JP5725294B2

JP5725294B2 - レーザ顕微鏡

Info

Publication number: JP5725294B2
Application number: JP2011156539A
Authority: JP
Inventors: 虹之景
Original assignee: Yokogawa Electric Corp
Current assignee: Yokogawa Electric Corp
Priority date: 2011-07-15
Filing date: 2011-07-15
Publication date: 2015-05-27
Anticipated expiration: 2031-07-15
Also published as: JP2013024906A

Description

本発明はレーザ光を用いたレーザ顕微鏡や共焦点レーザ顕微鏡に関し，特に、観察試料を照射するレーザ光の強さ（レベル）を一定に保つ機構に関するものである。

レーザ顕微鏡はガラススライドやディッシュなどの容器に入れた観察試料（以下、単に試料という）に対して、レーザ光源から出射するレーザ光を用いて照射し、照射された試料から発する蛍光信号を、対物レンズと結像レンズによって集光し、結像レンズの結像面に蛍光像を得るものである。

図３はこのような蛍光顕微鏡の一例を示す概略構成図である。図３において、レーザ光源１から出射したレーザ光（イ）はダイクロイックミラー２で反射し、結像レンズ３、対物レンズ４を介して容器６に入れた試料７を照射する。

ターレット５の上には、複数の対物レンズ４が搭載され選択的に使用される。ターレット５は回転軸Ｏを中心として電動モータ（図示せず）によって自動的に回転する。試料７で生じた蛍光信号（ロ）は入射経路を逆に辿ってダイクロイックミラー２を透過し結合手段（図示せず）に入射する。レーザ光源から出射するレーザ光は、ダイクロイックミラー２によって、全量の９０％以上は反射され、結像レンズ３及び対物レンズ４を介して試料を励起する。

レーザ光（イ）のうち、全量の数％以下はダイクロイックミラー２を透過し、漏れ光（ハ）として光センサ８に到達する。
この漏れ光（ハ）を光センサ８で受光し、それを信号変換手段（例えばＡ／Ｄ変換器）９で電気信号に変換し、制御手段（例えばＰＣ）１０に取り込む。制御手段１０では、取り込んだ信号に基づいて、レーザ光（イ）の全量を推測し、その強度が経時的に一定になるようにレーザ光源１の出力を調整し、校正する。
レーザ顕微鏡の先行技術としては下記の特許文献が知られている

特開２００５−２３４５００号公報特開２０１０−０１４８３９号公報

ところで、上述の従来例においては、校正に使うレーザ光は、ダイクロイックミラー２を透過した漏れ光（出射したレーザ光の数％以下）を用いて全量を推測しているため、正確さに欠けるという問題があった。

本発明は、上述の課題を解決するためになされたもので、レーザ光を正確に測定し、その値に基づいて試料への励起のレベル（レーザ光の強度）が常に一定になるように校正し、取得する共焦点画像の明るさを保証し、画像解析の信頼性を向上させたレーザ顕微鏡を提供することを目的としている。

本発明のレーザ顕微鏡は、請求項１においては、
レーザ光源と、
該レーザ光源から出射するレーザ光の光軸に対して直角方向に配置され回転軸を中心として自動的に回転する平板状のターレットと、
前記ターレットの円周上に複数個配置され前記レーザ光源から出射されたレーザ光を入
射する対物レンズと、
前記対物レンズの一つに対向して配置された試料と、
前記レーザ光源から出射したレーザ光がダイクロイックミラー及び前記対物レンズを介
して前記試料に照射され、照射された試料から発する蛍光信号を集光し、結像レンズの結
像面に蛍光像を得るように構成したレーザ顕微鏡において、
前記対物レンズが配置されたターレットの円周上に光センサを配置し、前記光源から出射し前記ダイクロイックミラーを透過したレーザ光の全量を受光するとともに、前記光センサの出力に基づいて前記レーザ光源から出射するレーザ光の出力を一定に制御する制御手段を備えたことを特徴とする。

請求項２においては、請求項１に記載のレーザ顕微鏡において、
前記制御手段はＡ／Ｄ変換器及びＰＣを含んで構成したことを特徴とする。

本発明のレーザ顕微鏡によれば、ターレットの円周上に光センサを配置しこの光センサの出力に基づいてレーザ光源から出射するレーザ光の出力を一定に制御するための制御手段を備えたので、蛍光を得るためのレーザ光の全量を受光することが可能となり取得する共焦点画像の明るさを保証し、画像解析の信頼性を向上させることができる。

本発明のレーザ顕微鏡の構成を示すブロック図である。光センサがレーザ光の照射を受ける位置に移動した状態を示すブロック図である。従来のレーザ顕微鏡の構成を示すブロック図である。

図１は本発明のレーザ顕微鏡の実施形態の一例を示す概略ブロック構成図である。図１において、レーザ光源１から出射したレーザ光（イ）は共焦点スキャナ２０を構成するマイクロレンズアレイディスク２１、ダイクロイックミラー２ａ及びピンホールアレイディスク２２を透過し、結像レンズ３及びターレット５ａの上に配置された複数の対物レンズ４の一つを介して容器６に入れた試料７を照射する。

ターレット５ａ上の複数の対物レンズ４は回転軸Ｏを中心として電動モータ（図示せず）によって自動的に回転する。ターレット５ａ上に配置された対物レンズ４はターレットの回転により選択的に使用される。

図１では、ターレット５ａの外周付近の円周が６等分され、その一つに光センサ８が配置されている。試料７で生じた蛍光信号（ロ）は入射経路を逆に辿って対物レンズ４、結像レンズ３を透過して共焦点スキャナ２０に入射する。

焦点スキャナ２０に入射した蛍光信号（ロ）はピンホールアレイディスク２２の結像面（ピンホール）２２ａを透過してダイクロイックミラー２ａで反射してリレーレンズ１３ａ→バンドパスフィルタ１１→リレーレンズ１３ｂを介してカメラ１２で試料の観察が行われる。マイクロレンズアレイディスク２１とピンホールアレイディスク２２は連結部材２３により連結されて回転中心軸Ｏを中心として回転する。なお、共焦点スキャナの構成や機能の詳細は公知なのでここでの説明は省略する。

図２はターレット５ａが回転し、光センサ８が結像レンズ３に対向する位置に配置された状態を示している。
本発明は、前記レーザ光源の出力強度を調整し、試料へのレーザ光の強度を一定値に制御する装置であり、光センサ８、信号変換手段９、制御手段１０から構成されている。

本発明は、レーザ光の強度を測定するための光センサ８をレーザ光源の励起光路上に設けることである。
図２に示すように、ターレット５ａ上に本来対物レンズを装着する場所の一つに、光センサ８を取り付ける。そして、レーザ光の強度を測定する際にはターレット５ａを回転させ、光センサ８を励起光路上に移動する。

この様に配置することにより、励起光として機能するレーザ光の１００％が直接光センサ８に入射し、レーザ光の強度を正確に測定することができる。
次に本発明の動作について説明する。予め、制御手段１０において、レーザ光の強度レベルを１００％に設定した場合、光センサ８で受ける信号レベルの値を記録しておく。

即ち、レーザ光の強度を校正するに際しては、ターレット５ａを回転して、光センサを８励起光路に移動させる。その後、レーザ光源をＯＮにして、光センサで受ける信号を測定する。測定値が予め記録した値から逸脱した場合、レーザ光源の出射パワーレベルを調整し、光センサ８で受ける信号が予め記録した値になるようにする。

この時、光センサで受けた信号を信号変換手段（Ａ／Ｄ変換器）９で変換し、制御手段（ＰＣ）１０へ入力する。制御手段１０では、信号変換手段９からの信号の大きさを予め設定した値と比較する。
そして、実測値と予め設定した値が予め定めた閾値を超えていた場合、制御手段では、レーザ光源の出射レベルを予め設定した値になるように調整する。

なお、レーザ光源は、経時的に劣化し、出力は使用頻度に比例して低下する。したがって、上記出力校正は定期的に行う必要がある。

上述の構成によれば、レーザ光源から出射する励起光の光路上に直接光センサを設置することによって、レーザ光を１００％受け、励起光レベルを正確に測定することができ、励起光の校正を正確に行うことができる。

また、光センサの設置場所は試料に近く、光源から対物レンズまでの間の光路に存在する光学素子の機械的ずれによる光量低下も検出できる。
例えば、図３に示す従来例では、ダイクロイックミラーが機械的に所定角度からずれると、透過光レベル（モニタする量）は変化しないが、反射光（励起光）は対物レンズに入射しなくなり、励起光は減少する。従来例では、この減少は検知できない。

以上説明したように、本発明のレーザ顕微鏡によれば、ターレットの円周上に光センサを配置しこの光センサの出力に基づいてレーザ光源から出射するレーザ光の出力を一定に制御するための制御手段を備えたので、蛍光を得るためのレーザ光の全量を受光することが可能となり取得する共焦点画像の明るさを保証し、画像解析の信頼性を向上させることができる。

なお、以上の説明は、本発明の説明および例示を目的として特定の好適な実施例を示したに過ぎない。本発明では共焦点スキャナ顕微鏡用いた例について説明したが他の顕微鏡であってもよい。
従って本発明は、上記実施例に限定されることなく、その本質から逸脱しない範囲で更に多くの変更、変形を含むものである。

１レーザ光源
２、２ａダイクロイックミラー
３結像レンズ
４対物レンズ
５，５ａ対物レンズ
６容器
７試料
８光センサ
９信号変換器
１０制御手段
１１バンドパスフィルタ
１２カメラ
１３ａ、１３ｂリレーレンズ
２０共焦点スキャナ
２１マイクロアレイディスク
２２ピンホールアレイディスク
２３連結部材

Claims

レーザ光源と、
該レーザ光源から出射するレーザ光の光軸に対して直角方向に配置され回転軸を中心として自動的に回転する平板状のターレットと、
前記ターレットの円周上に複数個配置され前記レーザ光源から出射されたレーザ光を入
射する対物レンズと、
前記対物レンズの一つに対向して配置された試料と、
前記レーザ光源から出射したレーザ光がダイクロイックミラー及び前記対物レンズを介
して前記試料に照射され、照射された試料から発する蛍光信号を集光し、結像レンズの結
像面に蛍光像を得るように構成したレーザ顕微鏡において、
前記対物レンズが配置されたターレットの円周上に光センサを配置し、前記光源から出射し前記ダイクロイックミラーを透過したレーザ光の全量を受光するとともに、前記光センサの出力に基づいて前記レーザ光源から出射するレーザ光の出力を一定に制御する制御手段を備えたことを特徴とするレーザ顕微鏡。
前記制御手段はＡ／Ｄ変換器及びＰＣを含んで構成したことを特徴とする請求項１に記載のレーザ顕微鏡。