラチンであり、アスタリスク（^＊）はｐ＜０．０５である。抗５Ｔ４抗体−カリチアマイシンのコンジュゲートで処理した後の、３７６２２異種移植片の腫瘍体積の退縮を示す折れ線グラフである。ステージング後の１、５、および９日目に、動物に抗５Ｔ４抗体−カリチアマイシンのコンジュゲートを投与した。値は、平均腫瘍体積±ＳＥＭを示す。 抗５Ｔ４抗体−カリチアマイシンのコンジュゲートで処理した一次移植異種移植片の腫瘍体積の退縮を示す図である。菱形はビヒクルであり、四角は抗５Ｔ４−カリチアマイシンのコンジュゲートであり、丸は抗ＣＤ３３−カリチアマイシンのコンジュゲートであり、三角形はシスプラチンであり、アスタリスク（^＊）はｐ＜０．０５である。抗５Ｔ４抗体−カリチアマイシンのコンジュゲートで処理した後の、６０２７４異種移植片の腫瘍体積の退縮を示す折れ線グラフである。ステージング後の１、５、および９日目に、動物に抗５Ｔ４抗体−カリチアマイシンのコンジュゲートを投与した。値は、平均腫瘍体積±ＳＥＭを示す。 抗５Ｔ４抗体−カリチアマイシンのコンジュゲートで処理した一次移植異種移植片の腫瘍体積の退縮を示す図である。菱形はビヒクルであり、四角は抗５Ｔ４−カリチアマイシンのコンジュゲートであり、丸は抗ＣＤ３３−カリチアマイシンのコンジュゲートであり、三角形はシスプラチンであり、アスタリスク（^＊）はｐ＜０．０５である。抗５Ｔ４抗体−カリチアマイシンのコンジュゲートで処理した後の、６０２７４異種移植片の腫瘍体積の退縮を示す折れ線グラフである。ステージング後の１、５、および９日目に、動物に抗５Ｔ４抗体−カリチアマイシンのコンジュゲートを投与した。値は、平均腫瘍体積±ＳＥＭを示す。 ＮＳＣＬＣ一次移植系３７６２２、６０２７４、および６０２５７の複数の腫瘍（Ｔ１、Ｔ２、Ｔ３）の転写物とハイブリダイズさせたＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ ＧＥＮＥＣＨＩＰ（登録商標）オリゴヌクレオチドアレイ上の５Ｔ４（ＴＰＢＧ）ｍＲＮＡレベルを示す棒グラフである。３７６２２異種移植片はヌードマウスのものであり、６０２７４および６０２５７異種移植片はｎｏｄ−ｓｃｉｄマウスのものであった。

本発明は、癌胎児性抗原５Ｔ４を発現し、場合によりＣＤ４４および低レベルのＣＤ２４も発現する腫瘍開始細胞の予測的同定の方法を提供する。これらの細胞は、ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏで腫瘍原性が高く、自己複製し、遊走が可能であり、分化する能力を有する。また、開示した腫瘍開始細胞集団は、アポトーシス耐性を示し、癌の再発および転移に寄与し得る。また、腫瘍開始細胞集団を単離する方法および集団中で腫瘍開始細胞を濃縮する方法も提供する。さらに、新規腫瘍開始細胞マーカーを提供する。

本明細書中に開示する腫瘍開始細胞集団は、腫瘍の増殖、再発、および転移に対する治療剤の効果を研究するために有用である。単離された腫瘍開始細胞は、腫瘍開始細胞を標的とする抗体を作製するために使用できる、ユニークな治療標的を同定するために使用できる。また、単離された腫瘍開始細胞は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ活性に基づいてまたは非腫瘍原性細胞を含めた腫瘍集団の細胞毒性に基づいて選択した薬物が、ｉｎ ｖｉｖｏでの疾患の根絶および再発の予防に成功する確率を向上させるためのスクリーニングアッセイにも使用することができる。また、患者から単離された腫瘍開始細胞を用いて、疾患の結果および／または既知の治療に対する感度を予想し得る。

Ｉ．腫瘍開始細胞
腫瘍開始細胞とは、（１）増殖または発達の潜在性が低下した１つまたは複数の種類の子孫を生じることができる細胞（たとえば分化した細胞）、（２）大規模な増殖能力を有する細胞、および（３）自己複製または自己維持が可能な細胞を意味することが、当分野で知られている。たとえばＰｏｔｔｅｎら、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ、１９９０、１１０：１００１〜１０２０を参照されたい。したがって、腫瘍開始細胞は、正常な組織の機能中に失われる細胞を常に補充する、成体組織中に見つかる幹細胞（血液、内臓、乳管系、および皮膚の細胞が含まれる）の特性を共有する。

幹細胞の分化による成体細胞の再生の最も知られている例は、造血系である。造血幹細胞および前駆細胞などの発達的に未成熟な前駆体が分子シグナルに応答して、様々な血液およびリンパ球の細胞種が徐々に形成される。また、幹細胞は、上皮組織（Ｓｌａｃｋ、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２０００、２８７：１４３１〜１４３３）および間葉組織（米国特許第５，９４２，２２５号）を含めた他の組織中にも見つかる。癌幹細胞は、たとえば、正常な幹細胞中の遺伝子損傷が原因で、または幹細胞および／もしくは分化した細胞の調節不全の増殖によって、これらの細胞種のうちの任意のものから生じ得る。

本発明の腫瘍開始細胞は、腫瘍原性幹細胞、すなわち、大規模または無制限に増殖する能力を有し、大多数の癌細胞を生じさせる多能性細胞を含む、任意の癌に由来し得る。確立された腫瘍内では、ほとんどの細胞は大規模に増殖して新しい腫瘍を形成する能力を失っており、腫瘍開始細胞の小さな部分組が増殖し、それにより、腫瘍開始細胞を再生させ、腫瘍形成能を欠く腫瘍細胞を生じさせる。腫瘍開始細胞は非対称的および対称的に分裂し、可変性の増殖速度を示し得る。

腫瘍開始細胞とは対照的に、非腫瘍原性腫瘍細胞は、免疫不全宿主内に移植した際に触知可能な腫瘍を形成することができず、同数の分画していない解離した癌細胞を同じ状況下で移植した場合、腫瘍開始細胞は同じ期間で触知可能な腫瘍を形成する。触知可能な腫瘍は、取り扱う、触診する、または感じることができる腫瘍として医学分野の技術者に知られている。また、非腫瘍原性細胞は、腫瘍開始細胞と比較して減少した遊走を示し、腫瘍開始細胞を生じることができず、分化マーカーの発現の増加も示す。

腫瘍開始細胞を単離し得る代表的な癌には、肺、卵巣、結腸直腸、および胃の腫瘍などの５Ｔ４発現腫瘍を含めた、固形腫瘍によって特徴づけられた癌が含まれる。腫瘍開始細胞を単離し得るさらなる代表的な癌には、聴神経腫、急性リンパ芽球性白血病、急性骨髄性白血病、急性骨髄性白血病、腺癌、腺扁平上皮癌、副腎皮質癌、ＡＩＤＳ関連リンパ腫、肛門癌、血管肉腫、星細胞腫、Ｂ細胞リンパ腫および白血病、基底細胞癌、類基底癌、胆管癌、胆管癌腫、膀胱癌、膀胱癌腫、脳腫瘍、乳癌、気管支原性癌、巨大病変ＮＨＬおよびワルデンストレームマクログロブリン血症、癌肉腫、小脳星細胞腫、大脳星細胞腫、子宮頚癌、軟骨肉腫、脊索腫、絨毛癌、慢性白血球性白血病、慢性リンパ球性白血病、慢性骨髄性白血病、明細胞癌、結腸癌、結腸直腸癌、頭蓋咽頭腫、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、嚢胞腺癌、胚性癌腫、子宮内膜癌、内皮肉腫、上衣腫、上皮肉腫、食道癌、ユーイング肉腫、ユーイング腫瘍、線維肉腫、胆嚢癌、妊娠性栄養芽細胞腫瘍、巨細胞癌、神経膠腫、有毛細胞白血病、血管芽腫、乳児期および小児期の血管腫、造血悪性疾患、急性リンパ芽球性白血病を含めた造血悪性疾患、肝細胞癌、高悪性度免疫芽細胞ＮＨＬ、高悪性度リンパ芽球性ＮＨＬ、高悪性度小型非切れ込み細胞ＮＨＬ、ホジキンリンパ腫、それだけには限定されないが低悪性度／濾胞性非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、中悪性度拡散性ＮＨＬ、中悪性度／濾胞性ＮＨＬを含めた下咽頭癌、島細胞癌、カポジ肉腫、腎臓癌、ラブドイド表現型を有する大細胞癌、大細胞肺癌、咽頭癌、平滑筋肉腫、脂肪肉腫、肝臓癌、肺癌、肺癌腫、リンパ管内皮肉腫、リンパ管肉腫、リンパ芽球性白血病、リンパ球性白血病、リンパ上皮腫様癌、悪性黒色腫、悪性中皮腫、悪性胸腺腫、髄様癌、髄芽腫、黒色腫、髄膜腫、中皮腫、単球性白血病、多発性骨髄腫、菌状息肉腫、骨髄性白血病、粘液肉腫、上咽頭癌、神経芽細胞腫、非ホジキンリンパ腫、非小細胞肺癌、乏突起神経膠腫、口腔癌、口咽頭癌、骨原性肉腫、骨肉腫、卵巣癌、上皮性卵巣癌、卵巣生殖細胞腫瘍、膵癌、膵癌腫、乳頭腺癌、乳頭癌、副甲状腺癌、陰茎癌、松果体腫、下垂体腫瘍、前骨髄急性白血病、前立腺癌、前立腺癌、肺芽細胞腫、直腸癌、腎細胞癌、網膜芽細胞腫、横紋筋肉腫、唾液腺癌、肉腫、皮脂腺癌、精上皮腫、皮膚癌、小細胞肺癌、小細胞肺癌腫、小腸癌、小リンパ球性（ＳＬ）ＮＨＬ、軟組織肉腫、扁平細胞癌、扁平細胞肺癌、胃癌、汗腺癌、滑膜腫、精巣癌、甲状腺癌、子宮癌、子宮肉腫、膣癌、外陰部癌、ならびにウィルムス腫瘍が含まれる。

また、腫瘍開始細胞は、増殖性疾患、すなわち、細胞分裂または増殖の制御の欠如または不良によって特徴づけられた、障害および疾患の多様なクラスに関連する細胞にも由来し得る。増殖性疾患には、強皮症、関節炎、若年性関節炎、痛風性関節炎、および肝硬変を含めた様々な線維性状態などの、結合組織の過成長に関連する障害、ならびに再狭窄、動脈硬化症、および増殖性糖尿病性網膜症などの状態が含まれる。

Ｉ．Ａ．腫瘍開始細胞マーカー
腫瘍開始細胞は、陽性および陰性の分子マーカーを用いて選択し得る。腫瘍開始細胞陽性マーカー（すなわち、腫瘍開始細胞によって、非腫瘍原性細胞または分化した細胞と比較して上昇したレベルで発現されるマーカー）と結合する試薬は、腫瘍開始細胞の選択に使用することができる。また、腫瘍開始細胞陽性マーカーは、非腫瘍原性癌細胞、すなわち腫瘍開始細胞以外の癌細胞上にも存在していてよいが、そのレベルは低下している。広く発現されるマーカーは、腫瘍開始細胞中で発現レベルの測定可能な変化を示し得る、および／またはさらなる陽性もしくは陰性のマーカーと組み合わせて使用した場合に腫瘍開始細胞の分解能を提供し得る。腫瘍開始細胞陰性マーカー（すなわち、腫瘍開始細胞によって発現されないまたは測定可能に低下したレベルで発現されるマーカー）と結合する試薬は、集団中の腫瘍開始細胞ではない腫瘍細胞の排除に使用することができる。陽性および陰性の分子マーカーを用いた選択では、有用なマーカーには、生細胞が分別および追跡を受け入れるように、細胞表面上に発現されるものが含まれる。

免疫ブロットなどの技法を用いて発現レベルを評価する場合、腫瘍開始細胞陽性マーカーは、典型的には、同じ起源の分化した細胞または非腫瘍原性細胞よりも少なくとも約２倍高い、たとえば、少なくとも約４倍高い、または少なくとも約５倍高い、または少なくとも約８倍高い、または少なくとも約１０倍高い、または少なくとも約１５倍高い、または少なくとも約２０倍高い、または少なくとも約５０倍高い、または少なくとも約１００倍高いレベルで発現される。フローサイトメトリーを用いて発現レベルを評価する場合、腫瘍開始細胞陽性マーカーは、典型的には、同じ起源の分化した細胞または非腫瘍原性細胞よりも少なくとも約０．５ｌｏｇ高い、たとえば、少なくとも約１ｌｏｇ高い、少なくとも約１．５ｌｏｇ高い、少なくとも約２ｌｏｇ高い、または少なくとも約３ｌｏｇ高いレベルで発現される。逆に、免疫ブロットなどの技法を用いて発現レベルを評価する場合、腫瘍開始細胞陰性マーカーは、典型的には、同じ起源の分化した細胞または非腫瘍原性細胞よりも少なくとも約２倍少ない、たとえば、少なくとも約４倍少ない、または少なくとも約８倍少ない、または少なくとも約１０倍少ない、または少なくとも約１５倍少ない、または少なくとも約２０倍少ない、または少なくとも約５０倍少ない、または少なくとも約１００倍少ないレベルで発現される。フローサイトメトリーを用いて発現レベルを評価する場合、腫瘍開始細胞陰性マーカーは、典型的には、同じ起源の分化した細胞または非腫瘍原性細胞よりも少なくとも約０．５ｌｏｇ低い、たとえば、少なくとも約１ｌｏｇ低い、少なくとも約１．５ｌｏｇ低い、少なくとも約２ｌｏｇ低い、または少なくとも約３ｌｏｇ低いレベルで発現される。

本明細書中では、腫瘍開始細胞を肺から予測同定および単離するために単独でまたは組み合わせて使用することができる、５Ｔ４、ＣＤ４４、およびＣＤ２４マーカーを開示する。５Ｔ４およびＣＤ４４の発現は陽性マーカーである一方で、ＣＤ２４の発現は陰性マーカーである。したがって、本発明の腫瘍開始細胞には、高レベルの５Ｔ４を発現する（５Ｔ４^高）、中等度から高レベルのＣＤ４４を発現する（ＣＤ４４^＋）、および／またはＣＤ２４をわずかに発現するもしくは発現しない（ＣＤ２４^−／低）ものが含まれる。

５Ｔ４癌胎児性抗原は、４２ｋＤａのグリコシル化されていないコアを含む、７２ｋＤａの高度にグリコシル化された膜貫通糖タンパク質である（Ｈｏｌｅら、Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ、１９８８、５７：２３９〜４６、Ｈｏｌｅら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ、１９９０、４５：１７９〜８４、ＰＣＴ国際公開ＷＯ８９／０７９４７号、米国特許第５，８６９，０５３号）。ヒト５Ｔ４は、膀胱、乳房、子宮頚部、子宮内膜、肺、食道、卵巣、膵臓、胃、および精巣の癌を含めた数々の癌種で発現されており、胎盤中のシンシチウム栄養芽層以外では、正常組織には実質的に存在しない（たとえば、Ｓｏｕｔｈａｌｌら、Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ、１９９０、６１：８９〜９５（ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｌｏｇｉｃａｌ ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ ｏｆ ５Ｔ４ ａｎｔｉｇｅｎ ｉｎ ｎｏｒｍａｌ ａｎｄ ｍａｌｉｇｎａｎｔ ｔｉｓｓｕｅｓ）、Ｍｉｅｋｅら、Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．、１９９７、３：１９２３〜１９３０（ｌｏｗ ｉｎｔｅｒｃｅｌｌｕｌａｒ ａｄｈｅｓｉｏｎ ｍｏｌｅｃｕｌｅ １ ａｎｄ ｈｉｇｈ ５Ｔ４ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｎ ｔｕｍｏｒ ｃｅｌｌｓ ｃｏｒｒｅｌａｔｅ ｗｉｔｈ ｒｅｄｕｃｅｄ ｄｉｓｅａｓｅ−ｆｒｅｅ ｓｕｒｖｉｖａｌ ｉｎ ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ ｃａｒｃｉｎｏｍａ ｐａｔｉｅｎｔｓ）、Ｓｔａｒｚｙｎｓｋａら、Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ、１９９４、６９：８９９〜９０２（ｐｒｏｇｎｏｓｔｉｃ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅ ｏｆ ５Ｔ４ ｏｎｃｏｆｅｔａｌ ａｎｔｉｇｅｎ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、Ｓｔａｒｚｙｎｓｋａら、Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ、１９９２、６６：８６７〜８６９（ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ５Ｔ４ ａｎｔｉｇｅｎ ｉｎ ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ ａｎｄ ｇａｓｔｒｉｃ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、Ｊｏｎｅｓら、Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ、１９９０、６１：９６〜１００（ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ５Ｔ４ ａｎｔｉｇｅｎ ｉｎ ｃｅｒｖｉｃａｌ ｃａｎｃｅｒ）、ＣｏｎｎｏｒおよびＳｔｅｒｎ、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ、１９９０、４６：１０２９〜１０３４（ｌｏｓｓ ｏｆ ＭＨＣ ｃｌａｓｓ−Ｉ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｃｅｒｖｉｃａｌ ｃａｒｃｉｎｏｍａｓ）、Ａｌｉら、Ｏｒａｌ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ、２００１、３７：５７〜６４（ｐａｔｔｅｒｎ ｏｆ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ５Ｔ４ ｏｎｃｏｆｅｔａｌ ａｎｔｉｇｅｎ ｏｎ ｎｏｒｍａｌ，ｄｙｓｐｌａｓｔｉｃ ａｎｄ ｍａｌｉｇｎａｎｔ ｏｒａｌ ｍｕｃｏｓａ）、ＰＣＴ国際公開ＷＯ８９／０７９４７号、米国特許第５，８６９，０５３号を参照）。たとえば、５Ｔ４の発現を有さないと報告されている組織には、肝臓、皮膚、脾臓、胸腺、中枢神経系（ＣＮＳ）、副腎、および卵巣が含まれる。局所的または低い５Ｔ４の発現を有すると報告されている組織には、肝臓、皮膚、脾臓、リンパ節、扁桃腺、甲状腺、前立腺、および精嚢が含まれる。弱い〜中等度の拡散した５Ｔ４の発現が、腎臓、肺、膵臓、咽頭、および胃腸管中で報告されている。高い５Ｔ４の発現を有すると報告されている唯一の組織はシンシチウム栄養芽層であり、また、５Ｔ４は正常な血清または妊娠した女性の血清にも存在しなかった（すなわち、レベルは＜１０ｎｇ／ｍｌであった）。腫瘍中の５Ｔ４の過剰発現は疾患の進行と相関されており、５Ｔ４発現の評価が、予後不良を有する患者の同定に有用な手法として示唆されている。たとえば、Ｍｕｌｄｅｒら、Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．、１９９７、３：１９２３〜１９３０、Ｎａｇａｎｕｍａら、Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．、２００、２２：１０３３〜１０３８、Ｓｔａｒｚｙｎｓｋａら、Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ、１９９４、６９：８９９〜９０２、Ｓｔａｒｚｙｎｓｋａら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ．Ｈｅｐａｔｏｌ．、１９９８、１０：４７９〜４８４、Ｗｒｉｇｌｅｙら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｇｙｎｅｃｏｌ．Ｃａｎｃｅｒ、１９９５、５：２６９〜２７４を参照されたい。

ＣＤ４４は、細胞の接着性、運動性、マトリックス分解、増殖、および／または細胞生存を変調することによって癌の転移に関与する膜貫通糖タンパク質である。たとえばＭａｒｈａｂａおよびＺｏｌｌｅｒ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｈｉｓｔｏｌ．、２００４、３５（３）：２１１〜２３１を参照されたい。ＣＤ２４抗原は、陰性マーカーとして使用される分化の細胞表面糖タンパク質マーカーである、すなわち、腫瘍開始細胞はＣＤ２４発現をわずかに示すまたは示さない（ＣＤ２４^−／低）。ＣＤ４４およびＣＤ２４^−／低を発現する細胞は、単独でまたは組み合わせて、乳房、結腸、頭頚部、および膵臓の腫瘍を含めた多くの腫瘍型中の腫瘍開始細胞を同定するために使用されている。たとえば、Ａｌ−Ｈａｊｊら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、２００３、１００：３９８３〜３９８８、Ｙｕら、Ｃｅｌｌ、２００７、１３１：１１０９〜１１２３、Ｄａｌｅｒｂａら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、２００７、１０４：１０１５８〜１０１６３、Ｐｒｉｎｃｅら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、２００７、１０４：９７３〜９７８、およびＬｉら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．、２００７、６７：１０３０〜１０３７を参照されたい。

本明細書中に記載の５Ｔ４およびＣＤ４４^＋マーカーに加えて、肺癌における他の潜在的な腫瘍開始細胞陽性マーカーには、ＳＬＵＧ、フィブロネクチン（ＦＮ１）、およびビメンチン（ＶＩＭ）（図７Ｃを参照）、血管内皮成長因子Ａ（ＶＥＧＦ−Ａ）、血管内皮成長因子Ｂ（ＶＥＧＦ−Ｂ）、血管内皮成長因子Ｃ（ＶＥＧＦ−Ｃ）、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、およびインスリン様成長因子−Ｉ（ＰＩＧＦ）（図７Ｆを参照）、ＣＤ１３３（Ｅｒａｍｏら、Ｃｅｌｌ Ｄｅａｔｈ Ｄｉｆｆｅｒ．、２００８、１５：５０４〜５１４を参照）、ならびにＣＤ１１７（Ｄｏｎｎｅｎｂｅｒｇら、Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｒｅｌｅａｓｅ、２００７、１２２（３）：３８５〜３９１）が含まれる。肺癌における代表的なさらなる潜在的な陽性腫瘍開始細胞マーカーには、トランスフォーミング成長因子βＩＩＩ型受容体（ＴＧＦβＲＩＩＩ）、ネトリン受容体ＵＮＣ５Ｄ（Ｕｎｃ５Ｄ）、パタチン様ホスホリパーゼドメイン含有タンパク質４（ＰＮＰＬＡ４）、内向き整流性カリウムチャネル２（ＫＣＮＪ２）、ガンマ−アミノ酪酸（ＧＡＢＡ）Ａ受容体、ベータ３（ＧＡＢＲＢ３）、ジヒドロピリミジンデヒドロゲナーゼ（ＤＰＹＤ）、精子関連抗原１（ＳＰＡＧ１）、腸管細胞（ＭＡＫ様）キナーゼ（ＩＣＫ）、スタニオカルシン２（ＳＴＣ２）、デフェンシンβ１（Ｄｅｆβ１）、およびＦＬＪ３８７３６が含まれる。実施例５を参照されたい。

さらなる陽性腫瘍開始細胞マーカーには、ＣＤ１３３（Ｂａｏら、Ｎａｔｕｒｅ、２００６、４４４：７５６〜７６０、Ｏ’Ｂｒｉｅｎら、Ｎａｔｕｒｅ、２００７、４４５：１０６〜１１０、Ｒｉｃｃｉ−Ｖｉｔｉａｎｉら、Ｎａｔｕｒｅ、２００７、４４５：１１１〜１１５、およびＨｅｒｍａｎｎら、Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ、２００７、１：３１３〜３２３）、ＡＬＤＨ１（Ｙｕら、Ｃｅｌｌ
２００７、１３１：１１０９〜１１２３）、ＥｐＣＡＭ^高（Ｄａｌｅｒｂａら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、２００７、１０４：１０１５８〜１０１６３）、上皮に特異的な抗原（ＥＳＡ、Ｌｉら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．、２００７、６７：１０３０〜１０３７）、ＣＤ９０（Ｌｉら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．、２００７、６７：１０３０〜１０３７）、ＡＢＣＧ５（Ｓｃｈａｔｔｏｎら、Ｎａｔｕｒｅ、２００８、４５１：３４５〜３４９）、ＡＢＣＧ２（Ｐａｔｒａｗａｌａら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．、２００５、６５（１４）：６２０７〜６２１９、Ｋｏｎｄｏら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．、２００４、１０１（３）：７８１〜７８６）、ＶＥＧＦ受容体−１（ＶＥＧＦＲ−１）、ＶＥＧＦＲ−２、ＶＥＧＦＲ−３、および血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）（図７ＦおよびＡｎｄｅｒｓｅｎら、Ｊ．Ｔｈｏｒａｃ．Ｏｎｃｏｌ．、２００９、［印刷前の電子出版］を参照）、ニューロンに特異的なエノラーゼ（ＮＳＥ）、サイトケラチン１９断片（ＣＹＦＲＡ）、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、扁平細胞癌抗原（ＳＣＣ）、ＣＡ１２５、ＣＡ１５．３およびＴＡＧ−７２．３（Ｍｏｌｉｎａら、Ｔｕｍｏｕｒ Ｂｉｏｌ．、２００８、２９（６）：３７１〜３８０を参照）、ＶＬＡ−２、Ｔｗｅａｋ（ＴＮＦ様アポトーシス弱誘導因子）、ＥｐｈＢ２、ＥｐｈＢ３、ヒトＳｃａ−１（ＢＩＧ１）、ＣＤ３４、β１インテグリン（ＣＤ２９）、ＣＤ１５０、ＣＸＣＲ４、ならびに表１および２に記載の分化した初代培養物に逆相関されている遺伝子組のメンバーが含まれる。実施例３および５を参照されたい。

低いまたは陰性の発現に基づいて腫瘍開始細胞の選択に使用し得るマーカーには、分化したまたは非腫瘍原性細胞中で発現される任意の遺伝子が含まれる。数々のそのような分子が当分野で知られている。本明細書中に記載のＣＤ２４^−／低マーカーに加えて、さらなる肺癌の腫瘍開始細胞陰性マーカーには、ＭＵＣ１／ＣＤ２２７およびサイトケラチン４（ＫＲＴ４）が含まれる（図７ＣおよびＫｕｅｍｍｅｌら、Ｌｕｎｇ Ｃａｎｃｅｒ、２００９、６３（１）：９８〜１０５を参照）。肺癌の腫瘍開始細胞の単離または濃縮に有用なさらなるマーカーには、ＣＥＡ、ＳＬＸ、ＣＹＦＲＡ、ＳＣＣ、プロガストリン放出ペプチド（ＰｒｏＧＲＰ）が含まれる。ＫｏｍａｇａｔａおよびＹｏｎｄｅａ、Ｇａｎ Ｔｏ Ｋａｇａｋｕ Ｒｙｏｈｏ、２００４、３１（１０）：１６０９〜１６１３を参照されたい。低いまたは陰性の発現に基づいて腫瘍開始細胞の選択に使用し得るさらなる代表的なマーカーには、表１および２に記載の分化した初代培養物に相関されている遺伝子組のメンバーが含まれる。実施例３および５を参照されたい。

また、上述のマーカーは、肺癌以外の癌における腫瘍開始細胞の同定にも使用することができる。

結腸もしくは結腸直腸癌または他の癌の場合、腫瘍開始細胞の同定に有用であり得るさらなる陽性マーカーには、プロスタグランジンＦ２受容体調節タンパク質（ＰＴＧＦＲＮ）、ＣＤ１６６（または活性白血球接着分子、ＡＬＣＡＭ）、ＣＤ１６４、ＣＤ８２、トランスフォーミング成長因子ベータ受容体１（ＴＧＦＢＲ１）、ＭＥＴ、エフリン−Ｂ２（ＥＦＮＢ２）、インテグリンアルファ６（ＩＴＧＡ６、ＣＤ４９ｆ）、奇形癌由来成長因子１（ＴＤＧＦｌ）、ヘパリン結合ＥＧＦ様成長因子（ＨＢＥＧＦ）、ＡＢＣファミリートランスポーターＡＢＣＣ４、ＡＢＣファミリートランスポーターＡＢＣＤ３、腫瘍示差的発現遺伝子２（ＴＤＥ２）、インテグリンベータ１（ＩＴＧＢ１）、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリー２１（ＴＮＦＲＳＦ２１）、ＣＤ８１およびＣＤ９（膜貫通−４スーパーファミリーのメンバー（ＴＭ４ＳＦまたはテトラスパニン））、ＫＩＡＡ１３２４、癌胎児性抗原関連細胞接着分子６（ＣＥＡＣＡＭ６）、ＦＺＤ６およびＦＺＤ７（Ｗｎｔ受容体）、ＢＭＰＲ１Ａ、ＪＡＧ１、インテグリンアルファＶ（ＩＴＧＡＶ）、ＮＯＴＣＨ２、ＳＯＸ４、ＨＥＳ１、ＨＥＳ６、アトーナル（ａｔｏｎａｌ）ホモログ１（ＡＴＯＨ１）、Ｅ−カドヘリン（ＣＤＨ１）、Ｅｐｈ受容体Ｂ２（ＥＰＨＢ２）、ｖ−ｍｙｂ骨髄芽球症ウイルス癌遺伝子ホモログ（ＭＹＢ）、ＭＹＣ、ＳＯＸ９、ＰＣＧＦ１、ＰＣＧＦ４、ＰＣＧＦ５、ＡＬＤＨ１Ａ１、ならびにＳＴＲＡＰが含まれる。結腸または結腸直腸癌における腫瘍開始細胞の同定に有用なさらなる陰性マーカーは、Ｔ細胞因子４（ＴＣＦ４）である。たとえばＰＣＴ国際公開ＷＯ０７／０５３６４８号を参照されたい。

本発明の特定の態様では、単離された腫瘍開始細胞集団は、同じ起源の非腫瘍原性細胞よりも少なくとも約２倍高いレベルで５Ｔ４を発現する大多数の細胞を含む。また、腫瘍開始細胞は、同じ起源の非腫瘍原性細胞よりも少なくとも約４倍高い、たとえば、少なくとも約５倍高い、または少なくとも約８倍高い、または少なくとも約１０倍高い、または少なくとも約１５倍高い、または少なくとも約２０倍高い、または少なくとも約５０倍高い、または少なくとも約１００倍高いレベルで５Ｔ４を発現する場合もある。また、フローサイトメトリーを用いて５Ｔ４発現を評価する場合、腫瘍開始細胞は、同じ起源の非腫瘍原性細胞よりも少なくとも約０．５ｌｏｇ高い、たとえば、少なくとも約１ｌｏｇ高い、または少なくとも約１．５ｌｏｇ高い、または少なくとも約２ｌｏｇ高い、または少なくとも約３ｌｏｇ高いレベルで５Ｔ４を発現する場合もある。

本発明の別の態様では、腫瘍開始細胞集団は、同じ起源のＣＤ２４^＋非腫瘍原性細胞よりも少なくとも約２倍低いレベルでＣＤ２４を発現するする大多数の細胞を含む。また、腫瘍開始細胞は、同じ起源の非腫瘍原性細胞よりも少なくとも約４倍低い、たとえば、少なくとも約５倍低い、または少なくとも約８倍低い、または少なくとも約１０倍低い、または少なくとも約１５倍低い、または少なくとも約２０倍低い、または少なくとも約５０倍低い、または少なくとも約１００倍低いレベルでＣＤ２４を発現する場合もある。また、フローサイトメトリーを用いてＣＤ２４発現を評価する場合、腫瘍開始細胞は、同じ起源のＣＤ２４^＋非腫瘍原性細胞よりも少なくとも約０．５ｌｏｇ低い、たとえば、少なくとも約１ｌｏｇ低い、または少なくとも約１．５ｌｏｇ低い、または少なくとも約２ｌｏｇ低い、または少なくとも約３ｌｏｇ低いレベルでＣＤ２４を発現する場合もある。

また、腫瘍開始細胞集団は、同じ起源の非腫瘍原性細胞よりも少なくとも約２倍高いレベルでＣＤ４４を発現する大多数の細胞を含むこともできる。また、腫瘍開始細胞は、同じ起源の非腫瘍原性細胞よりも少なくとも約４倍高い、たとえば、少なくとも約５倍高い、または少なくとも約８倍高い、または少なくとも約１０倍高い、または少なくとも約１５倍高い、または少なくとも約２０倍高い、または少なくとも約５０倍高い、または少なくとも約１００倍高いレベルでＣＤ４４を発現する場合もある。また、フローサイトメトリーを用いてＣＤ４４発現を評価する場合、腫瘍開始細胞は、同じ起源の非腫瘍原性細胞よりも少なくとも約０．５ｌｏｇ高い、たとえば、少なくとも約１ｌｏｇ高い、または少なくとも約１．５ｌｏｇ高い、または少なくとも約２ｌｏｇ高い、または少なくとも約３ｌｏｇ高いレベルでＣＤ４４を発現する場合もある。

単離された腫瘍開始細胞集団は、その天然の環境（固形腫瘍中など）から取り出されており、また、それが天然で共に存在するが、細胞の単離を基づかせたマーカーを欠く他の細胞を少なくとも約７５％含まない。たとえば、本明細書中に開示する単離された腫瘍開始細胞集団は、非腫瘍原性細胞を少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％含まない。純度のパーセンテージ、または非腫瘍原性細胞を含まないパーセンテージとして記載した腫瘍開始細胞集団に言及した場合、細胞の幹細胞部分集団および全癌細胞集団は、典型的には生細胞として定量する。

濃縮された細胞の集団は、分画していない癌細胞集団中のマーカーを有する細胞数と比較して増加した、分画した腫瘍開始細胞集団中の特定のマーカーを有する細胞数に基づいて定義することができる。また、これは、限界希釈頻度で腫瘍を形成する最小の細胞数としての腫瘍原性機能に基づいても定義し得る。濃縮された腫瘍開始細胞集団は、分画していない腫瘍細胞集団と比較して幹細胞数が約２倍濃縮されている、または約５倍以上濃縮されている、たとえば、約１０倍以上濃縮されている、または約２５倍以上濃縮されている、または約５０倍以上濃縮されている、または約１００倍以上濃縮されている場合がある。濃縮は、本明細書中に上述した腫瘍開始細胞の特性のうちの任意の１つ、たとえば、マーカー発現または腫瘍原性のレベルを用いて測定することができる。

本発明は、開示した腫瘍開始細胞集団を単離する方法を提供する。たとえば、本方法は、（ａ）解離した腫瘍細胞を提供するステップと、（ｂ）解離した腫瘍細胞を、５Ｔ４と特異的に結合する薬剤と接触させるステップと、（ｃ）５Ｔ４を発現しないまたは５Ｔ４を低レベルで発現する細胞よりも少なくとも約５倍高いレベルで（ｂ）の薬剤と特異的に結合する細胞を選択するステップとを含むことができる。また、本方法は、本明細書中に開示するまたは他の様式で当分野において知られている陽性または陰性の腫瘍開始細胞マーカーのうちの任意のものに基づいた、さらなる選択も含むことができる。陰性マーカーを用いた選択を行う場合、たとえば、１つまたは複数の陰性マーカーを発現する細胞を排除する場合、腫瘍開始細胞は、分化した細胞または非腫瘍原性細胞と比較して低下したマーカー発現を示す細胞として同定し得る。５Ｔ４^高、ＣＤ２４^−／低、および／またはＣＤ４４^＋腫瘍開始細胞集団を単離または濃縮するための代表的な方法を実施例１〜４に記載する。

腫瘍開始細胞は、蛍光色素とコンジュゲートしたマーカー結合試薬ならびに無血清条件を用いた初代培養物を用いたＦＡＣＳを含めた、当分野で知られている任意の適切な手段によって単離または濃縮することができる。固相に付着させることまたはそれから外すことを含めた、任意の他の適切な方法も本発明の範囲内にある。分離の手順には、抗体でコーティングした磁気ビーズを用いた磁気分離、アフィニティークロマトグラフィー、および固体マトリックス、たとえばプレートまたは他の好都合な支持体に付着した抗体を用いたパニングが含まれ得る。正確な分離を提供する技法には、複数の色チャネル、低角度かつ鈍角の光散乱検出チャネル、インピーダンスチャネルなどの様々な度合の精巧性を有することができる蛍光活性化細胞選別器が含まれる。死細胞は、死細胞と結合する色素（ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）または７−ＡＡＤなど）を用いた選択によって排除し得る。選択された細胞の生存度に対して過度に有害でない任意の技法を用い得る。

Ｉ．Ｂ．腫瘍開始細胞の機能的特性
本明細書中に記載のように、本発明の腫瘍開始細胞は、ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏで腫瘍原性であり、クローン原性などの腫瘍原性細胞の特徴を有しており、高度に増殖性の性質を有する。５Ｔ４^高、ＣＤ４４^＋、および／またはＣＤ２４^−／低を発現し、コロニー形成および増殖について有意に濃縮されている、肺腫瘍細胞系の部分集団を同定した。実施例１〜４を参照されたい。腫瘍開始細胞を宿主動物内に注射することで、７５％を超える場合で、たとえば、８０％を超える場合で、または８５％を超える、または９０％を超える、または９５％を超える場合で、または１００％の場合で、腫瘍の確立の成功が一貫してもたらされた。

本発明の癌幹細胞は、起源の腫瘍と同じ分化状態の腫瘍を生じさせる。たとえば、分化が乏しいおよび中等度である腫瘍から単離された腫瘍開始細胞は、それぞれ分化が乏しいまたは中等度である腫瘍をｉｎ ｖｉｖｏで生じさせる。生じる腫瘍の分子プロファイルも、腫瘍開始細胞の以前の選択に関わらず、起源の腫瘍に類似している。したがって、腫瘍開始細胞は、分化するまたは成熟癌集団の大部分を構成する非腫瘍原性細胞を生じさせる能力を示す。

本発明の腫瘍開始細胞は、５Ｔ４^高および／またはＣＤ２４^−／低ＣＤ４４^＋細胞は有するが、５Ｔ４^低および／またはＣＤ２４^＋／高ＣＤ４４^＋細胞は有さない、一貫して腫瘍を形成する能力によって実証されるように、自己複製する能力を有する。この特長により、腫瘍開始細胞が、繰り返す細胞分裂の全体にわたって多能性および高い増殖の潜在性を保持することが可能となる。

本発明の腫瘍開始細胞は、５Ｔ４^高および／またはＣＤ２４^−／低ＣＤ４４^＋細胞の遊走する能力によって実証されるように、遊走する能力を有する。トランスウェルアッセイでは、５Ｔ４^高および／またはＣＤ２４^−／低ＣＤ４４^＋細胞は、５Ｔ４^低および／またはＣＤ２４^＋／高ＣＤ４４^＋細胞よりも効率的に、血清依存性の様式で遊走する。別のアッセイでは、５Ｔ４^高および／またはＣＤ２４^−／低ＣＤ４４^＋細胞のスフェロイドはフィブロネクチンでコーティングしたスライドを横切って遊走したが、５Ｔ４^低および／またはＣＤ２４^＋／高ＣＤ４４^＋細胞のスフェロイドでは、２４時間後に細胞の遊走はわずかしか観察されない、または観察されなかった。

ＩＩ．応用
本明細書中に開示する腫瘍開始細胞集団は、腫瘍増殖、再発、および転移に対する治療剤の研究に有用である。癌患者から単離された場合、特定の治療の有効性は、単離された集団のユニークな遺伝子および分子プロファイルに基づいて試験および／または予想することができる。したがって、開示した腫瘍開始細胞集団は、個別化された癌治療を開発する手段を提供する。

本発明の一態様では、標的分子および／またはシグナル伝達経路を同定するために腫瘍開始細胞の遺伝子および分子の特長を記載する。したがって、本発明はまた、腫瘍開始細胞（濃縮された集団もしくは単離されたもの）、腫瘍開始細胞から抽出したポリヌクレオチド、または腫瘍開始細胞から抽出したタンパク質が直接または間接的に結合した、固相、たとえば表面を含有する、アレイまたはマイクロアレイも提供する。開示した腫瘍開始細胞集団に対して産生させたモノクローナルおよびポリクローナル抗体を、標準の技法を用いて作製し得る。腫瘍開始細胞の標的分子、および腫瘍開始細胞と特異的に結合する薬剤の同定は、大多数の非腫瘍原性細胞を標的とする現在の戦略を補足し、向上させるであろう。

また、腫瘍開始細胞のゲノムＤＮＡのマイクロアレイを一塩基多型（ＳＮＰ）についてプローブして、細胞が前癌性または腫瘍原性となることを引き起こす遺伝子突然変異の部位を位置決定することもできる。また、腫瘍開始細胞の遺伝子および／または分子プロファイルを患者の予後診断にも使用し得る。たとえば、治療の失敗を予測する癌による死のサインを記載している、Ｇｌｉｎｓｋｙら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．、２００５、１１５（６）：１５０３〜１５２１を参照されたい。

本発明の別の態様では、抗癌薬または候補抗癌薬の有効性は、単離された腫瘍開始細胞を試験化合物と接触させ、その後、本明細書中に記載した腫瘍開始細胞の特性の変化についてアッセイすることによって、試験することができる。たとえば、治療的組成物を培養中の腫瘍開始細胞に様々な用量で施用することができ、これらの細胞の応答を様々な時間で監視する。これらの細胞の物理的特徴は、細胞を顕微鏡観察によって観察することによって分析することができる。誘発された、または他の様式で変更された、核酸およびタンパク質の発現は、当分野で知られているように、たとえば、核酸のレベルをアッセイするためのハイブリダイゼーション技法およびポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅、免疫組織化学、酵素的アッセイ、受容体結合アッセイ、酵素連結免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、電気泳動分析、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を用いた分析、ウエスタンブロット、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣｓ）などを用いて評価することができる。

腫瘍開始細胞の腫瘍形成能を阻害または減少させる治療的化合物の能力は、腫瘍開始細胞を試験化合物と接触させ、応答に十分な期間を与え、その後、腫瘍開始細胞の成長をｉｎ ｖｉｔｒｏで評価することによって、試験することができる。あるいは、試験化合物に曝したあと、腫瘍開始細胞を宿主動物内に移植することができる（すなわち、異種移植モデルの準備であり、その後、これを腫瘍増殖、癌細胞のアポトーシス、動物の生存などについて監視する）。さらに別のスクリーニング様式では、試験化合物を異種移植宿主動物（すなわち、腫瘍開始細胞および／または生じた腫瘍を保有する動物）に投与する。アッセイし得るさらなる表現型には、細胞生存度、増殖速度、再生能力、および腫瘍開始細胞もしくは生じた非腫瘍原性癌細胞の細胞周期分布、または治療的結果に関連する任意の他の表現型が含まれる。

試験化合物には、既知の薬物および候補薬物、たとえば、ウイルス、タンパク質、ペプチド、アミノ酸、脂質、炭水化物、核酸、抗体、プロドラッグ、小分子（たとえば化学物質）、または、効果が有害、有益、もしくは他の様式であるかに関わらず、腫瘍細胞に対して効果を有し得る任意の他の物質が含まれる。試験化合物には、それだけには限定されないが、２，２’，２’’−トリクロロトリエチルアミン、２−エチルヒドラジド、２−ピロリノ−ドキソルビシン、５−ＦＵ（５−フルオロウラシル）、６−アザウリジン、６−ジアゾ−５−オキソ−Ｌ−ノルロイシン、６−メルカプトプリン、６−チオグアニン、カンプトテシン、サルコジクチン、ＡＢＲＡＸＡＮＥ（登録商標）、ＡＢＴ−５１０（Ａｂｂｏｔｔ Ｌａｂｓ）、アセグラトン、アセトゲニン、アクラシノマイシン、アクチノマイシン、ＡＤＲＩＡＭＹＣＩＮ（登録商標）、ＡＧ１４７８、ＡＧ１５７１（ＳＵ５２７１、Ｓｕｇｅｎ）、アルドホスファミドグリコシド、アルトレタミン、アミノグルテチミド、アミノレブリン酸、アミノプテリン、アムサクリン、アンシタビン、アンドロゲン、アンジオスタチン（ＥｎｔｒｅＭｅｄ）、Ａｎｇｉｚｙｍｅ（ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ）、アングイジン、代謝拮抗剤、アラビノシド（「Ａｒａ−Ｃ」）、アウスラマイシン、アザシチジン、アザセリン、アジリジン、ベンゾドーパ、ベストラブシル、ベバシズマブ、ベバシズマブ（ＡＶＡＳＴＩＮ（登録商標）Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）、ベキサロテン、ビサントレン、ブレオマイシン、ＢＭＳ−２７５２９１（Ｂｒｉｓｔｏｌ Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂ）、ボルテゾミブ（ＶＥＬＣＡＤＥ（登録商標）Ｍｉｌｌｅｎｉｕｍ Ｐｈａｒｍ．）、ブリオスタチン、ブスルファン、カクチノマイシン、カリスタチン、カルステロン、カペシタビン、カラビシン、カルボプラチン、カルボコン、カルミノマイシン、カルモフル、カルムスチン、カルジノフィリン、ＣＣ−１０６５、クロラムブシル、クロランブシル、クロルナファジン、クロロゾトシン、コロホスファミド、クロモマイシニス、シスプラチン、Ｃｏｍｂｒｅｓｔａｔｉｎ（Ｏｘｉｇｅｎｅ）、ＣＰＴ−１１、クリプトフィシン、シアノモルホリノ−ドキソルビシン、シクロオキシゲナーゼ−２（ＣＯＸ−２）阻害剤エクシスリンド、シクロホスファミド、シクロスホスファミド、シタラビン、ＣＹＴＯＸＡＮ（登録商標）、ダカルバジン、ダクチノマイシン、ダウノマイシン、ダウノルビシン、デフォファミン、デメコルシン、デオキシドキソルビシン、デトルビシン、ジアジコン、ジデオキシウリジン、ジフルオロメチルオルニチン（ＤＭＦＯ）、ドセタキセル、ドラスタチン、ドキシフルリジン、ドキソルビシン、プロピオン酸ドロモスタノロン、デュオカルマイシン、エダトラキセート、エダトレキサート、エリュテロビン、エルフォルミチン、酢酸エルプチニウム、エネジイン抗生物質、エニルウラシル、エノシタビン、エピルビシン、エピチオスタノール、エルロチニブ（ｔａｒｃｅｖａ）、エルロチニブ（ＴＡＲＣＥＶＡ（登録商標）Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ／ＯＳＩ Ｐｈａｒｍ．）、エソルビシン、エストラムスチン、エチレンイミン、エトグルシド、エトポシド、エトポシド（ＶＰ−１６）、フロキシウリジン、フルダラビン、デノプテリンなどの葉酸類似体、フロリン酸などの葉酸補充剤、フォテムスチン、、フルベストラント（ＦＡＳＬＯＤＥＸ（登録商標）ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ）、ガシトシン、硝酸ガリウム、ゲフィチニブ（ＩＲＥＳＳＡ（登録商標）ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ）、ＧＥＭＺＡＲ（登録商標）（ゲムシタビン）、ヒドロキシ尿素、イバンドロネート、イダルビシン、イホスファミド、メシル酸イマチニブ（ＧＬＥＥＶＥＣ（登録商標）Ｎｏｖａｒｔｉｓ）、インプロスルファンおよびピポスルファン、イリノテカン、ラパチニブ（ＧＳＫ５７２０１６、レンチナン、レトロゾール（ＦＥＭＡＲＡ（登録商標）Ｎｏｖａｒｔｉｓ）、ロイコボリン、ロムスチン、ロナファルニブ（ＳＣＨ６６３３６）、ロニダイニン、ロソキサントロン、マンノムスチン、マルセロマイシン、マリマスタット（Ｂｒｉｔｉｓｈ Ｂｉｏｔｅｃｈ）、メイタンシンおよびアンサミトシンなどのメイタンシノイド、メクロレタミン、メクロレタミンオキシド塩酸塩、メルファラン、メピチオスタン、メルカプトプリン、メトトレキサート、メトトレキサートおよび５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）、メチラメラミン（ｍｅｔｈｙｌａｍｅｌａｍｉｎｅｓ）、メツレドーパ、ミトブロニトール、ミトグアゾン、ミトラクトール、マイトマイシンＣ、マイトマイシン、ミトタン、ミトキサントロン、モピダンモール、モルホリノ−ドキソルビシン、ミコフェノール酸、ＭＹＬＯＴＡＲＧ（登録商標）（ゲムツズマブオゾガマイシン、Ｗｙｅｔｈ）、ＮＡＶＥＬＢＩＮＥ（登録商標）（ビノレルビン）、Ｎｅｏｖａｓｔａｔ（Ａｅｔｅｒｎａ Ｚｅｎｔａｒｉｓ）、ニムスチン、ニトラエリン、ナイトロジェンマスタード、ノガラマイシン、ｎｏｖａｎｔｒｏｎｅ、ｎｏｖｅｍｂｉｃｈｉｎ、オリボマイシン、またはビノレルビン、ＥＬＯＸＡＴＩＮ（登録商標）（オキサリプラチン、Ｓａｎｏｆｉ）、パクリタキセル、パンクラチスタチン、ペメトレキセド二ナトリウム（ＡＬＩＭＴＡ（登録商標）、ペントスタチン、ペプロマイシン、フェナメット、フェネステリン、ピポブロマン、ピラルビシン、ポドフィリン酸、ポトフィロマイシン、プレドニムスチン、プロカルバジン、プロテアソーム阻害剤、プテロプテリン、ＰＴＫ７８７／ＺＫ２２２５８４（Ｎｏｖａｒｔｉｓ）、ピューロマイシン、クエラマイシン、ラニムヌスチン、ラパマイシン（シロリムス、ＲＡＰＡＭＵＮＥ（登録商標）、Ｗｙｅｔｈ）、ラゾキサン、レチノイン酸、レチノイド、リゾキシン、ロドルビシン、ロリジンＡ、シゾフラン、ソラフェニブ（ＢＡＹ４３ ９００６、Ｂａｙｅｒ）、スピロゲルマニウム、スポンジスタチン、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、ＳＵ５４１６、ＳＵ６６６８（Ｓｕｇｅｎ）、スニチニブ（Ｐｆｉｚｅｒ）、ＳＵＴＥＮＴ（登録商標）（ＳＵ１１２４８、Ｐｆｉｚｅｒ）、Ｔ−２毒素、ＴＡＸＯＬ（登録商標）（パクリタキセル、Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ）、ＴＡＸＯＴＥＲＥ（登録商標）（ドキセタキセル、Ｒｈｏｎｅ−Ｐｏｕｌｅｎｃ Ｒｏｒｅｒ）、テムシロリムス（ＴＯＲＩＳＥＬ（登録商標）、Ｗｙｅｔｈ）、テニポシド、テヌアゾン酸、テストラクトン、抗副腎剤、サリドマイド（Ｃｅｌｇｅｎｅ）、チアミプリン、チオグアニン、チオテパ、トポイソメラーゼ阻害剤ＲＦＳ２０００、トポテカン、トリアジコン、トリコテセン、トリエチレンメラミン、トリエチレンホスホルアミド、トリエチレンチオホスホルアミド、トリロスタン、トリメチロメラミン、トリメトレキセート、トロホスファミド、ツベルシジン、ウベニメックス、ウラシルマスタード、ウレドーパ、ウレタン、ワクチン、ＶＥＧＦ−Ｔｒａｐ（Ｒｅｇｅｎｅｒｏｎ Ｐｈａｒｍ）、ベラキュリンＡ、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン、ビノレルビン、Ｖｉｔａｘｉｎ ＩＩ（ＭｅｄＩｍｍｕｎｅ）およびシレンギチド（Ｍｅｒｃｋ ＫｇａＡ）、Ｘｅｌｏｄａ、ＺＤ６４７４（ＺＡＣＴＩＭＡ（登録商標）ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ）、ジノスタチン、ゾルビシン、ならびに上記のうちの任意のものの薬学的に許容できる塩、酸、誘導体および抗体コンジュゲートが含まれる。

上述の応用のうちの任意のもの、または他の応用において使用するために、使用が必要になるまで本発明の腫瘍開始細胞を低温保存し得る。たとえば、細胞を、特定の低温保存剤を含有する等張溶液、好ましくは細胞培地中に懸濁させることができる。そのような低温保存剤には、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、グリセロールなどが含まれる。これらの低温保存剤は、５〜１５％、たとえば８〜１０％の濃度で使用する。細胞は、−１０℃〜−１５０℃、たとえば−２０℃〜−１００℃、または−１５０℃の温度まで徐々に凍結させる。

以下の実施例は、本発明の機序を例示するために含めた。以下の実施例の特定の態様は、本発明の実施において良好に機能するように、本発明の共同発明者らによって発見または熟慮された技法および手順に関して記載する。これらの実施例は、共同発明者らの標準的な実験の実施を例示する。本開示および当分野の一般技術レベルに鑑みて、当業者は、以下の実施例は例示的であることのみを意図し、本発明の範囲から逸脱せずに数々の変化、改変、および変更を用い得ることを理解されたい。

（実施例１）
非小細胞肺癌細胞系を用いたＣＤ２４^−／低ＣＤ４４^＋腫瘍開始細胞の単離
Ｈ４６０細胞は、米国バージニア州ＭａｎａｓｓａｓのＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）から入手した。Ｈ４６０細胞系は、肺の大細胞癌を有する患者の胸膜腔内液に由来するものである（Ｇａｚｄａｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、１９８９、２４６：４９１〜４９４）。ＨＣＣ２４２９細胞はＪ．Ｍｉｎｎａから入手した。Ｈａｒｕｋｉら、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｇｅｎｅｔ．、２００５、４２（７）：５５８〜６４を参照されたい。Ｈ４６０Ｔ細胞を用いたすべての実験は３７〜５１の継代数の細胞で行い、これは、これらの細胞がより低い継代数の細胞よりも頑強な表現型を有することが観察されたためである。最初にＡＴＣＣから入手した低い継代数のＨ４６０と識別するために、より高い継代数の細胞はＨ４６０Ｔと呼ぶ。すべての細胞は、３７℃で、５．０％の二酸化炭素（ＣＯ_２）を用いてインキュベーションした。Ｈ４６０Ｔ細胞は、ＲＰＭＩ−１６４０（ＧＩＢＣＯ（登録商標）、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、米国カリフォルニア州Ｃａｒｌｓｂａｄから入手可能）中で培養した。Ｍｏｏｒｅら、ＪＡＭＡ、１９６７、１９９：５１９〜５２４を参照されたい。１０％のウシ胎児血清（ＦＢＳ、ＧＩＢＣＯ（登録商標）、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、米国カリフォルニア州Ｃａｒｌｓｂａｄから入手可能）、２ｍＭのさらなるグルタミン、１００ＩＵ／ｍｌのペニシリン、１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン、１ｍＭのピルビン酸ナトリウム、０．１％の炭酸水素ナトリウム、０．４５％のさらなるグルコース、および１０ｍＭの４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジンエタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）。ＨＣＣ２４２９細胞を、ＲＰＭＩ−１６４０、１０％のＦＢＳ、２ｍＭのさらなるグルタミン、１００ＩＵ／ｍｌのペニシリン、１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン中で培養した。Ｈ４６０Ｔの核型分析および短いタンデム反復（ＳＴＲ）の分析によりそれがＨ４６０起源であることが確認されたが、Ｙ染色体がＨ４６０Ｔ細胞中には存在せず、ほとんどのＨ４６０細胞中に存在していた。

フローサイトメトリー分析には、細胞を、ＧＩＢＣＯ（登録商標）ＴＲＹＰＬＥ（商標）を用いて収集し、３％の熱不活性化仔ウシ血清（ＨＩＣＳ）を含み、カルシウムおよびマグネシウムを含まないハンクス平衡塩類溶液（ＨＢＳＳ）で洗浄し、１００μｇ／ｍｌのＤＮａｓｅ、５ｍＭのＭｇＣｌ_２および５０μｇ／ｍｌのヒト免疫グロブリン（ＩｇＧ）と共にインキュベーションし、抗体またはアイソタイプ対照と共にインキュベーションし、洗浄し、３％のＨＩＣＳ、２５μｇ／ｍｌのＤＮａｓｅ、１ｍＭのＭｇＣｌ_２、および２５ｍＭのＨＥＰＥＳを含むＨＢＳＳ中に再懸濁させた。異種移植片をペースト様の稠度まで刻み、コラゲナーゼ／ヒアルロニダーゼ（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カナダ、ブリティッシュコロンビア州Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ）中で１時間、頻繁に混合しながら３７℃の水浴中でインキュベーションし、４０ミクロンのフィルターを通して濾過した。細胞懸濁液を、どちらも製造者の指示に従って、赤血球溶解緩衝液（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、米国インディアナ州Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、）、続いてＡＣＣＵ−ＰＲＥＰ（登録商標）（Ａｘｉｓ、ノルウェー、Ｏｓｌｏ）で処理した。抗ヒトＣＤ２４（＃５５５４２８）およびＣＤ４４（＃５５９９４２）モノクローナル抗体はＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｓａｎ Ｊｏｓｅ、米国カリフォルニア州）から入手した。抗５Ｔ４抗体クローンＨ８（ＨｏｌｅおよびＳｔｅｒｎ、Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ、１９８８、５７（３）：２３９〜４６）はＯｘｆｏｒｄ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａ、英国Ｏｘｆｏｒｄから入手した。

Ｈ４６０Ｔ ＮＳＣＬＣ細胞系を抗ＣＤ２４および抗ＣＤ４４抗体で標識することで、長期的な培養にわたって安定した分布を有する明確に区別できる集団が明らかとなった（図１Ａ）。これらの集団を蛍光活性化細胞選別によって分離し、免疫不全ｎｕ／ｎｕマウスに皮下移植した場合、ＣＤ２４^−／低ＣＤ４４^＋細胞は迅速に大きな腫瘍を形成した一方で、ＣＤ２４^高ＣＤ４４^＋細胞はゆっくりと小さな腫瘍を形成した（ｐ＜０．００１、図１Ｂ〜１Ｃ）。また、ＣＤ２４^−／低ＣＤ４４^＋細胞は第３の集団、ＣＤ２４^−／低ＣＤ４４^低よりも大きな腫瘍を形成した（ｐ＜０．０２、図１Ｄ）。これらの研究は、ＣＤ２４^−／低およびＣＤ４４^＋がＨ４６０Ｔ中で腫瘍形成能を濃縮させることを実証している。

ＣＤ２４^−／低ＣＤ４４^＋細胞は、いくつかのさらなるアッセイにおいてＣＤ２４^高ＣＤ４４^＋細胞と表現型が明確に異なる。第１に、ＣＤ２４^−／低ＣＤ４４^＋細胞は、三次元培養においてスフェロイドとしてＣＤ２４^高ＣＤ４４^＋細胞よりも迅速に成長した（ｐ＜０．００１、図１Ｅ）。二次元培養では集団間で増殖速度、細胞周期プロファイル、または細胞の大きさの差は検出されなかった。

第２に、集団は、進行した腎細胞癌の処置に最近認可されたラパマイシン類似体であるｍＴＯＲ阻害剤ＣＣＩ−７７９に対して示差的応答を示した（Ｆａｉｖｒｅら、Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ．、２００６、５：６７１〜６８８）。ＣＤ２４^−／低ＣＤ４４^＋細胞は、ＣＤ２４^高ＣＤ４４^＋細胞よりもＣＣＩ−７７９に対して５〜１０倍高い耐性を有していた（図１Ｆ）。対照的に、集団はカンプトテシン、５−フルオロウラシル、および電離放射線に対して同等に応答し、これは、ＣＣＩ−７７９に対する示差的応答が特異的であったことを示す。

第３に、トランスウェル遊走アッセイおよびスフェロイド成長アッセイを用いて示したように、ＣＤ２４^−／低ＣＤ４４^＋細胞はＣＤ２４^高ＣＤ４４^＋細胞よりも効率的に遊走した。トランスウェル遊走アッセイを行うために、終夜、成長培地中で培養した細胞を選別し、その後、２４時間血清飢餓させた。５００，０００個の細胞／ウェルを、８．０ミクロン孔の２４ｍｍ直径のトランスウェル中の無血清培地に播種した。血清を含むまたは含まない培地を外チャンバに加え、細胞を１６〜１８時間インキュベーションした。細胞を最初にホルムアルデヒドで固定し、クリスタルバイオレットで染色した。外チャンバまで遊走した細胞を顕微鏡下で計数できるように、細胞を、湿ったおよび乾いた綿棒（Ｑ−ｔｉｐ）で内チャンバから注意深く擦り取った。８〜１０個のフィールド／ウェルを計数した。このアッセイを用いて、ＣＤ２４^−／低ＣＤ４４^＋細胞は、血清依存性の様式でＣＤ２４^高ＣＤ４４^＋細胞よりも２．５倍効率的に遊走した（ｎ＝４、図１Ｇ）。スフェロイド成長アッセイを行うために、５ｍｌの培地中の１００，０００個の選別した細胞を、５ｍｌの組織培養グレードの寒天（０．７％）で事前にコーティングした６０ｍｍのポリスチレン細胞培養皿上に、培地中で播種した。皿を５日間、３７℃でインキュベーションした。直径０．２ｍｍを有するスフェロイドを選択し、フィブロネクチンでコーティングしたスライド（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）上に置いた。ＣＤ２４^−／低ＣＤ４４^＋スフェロイドでは、フィブロネクチンでコーティングしたスライドを横切る細胞の遊走が、２４時間および続く時点で明らかであったが、ＣＤ２４^高ＣＤ４４^＋スフェロイドでは、細胞の遊走はわずかしか観察されなかったまたは観察されなかった（図１Ｈ）。この実験の３日間の期間にわたってスフェロイドの成長速度に差異はなかった。

Ｈ４６０Ｔの腫瘍開始集団も幹細胞様特徴を保有していたかどうかを決定するために、選別した細胞を培養物中で維持し、フローサイトメトリーによって定期的に監視した。ＣＤ２４^−／低ＣＤ４４^＋細胞は、選別の早くも３日後には明らかなＣＤ２４^高ＣＤ４４^＋細胞の有意な集団を常に生じた（図２Ａ）。対照的に、ＣＤ２４^高ＣＤ４４^＋細胞は、選別の２カ月後の最終時点までＣＤ２４^高ＣＤ４４^＋に保たれた（図２Ａ）。これらの結果は腫瘍開始細胞の多能性の表現型を示した。観察された移行が親系の状況で起こるかどうかを決定するために、標識したおよび標識していない集団を同時培養した。ＣＤ２４^高ＣＤ４４^＋細胞と共に同時培養した場合は、ＣＤ２４^−／低ＣＤ４４^＋細胞も多能性であり（図３Ａ〜３Ｃ）、これは、多能性の表現型が親Ｈ４６０Ｔの培養物中に存在することを示唆している。また、多能性はｉｎ ｖｉｖｏでも観察され、ＣＤ２４^−／低ＣＤ４４^＋細胞から成長させた異種移植片は、典型的には約５０％のＣＤ２４^高細胞を含有していた（図２Ｂ）。

多能性を単一の細胞レベルで追跡できることを確認するために、クローン分析を行った。単一のＣＤ２４^−／低ＣＤ４４^＋またはＣＤ２４^高ＣＤ４４^＋細胞のコロニーをクローン系へと拡大した。ほとんど（２３／３１個）のＣＤ２４^−／低ＣＤ４４^＋由来のクローン系は＞１０％のＣＤ２４^高細胞を含有していたが（「移行中のクローン」）、一部（８／３１個）は＜１％のＣＤ２４^高細胞を含有していた（「安定したクローン」）。すべて（６／６個）のＣＤ２４^高ＣＤ４４^＋由来のクローン系は１００％のＣＤ２４^高細胞を含有していた（図２Ｃ）。選別した親系の上記結果と一致して、すべての試験したＣＤ２４^−／低ＣＤ４４^＋クローン系の選別したＣＤ２４^−／低ＣＤ４４^＋細胞は腫瘍原性が高かった一方で、すべての試験したＣＤ２４^高ＣＤ４４^＋クローン系の選別したＣＤ２４^高ＣＤ４４^＋細胞は小さな腫瘍を形成したまたは腫瘍を形成しなかった（図２Ｄ）。

ＣＤ２４^高ＣＤ４４^＋細胞がＣＤ２４^−／低ＣＤ４４^＋細胞と比較して低下した腫瘍形成能を示すかどうかを試験するために、移行中のＣＤ２４^−／低ＣＤ４４^＋クローン系をＣＤ２４^−／低ＣＤ４４^＋およびＣＤ２４^高ＣＤ４４^＋細胞へと選別し、選別した細胞を動物内に移植した。３つのクローン系において、ＣＤ２４^−／低ＣＤ４４^＋細胞はＣＤ２４^高ＣＤ４４^＋細胞よりも大きな腫瘍を形成した（クローン２４Ｎ−４ではｐ＜０．００５、クローン２４Ｎ−１０ではｐ＝０．０１、クローン２４Ｎ−２５ではｐ＜０．０５、図２Ｅ）。３つの他のクローン系では有意な差異は観察されなかった。したがって、Ｈ４６０ＴのＣＤ２４^−／低ＣＤ４４^＋細胞は、より低い腫瘍原性の、機能的に明確に区別できるＣＤ２４^高ＣＤ４４^＋細胞を生じさせることができる。これらの結果は、Ｈ４６０Ｔ中の多能性腫瘍開始細胞の存在を実証している。

他のＮＳＣＬＣ細胞系を、ＣＤ２４およびＣＤ４４に関して不均質性について評価した。ＨＣＣ２４２９系（Ｄａｎｇら、Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ．、２０００、９２、１３５５〜１３５７）は、２つの明確に区別できるＣＤ２４集団、ＣＤ２４^−／低およびＣＤ２４^高を含有していた（図４Ａ）。ＦＡＣＳで単離したＣＤ２４^−／低細胞はＣＤ２４^高細胞よりも有意に大きな腫瘍を形成した（ｐ＜０．０５、図４Ｂ）。さらに、ＣＤ２４^−／低細胞は培養物中でＣＤ２４^高細胞を生じさせた一方で、ＣＤ２４^高細胞はＣＤ２４^高のままであった（図４Ｃ）。

（実施例２）
非小細胞肺癌細胞系における５Ｔ４^＋腫瘍開始細胞の同定
ＣＤ２４^−／低ＣＤ４４^＋とＣＤ２４^高ＣＤ４４^＋細胞との間の表現型の差異の根底にあるであろう遺伝子を同定するために、遺伝子発現プロファイルをＦＡＣＳで単離した集団の３つ組試料から作成した。予想どおり、ＣＤ２４のｍＲＮＡレベルはＣＤ２４^高ＣＤ４４^＋細胞で常に高く、ＣＤ２４^−／低ＣＤ４４^＋細胞で低かった（図５）。５Ｔ４（ＴＰＢＧとしても知られる）のレベルは、ＣＤ２４^高ＣＤ４４^＋細胞と比較してＣＤ２４^−／低ＣＤ４４^＋細胞で４．５倍高かった（図６Ａ）。

成長および分化の条件下での５Ｔ４の発現を決定するために、細胞をいくつかの時点で収集し、タンパク質抽出物を免疫ブロット分析に供した。細胞をＰＢＳで洗浄し、２５ｍＭのトリス緩衝生理食塩水、ｐＨ７．４（ＴＢＳ）中の０．５％ｖ／ｖのＮＰ４０で溶解した。タンパク質の推定の後（ＭＩＣＲＯＢＣＡ（商標）タンパク質アッセイキット、Ｐｉｅｒｃｅ、米国イリノイ州Ｒｏｃｋｆｏｒｄ）、溶解物を非還元Ｌａｅｍｍｌｉ試料緩衝液（Ｂｉｏｒａｄ、米国カリフォルニア州Ｈｅｒｃｕｌｅｓ）と混合し、１０μｇの試料を、非還元の４〜２０％のポリアクリルアミド勾配ゲル（ＮＯＶＥＸ（登録商標）、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、米国カリフォルニア州Ｃａｒｌｓｂａｄから入手可能）のそれぞれのウェルに載せた。試料を２〜３時間、１２５ボルトで流し、Ｎｏｖｅｘ（登録商標）電気泳動移行システムによってＰＶＤＦ（ポリフッ化ビニリデン）膜に移した。膜を、終夜、１％のヤギ血清を含むトリス緩衝生理食塩水Ｔｗｅｅｎ−２０（ＴＢＳＴ）中の５％の乳で遮断し、ＴＢＳＴ中の５％の乳中に１μｇ／ｍｌの抗５Ｔ４抗体Ｈ８でプローブし、洗浄し、１：５，０００の希釈率のＨＲＰコンジュゲートヤギ抗ｍｕＩｇＧでプローブした。ＥＣＬ検出システムを使用した（Ａｍｅｒｓｈａｍ、米国マサチューセッツ州Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ）。抗５Ｔ４抗体を用いた免疫ブロット分析により、ＣＤ２４^−／低ＣＤ４４^＋細胞中では５Ｔ４タンパク質の発現が示されたが、ＣＤ２４^高ＣＤ４４^＋細胞では示されなかった（図６Ｂ）。

抗５Ｔ４および抗ＣＤ２４抗体を用いた親Ｈ４６０Ｔの免疫蛍光により、５Ｔ４およびＣＤ２４の染色は排他的であり、ＣＤ２４^−／低ＣＤ４４^＋細胞のほぼすべても５Ｔ４を発現していたことが実証された。５Ｔ４は実施例１に記載したＣＤ２４^−／低ＣＤ４４^＋クローン系のすべてで発現されていた。

腫瘍細胞系における５Ｔ４発現をさらに評価するために、選別した細胞をオールトランス型レチノイン酸で処理して分化を誘発させ、その後、免疫ブロット分析に供した。選別した細胞はＦＡＣＳによって得られ、それぞれの免疫表現型の２．３×１０^５個の細胞を、６ウェルの皿に、完全な成長培地中で播種した。２４時間後、培地を除去し、細胞をＰＢＳで２回洗浄し、０．５％のＦＢＳ成長培地を再度与えた。培地を２４時間後に除去し、ビヒクル対照または１０μＭのオールトランス型レチノイン酸（Ｓｉｇｍａ、米国ミズーリ州Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ）と添加した０．５％のＦＢＳ成長培地で置き換えた。細胞を７２時間培養し、ＰＢＳで洗浄し、抗５Ｔ４ウエスタンブロット分析のために１×Ｌａｅｍｍｌｉ緩衝液（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、米国カリフォルニア州Ｈｅｒｃｕｌｅｓ）中で直接溶解した。５Ｔ４発現は処理したＣＤ２４^−／低ＣＤ４４^＋細胞中で劇的に低下しており（図６Ｂ）、これは、５Ｔ４が、癌細胞において未分化状態に関連していることを示している。

（実施例３）
非小細胞肺癌の初代培養物における腫瘍開始細胞の分化モデル
初代無血清培養物を新しく切除したＮＳＣＬＣ試料から確立した。細胞を、自己複製を促進する条件下で培養したか、または、レチノイン酸の存在下で気液界面に曝すことによって分化を誘発させた。気液界面は肺細胞の生理的環境であるとみなされ、胎児の肺発生の研究に使用されている（Ｖａｕｇｈａｎら、Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ、２００６、７４：１４１〜１４８）。このモデルを用いて分化を誘発するために、培養物を以下のように調製および処理した。Ｍｉｌｌｉｃｅｌｌの１μＭのＰＥＴハンギング細胞培養挿入物（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、米国マサチューセッツ州Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ）を６ウェルの皿の内部に入れた。膜をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で事前に湿らせ、８７４２６Ａ１腫瘍組織から得た２．５×１０^５個の初代細胞をそれぞれの挿入物上に播種し、ＢＥＢＭ培地で満たした。１〜２日後、培地を上部および下部のチャンバから除去し、ＰＢＳですすぎ、５０ｎＭのレチノイン酸および１ｍＭのＣａＣｌ_２を含有するＣｎＴ−２３培地（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、米国マサチューセッツ州Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ）を下部のチャンバに加え戻し、上部チャンバ中の細胞は空気に曝されたままにした。持ち上げられた培養物は、２日毎に新鮮な培地を加えたか、または示した時点でＲＮＡ単離用には緩衝液ＲＬＴ（ＱＩＡＧＥＮ、米国カリフォルニア州Ｖａｌｅｎｃｉａ）中で、もしくは抗５Ｔ４ウエスタンブロット分析用にはＴＢＳ（トリス緩衝生理食塩水）／０．５％ＮＰ４０（タージトール型ＮＰ−４０、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、米国ミズーリ州Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ）中で収集した。遺伝子発現プロファイリングには、同型成長の試料を一緒に分析し、限られた試料のため、８、１６、および２４日目の分化試料をプールして一緒に分析した。生細胞のイメージングにより、単層培養物が、気液界面および５０ｎＭのレチノイン酸に１８日間曝された後に３Ｄ重層の上皮を効率的に形成したことが明らかとなった（図７Ａ）。

成長および分化の条件下での５Ｔ４の発現を決定するために、細胞をいくつかの時点で収集し、実施例２に記載のようにタンパク質抽出物を免疫ブロット分析に供した。５Ｔ４のレベルは成長条件下で高く、分化の際に急速かつ劇的に減少した（図７Ｂ）。

この分化モデルの包括的な見解を得るために、実験を繰り返し、遺伝子発現プロファイルを成長および分化の条件下で細胞から作成した。実施例５および６を参照されたい。上記結果と一致して、分化中に５Ｔ４発現は減少し、ＣＤ２４発現は増加した（図７Ｃ）。また、成長および分化における初代培養物の遺伝子発現プロファイルを、Ｈ４６０Ｔ ＣＤ２４^−／低ＣＤ４４^＋およびＣＤ２４^高ＣＤ４４^＋集団のそれとも比較した（実施例５を参照）。初代培養物の分化中により高いレベルで発現された遺伝子の顕著な画分は、ＣＤ２４^高ＣＤ４４^＋細胞中でもより高いレベルで発現された（ＦＤＲ＝０．００１５）。Ｈ４６０Ｔおよび８７４２６のデータ組の統計的な比較には、分化した８７４２６培養物中でアップレギュレートされていた上位２５０個の遺伝子をＨ４６０Ｔ集団中で比較した。図７Ｄは、Ｈ４６０Ｔデータ組においてノイズレベルを超える遺伝子の発現の差異を示す。統計的分析により偽発見率０．００１５が得られた。この分析は、これらの非常に異なる実験系がＮＳＣＬＣにおける分化階層の生理的モデルであることを示す。マイクロアレイのデータはフローサイトメトリーによって確認された（図７Ｅ〜７Ｆ）。

また、発現プロファイルにより、上皮−間葉の移行および血管形成に関与する遺伝子の著しいパターンも明らかとなった。上皮−間葉の移行のマーカーであるビメンチン、フィブロネクチン、Ｓｌｕｇ、およびＴｗｉｓｔは、分化状態と比較して成長条件下において高レベルで発現されていた（図７Ｃ）。対照的に、上皮マーカーであるムチンおよびいくつかのサイトケラチンは、成長条件と比較して分化中に高レベルで発現されていた（図７Ｃ）。血管形成因子ＶＥＧＦ−Ａ、−Ｂ、−Ｃ、ＰＤＧＦ−Ａおよび−Ｃ、ならびにＰＩＧＦは、分化と比較して成長条件下で有意により高いレベルで発現されていた（図７Ｇ）。

発現データのバイアスのないメタ分析により、分化中に有意な発現変化を有するいくつかの遺伝子サインが明らかとなった（表１）。未分化の細胞中でより高い発現を有する遺伝子組には、臨床的予後不良、幹細胞、発癌性シグナル伝達、および発達シグナル伝達のサインが含まれていた。分化した細胞中でより高い発現を有する遺伝子組には、より良好な臨床的予後、分化した腫瘍、および分化した細胞のサインが含まれていた。この分析で使用したＢｒｏａｄ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅの分子サイン（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｉｇｎａｔｕｒｅｓ）データベースの情報を表２に示し、これには表１で同定した遺伝子組のそれぞれについての遺伝子（メンバー）のリストが含まれる。表１中のすべてのＮＴｋは偽発見率（ＦＤＲ）≦０．０１である。ＮＴｋ＞０は分化した初代培養物との直接の対応を示す。ＮＴｋ＜０は分化した初代培養物との逆の対応を示す。

総合すると、前述の結果は初代ＮＳＣＬＣ培養物における分化階層を定義しており、レチノイン酸の分化が腫瘍原性プロファイルを部分的に逆転させることができることを示している。

（実施例４）
非小細胞肺癌の細胞異種移植片における腫瘍開始細胞の同定
初代異種移植系は、Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ、米国マサチューセッツ州Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎから入手した雌の無胸腺症のｎｕ／ｎｕ（ヌード）およびＮＯＤ−ＳＣＩＤマウス（１８〜２３ｇ）を用いて調製した。選別した細胞の腫瘍形成能を評価するために、細胞を、５０％のＭａｔｒｉｇｅｌ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）中で、肩甲骨の間に皮下移植した。典型的には、Ｈ４６０ＴおよびＨＣＣ２４２９では、１匹のヌードマウスあたり１００個の選別した細胞を移植した。３７６２２系では、１匹のヌードマウスあたり２５００個の細胞を移植した。６０２５７系では、１匹のｎｏｄ−ｓｃｉｄマウスあたり５０００個の細胞を移植した。腫瘍は、少なくとも週に１度測定し、腫瘍体積＝０．５×（腫瘍の幅^２）×（腫瘍の長さ）とした。それぞれの移植系は、生じた異種移植片の断片を新しい動物内に外移植することによって増殖させ、したがって、主にｉｎ ｖｉｖｏで維持した。それぞれの系で、異種移植片の組織学は元の腫瘍のそれに似ていた。実験を低継代数の異種移植片で行って繰り返すことができるように、試料を低温保存した。

初代移植片の免疫組織化学的分析を、標準の技法を用いて行い、５Ｔ４の異種発現が明らかとなった。いくつかの複数の移植系において、最も高い５Ｔ４発現は腫瘍−間質の界面で観察された。３７６２２細胞を用いて調製した異種移植片では、上皮−間葉の分化の移行のマーカーであるビメンチンについて同様の染色パターンが観察された。ビメンチンは、６０２７４細胞を用いて調製した異種移植片では検出されなかった。

また、異種移植片中での異種５Ｔ４発現は、フローサイトメトリーによっても観察された。解離した３７６２２移植片は明確に区別できる５Ｔ４^高を示し、生きたヒト細胞で５Ｔ４^低集団が明らかであった（図８Ａ）。無血清培養物を３７６２２異種移植片から確立した際、すべての細胞が高い５Ｔ４を発現し（図８Ａ）、これは幹細胞の成長を促進する培養条件と一致していた。これらの細胞を動物内に再移植した場合、生じた腫瘍は５Ｔ４発現について異種であった（図８Ａ）。

Ｈ４６０Ｔの場合ように５Ｔ４発現がより高い腫瘍原性と関連していたかどうかを決定するために、一次移植異種移植片を解離し、ＦＡＣＳで単離した細胞を動物内に移植した。３７６２２および６０２５７移植系において、５Ｔ４^高細胞は５Ｔ４^低細胞よりも腫瘍原性が高かった（図８Ｂ）。

（実施例５）
腫瘍開始細胞のさらなるバイオマーカー
細胞を培養細胞系から収集し（実施例１および２に記載）、溶解緩衝液（ＱＩＡＧＥＮ、米国カリフォルニア州Ｖａｌｅｎｃｉａ）に再懸濁させ、ＱＩＡＧＥＮ ＲＮＥＡＳＹ（登録商標）カラムを用いて、製造者の指示に従って、全ＲＮＡを精製した。異種移植腫瘍には（実施例４に記載）、腫瘍試料を最初に３ｍｌの氷冷した４Ｍのグアニジニウム／１０％の酢酸ナトリウム緩衝液（ＲＮＡＧＥＮＴＳ（登録商標）、Ｐｒｏｍｅｇａ、米国ウィスコンシン州Ｍａｄｉｓｏｎ）中の超音波処理によって破壊し、フェノール−クロロホルム−イソアミルアルコール（５０：４８：２）で２×抽出し、同体積のイソプロパノールを用いてＲＮＡを水相から沈殿させた。続いて、沈殿物を溶解緩衝液（ＱＩＡＧＥＮ）に再懸濁させ、ＱＩＡＧＥＮ ＲＮＥＡＳＹ（登録商標）カラムを用いて、製造者の指示に従って、全ＲＮＡを精製した。

ＳＵＰＥＲＳＣＲＩＰＴ（登録商標）キット（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ、米国メリーランド州Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ）を用いて、本質的にＢｙｒｎｅら、Ｆ．ｅ．ａ．Ａｕｓｕｂｅｌ編、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、２０００、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．に記載されているように、１０μｇの全ＲＮＡからｃＤＮＡを合成した。第１の鎖の合成は、リボソームＲＮＡからの誤プライミングを防止するために５０℃で実施し、続くｉｎ ｖｉｔｒｏのアンチセンスＲＮＡ（ｃＲＮＡ）の増幅およびビオチン標識にポリ−Ｔプライマーを含有するＴ７ ＲＮＡポリメラーゼプロモーター（Ｔ７Ｔ２４）を利用した。ｃＤＮＡは、ＧＥＮＥＣＨＩＰ（登録商標）試料クリーンアップモジュール（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ、米国カリフォルニア州Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ）を用いて、製造者の指示に従って精製した。合成のためのｉｎ ｖｉｔｒｏのＴ７ポリメラーゼに駆動される転写反応およびアンチセンスｃＲＮＡのビオチン標識には、ＧＥＮＥＣＨＩＰ（登録商標）発現３’−増幅試薬キット（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ、米国カリフォルニア州Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ）を製造者の指示に従って利用した。合成されたｃＲＮＡはＱＩＡＧＥＮ ＲＮＥＡＳＹ（登録商標）カラムを用いて精製した。

それぞれの試料について、１０μｇのビオチン標識したｃＲＮＡを断片化し、製造者によって推奨される緩衝液および条件を用いて、ヒトゲノムＵ１３３＋２ＧＥＮＥＣＨＩＰ（登録商標）オリゴヌクレオチドアレイ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ、米国カリフォルニア州Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ）とハイブリダイズさせた。ＧＥＮＥＣＨＩＰ（登録商標）オリゴヌクレオチドアレイを洗浄し、ストレプトアビジンＲ−フィコエリスリン（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ、米国オレゴン州Ｅｕｇｅｎｅ）を用いて、ＧＥＮＥＣＨＩＰ（登録商標）Ｆｌｕｉｄｉｃｓ Ｓｔａｔｉｏｎ４５０を使用して染色し、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ ＧＥＮＥＣＨＩＰ（登録商標）Ｓｃａｎｎｅｒ３０００（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ、米国カリフォルニア州Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ）を用いて、製造者の指示に従って走査した。蛍光データを収集し、マイクロアレイスイート５．０（ＭＡＳ５）ソフトウェアを用いて遺伝子特異的なシグナル強度に変換し、ここで、遺伝子に特異的なオリゴヌクレオチドを含有する完全一致と単一のミスマッチのプローブ組との間の平均の蛍光の差異を用いてｍＲＮＡシグナル強度を決定する。分析には、同型試料の平均ｍＲＮＡシグナル強度を実験群のそれぞれについて決定した。遺伝子を最初にフィルタリングして、すべての試料がＭＡＳ５ソフトウェアによって存在しない（Ａｂｓｅｎｔ）と示されたプローブを除去した。続いて、平均シグナル強度の値を実験群間で比較して、典型的には２倍を超える平均の倍数の変化を有する遺伝子を同定した。

以下の遺伝子を含めたいくつかの遺伝子が腫瘍開始細胞中で示差的に発現されており、これらはＣＤ２４^−／低ＣＤ４４^＋腫瘍開始細胞中で上昇した発現を示していた：ＴＧＦβＲＩＩＩ、Ｕｎｃ５Ｄ、ＰＮＰＬＡ４、ＫＣＮＪ２、ＧＡＢＲＢ３、ＤＰＹＤ、ＳＰＡＧ１、ＩＣＫ、ＳＴＣ２、ＤＥＦβ１、および予想された遺伝子ＦＬＪ３８７３６。

また、成長および分化における初代培養物の遺伝子発現プロファイル（実施例３を参照）を、Ｈ４６０Ｔ ＣＤ２４^−／低ＣＤ４４^＋およびＣＤ２４^高ＣＤ４４^＋集団のそれとも比較した。初代培養物の分化中により高いレベルで発現された遺伝子の顕著な画分は、ＣＤ２４^高ＣＤ４４^＋細胞中でもより高いレベルで発現されていた（ＦＤＲ＝０．００１５）。Ｈ４６０Ｔおよび８７４２６のデータ組の統計的な比較には、分化した８７４２６培養物中でアップレギュレートされていた上位２５０個の遺伝子をＨ４６０Ｔ集団中で比較した。図７Ｄは、Ｈ４６０Ｔデータ組においてノイズレベルを超える遺伝子の発現の差異を示す。統計的分析により偽発見率０．００１５が得られた。この分析は、これらの非常に異なる実験系がＮＳＣＬＣにおける分化階層の生理的モデルであることを示す。マイクロアレイのデータはフローサイトメトリーによって確認された（図７Ｅ〜７Ｆ）。したがって、陽性選択、低レベルの発現、または分化した細胞の枯渇のいずれかによって腫瘍開始細胞を濃縮または単離するためのさらなるマーカーには、表１および２に記載のものが含まれる（実施例３を参照）。

（実施例６）
Ｓｏｘ２は肺癌の腫瘍開始細胞の分化を調節する
ＣＤ２４^高へと移行したクローンを安定化したクローン（＞９９％のＣＤ２４^−／低）と比較するために、遺伝子発現プロファイリングをＣＤ２４^−／低ＣＤ４４^＋クローンのパネルで行った。ＣＤ２４^−／低ＣＤ４４^＋細胞をそれぞれのクローンから選別し、実施例５に記載のようにＲＮＡをマイクロアレイ分析用に抽出した。

安定したＣＤ２４^−／低ＣＤ４４^＋クローンおよび移行中のＣＤ２４^−／低ＣＤ４４^＋クローンの遺伝子発現プロファイルは全体的に類似であったが、一部の遺伝子のｍＲＮＡレベルは移行効率と相関していた。たとえば、Ｓｏｘ２のｍＲＮＡレベルは安定したクローン中よりも移行中のクローン中で高かった（図９Ａ）。Ｓｏｘ２は幹細胞における多能性および自己複製に必要な転写因子であり（Ａｖｉｌｉｏｎら、Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．、２００３、１７：１２６〜１４０、Ｂｏｙｅｒら、Ｃｅｌｌ、２００５、１２２：９４７〜９５６）、分化した細胞中の多能性の誘発に寄与する可能性がある（ＴａｋａｈａｓｈｉおよびＹａｍａｎａｋａ、Ｃｅｌｌ、２００６、１２６：６６３〜６７６）。親Ｈ４６０Ｔ細胞では、Ｓｏｘ２はＣＤ２４^−／低ＣＤ４４^＋腫瘍開始細胞中では発現されたが、ＣＤ２４^高ＣＤ４４^＋細胞中では発現されなかった。

Ｓｏｘ２がＣＤ２４^−／低からＣＤ２４^高の発現への移行を調節できるかどうかを試験するために、外因性Ｓｏｘ２を安定したＣＤ２４^−／低ＣＤ４４^＋クローン内に導入した。ＧｅｎｅＣｏｐｏｅｉａ（米国メリーランド州Ｇｅｒｍａｎｔｏｗｎ）製の発現ベクターＥＸ−Ｔ２５４７−Ｍ４６（Ｓｏｘ−２）およびＥＸ−Ｍ０４２５−Ｍ４６（Ｓｏｘ−１１）を、Ａｍａｘａ ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ溶液Ｖ、プログラムＴ−０２０（２μｇのＤＮＡ／１０^６個の細胞）を用いてＨ４６０Ｔクローン内に導入した。安定したクローンを、Ｓｏｘ２−Ｆｌａｇ、Ｓｏｘ１１−Ｆｌａｇ、空のベクター、またはＤＮＡなしを用いて形質移入した。形質移入の４８時間後、Ｇ４１８を４００μｇ／ｍｌまで加えた。細胞をＧ４１８中で６日間インキュベーションし、続いてＧ４１８なしでインキュベートした。免疫ブロット分析を実施例２に記載のように実施し、これにより、示した導入遺伝子の発現が確認された（図９Ｂ）。Ｇ４１８中での６日間の選択およびさらに２週間の培養後、３つの安定したＣＤ２４^−／低ＣＤ４４^＋クローンのすべてが、Ｓｏｘ２−Ｆｌａｇを用いて形質移入した後にＣＤ２４^高ＣＤ４４^＋細胞の大きな画分を示したが、Ｓｏｘ１１−Ｆｌａｇまたは空のベクターを用いた場合はそうではなかった（図９Ｃ〜９Ｄ）。これらのデータにより、Ｓｏｘ２がＣＤ２４^−／低からＣＤ２４^高への移行を駆動するために十分であることが示され、多能性腫瘍開始細胞の分化における役割が示された。

（実施例７）
抗５Ｔ４抗体／薬物のコンジュゲートを用いた腫瘍細胞の成長の阻害
ＣＤ２４^−／低ＣＤ４４^＋集団は、細胞生存度アッセイおよびコロニー成長アッセイにおいてＣＤ２４^高ＣＤ４４^＋集団よりも抗５Ｔ４抗体−薬物のコンジュゲートに対する感受性が高かった。それぞれのアッセイについて、抗体−カリチアマイシンＡｃＢｕｔ連結（ＡｃＢｕｔ−ＡｃＢｕｔ−［４−（４−アセチルフェノキシ）ブタン酸］）のコンジュゲートを記載のように調製した（Ｈａｍａｎｎら、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ．Ｃｈｅｍ．、２００２、１３：４７〜５８）。選別した細胞に対する抗５Ｔ４ ｈｕＨ８抗体−薬物のコンジュゲートまたは抗ＣＤ２２抗体−薬物のコンジュゲートの効果を、細胞生存度の指示薬（（３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−５（３−カルボキシメトキシフェノール−２−（４−スルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム（ＭＴＳ）（Ｐｒｏｍｅｇａ、米国ウィスコンシン州Ｍａｄｉｓｏｎ）を用いて評価して、薬物処理に曝した後の生存した細胞の数を決定した。細胞はアッセイ開始の１８時間前に選別した。細胞を９６ウェルのマイクロタイタープレートに１０，０００個の細胞／ウェルの密度で播種し、様々な濃度の薬物に曝した。９６時間の薬物への曝露を生存した生細胞数を決定した後、それぞれの処理のＩＣ_５０は、用量応答曲線から誘導したロジスティック退縮パラメータに基づいて計算した。ＩＣ_５０値はロジスティック非直線退縮によって計算し、５０％の細胞生存度の低下を引き起こすそれぞれの処置群のカリチアマイシンジメチルヒドラジド（ＣａｌｉｃｈＤＭＨ）の濃度として報告する。ＣＤ２４^−／低ＣＤ４４^＋細胞は、抗５Ｔ４−カリチアマイシンのコンジュゲートに対して１０倍を超える感度を有していた（図１０Ａ）。抗ＣＤ２２−カリチアマイシンのコンジュゲートまたはカリチアマイシン単独で処理した場合に、２つの集団間の差異は観察されなかった（図１０Ａ）。

コロニー形成アッセイを行うために、細胞を２４ウェルプレートに５，０００個の細胞／ウェルの密度で播種した。播種の２４時間後、細胞を様々な濃度（０．００００９７、０．０００３９０、０．００１５６、０．００６２５、０．０２５、０．１、０．４ｎｇのカリチアマイシン相当／ｍｌ）の抗５Ｔ４ Ｈ８−ＡｃＢｕｔのコンジュゲート、抗ＣＤ２２ ＡｃＢｕｔのコンジュゲート、またはカリチアマイシン単独に曝した。薬物に曝した７２時間後、細胞をトリプシン処理し、計数し、２００個の細胞を６ウェルプレートに播種した。８日後、コロニーを固定し、メチレンブルーで染色した。ステレオスコープを用いてコロニー数／ウェルを計数した。ＣＤ２４^−／低ＣＤ４４^＋細胞はコンジュゲートに対して１０倍を超える感度を有していた（図１０Ｂ）。抗ＣＤ２２−カリチアマイシンのコンジュゲートまたはカリチアマイシン単独で処理した場合に、２つの集団間の差異は観察されなかった（図１０Ｂ）。

５Ｔ４発現が腫瘍形成能と直接関連していたかどうかを試験するために、Ｈ４６０Ｔ細胞を５Ｔ４^高および５Ｔ４^低の発現に基づいて選別し、マウス内に皮下移植した。５Ｔ４^高細胞の腫瘍は５Ｔ４^低細胞の腫瘍よりも大きかった（ｐ＜０．０３、図１１）。この実験ではＨ４６０Ｔクローン系２４Ｎ−２６を使用し、これは、親系と比較してより高い５Ｔ４発現のレベルならびに増加した５Ｔ４^高および５Ｔ４^低発現の分解能を示す。

（実施例８）
抗５Ｔ４抗体／薬物のコンジュゲートを用いた腫瘍の退縮
ヌード（３７６２２用）またはｎｏｄ−ｓｃｉｄ（６０２７４用）マウスに、低継代数の初代移植片の断片を肩甲骨の間に皮下注射した。腫瘍が０．２〜０．５ｇの質量に達した際、治療を投与する前に様々な処置群間で腫瘍質量が均質であることを確実にするために、腫瘍をステージングした。抗５Ｔ４ ｈｕＨ８抗体および抗ＣＤ３３ ｐ６７．６抗体を、記載のようにアミドリンカーを介してカリチアマイシンとコンジュゲートさせた（Ｈａｍａｎｎら、Ｂｉｏｃｏｎｕｇ．Ｃｈｅｍ．、２００２、１３：４０〜４６）。「アミド」リンカーは、カリチアマイシンの、抗体−薬物のコンジュゲートを内部移行させる細胞への放出を制限する（Ｈａｍａｎｎら、Ｂｉｏｃｏｎｕｇ．Ｃｈｅｍ．、２００２、１３：４０〜４６）。抗体−薬物のコンジュゲートまたはビヒクルを、無菌生理食塩水（０．２ｍｌ／マウス）中で、１日目にそれぞれ腹腔内投与し、同じ処置を４日間の間隔で２回繰り返した（Ｑ４Ｄ×３）。カリチアマイシンコンジュゲートは、１６０μｇ／ｋｇのＣａｌｉｃｈＤＭＨの用量で投与した。腫瘍は少なくとも週に１度測定し、その質量は体積＝０．５×（腫瘍の幅^２）（腫瘍の長さ）とした。それぞれの処置群の平均腫瘍体積（±ＳＥＭ）を計算し、片側ｔ検定を用いた統計的有意性のためにビヒクルで処置した群と比較し、ｔ検定の誤差項はすべての処置群にわたるプールした分散に基づく。それぞれの処置群の腫瘍値は、処置開始の１２０日後まで、または腫瘍を保有するマウスが死亡するまでもしくは腫瘍が体重の１５％まで成長するまで（この時点で、これらのマウスは施設の規制に従って安楽死させた）記録した。抗ＣＤ３３コンジュゲートは、これらの異種移植片がＣＤ３３を発現しないため、対照として役割を果たした。

抗５Ｔ４−カリチアマイシンのコンジュゲートを用いた処置により、３７６２２異種移植片が完全に根絶され、研究の終わりである最後の投薬の１２０日後まで、再成長は観察されなかった（図１２Ａ）。ビヒクルまたは抗ＣＤ３３−カリチアマイシンのコンジュゲートで処置した異種移植片は大きな腫瘍へと成長した。同様に、６０２７４異種移植片を抗５Ｔ４−カリチアマイシンのコンジュゲートで処置することで、腫瘍が有意に退縮した（図１２Ｂ）。対照的に、６０２７４腫瘍を最大の耐容用量のシスプラチンで処置することで、腫瘍の大きさが一過的に低下し、腫瘍は投薬レジメンの完了後に急速に再成長した（図１２Ｃ）。６０２７４細胞は、３７６２２細胞と比較して５Ｔ４をより低いレベルで発現した（図１３）。これらの結果は、異種５Ｔ４発現を有するＮＳＣＬＣ初代移植片の成長阻害に対する抗５Ｔ４抗体−カリチアマイシンのコンジュゲートの特異的な効果を実証している。

Claims (36)

1. 腫瘍細胞集団に由来する単離された腫瘍開始細胞集団であって、前記単離された腫瘍開始細胞集団が少なくとも90％の腫瘍開始細胞を含み、前記腫瘍開始細胞は、（ｉ）同じ起源の非腫瘍原性細胞よりも少なくとも２倍高いレベルで５Ｔ４を発現し、（ｉｉ）腫瘍原性であり、（ｉｉｉ）遊走が可能であり、（ｉｖ）自己複製が可能であり、（ｖ）非腫瘍原性細胞を含む腫瘍を生じる、単離された腫瘍開始細胞集団。
2. 少なくとも９５％の腫瘍開始細胞を含む、請求項１に記載の単離された腫瘍開始細胞集団。
3. 腫瘍開始細胞が、それが由来する腫瘍細胞集団の５０％未満を構成する、請求項１に記載の単離された腫瘍開始細胞集団。
4. 腫瘍開始細胞が、それが由来する腫瘍細胞集団の３３％未満を構成する、請求項３に記載の単離された腫瘍開始細胞集団。
5. 腫瘍開始細胞が、それが由来する腫瘍細胞集団の２５％未満を構成する、請求項４に記載の単離された腫瘍開始細胞集団。
6. 腫瘍開始細胞が、それが由来する腫瘍細胞集団の１５％未満を構成する、請求項５に記載の単離された腫瘍開始細胞集団。
7. 腫瘍開始細胞が、それが由来する腫瘍細胞集団の１０％未満を構成する、請求項６に記載の単離された腫瘍開始細胞集団。
8. 腫瘍開始細胞および非腫瘍原性細胞を含む腫瘍細胞集団に由来する濃縮された腫瘍開始細胞集団であって、前記腫瘍開始細胞が、（ｉ）同じ起源の非腫瘍原性細胞よりも少なくとも２倍高いレベルで５Ｔ４を発現し、（ｉｉ）腫瘍原性であり、（ｉｉｉ）遊走が可能であり、（ｉｖ）自己複製が可能であり、（ｖ）非腫瘍原性細胞を含む腫瘍を生じ、（ｖｉ）前記腫瘍細胞集団と比較して少なくとも２倍濃縮されている、濃縮された腫瘍開始細胞集団。
9. 腫瘍開始細胞が、前記腫瘍細胞集団と比較して少なくとも５倍濃縮されている、請求項８に記載の濃縮された腫瘍開始細胞集団。
10. 腫瘍開始細胞が、前記腫瘍細胞集団と比較して少なくとも１０倍濃縮されている、請求項９に記載の濃縮された腫瘍開始細胞集団。
11. 腫瘍開始細胞が、前記腫瘍細胞集団と比較して少なくとも５０倍濃縮されている、請求項１０に記載の濃縮された腫瘍開始細胞集団。
12. 腫瘍開始細胞が、前記腫瘍細胞集団と比較して少なくとも１００倍濃縮されている、請求項１１に記載の濃縮された腫瘍開始細胞集団。
13. 同じ起源の非腫瘍原性細胞よりも少なくとも５倍高いレベルで５Ｔ４を発現する、請求項１に記載の単離された腫瘍開始細胞集団または請求項８に記載の濃縮された腫瘍開始細胞集団。
14. 同じ起源の非腫瘍原性細胞よりも少なくとも１０倍高いレベルで５Ｔ４を発現する、請求項１に記載の単離された腫瘍開始細胞集団または請求項８に記載の濃縮された腫瘍開始細胞集団。
15. 同じ起源の非腫瘍原性細胞よりも少なくとも５倍低いレベルでＣＤ２４をさらに発現する、請求項１に記載の単離された腫瘍開始細胞集団または請求項８に記載の濃縮された腫瘍開始細胞集団。
16. ＣＤ４４をさらに発現する、請求項１に記載の単離された腫瘍開始細胞集団または請求項８に記載の濃縮された腫瘍開始細胞集団。
17. 同じ起源の非腫瘍原性細胞よりも少なくとも５倍低いレベルでＣＤ２４をさらに発現し、およびＣＤ４４をさらに発現する、請求項１に記載の単離された腫瘍開始細胞集団または請求項８に記載の濃縮された腫瘍開始細胞集団。
18. 肺腫瘍に由来する、請求項１に記載の単離された腫瘍開始細胞集団または請求項８に記載の濃縮された腫瘍開始細胞集団。
19. 単離された腫瘍開始細胞集団の１０個以下の細胞の部分集団が、触知可能な腫瘍を形成する能力を有する、請求項１に記載の単離された腫瘍開始細胞集団または請求項８に記載の濃縮された腫瘍開始細胞集団。
20. （ａ）細胞の大多数が５Ｔ４を低レベルで発現し、細胞の少数が５Ｔ４を高レベルで発現する、解離した腫瘍細胞を提供するステップと、
    （ｂ）前記解離した腫瘍細胞を、５Ｔ４と特異的に結合する薬剤と接触させるステップと、
    （ｃ）前記低レベルよりも少なくとも２倍高い、高レベルの５Ｔ４発現を示す（ｂ）の薬剤と特異的に結合する細胞を選択するステップと
    を含み、それにより、腫瘍開始細胞集団が単離または濃縮される、腫瘍開始細胞集団を単離または濃縮する方法。
21. ５Ｔ４と特異的に結合する薬剤が抗５Ｔ４抗体である、請求項２０に記載の方法。
22. 前記単離または濃縮された腫瘍開始細胞集団が少なくとも９５％の腫瘍開始細胞を含む、請求項２０に記載の方法。
23. 腫瘍開始細胞集団が、腫瘍開始細胞中で、解離した腫瘍細胞と比較して少なくとも２倍濃縮される、請求項２０に記載の方法。
24. 腫瘍開始細胞集団が、腫瘍開始細胞中で、解離した腫瘍細胞と比較して少なくとも５倍濃縮される、請求項２３に記載の方法。
25. 腫瘍開始細胞集団が、腫瘍開始細胞中で、解離した腫瘍細胞と比較して少なくとも１０倍濃縮される、請求項２４に記載の方法。
26. 解離した腫瘍細胞が肺癌細胞である、請求項２３から２５のいずれか１つに記載の方法。
27. 細胞を選択するステップが、フローサイトメトリー、蛍光活性化細胞選別、パニング、親和性カラム分離、または磁気選択によって行われる、請求項２０に記載の方法。
28. （ｄ）前記解離した腫瘍細胞を、ＣＤ４４と特異的に結合する薬剤と接触させるステップと、
    （ｅ）（ｄ）の薬剤と特異的に結合する細胞を選択するステップと
    をさらに含む、請求項２０に記載の方法。
29. ＣＤ４４と特異的に結合する薬剤が抗ＣＤ４４抗体である、請求項２８に記載の方法。
30. （ｄ）前記解離した腫瘍細胞を、ＣＤ２４と特異的に結合する薬剤と接触させるステップと、
    （ｅ）同じ起源の非腫瘍原性細胞よりも少なくとも５倍低い、低レベルのＣＤ２４発現を示し、かつ（ｄ）の薬剤と特異的に結合する細胞を選択するステップと
    をさらに含む、請求項２０または２８に記載の方法。
31. ＣＤ２４と特異的に結合する薬剤が抗ＣＤ２４抗体である、請求項３０に記載の方法。
32. （ｄ）前記解離した腫瘍細胞を、ＣＤ２４と特異的に結合する薬剤と接触させるステップと、
    （ｅ）同じ起源の非腫瘍原性細胞よりも少なくとも５倍高い、高レベルのＣＤ２４発現を示し、かつ（ｄ）の薬剤と特異的に結合する細胞を枯渇させるステップと
    をさらに含む、請求項２０または２８に記載の方法。
33. （ｄ）前記解離した腫瘍細胞を、腫瘍細胞によって発現される分化マーカーと特異的に結合する１つまたは複数の薬剤と接触させるステップと、
    （ｅ）（ｄ）の１つまたは複数の薬剤と特異的に結合する細胞の腫瘍開始細胞集団を枯渇させるステップと
    をさらに含む、請求項２０に記載の方法。
34. ＣＤ２４と特異的に結合する薬剤が抗ＣＤ２４抗体である、請求項３３に記載の方法。
35. 請求項２０から３４のいずれか一項に記載の方法に従って単離および調製された、単離または濃縮された腫瘍開始細胞集団。
36. （ａ）請求項１から１９または３５のいずれか一項に記載の、単離または濃縮された腫瘍開始細胞集団を提供するステップと、
    （ｂ）前記腫瘍開始細胞を抗癌薬または候補抗癌薬と接触させるステップと、
    （ｃ）前記腫瘍開始細胞を抗癌薬または候補抗癌薬と接触させた後の、腫瘍開始細胞の腫瘍形成能の変化を観察するステップと
    を含む、抗癌薬または候補抗癌薬の有効性を試験する方法。
    

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