JP5544548B2

JP5544548B2 - サーキュレータを有する走査型顕微鏡および共焦点走査型顕微鏡

Info

Publication number: JP5544548B2
Application number: JP2001185233A
Authority: JP
Inventors: ユーゲン、ホフマン
Original assignee: Leica Microsystems CMS GmbH
Current assignee: Leica Microsystems CMS GmbH
Priority date: 2000-06-28
Filing date: 2001-06-19
Publication date: 2014-07-09
Anticipated expiration: 2021-06-19
Also published as: DE10031458B4; US6492638B2; US20020020815A1; GB2369192A; GB0113359D0; GB2369192B; DE10031458A1; JP2002122786A

Description

本発明は、少なくとも１つの照射源、対物レンズおよび少なくとも１つの検出器を有する走査型顕微鏡に関する。さらに本発明は、共焦点走査型顕微鏡にも関する。

走査型顕微鏡法において、試料から発せられる反射光または蛍光を観測するために、試料は光ビームによって照射される。照射光ビームの焦点は一般に、２つのミラーを傾斜することによって試料面で移動され、偏向軸は一般に互いに垂直を成し、一方のミラーがＸ方向に移動し、他方のミラーがＹ方向に移動する。ミラーの傾斜は、たとえば、検流計位置決め素子を用いて実現される。高速の共振検流計も低速（かつ精度の高い）非共振検流計も用いられる。試料から届く光の出力レベルは、走査ビームの位置の関数として測定される。

走査型顕微鏡の一般的な構成は、ＪａｍｅｓＢ．Ｐａｗｌｅｙ「ＨａｎｄｂｏｏｋｏｆＢｉｏｌｏｇｉｃａｌＣｏｎｆｏｃａｌＭｉｃｒｏｓｃｏｐｙ」１９９０，ＰｌｅｎｕｍＰｒｅｓｓ，ＮｅｗＹｏｒｋのテキストに開示されている。共焦点顕微鏡法の原理は、たとえば、４〜７頁（Ｐａｗｌｅｙのテキストの図２参照）に記載されている。本願明細書では、試料は、正確に焦点を結ぶ光ビームを用いて走査される。試料から生じる光は、ビームスプリッタを通過して、検出器に達する。その前には入射ピンホールが置かれている。

特に共焦点走査型顕微鏡法において、試料は、光ビームの焦点に用いて３次元で走査される。共焦点走査型顕微鏡は一般に、光源、光源の光が絞り（「励起絞り」と呼ぶ）の上に集束される集束光学系、ビームスプリッタ、ビームを制御するための走査装置、顕微鏡光学系、検出絞り、検出光または蛍光を検出するための検出器を具備する。照射光は、主ビームスプリッタによって結合される。試料から来る蛍光または反射光は、同一の走査ミラーによって、主ビームスプリッタに戻り、主ビームスプリッタを通ってから、背後に検出器（通常は光電子増倍管）が位置する検出絞りに集束される。集束領域から直接届かない検出光は、異なる光路をとり、検出絞りを通過しないため、点データを生じ、試料の連続走査によって３次元画像を生ずる。３次元画像は一般に、層を成している画像データを記録することによって実現される。

発明が解決しようとする課題

ストークスシフトのために、励起光および検出光の波長が異なることから、２色主ビームスプリッタは一般に、蛍光を観測するために使用される。２色主ビームスプリッタは、照射光が直角に偏向されるのに対し、検出光は妨害されることなく通過することができるように設計される。この配置構成では、実質的な損失は生じない。

試料（たとえばいくつかの染料で調製されたもの）がいくつかの波長の光によって同時に照射される場合、または検出光が多色光である場合には、２色ビームスプリッタを用いることができない。２色ビームスプリッタは、特に、励起光および検出光が同一波長である反射顕微鏡法には適していない。このような状態では、広帯域ビームスプリッタが用いられる。

今度は、走査型顕微鏡法におけるビームスプリッタの利用に関連する問題について説明する。用いられるビームスプリッタが偏光ビームスプリッタまたは単色光ビームスプリッタでない場合には、励起光または検出光の相当の損失が生じる。５０：５０ビームスプリッタが用いられる場合には、励起光の５０％のみが試料に達する。試料で全反射されると仮定した場合でも、検出器に達するのはその５０％（すなわち照射光出力の２５％）にすぎない。９０：１０ビームスプリッタを使用することによって、検出光の損失を１０％まで低減することができるが、これは結果として励起光の９０％の損失を生じる。したがって、十分な励起光出力が利用できる場合に限って、この解決法は実用的である。しかし、たとえば青色レーザダイオードなどのある種の光源では、光出力がきわめて制限されている。

本発明の目的は、走査型顕微鏡法または共焦点走査型顕微鏡において、主ビームスプリッタでの励起光または検出光の損失を除去することにある。

課題を解決するための手段および作用効果

請求項１に対応する発明では、少なくとも１つの照射源（４）、対物レンズ（１０）および少なくとも１つの検出器（１２）を有する走査型顕微鏡（１００）であって、前記少なくとも１つの照射源（４）と前記対物レンズ（１０）との間かつ前記対物レンズ（１０）と前記少なくとも１つの検出器（１２）との間に光サーキュレータ（１４）が配置されることと、前記光サーキュレータ（１４）が、前記照射源（４）から供給される光を、検査対象である試料（１１）に向けて配置される前記対物レンズ（１０）へ伝送し、前記試料（１１）から前記検出器（１２）まで進めることと、前記光サーキュレータ（１４）が、少なくとも１つの照射源（４）用の少なくとも１つの入力（１）と、前記対物レンズ（１０）に向けて光を出力するとともに前記対物レンズ（１０）から進む光を入力する出入力（２）と、前記少なくとも１つの検出器（１２）に光を出力する個別の出力（３）と、を有することと、前記光サーキュレータ（１４）が、前記試料から進む光をスペクトルによって内部で分離し、対応する前記検出器（１２）に個別に分離したスペクトル成分を伝送することとを特徴としている。

さらに、請求項４に対応する発明では、少なくとも１つの照射源（４）、対物レンズ（１０）および少なくとも１つの検出器（１２）を有する共焦点走査型顕微鏡（１００）であって、前記少なくとも１つの照射源（４）と前記対物レンズ（１０）との間かつ前記対物レンズ（１０）と前記少なくとも１つの検出器（１２）との間に光サーキュレータ（１４）が配置されることと、前記光サーキュレータ（１４）が、前記照射源（４）から供給される光を、検査対象である試料（１１）に向けて配置される前記対物レンズ（１０）へ伝送し、前記試料（１１）から前記検出器（１２）まで進めることと、前記光サーキュレータ（１４）が、少なくとも１つの照射源（４）用の少なくとも１つの入力（１）と、前記対物レンズ（１０）に向けて光を出力するとともに前記対物レンズ（１０）から進む光を入力する出入力（２）と、前記少なくとも１つの検出器（１２）に光を出力する個別の出力（３）と、を有することと、前記光サーキュレータ（１４）が、前記試料から進む光をスペクトルによって内部で分離し、対応する前記検出器（１２）に個別に分離したスペクトル成分を伝送することとを特徴とし、前記少なくとも１つの検出器（１２）の前に配置される検出絞り（２３）を有することを特徴としている。

本発明の利点は、ビームスプリッタがサーキュレータで置き換えていることである。サーキュレータは、マイクロ波技術によって長い間知られている。光サーキュレータは一般に、ファラデー効果またはコットン−ムートン効果に基づいて動作する磁気光学構成要素である。原理において関連がある構成要素の一例が、光を１つの方向のみに通過させることができる光アイソレータである。他方、サーキュレータは、たった２つの入力ではなく、３つ以上の入力を有し、円形の方式で共に結合している。入力１，２，３を有するサーキュレータの場合には、たとえば、入力１に結合される光は、入力２から戻ってくる。入力２に結合される光は、入力３を通ってサーキュレータから出てくる。

顕微鏡装置の場合には、照射光源は入力１に、試料は入力２、検出器は入力３に関連するとすれば、サーキュレータは、完全にかつほとんど損失のない（わずかの挿入減衰は除く）方式で主ビームスプリッタの役目を果たす。

ビームスプリッタの反射率または透過率は一般に、偏光に左右される。高品質のビームスプリッタであっても完全に最適化することはできない。それゆえ、Ｓ偏光およびＰ偏光に関して反射および透過の挙動に差が常に生じる。特に光がグラスファイバによって結合される際によく起こる照射光の直線偏光方向が変動する場合には、試料において照射光の変動が生じる。

現在利用可能なサーキュレータは偏光に独立に作用するため、上記のような問題は発生しない。現在利用可能なサーキュレータのデータシートは、偏光不変性を明らかに実証している。

特に、光ファイバサーキュレータを用いることができる。具体的な実施形態として、試料に関連する出力にあるファイバ端は、照射絞りとしても検出絞りとしても作用することが可能である。スペクトルに関して広帯域のサーキュレータを用いることが好ましい。

図１は、既存技術の走査型顕微鏡１００を示している。走査型顕微鏡１００の構成は、大体は照射光ビーム５を発生する光源４を具備する。照射光ビーム５は、照射絞り６を通って主ビームスプリッタ８に達する。光源４の光は、主ビームスプリッタ８から走査器９に達する。走査器９は、それを用いて、検査する対象である試料１１が走査光ビーム２４によって所望の態様で走査されることができるように構成される。走査光ビーム２４は、対物レンズ１０を通って検査対象である試料１１へと進む。同様の方式で、試料１１から戻る検出光ビーム１３は、対物レンズ１０によって走査器９に結像する。検出光ビーム１３は、走査器９から進み、主ビームスプリッタ８を通過する。検出絞り７は、検出光ビーム１３において主ビームスプリッタ８の後に配置される検出器１２の前に設けられる。主ビームスプリッタ８の利用の問題点および欠点については、すでに序論で述べたため、ここではさらに説明する必要がない。

以下の説明において、同一の参照符号は、同一の素子に用いられる。図２は、主ビームスプリッタの代わりに光サーキュレータ１４を用いる走査型顕微鏡１００を示している。ここに示される具体的な実施形態において、光サーキュレータ１４は、入力１、出力／入力２、出力３を有する。光源４は照射光ビーム５を発生し、照射光ビーム５は光サーキュレータ１４の入力１へ向かう。照射光ビーム５は照射絞り６によって所望の径となる。次に、照射光ビーム５の光は、出力／入力２を通って光サーキュレータ１４から出る。出力／入力２から出てくる光は、走査光ビーム２４を規定する。走査光ビーム２４は、走査器９に当たり、そこから対物レンズ１０を通過して試料１１に達する。試料１１から反射される光は、試料１１から対物レンズ１０および走査器を通過して、光サーキュレータ１４の出力／入力２に達する検出光ビーム２５を規定する。この光は、光サーキュレータ１４によって出力３へと向かい、そこから出て検出器１２へと進む。検出絞り７が検出器１２の前に配置される。走査型顕微鏡法においてピンホールとしての検出絞り７の働きは、当業者には十分に周知である。

図３は、別の実施形態を示している。入力１、出力／入力２、出力３はそれぞれ光導波光ファイバ１８，２０，１６に接続されている。サーキュレータ１４の第１の入力１に接続される光ファイバ１８は、入力１とは逆の先端にファイバ結合光学系１９を有する。サーキュレータ１４の出力／入力２に接続された光ファイバ２０は、出力／入力２とは逆の先端にファイバ結合光学系２２を有する。サーキュレータ１４の出力３に接続された光ファイバ１６は、出力３とは逆の先端にファイバ結合光学系１７を有する。光路は、図２の光路と同称である。唯一の相違は、光源４からの光がファイバ結合光学系１９を通して直接光ファイバ１８に結合されていることである。光サーキュレータ１４の第２の入力２における光は、同様にファイバ結合光学系２２を通して光ファイバ２０に結合され、光ファイバ２０から出てくる。同様の方式で、光サーキュレータの出力３において光ファイバ１６からの光は、ファイバ結合光学系１７を通して検出器１２へ直接向かう。ここに示される具体的な実施形態において、光サーキュレータの出力／入力２に接続される光ファイバ２０は、その径が照射絞りおよび検出絞りとして同時に見なされるべきファイバ端２１を規定する。

図４は、光サーキュレータ１４を有する走査型顕微鏡の別の具体的な実施形態を示している。照射・検出絞り２３が走査光ビーム２４および検出光ビーム２５のビーム経路に設けられる点が、図３に示された具体的な実施形態と異なる。照射・検出絞り２３は、光サーキュレータ１４の出力／入力２に接続される光ファイバ２０用のファイバ結合光学系２２と走査器９との間に配置される。図２および図３によって十分に理解されているため、走査型顕微鏡の他の基本的な素子について、ここではこれ以上述べる必要がない。

既存技術に対応したビームスプリッタを有する共焦点走査型顕微鏡を示している。光サーキュレータを有する走査型顕微鏡を示している。光ファイバサーキュレータを有する走査型顕微鏡を示しており、試料に面するファイバ端面は、同時に照射絞りおよび検出絞りとして作用する。光ファイバサーキュレータを有する走査型顕微鏡を示しており、照射絞りおよび検出絞りとして作用している絞りは、サーキュレータと走査器との間に位置している。

１入力、２出力／入力、３出力、４照射源、５照射光ビーム、６照射絞り、７検出絞り、８主ビームスプリッタ、９走査器、１０対物レンズ、１１試料、１２検出器、１３検出光ビーム、１４光サーキュレータ、１６光ファイバ、１７ファイバ結合光学系、１８光ファイバ、１９ファイバ結合光学系、２０光ファイバ、２１光ファイバ端（ファイバ結合光学系）、２２ファイバ結合光学系、２３照射・検出絞り、２４走査光ビーム、２５検出光ビーム、１００走査型顕微鏡

Claims

少なくとも１つの照射源（４）、対物レンズ（１０）および少なくとも１つの検出器（１２）を有する走査型顕微鏡（１００）であって、前記少なくとも１つの照射源（４）と前記対物レンズ（１０）との間かつ前記対物レンズ（１０）と前記少なくとも１つの検出器（１２）との間に光サーキュレータ（１４）が配置されることと、前記光サーキュレータ（１４）が、前記照射源（４）から供給される光を、検査対象である試料（１１）に向けて配置される前記対物レンズ（１０）へ伝送し、前記試料（１１）から前記検出器（１２）まで進めることと、前記光サーキュレータ（１４）が、少なくとも１つの照射源（４）用の少なくとも１つの入力（１）と、前記対物レンズ（１０）に向けて光を出力するとともに前記対物レンズ（１０）から進む光を入力する出入力（２）と、前記少なくとも１つの検出器（１２）に光を出力する個別の出力（３）と、を有することと、前記光サーキュレータ（１４）が、前記試料から進む光をスペクトルによって内部で分離し、対応する前記検出器（１２）に個別に分離したスペクトル成分を伝送することとを特徴とする、走査型顕微鏡（１００）。
前記光サーキュレータ（１４）が、偏光に独立に作用することを特徴とする請求項１に記載の走査型顕微鏡（１００）。
光ファイバ（１８,２０,１６）が、前記照射源（４）と前記光サーキュレータ（１４）の入力（１）との間、前記対物レンズ（１０）と前記光サーキュレータ（１４）の出入力（２）との間、前記検出器（１２）と前記光サーキュレータ（１４）の出力（３）との間に、それぞれ配置される請求項１または２に記載の走査型顕微鏡（１００）。
少なくとも１つの照射源（４）、対物レンズ（１０）および少なくとも１つの検出器（１２）を有する共焦点走査型顕微鏡（１００）であって、前記少なくとも１つの照射源（４）と前記対物レンズ（１０）との間かつ前記対物レンズ（１０）と前記少なくとも１つの検出器（１２）との間に光サーキュレータ（１４）が配置されることと、前記光サーキュレータ（１４）が、前記照射源（４）から供給される光を、検査対象である試料（１１）に向けて配置される前記対物レンズ（１０）へ伝送し、前記試料（１１）から前記検出器（１２）まで進めることと、前記光サーキュレータ（１４）が、少なくとも１つの照射源（４）用の少なくとも１つの入力（１）と、前記対物レンズ（１０）に向けて光を出力するとともに前記対物レンズ（１０）から進む光を入力する出入力（２）と、前記少なくとも１つの検出器（１２）に光を出力する個別の出力（３）と、を有することと、前記光サーキュレータ（１４）が、前記試料から進む光をスペクトルによって内部で分離し、対応する前記検出器（１２）に個別に分離したスペクトル成分を伝送することとを特徴とし、前記少なくとも１つの検出器（１２）の前に配置される検出絞り（２３）を有する共焦点走査型顕微鏡（１００）。