JP5582482B2 - 復元されたペプチドの生産方法及びペプチドが固定化された固相の生産方法 - Google Patents

Description

本発明は、新規のペプチド、当該ペプチドの用途及び生産方法に関し、特に、親水性の固相に特異的に結合する機能を発現させるペプチド、当該ペプチドの用途及び生産方法に関する。また、本発明は、固相化法を用いた化合物の検出又は測定に利用可能なペプチド、及び当該ペプチドを利用した化合物の検出又は測定方法に関する。また、本発明は、抗原結合部位が形成される可変部を含むペプチドに関し、免疫グロブリン分子、さらに可変部を含む１本鎖抗体（scFv）、多価性１本鎖抗体（sc(Fv)_n）、定常部融合１本鎖抗体（scFv-Fc）、Fab断片又はF(ab’)₂断片及びこれらのペプチドが固定化された固相及びかかる固相の生産方法に関する。

抗体（免疫グロブリン）は、抗原に対して特異的に結合するタンパク質であり、生体内における体液性免疫の主役である。図６（ａ）は、抗体（免疫グロブリン）の基本構造を示す模式図である。抗体分子６１は、２本の分子量５万〜７万の重鎖（Ｈ鎖）６２と、２本の分子量２．３万の軽鎖（Ｌ鎖）６３の４本の鎖状ポリペプチドがジスルフィド結合及び非共有結合によって結合して、全体としてＹ字型を形成している。重鎖（Ｈ鎖）６２は、４つ又は５つのドメインから構成され、Ｎ末端側に可変部（Ｖ_H）のドメインが配置され、Ｃ末端側に向けて３〜４つの定常部（Ｃ_H１、Ｃ_H２、Ｃ_H３、Ｃ_H４）のドメインが配置される。なお、図６（ａ）では、４つのドメイン（Ｖ_H、Ｃ_H１、Ｃ_H２、Ｃ_H３）から構成される重鎖６２を示す。軽鎖（Ｌ鎖）６３は、２つのドメインから構成され、Ｎ末端側に可変部（Ｖ_L）のドメインが配置され、Ｃ末端側に定常部（Ｃ_L）のドメインが配置される。

重鎖６２及び軽鎖６３の可変部（Ｖ_H及びＶ_L）は、Ｎ末端側の２箇所に配置され、両者が一体となって、抗原に対して特異的に結合する立体的な抗原結合部位が形成される。したがって、抗体の特異性は、重鎖及び軽鎖の可変部（Ｖ_H及びＶ_L）のアミノ酸配列及び組み合わせによって決定され、対応する抗原に応じて、可変部（Ｖ_H及びＶ_L）のアミノ酸配列や組み合わせが異なる。重鎖及び軽鎖の定常部（Ｃ_H１、Ｃ_H２、Ｃ_H３、Ｃ_H４及びＣ_L）は、各クラスまたはサブクラス毎にほぼ一定の構造である。

抗体分子６１は、タンパク質分解酵素であるパパインによって、重鎖のＣ_H１とＣ_H２ドメインの間のヒンジ部６４で分解され、図６（ｂ）に示すように、２つのFab断片６５と一つのFc断片６６とに分解される。なお、別のタンパク質分解酵素であるペプシンによって抗体分子６１を分解すると、図６（ｃ）に示すように、２つのFab断片６５がヒンジ部６４でジスルフィド結合した構造のF(ab’)₂断片６７を得ることができる。Fab断片６５やF(ab’)₂断片６７は、重鎖及び軽鎖の可変部（Ｖ_H及びＶ_L）による抗原結合部位を備えているため、抗原に対する特異性を有しており、抗原抗体反応に利用することができる。

さらに、重鎖の可変部（Ｖ_H）と軽鎖の可変部（Ｖ_L）とをリンカーペプチド６９で結合した構造の一本鎖抗体（scFv）６８も、重鎖と軽鎖の可変部（Ｖ_H及びＶ_L）による立体的な抗原結合部位を形成できるため、抗原に対する特異性を有しており、抗原抗体反応に利用することができる。図６（ｄ）は、一本鎖抗体（scFv）６８の基本構造を示す模式図である。図６（ｄ）においてが、重鎖の可変部（Ｖ_H）のＣ末端が鎖状のリンカーペプチド６９によって、軽鎖の可変部（Ｖ_L）のＮ末端に連結されている。

抗原抗体反応は、抗原と抗体の特異性が高く、抗原結合部位が変われば対応する抗原も変わることから、１００万通り以上の重鎖及び軽鎖の可変部（Ｖ_H及びＶ_L）の組み合わせについて、どのような抗原抗体反応を示すのか検証する基礎的な実験が必要とされている。また、抗原と抗体の特異性が高いことを利用して、抗原抗体反応は、様々な用途及び分野において利用されている。

従来から、微量の物質を検出又は測定する方法として、抗原と抗体間の特異的な親和力を利用した免疫測定法（イムノアッセイ）が知られている。免疫測定法は、抗原抗体反応の多様性から、様々な生体成分の分析が可能であり、広い分野において使用されている。さらに、免疫測定法の測定感度を高めるために、放射線化合物、蛍光物質、酵素などの標識を用いた各種の手法が知られており、各標識に応じて、それぞれ放射免疫測定法（ラジオイムノアッセイ：ＲＩＡ）、免疫蛍光測定法（蛍光イムノアッセイ：ＦＩＡ）、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ：Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay。エンザイムイムノアッセイとも呼ぶ）などと呼ばれている。特に、ＥＬＩＳＡは、高感度で定量性に優れており、精製や前処理といった煩雑なステップを必要としない汎用性の高い検出法であることから、医療診断、環境ホルモン・残留農薬の定量、牛海綿状脳症（ＢＳＥ）検査、プロテオーム解析等の様々な分析に利用されている。

これらの免疫測定法における微量測定では、抗原、抗体又は酵素等のタンパク質を試験管やマイクロプレート等の固相に物理吸着や化学結合を利用して固定化する固相化法が利用されている。固相としては、通常、疎水性のプラスチックが利用される。疎水性の固相は、タンパク質が疎水性相互作用によって強固に結合するので、比較的多くの種類のタンパク質に対して適用できる点で優れている。現在、疎水性のプラスチックとしては、疎水性のポリスチレン（ＰＳ）が多用されている。

また、免疫測定法は、いずれの方法においても、多数回の吸着・反応処理及び洗浄処理が必要であり、目的物質を検出するまでに長時間を要するものであった。なお、抗原抗体反応を検証する実験においても、試験管やマイクロプレート等の固相に抗体等を固定化して実験するのが一般的であり、固相化法が利用されている。

例えば、ＥＬＩＳＡは、直接吸着法、サンドイッチ法及び競合法に大別されるが、サンドイッチ法のＥＬＩＳＡの場合、特許文献１によれば、第一に、固相に目的物質に対する抗体を結合させた後、固相を複数回洗浄する。第二に、固相上に残った未結合の部位に対して、固相表面にその他の試薬が結合しないように、抗原抗体反応及び酵素反応に関与しない試薬（以下「ブロッキング試薬」という。）を結合させてブロッキングした後、固相を複数回洗浄する。第三に、目的物質を含有する試料と固相上に結合された抗体とを反応させた後、固相を複数回洗浄する。第四に、第２の抗体と目的物質と反応させた後、固相を複数回洗浄する。第五に、第２の抗体と酵素標識とを反応させた後、固相を複数回洗浄する。第六に、酵素標識と基質とを反応させ、吸光度を測定し、試料中の目的物質を検出し、又は濃度を測定する（特許文献１の段落００３９参照）。なお、第四の処理で反応させる第２の抗体として、既に酵素標識された抗体を利用すれば、第五の処理は不要となる。
特表２００２-５２６７７７号公報

上で述べたとおり、重鎖及び軽鎖の可変部（Ｖ_H及びＶ_L）の組み合わせは、１００万通り以上も存在し、抗原抗体反応を検証するために、膨大な量の実験が必要である。しかし、抗体分子は、分子量が大きく、生産するために動物細胞が必要で、生産コストが高かった。

また、検証実験や免疫測定法等の固相化法では、通常、疎水性のプラスチックが利用されるが、疎水性相互作用を利用した結合であるため、抗原、抗体又は酵素等のタンパク質のいずれの部位が固相と結合するのか特定できず、固相と結合する部位によっては、構造変化や不活性化してしまう。例えば、酵素のＯ−アセチルセリンスルフヒドリラーゼ−Ａ（O-acetyl serine sulfhydryrase-A）は、疎水性ポリスチレンに結合すると、ほぼ完全に失活する。さらに、このようなタンパク質と固相の無秩序な結合により、測定感度が低下し、測定精度も悪くなってしまう。

抗体分子６１は、図６に示すように、全体としてＹ字状であり、その上側の２箇所のＮ末端側に重鎖と軽鎖の可変部（Ｖ_H及びＶ_L）による立体的な抗原結合部位が形成されている。抗体を固定化する際に、Ｃ末端側が固相表面に対して垂直に結合すれば、抗原結合部位が外側を向き、また立体的に正常な配置を取れるため、抗原抗体反応を行うことができる。しかし、Ｎ末端側が固相と結合すると、少なくとも結合したＮ末端側に配置された抗原結合部位は、抗原と反応することができなくなる。また、固相との結合の際に、抗原結合部位の立体構造が変化して、抗体が変性し、抗原抗体反応を示さなくなることもある。

Fab断片６５やF(ab’)₂断片６７は、抗体分子６１に比べて、分子量が小さくそれら自体を大腸菌や酵母等での生産が可能であるが、抗原結合部位の占める割合が高いので、無秩序に固相表面に結合させた場合、抗原抗体反応を示さなくなる可能性も高くなる。一本鎖抗体（scFv）６８に至っては、基本的に抗原結合部位のみによって構成されているので、Fc領域や定常部の影響を排除できるため抗原抗体反応を調べるための抗体側の物質としては好適な形態ではあったが、固定化には極めて不利であり、そのままの状態で疎水性の基板に固定化しても、ほとんど抗原抗体反応を示さなかった。

また、一般的に公知のクローン化技術によって製造されたタンパク質は、製造物である目的のタンパク質を回収するための分離、精製する工程に非常に時間と手間がかかっていた。例えば、宿主として大腸菌を使用した場合、大腸菌内には、目的とするタンパク質だけではなく、様々な種類の夾雑物が存在する。このため、大腸菌を培養した後、大腸菌の菌体を破砕して遠心分離することによって、菌体内可溶性画分を採取し、それをカラムによって精製して目的タンパク質を回収する必要があった。

また、組換えＤＮＡを導入することによって異種遺伝子を宿主内で大量に発現させた場合、生成されたタンパク質による宿主への悪影響を避けるため、不溶で不活性な凝集体である封入体（inclusion body）として生成されることがある。この封入体（inclusion body）は、遠心分離によって回収した後に、可溶化した上で、そのままでは活性がないので、タンパク質の折りたたみ構造を正常な状態に戻して活性化させるリフォールディングという作業も必要となる。

さらに、上述したとおり、免疫測定法は、多数回の吸着・反応処理及び洗浄処理が必要であり、目的物質を検出するまでに長時間を要するものであり、短時間で微量物質を検出又は測定できる手法の開発が望まれている。

本発明は、以上の課題及び問題点の一つ若しくは幾つかを解決するためのものであり、抗原抗体反応に利用できる可変部を含むペプチド、これらのペプチドが固定化された固相及びかかる固相の生産方法を提供する。また、生産効率を向上させた可変部を含むペプチド、固定化させても構造変化や不活性化しにくい可変部を含むペプチド、固定化されるタンパク質の構造をより維持し、活性をより保持できる免疫測定法に利用可能な可変部を含むペプチド、測定感度を向上させ、安定した測定精度の免疫測定法に利用可能な可変部を含むペプチド又は従来と比較して短時間で微量物質を検出又は測定できる方法に利用可能な可変部を含むペプチド並びにこれらのペプチドが固定化された固相及びかかる固相の生産方法を提供することを目的とする。

なお、本明細書では、新規で有用なペプチド及び当該ペプチドの用途も開示している。また、本発明は、親水性の固相に特異的に結合する機能を発現させるペプチド及び当該ペプチドの用途も開示している。さらに、本発明は、固相化法を用いた化合物の検出又は測定に利用可能なペプチド及び当該ペプチドの用途も開示している。

前述した目的を達成するため、抗原結合部位が形成される可変部を含むペプチドであって、重鎖の可変部よりもＣ末端側又は軽鎖の可変部よりもＣ末端側に、固相に対して特異的な吸着機能を発現させるアミノ酸配列を有する。また、本発明のペプチドは、抗原結合部位が形成される可変部を含むペプチドであって、重鎖の可変部よりもＣ末端側又は軽鎖の可変部よりもＣ末端側に、配列表における配列番号１乃至２０に示すアミノ酸配列の何れか一つを有する。さらに、本発明のペプチドは、１本鎖抗体（scFv）、多価性１本鎖抗体（sc(Fv)_n）、定常部融合１本鎖抗体（scFv-Fc）、Fab断片又はF(ab’)₂断片であることが好ましい。

本発明のペプチドは、前記アミノ酸配列は親水性の樹脂表面に対して特異的な吸着機能を発現させることが好ましく、前記樹脂表面は親水性のポリスチレン表面であってもよい。

さらに、前記重鎖及び軽鎖の両方に、前記アミノ酸配列を有する１本鎖抗体（scFv）、多価性１本鎖抗体（sc(Fv)_n）、定常部融合１本鎖抗体（scFv-Fc）、Fab断片又はF(ab’)₂断片であることがより好ましい。本発明のペプチドは、前記重鎖可変部と前記軽鎖可変部を結合するリンカーペプチドを有し、前記リンカーペプチドと前記可変部の間又は前記リンカーペプチド内に前記アミノ酸配列を有していてもよい。

また、本発明の精製されたペプチドの生産方法では、固相に対して特異的な吸着機能を発現させるアミノ酸配列を有するペプチドと夾雑物とを含む溶液を前記固相表面に接触させることにより、前記ペプチドを前記固相表面に直接吸着させ、前記ペプチドを精製する。

さらに、本発明の復元されたペプチドの生産方法では、固相に対して特異的な吸着機能を発現させるアミノ酸配列を有する変性されたペプチドと変性剤とを含む溶液を前記固相表面に接触させることにより、前記ペプチドを前記固相表面に直接吸着させ、前記変性されたペプチドを復元する。ここで、前記変性されたペプチドは、封入体であってもよい。

上記ペプチドの生産方法において、前記ペプチドは、抗原結合部位が形成される可変部を含み、重鎖の可変部よりもＣ末端側又は軽鎖の可変部よりもＣ末端側に、前記アミノ酸配列を有していてもよい。また、前記溶液は、前記ペプチドを生成した宿主の破砕物、培地または分泌物を含有していてもよい。そして、前記アミノ酸配列としては、配列表における配列番号１乃至２０に示すアミノ酸配列を使用することができる。

また、本発明では、固相に対して特異的な吸着機能を発現させるアミノ酸配列を有するペプチドをコードする塩基配列を含む遺伝子を宿主に導入して形質転換体とし、その生成物を含む溶液を前記固相表面に接触させることにより、前記ペプチドを前記固相表面に直接吸着させることによって、ペプチドが固定化された固相を生産してもよい。ここで、前記ペプチドは、抗原結合部位が形成される可変部を含み、重鎖の可変部よりもＣ末端側又は軽鎖の可変部よりもＣ末端側に有するものでもよく、前記生成物を含む溶液は、前記宿主の破砕物も含有するものであっても、前記宿主の培地を含有するものであっても、酵母から分泌生産された分泌物を含有するものであってもよい。

また、本発明の対象としては、抗原結合部位が形成される可変部を含むペプチドであって、重鎖の可変部よりもＣ末端側又は軽鎖の可変部よりもＣ末端側に、固相に対して特異的な吸着機能を発現させるアミノ酸配列を有するペプチドをコードする塩基配列を含む遺伝子、当該遺伝子に調製されたベクターまたは当該遺伝子が導入された宿主でもよい。

また、本発明のペプチドは、配列表における配列番号１に示すアミノ酸配列を含むペプチドであることが好ましい。また、免疫測定法における固相に固定化されるペプチドであって、配列表における配列番号１に示すアミノ酸配列を含むものでもよい。これらの配列番号１に示すアミノ酸配列は、配列表における配列番号２乃至１０に示すアミノ酸配列であってもよい。

前記固相は親水性の樹脂表面を有していてもよく、前記固相は親水性のポリスチレン表面を有していてもよい。前記免疫測定法はエンザイムイムノアッセイであってもよい。

また、本発明は、配列表における配列番号１に示すアミノ酸配列を含む固定化酵素、配列表における配列番号１に示すアミノ酸配列をコードする塩基配列を含む遺伝子、当該遺伝子に調製されたベクターまたは当該遺伝子が導入された宿主も開示する。そして、これらの配列番号１に示すアミノ酸配列は、配列表における配列番号２乃至１０に示すアミノ酸配列であってもよい。

本発明のペプチドは、特定の固相表面に対して優れた結合性能を示し、特定の固相に直接固定化させることができるので、本ペプチドを容易に分離、精製することができる。すなわち、本ペプチドを生産した後、十分な精製を行わなくても、本ペプチドを含む溶液を特定の固相に接触させるだけで、本ペプチドを固相に直接結合させることができ、本ペプチドの溶液からの分離、精製及び固相への固定化を同時に行うことができる。この結果、従来、長時間必要であった分離、精製工程（例えばアフィニティカラムを使用する精製工程）を省くことができ、本ペプチドの生産から固相への固定化までに要する時間を大幅に短縮させることができるので、本ペプチドでは生産効率が飛躍的に向上する。しかも、この過程において、封入体（inclusion body）の状態で生成されたタンパク質や変性されたタンパク質のリフォールディングも行うことも可能である。

また、本ペプチドは、固相化法を用いた化合物の検出又は測定に利用することも可能である。特に免疫測定法において、従来と比較して、特異性のある吸着機能により測定時間を短縮でき、しかも原ペプチドの活性を保ったまま固定化でき、測定感度を向上させ、安定した測定精度を得ることができる。

ＢＳＡの存在下における親水性のポリスチレン表面に対する固定化率を示すグラフ。 （ａ）〜（ｄ）は、それぞれＴｗｅｅｎ２０の添加量が０、０．１、１、１０％の条件における親水性のポリスチレンプレートに対する結合性能を示すグラフ。 （ａ）〜（ｄ）は、それぞれＴｗｅｅｎ２０の添加量が０、０．１、１、１０％の条件における疎水性のポリスチレンプレートに対する結合性能を示すグラフ。 （ａ）〜（ｆ）は、種々の夾雑物の存在下における親水性及び疎水性のポリスチレンプレートに対する結合性能を示すグラフ。 （ａ）〜（ｆ）は、種々の夾雑物の存在下における親水性及び疎水性のポリスチレンプレートに対する活性値を示すグラフ。 （ａ）は抗体の基本構造を示す模式図、（ｂ）はFab断片とFc断片の構造を示す模式図、（ｃ）はF(ab’)₂断片の構造を示す模式図、（ｄ）は一本鎖抗体（scFv）の基本構造を示す模式図。 ＢＳＡの存在下における親水性のポリスチレン表面に対する固定化率を示すグラフ。 （ａ）及び（ｂ）は、種々の夾雑物の存在下における親水性のポリスチレンプレートに対する活性値を示すグラフ。 ＢＳＡの存在下における親水性のポリスチレン表面に対する固定化率を示すグラフ。 （ａ）及び（ｂ）は、種々の夾雑物の存在下における親水性のポリスチレンプレートに対する活性値を示すグラフ。 （ａ）及び（ｂ）はそれぞれ本ペプチド及び原ペプチドを培養したコロニーにおける菌体濃度、（ｃ）及び（ｄ）はそれぞれ本ペプチド及び原ペプチドの結合性能を示すグラフ。 夾雑物として各種の培地を加えた状態における親水性のポリスチレン表面に対する結合性能を示すグラフ。 本アミノ酸配列を一本鎖抗体に導入したときの活性値を示すグラフ。 一本鎖抗体における本アミノ酸配列の導入位置と活性値の関係を示すグラフ。 一本鎖抗体における本アミノ酸配列の導入位置と活性値の関係を示すグラフ。 一本鎖抗体の量と親水性のポリスチレン基板に対する活性値の関係を示すグラフ。 未精製の変性した状態の本ペプチドのポリスチレン基板に対する結合性能及び活性値を示すグラフ。

以下、本発明を詳しく説明する。本発明のペプチドは、固相に対して特異的な吸着機能を発現させるアミノ酸配列（以下「本アミノ酸配列」という）を有する。本アミノ酸配列は、例えば配列表における配列番号１乃至２０に示すアミノ酸配列（以下、それぞれ「本アミノ酸配列１」乃至「本アミノ酸配列２０」という）である。本アミノ酸配列を有するペプチドを「本ペプチド」という。

本アミノ酸配列は、特定の固相（例えば、親水性の樹脂表面を有する固相）に対して特異的な吸着機能を発現させるため、本ペプチドは、特定の固相表面に対して優れた結合性能を示し、特定の固相に直接固定化させることができるので、本ペプチドを容易に分離、精製することができる。すなわち、本ペプチドを生産した後、十分な精製を行わなくても、本ペプチドを含む溶液を特定の固相に接触させるだけで、本ペプチドを固相に直接結合させることができ、本ペプチドの溶液からの分離、精製及び固相への固定化までの工程を同時に行うことができる。この結果、従来、長時間必要であった分離、精製工程（例えばアフィニティカラムを使用する精製工程）を省くことができ、本ペプチドの生産から固相への固定化までに要する時間を大幅に短縮させることができるので、本ペプチドでは生産効率が飛躍的に向上する。しかも、この過程において、封入体（inclusion body）の状態で生成されたタンパク質や変性されたタンパク質のリフォールディングも行うことも可能である。

また、本ペプチドは、固相化法を用いた化合物の検出又は測定に利用することも可能である。化合物の検出又は測定に利用される抗原、抗体又は酵素に対し、本アミノ酸配列を導入することにより、抗原、抗体又は酵素を特定の固相に直接固定化することができ、化合物の検出又は測定をすることができる。特に、本ペプチドは、免疫測定法を利用した微量物質の検出又は測定に適用することが好ましい。さらに、本ペプチドは、夾雑物の存在下であっても特異的に、しかも本アミノ酸配列の導入位置を優先して特定の固相上に直接結合させるため、配向及び構造を制御した状態で特定の固相上に固定化できるため、従来と比較して、原ペプチドの活性を保ったまま固定化でき、測定感度を向上させ、安定した測定精度を得ることができる。

例えば、サンドイッチ法のＥＬＩＳＡに適用した場合、目的物質と特異的に抗原抗体反応を示す抗体に対し、本アミノ酸配列のペプチドを導入し、本ペプチドである抗体を準備する。第一に、かかる抗体を特定の固相に直接結合させた後、固相を複数回洗浄する。第二に、固相上に残った未結合の部位に対して、ブロッキング試薬を結合させてブロッキングした後、固相を複数回洗浄する。第三に、目的物質を含有する試料と固相上に結合された本ペプチドである抗体とを反応させた後、固相を複数回洗浄する。第四に、本ペプチドではない第２の抗体と目的物質と反応させた後、固相を複数回洗浄する。第五に、第２の抗体と酵素標識とを反応させた後、固相を複数回洗浄する。第六に、酵素標識と基質とを反応させ、吸光度を測定し、試料中の目的物質を検出し、又は濃度を測定する。

このように、本ペプチドを利用した免疫測定法による化合物の検出又は測定を行うことができる。なお、第四の処理で反応させる第２の抗体として、既に酵素標識された抗体を利用すれば、第五の処理は不要となる。また、本ペプチドが、ブロッキング試薬の存在下においても特異的に結合するので、上記第一の処理において、特定の固相に対し、本ペプチドである抗体とブロッキング試薬とを同時に結合させることで、第二の処理を省略することができ、化合物の検出又は測定時間を短縮できる。

さらに、最初に、溶液中において、本ペプチドである抗体と目的物質とを抗原抗体反応させて免疫複合物を形成させ、その後、特定の固相上に免疫複合物を固定化させることにより、化合物の検出又は測定時間を劇的に短縮できる新たな化合物の検出又は測定方法を実現できる。すなわち、上記サンドイッチ法における第一の処理と第三の処理を一回の処理で実行できる。溶液中にブロッキング試薬も添加しておけば、上記第一、第二及び第三の処理を一回の処理で実行できる。より好ましくは、本ペプチドである抗体と目的物質との免疫複合物を形成した後に、溶液中において、さらに酵素標識された第２の抗体とも抗原抗体反応させて、より大きな免疫複合物を形成させ、それを特定の固相上に固定化すれば、上記第一乃至第五の処理を一回の処理で実行できる。

本ペプチドは、夾雑物の存在下であっても特異的に、しかも配向及び構造を制御した状態で、特定の固相上に直接固定化できるため、ブロッキング試薬が存在しても、免疫複合物の状態であっても、免疫複合物を固定化して、目的物質の検出又は測定を行うことができる。加えて、溶液中において立体障害なく極めて迅速に抗原抗体反応が行われるため、従来の固定化された状態での抗原抗体反応と比べて、飛躍的に反応速度を増加させることができ、測定感度を向上させ、安定した測定精度を得ることができる。

さらに本ペプチドの別の用途として、本ペプチドとして酵素を採用すれば、親水性の樹脂表面における固定化酵素として利用することができる。一般的に、酵素は水溶性であるため、利用する際に使い捨てているが、酵素を固相に結合させて固定化することにより、水溶性の反応生成物と分離することができ、連続的、かつ繰り返し反応させることができる。

本アミノ酸配列１は、配列表における配列番号１に示されているように、Ｎ末端側からＣ末端側に向けて順にＲＸＸＸＲＲＸＲＲ（Ｒ：アルギニン、Ｘ：イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、バリン（Ｖ）、アラニン（Ａ）、グリシン（Ｇ）、メチオニン（Ｍ）、セリン（Ｓ）又はトレオニン（Ｔ）の一つ又は複数の組合わせ）という配列である。したがって、本アミノ酸配列１には、少なくとも、本アミノ酸配列２乃至１０が含まれる。

本アミノ酸配列２は、本アミノ酸配列１のＸを全てイソロイシン（Ｉ）とした配列であり、Ｎ末端側からＣ末端側に向けて順にＲＩＩＩＲＲＩＲＲ（Ｒ：アルギニン、Ｉ：イソロイシン）という配列である。本アミノ酸配列３は、本アミノ酸配列１のＸをアラニン（Ａ）とイソロイシン（Ｉ）の組合わせとした配列であり、Ｎ末端側からＣ末端側に向けて順にＲＡＩＡＲＲＩＲＲ（Ｒ：アルギニン、Ａ：アラニン、Ｉ：イソロイシン）という配列である。本アミノ酸配列４は、本アミノ酸配列１のＸを全てロイシン（Ｌ）とした配列であり、Ｎ末端側からＣ末端側に向けて順にＲＬＬＬＲＲＬＲＲ（Ｒ：アルギニン、Ｌ：ロイシン）という配列である。本アミノ酸配列５は、本アミノ酸配列１のＸを全てバリン（Ｖ）とした配列であり、Ｎ末端側からＣ末端側に向けて順にＲＶＶＶＲＲＶＲＲ（Ｒ：アルギニン、Ｖ：バリン）という配列である。本アミノ酸配列６は、本アミノ酸配列１のＸを全てアラニン（Ａ）とした配列であり、Ｎ末端側からＣ末端側に向けて順にＲＡＡＡＲＲＡＲＲ（Ｒ：アルギニン、Ａ：アラニン）という配列である。本アミノ酸配列７は、本アミノ酸配列１のＸを全てグリシン（Ｇ）とした配列であり、Ｎ末端側からＣ末端側に向けて順にＲＧＧＧＲＲＧＲＲ（Ｒ：アルギニン、Ｇ：グリシン）という配列である。

後述する実施例１乃至６において示すとおり、本アミノ酸配列２乃至７を有するペプチドは、何れも特定の固相表面に対して特異的な吸着機能を発現させることが確認された。本アミノ酸配列２乃至７は、何れもアルギニン（Ｒ）の配置は、Ｎ末端側から１、５，６、８、９番目と共通であり、その間に配置されるアミノ酸（本アミノ酸配列１のＸ）を変えたものである。本アミノ酸配列２，４乃至７は、単一のアミノ酸を配置させているが、本アミノ酸配列３では、アラニン（Ａ）とイソロイシン（Ｉ）とを組合わせて配置させている。これら全てにおいて共通の性質を示したことから、本アミノ酸配列１のＸとして、イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、バリン（Ｖ）、アラニン（Ａ）又はグリシン（Ｇ）の一つ又は組み合わせとすることにより特定の固相表面に対して特異的な吸着機能を発現させることが予測される。

さらに、本アミノ酸配列８は、本アミノ酸配列１のＸを全てメチオニン（Ｍ）とした配列であり、Ｎ末端側からＣ末端側に向けて順にＲＭＭＭＲＲＭＲＲ（Ｒ：アルギニン、Ｍ：メチオニン）という配列である。本アミノ酸配列９は、本アミノ酸配列１のＸを全てセリン（Ｓ）とした配列であり、Ｎ末端側からＣ末端側に向けて順にＲＳＳＳＲＲＳＲＲ（Ｒ：アルギニン、Ｓ：セリン）という配列である。本アミノ酸配列１０は、本アミノ酸配列１のＸを全てトレオニン（Ｔ）とした配列であり、Ｎ末端側からＣ末端側に向けて順にＲＴＴＴＲＲＴＲＲ（Ｒ：アルギニン、Ｔ：トレオニン）という配列である。

後述する実施例７乃至９において示すとおり、本アミノ酸配列８乃至１０を有するペプチドは、何れも特定の固相表面に対して特異的な吸着機能を発現させることが確認された。メチオニン（Ｍ）、セリン（Ｓ）又はトレオニン（Ｔ）は、アミノ酸（Ｒ−ＣＨ（ＮＨ２）ＣＯＯＨ）のＲ基中に硫黄やヒドロキシ基（ＯＨ）が含まれてはいるものの、部分的に鎖状の飽和炭化水素を有し、中性のアミノ酸である点において、Ｒ基が鎖状の飽和炭化水素からなるイソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、バリン（Ｖ）及びアラニン（Ａ）と共通している。また、メチオニン（Ｍ）、セリン（Ｓ）及びトレオニン（Ｔ）は、Ｒ基に環状構造や芳香族化合物を含まず、立体構造の面においても比較的かさの小さいアミノ酸である点においても共通である。このため、本アミノ酸配列１のＸとして、メチオニン（Ｍ）、セリン（Ｓ）又はトレオニン（Ｔ）を選択しても、同様の効果が得られることが予測される。

さらに、本アミノ酸配列１１は、配列表における配列番号１１に示されているように、Ｎ末端側からＣ末端側に向けて順にＫＧＬＲＧＷＲＥＭＩＳＬ（リジン（Ｋ）、グリシン（Ｇ）、ロイシン（Ｌ）、アルギニン（Ｒ）、グリシン（Ｇ）、トリプトファン（Ｗ）、アルギニン（Ｒ）、グルタミン酸（Ｅ）、メチオニン（Ｍ）、イソロイシン（Ｉ）、セリン（Ｓ）、ロイシン（Ｌ））という配列である。

本アミノ酸配列１２は、配列表における配列番号１２に示されているように、Ｎ末端側からＣ末端側に向けて順にＡＤＹＬＳＲＷＧＳＩＲＮ（アラニン（Ａ）、アスパラギン酸（Ｄ）、チロシン（Ｙ）、ロイシン（Ｌ）、セリン（Ｓ）、アルギニン（Ｒ）、トリプトファン（Ｗ）、グリシン（Ｇ）、セリン（Ｓ）、イソロイシン（Ｉ）、アルギニン（Ｒ）、アスパラギン（Ｎ））という配列である。

本アミノ酸配列１３は、配列表における配列番号１３に示されているように、Ｎ末端側からＣ末端側に向けて順にＳＲＶＨＲＡＶＬＮＧＶＳ（セリン（Ｓ）、アルギニン（Ｒ）、バリン（Ｖ）、ヒスチジン（Ｈ）、アルギニン（Ｒ）、アラニン（Ａ）、バリン（Ｖ）、ロイシン（Ｌ）、アスパラギン（Ｎ）、グリシン（Ｇ）、バリン（Ｖ）、セリン（Ｓ））という配列である。

本アミノ酸配列１４は、配列表における配列番号１４に示されているように、Ｎ末端側からＣ末端側に向けて順にＲＰＰＧＶＶＲＲＹＡＬＧ（アルギニン（Ｒ）、プロリン（Ｐ）、プロリン（Ｐ）、グリシン（Ｇ）、バリン（Ｖ）、バリン（Ｖ）、アルギニン（Ｒ）、アルギニン（Ｒ）、チロシン（Ｙ）、アラニン（Ａ）、ロイシン（Ｌ）、グリシン（Ｇ））という配列である。

本アミノ酸配列１５は、配列表における配列番号１５に示されているように、Ｎ末端側からＣ末端側に向けて順にＶＲＳＷＥＥＱＡＲＶＴＴ（バリン（Ｖ）、アルギニン（Ｒ）、セリン（Ｓ）、トリプトファン（Ｗ）、グルタミン酸（Ｅ）、グルタミン酸（Ｅ）、グルタミン（Ｑ）、アラニン（Ａ）、アルギニン（Ｒ）、バリン（Ｖ）、トレオニン（Ｔ）、トレオニン（Ｔ））という配列である。

本アミノ酸配列１６は、配列表における配列番号１６に示されているように、Ｎ末端側からＣ末端側に向けて順にＲＡＦＩＡＳＲＲＩＫＲＰ（アルギニン（Ｒ）、アラニン（Ａ）、フェニルアラニン（Ｆ）、イソロイシン（Ｉ）、アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、アルギニン（Ｒ）、アルギニン（Ｒ）、イソロイシン（Ｉ）、リジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）、プロリン（Ｐ））という配列である。

本アミノ酸配列１７は、配列表における配列番号１７に示されているように、Ｎ末端側からＣ末端側に向けて順にＲＥＳＴＬＫＧＴＳＲＡＶ（アルギニン（Ｒ）、グルタミン酸（Ｅ）、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）、ロイシン（Ｌ）、リジン（Ｋ）、グリシン（Ｇ）、トレオニン（Ｔ）、セリン（Ｓ）、アルギニン（Ｒ）、アラニン（Ａ）、バリン（Ｖ））という配列である。

本アミノ酸配列１８は、配列表における配列番号１８に示されているように、Ｎ末端側からＣ末端側に向けて順にＡＧＬＲＬＫＫＡＡＩＨＲ（アラニン（Ａ）、グリシン（Ｇ）、ロイシン（Ｌ）、アルギニン（Ｒ）、ロイシン（Ｌ）、リジン（Ｋ）、リジン（Ｋ）、アラニン（Ａ）、アラニン（Ａ）、イソロイシン（Ｉ）、ヒスチジン（Ｈ）、アルギニン（Ｒ））という配列である。

本アミノ酸配列１９は、配列表における配列番号１９に示されているように、Ｎ末端側からＣ末端側に向けて順にＳＳＬＬＲＡＶＰＥＰＴＧ（セリン（Ｓ）、セリン（Ｓ）、ロイシン（Ｌ）、ロイシン（Ｌ）、アルギニン（Ｒ）、アラニン（Ａ）、バリン（Ｖ）、プロリン（Ｐ）、グルタミン酸（Ｅ）、プロリン（Ｐ）、トレオニン（Ｔ）、グリシン（Ｇ））という配列である。

本アミノ酸配列２０は、配列表における配列番号２０に示されているように、Ｎ末端側からＣ末端側に向けて順にＲＡＦＩＡＳＲＲＩＲＲＰ（アルギニン（Ｒ）、アラニン（Ａ）、フェニルアラニン（Ｆ）、イソロイシン（Ｉ）、アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、アルギニン（Ｒ）、アルギニン（Ｒ）、イソロイシン（Ｉ）、アルギニン（Ｒ）、アルギニン（Ｒ）、プロリン（Ｐ））という配列である。

本アミノ酸配列１乃至２０は、特定の固相に対して特異的な吸着機能を発現させることができる。特定の固相とは、現時点で確認されている範囲では、親水性の樹脂表面を有する固相である。すなわち、本ペプチドは、原ペプチドと比較して、親水性の樹脂表面に対する結合性能が向上する。特に、本ペプチドは、親水性のポリスチレン表面に対して優れた結合性能を示す。結合性能は、競合する夾雑物に対して優先的に結合する性能であり、競合する夾雑物、例えば他のペプチド、高分子化合物、界面活性剤等の存在下において、固相に対して結合する本ペプチドの量を比較することで評価できる。

親水性の樹脂表面を有する固相としては、ポリスチレン、ポリカーボネート、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）、ポリメタクリル酸メチル（ＰＭＭＡ）等などのプラスチック樹脂表面を変質させて親水化処理したものを用いることができる。通常、製造されたプラスチック樹脂表面は疎水性であるが、この表面に各種の親水化処理を行うことで、親水性の樹脂表面を有する固相とすることができる。例えば、ポリスチレン表面にＵＶ＋Ｏ₃処理やプラズマ酸化処理を行うことにより、親水性のポリスチレン表面を有する固相を準備できた。

固相の形態としては、板状（容器やウェルの壁面及び底面を含む）でもよいし、粒状でもよい。特開２００７−２７９０１８号公報に記載されているように、マイクロウェルプレートの流体取扱部（各ウェル）内に表面が親水化処理された粒状プラスチック基板を充填すれば、ウェル内に本ペプチドを含む溶液を注入するだけで粒状プラスチック基板表面に本ペプチドを固定化することができる。

本明細書において「ペプチド」とは、ペプチド結合によって２個以上のアミノ酸が結合したものを指し、オリゴペプチド、ポリペプチド、タンパク質、ホモメリックペプチド及びヘテロメリックペプチドを含む。また、本ペプチドは、電気的に中性の形態、又は塩の形態をとることがあり、配列表における本アミノ酸配列のみからなる形態、特定のタンパク質の末端部または内部に本ペプチドを融合させた融合タンパク質の形態、糖質やポリエチレングリコール、ＮＣＳ基（isothiocyanate）、ＮＨＳ基（N-Hydroxy succinimide ester)、マレイミド基、チオール基、ビオチン、蛍光色素等を付加して得られる複合体としての形態、さらには、ペプチドをアセチル化、アミド化及び／又は多官能試験により架橋重合させて得られる誘導体又は重合体としての形態であってもよい。

配列表における配列番号２１に示す塩基配列は、本アミノ酸配列２をコードする塩基配列の一例である。すなわち、５’末端側から３’末端側に向けて順にｃｇｔ ａｔｃ ａｔｃ ａｔｃ ｃｇａ ａｇｇ ａｔｔ ｃｇａ ｃｇａ（ａ：アデニン、ｇ：グアニン、ｃ：シトシン、ｔ：チミン）という塩基配列を含むＤＮＡである。配列番号２２に示す塩基配列は、本アミノ酸配列３をコードする塩基配列の一例である。すなわち、５’末端側から３’末端側に向けて順にｃｇｔ ｇｃｇ ａｔｔ ｇｃｇ ｃｇａ ａｇｇ ａｔｔ ｃｇａ ｃｇａ（ａ：アデニン、ｇ：グアニン、ｃ：シトシン、ｔ：チミン）という塩基配列を含むＤＮＡである。本アミノ酸配列２又は３をコードする塩基配列としては、配列番号２１又は２２に示す塩基配列に限定されるものではなく、その他にも、本アミノ酸配列２又は３の各アミノ酸に対応する各コドンの配列を採用できる。本アミノ酸配列をコードする塩基配列を含む遺伝子は、ファージやプラスミド等のベクターを用いて、あるいは宿主のゲノムＤＮＡ中に導入し、宿主内において発現させることにより、本ペプチドを生合成できる。

本ペプチドとしては、種々のタンパク質を利用することが可能であり、多くの抗原、抗体、レクチン、酵素又は受容体タンパク質等に適用することができる。例えば、グルタチオン転移酵素（ＧＳＴ：Glutathione S-Transferase）、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）、ペルオキシダーゼ（ＰＯＤ）、ルシフェラーゼ、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、β−ガラクトシダーゼ(β−Ｇａｌ)、トリプシン、キモトリプシン、トロンビン、Factor Xa、アンジオテンシン変換酵素、チロシンキナーゼ、インスリンレセプター、ＥＧＦレセプター、ストレプトアビジン（ＳＡ）、モノクローナル抗体（Ｍａｂ）、ポリクローナル抗体（Ｐａｂ）、１本鎖抗体（scFv）、多価性１本鎖抗体（sc(Fv)_n）（例えば２価性１本鎖抗体（sc(Fv)₂））、定常部融合１本鎖抗体（scFv-Fc）、Fab断片及びF(ab’)₂断片（抗原結合部位を含む抗体の断片）、補体系タンパク質Ｃ１ｑ、コンカナバリンＡ（ＣｏｎＡ）、レンチルレクチン（ＬＣＡ）、抗体結合タンパク質（Protein A、ZZ、Protein G、Protein L等）等に適用することができる。なお、本明細書において、本ペプチドと対比するために、本ペプチドから本アミノ酸配列を除いたペプチド（本アミノ酸配列を導入する前のペプチドを含む）を、以下においては「原ペプチド」と呼ぶ。

なお、本ペプチドとして、抗原結合部位が形成される可変部を含むペプチドとする場合、抗体分子それ自体も含むが、大腸菌や酵母での生産が可能である１本鎖抗体（scFv）、多価性１本鎖抗体（sc(Fv)_n）、定常部融合１本鎖抗体（scFv-Fc）、Fab断片、F(ab’)₂断片であることが好ましい。多価性１本鎖抗体（sc(Fv)_n）は、複数の１本鎖抗体（scFv）をリンカーペプチドで連結したものであり、分子内に複数の抗原結合部位（重鎖可変部（Ｖ_H）及び軽鎖可変部（Ｖ_L）ドメイン）を有するペプチドの総称である。複数の抗原結合部位は同じものでもよいし、異なっていてもよい。なお、２価性１本鎖抗体（sc(Fv)₂）とは、２つの１本鎖抗体（scFv）をリンカーペプチドで連結したものである。定常部融合１本鎖抗体（scFv-Fc）とは、１本鎖抗体（scFv）のＣ末端側にFcドメインを有する融合タンパク質の総称である。Fab断片とは、抗体分子をパパイン消化によって得られる断片のうち、Ｖ_L、Ｃ_Lからなる軽鎖とＶ_H、Ｃ_H１ドメインからなる重鎖が会合したものを指すが、遺伝子組換え技術で作成することも可能である。F(ab’)₂断片とは、抗体分子をペプシン消化後に得られる断片の一つで２分子のFabがヒンジ部のジスルフィド結合で連結されたものを指すが、遺伝子組換え技術で作成することも可能である。

本ペプチドにおいて、本アミノ酸配列の導入部位は、原ペプチドが本来有する生理活性を妨げない部位、例えば、抗原の場合は抗原決定基以外、抗体の場合は抗体活性基以外の部位とする。特に、原ペプチドの立体構造を維持したまま固相に固定化させるため、原ペプチドのＣ末端又はＮ末端近傍の部位に本アミノ酸配列を導入することが好ましい。なお、本ペプチドには、本アミノ酸配列以外にも、標識用のアフィニティタグ等が別途導入されていてもよい。

特に、本ペプチドとして、抗原結合部位が形成される可変部を含むペプチドとする場合は、重鎖の可変部よりもＣ末端側又は軽鎖の可変部よりもＣ末端側（両方を含む）に本アミノ酸配列を導入する。可変部よりもＣ末端側とは、重鎖または軽鎖可変部におけるＣ末端から本ペプチド全体におけるＣ末端までの位置であって、可変部の抗原結合を阻害しない位置全てを指す。

抗体分子の場合（図６（ａ）参照）は、重鎖（Ｈ鎖）６２の可変部（Ｖ_H）よりもＣ末端側に位置する定常部（Ｃ_H１、Ｃ_H２、Ｃ_H３、Ｃ_H４）のドメインにおけるＮ末端やＣ末端、軽鎖（Ｌ鎖）６３の定常部（Ｃ_L）のドメインにおけるＮ末端やＣ末端の一つ若しくは複数箇所に導入することが好ましく、特に、重鎖６２のFc領域の定常部（Ｃ_H２、Ｃ_H３、Ｃ_H４）のドメインにおけるＮ末端やＣ末端、軽鎖６３のＣ末端の一つ若しくは複数箇所に導入することが好ましい。

Fab断片又はF(ab’)₂断片の場合（図６（ｂ）及び（ｃ）参照）は、重鎖６２又は軽鎖６３の可変部のドメイン（Ｖ_H及びＶ_L）におけるＣ末端、定常部（Ｃ_H１及びＣ_L）のドメインにおけるＮ末端やＣ末端あるいはの一つ若しくは複数箇所に導入することが好ましく、特に、重鎖６２のＣ末端又は軽鎖６３のＣ末端の一つ若しくは複数箇所に導入することが好ましい。

また、１本鎖抗体（scFv）、多価性１本鎖抗体（sc(Fv)_n）、定常部融合１本鎖抗体（scFv-Fc）のように、重鎖と軽鎖を結合するリンカーペプチドを有する場合は、リンカーペプチドと重鎖または軽鎖の間、もしくはリンカーペプチド内部に本アミノ酸配列を導入してもよい。ここで、リンカーペプチドは、重鎖又は軽鎖の一方のＣ末端と、他方のＮ末端とを連結しているが、重鎖又は軽鎖のＣ末端側には、リンカーペプチド全体、すなわち重鎖又は軽鎖のＣ末端と結合している部分から他方のＮ末端までの領域も含まれる。なお、リンカーペプチドと重鎖または軽鎖の間、もしくはリンカーペプチド内部に本アミノ酸配列以外の標識用のアフィニティタグ等が別途導入されていてもよい。図６（ｄ）の１本鎖抗体（scFv）の場合、軽鎖の可変部（Ｖ_L）のＣ末端側か、重鎖の可変部（Ｖ_H）のＣ末端からリンカーペプチド６９の内部を含む軽鎖の可変部（Ｖ_L）のＮ末端までの間の一方又は両方に本アミノ酸配列を導入する。

複数の箇所に本アミノ酸配列を導入することにより、本ペプチドの立体構造をより正常な状態に維持することが可能である。たとえば、Fab断片又はF(ab’)₂断片の重鎖及び軽鎖のＣ末端側にそれぞれ本アミノ酸配列を導入したり、１本鎖抗体（scFv）の重鎖及び軽鎖のＣ末端側にそれぞれ本アミノ酸配列を導入すれば、その部位が固相表面に結合しやすくなるので、抗原結合部位が外側を向き、抗原抗体反応を起こしやすくなる。

本ペプチドは、公知のクローン化技術や化学合成法によって製造することが可能である。例えば、クローン化技術を利用すれば、本アミノ酸配列をコードするＤＮＡを調製し、これを自律複製可能なベクターに挿入して組換えＤＮＡとし、これを大腸菌、枯草菌、放線菌、酵母、糸状菌、植物細胞、昆虫細胞、動物細胞などの適宜宿主に導入して形質転換体とし、その培養物から本アミノ酸配列を含むペプチドを採取することができる。また、本アミノ酸配列をコードするＤＮＡを調製し、小麦胚芽や大腸菌細胞抽出液などを用いて無細胞タンパク質合成系により本ペプチドを合成することができる。また、「固相法」又は「液相法」等の慣用のペプチド化学合成法を利用して、本アミノ酸配列に示されるアミノ酸を逐次、脱水縮合させて伸長させれば、本アミノ酸配列からなる本ペプチドを合成することができる。さらに、かかる本アミノ酸配列からなる本ペプチドを所望の原ペプチドに結合させることにより、本アミノ酸配列を含むより高分子の本ペプチドを合成できる。

本ペプチドは、本アミノ酸配列を有しているため、形質転換体からの生成物を含む溶液を固相表面に接触させることにより、本ペプチドを固相表面に直接吸着させて、分離精製することができる。生成物を含む溶液とは、目的となる本ペプチドを含み、且つ宿主に起因する不要な夾雑物が存在する溶液全般を指し、例えば、菌体破砕液、菌体破砕液を遠心分離して得られた可溶性画分、菌体破砕液を遠心分離して得られた不溶性画分を可溶化したもの、細胞膜画分、細胞壁画分、細胞から分泌生産された分泌物、体液、またはこれらの不完全な精製物等を含む。

さらに、組換えＤＮＡを導入することによって異種遺伝子を宿主内で大量に発現させた場合、生成されたタンパク質による宿主への悪影響を避けるため、不溶で不活性な凝集体である封入体（inclusion body）として生成されることがあるが、本ペプチドが封入体（inclusion body）として生成されていても、変性剤で封入体（inclusion body）を可溶化後そのまま固相表面に固定化することができ、しかも固定化させた状態で変性剤を除去することによって本ペプチドがリフォールディングされる場合もある。

また、封入体に対してだけではなく、何らかの原因によって、立体構造が変性されていても、本ペプチドであれば、そのまま固相表面に固定化することができ、しかも固定化させた状態で適当なリフォールディングバッファを加えることによって本ペプチドをリフォールディングできる場合もある。変性の原因としては、加熱、凍結、高圧、超音波、紫外線、Ｘ線、かくはん、吸着、希釈などの物理的な原因と、極端な酸性またはアルカリ性、有機溶媒、重金属塩、変性剤、界面活性剤などの化学的な原因がある。

上で述べたとおり、本アミノ酸配列１乃至２０は、親水性の樹脂表面に対して優れた結合性能を示すため、本アミノ酸配列１乃至２０を有する本ペプチドを親水性の樹脂表面を有する固相に直接固定化することができるので、容易に分離、精製することができる。すなわち、本アミノ酸配列１乃至２０を有する本ペプチドを含む溶液を親水性の樹脂表面を有する固相が充填されたカラムを通過させることにより、本アミノ酸配列１乃至２０を有する本ペプチドを固相に直接結合させて溶液から分離、精製させることができる。

以下に、実施例により本発明を更に具体的に説明するが、本発明は、その要旨を越えない限りこれらの実施例に限定されるものではない。実施例１乃至１９は、グルタチオン転移酵素（ＧＳＴ）に本アミノ酸配列を導入した例であり、実施例２０は、抗体に本アミノ酸配列を導入した例であり、実施例２１乃至２８は、一本鎖抗体に本アミノ酸配列を導入した例である。なお、以下の実施例において、本ペプチドの濃度は、ウシ血清由来のアルブミン（ＢＳＡ）を標準タンパクとして使用したＬｏｗｒｙ法によって定量した。

［実施例１］（本アミノ酸配列２を有するＧＳＴの生合成）
まず、グルタチオン転移酵素（ＧＳＴ）をコードする遺伝子を組み込んだプラスミド（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス株式会社製「ｐＧＥＸ−３Ｘ」、データベース・アクセッション番号：Ｕ１３８５２）の制限酵素BamHIの認識する塩基配列部位と制限酵素EcoRIの認識する塩基配列部位の間に、本アミノ酸配列２をコードする遺伝子（配列表の配列番号２１に示す塩基配列）を導入したものをベクターとして作製した。

次に、宿主として大腸菌（ＢＬ２１）を使用し、本アミノ酸配列２をコードする遺伝子を導入したベクターを宿主に導入して宿主を形質転換し、アンピシリンを含む寒天培地上で選別した。その後、２ｘＹＴ培地５０ｍｌ中で大腸菌を培養し、終濃度が０．１ｍＭになるように、発現誘導物質としてイソプロピル１−チオ−ガラクトシド（ＩＰＴＧ：Isopropyl-1-thio-β-D(-)-galactoside）を加えて、本アミノ酸配列２を含むＧＳＴ（本ペプチド）を発現させた。

そして、菌体破砕後、精製用ゲル（GSH-Sepharose 6B）を用いて菌体内可溶性画分を精製し、リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ：Phosphate Buffered Saline）中で１晩透析し、滅菌フィルターによって凝集体を除去した。こうして、本ペプチドとして、Ｃ末端に本アミノ酸配列２が導入されたグルタチオン転移酵素（ＧＳＴ）を生合成した。以下、実施例１で生合成された本アミノ酸配列２を有するＧＳＴを本ペプチド１という。

［実施例２］（本アミノ酸配列３を有するＧＳＴの生合成）
プラスミド「ｐＧＥＸ−３Ｘ」の制限酵素BamHIの認識する塩基配列部位と制限酵素EcoRIの認識する塩基配列部位の間に、本アミノ酸配列３をコードする遺伝子（配列表の配列番号２２に示す塩基配列）を導入した点以外は、実施例１と同様の処理によって、本ペプチドとして、Ｃ末端に本アミノ酸配列３が導入されたグルタチオン転移酵素（ＧＳＴ）を生合成した。以下、実施例２で生合成された本アミノ酸配列３を有するＧＳＴを本ペプチド２という。

［実施例３〜６］（本アミノ酸配列４乃至７を有するＧＳＴの生合成）
プラスミド「ｐＧＥＸ−３Ｘ」の制限酵素BamHIの認識する塩基配列部位と制限酵素EcoRIの認識する塩基配列部位の間に、本アミノ酸配列４乃至７をコードする遺伝子を導入した点以外は、実施例１と同様の処理によって、本ペプチドとして、Ｃ末端に本アミノ酸配列４乃至７が導入されたグルタチオン転移酵素（ＧＳＴ）をそれぞれ生合成した。なお、実施例３で本アミノ酸配列４を有するＧＳＴを生合成し、実施例４で本アミノ酸配列５を有するＧＳＴを生合成し、実施例５で本アミノ酸配列６を有するＧＳＴを生合成し、実施例６で本アミノ酸配列７を有するＧＳＴを生合成した。以下、実施例３乃至６で生合成された本アミノ酸配列４乃至７を有するＧＳＴを、それぞれ本ペプチド３乃至６という。

［実施例７〜９］（本アミノ酸配列８乃至１０を有するＧＳＴの生合成）
プラスミド「ｐＧＥＸ−３Ｘ」の制限酵素BamHIの認識する塩基配列部位と制限酵素EcoRIの認識する塩基配列部位の間に、本アミノ酸配列８乃至１０をコードする遺伝子を導入した点以外は、実施例１と同様の処理によって、本ペプチドとして、Ｃ末端に本アミノ酸配列８乃至１０が導入されたグルタチオン転移酵素（ＧＳＴ）をそれぞれ生合成した。なお、実施例７で本アミノ酸配列８を有するＧＳＴを生合成し、実施例８で本アミノ酸配列９を有するＧＳＴを生合成し、実施例９で本アミノ酸配列１０を有するＧＳＴを生合成した。以下、実施例７乃至９で生合成された本アミノ酸配列８乃至１０を有するＧＳＴを、それぞれ本ペプチド７乃至９という。

［実施例１０］（本ペプチド１及び２の親水性のポリスチレン表面に対する結合性能評価、夾雑物：ＢＳＡ）
本ペプチドの親水性のポリスチレン表面に対する結合性能を評価するため、夾雑物としてウシ血清由来のアルブミン（ＢＳＡ）が存在する状態における実施例１の本ペプチド１、実施例２の本ペプチド２及び原ペプチドであるＧＳＴの親水性のポリスチレン表面に対する固定化率を測定した。

まず、ＢＳＡを添加しないＰＢＳと、ＢＳＡ濃度が０．００３〜５０ｍｇ／ｍｌとなるように調製したＰＢＳを用意し、各溶液中に、終濃度が５μｇ／ｍｌとなるように本ペプチド１を添加して試料を調製した。次に、１００μｌの各試料を親水性のポリスチレンプレート（ＡＧＣテクノグラス株式会社製「ＩＷＡＫＩマイクロプレート＃３８６０−０９６」）に加え、室温で１時間インキュベートして、本ペプチド１を固定化させ、０．１％のＴｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ（以下「０．１ＰＢＳＴ」という）で５回洗浄した。さらに、ブロッキング試薬として、２％のＢＳＡを含む０．１ＰＢＳＴを３００μｌ加え、室温で１時間インキュベートして、ポリスチレンプレート表面の未結合部位をブロッキングし、０．１ＰＢＳＴで５回洗浄した。そして、抗体として、０．２％のＢＳＡを含む０．１ＰＢＳＴで４０００倍に希釈された抗ＧＳＴ抗体を１００μｌ加え、室温で１時間インキュベートして、本ペプチド１に含まれるＧＳＴと抗ＧＳＴ抗体とを抗原抗体反応させ、０．１ＰＢＳＴで５回洗浄した。その後、酵素標識された第２の抗体として、０．２％のＢＳＡを含む０．１ＰＢＳＴで１０００倍に希釈されたHRP-conjugated anti-rabbit IgG antibodyを１００μｌ加え、室温で１時間インキュベートして、さらに抗原抗体反応させ、０．１ＰＢＳＴで５回洗浄した。最後に、発色基質として、ＡＢＴＳ（2,2'-azinobis(3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonic acid)）を加え、インキュベートし、マイクロプレートリーダー（ＴＥＣＡＮ製「ＳＵＮＲＩＳＥ Ｒｅｍｏｔｅ」）を用いて、４０５ｎｍにおける吸光度を測定した。本ペプチド２及びＧＳＴについても同様の処理を行い吸光度を測定した。

図１に実施例１０の測定結果を示す。図１中の黒丸（●）は本ペプチド１の結果であり、黒三角は本ペプチド２の結果であり、白丸（○）は原ペプチドであるＧＳＴの結果である。なお、図１において、縦軸は固定化率（％）であり、横軸はＢＳＡ濃度であるが、固定化率は、ＢＳＡを添加しないＰＢＳにおける吸光度（結合した量）を基準（１００％）として、その他の吸光度を規格化したものである。

図１から、原ペプチドであるＧＳＴでは、夾雑物としてＢＳＡが存在すると、急激に固定化率が低下し、結合する量が減少するが、本ペプチド１及び２では、１０ｍｇ／ｍｌという高濃度のＢＳＡが存在していても、固定化率は殆ど変わらず、親水性のポリスチレンプレートに特異的に結合することが確認できる。

［実施例１１］（本ペプチド１の親水性のポリスチレン表面に対する結合性能評価、夾雑物：ＢＳＡ及びＴｗｅｅｎ２０）
実施例１の本ペプチド１の結合性能をより詳細に評価するため、夾雑物としてＴｗｅｅｎ２０が存在する状態で、疎水性のポリスチレン表面及び親水性のポリスチレン表面に対して結合した量（吸光度）を測定した。

まず、Ｔｗｅｅｎ２０を添加しないＰＢＳと、Ｔｗｅｅｎ２０濃度が０．１、１，１０％となるように調製したＰＢＳを用意し、各溶液中に、終濃度が０〜１μｇ／ｍｌとなるように本ペプチド１を添加して試料を調製した。次に、１００μｌの各試料を親水性のポリスチレンプレート（ＡＧＣテクノグラス株式会社製「ＩＷＡＫＩマイクロプレート＃３８６０−０９６」）及び疎水性のポリスチレンプレート（ベクトン・ディッキンソン アンド カンパニー社製「ＢＤ Ｆａｌｃｏｎマイクロプレート＃３５１１７２」）に加え、室温で１時間インキュベートして、本ペプチド１を固定化させ、０．１ＰＢＳＴで５回洗浄した。その後、実施例１０と同じ条件で、ブロッキング試薬、抗体、酵素標識された第２の抗体及び発色基質を添加する処理及び洗浄処理を行い吸光度を測定した。原ペプチドであるＧＳＴについても同様の処理を行い吸光度を測定した。

図２（ａ）〜（ｄ）に実施例１１の親水性のポリスチレンプレートにおける測定結果を示し、図３（ａ）〜（ｄ）に実施例１１の疎水性のポリスチレンプレートにおける測定結果を示す。図２及び図３の（ａ）〜（ｄ）は、それぞれＴｗｅｅｎ２０の添加量が０、０．１、１、１０％の条件の時の測定結果である。図２及び図３中の黒丸（●）は本ペプチド１の結果であり、白丸（○）は原ペプチドであるＧＳＴの結果である。図２及び３において、縦軸は４０５ｎｍにおける吸光度であり、横軸は本ペプチド１及びＧＳＴの濃度である。なお、図２及び３において、ＧＳＴの結果と本ペプチド１の結果が同じだった場合は、ＧＳＴの結果である白丸（○）が本ペプチド１の黒丸（●）と重なっており確認できない。例えば、図３（ｂ）〜（ｄ）ではＧＳＴの白丸（○）の全部が本ペプチド１の黒丸（●）と重なっている。

図２（ａ）〜（ｄ）から、本ペプチド１及びＧＳＴは、いずれも添加濃度を増やすと、親水性のポリスチレンプレートに結合する量が増えることが確認できる。また、本ペプチド１では、夾雑物としてＴｗｅｅｎ２０を添加しても、親水性のポリスチレンプレートに結合する量は減らず、むしろ若干増加している。ＧＳＴでは、夾雑物としてＴｗｅｅｎ２０を添加すると、親水性のポリスチレンプレートに結合する量が少し減少する。

また、図３（ａ）によれば、本ペプチド１及びＧＳＴは、いずれも、夾雑物としてＴｗｅｅｎ２０が存在しない場合には疎水性のポリスチレンプレートに対し結合する。しかし、図３（ｂ）〜（ｄ）に示すとおり、本ペプチド１及びＧＳＴは、いずれも、夾雑物としてＴｗｅｅｎ２０が存在すると、疎水性のポリスチレンプレートには殆ど結合できない。このように、本ペプチドの結合性能は、親水性の樹脂表面を有する固相に特異的なものである。

［実施例１２］（本ペプチド１の親水性のポリスチレン表面に対する結合性能評価、夾雑物：ＢＳＡ及びＴｗｅｅｎ２０）
実施例１の本ペプチド１の結合性能をより詳細に評価するため、夾雑物としてＴｗｅｅｎ２０が存在する状態及びＴｗｅｅｎ２０及びＢＳＡが存在する状態のそれぞれで、本ペプチド１の添加量を変化させて、疎水性のポリスチレン表面及び親水性のポリスチレン表面に対して結合した量（吸光度）を測定した。

まず、ＰＢＳと、０．１ＰＢＳＴと、２０ｍｇ／ｍｌのＢＳＡを含む０．１ＰＢＳＴとを用意し、各溶液中に、終濃度が０〜１０μｇ／ｍｌとなるように本ペプチド１を添加して試料を調製した。次に、１００μｌの各試料を親水性のポリスチレンプレート（ＡＧＣテクノグラス株式会社製「ＩＷＡＫＩマイクロプレート＃３８６０−０９６」）及び疎水性のポリスチレンプレート（ベクトン・ディッキンソン アンド カンパニー社製「ＢＤ Ｆａｌｃｏｎマイクロプレート＃３５１１７２」）に加え、室温で２時間インキュベートして、本ペプチド１を固定化させ、０．１ＰＢＳＴで５回洗浄した。その後、実施例１０と同じ条件で、ブロッキング試薬、抗体、酵素標識された第２の抗体及び発色基質を添加する処理及び洗浄処理を行い吸光度を測定した。原ペプチドであるＧＳＴについても同様の処理を行い吸光度を測定した。

図４に実施例１２の測定結果を示す。図４の（ａ）〜（ｃ）は、それぞれＰＢＳ、０．１ＰＢＳＴ及びＢＳＡを含む０．１ＰＢＳＴにおける親水性のポリスチレンプレートについての測定結果であり、図４の（ｄ）〜（ｆ）は、それぞれＰＢＳ、０．１ＰＢＳＴ及びＢＳＡを含む０．１ＰＢＳＴにおける疎水性のポリスチレンプレートについての測定結果である。また、図４中の黒丸（●）は本ペプチド１の結果であり、白丸（○）は原ペプチドであるＧＳＴの結果である。図４において、縦軸は４０５ｎｍにおける吸光度であり、横軸は本ペプチド１及びＧＳＴの濃度である。なお、図４において、ＧＳＴの結果と本ペプチド１の結果が同じだった場合は、ＧＳＴの結果である白丸（○）が本ペプチド１の黒丸（●）と重なっており確認できない。例えば、図４（ｅ）及び（ｆ）ではＧＳＴの白丸（○）の全部が本ペプチド１の黒丸（●）と重なっている。

図４（ａ）〜（ｃ）から、本ペプチド１では、夾雑物としてＴｗｅｅｎ２０を添加した場合（図４（ｂ））でも、夾雑物としてＴｗｅｅｎ２０及びＢＳＡを添加した場合（図４（ｃ））でも、親水性のポリスチレンプレートに結合する量はほとんど変わらないことが確認できる（図４（ｂ）及び（ｃ）の黒丸）。これに対し、ＧＳＴでは、夾雑物としてＴｗｅｅｎ２０を添加すると、親水性のポリスチレンプレートに結合する量が少し減少し（図４（ｂ）の白丸）、さらにＢＳＡを添加した場合には殆ど結合できない（図４（ｃ）の白丸）。このように、本アミノ酸配列２を導入することにより、親水性のポリスチレンプレートに対する結合性能が向上する。

また、図４（ｄ）〜（ｆ）によれば、本ペプチド１及びＧＳＴは、いずれも、夾雑物としてＴｗｅｅｎ２０が存在しない場合には疎水性のポリスチレンプレートに対し結合するが、夾雑物としてＴｗｅｅｎ２０やＢＳＡが存在すると、疎水性のポリスチレンプレートには殆ど結合できない。

［実施例１３］（本ペプチド１の活性値評価）
実施例１の本ペプチド１の固定化された状態における活性値を評価するため、夾雑物としてＴｗｅｅｎ２０が存在する状態及びＴｗｅｅｎ２０及びＢＳＡが存在する状態のそれぞれで、疎水性のポリスチレン表面及び親水性のポリスチレン表面に対して結合させ、固定化されたＧＳＴの酵素としての活性値を測定した。

まず、ＰＢＳと、０．１ＰＢＳＴと、２０ｍｇ／ｍｌのＢＳＡを含む０．１ＰＢＳＴとを用意し、各溶液中に、終濃度が１０、２０、４０μｇ／ｍｌとなるように本ペプチド１を添加して試料を調製した。次に、１００μｌの各試料を親水性のポリスチレンプレート（ＡＧＣテクノグラス株式会社製「ＩＷＡＫＩマイクロプレート＃３８６０−０９６」）及び疎水性のポリスチレンプレート（ベクトン・ディッキンソンアンド カンパニー社製「ＢＤ Ｆａｌｃｏｎマイクロプレート＃３５１１７２」）に加え、室温で２時間インキュベートして、本ペプチド１を固定化させ、０．１ＰＢＳＴで５回洗浄した。その後、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０、１ｍＭの還元型グルタチオン及びＧＳＴの基質として１ｍＭのＣＤＮＢ（1-chloro-2,4-dinitrobenzene）を含む０．１Ｍリン酸カリウムバッファー（ｐＨ６．５）を２００μｌ加え、室温で３０分間撹拌しつつ、３０秒毎に３４０ｎｍにおける吸光度を測定した。原ペプチドであるＧＳＴについても同様の処理を行い吸光度を測定した。

図５に実施例１３の測定結果を示す。図５の（ａ）〜（ｃ）は、それぞれＰＢＳ、０．１ＰＢＳＴ及びＢＳＡを含む０．１ＰＢＳＴにおける親水性のポリスチレンプレートについての測定結果であり、図５の（ｄ）〜（ｆ）は、それぞれＰＢＳ、０．１ＰＢＳＴ及びＢＳＡを含む０．１ＰＢＳＴにおける疎水性のポリスチレンプレートについての測定結果である。また、図５中の黒丸（●）は本ペプチド１の結果であり、白丸（○）は原ペプチドであるＧＳＴの結果である。図５において、縦軸は活性値（吸光度の変化率）であり、横軸は本ペプチド１及びＧＳＴの濃度である。なお、図５において、ＧＳＴの結果と本ペプチド１の結果が同じだった場合は、ＧＳＴの結果である白丸（○）が本ペプチド１の黒丸（●）と重なっており確認できない。例えば、図５（ｅ）及び（ｆ）ではＧＳＴの白丸（○）の全部が本ペプチド１の黒丸（●）と重なっている。

図５（ａ）〜（ｃ）から、親水性のポリスチレンプレートに固定化された本ペプチド１のＧＳＴは、夾雑物としてＴｗｅｅｎ２０を添加した場合（図５（ｂ））でも、夾雑物としてＴｗｅｅｎ２０及びＢＳＡを添加した場合（図５（ｃ））でも、酵素として非常に活性であることが確認できる。これに対し、ＧＳＴは、実施例１２における図４（ａ）及び（ｂ）の白丸で示されるように、夾雑物が添加されていない場合及び夾雑物としてＴｗｅｅｎ２０が添加されている場合では親水性のポリスチレンプレートに結合しているが、図５（ａ）及び（ｂ）に示すとおり、全く酵素の活性を示していない。これは、原ペプチドであるＧＳＴは、親水性のポリスチレンプレートに対し固定化されるが、構造変化や不活性化していることを意味している。なお、ＧＳＴは、図５（ｃ）においても全く酵素の活性を示していないが、これは、図４（ｃ）に示すように、そもそもＴｗｅｅｎ２０及びＢＳＡの存在下では、親水性のポリスチレンプレートに殆どＧＳＴが結合できないためである。

また、図５（ｄ）から、疎水性のポリスチレンプレートに固定化された本ペプチド１のＧＳＴは、殆ど酵素の活性を示していない。実施例１２における図４（ｄ）から明らかなように、夾雑物が存在しない状態であれば、本ペプチド１は、疎水性のポリスチレンプレートに対して結合できるが、構造変化や不活性化によって活性が失われることが確認できる。つまり、本アミノ酸配列２の結合性能は、親水性のポリスチレンプレートに対して特異的なものであることが確認され、従来の疎水性のポリスチレンプレートを利用した固定化に比べて、本ペプチド１を親水性のポリスチレンプレートに固定化した方が、活性を維持できることが確認できる。なお、図５（ｅ）及び（ｆ）において、本ペプチド１及びＧＳＴは、いずれも、全く酵素の活性を示していないが、これは、夾雑物としてＴｗｅｅｎ２０やＢＳＡが存在すると、疎水性のポリスチレンプレートには殆ど結合できないからである。

［実施例１４］（本ペプチド３乃至６の親水性のポリスチレン表面に対する結合性能評価、夾雑物：ＢＳＡ及びＴｗｅｅｎ２０）
本ペプチド３乃至６の親水性のポリスチレン表面に対する結合性能を評価するため、夾雑物としてＢＳＡ及びＴｗｅｅｎ２０が存在する状態における実施例３乃至６の本ペプチド３乃至６並びに評価のために本ペプチド１及び原ペプチドであるＧＳＴの親水性のポリスチレン表面に対する固定化率を測定した。

まず、ＢＳＡを添加しない０．１ＰＢＳＴと、ＢＳＡ濃度が０．００３〜５０ｍｇ／ｍｌとなるように調製した０．１ＰＢＳＴを用意し、各溶液中に、終濃度が５μｇ／ｍｌとなるように本ペプチド３を添加して試料を調製した。次に、１００μｌの各試料を親水性のポリスチレンプレート（ＡＧＣテクノグラス株式会社製「ＩＷＡＫＩマイクロプレート＃３８６０−０９６」）に加え、２５℃で３時間インキュベートして、本ペプチド３を固定化させ、０．１％ＰＢＳで６回洗浄した。さらに、ブロッキング試薬として、２％のＢＳＡを含む０．１ＰＢＳＴを３００μｌ加え、２５℃で１時間インキュベートして、ポリスチレンプレート表面の未結合部位をブロッキングし、０．１ＰＢＳＴで６回洗浄した。そして、抗体として、０．２％のＢＳＡを含む０．１ＰＢＳＴで５０００倍に希釈された抗ＧＳＴ抗体を１００μｌ加え、２５℃で１時間インキュベートして、本ペプチド３に含まれるＧＳＴと抗ＧＳＴ抗体とを抗原抗体反応させ、０．１ＰＢＳＴで６回洗浄した。その後、酵素標識された第２の抗体として、０．２％のＢＳＡを含む０．１ＰＢＳＴで５０００倍に希釈されたHRP-conjugated anti-rabbit IgG antibodyを１００μｌ加え、２５℃で１時間インキュベートして、抗原抗体反応させ、さらに０．１ＰＢＳＴで６回洗浄した。最後に、発色基質として、ＡＢＴＳ（2,2'-azinobis(3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonic acid)）を加え、インキュベートし、マイクロプレートリーダー（ＴＥＣＡＮ製「ＳＵＮＲＩＳＥ Ｒｅｍｏｔｅ」）を用いて、４０５ｎｍにおける吸光度を測定した。本ペプチド４乃至６、本ペプチド１及びＧＳＴについても同様の処理を行い吸光度を測定した。

図７に実施例１４の測定結果を示す。図７中の黒塗りの三角は本ペプチド３の結果であり、白抜き三角（△）は本ペプチド４の結果であり、黒塗りの四角は本ペプチド５の結果であり、白抜き四角（□）は本ペプチド６の結果であり、黒丸（●）は本ペプチド１の結果であり、白丸（○）は原ペプチドであるＧＳＴの結果である。図７において、縦軸は固定化率（％）であり、横軸はＢＳＡ濃度であるが、固定化率は、ＢＳＡを添加しないＰＢＳＴにおける吸光度（結合した量）を基準（１００％）として、その他の吸光度を規格化したものである。なお、図７において、本ペプチド１、３乃至６の結果は、類似しており、重畳している部分がある。

図７から、原ペプチドであるＧＳＴでは、夾雑物としてＢＳＡ及びＴｗｅｅｎ２０が存在すると、急激に固定化率が低下し、結合する量が減少するが、本ペプチド３乃至６では、１０ｍｇ／ｍｌという高濃度のＢＳＡが存在していても、固定化率は殆ど変わらず、本ペプチド１と同じレベルで、親水性のポリスチレンプレートに特異的に結合することが確認できる。

［実施例１５］（本ペプチド３乃至６のポリスチレン表面における活性値評価、夾雑物：ＢＳＡ及びＴｗｅｅｎ２０）
親水性のポリスチレン表面に固定化された状態における本ペプチド３乃至６の活性値を評価するため、夾雑物としてＴｗｅｅｎ２０が存在する状態及びＴｗｅｅｎ２０及びＢＳＡが存在する状態のそれぞれで、固定化されたＧＳＴの酵素としての活性値を測定した。

まず、ＰＢＳと、０．１ＰＢＳＴとを用意し、各溶液中に、終濃度が０．５、１０、２０、４０μｇ／ｍｌとなるように本ペプチド１、３乃至６をそれぞれ添加して試料を調製した。次に、１００μｌの各試料を親水性のポリスチレンプレート（ＡＧＣテクノグラス株式会社製「ＩＷＡＫＩマイクロプレート＃３８６０−０９６」）に加え、２５℃で２時間インキュベートして、本ペプチドを固定化させ、０．１ＰＢＳＴで６回洗浄し、さらに０．１％Ｔｗｅｅｎ２０を含む０．１Ｍリン酸カリウム溶液（ｐＨ６．５）で１回洗浄した。その後、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０、１ｍＭの還元型グルタチオン及びＧＳＴの基質として１ｍＭのＣＤＮＢ（1-chloro-2,4-dinitrobenzene）を含む０．１Ｍリン酸カリウムバッファー（ｐＨ６．５）を２００μｌ加え、室温で３０分間撹拌しつつ、３０秒毎に３４０ｎｍにおける吸光度を測定した。原ペプチドであるＧＳＴについても同様の処理を行い吸光度を測定した。

図８に実施例１５の測定結果を示す。図８の（ａ）は、ＰＢＳにおける測定結果であり、（ｂ）は０．１ＰＢＳＴにおける測定結果である。また、図８中の黒塗りの三角は本ペプチド３の結果であり、白抜き三角（△）は本ペプチド４の結果であり、黒塗りの四角は本ペプチド５の結果であり、白抜き四角（□）は本ペプチド６の結果であり、黒丸（●）は本ペプチド１の結果であり、白丸（○）は原ペプチドであるＧＳＴの結果である。図８において、縦軸は活性値（吸光度の変化率）であり、横軸は本ペプチド及びＧＳＴの濃度である。なお、図８において、本ペプチド１、３乃至６の結果は、類似しており、重畳している部分がある。

図８（ａ）及び（ｂ）から、親水性のポリスチレンプレートに固定化された本ペプチド１、３乃至６のＧＳＴは、そのままでも（図８（ａ））、夾雑物としてＴｗｅｅｎ２０を添加した場合（図８（ｂ））でも、酵素として非常に活性であることが確認できた。

［実施例１６］（本ペプチド７乃至９の親水性のポリスチレン表面に対する結合性能評価、夾雑物：ＢＳＡ及びＴｗｅｅｎ２０）
実施例７乃至９で生合成した本ペプチド７乃至９の親水性のポリスチレン表面に対する結合性能を評価するため、本ペプチド７乃至９並びに原ペプチドであるＧＳＴについて、実施例１４と同様の処理を行い吸光度を測定し、親水性のポリスチレン表面に対する固定化率を評価した。

図９に実施例１６の測定結果を示す。図９中の黒塗りの丸は本ペプチド７の結果であり、黒塗りの菱形は本ペプチド８の結果であり、白抜き三角（△）は本ペプチド９の結果であり、白丸（○）は原ペプチドであるＧＳＴの結果である。図９において、縦軸は固定化率（％）であり、横軸はＢＳＡ濃度であるが、固定化率は、ＢＳＡを添加しないＰＢＳＴにおける吸光度（結合した量）を基準（１００％）として、その他の吸光度を規格化したものである。

図９から、原ペプチドであるＧＳＴでは、夾雑物としてＢＳＡ及びＴｗｅｅｎ２０が存在すると、急激に固定化率が低下し、結合する量が減少するが、本ペプチド７乃至９では、１０ｍｇ／ｍｌという高濃度のＢＳＡが存在していても、固定化率は殆ど変わらず、親水性のポリスチレンプレートに特異的に結合することが確認できた。

［実施例１７］（本ペプチド７乃至９のポリスチレン表面における活性値評価、夾雑物：ＢＳＡ及びＴｗｅｅｎ２０）
親水性のポリスチレン表面に固定化された状態における本ペプチド７乃至９の活性値を評価するため、本ペプチド７乃至９並びに原ペプチドであるＧＳＴについて、実施例１５と同様の処理を行い活性値を測定した。

図１０に実施例１７の測定結果を示す。図１０の（ａ）は、ＰＢＳにおける測定結果であり、（ｂ）は０．１ＰＢＳＴにおける測定結果である。また、図１０中の黒塗りの丸は本ペプチド７の結果であり、黒塗りの菱形は本ペプチド８の結果であり、白抜き三角（△）は本ペプチド９の結果であり、白丸（○）は原ペプチドであるＧＳＴの結果である。図１０において、縦軸は活性値（吸光度の変化率）であり、横軸は本ペプチド及びＧＳＴの濃度である。

図１０（ａ）及び（ｂ）から、親水性のポリスチレンプレートに固定化された本ペプチド７乃至９のＧＳＴは、そのままでも（図１０（ａ））、夾雑物としてＴｗｅｅｎ２０を添加した場合（図１０（ｂ））でも、酵素として非常に活性であることが確認できた。

［実施例１８］（本ペプチド１の生産時における分離精製工程への適用例、夾雑物：菌体破砕液）
本実施例においては、本ペプチドの特異的な吸着機能を生産時における分離精製工程への適用可能性を評価するため、大腸菌を使用して発現させた本アミノ酸配列２を含むＧＳＴを、特別な精製工程を行うことなく、菌体破砕液をそのまま親水性のポリスチレン表面に固定化させた時の結合した量（吸光度）を測定した。比較用として、原ペプチドであるＧＳＴについても同様に結合した量（吸光度）を測定した。

まず、１列につき８個の培養容器（ウェル）が設けられたウェルプレートを５列用いて、３９個の培養容器（ウェル）内に２００μｌの２ｘＹＴ培地を添加し、各ウェルに、実施例１と同様の本アミノ酸配列２をコードする遺伝子を導入したベクターを導入して形質転換した大腸菌（ＢＬ２１）を植菌してコロニーを形成し、３７℃、２００ｒｐｍで一晩培養した。原ペプチドであるＧＳＴについても同様に４０コロニーを作成し培養した。各コロニーの培養の程度を確認するため、各培養液を１００μｌ回収し、菌体濃度を測定した。図１１（ａ）は本ペプチドを培養した３９コロニーにおける菌体濃度（６３０ｎｍにおける吸光度）であり、図１１（ｂ）は原ペプチドを培養した４０コロニーにおける菌体濃度である。図１１において、横軸はウェルプレートの列番号であり、各列毎に８個のウェルの結果が示されている。図１１（ａ）及び（ｂ）から、全てのコロニーで同程度に培養されていることが確認された。

次に、菌体破砕後、菌体破砕液を１０μｌ回収し、１０ｍｇ／ｍｌのＢＳＡを１％含むＰＢＳを９０ｍｌと混合して、親水性のポリスチレンプレート（ＡＧＣテクノグラス株式会社製「ＩＷＡＫＩマイクロプレート＃３８６０−０９６」）に加え、室温で１時間インキュベートして、固相上にペプチドを固定化させた。その後、実施例７と同じ条件で、ブロッキング試薬、抗体、酵素標識された第２の抗体及び発色基質を添加する処理及び洗浄処理を行い吸光度を測定した。原ペプチドであるＧＳＴについても同様の処理を行い吸光度を測定した。

図１１（ｃ）及び（ｄ）に実施例１８の測定結果を示す。図１１（ｃ）は本ペプチドを培養した３９コロニーにおける吸光度（４０５ｎｍ）であり、図１１（ｄ）は原ペプチドを培養した４０コロニーにおける吸光度（４０５ｎｍ）である。図１１（ｄ）に示すように、原ペプチドであるＧＳＴは、吸光度がバックグラウンド程度であり、ほとんど固相表面に固定化されていない。これに対し、図１１（ｃ）から、本ペプチドでは、大腸菌の菌体破砕液に含まれた状態のままであっても、固相表面に接触させることで、固相表面に特異的に固定化されることが確認できた。大腸菌の菌体破砕液の中には、夾雑物として、特定されていない大小様々なタンパク質に加えて、タンパク質以外の低分子化合物や脂質なども存在する。これらの夾雑物が存在しても、本ペプチドは親水性のポリスチレンプレートに対し特異的に結合するので、生産時における分離精製工程として利用可能であることが確認できた。

［実施例１９］（本ペプチド１の生産時における分離精製工程への適用例、夾雑物：培地）
本実施例においては、本ペプチドの特異的な吸着機能を生産時における分離精製工程への適用可能性を評価するため、本ペプチド１に夾雑物として各種の培地（ＹＰＤ、ＢＭＭＹ、２ｘＴＹ、ＬＢ）を加えた状態における親水性のポリスチレン表面に対する結合した量（吸光度）を測定した。比較用として、原ペプチドであるＧＳＴについても同様に結合した量（吸光度）を測定した。ＹＰＤは一般的な酵母の培養培地であり、ＢＭＭＹはP. pastoris専用培地であり、２ｘＴＹ及びＬＢは大腸菌専用培地である。

まず、ＹＰＤ、ＢＭＭＹ、２ｘＴＹ及びＬＢの４種類の培地を用意し、それぞれ原液〜１００００倍に希釈した溶液に対し、５μｇ／ｍｌとなるように本ペプチド１を添加して試料を調製した。各試料を、親水性のポリスチレンプレート（ＡＧＣテクノグラス株式会社製「ＩＷＡＫＩマイクロプレート＃３８６０−０９６」）に加え、室温で１時間インキュベートして、固相上にペプチドを固定化させた。その後、実施例７と同じ条件で、ブロッキング試薬、抗体、酵素標識された第２の抗体及び発色基質を添加する処理及び洗浄処理を行い吸光度を測定した。原ペプチドであるＧＳＴについても同様の処理を行い吸光度を測定した。原ペプチドであるＧＳＴについても同様に吸光度を測定した。

図１２に実施例１９の測定結果を示す。図１２中の黒丸（●）は本ペプチド１と培地ＹＰＤの混合試料の結果であり、白丸（○）は原ペプチドであるＧＳＴと培地ＹＰＤの混合試料の結果であり、黒塗りの三角は本ペプチド１と培地ＢＭＭＹの混合試料の結果であり、白抜き三角（△）は原ペプチドであるＧＳＴと培地ＢＭＭＹの混合試料の結果であり、黒塗りの四角は本ペプチド１と培地２ｘＹＴの混合試料の結果であり、白抜き四角（□）は原ペプチドであるＧＳＴと培地２ｘＹＴの混合試料の結果であり、菱形（◆）は本ペプチド１と培地ＬＢの混合試料の結果であり、白抜き菱形（◇）は原ペプチドであるＧＳＴと培地ＬＢの混合試料の結果でありである。図１２において、縦軸は吸光度（４０５ｎｍ）であり、横軸は培地の相対濃度（希釈率）（右端の１が原液）である。図１２に示すように、原ペプチドであるＧＳＴ（白丸、白抜き三角、白抜き四角、白抜き菱形）は、何れも培地が濃くなるにつれて固相表面に結合される量が減っている。これに対し、本ペプチド１（黒丸、黒塗り三角、黒塗り四角、黒塗り菱形）では、培地が濃くなってもかなりの量が固定化されて固相表面に結合されており、培地の濃度にあまり影響されず、固相表面に特異的に固定化されることが確認できた。

特に、酵母で使用される培地であるＹＰＤ及びＢＭＭＹにおいても特異的な吸着性能を発現するので、酵母からの分泌生産に利用可能である。つまり、酵母からの分泌液を直接固相表面に接触させることで、分泌液中の本ペプチドを固定化して分離精製することが可能である。

さらに、一本鎖抗体（scFv）の生産に有効な培地であるＢＭＭＹ及び２ｘＹＴでも特異的な吸着性能を発現するので、本ペプチドとして一本鎖抗体（scFv）を生産した場合でも、酵母の分泌液や大腸菌の破砕液から直接一本鎖抗体（scFv）を分離精製することが可能である。

［実施例２０］（本アミノ酸配列２からなる本ペプチドを標識した抗体の生産）
まず、固相法によって、本アミノ酸配列２からなる本ペプチドのＮ末端側にリジン（Ｋ）を有するペプチド（ＫＲＩＩＩＲＲＩＲＲ）を合成した。次に、０．５ｍｇの本アミノ酸配列２からなる本ペプチドを１００μｌの２５％グルタルアルデヒド溶液で溶解し、室温で１０分間インキュベートした。そして、９ｍｌのジエチルエーテル及び１ｍｌのエタノールを加えてグルタルアルデヒドで標識された本ペプチドを析出させ、遠心分離により回収した。

さらに、０．５ｍｇのマウスモノクローナル抗ヒトＣＲＰ抗体（オリエンタル酵母社製、＃４７１５５００）を溶解した０．５ｍｌのＰＢＳに、グルタルアルデヒドで標識された本ペプチドを溶解し、２５℃で１時間インキュベートした。その後、１００μｌの２Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）を加え、反応を停止して、限外ろ過法によって、本ペプチドとして、本アミノ酸配列２を含む抗ＣＲＰ抗体を精製した。以下、実施例２０で生成した本アミノ酸配列２を含む抗ＣＲＰ体を「本ペプチド２０」といい、その原ペプチドを「原ペプチド２０」という。

［実施例２１］（本アミノ酸配列２をＣ末端側に有する一本鎖抗体の生成）
本実施例では、配列表の配列番号２３、２４、２５に示す３種類の一本鎖抗体（scFv）のＣ末端側に本アミノ酸配列２を導入して３種類の一本鎖抗体を生成した。なお、以下、配列表の配列番号２３、２４及び２５に示す３種類の一本鎖抗体（原ペプチド）を、それぞれ「原ペプチド２１−１」、「原ペプチド２１−２」及び「原ペプチド２１−３」といい、本実施例で生成される原ペプチド２１−１、原ペプチド２１−２及び原ペプチド２１−３に本アミノ酸配列２を導入した３種類の一本鎖抗体（本ペプチド）を、それぞれ「本ペプチド２１−１」、「本ペプチド２１−２」及び「本ペプチド２１−３」という。これらの一本鎖抗体は、いずれもＣ反応性蛋白（C-Reactive Protein：ＣＲＰ）に対して特異的な抗原抗体反応を示す抗原結合部位を有する。原ペプチド２１−１ないし２１−３は、重鎖の可変部（Ｖ_H）のＣ末端と軽鎖の可変部（Ｖ_L）のＮ末端とが４つのグリシン（Ｇ）とセリン（Ｓ）の組合わせを３組連結した構造 (G₄S)₃の鎖状のリンカーペプチドで連結した構造である。さらに原ペプチド２１−１ないし２１−３には軽鎖の可変部（Ｖ_L）のＣ末端にヒスタジンタグが導入されている。なお、実施例２２及び２３の原ペプチドは、配列番号２３の一本鎖抗体（原ペプチド２１−１）である。

まず、5’末端側がリン酸化された本アミノ酸配列２をコードする遺伝子を含むセンス鎖（PStag-sense）及びアンチセンス鎖（PStag-antisense）のオリゴＤＮＡを合成し、アニール後、制限酵素NotI及びXhoIで消化したpET22b(+)ベクター（Novagen製）に導入し、本アミノ酸配列２をコードする遺伝子を含むpET-PStagベクター（pET22b(+)にPStagが導入されたベクター）を調製した。なお、「PStag」とは本アミノ酸配列２を発現させる遺伝子を意味する。以下同じ。

次に、重鎖の可変部（Ｖ_H）をコードする遺伝子を含むセンス鎖（V_H-sense）のオリゴＤＮＡ及び軽鎖の可変部（Ｖ_L）をコードする遺伝子を含むアンチセンス鎖（V_L-antisense）のオリゴＤＮＡを合成した。これらの合成オリゴＤＮＡをプライマーとし、それぞれ配列番号２３，２４，２５に示す３種類の一本鎖抗体発現ベクターpET-scFv（pET22b(+)にscFvの遺伝子が導入されたベクター）を鋳型としてPCR法によって３種類の一本鎖抗体（scFv）の遺伝子を増幅した。増幅したscFv遺伝子を制限酵素NdeI及びNotIで消化し、同酵素で消化した本アミノ酸配列２をコードする遺伝子を含むpET-PStagベクターに導入し、Ｃ末端側に本アミノ酸配列２をコードする遺伝子を含む３種類の一本鎖抗体の発現ベクター（pET-scFv-PStagベクター）を調製した。

宿主として大腸菌（ＢＬ２１（ＤＥ３）Ｒｏｓｅｔｔａ（Ｎｏｖａｇｅｎ））を使用し、上記pET-scFv-PStagベクターを宿主に導入して宿主を形質転換し、アンピシリンを含む寒天培地上で選別した。その後、２ｘＹＴ培地５０ｍｌ中で大腸菌を培養し、終濃度が１ｍＭになるように、発現誘導物質としてイソプロピル１−チオ−ガラクトシド（ＩＰＴＧ：Isopropyl-1-thio-β-D(-)-galactoside）を加えて、本アミノ酸配列２をＣ末端に含む一本鎖抗体（scFv-PStag）を発現させた。

そして、菌体破砕後、菌体内不溶性画分を６Ｍ塩酸グアニジン（変性剤）及び１０ｍＭメルカプトエタノール（還元剤）を含む可溶化液で溶解した。こうして、未精製の変性された本アミノ酸配列２をＣ末端に含む一本鎖抗体を得ることができた。以下、この状態の実施例２１の一本鎖抗体を「未精製の変性本ペプチド２１−１」ないし「未精製の変性本ペプチド２１−３」という。

さらに、未精製の変性本ペプチド２１−１ないし２１−３を変性状態のままHisTrap HP (GE HealthCare)を用いたNiキレートアフィニティクロマトグラフィ（IMAC）によって精製し、本アミノ酸配列２をＣ末端側に含む変性した一本鎖抗体を生産した。以下、この状態の実施例２１の一本鎖抗体を「精製後の変性本ペプチド２１−１」ないし「精製後の変性本ペプチド２１−３」という。本ペプチド２１−１のアミノ酸配列を配列表の配列番号２６に示し、本ペプチド２１−２のアミノ酸配列を配列表の配列番号２７に示し、本ペプチド２１−３のアミノ酸配列を配列表の配列番号２８に示す。本ペプチド２１−１ないし２１−３は、軽鎖の可変部（Ｖ_L）のＣ末端側に本アミノ酸配列２を有しており、本アミノ酸配列２のさらにＣ末端側にヒスタジンタグが連結されている。なお、アミノ酸配列それ自体は、精製の前後でも、変性の前後でも変わらず、配列番号２６、２７、２８に示すとおりである。

［実施例２２］（本アミノ酸配列２を重鎖可変部（Ｖ_H）とリンカーペプチドの間に有する一本鎖抗体の生成）
本実施例では、本アミノ酸配列２を原ペプチド２１−１（配列番号２３）及び原ペプチド２１−２（配列番号２４）の重鎖の可変部（Ｖ_H）と軽鎖の可変部（Ｖ_L）を連結するリンカーペプチドに導入した一本鎖抗体（以下で生成されるペプチドを、それぞれ「本ペプチド２２−１」及び「本ペプチド２２−２」という）を生成する。まず、重鎖の可変部（Ｖ_H）をコードする遺伝子を含むセンス鎖（V_H-sense）のオリゴＤＮＡ及びアンチセンス鎖（V_H-antisense）のオリゴＤＮＡを合成し、これらの合成オリゴＤＮＡをプライマーとし、配列番号２３の一本鎖抗体を発現するpET-scFvベクターを鋳型としてPCR法によって重鎖の可変部（Ｖ_H）の遺伝子を増幅した。

次に、軽鎖の可変部（Ｖ_L）をコードする遺伝子を含むセンス鎖（V_L-sense）のオリゴＤＮＡ及びアンチセンス鎖（V_L-antisense）のオリゴＤＮＡを合成し、同様に軽鎖の可変部（Ｖ_L）の遺伝子を増幅した。

さらに、重鎖の可変部（Ｖ_H）のＣ末端部、本アミノ酸配列２及びリンカーペプチドの順にこれらをコードする遺伝子を持つセンス鎖（V_H-Pstag-(G₄S)₃-sense）のオリゴＤＮＡと本アミノ酸配列２、リンカーペプチド及び軽鎖の可変部（Ｖ_L）のＮ末端部分の順にこれらをコードする遺伝子を含むアンチセンス鎖（PStag-(G₄S)₃-V_L-antisense）のオリゴＤＮＡを合成した。

重鎖の可変部（Ｖ_H）の遺伝子、軽鎖の可変部（Ｖ_L）の遺伝子、センス鎖（V_H-PStag-(G₄S)₃-sense）のオリゴＤＮＡ、アンチセンス鎖（PStag-(G₄S)₃-V_L-antisense）のオリゴＤＮＡ、センス鎖（V_H-sense）のオリゴＤＮＡ及びアンチセンス鎖（V_L-antisense）のオリゴＤＮＡを用いて、Overlapping PCR法により本アミノ酸配列２を重鎖可変部（Ｖ_H）とリンカーペプチド(G₄S)₃との間に有する一本鎖抗体の遺伝子（scFv-(PStag)）を調製した。当該遺伝子を制限酵素NdeI及びNotIで消化し、同酵素で消化したpET22b(+)に導入し、リンカーペプチド(G₄S)₃に本アミノ酸配列２をコードする遺伝子を含む一本鎖抗体の発現ベクター（pET-scFv-(PStag) ベクター）を作製した。なお、「(PStag)」とは一本鎖抗体の途中である重鎖可変部（Ｖ_H）とリンカーペプチド(G₄S)₃との間にPStagが導入されることを意味する。以下同じ。

後は、実施例２１と同様に、当該pET-scFv-(PStag)ベクターを宿主に導入して培養し、菌体破砕後、菌体内不溶性画分を６Ｍ塩酸グアニジン（変性剤）及び１０ｍＭメルカプトエタノール（還元剤）を含む可溶化液で溶解して、未精製の変性されたリンカーペプチド(G₄S)₃に本アミノ酸配列２を有する一本鎖抗体を得ることができた。さらに、実施例２１と同様の方法で精製し、精製された変性した状態の本ペプチド２２−１（以下「精製後の変性本ペプチド２２−１」という）を生産した。本ペプチド２２−１のアミノ酸配列を配列表の配列番号２９に示す。本ペプチド２２−１は、重鎖の可変部（Ｖ_H）のドメインとリンカーペプチド(G₄S)₃の間に本アミノ酸配列２が配置されている。

また、同様の手法によって、原ペプチド２１−２（配列番号２４）の重鎖の可変部（Ｖ_H）のドメインとリンカーペプチド(G₄S)₃の間に本アミノ酸配列２が配置されている精製後の変性本ペプチド２２−２を生産した。本ペプチド２２−２のアミノ酸配列を配列表の配列番号３０に示す。

［実施例２３］（本アミノ酸配列２をＣ末端及び重鎖可変部（Ｖ_H）とリンカーペプチドとの間の両方に有する一本鎖抗体の生成）
本実施例では、本アミノ酸配列２を原ペプチド２１−１及び原ペプチド２１−２の一本鎖抗体のＣ末端側（すなわち軽鎖の可変部（Ｖ_L）のＣ末端側）及び重鎖可変部（Ｖ_H）とリンカーペプチドの間（すなわち重鎖の可変部（Ｖ_H）のＣ末端側）の両方に導入した一本鎖抗体（以下で生成されるペプチドを、それぞれ「本ペプチド２３−１」及び「本ペプチド２３−２」という）を生成する。まず、実施例２２と同様に、本アミノ酸配列２を重鎖可変部（Ｖ_H）とリンカーペプチド(G₄S)₃の間に有する一本鎖抗体の遺伝子（scFv-(PStag)）を調製した。当該遺伝子を実施例２２ではpET22b(+)に導入したが、本実施例では、実施例２１で使用した本アミノ酸配列２をコードする遺伝子を含むpET-PStagベクターに導入し、Ｃ末端側及び重鎖可変部（Ｖ_H）とリンカーペプチド(G₄S)₃との間の両方に本アミノ酸配列２をコードする遺伝子を含む一本鎖抗体の発現ベクター（pET-scFv-(PStag)-PStagベクター）を作製した。

後は、実施例２１と同様に、当該pET-scFv-(PStag)-PStagベクターを宿主に導入して培養し、菌体破砕後、菌体内不溶性画分を６Ｍ塩酸グアニジン（変性剤）及び１０ｍＭメルカプトエタノール（還元剤）を含む可溶化液で溶解して、未精製の変性されたＣ末端側及びリンカーペプチドの両方に本アミノ酸配列２を有する一本鎖抗体（scFv）を得ることができた。さらに、実施例２１と同様に精製し、精製された変性した状態の本ペプチド２３−１（以下「精製後の変性本ペプチド２３−１」という）を生産した。本ペプチド２３−１のアミノ酸配列を配列表の配列番号３１に示す。本ペプチド２３−１は、本ペプチド２１−１と同様に軽鎖の可変部（Ｖ_L）のＣ末端側に本アミノ酸配列２を有しており、さらに本アミノ酸配列２のＣ末端側にヒスタジンタグが連結されている。さらに本ペプチド２２−１と同様に重鎖の可変部（Ｖ_H）のドメインとリンカーペプチド(G₄S)₃との間に本アミノ酸配列２を有している。

また、同様の手法によって、原ペプチド２１−２（配列番号２４）の軽鎖の可変部（Ｖ_L）のＣ末端側及び重鎖の可変部（Ｖ_H）のドメインとリンカーペプチド(G₄S)₃の間に本アミノ酸配列２が配置されている精製後の変性本ペプチド２３−２を生産した。本ペプチド２３−２のアミノ酸配列を配列表の配列番号３２に示す。

［実施例２４］（本ペプチド２１−１ないし２１−３の固定化後の活性値評価）
本実施例では、本ペプチド２１−１ないし２１−３（配列番号２６〜２８）の固定化された状態における活性値を評価するため、精製後の変性本ペプチド２１−１ないし２１−３を液相でリフォールディングした後、これらのペプチドを親水性のポリスチレン表面に対して結合させ、抗原抗体反応の活性値を測定した。比較用として、原ペプチド２１−１ないし２１−３（配列番号２３〜２５）と、一本鎖抗体ではなく抗体分子である本ペプチド２０及び原ペプチド２０についても親水性のポリスチレン表面に対して結合させ、活性値を測定した。さらに、従来との比較用として、原ペプチド２０（抗体分子）を疎水性のポリスチレン表面に対して結合させ、活性値を測定した。

まず、変性剤である尿素が８０ｍＭとなるように精製後の変性本ペプチド２１−１ないし２１−３（配列番号２６〜２８）を３７５μＭ 酸化型グルタチオン（ＧＳＳＧ）を含むＰＢＳ中に希釈し、室温で３時間インキュベートしてリフォールディングを行った。遠心分離によって凝集体を除去した後HisTrap HP (GE HealthCare)を用いたNiキレートアフィニティクロマトグラフィ（IMAC）によって精製し、ＰＢＳで透析することで可溶性の３種類の本ペプチド２１−１ないし２１−３を生成した。

次に、本ペプチド２１−１ないし２１−３を５μｇ／ｍｌの濃度に０．１ＰＢＳＴで希釈し、１００μｌを親水性のポリスチレンプレート（ＡＧＣテクノグラス株式会社製「ＩＷＡＫＩマイクロプレート＃３８６０−０９６」）に加え、２時間室温でインキュベートして、本ペプチドを固定化させた。０．１ＰＢＳＴで６回洗浄した後、２％のＢＳＡを含む０．１ＰＢＳＴ（ブロッキング試薬）によってポリスチレンプレート表面の未結合部位をブロッキングした。さらに、０．１ＰＢＳＴで６回洗浄した後、０．２％のＢＳＡを含む０．１ＰＢＳＴで１〜５０００ｎｇ／ｍｌに希釈されたbiotin-CRP （抗原）を１００μｌ加え、室温で１時間インキュベートして、本ペプチドと抗原抗体反応させた。さらに、０．１ＰＢＳＴで６回洗浄した後、０．２％のＢＳＡを含む０．１ＰＢＳＴで５０００倍に希釈されたHRP標識ストレプトアビジンを１００μｌ加え、室温で３０分インキュベートして、０．１ＰＢＳＴで６回洗浄した後に、発色基質を加えて３０分間発色させた。３０分後にマイクロプレートリーダー（ＴＥＣＡＮ製「ＳＵＮＲＩＳＥ Ｒｅｍｏｔｅ」）を用いて、４０５ｎｍにおける吸光度を測定した。配列番号２３〜２５に示す原ペプチド２１−１ないし２１−３である一本鎖抗体、実施例２０に記載した本アミノ酸配列２を標識した本ペプチド２０、原ペプチド２０についても同様の処理を行い吸光度を測定した。さらに、５μｇ／ｍｌの原ペプチド２０をＰＢＳ中で疎水性のポリスチレンプレート（ベクトン・ディッキンソン アンド カンパニー社製「ＢＤ Ｆａｌｃｏｎマイクロプレート＃３５１１７２」）に固定化して吸光度を測定した。

図１３に実施例２４の測定結果を示す。図１３中、黒丸（●）、黒塗りの三角及び黒塗りの四角はそれぞれ配列番号２６、２７、２８に示す本ペプチド２１−１、２１−２、２１−３の結果であり、白丸（○）、白塗りの三角（△）及び白塗りの四角（□）はそれぞれ配列番号２３、２４、２５に示す原ペプチド２１−１、２１−２、２１−３の結果である。さらに、黒塗りの菱形（◆）は、本ペプチド２０の結果であり、白塗りの菱形（◇）は、原ペプチド２０であるマウスモノクローナル抗ヒトＣＲＰ抗体（オリエンタル酵母社製、＃４７１５５００）の結果である。×印は原ペプチド２０の疎水性のポリスチレンプレートに固定化して実験を行った結果である。図１１において、縦軸は、吸光度（４０５ｎｍ）であり、横軸はbiotin-CRPの濃度（ｎｇ／ｍｌ）である。

図１３から原ペプチド２１−１、２１−２、２１−３（○、△、□）並びに原ペプチド２０（◇）では、親水性のポリスチレン表面においては、ほとんど活性化されていないが、本ペプチド２１−１、２１−２、２１−３（黒丸、黒塗り三角、黒塗りの四角）では、１本鎖抗体のアミノ酸配列の違いによらず何れも高い抗原結合活性が維持されていることが確認できる。また、本アミノ酸配列２を標識した本ペプチド２０（◆）においても親水性ポリスチレンプレート上に選択的に固定化され高い抗原結合活性を示していることがわかる。従来ＥＬＩＳＡに用いられてきた疎水性ポリスチレンプレート上に固定化されたマウスモノクローナル抗体（原ペプチド２０）の結果（×）と比較しても本アミノ酸配列２を有する本ペプチド２０並びに２１−１、２１−２及び２１−３は同等もしくはそれ以上に高いシグナルが得られていることが分かる。以上の結果より、様々な１本鎖抗体のＣ末端側に本アミノ酸配列２を導入した本ペプチド２１−１、２１−２、２１−３を生産することで親水性ポリスチレンプレートに抗原結合活性を高く維持した状態で固定化できることが確認できた。また、本アミノ酸配列２をモノクローナル抗体に標識することで親水性ポリスチレンプレートに抗原結合活性を高く維持した状態で固定化できることが確認できた。

［実施例２５］（精製後の変性本ペプチド２１−１，２２−１及び２３−１の固相リフォールディング及び活性値評価）
本実施例では、精製後の変性本ペプチド２１−１，２２−１及び２３−１の固定化された状態におけるリフォールディング及び活活性値を評価するため、これらのペプチドを親水性のポリスチレン表面に対して結合させ、抗原抗体反応の活性値を測定した。

まず、変性剤である尿素の終濃度が４Ｍとなるように、各精製後の変性本ペプチド２１−１（配列番号２６），２２−１（配列番号２９）及び２３−１（配列番号３１）を調製して試料を作成した。次に、各試料２０μｌを親水性のポリスチレンプレート（ＡＧＣテクノグラス株式会社製「ＩＷＡＫＩマイクロプレート＃３８６０−０９６」）に加え、ミキサーで撹拌後、室温で１時間インキュベートして、本ペプチドを固定化させた（１ウェルあたりのscFvの重量：０．５μｇ／ウェル）。０．１ＰＢＳＴで６回洗浄した後、２％のＢＳＡを含む０．１ＰＢＳＴ（ブロッキング試薬）によってポリスチレンプレート表面の未結合部位をブロッキングした。さらに、０．１ＰＢＳＴで６回洗浄した後、０．２％のＢＳＡを含む０．１ＰＢＳＴで１〜５０００ｎｇ／ｍｌに希釈されたbiotin-CRP （抗原）を１００μｌ加え、室温で１時間インキュベートして、本ペプチドと抗原抗体反応させた。さらに、０．１ＰＢＳＴで６回洗浄した後、０．２％のＢＳＡを含む０．１ＰＢＳＴで５０００倍に希釈されたHRP標識ストレプトアビジンを１００μｌ加え、室温で３０分インキュベートして、０．１ＰＢＳＴで６回洗浄した後に、発色基質を加えて３０分間発色させた。３０分後にマイクロプレートリーダー（ＴＥＣＡＮ製「ＳＵＮＲＩＳＥ Ｒｅｍｏｔｅ」）を用いて、４０５ｎｍにおける吸光度を測定した。原ペプチド２１−１（配列番号２３）についても同様の処理を行い吸光度を測定した。

図１４に実施例２５の測定結果を示す。図１４中、黒丸（●）は精製後の変性本ペプチド２１−１の結果であり、黒塗りの三角は精製後の変性本ペプチド２２−１の結果であり、黒塗りの四角は精製後の変性本ペプチド２３−１の結果であり、白丸（○）は原ペプチド２１−１の結果である。図１４において、縦軸は、吸光度（４０５ｎｍ）であり、横軸はbiotin-CRPの濃度（ｎｇ／ｍｌ）である。

図１４から、原ペプチド２１−１である一本鎖抗体（○）では、ほとんど活性化されていないが、精製後の変性本ペプチド２１−１，２２−１及び２３−１は何れも活性化されていることが確認できる。つまり、本アミノ酸配列を用いることにより、変性されている本ペプチド２１−１，２２−１及び２３−１を固相に接触させることによって、固定化させると共に、変性を復元するリフォールディングも行われている。

さらに、本アミノ酸配列２をＣ末端側に導入した本ペプチド２１−１も、本アミノ酸配列２を重鎖可変部とリンカーペプチドとの間に導入した本ペプチド２２−１も同程度の活性であるのに対し、本アミノ酸配列２をＣ末端側及び重鎖可変部とリンカーペプチドとの間の両方に導入した本ペプチド２３−１ではより高い活性が得られることが確認できた。

［実施例２６］（精製後の変性本ペプチド２１−２，２２−２及び２３−２の固相リフォールディング及び活性値評価）
本実施例では、精製後の変性本ペプチド２１−２，２２−２及び２３−２の固定化された状態におけるリフォールディング及び活活性値を評価するため、これらのペプチドについて、親水性のポリスチレン表面に対して結合させ、抗原抗体反応の活性値を測定した。なお、本実施例は、基本的な操作は実施例２５と同様であるが、多少条件を変更しているため、以下念のため記載する。

まず、変性剤である尿素の終濃度が４Ｍとなり、各精製後の変性本ペプチド２１−２（配列番号２７），２２−２（配列番号３０）及び２３−２（配列番号３２）が１０μｇ／ｍｌとなるように、１％のＴｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳによって溶液を調製して試料を作成した。次に、各試料１００μｌを親水性のポリスチレンプレート（ＡＧＣテクノグラス株式会社製「ＩＷＡＫＩマイクロプレート＃３８６０−０９６」）に加え、ミキサーで撹拌後、室温で３時間インキュベートして、本ペプチドを固定化させた。０．１ＰＢＳＴで６回洗浄した後、２％のＢＳＡを含む０．１ＰＢＳＴ（ブロッキング試薬）を３００μｌ加えて、室温で１時間インキュベートしてポリスチレンプレート表面の未結合部位をブロッキングした。さらに、０．１ＰＢＳＴで６回洗浄した後、０．２％のＢＳＡを含む０．１ＰＢＳＴで１〜５０００ｎｇ／ｍｌに希釈されたbiotin-CRP （抗原）を１００μｌ加え、室温で１時間インキュベートして、本ペプチドと抗原抗体反応させた。さらに、０．１ＰＢＳＴで６回洗浄した後、０．２％のＢＳＡを含む０．１ＰＢＳＴで５０００倍に希釈されたHRP標識ストレプトアビジンを１００μｌ加え、室温で１時間インキュベートした。さらに、０．１ＰＢＳＴで６回洗浄した後に、発色基質を１００μｌ加えて３０分間発色させた。３０分後にマイクロプレートリーダー（ＴＥＣＡＮ製「ＳＵＮＲＩＳＥ Ｒｅｍｏｔｅ」）を用いて、４０５ｎｍにおける吸光度を測定した。原ペプチド２１−２（配列番号２４）についても同様の処理を行い吸光度を測定した。

図１５に実施例２６の測定結果を示す。図１５中、黒丸（●）は精製後の変性本ペプチド２１−２の結果であり、黒塗りの三角は精製後の変性本ペプチド２２−２の結果であり、黒塗りの四角は精製後の変性本ペプチド２３−２の結果であり、白丸（○）は原ペプチド２１−２の結果である。図１５において、縦軸は、吸光度（４０５ｎｍ）であり、横軸はbiotin-CRPの濃度（ｎｇ／ｍｌ）である。

図１５から、原ペプチド２１−２である一本鎖抗体（○）では、ほとんど活性化されていないが、精製後の変性本ペプチド２１−２，２２−２及び２３−２は何れも活性化されていることが確認できる。つまり、実施例２５と同様に、本実施例においても、本アミノ酸配列を用いることにより、変性されている本ペプチド２１−２，２２−２及び２３−２を固相に接触させることによって、固定化させると共に、変性を復元するリフォールディングも行われることが確認できた。

さらに、本アミノ酸配列２をＣ末端側に導入した本ペプチド２１−２の方が、本アミノ酸配列２を重鎖可変部とリンカーペプチドとの間に導入した本ペプチド２２−２よりも活性が高いことが確認できるが、それ以上に、本アミノ酸配列２をＣ末端側及び重鎖可変部とリンカーペプチドとの間の両方に導入した本ペプチド２３−２の方がより高い活性が得られることも確認できた。

［実施例２７］（精製後の変性本ペプチド２１−１の固相に対する結合性能及び活性値評価）
本実施例では、精製後の変性本ペプチド２１−１（配列番号２６）の量と親水性のポリスチレン表面に対する結合性能及び活性値との関係を評価した。

まず、精製後の変性本ペプチド２１−１を３．２μｇ／ｍｌ、３２μｇ／ｍｌ及び３２０μｇ／ｍｌの各濃度となるように８Ｍ尿素で調製して試料を作成した。次に、各１０μｌの試料をそれぞれ親水性のポリスチレンプレート（ＡＧＣテクノグラス株式会社製「ＩＷＡＫＩマイクロプレート＃３８６０−０９６」）に加え、さらに各ウェルに０．１ＰＢＳＴを９０μｌ加えて１０倍に希釈し、４℃で一晩インキュベートして、本ペプチド２１−１を固定化させた。０．１ＰＢＳＴで６回洗浄した後、２％のＢＳＡを含む０．１ＰＢＳＴ（ブロッキング試薬）によってポリスチレンプレート表面の未結合部位をブロッキングした。さらに、０．１ＰＢＳＴで６回洗浄した後、０．２％のＢＳＡを含む０．１ＰＢＳＴで１〜５０００ｎｇ／ｍｌに希釈されたbiotin-CRP （抗原）を１００μｌ加え、室温で１時間インキュベートして、本ペプチドと抗原抗体反応させた。さらに、０．１ＰＢＳＴで６回洗浄した後、０．２％のＢＳＡを含む０．１ＰＢＳＴで１０００倍に希釈されたHRP標識ストレプトアビジンを１００μｌ加え、室温で３０分インキュベートして、０．１ＰＢＳＴで６回洗浄した後に、発色基質を加えて３０分間発色させた。３０分後にマイクロプレートリーダー（ＴＥＣＡＮ製「ＳＵＮＲＩＳＥ Ｒｅｍｏｔｅ」）を用いて、４０５ｎｍにおける吸光度を測定した。

図１６に実施例２７の測定結果を示す。図１６中、黒丸（●）は精製後の変性本ペプチド２１−１の量が１ウェルあたり０．０３２μｇの場合、黒塗りの三角は０．３２μｇの場合、黒塗りの四角は３.２μｇの場合の結果である。図１６において、縦軸は、吸光度（４０５ｎｍ）であり、横軸はbiotin-CRPの濃度（ｎｇ／ｍｌ）である。

図１６から、精製後の変性本ペプチド２１−１は、親水性のポリスチレン表面において活性化されていることが確認できる。つまり、本アミノ酸配列を用いることにより、親水性のポリスチレン基板に対して特異的な結合性能を示し、固定化させると共に、変性を復元するリフォールディングもできることが確認された。

［実施例２８］（未精製の変性本ペプチド２１−１ないし２１−３の固定化による分離精製及び活性値評価）
本実施例では、未精製の変性本ペプチド２１−１ないし２１−３（配列番号２６、２７、２８）を親水性のポリスチレン表面に固定化することによる分離精製の可能性及び固定化された状態の活性値を評価した。

まず、未精製の変性本ペプチド２１−１ないし２１−３及び３．２ｍｇ／ｍｌの精製後の変性本ペプチド２１−１を０．１ＰＢＳＴで１０倍に希釈した試料及び１００倍に希釈した試料を親水性のポリスチレンプレート（ＡＧＣテクノグラス株式会社製「ＩＷＡＫＩマイクロプレート＃３８６０−０９６」）に２００μｌ加え、４℃で一晩インキュベートして、本ペプチドを固定化させた。０．１ＰＢＳＴで６回洗浄した後、２％のＢＳＡを含む０．１ＰＢＳＴ（ブロッキング試薬）によってポリスチレンプレート表面の未結合部位をブロッキングした。さらに、０．１ＰＢＳＴで６回洗浄した後、０．２％のＢＳＡを含む０．１ＰＢＳＴで１〜５０００ｎｇ／ｍｌに希釈されたbiotin-CRP （抗原）を１００μｌ加え、室温で１時間インキュベートして、本ペプチドと抗原抗体反応させた。さらに、０．１ＰＢＳＴで６回洗浄した後、０．２％のＢＳＡを含む０．１ＰＢＳＴで１０００倍に希釈されたHRP標識ストレプトアビジンを１００μｌ加え、室温で３０分インキュベートして、０．１ＰＢＳＴで６回洗浄した後に、発色基質を加えて３０分間発色させた。３０分後にマイクロプレートリーダー（ＴＥＣＡＮ製「ＳＵＮＲＩＳＥ Ｒｅｍｏｔｅ」）を用いて、４０５ｎｍにおける吸光度を測定した。

図１７（ａ）は１０倍に希釈した場合の測定結果であり、図１７（ｂ）は１００倍に希釈した場合の測定結果である。図１７（ａ）及び（ｂ）中、黒丸（●）は未精製の変性本ペプチド２１−１の結果であり、黒塗りの三角は未精製の変性本ペプチド２１−２の結果であり、黒塗りの四角は未精製の変性本ペプチド２１−３の結果であり、白丸（○）は精製後の変性本ペプチド２１−１の結果である。図１７（ａ）及び（ｂ）において、縦軸は、吸光度（４０５ｎｍ）であり、横軸はbiotin-CRPの濃度（ｎｇ／ｍｌ）である。

図１７から、未精製の状態であっても、親水性のポリスチレン表面に固定化され、活性化されることが確認できる。つまり、本アミノ酸配列を用いることにより、本ペプチドは親水性のポリスチレンプレートに対し特異的に結合するので、生産時における分離精製工程として利用可能であり、しかも活性化されるのでリフォールディングもされていることが確認できた。

配列表フリ−テキスト

配列番号１：親水性固体表面に特異的な親和性を有するペプチド。
配列番号２：親水性固体表面に特異的な親和性を有するペプチド。
配列番号３：親水性固体表面に特異的な親和性を有するペプチド。
配列番号４：親水性固体表面に特異的な親和性を有するペプチド。
配列番号５：親水性固体表面に特異的な親和性を有するペプチド。
配列番号６：親水性固体表面に特異的な親和性を有するペプチド。
配列番号７：親水性固体表面に特異的な親和性を有するペプチド。
配列番号８：親水性固体表面に特異的な親和性を有するペプチド。
配列番号９：親水性固体表面に特異的な親和性を有するペプチド。
配列番号１０：親水性固体表面に特異的な親和性を有するペプチド。
配列番号１１：親水性固体表面に特異的な親和性を有するペプチド。
配列番号１２：親水性固体表面に特異的な親和性を有するペプチド。
配列番号１３：親水性固体表面に特異的な親和性を有するペプチド。
配列番号１４：親水性固体表面に特異的な親和性を有するペプチド。
配列番号１５：親水性固体表面に特異的な親和性を有するペプチド。
配列番号１６：親水性固体表面に特異的な親和性を有するペプチド。
配列番号１７：親水性固体表面に特異的な親和性を有するペプチド。
配列番号１８：親水性固体表面に特異的な親和性を有するペプチド。
配列番号１９：親水性固体表面に特異的な親和性を有するペプチド。
配列番号２０：親水性固体表面に特異的な親和性を有するペプチド。
配列番号２１：合成ＤＮＡ。
配列番号２２：合成ＤＮＡ。
配列番号２３：一本鎖抗体。
配列番号２４：一本鎖抗体。
配列番号２５：一本鎖抗体。
配列番号２６：親水性固体表面に特異的な親和性を有する一本鎖抗体。
配列番号２７：親水性固体表面に特異的な親和性を有する一本鎖抗体。
配列番号２８：親水性固体表面に特異的な親和性を有する一本鎖抗体。
配列番号２９：親水性固体表面に特異的な親和性を有する一本鎖抗体。
配列番号３０：親水性固体表面に特異的な親和性を有する一本鎖抗体。
配列番号３１：親水性固体表面に特異的な親和性を有する一本鎖抗体。
配列番号３２：親水性固体表面に特異的な親和性を有する一本鎖抗体。

Claims (13)

1. (a)親水化処理された樹脂表面の固相に対して特異的な吸着機能を発現させるアミノ酸配列を生理活性を妨げない部位に有し、封入体の状態から変性された生理活性を持つペプチドと、
   (b)変性剤と、
   (c)夾雑物と、
   を含む溶液を親水化処理された樹脂表面の固相に接触させることにより、前記ペプチドを前記固相表面に直接吸着させ、前記変性されたペプチドの立体構造を復元することを特徴とする復元されたペプチドの生産方法。
2. 前記ペプチドは、抗原結合部位が形成される可変部を含み、重鎖の可変部よりもＣ末端側又は軽鎖の可変部よりもＣ末端側に、前記アミノ酸配列を有することを特徴とする請求項１に記載のペプチドの生産方法。
3. 前記溶液は、前記ペプチドを生成した宿主の破砕物、培地または分泌物を含有することを特徴とする請求項１又は２に記載のペプチドの生産方法。
4. 前記アミノ酸配列は、配列表における配列番号１乃至２０に示すアミノ酸配列の何れかであって、親水化処理された樹脂表面の固相に対して特異的な吸着機能を発現させることを特徴とする請求項１乃至３の何れか１項に記載のペプチドの生産方法。
5. 前記ペプチドを前記固相表面に直接吸着させた状態で、前記変性剤を除去することにより、前記変性されたペプチドの立体構造を復元することを特徴とする請求項１乃至４の何れか１項に記載のペプチドの生産方法。
6. 前記ペプチドは前記樹脂表面の固相に直接吸着することを特徴とする請求項１乃至５の何れか１項に記載のペプチドの生産方法。
7. 前記樹脂表面は親水性のポリスチレン表面であることを特徴とする請求項６に記載のペプチドの生産方法。
8. 親水化処理された樹脂表面の固相に対して特異的な吸着機能を発現させる配列表における配列番号１に示すアミノ酸配列を生理活性を妨げない部位に有する生理活性を持つペプチドをコードする塩基配列を含む遺伝子を宿主に導入して形質転換体とし、その生成物を含む溶液を親水化処理された樹脂表面の固相に接触させることにより、前記ペプチドを前記固相表面に直接吸着させることを特徴とするペプチドが固定化された固相の生産方法。
9. 親水化処理された樹脂表面の固相に対して特異的な吸着機能を発現させるアミノ酸配列を生理活性を妨げない部位に有し、封入体の状態から変性された生理活性を持つペプチドと、
   変性剤と、
   夾雑物と、
   を含む溶液を親水化処理された樹脂表面の固相に接触させることにより、前記ペプチドを前記固相表面に直接吸着させ、前記変性されたペプチドの立体構造を復元することを特徴とするペプチドが固定化された固相の生産方法。
10. 前記溶液は、前記ペプチドを生成した宿主の破砕物、培地または分泌物を含有することを特徴とする請求項９に記載のペプチドが固定化された固相の生産方法。
11. 前記宿主は酵母であることを特徴とする請求項８に記載のペプチドが固定化された固相の生産方法。
12. 前記ペプチドは、抗原結合部位が形成される可変部を含み、重鎖の可変部よりもＣ末端側又は軽鎖の可変部よりもＣ末端側に、前記アミノ酸配列を有することを特徴とする請求項８乃至１１の何れか１項に記載のペプチドが固定化された固相の生産方法。
13. 前記アミノ酸配列は、配列表における配列番号１乃至２０に示すアミノ酸配列の何れかであって、親水化処理された樹脂表面の固相に対して特異的な吸着機能を発現させることを特徴とする請求項９乃至１２の何れか１項に記載のペプチドが固定化された固相の生産方法。