JP5513038B2 - 三次元細胞画像解析装置 - Google Patents

Description

本発明は、三次元の細胞画像を解析するための三次元細胞画像解析装置に関する。

従来、三次元の細胞画像を解析するための装置としては、次の非特許文献１に記載の細胞画像解析装置がある。

取り扱い説明書、「ＣＥＬＡＶＩＥＷ ＲＳ１００ 解析ソフトウェア操作編」、ver1.4、3-6〜3-18頁、発行者：オリンパス株式会社

三次元細胞画像の解析、さらにはこれらの時間変化の解析においては、解析に用いる細胞画像のデータ量が膨大になることから、効率よく、解析対象領域を特定することが求められる。つまり、データ量を極力少なくして、高速に、解析対象領域を特定する解析処理方法が望まれる。

しかし、従来の三次元細胞画像解析装置は、一般的に、三次元細胞画像データ中の解析対象領域を特定するには、三次元細胞画像データにおける全てのＸＹＺ座標領域に対し、輝度値の精査を行う必要がある。このため、解析対象領域の特定に際し、データ量が膨大化し、処理速度が遅くなっていた。

本発明は、このような従来の問題点に鑑みてなされたものであり、細胞質、細胞核あるいは、細胞小器官などが存在する解析対象領域の特定を、データ量を極力少なくして、高速に、実現することが可能な三次元細胞画像解析装置を提供することを目的としている。

上記目的を達成するため、本発明による三次元細胞画像解析装置は、三次元細胞画像解析システムにおいて、コンフォーカル蛍光顕微鏡で構成された三次元細胞画像撮像装置とともに備えられ、該三次元細胞画像撮像装置を用いて、試料に対する合焦位置をＺ方向に所定ピッチで連続的に変えて、各合焦位置における試料の像を撮像することにより、試料の合焦位置がＺ方向に所定ピッチで連続的に異なった状態でＺ方向に順に蓄積された、複数の二次元の細胞画像の集合体からなる三次元の細胞画像を解析する、コンピュータを備えた三次元細胞画像解析装置であって、前記コンピュータを、前記三次元の細胞画像をなす、前記Ｚ方向に順に蓄積された複数の二次元の細胞画像の集合体を用いて、各ＸＹ座標に対して所定の輝度値を持つＺ座標の集合体を示す二次元射影データを作成する二次元射影データ作成手段、前記二次元射影データ作成手段が作成した二次元射影データにおけるＺ座標の集合体において、Ｚ座標の値が互いにＸＹ方向に不連続となる領域を特定する不連続領域特定手段、前記不連続領域特定手段が特定した個々の領域のＸＹ方向への広がりを検出するサイズ検出手段、前記不連続領域特定手段が特定した個々の領域のＺ座標の平均値を算出するＺ座標平均値算出手段、として機能させる画像解析ソフトウェアを有し、前記二次元射影データ作成手段が作成した二次元射影データを用いて、前記不連続領域特定手段が前記個々の領域を特定し、前記サイズ検出手段及び前記Ｚ座標平均値算出手段が前記個々の領域のＸＹ方向への広がりとＺ座標の平均値を算出することにより、細胞自体あるいは、核、小器官などの三次元の細胞器官の領域を構築することを特徴としている。

また、本発明の三次元細胞画像解析装置においては、前記二次元射影データ作成手段は、前記Ｚ方向に順に蓄積された全ての二次元の細胞画像の輝度値を検出し、検出した輝度値を用いて、各ＸＹ座標に対して前記所定の輝度値として最大の輝度値を持つＺ座標を抽出し、抽出したＺ座標を用いて、各ＸＹの点に対して最大の輝度値を持つＺ座標の集合体を示す二次元射影データを作成するのが好ましい。

また、本発明の三次元細胞画像解析装置においては、前記二次元射影データ作成手段は、前記Ｚ方向に順に蓄積された全ての二次元の細胞画像の輝度値を検出し、検出した輝度値を用いて、各ＸＹ座標に対して前記所定の輝度値として任意の輝度値に最も近い輝度値を持つＺ座標を抽出し、抽出したＺ座標を用いて、各ＸＹ座標に対して任意の輝度値に最も近い輝度値を持つＺ座標の集合体を示す二次元射影データを作成するのが好ましい。

また、本発明の三次元細胞画像解析装置においては、前記二次元射影データ作成手段は、前記Ｚ方向に順に蓄積された全ての二次元の細胞画像の輝度値を検出し、検出した輝度値を用いて、各ＸＹ座標に対して前記所定の輝度値として任意の輝度値以上の輝度値を持つ少なくとも一つのＺ座標群を取得し、各ＸＹ座標に対して取得した各Ｚ座標群のうちの中心となるＺ座標を抽出し、抽出した中心となるＺ座標を用いて、各ＸＹ座標に対して任意の輝度値以上の輝度値を持つ各Ｚ座標群のうちの中心となるＺ座標の集合体を示す二次元射影データを作成するのが好ましい。

また、本発明の三次元細胞画像解析装置においては、前記二次元射影データ作成手段は、前記各ＸＹ座標に対して任意の輝度値以上の輝度値を持つ各Ｚ座標群のうちの中心となるＺ座標の集合体の個数を、前記各ＸＹ座標に対して任意の輝度値以上の輝度値を持つ各Ｚ座標群のうちの中心となるＺ座標の集合体を示す二次元射影データに付加するのが好ましい。

また、本発明の三次元細胞画像解析装置においては、前記二次元射影データ作成手段は、前記Ｚ方向に順に蓄積された全ての二次元の細胞画像の輝度値を検出し、前記所定の輝度値として任意の輝度値以上の輝度値を持つ少なくとも一つのＺ座標を取得し、取得したＺ座標の範囲において各ＸＹ座標に対してＺ方向に対する輝度値の変化量を算出し、算出した輝度値の変化量が極小又は極大となるＺ座標を抽出し、抽出したＺ座標を用いて、各ＸＹ座標に対して輝度値の変化量が極小又は極大となるＺ座標の集合体を示す二次元射影データを作成するのが好ましい。

また、本発明の三次元細胞画像解析装置においては、前記二次元射影データ作成手段は、前記各ＸＹ座標に対して輝度値の変化量が極小又は極大となるＺ座標の集合体の個数を、前記各ＸＹ座標に対して輝度値の変化量が極小又は極大となるＺ座標の集合体を示す二次元射影データに付加するのが好ましい。

本発明によれば、細胞質、細胞核あるいは、細胞小器官などが存在する位置情報を検出して、輝度値の精査を行う領域をあらかじめ絞り込むようにしたので、三次元細胞画像データを解析する際には、三次元細胞画像データにおける全てのＸＹＺ座標領域に対して、輝度データの精査を行うことなく、細胞小器官などが存在する解析対象領域を特定できる。このため、本発明によれば、細胞質、細胞核あるいは、細胞小器官などが存在する解析対象領域の特定を、データ量を極力少なくして、高速に、実現することが可能な三次元細胞画像解析装置が得られる。その結果、効率よく、三次元の細胞画像の解析、さらにはそれらの三次元の細胞画像の経時的な解析をすることが可能になる。

本発明の三次元細胞画像解析装置を用いた三次元細胞画像解析システムの全体構成の一例を示すブロック図である。 図１の三次元細胞画像解析システムにおける処理手順を示す図で、(a)は全体の処理の流れを概略的に示すフローチャート、(b)は図１の三次元細胞画像解析装置による解析及び出力処理の流れを示すフローチャートである。 本発明の参考例としての第一実施形態にかかる三次元細胞画像解析装置を用いた三次元細胞画像解析システムの全体構成を示すブロック図である。 第一実施形態の三次元細胞画像解析装置における三次元の細胞器官の領域の構築までの処理手順を示すフローチャートである。 第一実施形態の三次元細胞画像解析装置における三次元の細胞器官の領域の構築までの処理を模式的に示す説明図で、(a)は三次元の細胞画像におけるＺ方向に添う断面図、(b)は(a)の細胞画像を種類の異なる夫々の細胞器官の領域に分割した状態を示す図、(c)は(b)の状態から夫々の細胞器官の領域の中心部を検出した状態を示す図、(e)は(c)の状態から夫々の細胞器官の領域の境界部を検出した状態を示す図である。 第一実施形態の三次元細胞画像解析装置における中心部検出手段２ａ１の具体的な処理手順の一例を示すフローチャートである。 第一実施形態の三次元細胞画像解析装置における中心部検出手段２ａ１の具体的な処理手順の他の例を示すフローチャートである。 第一実施形態の三次元細胞画像解析装置における中心部検出手段２ａ１の具体的な処理手順のさらに他の例を示すフローチャートである。 第一実施形態の三次元細胞画像解析装置における境界部検出手段２ｂ１の具体的な処理手順の一例を示すフローチャートである。 第一実施形態の三次元細胞画像解析装置における境界部検出手段２ｂ１の具体的な処理手順の他の例を示すフローチャートである。 第一実施形態の変形例にかかる三次元細胞画像解析装置を備えた三次元細胞画像解析システムの全体構成を示すブロック図である。 本発明の第二実施形態にかかる三次元細胞画像解析装置を用いた三次元細胞画像解析システムの全体構成を示すブロック図である。 第二実施形態の三次元細胞画像解析装置における三次元の細胞器官の領域を構築するまでの処理手順を示すフローチャートである。 第二実施形態の三次元細胞画像解析装置において作成する二次元射影データを概念的に示す説明図で、(a)は三次元の細胞画像におけるＺ方向に添う断面図、図(b)は本実施形態の二次元射影データ作成手段を用いて、各ＸＹ座標に対して最大の輝度値を持つＺ座標の集合体を示す射影図である。 三次元細胞画像をなす、Ｚ方向に順に蓄積された複数の二次元の細胞画像の集合体から二次元射影データを作成する原理を概念的に示す説明図で、(a)は図１４(a)の細胞器官の領域Ａの一部の局所領域（領域Ｏ）における、Ｙ座標がＹ₅であるときのＺＸ面上での細胞画像の輝度値の一例を示す図、(b)は(a)におけるＹ座標がＹ₅であるときのＺＸ面上での細胞画像の輝度値の最大値をＸＹ面上に示す図、(c)は(a)におけるＹ座標がＹ₅であるときのＺＸ面上での細胞画像の輝度値が最大値となるＺ座標をＸＹ面上に示す図である。 第二実施形態の三次元細胞画像解析装置における二次元射影データ作成手段２ａ１’の具体的な処理手順の一例を示すフローチャートである。 第二実施形態の三次元細胞画像解析装置における二次元射影データ作成手段２ａ１’の具体的な処理手順の他の例を示すフローチャートである。 第二実施形態の三次元細胞画像解析装置における二次元射影データ作成手段２ａ１’の具体的な処理手順のさらに他の例を示すフローチャートである。 第二実施形態の三次元細胞画像解析装置における二次元射影データ作成手段２ａ１’の具体的な処理手順のさらに他の例を示すフローチャートである。 図１９の例の二次元射影データ作成手段２ａ１’の処理を模式的に示す説明図で、(a)は三次元細胞画像においてＺ方向に２つの細胞器官の領域が重なった状態を示すＺ方向に沿う断面図、(b)は(a)の三次元細胞画像をなす、Ｚ方向に順に蓄積された複数の二次元の細胞画像の集合体からＺ座標の集合体を示す二次元射影データを作成した状態を示す説明図、(c)は(a)の三次元細胞画像における重なった２つの細胞器官の領域に対し同一の所定のＸＹ座標を示す図、(d)は(c)に示すＸＹ座標上で一定の輝度値以上の輝度値が得られたＺ座標群を抽出した状態を示す図、(e)は(d)に示す各Ｚ座標群のうちの中心となるＺ座標の集合体の個数を示す二次元射影データを示す図である。 図１６の例の二次元射影データ作成手段２ａ１’のように輝度値が最大となるＺ座標の値を射影データとして、三次元の細胞画像をなす、Ｚ方向に順に蓄積された複数の二次元の細胞画像の集合体から二次元射影データを作成したときの射影データの説明図で、(a)は三次元細胞画像において大きさ又はＸＹ座標の位置が一部で異なる２つの細胞器官の領域がＺ方向に重なった状態を示すＺ方向に沿う断面図、(b)は(a)の三次元細胞画像をなす、Ｚ方向に順に蓄積された複数の二次元の細胞画像の集合体からＺ座標の集合体を示す二次元射影データを作成した状態の一例を示す説明図、(c)は(a)の三次元細胞画像をなす、Ｚ方向に順に蓄積された複数の二次元の細胞画像の集合体からＺ座標の集合体を示す二次元射影データを作成した状態の一例を示す説明図、(d)は三次元細胞画像において大きさ及びＸＹ座標の位置が同じ２つの細胞器官の領域がＺ方向に重なった状態を示すＺ方向に沿う断面図、(e)は(d)は(a)の三次元細胞画像をなす、Ｚ方向に順に蓄積された複数の二次元の細胞画像の集合体からＺ座標の集合体を示す二次元射影データを作成した状態の一例を示す説明図である。 第二実施形態の三次元細胞画像解析装置における二次元射影データ作成手段２ａ１’の具体的な処理手順のさらに他の例における一部の処理手順を示すフローチャートである。 図２２に示した処理に続く処理手順を示すフローチャートである。 図２２及び図２３の例の二次元射影データ作成手段２ａ１’の処理を模式的に示す説明図で、(a)は三次元細胞画像において中心部の輝度が低くなっている細胞器官の領域を示すＺ方向に沿う断面図、(b)は(a)の三次元細胞画像をなす、Ｚ方向に順に蓄積された複数の二次元の細胞画像の集合体から所定の輝度値以上の輝度値を持つＺ座標の集合体を示す二次元射影データを作成した状態を示す説明図、(c)は(a)の三次元細胞画像におけるＺ方向の輝度断面を示す図、(d)は(c)の輝度断面を用いて(a)の三次元細胞画像における細胞器官の領域の輝度値（又は輝度値の変化量）が極小となるＺ座標を抽出した状態を示す図、(e)は(d)に示す細胞器官の領域の輝度値（又は輝度値の変化量）が極小となるＺ座標を示す二次元射影データを示す図である。 第二実施形態の三次元細胞画像解析装置における二次元射影データ作成手段２ａ１’の具体的な処理手順のさらに他の例における、図２２に示した処理に続く処理手順を示すフローチャートである。

図１は本発明の三次元細胞画像解析装置を用いた三次元細胞画像解析システムの全体構成の一例を示すブロック図、図２は図１の三次元細胞画像解析システムにおける処理手順を示す図で、(a)は全体の処理の流れを概略的に示すフローチャート、(b)は図１の三次元細胞画像装置による解析及び出力処理の流れを示すフローチャートである。
図１の三次元細胞画像解析システムは、三次元細胞画像撮像装置１と第一実施形態の三次元細胞画像解析装置２を有する。
三次元細胞画像撮像装置１は、例えば、コンフォーカル顕微鏡で構成されており、観察光学系１ａと、撮像素子１ｂを有する。
観察光学系１ａは、光源、照明レンズ、複数種類の励起フィルタをターレット等に備えた励起光切換手段、対物レンズ、吸収フィルタ、結像レンズ、ピンホール等、一般的なコンフォーカル蛍光顕微鏡における照明光学系及び観察光学系（図示省略）で構成され、蛍光たんぱく質又は蛍光分子で標識された特定のたんぱく質の細胞内挙動を蛍光観察可能であるとともに、試料に対する合焦位置をＺ方向に所定ピッチで連続的に変えて、各合焦位置における試料の像を撮像素子１ｂの撮像面に結像する。
撮像素子１ｂは、観察光学系１ａを介して結像された細胞像を撮像する。
このように構成された三次元細胞画像撮像装置１を用いて、試料に対する合焦位置をＺ方向に所定ピッチで連続的に変えて、各合焦位置における試料の像を撮像することにより、試料の合焦位置がＺ方向に所定ピッチで連続的に異なった状態でＺ方向に順に蓄積された、複数の二次元の細胞画像の集合体からなる三次元の細胞画像が得られる。

三次元細胞画像解析装置２は、コンピュータと、画像解析ソフトウェアを備えて構成されている。
画像解析ソフトウェアは、コンピュータを、位置情報検出手段２ａ、三次元領域構築手段２ｂとして機能させるように構成されている。
位置情報検出手段２ａは、三次元の細胞画像をなす、Ｚ方向に順に蓄積された複数の二次元の細胞画像の集合体に対して、細胞自体あるいは、核、小器官など種類の異なる夫々の細胞器官の領域の所定の位置情報を検出する。
三次元領域構築手段２ｂは、三次元の細胞画像をなす、Ｚ方向に順に蓄積された複数の二次元の細胞画像の集合体に対して、位置情報検出手段２ａが検出した夫々の細胞器官の領域の所定の位置情報を用いて、三次元の細胞器官の領域を構築する。

また、図１の三次元画像解析装置では、画像解析ソフトウェアは、コンピュータを、さらに、特徴量抽出手段２ｃ、領域分類手段２ｄ、定量・出力手段２ｅとしても機能させるように構成されている。
特徴量抽出手段２ｃは、三次元領域構築手段２ｂを介して特定された三次元座標上での各細胞内領域に対して、各蛍光の輝度の総和、輝度の平均などの蛍光情報や、大きさ、位置、丸み度などの形態情報を、三次元座標上での各細胞内領域の特徴量として抽出する。
領域分類手段２ｄは、特徴量抽出手段２ｃを介して抽出された三次元座標上での各細胞内領域の特徴量に基づき、三次元座標上での各細胞内領域を細胞膜、核、小器官などに分類する。
定量・出力手段２ｅは、領域分類手段２ｄを介して分類された細胞内器官等の各細胞内領域における蛍光量を定量し、結果の出力を行う。

次に、このように構成された図１の三次元細胞画像解析システムを用いた細胞の撮像から画像解析までの全体の処理手順について説明する。
全体の処理は、図２(a)に示すように、三次元細胞画像撮像装置１による細胞像の撮像（ステップＳ１）、三次元細胞画像解析装置２による細胞画像の解析（ステップＳ２）、解析結果の出力（ステップＳ３）の順で行われる。

撮像処理段階（ステップＳ１）
撮像処理段階では、コンフォーカル顕微鏡で構成された三次元細胞画像撮像装置１の観察光学系１ａが、各チャネルの蛍光ごとに、試料に対する合焦位置をＺ方向に所定ピッチで連続的に変えて、各合焦位置における試料の像を結像し、撮像素子１ｂが観察光学系１ａを介して結像された細胞像を撮像する。

解析処理段階（ステップＳ２）
細胞器官の領域の位置情報の検出（ステップＳ２ ₁ ）
解析処理段階では、まず、位置情報検出手段２ａが、三次元の細胞画像をなす、Ｚ方向に順に蓄積された複数の二次元の細胞画像の集合体に対して、細胞自体あるいは、核、小器官など種類の異なる夫々の細胞器官の領域の所定の位置情報を検出する。

三次元の細胞器官の領域の構築（ステップＳ２ ₂ ）
次いで、三次元領域構築手段２ｂが、三次元の細胞画像をなす、Ｚ方向に順に蓄積された複数の二次元の細胞画像の集合体に対して、位置情報検出手段２ａを介して検出された夫々の細胞器官の領域の所定の位置情報を用いて、三次元座標上での細胞器官の領域を構築する。

三次元細胞内領域の特徴量抽出（ステップＳ２ ₃ ）
次いで、特徴量抽出手段２ｃが、三次元領域構築手段２ｂを介して特定された三次元座標上での各細胞内領域に対して、各蛍光の輝度の総和、輝度の平均などの蛍光情報や、大きさ、位置、丸み度などの形態的な情報を、三次元座標上での各細胞内領域の特徴量として抽出する。

三次元細胞内領域の分類（ステップＳ２ ₄ ）
次いで、領域分類手段２ｄが、あらかじめ操作者が設定した値に基づき、三次元座標上での各細胞内領域を、細胞膜、核、小器官などの細胞内器官等に分類する。あるいは、特徴量抽出手段を介して抽出された特徴量の統計的な分布を取得し、三次元座標上での各細胞内領域の特徴量に基づき、三次元座標上での各細胞内領域を、細胞膜、核、小器官などの細胞内器官等に分類する。

蛍光量の定量・出力（ステップＳ２ ₅ 、ステップＳ３）
次いで、定量・出力手段２ｅが、領域分類手段２ｄにより分類された細胞内器官等の各細胞内領域における蛍光量を定量する（ステップＳ２₅）。蛍光量の定量は、領域の総蛍光量、平均蛍光量、最大蛍光量、最小蛍光量や、あるいは、ドット（極小領域）として認識できる蛍光の数など、を測定することによって行う。
次いで、細胞内器官等に分類された個々の細胞内領域における蛍光情報、あるいは細胞内器官等に分類された細胞内領域ごとの特徴量の統計量（例えば、複数細胞膜の蛍光量の平均値）、さらにこれらの時間変化などを出力する（ステップＳ３）。

ここで、本発明の三次元細胞画像解析装置では、位置情報検出手段２ａが、三次元の細胞画像における夫々の細胞器官の位置情報を検出しておき、三次元領域構築手段２ｂが、位置情報検出手段２ａを介して検出された夫々の細胞器官の領域の所定の位置情報を用いて、三次元の細胞器官の領域を構築するので、三次元の細胞画像を解析する際、三次元の細胞画像における全てのＸＹＺ座標に対して輝度値の精査を行わずに済む。その結果、データ量を膨大化させることなく効率的に、少ない計算量で高速に、三次元の細胞器官の領域を特定することができる。

以下、本発明の三次元細胞画像解析装置における要部の構成及び効果を示す具体的な実施形態について、図面を用いて説明する。
第一実施形態
図３は本発明の参考例としての第一実施形態にかかる三次元細胞画像解析装置を用いた三次元細胞画像解析システムの全体構成を示すブロック図、図４は第一実施形態の三次元細胞画像解析装置における三次元の細胞器官の領域の構築までの処理手順を示すフローチャートである。図５は第一実施形態の三次元細胞画像解析装置における三次元の細胞器官の領域の構築までの処理を模式的に示す説明図で、(a)は三次元の細胞画像におけるＺ方向に添う断面図、(b)は(a)の細胞画像を種類の異なる夫々の細胞器官の領域に分割した状態を示す図、(c)は(b)の状態から夫々の細胞器官の領域の中心部を検出した状態を示す図、(e)は(c)の状態から夫々の細胞器官の領域の境界部を検出した状態を示す図である。なお、第一実施形態の三次元細胞画像解析装置を用いた三次元細胞画像解析システムにおける要部以外の構成であって図１に示した三次元細胞画像解析システムと同じ構成については同じ符号を付し、説明は省略する。

三次元細胞画像解析システムは、三次元細胞画像撮像装置１と第一実施形態の三次元細胞画像解析装置２を有する。
三次元細胞画像撮像装置１は、図１に示したものと同様に構成されている。
三次元細胞画像解析装置２は、コンピュータと、画像解析ソフトウェアを備えて構成されている。
画像解析ソフトウェアは、コンピュータを、位置情報検出手段としての中心部検出手段２ａ１、三次元領域構築手段としての境界部検出手段２ｂ１として機能させるように構成されている。
中心部検出手段２ａ１は、三次元の細胞画像をなす、Ｚ方向に順に蓄積された複数の二次元の細胞画像の集合体に対して、第１の輝度の閾値を用いて、細胞自体あるいは、核、小器官など種類の異なる夫々の細胞器官の領域に分割するとともに、分割した夫々の細胞器官の領域の中心部を検出するように構成されている。
境界部検出手段２ｂ１は、三次元の細胞画像をなす、Ｚ方向に順に蓄積された複数の二次元の細胞画像の集合体に対して、中心部検出手段２ａ１が検出した夫々の細胞器官の領域の中心部からその周囲に向けて、第２の輝度の閾値を用いて、該夫々の細胞器官の領域の境界部を検出するように構成されている。
そして、第一実施形態の三次元細胞画像解析装置２では、図４に示すように、図２(b)に示した細胞器官の領域の位置情報を検出するステップ（ステップＳ２₁）において、中心部検出手段２ａ１が、三次元細胞画像をなす、Ｚ方向に順に蓄積された複数の二次元の細胞画像の集合体データを用いて個々の細胞器官の領域の中心部を検出（ステップＳ２₁₀）する。また、図２(b)に示した三次元の細胞器官の領域を構築するステップ（ステップＳ２₂）において、境界部検出手段２ｂ１が、中心部検出手段２ａ１が検出した夫々の細胞器官の領域の中心部のデータを用いて、夫々の細胞器官の領域の境界部を検出する（ステップＳ２₂₁）。これにより、細胞自体あるいは、核、小器官などの三次元の細胞器官の領域が構築される。

ここで、中心部検出手段２ａ１、境界部検出手段２ｂ１の機能について、より詳しく説明する。
中心部検出手段２ａ１は、三次元の細胞画像（図５(a)）を構成している、Ｚ方向に順に蓄積された夫々の二次元の細胞画像に対して、第１の輝度の閾値以上であり、且つ、Ｘ，Ｙ，Ｚのいずれかの方向に近接する領域同士を同じ種類の細胞器官の領域として検出するとともに、第１の輝度の閾値以上であり、且つ、Ｘ，Ｙ，Ｚのいずれの方向にも近接しない領域同士を異なる種類の細胞器官の領域として検出する。そして、これらの処理をＺ方向に順に蓄積されたすべての二次元の細胞画像に対して行い、Ｚ方向に順に蓄積された夫々の二次元の細胞画像において同じ種類の細胞器官として検出した領域の座標の集合体（図５(b)）を用いて、三次元の細胞画像における個々の細胞器官の領域の中心部（図５(c)）を検出する。

例えば、中心部検出手段２ａ１は、三次元細胞画像データを構成する夫々の二次元の細胞画像における、各ＸＹ座標上の輝度値が第１の輝度の閾値以上となっている領域を“１”、それ以外の領域を“０”として出力する。次いで、その二次元の細胞画像において、“１”が出力される領域であって、ＸＹ方向に近接する領域同士、及び、隣接する二次元の細胞画像同士において、“１”が出力される領域であって、Ｚ方向に近接する領域同士を同じ種類の細胞器官の領域として検出する。また、これにより、その二次元の細胞画像において、“１”が出力される領域であって、Ｘ，Ｙ，Ｚのいずれの方向にも近接しない領域同士が異なる種類の細胞器官の領域として検出される。そして、これらの処理をＺ方向に順に蓄積されたすべての二次元の細胞画像に対して行う。
これにより、三次元細胞画像データから個々の細胞器官の領域が絞り込まれる。

次いで、中心部検出手段２ａは、Ｚ方向に順に蓄積された夫々の二次元の細胞画像において同じ種類の細胞器官として検出した領域の座標の集合体における重心座標を、三次元の細胞画像における個々の細胞器官の領域の中心部として検出する。
これにより、三次元の細胞画像に対して、細胞自体あるいは、核、小器官など種類の異なる夫々の細胞器官の領域の所定の位置情報として、三次元の細胞画像における個々の細胞器官の領域の中心部が抽出される。

図６は第一実施形態の三次元細胞画像解析装置における中心部検出手段２ａ１の具体的な処理手順の一例を示すフローチャートである。
図６の例では、中心部検出手段２ａ１は、三次元細胞画像をなす、Ｚ方向に順に蓄積された複数の二次元の細胞画像の集合体データからＺ方向に蓄積されている二次元細胞画像データを抽出する（ステップＳ１２）。次いで、抽出画像があるか否かをチェックする（ステップＳ１３）。抽出画像がある場合、抽出した二次元細胞画像における各ＸＹ座標の輝度値を第１の輝度の閾値と比較し、第１の輝度の閾値以上のＸＹ座標を抽出する（ステップＳ１４）。次いで、抽出したＸＹ座標のうち、互いに近接するＸＹ座標同士を同じ種類の細胞器官の領域として検出する（ステップＳ１５）。次いで、現在抽出している二次元細胞画像が２番目以降の画像であるか否かをチェックする（ステップＳ１６）。２番目以降の画像である場合、その一つ前の二次元細胞画像において夫々の種類の細胞器官の領域として検出したＸＹ座標と、現在抽出している二次元細胞画像において夫々の種類の細胞器官の領域として検出したＸＹ座標とで、Ｚ方向に互いに近接する座標同士を同じ種類の細胞器官の領域として検出する（ステップＳ１７）。そして、これらの処理をＺ方向に順に蓄積されたすべての二次元の細胞画像に対して行う（ステップＳ１１〜ステップＳ１８）。次いで、検出した夫々の種類の細胞器官の領域の座標の集合体の重心座標を、三次元細胞画像における個々の細胞器官の領域の中心部として検出する（ステップＳ１９）。

ところで、一般に、観察対象となる細胞領域は、一定の輝度値を持つとは限らない。通常は、実験条件や撮像条件等により、或いは時間の経過によって、輝度値が変化する。このため、上述のように、第１の輝度の閾値により“１”と“０”の領域に分けて、個々の細胞器官の領域を認識させるようにする構成においては、実験条件や撮像条件、或いは時間の経過によって、細胞器官の領域の輝度が大きく変化した場合、細胞器官の領域の大きさや形状を誤認識してしまうという問題がある。

また、この構成においては、輝度の染色ムラなどの、局所的に輝度が高くなったり、低くなったりするという現象に対応できず、単一の領域を複数の領域と誤認識してしまう問題もある。

そこで、このような誤認識の問題を除去するために、中心部検出手段２ａ１は、例えば、図７のフローチャートに示すように、三次元の細胞画像をなす、Ｚ方向に順に蓄積された複数の二次元の細胞画像の集合体に対して第１の輝度の閾値を用いて複数の領域に分割する際に、三次元の細胞画像の輝度値を二次元又は三次元の所定の局所領域ごとに平均化するように構成するのが好ましい。

図７は第一実施形態の三次元細胞画像解析装置における中心部検出手段２ａ１の具体的な処理手順の他の例を示すフローチャートである。
図７の例では、中心部検出手段２ａ１は、三次元細胞画像をなす、Ｚ方向に順に蓄積された複数の二次元の細胞画像の集合体データからＺ方向に蓄積されている二次元細胞画像データを抽出する（ステップＳ１２'）。次いで、抽出画像があるか否かをチェックする（ステップＳ１３'）。抽出画像がある場合、抽出した二次元細胞画像における各ＸＹ座標の輝度値を所定の局所領域ごとに平均化する（ステップＳ１４'）。次いで、抽出した二次元細胞画像における各ＸＹ座標の平均化した輝度値を第１の輝度の閾値と比較し、第１の輝度の閾値以上のＸＹ座標を抽出する（ステップＳ１５'）。
次いで、抽出したＸＹ座標のうち、互いに近接するＸＹ座標同士を同じ種類の細胞器官の領域として検出する（ステップＳ１６'）。次いで、現在抽出している二次元細胞画像が２番目以降の画像であるか否かをチェックする（ステップＳ１７'）。２番目以降の画像である場合、その一つ前の二次元細胞画像において夫々の種類の細胞器官の領域として検出したＸＹ座標と、現在抽出している二次元細胞画像において夫々の種類の細胞器官の領域として検出したＸＹ座標とで、Ｚ方向に互いに近接する座標同士を同じ種類の細胞器官の領域として検出する（ステップＳ１８'）。そして、これらの処理をＺ方向に順に蓄積されたすべての二次元の細胞画像に対して行う（ステップＳ１１'〜ステップＳ１９'）。次いで、検出した夫々の種類の細胞器官の領域の座標の集合体の重心座標を、三次元細胞画像における個々の細胞器官の領域の中心部として検出する（ステップＳ２０'）。

図７の例のように、中心部検出手段２ａ１を、三次元の細胞画像をなす、Ｚ方向に順に蓄積された複数の二次元の細胞画像の集合体に対して第１の輝度の閾値を用いて複数の領域に分割する際に、三次元の細胞画像の輝度値を二次元又は三次元の所定の局所領域ごとに平均化するように構成すれば、細胞画像の全体にわたって輝度の変化が小さくなり、同一の細胞器官の領域内において偶発的に輝度が大きく変化する画素領域が除かれる。このため、単一の細胞器官の領域を複数の細胞器官の領域として誤認識するおそれを除去することができる。

また、実験条件や撮像条件、時間変化などによって、輝度の絶対値は変化しても、個々の細胞器官の領域及びその背景の領域の相対的な輝度変化特性はそれほど変化しない。
このため、中心部検出手段２ａ１は、例えば、図８のフローチャートに示すように、三次元の細胞画像に対して所定の局所領域ごとに平均化した輝度値の変化量又は輝度値が極大又は極小となる座標又は座標領域を、三次元の細胞画像における個々の細胞器官の領域の中心部として検出するように構成するのが好ましい。

図８は第一実施形態の三次元細胞画像解析装置における中心部検出手段２ａ１の具体的なの処理手順のさらに他の例を示すフローチャートである。
図８の例では、中心部検出手段２ａ１は、三次元細胞画像をなす、Ｚ方向に順に蓄積された複数の二次元の細胞画像の集合体データからＺ方向に蓄積されている二次元細胞画像データを抽出する（ステップＳ１２"）。次いで、抽出画像があるか否かをチェックする（ステップＳ１３"）。抽出画像がある場合、抽出した二次元細胞画像における各ＸＹ座標の輝度値を所定の局所領域ごとに平均化する（ステップＳ１４"）。次いで、抽出した二次元細胞画像における各ＸＹ座標の平均化した輝度値を第１の輝度の閾値と比較し、第１の輝度の閾値以上のＸＹ座標を抽出する（ステップＳ１５"）。次いで、抽出したＸＹ座標のうち、互いに近接するＸＹ座標同士を同じ種類の細胞器官の領域として検出する（ステップＳ１６"）。次いで、現在抽出している二次元細胞画像が２番目以降の画像であるか否かをチェックする（ステップＳ１７"）。２番目以降の画像である場合、その一つ前の二次元細胞画像において夫々の種類の細胞器官の領域として検出したＸＹ座標と、現在抽出している二次元細胞画像において夫々の種類の細胞器官の領域として検出したＸＹ座標とで、Ｚ方向に互いに近接する座標同士を同じ種類の細胞器官の領域として検出する（ステップＳ１８"）。そして、これらの処理をＺ方向に順に蓄積されたすべての二次元の細胞画像に対して行う（ステップＳ１１"〜ステップＳ１９"）。次いで、検出した夫々の種類の細胞器官の領域の座標の集合体に対して所定の局所領域ごとに平均化した輝度値の変化量又は輝度値が極大又は極小となる座標又は座標の集合体を、三次元細胞画像における個々の細胞器官の領域の中心部として検出する（ステップＳ２０"）。

図８の例のようにすれば、細胞器官の領域の大きさや形状を誤認識するおそれを除去することができる。

また、経時的な解析を行う場合は、直前あるいは直後のすでに解析されたデータをもとに、それらの個々の細胞器官の領域の中心部を、現時点の解析における個々の細胞器官の領域の中心部として用いるようにしてもよい。
即ち、中心部検出手段２ａ１は、同一の試料を対象として経時的に得られる三次元の細胞画像を解析する場合において、異なる時間に得られた三次元の細胞画像における個々の細胞器官の領域の中心部を既に検出済みであるときに、既に検出済みのいずれかの三次元の細胞画像における個々の細胞器官の領域の中心部を、現在解析対象となっている三次元の細胞画像における個々の細胞器官の領域の中心部として検出するように構成してもよい。
このように構成すれば、時間変化によって、輝度の絶対値は変化しても、細胞器官の領域の大きさや形状を誤認識するおそれを除去することができる。また、細胞器官の領域の中心部の検出は、最初の１回（に要する時間）だけとなるので、全体の処理がさらに高速化する。

境界部検出手段２ｂ１は、例えば、図９のフローチャートに示すように、Ｚ方向に順に蓄積された二次元の細胞画像の集合体に対して、中心部検出手段２ａ１が検出した個々の細胞器官の領域の中心部からその周囲に向けて、第２の輝度の閾値以上であり、且つ、Ｘ，Ｙ，Ｚのいずれかの方向に連続する領域と、第２の輝度の閾値を下回る領域との境界を、三次元の細胞画像における個々の細胞器官の領域の境界部（図５(d)）として検出する。
第２の輝度の閾値としては、例えば、第１の輝度の閾値と同じ値を用いることができる。

図９は第一実施形態の三次元細胞画像解析装置における境界部検出手段２ｂ１の具体的な処理手順の一例を示すフローチャートである。
図９の例では、境界部検出手段２ｂ１は、Ｚ方向に順に蓄積された二次元細胞画像の集合体において、中心部検出手段２ａ１が検出した個々の細胞器官の領域の中心部のうちの一つの細胞器官の領域の中心部に、Ｚ座標が位置する二次元細胞画像データを抽出する（ステップＳ１１”’）。次いで、抽出した二次元細胞画像における当該細胞器官の領域の中心部からその周囲に向けて順にＸＹ座標の輝度を第２の輝度の閾値と比較し、第２の輝度の閾値以上であり、且つ、ＸＹ方向に連続する座標の領域と、第２の輝度の閾値を下回る座標の領域との境界を二次元細胞画像における当該細胞器官の領域の境界部として検出する（ステップＳ１２”’）。次いで、Ｚ方向に順に蓄積された二次元細胞画像の集合体において、現在、抽出している二次元細胞画像データに前後して蓄積された二次元細胞画像データを抽出する（ステップＳ１３”’）。次いで、抽出画像があるか否かをチェックする（ステップＳ１４”’）。抽出画像がある場合、現在抽出している二次元細胞画像において、該二次元細胞画像の直前に検出した二次元細胞画像における当該細胞器官の境界部内のＸＹ座標に対応するＸＹ座標の領域からその周囲に向けて順にＸＹ座標の輝度を第２の輝度の閾値と比較し、第２の輝度の閾値以上であり、且つ、ＸＹ方向に連続するとともに、その一部が現在抽出している二次元細胞画像の直前に検出した二次元細胞画像における当該細胞器官の境界部とＺ方向に連続する座標の領域と、現在及び直前に抽出した二次元細胞画像における第２の輝度の閾値を下回る座標の領域との境界を現在抽出している二次元細胞画像における当該細胞器官の領域の境界部として検出する（ステップＳ１５”’）。次いで、全ての細胞器官の領域の境界部を検出したか否かをチェックする（ステップＳ１６”’）。境界部が未検出の細胞器官の領域が存在する場合、Ｚ方向に順に蓄積された二次元細胞画像の集合体において、中心部検出手段が検出した個々の細胞器官の領域の中心部のうちの次の細胞器官の領域の中心部に、Ｚ座標が位置する二次元細胞画像データを抽出する（ステップＳ１７”’）。以下、全ての細胞器官の領域の境界部を検出するまで、ステップＳ１２”’〜ステップＳ１７”’の処理を繰り返す。

あるいは、「細胞画像における細胞器官の領域の境界は、輝度変化が大きい」という特性を用いて、境界部検出手段２ｂ１は、例えば、図１０のフローチャートに示すように、第２の輝度の閾値として、輝度値の変化量の最大値を用い、Ｚ方向に順に蓄積された二次元の細胞画像の集合体を用いて、中心部検出手段２ａ１が検出した個々の細胞器官の領域の中心部からその周囲に向けて、１画素ずつ輝度値の変化量を計算し、計算した輝度値の変化量が第２の輝度の閾値を下回り、且つ、Ｘ，Ｙ，Ｚのいずれかの方向に連続する領域と、第２の輝度の閾値以上の領域との境界を、三次元の細胞画像における個々の細胞器官の領域の境界部として検出するようにしてもよい。

図１０は第一実施形態の三次元細胞画像解析装置における境界部検出手段２ｂ１の具体的な処理手順の他の例を示すフローチャートである。
図１０の例では、境界部検出手段２ｂ１は、Ｚ方向に順に蓄積された二次元細胞画像の集合体において、中心部検出手段２ａ１が検出した個々の細胞器官の領域の中心部のうちの一つの細胞器官の領域の中心部に、Ｚ座標が位置する二次元細胞画像データを抽出する（ステップＳ１１””）。次いで、抽出した二次元細胞画像における当該細胞器官の領域の中心部からその周囲に向けて、１画素ずつ輝度値の変化量を計算し、計算した輝度値の変化量を第２の輝度の閾値としての輝度値の変化量の最大値と比較し、計算した輝度値の変化量が第２の輝度の閾値を下回り、且つ、ＸＹ方向に連続する座標の領域と、第２の輝度の閾値以上の座標の領域との境界を、二次元細胞画像における当該細胞器官の領域の境界部として検出する（ステップＳ１２””）。次いで、Ｚ方向に順に蓄積された二次元細胞画像の集合体において、現在、抽出している二次元細胞画像データに前後して蓄積された二次元細胞画像データを抽出する（ステップＳ１３””）。次いで、抽出画像があるか否かをチェックする（ステップＳ１４””）。抽出画像がある場合、現在抽出している二次元細胞画像において、該二次元細胞画像の直前に検出した二次元細胞画像における当該細胞器官の境界部内のＸＹ座標に対応するＸＹ座標の領域からその周囲に向けて、１画素ずつ輝度値の変化量を計算し、計算した輝度値の変化量を第２の輝度の閾値としての輝度値の変化量の最大値と比較し、計算した輝度値の変化量が第２の輝度の閾値を下回り、且つ、ＸＹ方向に連続するとともに、その一部が現在抽出している二次元細胞画像の直前に検出した二次元細胞画像における当該細胞器官の境界部とＺ方向に連続する座標の領域と、現在及び直前に抽出した二次元細胞画像における第２の輝度の閾値を下回る座標の領域との境界を、現在抽出している二次元細胞画像における当該細胞器官の領域の境界部として検出する（ステップＳ１５””）。次いで、全ての細胞器官の領域の境界部を検出したか否かをチェックする（ステップＳ１６””）。境界部が未検出の細胞器官の領域が存在する場合、Ｚ方向に順に蓄積された二次元細胞画像の集合体において、中心部検出手段が検出した個々の細胞器官の領域の中心部のうちの次の細胞器官の領域の中心部に、Ｚ座標が位置する二次元細胞画像データを抽出する（ステップＳ１７””）。以下、全ての細胞器官の領域の境界部を検出するまで、ステップＳ１２””〜ステップＳ１７””の処理を繰り返す。

この構成は、特に、細胞領域内の輝度値が一定しないような場合に有効である。輝度の絶対値自体は変化が大きいが、細胞器官の領域の境界は、一般にある程度の輝度差を持って認識できるものであるから、この構成を用いれば、ほとんどの細胞器官の領域に対してその境界を抽出することが可能となる。

また、第一実施形態の細胞画像解析装置においては、画像解析ソフトウェアが、コンピュータを、さらに、境界部補正手段２ｂ２として機能させるとより好ましい。
図１１は第一実施形態の変形例にかかる三次元細胞画像解析装置を備えた三次元細胞画像解析システムの全体構成を示すブロック図である。なお、本変形例の三次元細胞画像解析装置を用いた三次元細胞画像解析システムにおける要部以外の構成であって図３に示した三次元細胞画像解析システムと同じ構成については同じ符号を付し、説明は省略する。

境界部補正手段２ｂ２は、境界部検出手段２ｂ１が検出した境界部の内側領域に、中心部検出手段２ａ１が検出した個々の細胞器官の領域の中心部が複数存在する場合に、これらの中心部同士の間における輝度値の変化量が最大となる領域を、三次元の細胞画像における個々の細胞器官の領域の境界部として補正する。

図３〜図１１に示した第一実施形態の三次元細胞画像解析装置によれば、三次元の細胞画像においてあらかじめ特徴的な構造を持つ領域の中心部を特定するようにしたので、三次元の細胞画像の解析において個々の三次元の細胞器官の領域を特定する際には、三次元の細胞画像における中心部の領域周辺の精査のみ行えば済む。そのため、従来の三次元細胞画像解析装置における三次元領域すべてを精査する一般的な方法に比べて、効率のよい画像解析処理が可能となる。
特に経時的な解析を行う場合、以前検出した細胞器官の領域の重心を中心部とするなどの方法により、効率よく個々の細胞器官の領域に対する経時的な解析を行うことができる。

また、個々の細胞器官の領域が近接している場合には、個々の細胞器官の領域の境界部が不明確な場合が多く、特に、複数の細胞器官の領域を単一の細胞器官の領域として誤認識することは、解析結果に与える悪影響が大きいため避けなくてはならない。
細胞画像内に境界部が存在するか否か？（即ち、細胞画像において領域を分割すべきか否か？）という判断は一般的に難しい。これに対し、存在するとわかっている境界部であれば、その領域内において最も輝度差が大きい画素領域等というように境界部を相対的に定義することが可能であるので、比較的容易にその境界部を探し出すことができる。
しかるに、第一実施形態の三次元細胞画像解析装置によれば、あらかじめ個々の細胞器官の領域の中心部を特定するようにしたので、個々の細胞器官の領域が近接している場合におけるこれらの細胞器官の領域の境界部を誤認識するおそれを除去することが可能となる。

第二実施形態
図１２は本発明の第二実施形態にかかる三次元細胞画像解析装置を用いた三次元細胞画像解析システムの全体構成を示すブロック図、図１３は第二実施形態の三次元細胞画像装置における三次元の細胞器官の領域を構築するまでの処理手順を示すフローチャートである。
図１４は第二実施形態の三次元細胞画像解析装置において作成する二次元射影データを概念的に示す説明図で、(a)は三次元の細胞画像におけるＺ方向に添う断面図、図(b)は本実施形態の二次元射影データ作成手段を用いて、各ＸＹ座標に対して最大の輝度値を持つＺ座標の集合体を示す射影図である。なお、第二実施形態の三次元細胞画像解析装置を用いた三次元細胞画像解析システムにおける要部以外の構成であって図１に示した三次元細胞画像解析システムと同じ構成については同じ符号を付し、説明は省略する。

三次元細胞画像解析システムは、三次元細胞画像撮像装置１と第二実施形態の三次元細胞画像解析装置２’を有する。
三次元細胞画像撮像装置１は、図１に示したものと同様に構成されている。
三次元細胞画像解析装置２’は、コンピュータと、画像解析ソフトウェアを備えて構成されている。
画像解析ソフトウェアは、コンピュータを、位置情報検出手段としての二次元射影データ作成手段２ａ１’、三次元領域構築手段としての不連続領域特定手段２ｂ１’、 サイズ検出手段２ｂ２’、Ｚ座標平均値算出手段２ｂ３’として機能させるように構成されている。
二次元射影データ作成手段２ａ１’は、三次元の細胞画像をなす、Ｚ方向に順に蓄積された複数の二次元の細胞画像の集合体を用いて各ＸＹ座標に対して所定の輝度値を持つＺ座標の集合体を示す二次元射影データを作成する。
不連続領域特定手段２ｂ１’は、二次元射影データ作成手段２ａ１’が作成した二次元射影データにおけるＺ座標の集合体において、Ｚ座標の値が互いにＸＹ方向に不連続となる領域を特定する。
サイズ検出手段２ｂ２’は、不連続領域特定手段２ｂ１’が特定した個々の領域のＸＹ方向への広がりを検出する。
Ｚ座標平均値算出手段２ｂ３’は、不連続領域特定手段２ｂ１が特定した個々の領域のＺ座標の平均値を算出する。
そして、第二実施形態の三次元細胞画像解析装置２’では、図１３に示すように、図２(b)に示した細胞器官の領域の位置情報を検出するステップ（ステップＳ２₁）において、二次元射影データ作成手段２ａ１’が、三次元細胞画像をなす、Ｚ方向に順に蓄積された複数の二次元の細胞画像の集合体データを用いて二次元射影データを作成する（ステップＳ２₁₁’）。また、図２(b)に示した三次元の細胞器官の領域を構築するステップ（ステップＳ２₂）において、不連続領域特定手段２ｂ１’が、二次元射影データ作成手段２ａ１’が作成した二次元射影データを用いて、個々の領域を特定（ステップＳ２₂₁’）し、次いで、サイズ検出手段２ｂ２’が、個々の領域のＸＹ方向への広がりを検出し（ステップＳ２₂₂’）、次いで、座標平均値算出手段２ｂ３’が、個々の領域のＺ座標の平均値を算出する（ステップＳ２₂₃’）。これにより、細胞自体あるいは、核、小器官などの三次元の細胞器官の領域が構築される。

ここで、二次元射影データ作成手段２ａ１’、不連続領域特定手段２ｂ１’、サイズ検出手段２ｂ２’、Ｚ座標平均値算出手段２ｂ３’の機能について、より詳しく説明する。
二次元射影データ作成手段２ａ１’は、Ｚ方向に順に蓄積された全ての二次元の細胞画像における輝度値を検出し、検出した輝度値を用いて各ＸＹ座標に対して所定の輝度値として最大の輝度値を持つＺ座標を抽出し、抽出したＺ座標を用いて、各ＸＹの点に対して最大の輝度値を持つＺ座標の集合体を示す二次元射影データを作成する。

三次元の細胞画像は、上述したように、試料の合焦位置がＺ方向に所定ピッチで連続的に異なった状態でＺ方向に順に蓄積された、複数の二次元の細胞画像の集合体からなる。図１４(a)はこの二次元の細胞画像の集合体におけるＺ方向に沿う断面を示したものである。ここで、図１４(a)においてＸＹ座標に対して輝度値が最大となるＺ座標の集合体をＸＹ面上に示したものが図１４(b)である。なお、図１４(b)では、便宜上、輝度値が最大となるＺ座標（Ｚ_n1，Ｚ_n2，Ｚ_n3）を各Ｚ座標の集合体ａ，ｂ，ｃに引出し線を付けて示し、また、輝度値が最大となるＺ座標を、図１４(a)における細胞器官の領域Ａ，Ｂ，Ｃのそれぞれにおける代表的な高さに位置する一つのＺ座標で示してある。実際の二次元射影データには、各Ｚ座標の集合体ａ，ｂ，ｃ内の各ＸＹ座標上に複数のＺ座標が示される。

この点に関し、図１５を用いてさらに詳しく説明する。
図１５は三次元細胞画像をなす、Ｚ方向に順に蓄積された複数の二次元の細胞画像の集合体から二次元射影データを作成する原理を概念的に示す説明図で、(a)は図１４(a)の細胞器官の領域Ａの一部の局所領域（領域Ｏ）における、Ｙ座標がＹ₅であるときのＺＸ面上での細胞画像の輝度値の一例を示す図、(b)は(a)におけるＹ座標がＹ₅であるときのＺＸ面上での細胞画像の輝度値の最大値をＸＹ面上に示す図、(c)は(a)におけるＹ座標がＹ₅であるときのＺＸ面上での細胞画像の輝度値が最大値となるＺ座標をＸＹ面上に示す図である。なお、図１５(a)における座標上に示される輝度値は、細胞器官Ａの領域の外側の輝度値を１として相対的に示してある。また、ここでは便宜上、図１５(a)に示されるＺ座標に輝度の最大値が存在し、図１５(a)に示されていないＺ座標には輝度の最大値が存在しないものとする。

図１５(a)に示す各Ｚ座標（Ｚ₁〜Ｚ₉）は、それぞれの二次元細胞画像に撮像されている試料（細胞）の合焦位置を示している。また、図１５(a)に示すＺＸ座標上の数値は、このようにＺ位置の異なる二次元細胞画像を蓄積してなる三次元細胞画像の領域Ｏに対し、Ｙ座標がＹ５であるときのＺＸ面の輝度値を示している。
図１５(a)の例の場合、同一のＸＹ座標上における輝度の最大値は、座標（Ｘ₁，Ｙ₅）においては“１”、座標（Ｘ₂，Ｙ₅）においては“９”、座標（Ｘ₃，Ｙ₅）においては“１０”、座標（Ｘ₄，Ｙ₅）においては“１０”、座標（Ｘ₅，Ｙ₅）においては“１１”、座標（Ｘ₆，Ｙ₅）においては“１１”、座標（Ｘ₇，Ｙ₅）においては“１１”、座標（Ｘ₈，Ｙ₅）においては“１１”、座標（Ｘ₉，Ｙ₅）においては“１１”、座標（Ｘ₁₀，Ｙ₅）においては“１１”となっている。
そこで、二次元射影データ作成手段２ａ１’は、まず、この三次元細胞画像における各ＸＹ座標上における輝度の最大値を検出する。
検出した輝度の最大値をＸＹ平面上に示すと図１５(b)のようになる。

また、図１５(a)の例の場合、夫々のＸＹ座標上において輝度値が最大となるＺ座標は、座標（Ｘ₁，Ｙ₅）においては不特定、座標（Ｘ₂，Ｙ₅）においては“Ｚ₄”，“Ｚ₅”、座標（Ｘ₃，Ｙ₅）においては“Ｚ₄”，“Ｚ₅”、座標（Ｘ₄，Ｙ₅）においては“Ｚ₄”〜“Ｚ₆”、座標（Ｘ₅，Ｙ₅）においては“Ｚ₅”、座標（Ｘ₆，Ｙ₅）においては“Ｚ₄”，“Ｚ₅”、座標（Ｘ₇，Ｙ₅）においては“Ｚ₄”〜“Ｚ₆”、座標（Ｘ₈，Ｙ₅）においては“Ｚ₃”〜“Ｚ₆”、座標（Ｘ₉，Ｙ₅）においては“Ｚ₃”〜“Ｚ₇”、座標（Ｘ₁₀，Ｙ₅）においては“Ｚ₃”〜“Ｚ₇”となっている。
そこで、二次元射影データ作成手段２ａ１’は、次いで、この三次元細胞画像における各ＸＹ座標上において輝度値が最大となるＺ座標を検出する。
検出した輝度値が最大となるＺ座標をＸＹ平面上に示すと図１５(c)のようになる。
二次元射影データ作成手段は、このようなＺ座標の作成を三次元細胞画像における全てのＸＹ座標に対して行う。これにより、各ＸＹの点に対して最大の輝度値を持つＺ座標の
集合体を示す二次元射影データが作成される。

図１６は第二実施形態の三次元細胞画像解析装置における二次元射影データ作成手段２ａ１'の具体的な処理手順の一例を示すフローチャートである。
図１６の例では、二次元射影データ作成手段２ａ１'は、三次元細胞画像をなす、Ｚ方向に順に蓄積された複数の二次元の細胞画像の集合体データからＺ方向に蓄積されている二次元細胞画像データを抽出する（ステップＳ２２）。次いで、抽出画像があるか否かをチェックする（ステップＳ２３）。抽出画像がある場合、現在抽出している二次元細胞画像が２番目以降の画像であるか否かをチェックする（ステップＳ２４）。現在抽出している二次元細胞画像が１番目の画像である場合、二次元細胞画像における各ＸＹ座標の輝度値及びＺ座標を、射影データ候補領域において対応するＸＹ座標の輝度値及びＺ座標の格納領域にセットし（ステップＳ２６）、次の二次元細胞画像データを対象として（ステップＳ２７）、ステップＳ２２〜ステップＳ２４の処理を繰り返す。現在抽出している二次元細胞画像が２番目以降の画像である場合、現在抽出している二次元細胞画像における各ＸＹ座標の輝度値と、現時点で射影データ候補領域にセットされている、各ＸＹ座標における輝度値とを比較する。そして、現在抽出している二次元細胞画像における各ＸＹ座標の輝度値の方が大きい場合、そのＸＹ座標の輝度値及びＺ座標を射影データ候補領域において対応するＸＹ座標の輝度値及びＺ座標の格納領域にセットする（ステップＳ２５）。そして、これらの処理をＺ方向に順に蓄積されたすべての二次元の細胞画像に対して行う（ステップＳ２１〜ステップＳ２７）。次いで、射影データ候補領域にセットされている各ＸＹ座標上でのＺ座標を用いて、各ＸＹ座標上に最大の輝度値を持つＺ座標の集合体を示す二次元射影データを作成する（ステップＳ２８）。

次に、不連続領域特定手段２ｂ１’について説明する。
上述したように、図１４は、細胞のＺ方向の断面図（図１４(a)）と、各ＸＹ座標にお
いてＺ方向に最大の輝度値を持つＺ座標の位置をＸＹ面上に射影した図（図１４(b)）を示している。
ここで、図１４(b)に示す射影画像上のａ，ｂ，ｃの領域は、図１４(a)に示すＺ方向の断面図の特定領域Ａ，Ｂ，Ｃにおける最大の輝度値を持つＺ座標を射影したものである。また、図１４(b)は、これらａ，ｂ，ｃの領域を取り囲むように細胞膜の領域ｄを示している。

ここで、細胞膜Ｄに対応した領域ｄは、最大の輝度値を持つＺ座標の値が細胞膜の構造に応じて、図１４(b)のＸＹ面上において連続的に変化する。

これに対して、細胞内の特定小器官Ａ，Ｂ，Ｃに対応した領域ａ，ｂ，ｃは、最大の輝度値を持つＺ座標の値を、それぞれ代表的な高さ付近のＺ座標の値として持ち、それらの領域の境界ではＺ座標の値はＸＹ方向に不連続となっている。

そこで、不連続領域特定手段２ｂ１’が、二次元射影データにおけるＺ座標の集合体において、Ｚ座標の値が互いにＸＹ方向に不連続となる領域を特定する。これにより、二次元射影データの領域が個々の細胞器官の領域に分割されることになる。

不連続領域特定手段２ｂ１’により、これら不連続面で分割した個々の細胞器官の領域ａ，ｂ，ｃに対し、サイズ検出手段２ｂ２’が、ＸＹ射影面上での広がりを検出する。

また、座標平均値算出手段２ｂ３’が、個々の細胞器官の領域ａ，ｂ，ｃにおけるＺ座標の平均値を算出する。
これにより、個々の細胞器官のおおよその高さ位置を知ることができる。

これらの情報をもとに、個々の細胞器官の領域（領域ａ，ｂ，ｃ）周辺近傍の三次元細胞画像データを詳細に解析することによって、正確な三次元の細胞器官の領域の構築が可能となる。
すなわち、ＸＹ平面上に射影されたＺ座標値を解析することで、特定小器官の存在する
おおよその領域を特定することが可能となり、この情報をもとに各領域の三次元領域の特定が可能となる。

第一実施形態の細胞画像解析装置のように、中心部検出手段２ａ１を用いて個々の細胞器官の領域の中心部を検出し、境界部検出手段２ｂ１が中心部から個々の細胞器官の境界部を検出することで、三次元の細胞領域を構築する構成の場合、例えば、隣接する領域の輝度値の変化が小さいときに、細胞領域を実際の大きさよりも大きく特定してしまうおそれが内在する。
これに対し、第二実施形態の細胞画像解析装置によれば、二次元射影データにおいて、あらかじめ細胞器官の領域のＸＹ方向の範囲がほぼ特定できるので、このＸＹ領域を参照
することによって細胞器官の領域を正確な大きさに特定した状態で、三次元の細胞器官の領域の構築が可能となる。

なお、図１６の例では、二次元射影データ作成手段２ａ１’は、最大輝度を持つＺ座標を二次元射影データを作成するように構成されているが、射影データとしては、次の変形例に示すものを用いてもよい。
例えば、二次元射影データ作成手段２ａ１’は、図１７のフローチャートに示すように、Ｚ方向に順に蓄積された全ての二次元の細胞画像における輝度値を検出し、各ＸＹ座標に対して前記所定の輝度値として任意の輝度値に最も近い輝度値を持つＺ座標の集合体を示す二次元射影データを作成するようにしてもよい。

図１７は第二実施形態の三次元細胞画像解析装置における二次元射影データ作成手段２ａ１'の具体的な処理手順の他の例を示すフローチャートである。
図１７の例では、二次元射影データ作成手段２ａ１'は、三次元細胞画像データをなす、Ｚ方向に順に蓄積された複数の二次元の細胞画像の集合体からＺ方向に蓄積されている二次元細胞画像データを抽出する（ステップＳ２２'）。次いで、抽出画像があるか否かをチェックする（ステップＳ２３'）。抽出画像がある場合、現在抽出している二次元細胞画像が２番目以降の画像であるか否かをチェックする（ステップＳ２４'）。現在抽出している二次元細胞画像が１番目の画像である場合、二次元細胞画像における各ＸＹ座標の輝度値及びＺ座標を、射影データ候補領域において対応するＸＹ座標の輝度値及びＺ座標の格納領域にセットし（ステップＳ２６'）、次の二次元細胞画像データを対象として（ステップＳ２７'）、ステップＳ２２'〜ステップＳ２４'の処理を繰り返す。現在抽出している二次元細胞画像が２番目以降の画像である場合、現在抽出している二次元細胞画像における各ＸＹ座標の輝度値と、現時点で射影データ候補領域にセットされている、各ＸＹ座標における輝度値とを、予め設定された任意の輝度値との近さの点で比較する。そして、現在抽出している二次元細胞画像における各ＸＹ座標の輝度値の方がこの任意の輝度値に近い場合、そのＸＹ座標の輝度値及びＺ座標を射影データ候補領域において対応するＸＹ座標の輝度値及びＺ座標の格納領域にセットする（ステップＳ２５'）。そして、これらの処理をＺ方向に順に蓄積されたすべての二次元の細胞画像に対して行う（ステップＳ２１'〜ステップＳ２７'）。次いで、射影データ候補領域にセットされている各ＸＹ座標上でのＺ座標を用いて、各ＸＹ座標上に任意の輝度値に最も近い輝度値を持つＺ座標の集合体を示す二次元射影データを作成する（ステップＳ２８'）。

また、例えば、二次元射影データ作成手段２ａ１’は、図１８のフローチャートに示すように、Ｚ方向に順に蓄積された全ての二次元の細胞画像における輝度値を検出し、各ＸＹ座標に対して前記所定の輝度値として任意の輝度値以上の輝度値を持つ複数のＺ座標の集合体を取得し、取得したＺ座標の集合体のうちの一つのＺ座標の集合体を抽出し、抽出したＺ座標の集合体を示す二次元射影データを作成するようにしてもよい。

図１８は第二実施形態の三次元細胞画像解析装置における二次元射影データ作成手段２ａ１’の具体的な処理手順のさらに他の例を示すフローチャートである。
図１８の例では、二次元射影データ作成手段２ａ１’は、三次元細胞画像をなす、Ｚ方向に順に蓄積された複数の二次元の細胞画像の集合体データからＺ方向に蓄積されている二次元細胞画像データを抽出する（ステップＳ２２”）。次いで、抽出画像があるか否かをチェックする（ステップＳ２３”）。抽出画像がある場合、現在抽出している二次元細胞画像における各ＸＹ座標の輝度値を、予め設定された任意の輝度値と比較する。そして、任意の輝度値以上の輝度値を持つＸＹ座標の輝度値及びＺ座標を、射影データ候補領域において対応するＸＹ座標の輝度値及びＺ座標の格納領域にセットする（ステップＳ２４”）。そして、これらの処理をＺ方向に順に蓄積されたすべての二次元の細胞画像に対して行うことで、少なくとも一つのＺ座標群を取得する（ステップＳ２１”〜ステップＳ２５”）。次いで、射影データ候補領域にセットされている各ＸＹ座標上での各Ｚ座標群のうちの中心となる（代表的な）Ｚ座標を抽出し、抽出したＺ座標を用いて、各ＸＹ座標上に任意の輝度値以上の輝度値を持つ各Ｚ座標群のうちの中心となる（代表的な）Ｚ座標の集合体を示す二次元射影データを作成する（ステップＳ２６”）。

また、例えば、二次元射影データ作成手段２ａ１’は、図１９のフローチャートに示すように、各ＸＹ座標に対して任意の輝度値以上の輝度値を持つ各Ｚ座標群のうちの中心となるＺ座標の集合体の個数を、各ＸＹ座標に対して任意の輝度値以上の輝度値を持つ各Ｚ座標群のうちの中心となるＺ座標の集合体を示す二次元射影データに付加するようにするのが好ましい。

図１９は第二実施形態の三次元細胞画像解析装置における二次元射影データ作成手段２ａ１’の具体的な処理手順のさらに他の例を示すフローチャートである。
図１９の例では、二次元射影データ作成手段２ａ１’は、図１８の例におけるステップＳ２１”〜ステップＳ２６”と同様の処理（ステップＳ２１”’〜ステップＳ２６”’）を行い二次元射影データを作成し、次いで、Ｚ座標の集合体の個数を二次元射影データに付加する（ステップＳ２７”’）。

図１９の例の二次元射影データ作成手段２ａ１’は、例えば、図２０に示すような、細胞器官の領域がＺ方向に複数重なった場合に有効である。図１９の例の二次元射影データ作成手段２ａ１’を用いれば、上下に重なった複数の細胞器官の領域を夫々別領域として特定することができる。
図２０は図１９の例の二次元射影データ作成手段２ａ１’の処理を模式的に示す説明図で、(a)は三次元細胞画像においてＺ方向に２つの細胞器官の領域が重なった状態を示すＺ方向に沿う断面図、(b)は(a)の三次元細胞画像をなす、Ｚ方向に順に蓄積された複数の二次元の細胞画像の集合体からＺ座標の集合体を示す二次元射影データを作成した状態を示す説明図、(c)は(a)の三次元細胞画像における重なった２つの細胞器官の領域に対し同一の所定のＸＹ座標を示す図、(d)は(c)に示すＸＹ座標上で一定の輝度値以上の輝度値が得られたＺ座標群を抽出した状態を示す図、(e)は(d)に示す各Ｚ座標群のうちの中心となるＺ座標の集合体の個数を示す二次元射影データを示す図である。

この点に関し、さらに補足説明する。
二次元射影データを用いて細胞器官の領域を構築する構成においては、細胞画像中の細胞器官の領域がＺ方向に重なった場合の処理が問題となる。

図２１は図１６の例の二次元射影データ作成手段２ａ１'のように輝度値が最大となるＺ座標の値を射影データとして、三次元の細胞画像をなす、Ｚ方向に順に蓄積された複数の二次元の細胞画像の集合体から二次元射影データを作成したときの射影データの説明図で、(a)は三次元細胞画像において大きさ又はＸＹ座標の位置が一部で異なる２つの細胞器官の領域がＺ方向に重なった状態を示すＺ方向に沿う断面図、(b)は(a)の三次元細胞画像をなす、Ｚ方向に順に蓄積された複数の二次元の細胞画像の集合体からＺ座標の集合体を示す二次元射影データを作成した状態の一例を示す説明図、(c)は(a)の三次元細胞画像をなす、Ｚ方向に順に蓄積された複数の二次元の細胞画像の集合体からＺ座標の集合体を示す二次元射影データを作成した状態の一例を示す説明図、(d)は三次元細胞画像において大きさ及びＸＹ座標の位置が同じ２つの細胞器官の領域がＺ方向に重なった状態を示すＺ方向に沿う断面図、(e)は(d)は(a)の三次元細胞画像をなす、Ｚ方向に順に蓄積された複数の二次元の細胞画像の集合体からＺ座標の集合体を示す二次元射影データを作成した状態の一例を示す説明図である。

図２１(c)の例（例１）は、細胞器官の領域Ａ，細胞器官の領域Ｂよりも大きさが小さく、かつ、ＸＹ座標上で細胞器官の領域Ａが細胞器官の領域Ｂの内部に位置する場合において、輝度値が最大となるＺ座標の集合体ａ，ｂを射影データとして作成したときの状態を示している。
また、図２１(d)の例（例２）は、細胞器官の領域Ａ，細胞器官の領域Ｂよりも大きさが小さく、かつ、ＸＹ座標上で細胞器官の領域Ａの一部が細胞器官の領域Ｂの外部に位置する場合において、輝度値が最大となるＺ座標の集合体ａ，ｂを射影データとして作成したときの状態を示している。
図２１における例１はあるいは例２の場合は、作成された二次元射影データを用いて三次元の細胞器官を解析可能である。これらの例１，例２では、領域ａと領域ｂとではＺ座標の値が大きく異なるため、不連続領域特定手段２ｂ１’を介して二次元射影データにおける個々の領域を検出することが可能である。これにより、これらの二次元射影データから、三次元の個々の細胞器官の領域Ａ，Ｂの構築を行うことができる。

これに対し、図２１(e)の例（例３）の場合は、２つの領域Ａ，Ａ’が同じＸＹ座標上に位置しＺ方向に完全に領域が重なっているような状態にある。このような場合、輝度値が最大となるＺ座標の値を用いて二次元射影データを作成すると、輝度が相対的に低い上部の細胞器官の領域Ａ’の存在を検出することができない。

このような場合に、上述した図１９の例の二次元射影データ作成手段２ａ１’を用いて作成した図２０(e)に示す二次元射影データを用いれば、輝度が相対的に低い上部の細胞器官の領域Ａ’の存在を検出することが可能となる。

図２０(e)に示す二次元射影データは、図２０(b)や図２１(e)に示す二次元射影データとは別の射影データであり、例えば、一定の輝度値以上の輝度を持つ各Ｚ座標群のうちの中心となるＺ座標の集合体の個数を示すように作成してある。図２０の例では重なっている細胞器官の領域の個数が２つであり、図２０(e)において作成される射影データは「２」の値を持つ（即ち、細胞器官の領域が２つ存在することを意味する）。なお、この射影データの値が「１」であるときは、そのＸＹ座標上に存在している細胞器官の領域の個数は１である。

このようにして作成した射影データを用いた三次元細胞器官の領域の構築は次のようにして行う。
まず、図１９に示す例の二次元射影データ作成手段２ａ１’を用いて作成した二次元射影データのうち、図２０(b)に示すような、所定の輝度値以上の値を持つＺ座標の集合体のうちの１つの集合体ａを示す二次元射影データを用いて、不連続領域特定手段２ｂ１’、サイズ検出手段２ｂ２’、Ｚ座標平均値算出手段２ｂ３’を介して、図２０(a)に示す２つの細胞器官の領域Ａ，Ａ’のうち、一方（例えば、図２０(a)の下側）の細胞器官の領域Ａを構築する。
また、図２０の例においては、図１９の例の二次元射影データ作成手段２ａ１’は、Ｚ座標の集合体の個数として２を示す、別の射影データを作成している。Ｚ座標の集合体の個数が２であるということは、図２０(b)に二次元射影データで示される細胞器官の領域Ａの上方（又は下方）に別の細胞器官の領域Ａ’が存在していることになる。そこで、不連続領域特定手段２ｂ１’、サイズ検出手段２ｂ２’、Ｚ座標平均値算出手段２ｂ３’は、例えば、既に三次元の細胞器官の領域Ａとして構築した領域のＺ座標の上限（又は下限）よりも上方（又は下方）の三次元の細胞画像の領域を範囲として、ＸＹ座標に対して、例えば、輝度の最大値となるＺ座標の集合体を射影データとして検出する。検出したＺ座標の集合体を用いることで、上方（又は下方）の三次元の細胞器官の領域Ａ’も構築することができる。

また、例えば、二次元射影データ作成手段２ａ１’は、図２２、図２３のフローチャートに示すように、Ｚ方向に順に蓄積された全ての二次元の細胞画像の輝度値を検出し、所定の輝度値として任意の輝度値以上の輝度値を持つ少なくとも一つのＺ座標を取得し、取得したＺ座標の範囲において各ＸＹ座標に対してＺ方向に対する輝度値の変化量を算出し、算出した輝度値の変化量が極小又は極大となるＺ座標を抽出し、抽出したＺ座標を用いて、各ＸＹ座標に対して輝度値の変化量が極小又は極大となるＺ座標の集合体を示す二次元射影データを作成するようにしてもよい。

図２２は第二実施形態の三次元細胞画像解析装置における二次元射影データ作成手段２ａ１’の具体的な処理手順のさらに他の例における一部の処理手順を示すフローチャート、図２３は図２２に示した処理に続く処理手順を示すフローチャートである。
本例では、二次元射影データ作成手段２ａ１’は、まず、図２２に示すように、三次元細胞画像データからＺ方向に蓄積されている二次元細胞画像データを抽出する（ステップＳ２２””）。次いで、抽出画像があるか否かをチェックする（ステップＳ２３””）。抽出画像がある場合、現在抽出している二次元細胞画像における各ＸＹ座標の輝度値を、予め設定された任意の輝度値と比較する。そして、任意の輝度値以上の輝度値を持つＺ座標を、ＸＹ座標ごとに設けられているＺ座標の格納領域における当該ＸＹ座標に対応する領域にセットする（ステップＳ２４””）。そして、これらの処理をＺ方向に順に蓄積されたすべての二次元の細胞画像に対して行う（ステップＳ２１””〜ステップＳ２５””）。

次いで、二次元射影データ作成手段２ａ１'は、図２３に示すように、二次元細胞画像に存在する１番目のＸＹ座標を処理対象とし、変化量格納領域に初期値（最大値又はゼロ）をセットの後、当該ＸＹ座標に対応するＺ座標の格納領域にセットされているＺ座標のうち、１番目にセットされているＺ座標に対応する二次元細胞画像データを三次元細胞画像をなす、Ｚ方向に順に蓄積された複数の二次元の細胞画像の集合体データから抽出する（ステップＳ２６""〜ステップＳ２９""）。次いで、抽出画像があるか否かをチェックする（ステップＳ３０""）。１番目の抽出画像がある場合、二次元細胞画像データにおける当該ＸＹ座標に対応するＺ座標を、ＸＹ座標ごとに設けられている射影データ候補領域における当該ＸＹ座標に対応する領域にセットする（ステップＳ３１""）。次いで、当該ＸＹ座標に対応するＺ座標の格納領域にセットされている次の二次元細胞画像データを三次元細胞画像をなす、Ｚ方向に順に蓄積された複数の二次元の細胞画像の集合体データから抽出する（ステップＳ３２""，３３""）。次いで、抽出画像があるか否かをチェックする（ステップＳ３４""）。当該抽出画像がある場合、抽出した当該Ｚ座標に対応する二次元細胞画像データと、当該Ｚ座標の一つ前のＺ座標に対応する二次元細胞画像データとの輝度の変化量（差）を算出し（ステップＳ３５""）、次いで、算出した変化量と、変化量格納領域に格納されている変化量とを比較する（ステップＳ３６""）。なお、算出した変化量が、変化量格納領域に格納されている変化量よりも小さい（又は大きい）場合、算出した変化量及び当該Ｚ座標を、現在セットされている変化量及び当該Ｚ座標に差し替えて変化量格納領域にセットする（ステップＳ３７""）とともに、当該座標を射影データ候補領域における当該ＸＹ座標に対応する領域にセットする（ステップＳ３８""）。そして、これらの処理を当該ＸＹ座標に対応するＺ座標の格納領域にセットされている全てのＺ座標に対応する二次元細胞画像データに対して行う（ステップＳ３２""〜ステップＳ３８""）。

当該ＸＹ座標に対応するＺ座標の格納領域にセットされている全てのＺ座標に対応する二次元細胞画像データに対する処理が終了したときには、次のＸＹ座標を処理対象とし（ステップＳ３９””）、ステップＳ２７””〜ステップＳ３８””の処理を、全てのＸＹ座標を処理対象としたステップＳ２７””〜ステップＳ３８””の処理が終了するまで繰り返す（ステップＳ２７””〜ステップＳ４０””）。全てのＸＹ座標を処理対象としたステップＳ２７””〜ステップＳ３８””の処理が終了したとき、射影データ候補領域にセットされている各ＸＹ座標に対応するＺ座標を用いて、各ＸＹ座標上に対して輝度の変化量が極小（又は極大）となるＺ座標の集合体を示す二次元射影データを作成する（ステップＳ４１””）。

図２２及び図２３の例の二次元射影データ作成手段２ａ１’は、例えば、図２４に示すような、細胞器官の領域の中心部の輝度値が低く（又は高く）なっているような場合に有効である。図２３の例の二次元射影データ作成手段２ａ１’を用いれば、例えば、領域の中心部の輝度が極大でなく、周辺の輝度のほうが高くなっているような細胞器官の領域に対して、その輝度が低い中心部を効率よく検出することができる。

図２４は図２２及び図２３の例の二次元射影データ作成手段２ａ１’の処理を含む射影データの作成処理の模式的に示す説明図で、(a)は三次元細胞画像において中心部の輝度が低くなっている細胞器官の領域を示すＺ方向に沿う断面図、(b)は(a)の三次元細胞画像から所定の輝度値以上の輝度値を持つＺ座標の集合体を示す二次元射影データを作成した状態を示す説明図、(c)は(a)の三次元細胞画像におけるＺ方向の輝度断面を示す図、(d)は(c)の輝度断面を用いて(a)の三次元細胞画像における細胞器官の領域の輝度値（又は輝度値の変化量）が極小となるＺ座標を抽出した状態を示す図、(e)は(d)に示す細胞器官の領域の輝度値（又は輝度値の変化量）が極小となるＺ座標を示す二次元射影データを示す図である。

なお、図２４の例では、図２４(b)に示すように、図２２の処理によりＺ座標の格納領域に格納された任意の輝度値以上の輝度値を持つＺ座標の集合体に対してもＸＹ方向の二次元射影データを作成している。また、便宜上、図２４(e)に示すように、図２３の処理により作成される細胞器官の領域の輝度値（又は輝度値の変化量）が極小となるＺ座標の集合体のうちの１つのＺ座標のみを星印で示してある。

また、例えば、二次元射影データ作成手段２ａ１’は、図２２のフローチャートに示す処理の後に、図２５のフローチャートに示すように、各ＸＹ座標に対して輝度値の変化量が極小又は極大となるＺ座標の集合体の個数を、各ＸＹ座標に対して輝度値の変化量が極小又は極大となるＺ座標の集合体を示す二次元射影データに付加するようにするのが好ましい。

図２５は第二実施形態の三次元細胞画像解析装置における二次元射影データ作成手段２ａ１’の具体的な処理手順のさらに他の例における、図２２に示した処理に続く処理手順を示すフローチャートである。
図２５の例では、二次元射影データ作成手段は、図２３の例におけるステップＳ２６””〜ステップＳ４１””と同様の処理（ステップＳ２６””’〜ステップＳ４１””’）を行い、行い二次元射影データを作成し、次いで、Ｚ座標の集合体の個数を二次元射影データに付加する（ステップＳ４２””’）。

本発明の三次元細胞画像解析システム及びそれに用いる三次元細胞画像解析装置は、大量の細胞画像データを用いて、細胞内小器官や細胞膜など特定の細胞部位の蛍光量を正確に精度良く定量することが求められる細胞画像の自動解析分野に有用である。

１ 三次元細胞画像撮像装置
１ａ 観察光学系
１ｂ 撮像素子
２ 三次元細胞画像解析装置
２ａ 位置情報検出手段
２ａ１ 中心部検出手段
２ａ１’ 二次元射影データ作成手段
２ｂ 三次元領域構築手段
２ｂ１ 境界部検出手段
２ｂ１’ 不連続領域特定手段
２ｂ２’ サイズ検出手段
２ｂ３’ Ｚ座標平均値算出手段
２ｃ 特徴量抽出手段
２ｄ 領域分類手段
２ｅ 定量・出力手段

Claims (7)

1. 三次元細胞画像解析システムにおいて、コンフォーカル蛍光顕微鏡で構成された三次元細胞画像撮像装置とともに備えられ、該三次元細胞画像撮像装置を用いて、試料に対する合焦位置をＺ方向に所定ピッチで連続的に変えて、各合焦位置における試料の像を撮像することにより、試料の合焦位置がＺ方向に所定ピッチで連続的に異なった状態でＺ方向に順に蓄積された、複数の二次元の細胞画像の集合体からなる三次元の細胞画像を解析する、コンピュータを備えた三次元細胞画像解析装置であって、
   前記コンピュータを、
   前記三次元の細胞画像をなす、前記Ｚ方向に順に蓄積された複数の二次元の細胞画像の集合体を用いて、各ＸＹ座標に対して所定の輝度値を持つＺ座標の集合体を示す二次元射影データを作成する二次元射影データ作成手段、
   前記二次元射影データ作成手段が作成した二次元射影データにおけるＺ座標の集合体において、Ｚ座標の値が互いにＸＹ方向に不連続となる領域を特定する不連続領域特定手段、
   前記不連続領域特定手段が特定した個々の領域のＸＹ方向への広がりを検出するサイズ検出手段、
   前記不連続領域特定手段が特定した個々の領域のＺ座標の平均値を算出するＺ座標平均値算出手段、
   として機能させる画像解析ソフトウェアを有し、
   前記二次元射影データ作成手段が作成した二次元射影データを用いて、前記不連続領域特定手段が前記個々の領域を特定し、前記サイズ検出手段及び前記Ｚ座標平均値算出手段が前記個々の領域のＸＹ方向への広がりとＺ座標の平均値を算出することにより、細胞自体あるいは、核、小器官などの三次元の細胞器官の領域を構築することを特徴とする三次元細胞画像解析装置。
2. 前記二次元射影データ作成手段は、前記Ｚ方向に順に蓄積された全ての二次元の細胞画像の輝度値を検出し、検出した輝度値を用いて、各ＸＹ座標に対して前記所定の輝度値として最大の輝度値を持つＺ座標を抽出し、抽出したＺ座標を用いて、各ＸＹの点に対して最大の輝度値を持つＺ座標の集合体を示す二次元射影データを作成することを特徴とする請求項１に記載の三次元細胞画像解析装置。
3. 前記二次元射影データ作成手段は、前記Ｚ方向に順に蓄積された全ての二次元の細胞画像の輝度値を検出し、検出した輝度値を用いて、各ＸＹ座標に対して前記所定の輝度値として任意の輝度値に最も近い輝度値を持つＺ座標を抽出し、抽出したＺ座標を用いて、各ＸＹ座標に対して任意の輝度値に最も近い輝度値を持つＺ座標の集合体を示す二次元射影データを作成することを特徴とする請求項１に記載の三次元細胞画像解析装置。
4. 前記二次元射影データ作成手段は、前記Ｚ方向に順に蓄積された全ての二次元の細胞画像の輝度値を検出し、検出した輝度値を用いて、各ＸＹ座標に対して前記所定の輝度値として任意の輝度値以上の輝度値を持つ少なくとも一つのＺ座標群を取得し、各ＸＹ座標に対して取得した各Ｚ座標群のうちの中心となるＺ座標を抽出し、抽出した中心となるＺ座標を用いて、各ＸＹ座標に対して任意の輝度値以上の輝度値を持つ各Ｚ座標群のうちの中心となるＺ座標の集合体を示す二次元射影データを作成することを特徴とする請求項１に記載の三次元細胞画像解析装置。
5. 前記二次元射影データ作成手段は、前記各ＸＹ座標に対して任意の輝度値以上の輝度値を持つ各Ｚ座標群のうちの中心となるＺ座標の集合体の個数を、前記各ＸＹ座標に対して任意の輝度値以上の輝度値を持つ各Ｚ座標群のうちの中心となるＺ座標の集合体を示す二次元射影データに付加することを特徴とする請求項４に記載の三次元細胞画像解析装置。
6. 前記二次元射影データ作成手段は、前記Ｚ方向に順に蓄積された全ての二次元の細胞画像の輝度値を検出し、前記所定の輝度値として任意の輝度値以上の輝度値を持つ少なくとも一つのＺ座標を取得し、取得したＺ座標の範囲において各ＸＹ座標に対してＺ方向に対する輝度値の変化量を算出し、算出した輝度値の変化量が極小又は極大となるＺ座標を抽出し、抽出したＺ座標を用いて、各ＸＹ座標に対して輝度値の変化量が極小又は極大となるＺ座標の集合体を示す二次元射影データを作成することを特徴とする請求項１に記載の三次元細胞画像解析装置。
7. 前記二次元射影データ作成手段は、前記各ＸＹ座標に対して輝度値の変化量が極小又は極大となるＺ座標の集合体の個数を、前記各ＸＹ座標に対して輝度値の変化量が極小又は極大となるＺ座標の集合体を示す二次元射影データに付加することを特徴とする請求項６に記載の三次元細胞画像解析装置。