JP5753720B2 - バイオセンサ - Google Patents

Description

本発明は、ヒトや動物の体液に含まれる特定の基質を測定するバイオセンサに関する。

従来、被験者の腹部や腕部に植え込んだ電気化学センサを利用して、血液，尿，間質液のような体液中の被検物質に関する数値情報、例えば、被検者の間質液中のグルコース濃度（いわゆる血糖値）を連続的に測定する技術が知られている。電気化学センサは、電気化学反応を利用して微量な電流を検出可能なセンサであり、酸化還元反応を生じる微量な化学物質の検出に適している。

グルコース濃度を測定するための電気化学センサとして、センサ部に酵素を固定化し、酵素反応を利用して試料中の被検物質を検出するバイオセンサを用いることが多い。この種のバイオセンサは、一般に、作用極と対極とを有しており、作用極には酵素（例えば、グルコース酸化酵素）が固定化されている。グルコース濃度は、作用極と対極との間に電圧を印加した場合に得られる応答電流に基づいて測定することができる。

グルコース酸化酵素は、酸素の存在下、グルコースと選択的に反応してグルコン酸を生成する。この際に、酸素が還元される一方で、グルコースの量に比例した過酸化水素が生成される。過酸化水素は、電気化学的に容易に酸化することができるので、一対の電極を用いて測定することができる。すなわち、応答電流値は、このように酵素の酸化反応により発生した過酸化水素を電気的に酸化することにより得ることができる。そして、グルコース濃度は、連続的に得られる応答電流値から定期的に電流をサンプリングすることで得られるサンプリング電流に基づいて演算することができる。

ところで、生体液中には、上述したグルコース測定のための応答電流の測定値に干渉を及ぼす干渉物質が含まれることがある。干渉物質として、例えば、アスコルビン酸，赤血球，ビタミンＣが知られている。グルコース濃度の測定対象となる生体液に干渉物質が含まれていると、応答電流中に、酵素による酸化還元反応に由来する信号成分だけでなく、干渉物質と電極との反応のような非酵素的な反応（非特異反応）に由来する信号成分が混在する。この場合、応答電流に基づき得られたグルコース濃度が、実際の値と著しく異なってしまう可能性があった。

応答電流の観測では、当該応答電流に非特異反応に由来する信号成分が含まれているか否かの判断は困難である。そこで、従来では、センサの電極上に干渉物質除去膜を作成し、生体成分以外の干渉物質が電極と反応することが防止する技術がある（例えば特許文献１参照）。

米国特許公報第５３５６７８６号公報 米国特許公報第７００３３４１号公報 米国特許公報第７１９０９８８号公報 米国特許公報第７４６２２６４号公報

しかしながら、特許文献１に記載されたような干渉物質除去膜を電極上に作成する技術
では、電極上に試薬を配置する構成が複雑となる。また、干渉物質除去膜は、意図された特定の干渉物質しか除くことができなかった。

本発明は、上述した事情に鑑みなされたものであり、干渉物質の影響を抑えて精度の高い基質の物理量の測定結果を得ることができる技術を提供することを目的とする。

本発明は、上記した課題を解決するため、以下の構成を採用する。
すなわち、本発明の第１の態様は、バイオセンサであって、
特定の基質と反応する性質を有する生体触媒が配置された、第１作用極と、
前記特定の基質と反応する性質が失われた、前記生体触媒が配置された、第２作用極と、
前記第１作用極、及び前記第２作用極との間に、それぞれ電圧を印加するための少なくとも１つの対極と、を含む。

本発明の第１の態様によると、少なくとも１つの対極と第１作用極との間、少なくとも１つの対極と第２作用極との間の夫々に電圧を印加すると、第１作用極からの応答電流（第１応答電流と称する）と、第２作用極からの応答電流（第２応答電流と称する）とが得られる。第１応答電流は生体触媒と特定の基質の反応（生体触媒反応）に由来する信号成分と、生体触媒反応に由来しない信号成分とを含むのに対し、第２応答電流は生体触媒と特定の基質の反応に由来する信号成分を含んでいない。すなわち、第２応答電流は、生体触媒反応に由来しない信号成分のみを含んでいると考えることができる。よって、例えば、第１応答電流から第２応答電流を差し引くことで、第１応答電流から生体触媒反応に由来する信号成分を抽出することができる。これにより、正確な特定の基質の物理量（例えば濃度）を求めることが可能となる。

第１の態様において、第１作用極及び第２作用極の夫々から応答電流を得るための対極の数は１つに限られない。すなわち、第１作用極及び第２作用極の夫々に対応する対極が用意されていても良い。もっとも、第１作用極と第２作用極との間で共通な対極を１つ設けることで、バイオセンサの製造工数の低減、バイオセンサの小型化・簡素化を図ることができる。また、対極及び作用極以外に参照極が設けられていても良い。

本発明の第１の態様は、前記特定の基質と反応する性質を有する生体触媒を前記第２作用極に配置し、前記第２作用極に対してエネルギーを与えて、前記生体触媒の前記性質を失わせる、構成を採用することができる。上記エネルギーは、例えば、熱エネルギー及び電気的エネルギーの少なくとも一方を適用することができる。

また、本発明の第１の態様は、前記特定の基質と反応する性質を有する生体触媒を前記第２作用極に配置し、前記第２作用極に対して前記生体触媒の前記性質を喪失または阻害する物質を添加し、前記生体触媒の前記性質を失わせる、ように構成されていても良い。

また、本発明に適用可能な生体触媒は、例えば、酵素である。酵素は、物理量の測定対象の特定の基質に応じた酵素が選択される。例えば、特定の基質がグルコースであれば、酵素として、グルコース酸化酵素（グルコースオキシダーゼ：ＧＯＤ）やグルコース脱水素酵素（グルコースデヒドロゲナーゼ：ＧＤＨ）を適用することができる。

本発明の第２の態様は、バイオセンサであって、特定の基質と反応する性質を有する第１生体触媒が配置された、第１作用極と、
前記特定の基質と反応する性質を有する第２生体触媒が配置された、第２作用極と、
前記第１作用極、及び前記第２作用極との間に、それぞれ電圧を印加するための少なく
とも１つの対極と、を備え、前記第１生体触媒及び前記第２生体触媒の前記基質との反応速度はそれぞれ異なることを特徴する。

本発明の第２の態様によれば、第１生体触媒と第２生体触媒の上記基質との反応速度が夫々異なる。すなわち、第１生体触媒と第２生体触媒とは、異なる最大反応速度Ｖmaxと
ミカエリス定数Ｋｍとの少なくとも一方を有する。言い換えれば、両者は異なるキャリブレーションカーブを有する。このことは、第１生体触媒との反応から基質の物理量を求めるための検量線と、第２生体触媒の反応から基質の物理量を求めるための検量線とが異なることを意味する。

そして、第２の態様に係るバイオセンサで、同一の体液について第１作用極から応答電流ｙを得るとともに、第２作用極から応答電流ｙ´を得る場合において、体液中に含まれる干渉物質が第１作用極及び第２作用極に対して等しく影響を与えると仮定するならば、応答電流ｙ及びｙ´は、次のように表すことができる。
ｙ＝ａｘ＋ｃ・・・（１）， ｙ´＝ｂｘ＋ｃ・・・（２）

ここに、ｃは、干渉物質のような非生体触媒の反応に由来する信号成分であり、ａは第１生体触媒に応じた検量線係数であり、ｂは第２生体触媒に応じた検量線係数である。また、ｘは、体液中の特定の基質の物理量である。上記式（１）及び（２）を用いて、次のｘを求める式（３）を得ることができる。
ｘ＝（ｙ−ｙ´）／（ａ−ｂ）・・・（３）
よって、特定の基質の物理量を正確に測定することができる。

第２の態様において、前記第１生体触媒及び前記第２生体触媒は、例えば、酵素である。酵素としては、例えば、第１の態様において説明したものを適用することができる。また、第２生体触媒としては、前記第１生体触媒に対して遺伝子改変を施した酵素を適用することができる。

本発明の第３の態様は、バイオセンサであって、特定の基質と反応する性質を有する第１生体触媒が配置された、第１作用極と、
前記特定の基質と反応する性質を有する第２生体触媒が配置された、第２作用極と、
前記第１作用極、及び前記第２作用極との間に、それぞれ電圧を印加するための少なくとも１つの対極と、を備え、
前記第1作用極上と前記第２作用極上の前記反応面積は異なることを特徴とする。

本発明の第３の態様によれば、第１作用極上と第２作用極上の反応面積が異なることで、第２の態様と同様に、第１作用極からの応答電流から特定の基質の物理量を求める検量線と、第２作用極からの応答電流から特定の基質の物理量を求める検量線が異なることになる。よって、第２実施形態と同様の手法を用いて、特定の基質の物理量ｘを求めることができるので、正確な物理量ｘを測定することが可能となる。

本発明の第４の態様は、バイオセンサであって、特定の基質と反応する性質を有する第１生体触媒が配置された、第１作用極と、
前記特定の基質と反応する性質を有する第２生体触媒が配置された、第２作用極と、
前記第１作用極、及び前記第２作用極との間に、それぞれ電圧を印加するための少なくとも１つの対極と、を備え、
前記第1作用極上と前記第２生体触媒上のそれぞれの総反応活性は異なることを特徴と
する。

本発明の第４の態様によれば、第１作用極上と第２作用極上のそれぞれの総反応活性が
異なることで、第２及び第３の態様と同様に、第１作用極からの応答電流から特定の基質の物理量を求める検量線と、第２作用極からの応答電流から特定の基質の物理量を求める検量線が異なることになる。よって、第２実施形態と同様の手法を用いて、特定の基質の物理量ｘを求めることができるので、正確な物理量ｘを測定することが可能となる。

第３の態様及び第４の態様における第１生体触媒及び第２生体触媒は、同種類の生体触媒であっても良く、異なる生体触媒であっても良い。また、第１生体触媒及び第２生体触媒の夫々は、例えば酵素であり、第１の態様について説明した酵素を適用することができる。

本発明の第５の態様は、測定機であって、特定の基質と反応する性質を有する生体触媒が配置された第１作用極と、対極との間での、電圧印加により得られる前記第１作用極からの第１信号値を検出する、第１検出部と、
前記特定の基質との反応する性質が失われた前記生体触媒が配置された第２作用極と、対極との間での、電圧印加により得られる前記第２作用極からの第２信号値を検出する、第２検出部と、
前記第１信号値から算出された前記特定の基質の濃度を前記第２信号値で補正する補正部と、
前記補正された前記特定の基質の濃度を出力する出力部とを含む。

第５の態様における前記補正部は、前記第１信号値から前記第２信号値を減じた値を前記特定基質の補正濃度として算出する、ように構成することができる。

本発明の第６の態様は、測定機であり、特定の基質と反応する性質を有する第１生体触媒が配置された第１作用極と、対極との間での、電圧印加により得られる前記第１作用極からの第１信号値を検出する、第１検出部と、
前記特定の基質と反応する性質を有し、かつ前記第１生体触媒とは反応速度が異なる、第２生体触媒が配置された第２作用極と、対極との間での、電圧印加により得られる前記第２作用極からの第２信号値を検出する、第２検出部と、
前記第１信号値から算出された前記特定の基質の濃度を前記第２信号値で補正する補正部と、
前記補正された前記特定の基質の濃度を出力する出力部とから構成される。

第６の態様において、前記補正部は、或る時間ｔにおける前記第１信号ｙ（ｔ）を検量線係数ａ，前記特定基質の濃度ｘ，及び前記生体液中の特定基質以外の物質に基づく信号成分ｃにより一次関数ｙ（ｔ）＝ａｘ（ｔ）＋ｃで表し、前記或る時間ｔにおける前記第２信号ｙ´を検量線係数ｂ，前記特定物質の濃度ｘ，及び前記信号成分ｃにより一次関数ｙ´（ｔ）＝ｂｘ（ｔ）＋ｃで表したときに、前記第１信号ｙ（ｔ）及び前記第２信号ｙ´（ｔ）中の前記信号成分ｃの値が等しいとの仮定において前記特定基質の濃度ｘ（ｔ）を以下の式に基づいて求めるように構成することができる。
（式） ｘ（ｔ）＝（ｙ（ｔ）−ｙ´（ｔ））／（ａ−ｂ）

本発明の第７の態様は、特定の基質と反応する性質を有する生体触媒が配置された第１作用極と、対極との間での、電圧印加による得られる前記第１作用極からの第１信号値を検出するステップと、
前記特定の基質との反応する性質が失われた前記生体触媒が配置された第２作用極と対極との間での、電圧印加により得られる前記第２作用極からの第２信号値を検出するステップと、
前記第１信号値から算出された前記特定の基質の濃度を前記第２信号値で補正するステップと、
を情報処理装置に実行させるプログラムである。

第７の態様は、前記補正するステップにおいて、前記第１信号値から前記第２信号値を減じた値を前記特定基質の補正濃度として算出する、ように構成することができる。

本発明の第８の態様は、特定の基質と反応する性質を有する第１生体触媒が配置された第１作用極と、対極との間での、電圧印加による得られる前記第１作用極からの第１信号値を検出するステップと、
前記特定の基質と反応する性質を有し、かつ第１生体触媒とは反応速度の異なる第２生体触媒が配置された、第２作用極と対極との間での、電圧印加により得られる前記第２作用極からの第２信号値を検出するステップと、
前記第１信号値から算出された前記特定の基質の濃度を前記第２信号値で補正するステップと、
を情報処理装置に実行させるプログラムである。

第８の態様は、前記補正するステップにおいて、或る時間ｔにおける前記第１信号ｙ（ｔ）を検量線係数ａ，前記特定基質の濃度ｘ，及び前記生体液中の特定基質以外の物質に基づく信号成分ｃにより時間の一次関数ｙ（ｔ）＝ａｘ（ｔ）＋ｃで表し、前記或る時間ｔにおける前記第２信号ｙ´を検量線係数ｂ，前記特定物質の濃度ｘ，及び前記信号成分ｃにより時間の一次関数ｙ´（ｔ）＝ｂｘ（ｔ）＋ｃで表し、前記第１信号ｙ（ｔ）及び前記第２信号ｙ´（ｔ）中の前記信号成分ｃの値が等しいと仮定し、前記特定基質の濃度ｘ（ｔ）を以下の式により求める、ように構成することができる。
（式） ｘ（ｔ）＝（ｙ（ｔ）−ｙ´（ｔ））／（ａ−ｂ）

また、本発明は、上記した第７および第８の態様とほぼ同様の構成を有する測定方法の発明、あるいは、第７および第８の態様にかかるプログラムを記録したコンピュータ読み取り可能な記録媒体の発明として特定することが可能である。

本発明によれば、干渉物質の影響を抑えた精度の高い基質の物理量の測定結果を得ることができる。

本発明の第１実施形態における測定機の概略構成を示す図である。 図１に示したバイオセンサ（グルコースセンサ）の構成例を示す図であり、図２（Ａ）は平面図、図２（Ｂ）はＡ−Ａ線断面図である。 図１に示した制御コンピュータに係る構成例を示す図である。 第１実施形態に係る制御部のプログラム処理の例を示すフローチャートである。 第２実施形態における第１作用極及び第２作用極からの応答電流とグルコース濃度の関係を示すグラフである。 第２実施形態における制御部のプログラム処理の例を示すフローチャートである。 第２実施形態の作用効果を説明するシミュレーション実験例を示すグラフであって、センサ出力（応答電流）の時間変化を示す。 第２実施形態の作用効果を説明するシミュレーション実験例を示すグラフであって、検体濃度の時間変化を示す。 本発明の実施例１を示すグラフであり、グルコース添加時における応答電流密度を示す。 本発明の実施例１を示すグラフであり、アスコルビン酸添加時における応答電流密度を示す。 本発明の実施例１を示すグラフであり、グルコース添加による応答電流密度と、アスコルビン酸添加による応答電流密度への影響を示すとともに、本発明に係る補正方法にて補正した補正電流密度の時間変化を示す。 本発明の実施例２に係るグラフであり、天然ＧＤＨで調整した主センサ（Main WE）、及び遺伝子改変ＧＤＨで調整した副センサ（Sub WE）のグルコースに対する検量線を示す。 本発明の実施例２に係るグラフであり、主センサ及び副センサのセンサ出力の推移を示す。 本発明の実施例２に係るグラフであり、主センサのセンサ出力と副センサのセンサ出力とを用いて補正したグルコース濃度の推移を示す。

以下、図面を参照して本発明の実施の形態について説明する。実施の形態の構成は零時であり、本発明は実施の形態の構成に限定されない。

〔第１実施形態〕
図１は、第１実施形態にかかる測定装置（測定機）１の概略構成を示す図である。図１に示す測定機１は、体液中の特定の基質の物理量として、ヒトや動物の間質液または血液中のグルコースの濃度を連続的に自動で測定するために使用される。測定装置１は、筺体（ハウジング）２と、制御コンピュータ３と、電気化学センサ４とを備えている。

電気化学センサ４は、電気化学的反応を利用して特定の被検物質を検出するセンサであり、本実施形態ではバイオセンサが適用されている。バイオセンサは、生物または生物由来の材料を、被検物質を検出する素子として用いて、被検物質を連続的に測定、検出する。

本実施形態における電気化学センサ４は、間質液または血液中のグルコース濃度を連続的に測定するために用いられる。以下、電気化学センサ（バイオセンサ）４を、「グルコースセンサ４」と称する。

筺体２は、測定機１の外形をなすものであり、カバー２０および基板２１を含んでいる。カバー２０および基板２１は相互に固定されており、これらによって画定される制御コンピュータ３が収容されている。筺体２は、防水性あるいは耐水性を有する材料を用いて構成される。筺体２は、たとえば、少なくともカバー２０（必要に応じて基板２１）が、金属や合成樹脂などの透水性の極めて低い材料により形成されることができる。合成樹脂としては、たとえば、ポリプロピレンを適用することができる。

基板２１には、グルコースセンサ４の基端部４０Ａが固定され、グルコースセンサ４の末端部４０Ｂは、基板２１に設けられた図示しない挿通口を通じて筺体２の外部に延出する。基板２１の外面には、接着フィルム５が固定されている。接着フィルム５は、測定機１を被検者の皮膚上に固定するために使用される。接着フィルム５として、たとえば、両面粘着性を有する両面テープが適用される。

制御コンピュータ３は、グルコースセンサ４に対する電圧印加、応答電流からのグルコース濃度の演算のような、グルコースを測定するための所定の動作を実施するために必要なコンピュータなどを構成する電子部品群と、グルコースセンサ４が備える電極４２との電気的接続を行う端子３０とを備えている。端子３０は、グルコースセンサ４に電圧を印加して、グルコースセンサ４から応答電流値を得るために利用される。

グルコースセンサ４は、間質液中のグルコース濃度に応じた応答を得るために使用される。グルコースセンサ４の末端部には、間質液中のグルコースを検出するための生体触媒である酵素が固定されたセンサ部が形成されており、少なくともセンサ部が皮下に植え込まれて使用される。本実施形態の例では、図１に示すように、グルコースセンサ４の筺体２の基板２１から外方へ延出した部分が皮膚６に挿入されている。

図２は、本発明の第１実施形態に係るグルコースセンサ４の構成例を示す図であり、図２（Ａ）は、グルコースセンサ４の平面図であり、図２（Ｂ）は、図２（Ａ）に示したグルコースセンサのＡ−Ａ断面図である。図２（Ａ）（Ｂ）に示すように、グルコースセンサ４は、基板４１と、基板４１上に形成された電極及びリード線と、酵素固定部とを備えている。

すなわち、基板４１の片面上には、金属層４２ａ，４２ｂ及び４２ｃが形成されている。金属層４２ａ，４２及び４２ｃは、フィルム状の基板４１の片面に、金や白金等の金属を物理蒸着（ＰＶＤ，例えばスパッタリング）、或いは化学蒸着（ＣＶＤ）により製膜し、レーザでトリミングを行うことにより形成することができる。基板４１の材料には、例えば、ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ），ポリプロピレン（ＰＰ），ポリエチレン（ＰＥ）のような熱可塑性樹脂，ポリイミド樹脂やエポキシ樹脂のような、人体への害がなく、適当な絶縁性及び可撓性を有する樹脂を適用することができる。

金属層４２ａ，４２ｂ及び４２ｃの夫々は、基板４１の末端から基端へ亘って基板４１の長手方向に形成されており、各末端部が第１作用極４２Ａ，第２作用極４２Ｂ及び対極４２Ｃとして利用される。これに対し、金属層４２ａ，４２ｂ及び４２ｃの中間部及び基端部は、それぞれリード線として利用される。

金属層４２ａ，４２ｂ及び４２ｃの基端部は、基板４１の基端部に設けられたコンタクトバッド４４Ａ，４４Ｂ，４４Ｃと夫々接続されている。コンタクトパッド４４Ａ，４４Ｂ，４４Ｃは、制御用コンピュータ３の端子３０（図１）との電気的な接続に利用される。コンタクトパッド４４Ａ，４４Ｂ，４４Ｃは、例えば、金属層４２ａ，４２ｂ，４２ｃのトリミングにより電極及びリード線と一体に形成することができる。もっとも、コンタクトパッド４４Ａ，４４Ｂ，４４Ｃは、金属層と別の工程で導体を用いて形成されるようにしても良い。本実施形態では、端子３０は、制御用コンピュータ３と接続されたポテンショスタット３Ａの端子Ｗ１，端子Ｗ２及び端子ＣＲを含んでおり、コンタクトパッド４４Ａ，４４Ｂ，４４Ｃは、端子Ｗ１，Ｗ２，ＣＲに夫々接続されている。

具体的には、図１において、コンタクトパッド４４Ａ，４４Ｂ，４４Ｃの図示は省略されているが、測定機１の基板２１とカバー２０とを接合した場合に、グルコースセンサ４の基端部が制御用コンピュータ３の基板３ａと基板２１とで挟まれて固定された状態となる。この際に基板３ａに設けられた端子３０がコンタクトパッド４４Ａ，４４Ｂ，４４Ｃに押しつけられた状態で固定されることで、グルコースセンサ４と測定機１とが電気的に接続された状態となる。

対極４２Ｃとしての金属層４２ｃの所定領域上には、参照極４２Ｄが形成されている。参照極４２Ｄは、例えば、銀塩化銀インクを対極４２Ｃ上の所定領域に塗布又は印刷することで形成することができる。

一方、金属層４２ａ及び４２ｂの末端側の所定領域には、カーボンペーストをスクリーン印刷することで形成されたカーボン層４５ａ，４５ｂが積層されている。これにより、金属層４２ａ及びカーボン層４５ａからなる第１作用極４２Ａが形成され、金属層４２ｂ及びカーボン層４５ｂからなる第２作用極４２Ｂが形成されている。

以上のように、本実施形態のグルコースセンサ４は、第１作用極４２Ａ，第２作用極４２Ｂ，対極４２Ｃ及び参照極４２Ｄからなる電極４２を備える。但し、参照極４２Ｄは省略可能である。また、図２に示す例では、第１作用極４２Ａ及び第２作用極４２Ｂに共通な対極４２Ｃが設けられているが、第１作用極４２Ａ及び第２作用極４２Ｂに夫々対応する二つの対極が設けられていても良い。

カーボン層４５Ａ，４５Ｂの上には、酵素が固定化された酵素固定化層４３Ａ，４３Ｂがそれぞれ形成されている。酵素固定化層４３Ａ，４３Ｂは、グルコースと反応するグルコースデヒドロゲナーゼ（ＧＤＨ）をカーボン層４５Ａ，４５Ｂ上に分注し、グルタルアルデヒドのような固定化物質で固定化することにより形成されている。以上のようにして、グルコースセンサ４の末端部にセンサ部４０Ｃが形成されている。以下、酵素固定化層４３Ａを第１酵素固定部４３Ａと表記し、酵素固定化層４３Ｂを第２酵素固定部４３Ｂと表記することもある。

第１作用極４２Ａ及び第２作用極４２Ｂは、対極４２Ｃを挟んで配置され、第１作用極４２Ａ及び第２作用極４２Ｂと対極４２Ｃとの距離は夫々等しくなるように配置されている。また、カーボン層４５Ａ，４５Ｂ，及び酵素固定化層４３Ａ，４３Ｂの面積は、同面積となるように形成され、酵素固定化層４３Ａ，４３Ｂに含まれる酵素量は等しくなるように形成されている。すなわち、グルコースセンサ４は、同一構成を有する二つの作用極４２Ａ，４２Ｂ及び第１及び第２酵素固定部４３Ａ，４３Ｂ（酵素固定部４３，図１）を有するように構成されている。

図３は、測定機１内に収容された主な電子部品の構成例を示す。図３に示すような、制御コンピュータ３，ポテンショスタット３Ａ，電力供給装置１１が、筐体２内に収容された基板３ａに設けられている。図３では、表示ユニット１４は、基板３ａに含まれているように図示されているが、実際には、図１に示すように、表示ユニット１４は、グルコース濃度の演算結果を表示するための表示パネル１５を有する。また、表示ユニット１４の筐体１７は、筐体２と同様に、接着フィルム５などによって皮膚上に固定することができる。

図３に戻って、制御コンピュータ３は、ハードウェア的には、ＣＰＵ（中央演算処理装置）のようなプロセッサと、メモリ（ＲＡＭ（Random Access Memory）, ＲＯＭ（Read Only Memory））のような記録媒体と、通信ユニットと、図示しない入出力装置（Ｉ／Ｏ
）とを含んでおり、プロセッサが記録媒体（例えばＲＯＭ）に記憶されたプログラムをＲＡＭにロードして実行することによって、通信部１０，制御部１２及び記憶部１３を備えた装置として機能する。なお、制御コンピュータ３は、半導体メモリ（ＥＥＰＲＯＭ，フラッシュメモリ）やハードディスクのような、補助記憶装置を含んでいても良い。

制御部１２は、電圧印加のタイミング，印加電圧値，応答電流のサンプリング，グルコース濃度の演算，或いは外部の情報処理端末との通信を制御する。通信部１０は、表示ユニット１４（図１）との間でデータ通信を行い、制御部１２によるグルコース濃度の演算結果を表示ユニット１４に送信する。データ通信は、ケーブルを用いた有線通信であっても良く、赤外線や無線を用いた非接触通信（ＩｒＤＡ、ブルートゥース）を適用することも可能である。表示ユニット１４は、例えば、測定機１から受信されたグルコース濃度の演算結果を所定のフォーマットで表示画面（表示パネル１５）に表示することができる。

電力供給装置１１は、バッテリ１１０を有しており、制御部３やポテンショスタット３Ａに動作用の電力を供給する。なお、電力供給装置１１は、筐体２の外部に置くこともできる。

ポテンショスタット３Ａは、第１作用極４２Ａ，第２作用極４２Ｂの電位を参照電極４２Ｄに対して一定にする装置である。ポテンショスタット３Ａは、端子ＣＲ，Ｗ１及びＷ２を用いて対極４２Ｃと第１作用極４２Ａとの間、対極４２Ｃと第１作用極４２Ｂとの間に所定の電圧を印加し、端子Ｗ１で得られる第１作用極４２Ａの応答電流（第１応答電流）を測定するとともに、端子Ｗ２で得られる第２作用極４２Ｂの応答電流（第２応答電流）を測定し、第１及び第２応答電流の測定結果を制御部１２に送る。

なお、制御コンピュータ３の制御部１２及び記憶部１３としての機能が表示ユニット１４に搭載され、筐体２側では、ポテンショスタット３Ａによる測定結果が通信部１０によって表示ユニット１４へ送信されるようにしても良い。或いは、制御コンピュータ３及びポテンショスタット３Ａが表示ユニット１４に搭載され、グルコースセンサ４に対する電圧印加及び応答電流検出が表示ユニット１４に搭載されたポテンショスタット３Ａにより実行されるようにしても良い。

図４は、第１実施形態における制御コンピュータ３によるグルコース濃度測定処理の例を示すフローチャートである。前提として、測定機１及びグルコースセンサ４が適正に被検者の所定位置（腹部或いは腕部）に設置され、センサ部４０Ｃが間質液中に浸漬されていることとする。

図４において、制御コンピュータ３のＣＰＵ（制御部１２）は、外部から発せられたグルコース濃度測定の開始指示を受け付けると、ポテンショスタット３Ａを制御し、第２作用極４２Ｂのみに過電流を通電する（ステップＳ０１）。測定機１は、図示しない入力装置を有しており、入力装置を用いて測定開始及び測定終了の指示を制御コンピュータ３に対して入力することができる。開始指示を受け付けた制御部１２は、例えば、第１作用極４２Ａと端子Ｗ１間との間に設けられたスイッチＳＷを開放して、第１作用極４２Ａに電流が流れない状態にする一方で、対極４２Ｃと第２作用極４２Ｂとの間に、過電流を所定の時間通電する。これによって、第２作用極４２Ｂ上の第２酵素固定部４３Ｂに固定化された酵素（ＧＤＨ）が失活状態にされる。過電流は、通電によって対極４２Ｃや第２作用極４２Ｂがダメージを受けない程度の電流とされる。通電すべき電流値、及び通電時間は、酵素量や失活速度を考慮して、適宜設定可能である。

第２作用極４２Ｂへの過電流の通電によって、第２作用極４２Ｂ側は、酵素が特定の基質であるグルコースと反応する性質が失われた状態を除き、第１作用極４２Ａ側と同様の構成を有する状態となる。

次に、制御部１２は、スイッチＳＷを閉じ、ポテンショスタット３Ａを制御して、第１作用極４２Ａ及び第２作用極４２Ｂへの所定の電圧印加を開始し（ステップＳ０２）、第１作用極４２Ａからの応答電流（第１応答電流）及び第２作用極４２Ｂからの応答電流（第２応答電流）の測定を開始する（ステップＳ０３）。ポテンショスタット３Ａは、電圧印加によって得られる第１及び第２応答電流を夫々測定し、制御部１２へ送る。

制御部１２は、第２応答電流を用いて第１応答電流を補正する補正処理を行う（ステップＳ０４）。すなわち、制御部１２は、次のような処理を行う。ここに、第１応答電流値は、第１酵素固定部４３Ａに含まれる活性状態のＧＤＨとグルコースとの反応に由来する電流成分（信号成分）を含んでいる。もし、間質液がアスコルビン酸のようなグルコース濃度測定に影響を及ぼす干渉物質を含んでいるならば、第１応答電流値には、干渉物質の影響のような、酵素反応以外の反応由来（非酵素反応由来）の信号成分を含むことになる。

これに対し、第２応答電流値は、第２酵素固定部４３ＢにおけるＧＤＨが失活しているので、ＧＤＨとグルコースとの反応に由来する信号成分は含まれず、非酵素反応由来の信号成分のみを含むことになる。従って、酵素反応由来の信号成分をｍ、酵素反応以外の反応由来の信号成分をｎとすれば、第１応答電流値ｙ及び第２応答電流値をｙ´（ｙ及びｙ´は時間ｔの関数）は、次のような一次関数で表すことができる。
ｙ（ｔ）＝ｍ（ｔ）＋ｎ（ｔ）・・・（式１），ｙ´（ｔ）＝ｎ（ｔ）・・・（式２）

よって、制御部１２は、上記式１及び式２に従って、第１応答電流値から第２応答電流値を差し引くことで、非酵素反応由来の信号成分ｎを第１応答電流値から除去することができる。

制御部１２は、信号成分ｎが除去された第１応答電流値（補正電流値）に基づいて、公知の手法を用いたグルコース濃度の演算処理を行い、時間（ｔ）におけるグルコース濃度を算出する（ステップＳ０５）。例えば、制御コンピュータ３の記憶部１３は、第１酵素固定部４３Ａに固定化されたＧＤＨに対応するグルコース濃度の検量線データを予め保持しており、制御部１２は、検量線データで示される検量線を用いてグルコース濃度を割り出す。或いは、制御部１２は、所定のグルコース濃度の演算式に、補正に係る第１応答電流値を代入してグルコース濃度を算出する。

通信部１０は、算出されたグルコース濃度の算出結果を、表示ユニット１４との間に形成された通信リンク１８を通じて表示ユニット１４へ送信する（ステップＳ０６）。その後、制御部１２は、測定が終了か否かを判定し、測定が終了であれば、図４のフローによる処理を終了する。これに対し、測定が終了でない場合には、処理をステップＳ０２に戻す。これによって、測定終了指示の入力のような、測定終了のトリガが入力装置を通じて制御コンピュータ３に入力されるまで、グルコース濃度が連続的に測定される。表示ユニット１４では、測定機１からグルコース濃度の測定結果が連続して受信されることで、例えば、グルコース濃度の時間変化をプロットしたグラフを作成し、表示画面（表示パネル１５）に表示することができる。

第１実施形態によれば、第１応答電流値から第２応答電流値として得られた非酵素反応由来の信号成分が除去されるので、第１応答電流値は実際の酵素反応由来の信号成分による応答電流値に補正される。このように補正された応答電流値でグルコース濃度が算出されるので、精度の向上したグルコース濃度を得ることができる。

第１実施形態は、以下のような変形が可能である。第１実施形態では、第２作用極４２Ａへ過電流を通電することにより、第２作用極４２Ｂに対応する酵素固定部４３Ｂの酵素を失活させたが、他の方法により酵素を失活させても良い。例えば、加熱によりグルコースとの反応作用を失活した酵素（ＧＤＨ）を分注して酵素固定部４３Ｂが形成されるようにしても良い。可能であれば、被検者への測定機１及びグルコースセンサ４の設置前に、酵素固定部４３Ｂを加熱して酵素固定部４３Ｂの酵素を失活させることも考えられる。

或いは、組成がグルコースとの反応が失活される程度に粉砕（すりつぶし）された酵素（ＧＤＨ）を用いて第２酵素固定部４３Ｂが形成されるようにしても良い。或いは、酵素反応の失活を促進又は阻害する物質（例えば、アジ化ナトリウム）をグルコースセンサ４の製造工程、またはグルコース濃度測定前に第２酵素固定部４３Ｂに添加して、測定時において第２酵素固定部４３Ｂの酵素が失活状態となるようにしても良い。このように、測定開始前に、酵素失活処理が施される場合には、図４に示したステップＳ０１のような過電流通電処理や、過電流通電処理のために用いられるスイッチＳＷは省略が可能である。

また、第１実施形態では、酵素としてＧＤＨを用いた例を示したが、ＧＤＨの代わりに
グルコースオキシダーゼ（ＧＯＤ）を適用しても良い。また、第１実施形態では、特定の基質としてグルコースを例示したが、他の特定の基質の物理量の検出を目的として、当該他の特定の基質に応じた生体触媒を測定し、第１実施形態の構成を有するバイオセンサ及び測定機を用いて、精度の向上した物理量を得ることが可能である。

また、第１実施形態では、第１応答電流値から第２応答電流値を差し引くことで、応答電流値を補正していたが、第１応答電流値及び第２応答電流値に基づくグルコース濃度の算出結果を得て、第１応答電流値に基づくグルコース濃度演算結果から第２応答電流値に基づくグルコース濃度演算結果を差し引き、補正されたグルコース濃度を得ることで、精度の向上したグルコース濃度を得るようにしても良い。

〔第２実施形態〕
次に、本発明の第２実施形態について説明する。第２実施形態は第１実施形態と共通する構成を有するので、主として第１実施形態との相違点について説明し、共通点については、同一の符号を付して説明を省略する。

第２実施形態におけるバイオセンサ（グルコースセンサ）及び測定機１の物理的な構成は、第１実施形態にて説明したものを適用することができる。但し、第２実施形態では、バイオセンサ（グルコースセンサ４）における第１酵素固定部４３Ａ，第２酵素固定部４３Ｂの構成が、第１実施形態と異なる。

すなわち、第２実施形態では、第１酵素固定部４３Ａ，第２酵素固定部４３Ｂに含まれる酵素（ＧＤＨ）として、検量線の異なるものが適用される。第２実施形態の例では、第１酵素固定部４３Ａに適用されるＧＤＨとして、天然のＧＤＨが適用され、第２酵素固定部４３Ｂに適用されるＧＤＨとして、天然のＧＤＨに遺伝子改変を施したＧＤＨが適用されている。

第１酵素固定部４３Ａに適用されたＧＤＨ（第１酵素：第１生体触媒）と、第２酵素固定部４３Ｂに適用されたＧＤＨ（第２酵素：第２生体触媒）とは、ミカエリス定数Ｋｍが異なる。このような第１酵素及び第２酵素が固定化された第１作用極４２Ａ及び第２作用極４２Ｂを設けた場合における、夫々のセンサ出力（応答電流密度）とグルコース濃度との関係（キャリブレーションカーブ）を図５に示す。

図５のグラフに示すように、第１酵素（天然ＧＤＨ）が適用された第１作用極４２Ａのキャリブレーションカーブと、第２酵素（遺伝子改変ＧＤＨ）が適用された第２作用極４２Ｂのキャリブレーションカーブとは異なり、異なる検量線を有することが分かる。図５において、黒のプロットが天然ＧＤＨを示し、白のプロットが遺伝子改変ＧＤＨを示す。なお、図５では、第１酵素（天然ＧＤＨ）に対するキャリブレーションカーブがｙ＝０．８ｘであり、第２酵素（遺伝子改変ＧＤＨ）に対するキャリブレーションカーブがｙ´＝０．６ｘの例を示す。ｙ，ｙ´は応答電流値、ｘはグルコース濃度、“０．８”，“０．６”は検量線係数を示す。

このように、第２実施形態では、第１酵素が配置された第１作用極４２Ａの検量線と第２酵素が配置された第２作用極４２Ｂの検量線とが異なっており、各検量線に係るデータ（検量線係数）が、測定機１の制御コンピュータ３の記憶部１３（例えばＲＯＭ）に予め格納されている。

また、第２実施形態では、グルコース濃度の補正手法が第１実施形態と異なる。図５は、第２実施形態に係る制御コンピュータ３（制御部１２）による処理の例を示すフローチャートである。

図５に示す処理は、ステップＳ０１が除かれ、且つステップＳ０４及びＳ０５の代わりのステップＳ１１（グルコース濃度演算（補正処理））が実行される点で、第１実施形態と異なる。

ステップＳ１１では、制御部１２は、ポテンショスタット３Ａにより得られる第１応答電流値及び第２応答電流値を得る。制御部１２は、以下の式３に基づいて補正された単位時間ｔにおけるグルコース濃度ｘを求める。
ｘ（ｔ）＝（ｙ（ｔ）−ｙ´（ｔ））／（ａ−ｂ） ・・・（式３）
但し、ｙは、第１応答電流値（第１作用極４２Ａから得られた信号）であり、ｙ´は第２応答電流値（第２作用極４２Ｂから得られた信号）である。また、ａは、第１酵素（天然ＧＤＨ）に応じた検量線係数であり、ｂは、第２酵素（遺伝子改変ＧＤＨ）に応じた検量線係数である。

式３は、以下のような考えに基づき求められる。すなわち、第１作用極４２Ａ（酵素固定部４３Ａ），及び第２作用極４２Ｂ（酵素固定部４３Ｂ）は、同一の条件下で間質液中に浸漬された状態となる。このため、第１応答電流及び第２応答電流には、干渉物質反応のような非酵素反応由来の信号成分が等しく含まれていると考えることができる。このため、第１応答電流ｙ及び第２応答電流ｙ´は、次の式４，式５のような一次関数で表すことができる。
ｙ（ｔ）＝ａｘ＋ｃ ・・・（式４）， ｙ´（ｔ）＝ｂｘ＋ｃ ・・・（式５）
但し、ａ，ｂは検量線係数であり、ｃは非酵素反応由来の信号成分である。上記式４及び式５を用いて式変形を行うと、上述したグルコース濃度ｘの算出式である式３を得ることができる。

制御部１２は、第１応答電流ｙ及び第２応答電流ｙ´を上記式３に代入する（検量線係数ａ及びｂは既知であり、記憶部１３に予め保持されている）ことで、非酵素反応由来の信号成分ｃが除去されたグルコース濃度ｘを求めることができる。

図７及び図８は、第２実施形態の作用効果を証明するシミュレーション実験例を示すグラフである。図７は、図５について説明した第１酵素及び第２酵素を用いたグルコースセンサ４でのセンサ出力（第１応答電流（第１作用極４２Ａ）、第２応答電流（第２作用極４２Ｂ））の時間変化を示すグラフである。センサ出力は、センサ（本実施形態ではグルコースセンサ４）により検出される電流シグナルを示す。図７において、実線のセンサ出力のグラフが第１応答電流を示し、破線のセンサ出力のグラフが第２応答電流を示す。図７に示すシミュレーション実験では、体液としての試験液として、干渉物質が含まれていないものを適用している。従って、第１応答電流及び第２応答電流は、非酵素反応由来の信号成分が含まれていない場合の応答電流と考えることができる。

図７のグラフにおける、時間約２８で、実験対象の体液中に、干渉物質（この実験ではアスコルビン酸）が添加されている。この結果、アスコルビン酸と電極との反応による信号成分、すなわち非酵素反応由来の信号成分が応答電流に加わり、第１及び第２応答電流が夫々上昇している。図７のグラフから、干渉物質添加による電流上昇分、すなわち、非酵素反応由来の信号成分ｃは、第１応答電流及び第２応答電流に夫々均等に含まれることが分かる。これより、図７の第１応答電流は、式４により表され、第２応答電流は式５により表されることが分かる。

図８は、シミュレーション実験における、検体（この例ではグルコース）濃度の時間変化を示したグラフであり、図７に示した応答電流に対応するグルコース濃度を示すものである。図８における白のプロットは、第１作用極４２Ａからの第１応答電流に基づき得ら
れたグルコース濃度を示す。白のプロットは、干渉物質添加（時間約２８）による第１応答電流の増加に併せて、演算によって得られるグルコース濃度が上昇することを示している。

これに対し、干渉物質添加時点から白のプロットにほぼ連続して後続する黒のプロットは、上述した式３を用いて算出した補正後のグルコース濃度を示す。このように、黒のプロットからは、干渉物質が添加されなければ、第１作用極４２Ａから検出されたであろう第１応答電流に基づくグルコース濃度の演算値とほぼ等しい補正値が得られていることが分かる。

よって、第２実施形態に係るグルコースセンサ４及び測定機１によれば、間質液（体液）に干渉物質が含まれ、それが電極と反応して応答電流値に影響を与えたとしても、当該影響が適正に除去された補正値を得ることができる。すなわち、精度の高いグルコース濃度の測定結果を得ることができる。

第２実施形態は、次のような変形が可能である。すなわち、第２実施形態では、検量線の異なる第１及び第２酵素（第１及び第２生体触媒）として、ミカエリス定数Ｋｍの異なる二つの酵素を用いた。反応速度の違いから検量線を異ならせる観点からは、最大反応速度Ｖmaxが異なる二つの酵素を適用することも可能である。すなわち、Ｋｍ及びＶmaxの少なくとも一方が異なる二つの酵素を適用することができる。

また、検量線が異なれば良いので、同種類の酵素を用いる一方で、第１作用極４２Ａ（第１酵素固定部４３Ａ）と第２作用極４２Ｂ（第２酵素固定部４３Ｂ）との夫々に対する酵素の配置量（酵素量）を異ならせ、第１作用極４２Ａ上及び第２作用極４２Ｂ上での夫々の総反応活性量を異ならせるようにしても良い。

或いは、同種類の酵素を用いる一方で、第１作用極４２Ａ（酵素固定部４３Ａ）と第２作用極４２Ｂ（酵素固定部４３Ｂ）とで、酵素と体液との接触面積を異ならせることにより、検量線（キャリブレーションカーブ）を異ならせるようにしても良い。

また、検量線を異ならせる観点からは、作用極間で異なる酵素を用いるようにしても良い。例えば、第１作用極４２Ａ（第１酵素固定部４３Ａ）及び第２作用極４２Ｂ（第２酵素固定部４３Ｂ）との一方にＧＤＨを適用し、他方にＧＯＤを適用することが考えられる。

なお、第１実施形態におけるグルコースセンサ４（バイオセンサ）の第２作用極４２Ａから得られる第２応答電流は、酵素反応に由来する信号成分を含まないのであるから、式５における“ｂｘ（基質濃度ｘ及び検量線係数ｂの少なくとも一方）”が零であると考えることができる。よって、第１の実施形態におけるグルコースセンサ４を用い、第２の実施形態における制御部１２のプログラム処理（式３の演算）によって、適正なグルコース濃度を測定することができる。

以上説明した第１及び第２実施形態に係る構成は、本発明の目的を逸脱しない範囲で適宜組み合わせることができる。

次に、本発明の実施例１について説明する。実施例１では、二つの作用極ＷＥ１，ＷＥ２、参照極ＲＥ及び対極ＣＥからなる４電極の電極系を作製した。すなわち、基材（ポリエーテルイミド（ＰＥＩ）、１００μｍ）上に、スパッタリングにより５ｎｍのＡｕによる金属層を形成した。この金属層に絶縁処理を施して相互に絶縁された３つの領域を形成
し、３つの金属層の領域うちの２つの領域上に、カーボンインクをそれぞれ印刷して１１０℃の環境下で３０分乾燥させることにより、二つの作用極ＷＥ１，ＷＥ２を作製した。残りの領域は、対極ＣＥとした。

また、上記した金属層の残りの領域（対極ＣＥ）上に、銀塩化銀（Ａｇ／ＡｇＣｌ）インクを印刷し、１５０℃の環境で３０分乾燥させることによって参照極ＲＥを作製した。銀塩化銀インクとして、ＥＲＣＯＮ社製の「Ｅ２４１４」を用いた。

作用極ＷＥ１及び作用極ＷＥ２に分注する試薬として、酵素としてのグルコースデヒドロゲナーゼ（ＧＤＨ），ｐＨ調整剤としてのリン酸ナトリウム（ｐＨ５．８），架橋剤としてのグルタルアルデヒド（ＧＡ）を混合したＧＤＨ溶液を作成した。このとき、ＧＤＨの終濃度（f.c.）は１２５０Ｕ／ｍＬ、リン酸ナトリウムの終濃度は５０ｍＭとした。また、架橋条件として、反応時間は４５分，反応温度は２０℃とした。

作用極ＷＥ１に対し、上記したＧＤＨ溶液を０．３２μＬ分注して乾燥させた後、８０℃の環境下で１０分間乾燥させることにより、ＧＤＨを失活させた。その後、作用極ＷＥ２に対し、上記したＧＤＨ溶液を０．３２μＬ分注して乾燥させた。このようにして、作用極ＷＥ１をＧＤＨの酵素作用が熱により失活した熱失活電極とし、作用極ＷＥ２をＧＤＨ活性を有する活性作用極とした。

上記した電極系を用いて、４００ｍＶの電位差を電極系に印加するクロノアンペロメトリー法により、グルコースに対する応答感度と、干渉物質であるアスコルビン酸（ＡｓＡ）に対する応答感度とを検討した。

まず、グルコース（Ｇｌｕ）に対する応答感度の測定方法として、上記電極系の作用極（熱失活電極）ＷＥ１，作用極（活性作用極）ＷＥ２，及び対極ＣＥとポテンショスタットとを電気的に接続するとともに、上記電極系を測定液としての０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）中に浸漬した。そして、作用極ＷＥ１及び作用極ＷＥ２に定電圧（４００ｍＶ ｖｓ Ａｇ／ＡｇＣｌ）を印加しながら、上記緩衝液中に２．０Ｍグルコース溶液を滴下しつづけ、グルコースの終濃度が１００ｍｇ／ｄＬにおける定常電流密度（ｎＡ／ｍｍ²）を測定した。定常電流密度が応答感度に相当する。

図９に、グルコースに対するセンサ出力（電流密度）の測定結果を示す。図９から分かるように、活性作用電極ＷＥ２では、ＧＤＨの酵素反応による応答電流密度が観測されたのに対し、ＧＤＨが失活した熱失活電極ＷＥ１では、応答電流密度が殆ど見られないことが確認された。これより、電極ＷＥ１上のＧＤＨが失活していることが確認された。

次に、アスコルビン酸（ＡｓＡ）に対する応答感度の測定方法として、上記電極系の作用極（熱失活電極）ＷＥ１，作用極（活性作用極）ＷＥ２，及び対極とポテンショスタットとを電気的に接続するとともに、上記電極系を０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）中に浸漬した。そして、熱失活電極ＷＥ１及び活性作用極ＷＥ２に定電圧（４００ｍＶ ｖｓ Ａｇ／ＡｇＣｌ）を印加しながら、上記緩衝液中に１０ｍｇ／ｍＬアスコルビン酸（ＡｓＡ）を添加し、ＡｓＡの終濃度が１．０ｍｇ／ｄＬにおける定常電流密度（ｎＡ／ｍｍ²）を測定した。定常電流密度が応答感度に相当する。

図１０に、ＡｓＡに対する応答感度の測定結果を示す。図１０から分かるように、熱失活電極ＷＥ１，活性作用電極ＷＥ２ともに、ＡｓＡの電極反応に由来する応答電流密度がほぼ同程度検出されることが確認された。

さらに、グルコースの応答感度の測定中にアスコルビン酸（ＡｓＡ）を添加した場合に
おけるアスコルビン酸の影響を確認した。測定方法として、上記電極系の作用極（熱失活電極）ＷＥ１，作用極（活性作用極）ＷＥ２，及び対極ＣＥとポテンショスタットとを電気的に接続するとともに、上記電極系を０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）中に浸漬した。そして、熱失活電極ＷＥ１及び活性作用極ＷＥ２に定電圧（４００ｍＶ ｖｓ Ａｇ／ＡｇＣｌ）を印加しながら、測定開始から３００秒の経過時点で、上記緩衝液中にグルコース溶液を滴下しつづけ、グルコースの終濃度が１００ｍｇ／ｄＬにおける定常電流密度（ｎＡ／ｍｍ²）を測定した。

その後、測定開始から４００秒の経過時点で１０ｍｇ／ｍＬアスコルビン酸（ＡｓＡ）を上記緩衝液中に添加して、ＡｓＡの終濃度が１．０ｍｇ／ｄＬにおける定常電流密度（ｎＡ／ｍｍ²）を測定した。

その後、測定開始から５００秒の経過時点で１０ｍｇ／ｍＬアスコルビン酸（ＡｓＡ）を上記緩衝液中にさらに添加して、ＡｓＡの終濃度が２．０ｍｇ／ｄＬにおける定常電流密度（ｎＡ／ｍｍ²）を測定した。

図１１に、熱失活作用極ＷＥ１及び活性作用極ＷＥ２のセンサ出力（電流密度）（ｎＡ／ｍｍ²）の時間変化の測定結果を示す。図１１中のグラフにおいて、実線が活性作用電
極ＷＥ２のセンサ出力（応答電流密度）を示し、破線が熱失活電極ＷＥ１のセンサ出力（応答電流密度）を示す。さらに、グラフ中の一点鎖線は、第１実施形態で説明した補正手法により補正された電流密度（補正値）の時間変化を示す。

測定開始から所定時刻（３００秒経過時点）でのグルコース滴下（添加）に対し、活性作用極ＷＥ２にＧＤＨの酵素反応による応答電流が観測されたのに対し、熱失活作用極ＷＥ１からは、微少な応答電流が検出されたことが確認された。

その後の、測定開始から所定時刻（４００秒経過時点）でのＡｓＡの添加により、ＡｓＡの電極反応による非酵素由来の信号成分としての電流密度が熱失活電極ＷＥ１及び活性作用電極Ｗ２の双方からほぼ均等に検出されたことが確認された。

さらに、測定開始から所定時刻（５００秒経過時点）でのＡｓＡの濃度倍増により、電極ＷＥ１及び電極ＷＥ２の双方の応答電流が増大することが確認された。そして、電極ＷＥ２の応答電流密度から電極ＷＥ１の応答電流密度を差し引くことで得られる補正シグナル（補正値）は、ＡｓＡの終濃度が１．０ｍｇ／ｄＬの期間（４００〜５００秒）、及びＡｓＡの終濃度が２．０ｍｇ／ｄＬの期間（５００秒〜）に亘って、活性作用電極ＷＥ２より低い電流密度を示すことが確認された。これより、応答電流の補正値を得ることで、アスコルビン酸の影響を抑えたグルコース濃度測定を実施できることが確認された。

さらに、図１１の測定結果からは、補正値は、ＡｓＡの添加量増加で振幅が大きくなるものの、グルコースのみが添加された場合（３００秒〜４００秒）の作用極ＷＥ２の応答電流密度（約１５０ｎＡ／ｍｍ²）を中心としてプラス及びマイナス方向に振れており、
例えば、補正値の時間平均を採ることで、アスコルビン酸無添加時に近い応答電流密度を算出できることが確認された。

次に、本発明の実施例２について説明する。実施例２では、天然（野生型）酵素で調整した主電極の応答中の干渉物質の影響を、遺伝子改変（遺伝子変異）酵素で調整した副電極の応答を用いて補正するデータを取得した。

実施例２では、作用極ＷＥ１，参照極ＲＥ及び対極ＣＥからなる３電極の電極系を有す
る主センサ（Main WE）と、作用極ＷＥ２，参照極ＲＥ及び対極ＣＥからなる３電極の電
極系を有する副センサ（Sub WE）とを作製した。ここに、主センサ（Main WE）の作用極
ＷＥ１の面積と副センサ（Sub WE）の作用極ＷＥ２の面積とは同じ面積に形成し、主センサ及び副センサの各センサ出力（電流値）に対する相対比較を可能とした。

主センサ及び副センサのそれぞれは、以下のようにして作製した。すなわち、基材（ポリエーテルイミド（ＰＥＩ）、１００μｍ）上に、スパッタリングにより５ｎｍのＡｕによる金属層を形成した。この金属層に絶縁処理を施して相互に絶縁された２つの領域を形成し、２つの金属層の領域のうちの一方の領域上に、カーボンインクをそれぞれ印刷して１１０℃の環境下で３０分乾燥させることにより、作用極ＷＥ１（作用極ＷＥ２）を作製した。残りの領域は、対極ＣＥとした。

また、上記した金属層の残りの領域（対極ＣＥ）上に、銀塩化銀（Ａｇ／ＡｇＣｌ）インクを印刷し、１５０℃の環境で３０分乾燥させることによって参照極ＲＥを作製した。銀塩化銀インクとして、ＥＲＣＯＮ社製の「Ｅ２４１４」を用いた。

主センサの作用極ＷＥ１及び副センサの作用極ＷＥ２にそれぞれ分注する試薬として、酵素としてのグルコースデヒドロゲナーゼ（ＧＤＨ），ｐＨ調整剤としてのリン酸ナトリウム（ｐＨ５．８），架橋剤としてのグルタルアルデヒド（ＧＡ）を混合したＧＤＨ溶液を作成した。このとき、ＧＤＨの終濃度（f.c.）は１２５０Ｕ／ｍＬ、リン酸ナトリウムの終濃度は５０ｍＭとした。また、架橋条件として、反応時間は４５分，反応温度は２０℃とした。

但し、主センサの作用極ＷＥ１に分注する試薬中のＧＤＨには、天然ＧＤＨを用いる一方で、副センサの作用極ＷＥ２に分注する試薬中のＧＤＨには、遺伝子改変ＧＤＨを用いた。このようにして、主センサ用の天然ＧＤＨ溶液と、副センサ用の遺伝子改変ＧＤＨ溶液を作成した。

主センサの作用極ＷＥ１に対し、上記した天然ＧＤＨ溶液を０．３２μＬ分注して乾燥させた。一方、副センサの作用極ＷＥ２に対し、上記した遺伝子改変ＧＤＨ溶液を０．３２μＬ分注して乾燥させた。このようにして、天然ＧＤＨを分注した主センサ（Main WE
）と遺伝子改変ＧＤＨを分注した副センサ（Sub WE）とを得た。

上記した主センサ（Main WE）及び副センサ（Sub WE）について、グルコースに対する
検量線を作成した。結果を図１２に示す。図１２中のグラフＡが主センサのセンサ出力から得られた検量線を示し、グラフＢが副センサのセンサ出力から得られた検量線を示す。主センサ及び副センサの何れも、グルコース濃度の上昇に応じてセンサ出力（電流値：応答感度）が高まる特性を示した。

主センサ及び副センサを用いて、４００ｍＶの電位差を電極系に印加するクロノアンペロメトリー法により、グルコースに対する応答感度と、干渉物質であるアスコルビン酸（ＡｓＡ）に対する応答感度とを検討した。

まず、グルコース（Ｇｌｕ）に対する応答感度の測定方法として、主センサ及び副センサのそれぞれについて、作用極ＷＥ１（作用極ＷＥ２）及び対極ＣＥをポテンショスタットと電気的に接続した。次に、主センサ及び副センサのそれぞれを２００ｍｇ／ｄＬのグルコース溶液に浸漬し、作用極ＷＥ１及び作用極ＷＥ２のそれぞれに定電圧（４００ｍＶ
ｖｓ Ａｇ／ＡｇＣｌ）を印加して測定を開始した。

その後、０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）をグルコース溶液中に添加して、グルコ
ースの終濃度が１００ｍｇ／ｄＬにおける、主センサ及び副センサの各センサ出力（電流値）（ｎＡ）を測定した。さらに、測定開始から所定時間経過後に、１０ｍｇ／ｍＬアスコルビン酸（ＡｓＡ）を添加し、ＡｓＡの終濃度が１．０ｍｇ／ｄＬにおける、主センサ及び副センサのセンサ出力（各電流値（ｎＡ）：Ｙの値と称する）を測定した。

測定結果を図１３に示す。図１３中のグラフＡが主センサの測定結果であり、グラフＢが副センサの測定結果を示す。図１３から分かるように、緩衝液の添加によるグルコース溶液の希釈に応じて、主センサ及び副センサのセンサ出力が検量線に従った応答電流値を示すことが確認された。また、ＡｓＡの添加により、作用極ＷＥ１及び作用極ＷＥ２の双方において、ＡｓＡの電極反応に由来する応答電流値がほぼ同程度検出されることが確認された。

さらに、図１３に示したセンサ出力（Ｙの値）を図１２に示した検量線に従ってグルコース濃度Ｘに換算した値を求めるとともに、実施形態で説明した補正に係るグルコース濃度ｘ（ｔ）を求める上記（式３）に従って主センサの補正値（補正データ）を得た。結果を図１４に示す。図１４中のグラフＡ（丸プロット）が主センサの測定結果（Main WE (Wild t.)）を示し、グラフＢ（四角プロット）が副センサの測定結果（Sub WE (Mut.)）を示し、グラフＣ（三角プロット）が補正データ（Offset)を示す。但し、図１４中に示す
グラフＡ及びＢは、図１３に示した主センサ及び副センサの各電流値（Ｙの値）から求まる電流密度（ｎＡ／ｍｍ²）を用いたときの結果（Ｘの値）を示す。また、グラフＣは、
主センサ及び副センサの各電流密度を（式３）における第１応答電流値ｙ及び第２応答電流値ｙ´として用いたときの補正データ（補正されたＸの値）を示す。

図１４から分かるように、主センサ（Main WE）によって得られたＸの値(Ａ：丸プロット)は、ＡｓＡの添加によって、ＡｓＡ由来の成分を含んで著しく上昇するのに対し、補
正されたＸの値（Ｃ：三角プロット）では、ＡｓＡの添加後においても上昇が殆どなかった。

実施例２によれば、天然ＧＤＨを含む試薬が分注された作用極ＷＥ１、及び遺伝子改変ＧＤＨを含む試薬が分注された作用極ＷＥ２を有するセンサを用いて、ＡｓＡの影響を抑えたグルコース濃度測定を実施できることが確認された。

１・・・測定機
２・・・筐体
３・・・制御用コンピュータ
３ａ・・・基板
３Ａ・・・ポテンショスタット
４・・・電気化学センサ（バイオセンサ）
５・・・接着フィルム
６・・・皮膚
１０・・・通信部
１１・・・電力供給装置
１２・・・制御部
１３・・・記憶部
１４・・・表示ユニット
２０・・・カバー
２１・・・基板
４１・・・樹脂製のフィルム基板
４２ａ，４２ｂ，４２ｃ・・・金属層
４２Ａ・・・第１作用極
４２Ｂ・・・第２作用極
４２Ｃ・・・対極
４２Ｄ・・・参照極
４３・・・酵素固定部
４３Ａ・・・第１酵素固定部
４３Ｂ・・・第２酵素固定部
４４Ａ，４４Ｂ，４４Ｃ・・・コンタクトパッド
４５ａ，４５ｂ・・・カーボン層
１１０・・・バッテリ

Claims (4)

1. 特定の基質と反応する性質を有する生体触媒が配置された第１作用極と、前記生体触媒が配置された第２作用極と、前記第１作用極及び前記第２作用極との間にそれぞれ電圧を印加するための少なくとも１つの対極と、を含むバイオセンサと、
   前記第１作用極，前記第２作用極，及び前記対極と電気的に接続される電圧印加部と、
   前記第１作用極と前記電圧印加部との電気的接続をオンオフするスイッチと、
   前記スイッチを操作して前記第１作用極と前記電圧印加部との電気的接続をオフにするとともに前記電圧印加部と電気的に接続された前記第２作用極に電流を所定時間通電させて前記第２作用極に配置された生体触媒の前記性質を失わせる制御部と、
   前記電圧印加部との電気的接続がオンの前記第１作用極と前記対極との間に前記電圧印加部が電圧を印加することによって得られる前記第１作用極からの第１信号値を検出する第１検出部と、
   前記通電後の前記第２作用極と前記対極との間に前記電圧印加部が電圧を印加することによって得られる前記第２作用極からの第２信号値を検出する第２検出部と、
   前記第１信号値から算出された前記特定の基質の濃度を前記第２信号値で補正する補正部と、
   前記補正された前記特定の基質の濃度を出力する出力部と
   を含む測定機。
2. 前記制御部は、前記所定時間経過後に前記スイッチを操作して前記第１作用極と前記電圧印加部との電気的接続をオンにし、前記電圧印加部に電圧印加を開始させる
   請求項１に記載の測定機。
3. 前記生体触媒は、酵素である、
   請求項１又は２に記載の測定機。
4. 前記補正部は、前記第１信号値から前記第２信号値を減じた値を前記特定基質の補正濃度として算出する、請求項１から３のいずれか１項に記載の測定機。
   

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