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JP5554970B2 - Scanning microscope - Google Patents

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JP5554970B2
JP5554970B2 JP2009267663A JP2009267663A JP5554970B2 JP 5554970 B2 JP5554970 B2 JP 5554970B2 JP 2009267663 A JP2009267663 A JP 2009267663A JP 2009267663 A JP2009267663 A JP 2009267663A JP 5554970 B2 JP5554970 B2 JP 5554970B2
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Description

本発明は、走査型顕微鏡に関するものである。   The present invention relates to a scanning microscope.

従来、レゾナント型スキャナとガルバノミラー型スキャナとにより照明光を2次元的に走査する走査型顕微鏡が知られている(例えば、特許文献1参照。)。
この走査型顕微鏡は、レゾナント型スキャナ自体では走査速度の調節ができずに、当該レゾナント型スキャナの走査間隔で画像取得が行われてしまうという問題を解決するために、レゾナント型スキャナによる複数回の走査の内、1画面の画像を取得するのに必要な時間だけ光源から画像取得に必要な光量の光を出射させることとしている。
Conventionally, there is known a scanning microscope that scans illumination light two-dimensionally with a resonant scanner and a galvanometer mirror scanner (see, for example, Patent Document 1).
In order to solve the problem that the scanning speed cannot be adjusted by the resonant scanner itself, and the image acquisition is performed at the scanning interval of the resonant scanner, this scanning microscope is used a plurality of times by the resonant scanner. In scanning, the light source emits light of a light quantity necessary for image acquisition for a time required to acquire an image of one screen.

特開2009−25632号公報JP 2009-25632 A

しかしながら、特許文献1の走査型顕微鏡では、1画面の画像を取得するのに必要な時間だけ試料に照明光を照射し、他の時間には画像取得に必要な光量より小さくするかゼロにするので、単位時間当たりに試料に照射するレーザ光の光量が低下するという不都合がある。単位時間当たりに試料に照射するレーザ光の光量が低下すると、単位時間当たりに得られる蛍光量も減少するので、暗い蛍光画像しか得られないことになる。この方法を用いながら蛍光画像の輝度を向上するためには、試料に照射されるレーザ光の強度を増加させなければならないが、過度に強いレーザ光は試料にダメージを与え、蛍光の褪色を誘発するという不都合がある。   However, in the scanning microscope of Patent Document 1, the sample is irradiated with illumination light for a time required to acquire an image on one screen, and the light amount required for image acquisition is set to be smaller or zero at other times. Therefore, there is an inconvenience that the amount of laser light irradiated to the sample per unit time decreases. When the amount of laser light applied to the sample per unit time decreases, the amount of fluorescence obtained per unit time also decreases, so that only a dark fluorescence image can be obtained. In order to improve the brightness of the fluorescent image while using this method, the intensity of the laser beam irradiated to the sample must be increased. However, excessively strong laser light damages the sample and induces a fluorescent fading. There is an inconvenience of doing.

本発明は上述した事情に鑑みてなされたものであって、レゾナント型スキャナを用いて照明光を走査する場合に、試料に照射する照明光の光量を過度に大きくすることなく、フレームレートを低下させつつ、明るい画像を得ることができる走査型顕微鏡を提供することを目的としている。   The present invention has been made in view of the circumstances described above, and when scanning illumination light using a resonant scanner, the frame rate is reduced without excessively increasing the amount of illumination light applied to the sample. It is an object of the present invention to provide a scanning microscope that can obtain a bright image.

上記目的を達成するために、本発明は以下の手段を提供する。
本発明は、光源からの照明光を走査するレゾナント型スキャナを含む走査部と、該走査部により走査された照明光が試料に照射されることによる試料からの戻り光を検出する光検出部と、該光検出部により検出された戻り光の光量と前記走査部による照明光の走査位置情報とに基づいて2次元画像を生成する画像生成部と、フレームレートを設定するフレームレート設定部と、前記光源から発せられる照明光の光量を設定する光量設定部と、光量調節部とを備え、前記画像生成部が、前記フレームレート設定部により設定されたフレームレートにより最大フレームレートを除算して得られた回数だけ前記光検出部により順次検出された同一走査位置の戻り光の光量を積算して2次元画像を生成し、前記光量調節部が、前記光量設定部により設定された光量を前記回数で除算した光量となるように、前記試料に照射される照明光の光量を調節する走査型顕微鏡を提供する。
In order to achieve the above object, the present invention provides the following means.
The present invention includes a scanning unit including a resonant scanner that scans illumination light from a light source, and a light detection unit that detects return light from the sample when the illumination light scanned by the scanning unit is irradiated on the sample. An image generation unit that generates a two-dimensional image based on the amount of return light detected by the light detection unit and scanning position information of illumination light by the scanning unit; a frame rate setting unit that sets a frame rate ; A light amount setting unit that sets a light amount of illumination light emitted from the light source; and a light amount adjustment unit , wherein the image generation unit divides the maximum frame rate by the frame rate set by the frame rate setting unit. was number of times by integrating the light amount of return light are sequentially detected the same scanning position by the optical detection unit to generate a two-dimensional image, the light amount adjustment unit, set by the light quantity setting section As the amount of light divided by the light quantity in the number, it provides a scanning microscope to adjust the light amount of illumination light irradiated to the sample.

本発明によれば、光源からの照明光が走査部により試料において2次元的に走査され、試料から戻る戻り光が光検出部により検出されると、画像生成部により戻り光の光量と走査位置情報とに基づいて2次元画像が生成される。走査部に含まれるレゾナント型スキャナは、それ自体で速度調節はできないので、照明光は予め定められた走査速度で試料に照射され、最大フレームレートによって定められた数のデータが取得される。   According to the present invention, when the illumination light from the light source is scanned two-dimensionally on the sample by the scanning unit, and the return light returning from the sample is detected by the light detection unit, the amount of the return light and the scanning position are detected by the image generation unit. A two-dimensional image is generated based on the information. Since the resonant scanner included in the scanning section cannot adjust the speed by itself, the illumination light is irradiated onto the sample at a predetermined scanning speed, and the number of data determined by the maximum frame rate is acquired.

画像生成部は取得されたデータの全ての別個の2次元画像として生成するのではなく、フレームレート設定部により設定されたフレームレートで最大フレームレートを除算して得られた回数だけ取得されたデータを積算するので、設定されたフレームレート通りに2次元画像が生成される。この場合において、本発明によれば、試料への照明光の照射を間引くのではなく、得られたデータを積算してフレームレートを下げるので、単位時間当たりの照明光の光量を低下させることなく、得られる2次元画像の輝度の低下を防止することができる。   The image generation unit does not generate the acquired data as all separate two-dimensional images, but the data acquired by the number of times obtained by dividing the maximum frame rate by the frame rate set by the frame rate setting unit Therefore, a two-dimensional image is generated according to the set frame rate. In this case, according to the present invention, the illumination data is not thinned out, but the frame rate is reduced by accumulating the obtained data without reducing the amount of illumination light per unit time. Therefore, it is possible to prevent a decrease in luminance of the obtained two-dimensional image.

その結果、2次元画像の輝度の低下を防止するために照明光の光量を増大させる必要がなく、試料に与えるダメージを低減することができる。さらに、結果として明る過ぎる画像が得られる場合には、照明光の光量を低減することができ、試料にかかる負担をさらに軽減することができる。   As a result, it is not necessary to increase the amount of illumination light in order to prevent a decrease in the brightness of the two-dimensional image, and damage to the sample can be reduced. Furthermore, when an image that is too bright is obtained as a result, the amount of illumination light can be reduced, and the burden on the sample can be further reduced.

上記発明においては、前記走査部が、各フレームで前記レゾナント型スキャナによる照明光の走査ラインを毎回異ならせるように駆動され、前記画像生成部が、複数フレーム毎に前記戻り光の光量を積算してもよい。
このようにすることで、照明光が試料の所定領域に1回ずつ照射されて得られた1フレーム分の戻り光の光量が、複数フレーム分積算されることにより、レゾナント型スキャナのフレームレートより低いフレームレートで、明るい2次元画像を得ることができる。
In the above invention, the scanning unit, the scanning lines of the illumination light by the resonant scanner is driven so as to vary every time in each frame, the image generation unit, the light quantity of the return light is integrating a plurality of frames May be.
By doing so, the amount of the return light for one frame obtained by irradiating the illumination light to the predetermined region once in the sample is integrated for a plurality of frames, thereby obtaining the frame rate of the resonant scanner. A bright two-dimensional image can be obtained at a low frame rate.

また、上記発明においては、前記走査部が、前記レゾナント型スキャナによる照明光の走査ラインを前記回数分の走査毎に異ならせるように駆動され、前記画像生成部が、ライン毎に前記戻り光の光量を積算してもよい。
このようにすることで、試料の所定領域における各走査ラインに対して、照明光が複数回走査されつつ積算された後に、走査ラインを切り替える動作が繰り返される。これにより、レゾナント型スキャナのフレームレートより低いフレームレートで、明るい2次元画像を得ることができる。また、各走査ラインに対して時間間隔をあけずに複数回照明光を走査するので、走査ライン毎の時間的な分解能を向上することができる。
In the above invention, the scanning unit is driven so as to change the scanning line of the illumination light by the resonant scanner for each scan of the number of times, and the image generation unit is configured to output the return light for each line. The amount of light may be integrated.
By doing in this way, the operation of switching the scanning lines is repeated after the illumination light is integrated while being scanned a plurality of times for each scanning line in the predetermined region of the sample. Thereby, a bright two-dimensional image can be obtained at a frame rate lower than that of the resonant scanner. In addition, since the illumination light is scanned a plurality of times without leaving a time interval for each scan line, the temporal resolution of each scan line can be improved.

また、上記発明においては、前記光源から発せられる照明光の光量を設定する光量設定部と、該光量設定部により設定された光量を前記回数で除算した光量となるように、前記試料に照射される照明光の光量を調節する光量調節部とを備えている
このようにすることで、得られる2次元画像の明るさを暗くすることなく、レゾナント型スキャナのフレームレートより低いフレームレートで、明るい2次元画像を得ることができる。すなわち、必要な2次元画像の明るさを得るために必要最小限の光量の照明光を試料に照射するだけで済み、試料にかかる負担を軽減することができる。
Further, in the above invention, the sample is irradiated so that the light quantity setting unit for setting the light quantity of the illumination light emitted from the light source and the light quantity set by the light quantity setting part is divided by the number of times. And a light amount adjusting unit for adjusting the light amount of the illumination light .
By doing so, it is possible to obtain a bright two-dimensional image at a frame rate lower than the frame rate of the resonant scanner without reducing the brightness of the obtained two-dimensional image. That is, it is only necessary to irradiate the sample with a minimum amount of illumination light to obtain the necessary brightness of the two-dimensional image, and the burden on the sample can be reduced.

また、上記発明においては、バックグラウンド光量を設定するバックグラウンド設定部と、前記画像生成部が、積算して得られる戻り光の光量から前記バックグラウンド光量に前記回数を乗算した光量を減算して2次元画像を生成してもよい。
このようにすることで、複数回積算することにより2次元画像内において増加するバックグラウンドを除去して、鮮明な画像を得ることができる。
In the above invention, the background setting unit for setting the background light amount and the image generation unit subtract the light amount obtained by multiplying the background light amount by the number of times from the light amount of the return light obtained by integration. A two-dimensional image may be generated.
By doing in this way, the background which increases in a two-dimensional image by accumulating several times is removed, and a clear image can be obtained.

また、上記発明においては、前記画像生成部が、前記レゾナント型スキャナによる往動作時または復動作時のいずれかに前記光検出部により検出された同一走査位置の戻り光の光量を積算して2次元画像を生成してもよい。
このようにすることで、画素ずれの少ないデータが積算されて、鮮明な2次元画像を生成することができる。
In the above invention, the image generation unit adds up the amount of return light at the same scanning position detected by the light detection unit during the forward operation or the backward operation by the resonant scanner. A dimensional image may be generated.
By doing so, data with little pixel shift can be integrated and a clear two-dimensional image can be generated.

本発明によれば、レゾナント型スキャナを用いて照明光を走査する場合に、試料に照射する照明光の光量を過度に大きくすることなく、フレームレートを低下させつつ、明るい画像を得ることができるという効果を奏する。   According to the present invention, when scanning illumination light using a resonant scanner, a bright image can be obtained while reducing the frame rate without excessively increasing the amount of illumination light applied to the sample. There is an effect.

本発明の一実施形態に係る走査型顕微鏡を示すブロック図である。It is a block diagram which shows the scanning microscope which concerns on one Embodiment of this invention. 図1の走査型顕微鏡による画像生成処理を説明するフローチャートである。3 is a flowchart for explaining image generation processing by the scanning microscope of FIG. 1. 図2のフローチャートの変形例である。It is a modification of the flowchart of FIG. 図1のフローチャートにおけるデータ取得タイミングとレーザ光照射タイミングとの関係を示すタイムチャートである。It is a time chart which shows the relationship between the data acquisition timing in the flowchart of FIG. 1, and a laser beam irradiation timing. 図4のタイムチャートの変形例であって(a)往路のみにデータを取得する場合、(b)復路のみにデータを取得する場合をそれぞれ示している。FIG. 4 is a modification of the time chart of FIG. 4, showing (a) when acquiring data only for the forward path, and (b) when acquiring data only for the return path. 図2のフローチャートの他の変形例である。It is another modification of the flowchart of FIG. 図3のフローチャートの変形例である。It is a modification of the flowchart of FIG.

以下、本発明の一実施形態に係る走査型顕微鏡1について、図面を参照して説明する。
本実施形態に係る走査型顕微鏡1は、図1に示されるように、レーザ走査型共焦点顕微鏡である。
Hereinafter, a scanning microscope 1 according to an embodiment of the present invention will be described with reference to the drawings.
As shown in FIG. 1, the scanning microscope 1 according to the present embodiment is a laser scanning confocal microscope.

この走査型顕微鏡1は、レーザ光(照明光)を射出するレーザ光源2と、該レーザ光源2からのレーザ光を2次元的に走査する走査部3と、該走査部3により走査されたレーザ光を試料Aに集光する一方、試料Aにおいて発生した蛍光を集光する対物レンズ4と、該対物レンズ4および走査部3を介して戻る蛍光をレーザ光の光路から分岐するダイクロイックミラー5と、該ダイクロイックミラー5によりレーザ光から分岐された蛍光の光路上の試料Aと光学的に共役な位置に配置されたピンホール6と、該ピンホール6を通過した蛍光を検出する光検出器(例えば、光電子増倍管)7と、これらを制御する制御部(画像生成部)8と、生成された画像を記憶する記憶部9と、所望のフレームレート等を入力する入力部(フレームレート設定部)10とを備えている。   The scanning microscope 1 includes a laser light source 2 that emits laser light (illumination light), a scanning unit 3 that two-dimensionally scans the laser light from the laser light source 2, and a laser that is scanned by the scanning unit 3. An objective lens 4 that condenses the light on the sample A while condensing the fluorescence generated in the sample A, and a dichroic mirror 5 that branches the fluorescence returning through the objective lens 4 and the scanning unit 3 from the optical path of the laser light; , A pinhole 6 disposed at a position optically conjugate with the sample A on the optical path of the fluorescence branched from the laser beam by the dichroic mirror 5, and a photodetector for detecting the fluorescence passing through the pinhole 6 ( For example, a photomultiplier tube) 7, a control unit (image generation unit) 8 that controls these, a storage unit 9 that stores the generated image, and an input unit (frame rate setting) that inputs a desired frame rate and the like ) And a 10.

走査部3は、レーザ光を一方向(例えば、X方向)に走査するレゾナント型スキャナ11と、該レゾナント型スキャナ11による走査方向に交差する他方向(例えば,Y方向)に走査するガルバノミラー12とを備えている。   The scanning unit 3 includes a resonant scanner 11 that scans laser light in one direction (for example, the X direction), and a galvanometer mirror 12 that scans in another direction (for example, the Y direction) that intersects the scanning direction of the resonant scanner 11. And.

入力部10は、レゾナント型スキャナ11のフレームレート(Fmax:最大フレームレート)に対して何分の一のフレームレートが好ましいかを示す数値(回数)Rを入力するようになっている。これにより、入力部10は、間接的に所望のフレームレート(Fmax/R)を入力することができるようになっている。なお、直接的に所望のフレームレートを入力することにしてもよい。また、入力部10は、必要な取得画像数(Nmax)を入力するようになっている。   The input unit 10 is configured to input a numerical value (number of times) R indicating a fraction of the frame rate with respect to the frame rate (Fmax: maximum frame rate) of the resonant scanner 11. Thereby, the input unit 10 can input a desired frame rate (Fmax / R) indirectly. Note that a desired frame rate may be directly input. The input unit 10 is configured to input a necessary number of acquired images (Nmax).

制御部8は、標準的なレーザ光の強度Iexと、標準的なバックグラウンド蛍光量を記憶している。
そして、制御部8は、走査部3に指令してレゾナント型スキャナ11およびガルバノミラー12を往復駆動させ、標本A上におけるレーザ光の走査ラインが全て異なるようにレーザ光を走査させ、レゾナント型スキャナ11およびガルバノミラー12の各走査位置において光検出器7により検出された蛍光の強度を走査位置情報と対応づけて記憶するようになっている。そして、1フレーム分の蛍光強度と走査位置情報とが対応づけられたフレームデータが取得された時点で、各走査位置における蛍光強度からバックグラウンド蛍光量を減算し、フレームバッファに積算するようになっている。
The control unit 8 stores a standard laser light intensity Iex and a standard background fluorescence amount.
Then, the control unit 8 instructs the scanning unit 3 to reciprocate the resonant scanner 11 and the galvanometer mirror 12 to scan the laser beam so that the scanning lines of the laser beam on the specimen A are all different, and the resonant scanner. 11 and the galvanometer mirror 12 are stored in association with the scanning position information of the fluorescence intensity detected by the photodetector 7 at each scanning position. At the time when frame data in which the fluorescence intensity for one frame is associated with the scanning position information is acquired, the background fluorescence amount is subtracted from the fluorescence intensity at each scanning position and integrated in the frame buffer. ing.

さらに制御部8は、フレームデータの取得、バックグラウンド蛍光量の減算およびフレームバッファへの積算を数値R回にわたって繰り返し、フレームバッファに得られた積算されたフレームデータを2次元蛍光画像として記憶部9に記憶するようになっている。   Further, the control unit 8 repeats the acquisition of the frame data, the subtraction of the background fluorescence amount, and the accumulation to the frame buffer over the numerical value R times, and the accumulated frame data obtained in the frame buffer is stored as a two-dimensional fluorescence image in the storage unit 9. To come to remember.

このように構成された本実施形態に係る走査型顕微鏡1の動作について、具体例を挙げて以下に説明する。
この例においては、レゾナント型スキャナ11は、例えば、その共振周波数で駆動され、ガルバノミラー12は、例えば、30フレーム/秒のフレームレートで駆動されるようになっている。また、所望のフレームレートとして10フレーム/秒が設定される場合について説明する。
The operation of the scanning microscope 1 according to the present embodiment configured as described above will be described below with a specific example.
In this example, the resonant scanner 11 is driven, for example, at its resonance frequency, and the galvanometer mirror 12 is driven, for example, at a frame rate of 30 frames / second. A case where 10 frames / second is set as a desired frame rate will be described.

図2に示されるように、作業者が、所望のフレームレートを設定するための数値R=3を入力し(ステップS1)、取得したい2次元蛍光画像の数Nmax=2を入力する(ステップS2)と、カウンタi,jが1に初期化され(ステップS3)、走査部3によるレーザ光の試料A上における走査が開始される(ステップS4)。   As shown in FIG. 2, the operator inputs a numerical value R = 3 for setting a desired frame rate (step S1), and inputs the number Nmax = 2 of two-dimensional fluorescent images desired to be acquired (step S2). ), The counters i and j are initialized to 1 (step S3), and scanning of the laser light on the sample A by the scanning unit 3 is started (step S4).

走査部3においては、レゾナント型スキャナ11が所定の角度範囲にわたって複数回往復揺動させられる間に、ガルバノミラー12が連続的に揺動角度を1回変化させることにより、試料A上の所定の観察範囲にわたってレーザ光が照射され、各照射位置から蛍光が発生する。発生した蛍光は対物レンズ4により集光され、走査部3を介して戻る途中でダイクロイックミラー5によって分岐され、ピンホール6を通過したもののみが光検出器7により検出される。   In the scanning unit 3, while the resonant scanner 11 is reciprocally swung a plurality of times over a predetermined angle range, the galvano mirror 12 continuously changes the rocking angle once so that a predetermined on the sample A is obtained. Laser light is irradiated over the observation range, and fluorescence is generated from each irradiation position. The generated fluorescence is condensed by the objective lens 4, branched by the dichroic mirror 5 on the way back through the scanning unit 3, and only the light passing through the pinhole 6 is detected by the photodetector 7.

走査部3による各走査位置情報と光検出器7により検出された蛍光強度とが対応づけて記憶されていき、1フレーム分のデータセットであるフレームデータが取得された時点で(ステップS5)、記憶していたバックグラウンド蛍光量が各走査位置における蛍光強度から減算され(ステップS6)、減算された結果の蛍光強度がフレームバッファに積算される(ステップS7)。   Each scanning position information by the scanning unit 3 and the fluorescence intensity detected by the photodetector 7 are stored in association with each other, and when frame data that is a data set for one frame is acquired (step S5). The stored background fluorescence amount is subtracted from the fluorescence intensity at each scanning position (step S6), and the resulting fluorescence intensity is integrated in the frame buffer (step S7).

フレームデータが数値R=3セット取得されたか否かが判定され(ステップS8)、取得されていない場合には、カウンタjがインクリメントされて(ステップS9)、ステップS5〜S7が繰り返される。
フレームデータが3セット分取得された場合には、フレームバッファに記憶されているデータセットが、2次元蛍光画像として記憶部9に記憶される(ステップS10)。
It is determined whether or not the numerical value R = 3 sets of frame data has been acquired (step S8). If not, the counter j is incremented (step S9), and steps S5 to S7 are repeated.
When three sets of frame data have been acquired, the data set stored in the frame buffer is stored in the storage unit 9 as a two-dimensional fluorescence image (step S10).

取得したい2次元蛍光画像の数Nmax=2枚が取得されたか否かが判定され(ステップS11)、取得されていない場合には、カウンタiがインクリメントされるとともに、カウンタjが1にリセットされ、かつ、フレームバッファが0に初期化されて(ステップS12)、ステップS5からのフローが繰り返される。
取得したい枚数Nmax=2枚の2次元蛍光画像が取得された場合には、動作が終了する。
It is determined whether or not the number Nmax = 2 of two-dimensional fluorescent images to be acquired has been acquired (step S11). If not acquired, the counter i is incremented and the counter j is reset to 1. In addition, the frame buffer is initialized to 0 (step S12), and the flow from step S5 is repeated.
When the number Nmax = 2 of the two-dimensional fluorescence images desired to be acquired is acquired, the operation ends.

このようにすることで、レゾナント型スキャナ11が定格周期で駆動されていても、単位時間当たりに得られる2次元蛍光画像の数は減少するので、見かけのフレームレートを低減することができる。この場合に、試料Aへのレーザ光の照射時間を間引くのではなく、フレームデータを積算するので、試料Aに単位時間当たりに照射されるレーザ光は低下せず、フレームレートを低下させても得られる2次元蛍光画像が暗くならないようにすることができる。   In this way, even if the resonant scanner 11 is driven at the rated cycle, the number of two-dimensional fluorescence images obtained per unit time is reduced, so that the apparent frame rate can be reduced. In this case, since the frame data is accumulated instead of thinning out the irradiation time of the laser beam to the sample A, the laser beam irradiated to the sample A per unit time does not decrease, and even if the frame rate is decreased. The obtained two-dimensional fluorescence image can be prevented from becoming dark.

すなわち、明るい2次元蛍光画像を得るために、試料Aに照射するレーザ光の光量を過度に増大させる必要がなく、試料Aに与えるダメージを低減することができる。特に、得られる2次元蛍光画像が明るすぎる場合には、レーザ光の光量を減少させても十分に明るい2次元蛍光画像を得ることができ、試料Aに与えるダメージをさらに低減することができる。   That is, in order to obtain a bright two-dimensional fluorescent image, it is not necessary to excessively increase the amount of laser light applied to the sample A, and damage to the sample A can be reduced. In particular, when the obtained two-dimensional fluorescent image is too bright, a sufficiently bright two-dimensional fluorescent image can be obtained even if the amount of laser light is reduced, and damage to the sample A can be further reduced.

なお、本実施形態においては、数値Rを入力することで、見かけのフレームレートを設定することにした。この場合に、見かけのフレームレートFmax/Rが割り切れることが望ましいが、割り切れない場合には、少数以下を切り捨てあるいは切り上げることにより近似された整数を見かけのフレームレートとして設定すればよい。   In the present embodiment, the apparent frame rate is set by inputting the numerical value R. In this case, it is desirable that the apparent frame rate Fmax / R is divisible, but if it is not divisible, an approximate integer may be set as the apparent frame rate by rounding down or rounding up the decimals.

また、本実施形態においては、フレームデータが取得される毎にバックグラウンド蛍光量を減算することとした。これにより、自家蛍光等を除去して、蛍光強度の高い部分を際だたせることができる。
これに代えて、最終的に得られた2次元蛍光画像からバックグラウンド蛍光量に数値Rを積算した値を減算することにしてもよい。このようにすることで、計算量を減らして同一の効果を得ることができる。
In the present embodiment, the background fluorescence amount is subtracted every time frame data is acquired. Thereby, autofluorescence etc. can be removed and a part with high fluorescence intensity can be made to stand out.
Instead of this, a value obtained by adding the numerical value R to the background fluorescence amount may be subtracted from the finally obtained two-dimensional fluorescence image. By doing in this way, the amount of calculation can be reduced and the same effect can be acquired.

また、本実施形態においては、フレームデータが取得される毎にフレームデータを数値R回積算して2次元蛍光画像を生成することとしたが、これに代えて、1ライン分のデータが取得される毎に、データを積算することにしてもよい。
この具体例について、図3を参照して説明する。この説明においては、図2のフローと共通する箇所には同一符号を付して説明を省略する。
In this embodiment, every time frame data is acquired, the frame data is integrated R times to generate a two-dimensional fluorescent image. Instead, data for one line is acquired. Data may be integrated each time.
A specific example will be described with reference to FIG. In this description, portions common to the flow in FIG.

具体的には、図3に示されるように、ステップS3’において、カウンタi,j.kが1に初期化される。走査部3は、レゾナント型スキャナ11によって数値R回分同一の走査ラインを走査した後に、ガルバノミラー12を間欠駆動して次の走査ラインに送ることを繰り返すように駆動される。   Specifically, as shown in FIG. 3, in step S3 ', counters i, j. k is initialized to 1. The scanning unit 3 is driven to repeatedly drive the galvano mirror 12 to the next scanning line after scanning the same scanning line by the numerical value R times by the resonant scanner 11.

ステップS5’において1ライン分のデータが取得された時点で、ステップS6においてバックグラウンド蛍光量が減算され、ステップS7’においてフレームバッファに1ライン分のデータが積算される。
1ライン分のデータが数値R=3セット取得されたか否かが判定され(ステップS8)、取得されていない場合には、カウンタjがインクリメントされてステップS5〜S7’が繰り返される。
When the data for one line is acquired in step S5 ′, the background fluorescence amount is subtracted in step S6, and the data for one line is integrated in the frame buffer in step S7 ′.
It is determined whether or not the numerical value R = 3 sets of data for one line has been acquired (step S8). If not acquired, the counter j is incremented and steps S5 to S7 ′ are repeated.

1ライン分のデータが3セット分取得された場合には、取得されたラインが最終ラインであるか否か(kが所定値であるか否か)が判定され(ステップS13)、最終ラインではない場合には、1ライン分のデータがフレームバッファに記憶されるとともに、カウンタkがインクリメントされて、カウンタjが1に初期化され(ステップS14)、ステップS5〜S8が繰り返される。   When three sets of data for one line have been acquired, it is determined whether or not the acquired line is the final line (whether or not k is a predetermined value) (step S13). If not, data for one line is stored in the frame buffer, the counter k is incremented, the counter j is initialized to 1 (step S14), and steps S5 to S8 are repeated.

一方、最終ラインである(kが所定値である)場合には、フレームバッファに記憶されているデータセットが、2次元蛍光画像として記憶部9に記憶される(ステップS10)。そして、取得したい2次元蛍光画像の数Nmaxが取得されたか否かが判定され(ステップS11)、取得されていない場合には、カウンタiがインクリメントされるとともに、カウンタj,kが1にリセットされ、かつ、フレームバッファが0に初期化されて(ステップS12’)、ステップS5’からのフローが繰り返される。
このようにすることで、数値R回積算される同一の走査ラインについて、時間間隔をあけずに取得されたデータが使用されるので、データ間における試料Aの移動が最小限に抑えられ、ライン毎の時間分解能の高い2次元蛍光画像を取得することができる。
On the other hand, if it is the last line (k is a predetermined value), the data set stored in the frame buffer is stored in the storage unit 9 as a two-dimensional fluorescent image (step S10). Then, it is determined whether or not the number Nmax of the two-dimensional fluorescent images desired to be acquired has been acquired (step S11). If not acquired, the counter i is incremented and the counters j and k are reset to 1. And the frame buffer is initialized to 0 (step S12 ′), and the flow from step S5 ′ is repeated.
In this way, since the data acquired without a time interval is used for the same scanning line that is accumulated R times, the movement of the sample A between the data can be minimized, and the line A two-dimensional fluorescence image with high temporal resolution can be acquired for each time.

また、走査部による走査範囲は、通常、観察しようとする領域を超えているので、図4に示されるように、観察しようとする領域からの蛍光を検出するタイミングに合わせて、レーザ光源2を駆動して、蛍光検出を行う期間のみにレーザ光を照射するようにすることが好ましい。このようにすることで、データを取得しない時間帯にレーザ光が試料Aに照射されることを防止して、試料Aに与えられるダメージを軽減することができる。   Further, since the scanning range by the scanning unit usually exceeds the region to be observed, as shown in FIG. 4, the laser light source 2 is adjusted in accordance with the timing of detecting the fluorescence from the region to be observed. It is preferable to drive and irradiate the laser beam only during the period of fluorescence detection. By doing so, it is possible to prevent the sample A from being irradiated with laser light during a time period when data is not acquired, and to reduce damage to the sample A.

また、上記実施形態においては、レゾナント型スキャナ11による往路および復路の両方におけるレーザ光の走査の際に検出されたデータを用いたが、図5(a),(b)に示されるように往路または復路のいずれかにおいて検出されたデータのみを用いることにしてもよい。このようにすることで、試料Aに対して照射するレーザ光の位置を一定に維持することができ、画素ずれを防止して分解能の高い2次元蛍光画像を取得することができるという利点がある。   In the above embodiment, the data detected during the scanning of the laser beam in both the forward path and the backward path by the resonant scanner 11 is used, but as shown in FIGS. 5A and 5B, the forward path is used. Alternatively, only data detected in any of the return paths may be used. By doing in this way, the position of the laser beam irradiated with respect to the sample A can be maintained constant, and there exists an advantage that a two-dimensional fluorescence image with high resolution can be acquired by preventing pixel shift. .

この場合には、レゾナント型スキャナ11による往路または復路のみにレーザ光を走査するので、見かけのフレームレートが偶数となる場合のみに適用することができる。例えば、上記の例において、Fmax=30フレーム/秒の場合には、R=3,R=5の場合に適用でき、その場合の見かけのフレームレートは10フレーム/秒および6フレーム/秒である。   In this case, since the laser beam is scanned only in the forward or backward path by the resonant scanner 11, it can be applied only when the apparent frame rate is an even number. For example, in the above example, when Fmax = 30 frames / second, it can be applied to R = 3 and R = 5, and the apparent frame rates in this case are 10 frames / second and 6 frames / second. .

また、本実施形態においては、レーザ光源2からの標準的なレーザ光強度Iexが記憶されていることとしたが、レーザ光強度は、上記フローの任意の時点において変更することができることが好ましく、得られた2次元蛍光画像が明るすぎる場合にはレーザ光強度Iexを低下させることにより、試料Aに照射するレーザ光の強度を低減して試料Aの健全性を維持することができる。   In the present embodiment, the standard laser light intensity Iex from the laser light source 2 is stored, but it is preferable that the laser light intensity can be changed at any point in the flow. If the obtained two-dimensional fluorescent image is too bright, the laser beam intensity Iex is decreased, whereby the intensity of the laser beam irradiated onto the sample A can be reduced and the soundness of the sample A can be maintained.

また、図6および図7に示されるように、制御部8が、標準的なレーザ光強度Iexを数値Rで除算した強度のレーザ光が射出されるようにレーザ光源2を制御することにしてもよい(ステップS15)。このようにすることで、数値Rが入力されて、レゾナント型スキャナ11の定格周波数より低い任意のフレームレートが設定されても、同等の明るさの2次元蛍光画像を取得することができるという利点がある。   Also, as shown in FIGS. 6 and 7, the control unit 8 controls the laser light source 2 so that the laser beam having the intensity obtained by dividing the standard laser beam intensity Iex by the numerical value R is emitted. (Step S15). In this way, even if the numerical value R is input and an arbitrary frame rate lower than the rated frequency of the resonant scanner 11 is set, a two-dimensional fluorescent image with the same brightness can be obtained. There is.

A 試料
R 数値(回数)
1 走査型顕微鏡
2 レーザ光源(光源)
3 走査部
7 光検出部
8 制御部(画像生成部、光量設定部、光量調節部、バックグラウンド設定部)
10 入力部(フレームレート設定部)
11 レゾナント型スキャナ
A Sample R Numerical value (number of times)
1 Scanning microscope 2 Laser light source (light source)
3 Scanning unit 7 Light detection unit 8 Control unit (image generation unit, light amount setting unit, light amount adjustment unit, background setting unit)
10 Input section (frame rate setting section)
11 Resonant scanner

Claims (5)

光源からの照明光を走査するレゾナント型スキャナを含む走査部と、該走査部により走査された照明光が照射されることによる試料からの戻り光を検出する光検出部と、該光検出部により検出された戻り光の光量と前記走査部による照明光の走査位置情報とに基づいて2次元画像を生成する画像生成部と、フレームレートを設定するフレームレート設定部と、前記光源から発せられる照明光の光量を設定する光量設定部と、光量調節部とを備え、
前記画像生成部が、前記フレームレート設定部により設定されたフレームレートにより最大フレームレートを除算して得られた回数だけ前記光検出部により順次検出された同一走査位置の戻り光の光量を積算して2次元画像を生成し、
前記光量調節部が、前記光量設定部により設定された光量を前記回数で除算した光量となるように、前記試料に照射される照明光の光量を調節する走査型顕微鏡。
A scanning unit including a resonant scanner that scans illumination light from a light source, a light detection unit that detects return light from a sample by irradiation of illumination light scanned by the scanning unit, and the light detection unit. An image generation unit that generates a two-dimensional image based on the amount of detected return light and scanning position information of illumination light by the scanning unit, a frame rate setting unit that sets a frame rate, and illumination emitted from the light source A light amount setting unit for setting the light amount of light, and a light amount adjustment unit ;
The image generation unit integrates the amount of return light at the same scanning position sequentially detected by the light detection unit by the number of times obtained by dividing the maximum frame rate by the frame rate set by the frame rate setting unit. To generate a two-dimensional image ,
The scanning microscope which adjusts the light quantity of the illumination light with which the said light quantity adjustment part irradiates the said sample so that it may become the light quantity which divided the light quantity set by the said light quantity setting part by the said frequency | count .
前記画像生成部が、前記レゾナント型スキャナによる往動作時または復動作時のいずれかに前記光検出部により検出された同一走査位置の戻り光の光量を積算して2次元画像を生成する請求項1に記載の走査型顕微鏡。 Claims wherein the image generation unit generates a two-dimensional image by integrating the light intensity of the resonant scanner of the same scan position detected by the light detection unit to either the time or backward operation during forward operation by returning light 2. A scanning microscope according to 1. バックグラウンド光量を設定するバックグラウンド設定部と、
前記画像生成部が、積算して得られる戻り光の光量から前記バックグラウンド光量に前記回数を乗算した光量を減算して2次元画像を生成する請求項1または請求項2に記載の走査型顕微鏡。
A background setting unit for setting the background light intensity;
The scanning microscope according to claim 1 , wherein the image generation unit generates a two-dimensional image by subtracting a light amount obtained by multiplying the background light amount by the number of times from a return light amount obtained by integration. .
前記走査部が、各フレームで前記レゾナント型スキャナによる照明光の走査ラインを全て異ならせるように駆動され、
前記画像生成部が、複数フレーム毎に前記戻り光の光量を積算する請求項1に記載の走査型顕微鏡。
The scanning unit is driven so that all scanning lines of illumination light from the resonant scanner are different in each frame ,
The scanning microscope according to claim 1, wherein the image generation unit integrates the amount of the return light for each of a plurality of frames.
前記走査部が、前記レゾナント型スキャナによる照明光の走査ラインを前記回数分の走査毎に異ならせるように駆動され、
前記画像生成部が、ライン毎に前記戻り光の光量を積算する請求項1に記載の走査型顕微鏡。
The scanning unit is driven so as to change the scanning line of the illumination light by the resonant scanner for each scan of the number of times,
The scanning microscope according to claim 1, wherein the image generation unit integrates the amount of the return light for each line.
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