[go: up one dir, main page]

JP5498952B2 - アルキン類及び１，３−双極子機能性化合物とアルキン類を反応させる方法 - Google Patents

アルキン類及び１，３−双極子機能性化合物とアルキン類を反応させる方法 Download PDF

Info

Publication number
JP5498952B2
JP5498952B2 JP2010535090A JP2010535090A JP5498952B2 JP 5498952 B2 JP5498952 B2 JP 5498952B2 JP 2010535090 A JP2010535090 A JP 2010535090A JP 2010535090 A JP2010535090 A JP 2010535090A JP 5498952 B2 JP5498952 B2 JP 5498952B2
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
linker
group
alkyne
mmol
room temperature
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
JP2010535090A
Other languages
English (en)
Other versions
JP2011504507A (ja
Inventor
ブーンズ，ギールト−ヤン
グオ，ジュン
ニン，シンハイ
ウォルフェルト，マルガレサ
Original Assignee
ユニバーシティ・オブ・ジョージア・リサーチ・ファウンデイション・インコーポレイテッド
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by ユニバーシティ・オブ・ジョージア・リサーチ・ファウンデイション・インコーポレイテッド filed Critical ユニバーシティ・オブ・ジョージア・リサーチ・ファウンデイション・インコーポレイテッド
Publication of JP2011504507A publication Critical patent/JP2011504507A/ja
Application granted granted Critical
Publication of JP5498952B2 publication Critical patent/JP5498952B2/ja
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/54—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic compound
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/54—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic compound
    • A61K47/542—Carboxylic acids, e.g. a fatty acid or an amino acid
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
    • A61K47/61—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule the organic macromolecular compound being a polysaccharide or a derivative thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
    • A61K47/64—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/69—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit
    • A61K47/6921—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit the form being a particulate, a powder, an adsorbate, a bead or a sphere
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K49/00—Preparations for testing in vivo
    • A61K49/001—Preparation for luminescence or biological staining
    • A61K49/0013—Luminescence
    • A61K49/0017—Fluorescence in vivo
    • A61K49/0019—Fluorescence in vivo characterised by the fluorescent group, e.g. oligomeric, polymeric or dendritic molecules
    • A61K49/0021—Fluorescence in vivo characterised by the fluorescent group, e.g. oligomeric, polymeric or dendritic molecules the fluorescent group being a small organic molecule
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K49/00—Preparations for testing in vivo
    • A61K49/001—Preparation for luminescence or biological staining
    • A61K49/0013—Luminescence
    • A61K49/0017—Fluorescence in vivo
    • A61K49/0019—Fluorescence in vivo characterised by the fluorescent group, e.g. oligomeric, polymeric or dendritic molecules
    • A61K49/0021—Fluorescence in vivo characterised by the fluorescent group, e.g. oligomeric, polymeric or dendritic molecules the fluorescent group being a small organic molecule
    • A61K49/0041—Xanthene dyes, used in vivo, e.g. administered to a mice, e.g. rhodamines, rose Bengal
    • A61K49/0043—Fluorescein, used in vivo
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K49/00—Preparations for testing in vivo
    • A61K49/001—Preparation for luminescence or biological staining
    • A61K49/0013—Luminescence
    • A61K49/0017—Fluorescence in vivo
    • A61K49/005—Fluorescence in vivo characterised by the carrier molecule carrying the fluorescent agent
    • A61K49/0052—Small organic molecules
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/04—Immunostimulants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C211/00—Compounds containing amino groups bound to a carbon skeleton
    • C07C211/33—Compounds containing amino groups bound to a carbon skeleton having amino groups bound to carbon atoms of rings other than six-membered aromatic rings
    • C07C211/39—Compounds containing amino groups bound to a carbon skeleton having amino groups bound to carbon atoms of rings other than six-membered aromatic rings of an unsaturated carbon skeleton
    • C07C211/41—Compounds containing amino groups bound to a carbon skeleton having amino groups bound to carbon atoms of rings other than six-membered aromatic rings of an unsaturated carbon skeleton containing condensed ring systems
    • C07C211/42—Compounds containing amino groups bound to a carbon skeleton having amino groups bound to carbon atoms of rings other than six-membered aromatic rings of an unsaturated carbon skeleton containing condensed ring systems with six-membered aromatic rings being part of the condensed ring systems
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C251/00—Compounds containing nitrogen atoms doubly-bound to a carbon skeleton
    • C07C251/32—Oximes
    • C07C251/34—Oximes with oxygen atoms of oxyimino groups bound to hydrogen atoms or to carbon atoms of unsubstituted hydrocarbon radicals
    • C07C251/44—Oximes with oxygen atoms of oxyimino groups bound to hydrogen atoms or to carbon atoms of unsubstituted hydrocarbon radicals with the carbon atom of at least one of the oxyimino groups being part of a ring other than a six-membered aromatic ring
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C251/00—Compounds containing nitrogen atoms doubly-bound to a carbon skeleton
    • C07C251/32—Oximes
    • C07C251/50—Oximes having oxygen atoms of oxyimino groups bound to carbon atoms of substituted hydrocarbon radicals
    • C07C251/58—Oximes having oxygen atoms of oxyimino groups bound to carbon atoms of substituted hydrocarbon radicals of hydrocarbon radicals substituted by nitrogen atoms not being part of nitro or nitroso groups
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C271/00—Derivatives of carbamic acids, i.e. compounds containing any of the groups, the nitrogen atom not being part of nitro or nitroso groups
    • C07C271/06—Esters of carbamic acids
    • C07C271/32—Esters of carbamic acids having oxygen atoms of carbamate groups bound to carbon atoms of rings other than six-membered aromatic rings
    • C07C271/34—Esters of carbamic acids having oxygen atoms of carbamate groups bound to carbon atoms of rings other than six-membered aromatic rings with the nitrogen atoms of the carbamate groups bound to hydrogen atoms or to acyclic carbon atoms
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C35/00—Compounds having at least one hydroxy or O-metal group bound to a carbon atom of a ring other than a six-membered aromatic ring
    • C07C35/22—Compounds having at least one hydroxy or O-metal group bound to a carbon atom of a ring other than a six-membered aromatic ring polycyclic, at least one hydroxy group bound to a condensed ring system
    • C07C35/37—Compounds having at least one hydroxy or O-metal group bound to a carbon atom of a ring other than a six-membered aromatic ring polycyclic, at least one hydroxy group bound to a condensed ring system with a hydroxy group on a condensed system having three rings
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C49/00—Ketones; Ketenes; Dimeric ketenes; Ketonic chelates
    • C07C49/587—Unsaturated compounds containing a keto groups being part of a ring
    • C07C49/657—Unsaturated compounds containing a keto groups being part of a ring containing six-membered aromatic rings
    • C07C49/683—Unsaturated compounds containing a keto groups being part of a ring containing six-membered aromatic rings having unsaturation outside the aromatic rings
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D249/00—Heterocyclic compounds containing five-membered rings having three nitrogen atoms as the only ring hetero atoms
    • C07D249/16—Heterocyclic compounds containing five-membered rings having three nitrogen atoms as the only ring hetero atoms condensed with carbocyclic rings or ring systems
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D261/00—Heterocyclic compounds containing 1,2-oxazole or hydrogenated 1,2-oxazole rings
    • C07D261/20—Heterocyclic compounds containing 1,2-oxazole or hydrogenated 1,2-oxazole rings condensed with carbocyclic rings or ring systems
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D271/00—Heterocyclic compounds containing five-membered rings having two nitrogen atoms and one oxygen atom as the only ring hetero atoms
    • C07D271/12—Heterocyclic compounds containing five-membered rings having two nitrogen atoms and one oxygen atom as the only ring hetero atoms condensed with carbocyclic rings or ring systems
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D307/00—Heterocyclic compounds containing five-membered rings having one oxygen atom as the only ring hetero atom
    • C07D307/94—Heterocyclic compounds containing five-membered rings having one oxygen atom as the only ring hetero atom spiro-condensed with carbocyclic rings or ring systems, e.g. griseofulvins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D311/00—Heterocyclic compounds containing six-membered rings having one oxygen atom as the only hetero atom, condensed with other rings
    • C07D311/02—Heterocyclic compounds containing six-membered rings having one oxygen atom as the only hetero atom, condensed with other rings ortho- or peri-condensed with carbocyclic rings or ring systems
    • C07D311/78—Ring systems having three or more relevant rings
    • C07D311/80—Dibenzopyrans; Hydrogenated dibenzopyrans
    • C07D311/82—Xanthenes
    • C07D311/90—Xanthenes with hydrocarbon radicals, substituted by amino radicals, directly attached in position 9
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D495/00—Heterocyclic compounds containing in the condensed system at least one hetero ring having sulfur atoms as the only ring hetero atoms
    • C07D495/02—Heterocyclic compounds containing in the condensed system at least one hetero ring having sulfur atoms as the only ring hetero atoms in which the condensed system contains two hetero rings
    • C07D495/04—Ortho-condensed systems
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H21/00—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2/00—Peptides of undefined number of amino acids; Derivatives thereof
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/58—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances
    • G01N33/582—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances with fluorescent label
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C2603/00—Systems containing at least three condensed rings
    • C07C2603/02—Ortho- or ortho- and peri-condensed systems
    • C07C2603/04—Ortho- or ortho- and peri-condensed systems containing three rings
    • C07C2603/36—Ortho- or ortho- and peri-condensed systems containing three rings containing eight-membered rings

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Heterocyclic Carbon Compounds Containing A Hetero Ring Having Oxygen Or Sulfur (AREA)
  • Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)
  • Plural Heterocyclic Compounds (AREA)
  • Furan Compounds (AREA)
  • Heterocyclic Carbon Compounds Containing A Hetero Ring Having Nitrogen And Oxygen As The Only Ring Hetero Atoms (AREA)

Description

本願は、全体として参照により本明細書に援用される、２００７年１１月２１日に出願された米国仮特許出願第６１／００４，０２１号；２００７年１２月１４日に出願された同第６１／００７，６７４号；２００８年７月２５日に出願された同第６１／１３７，０６１号の利益を主張する。
政府による財政的支援
本発明は、米国国立衛生研究所の生物医学複合糖質の研究資源センターからの助成金による政府支援でなされた（認可番号Ｐ４１−ＲＲ−５３５１）。
背景
バイオ直交反応は、互いを材料する反応であって、各材料は、インビボで見出される官能基との制限された反応性を有するか、又は実質的に反応性がない。アジドと末端アルキンとの効率的反応は、即ち、「クリック」化学の最も幅広く研究された例であり、バイオ直交反応の有用な例として知られている。特に、末端アルキン類を用いてアジドの１，３−環化され、安定なチアゾール類が得られるＣｕ（Ｉ）（例えば、Ｂｉｎｄｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｍａｃｒｏｍｏｌ．Ｒａｐｉｄ Ｃｏｍｍｕｎ．２００８，２９：９５２−９８１）は、タンパク質、核酸、脂質、及び単糖類を含む様々な生体分子にタグを付けるために使用されている。付加環化はまた、活性に基づくタンパク質プロフィーリング、酵素活性のモニターリング、並びにマイクロアレイ及び低分子ライブラリーの化学的合成に使用されている。
アジド類を生体分子にインストールするための魅力的なアプローチは、代謝標識に基づくものであり、それにより、アジド含有の生合成前駆体が、細胞の生合成機構を用いて生体分子に組み込まれる。このアプローチは、様々な反応性プローブを用いた、生物系のタンパク質、グリカン、及び脂質にタグを付けるために使用されている。これらのプローブは、単糖選択性糖タンパク質のマッピングを促進し、グリコシル化部位を同定することができる。また、アルキンプローブは、アジド修飾された生体分子の細胞表面イメージングのために使用され、特に魅力的なアプローチは、［３＋２］付加環化による非蛍光性前駆体由来の蛍光プローブの生成を伴う。
アジドと末端アルキンとの反応の明らかな有用性にも関わらず、この反応を用いて生物系における応用は、銅触媒の望ましくない存在を含む因子によって特に制限されてきた。このようにして、新規なバイオ直交反応のための絶え間ない満たされない必要性が存在する。
概要
一局面では、本発明は、アルキンを提供し、アルキンを製造する方法を提供する。一態様では、アルキンは、式：
Figure 0005498952
であり、式中、各Ｒ1は、独立して、水素、ハロゲン、ヒドロキシ、アルコキシ、硝酸エステル、亜硝酸エステル、硫酸エステル、及びＣ１−Ｃ１０有機基からなる群から選択され；各Ｒ2は、独立して、水素、ハロゲン、ヒドロキシ、アルコキシ、硝酸エステル、亜硝酸エステル、硫酸エステル、及びＣ１−Ｃ１０有機基からなる群から選択され；Ｘは、Ｃ＝Ｏ、Ｃ＝Ｎ−ＯＲ3、Ｃ＝Ｎ−ＮＲ3Ｒ4、ＣＨＯＲ3、又はＣＨＮＨＲ3を表し；並びに、各Ｒ3及びＲ4は、独立して、水素又は有機基である（例えば、切断可能なリンカーを含むことができる）。また、また、例えば、本願明細書に記載される薬物の送達を制御するために有用であり得る、重合体、又は任意に共重合体ミセルから形成可能な共重合体とある種のアルキンの混和物が提供される。
別の態様では、アルキンは、少なくとも２つの末端を含む切断可能なリンカー断片；切断可能なリンカー断片の第１末端に結合したアルキン断片；及び、切断可能なリンカー断片の第２末端に結合したビオチン化断片を含む。好ましい態様では、アルキン断片には、歪んだ環状アルキン断片が含まれる。ある種の態様では、アルキンは、さらに、少なくとも１つの重質量（ｈｅａｖｙ ｍａｓｓ）アイソトープを含む。任意に、アルキンは、さらに、蛍光標識などの少なくとも１つの検出可能な標識を含む。
本明細書において上述されるアルキンなどのアルキンは、環化反応において、少なくとも１つの１，３−双極子機能性化合物（例えば、アジド機能性化合物、ニトリル酸化物機能性化合物、ニトロン機能性化合物、アゾキシ機能性化合物、及び／又はアシルジアゾ機能性化合物）と反応させ、複素環式化合物を形成することができ、添加触媒（例えば、Ｃｕ（Ｉ））が実質的に存在しないことが好ましい。任意に、反応は、生細胞内又は生細胞の表面上で行うことができる。ある種の態様では、少なくとも１，３−双極子機能性化合物には、１，３−双極子機能性生体分子、例えばペプチド、タンパク質、糖タンパク質、核酸、脂質、単糖、オリゴ糖、及び／又は多糖が含まれる。任意に、１，３−双極子機能性生体分子は、アフィニティー標識などの検出可能な標識を含む。また、アルキンと少なくとも１つの１，３−双極子機能性化合物によって形成される複素環式化合物が本明細書中に開示される。ある種の態様では、アルキンと少なくとも１つの１，３−双極子機能性化合物との反応は、生細胞内又は生細胞の表面上で行うことができる。
複素環式化合物がビオチン化断片を含む態様については、複素環式化合物は、アビジン及び／又はストレプトアビジンなどの、ビオチンに結合する化合物に結合することができる。
別の局面では、本発明は、表面上に、本明細書に記載されているアルキンを有する基質を提供する。基質は、レジン、ゲル、ナノ粒子、又はそれらの組み合わせの形状であってもよい。任意に、基質は３次元マトリックスである。好ましい態様では、式ＩのアルキンおＸ基は、基質の表面への結合点を表す。このような基質は、ペプチド、タンパク質、糖タンパク質、核酸、脂質、単糖、オリゴ糖、及び／又は多糖などの生体分子を固定するために有用であり得る。また、３次元マトリックス上に固定されたタンパク質などの固定化された生体分子を含む製品も本明細書に開示されている。
本明細書に開示されている組成物及び方法は、当該技術分野において知られているバイオ直交反応を超えた利点を提供することができる。例えば、Ｂａｓｋｉｎ ｅｔ ａｌ．，ＱＳＡＲ Ｃｏｍｂ．Ｓｃｉ．２００７，２６：１２１１−１２１９を参照されたい。
例えば、驚くべきことに、本明細書に記載されている式Ｉで表されるアルキン（例えば、式中、ＸはＣ＝Ｏ、Ｃ＝Ｎ−ＯＲ3、Ｃ＝Ｎ−ＮＲ3Ｒ4、ＣＨＯＲ3、又はＣＨＮＨＲ3を表し；各Ｒ３及びＲ４は、独立して、水素又は有機基を表す）は、他の歪んだ環状アルキン（例えば、式中、ＸはＣＨ2を表す）よりも１，３−双極子機能性化合物に対する高い反応性を有することが見出されている。例えば、Ｃｏｄｅｌｌｉ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２００８，１３０：１１４８６−１１４９３；Ｊｏｈｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍｕｎ．２００８，３０６４−３０６６；Ｓｌｅｔｔｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｏｒｇａｎｉｃ Ｌｅｔｔｅｒｓ ２００８，１０：３０９７−３０９９；ａｎｄ Ｌａｕｇｈｌｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２００８，３２０：６６４−６６７を参照されたい。さらに、式Ｉで表される様々なアルケンを製造するための柔軟性を有する好都合な方法が本明細書中に開示されている。さらに、式Ｉで表されるアルキンは、アジドだけでなく、様々な他の１，３−双極子機能性化合物とも反応する能力を有する。
定義：
用語「含む」及びその変形は、これらが明細書及び特許請求の範囲に見られる限定された意味を有しない。本明細書で使用するとき、「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」、「その（ｔｈｅ）」、「少なくとも１つの」、及び「１以上の」は交換可能に使用される。
本明細書で使用するとき、用語「又は（ｏｒ）」は、一般には、使用の内容が明確に他を指示していなければ、「及び／又は（ａｎｄ／ｏｒ）」を含む意味において使用される。
また、本明細書において、端点による数値域の引用には、その範囲内に含まれる全ての数を含む（例えば、１〜５は、１、１．５、２、２．７５、３、３．８０、４、５などを含む）。
上記の概要は、各々、本発明の開示された態様又は全ての実施を記載することを意図していない。以下の説明は、実例となる態様をより具体的に例示する。本出願の全体でいくつかの部分では、ガイダンスが実施例のリストを通じて提供され、実施例が様々な組み合わせで使用され得る。各例では、記載されたリストは、代表的なグループとしてのみ役立ち、排他的なリストとして解釈されてはならない。
アジド機能性生体分子を標識するための例示的な試薬を説明する。 スキーム１を説明する：例示的な試薬及び条件：ａ）ＴＮＳＣｌ、ピリジン；ｂ）Ｂｒ2、ＣＨＣｌ3；ｃ）ＬＤＡ、テトラヒドロフラン；ｄ）４−ニトロフェニルクロロギ酸エステル、ピリジン、ＣＨ2Ｃｌ3；ｅ）Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、トリエチルアミン（ＴＥＡ）。ＬＤＡ＝リチウムジイソプロピルアミド、ＴＢＳ＝ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル。 スキーム２を説明する：例示的な試薬及び条件：ａ）メタノール中の化合物３。 アジド機能性アミノ酸及び単糖を用いた化合物３の例示的な金属不含付加環化を説明する。Ｂｏｃ＝ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル、ＴＤＳ＝テキシルジメチルシリル。 スキームを説明する：例示的な試薬及び条件：ａ）１、トリエチルアミン、ＤＭＦ、室温、７８％；ｂ）２０％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）、室温、９５％；ｃ）２、ＴＥＡ、ＤＭＦ、室温、６８％。
化合物２及び９を用いた細胞表面標識の態様を説明する。Ａｃ4ＭａｎＮＡｚ（２５μｍｏｌ濃度）の不存在又は存在下で３日間増殖さえたＪｕｒｋａｔ細胞は、ａ）化合物２及び９（３０μｍｏｌ濃度）とともに、０〜１８０分間、又はｂ）化合物２及び９（０〜１００μｍｏｌ濃度）とともに、１時間、室温でインキュベートされた。次に、細胞をアビジン−ＦＩＴＣとともに、１５分間、４℃でインキュベートされ、その後、細胞溶解物を蛍光強度について評価した。試料を次のように指示する：２（白丸）又は９（白四角）とともにインキュベートされたブランク細胞、及び２（黒丸）又は（黒四角）とともにインキュベートされたＡｃ，ＭａｎＮＡｚ細胞。 化合物を用いた細胞標識手法及び付加環化反応の毒性評価の態様を説明する。Ａｃ4ＭａｎＮＡｚ（２５μｍｏｌ濃度）の不存在下（ａ）又は存在下（ｂ）での３日間のＪｕｒｋａｔ細胞増殖は、化合物９（０〜１００μｍｏｌ濃度）とともに１時間、室温でインキュベートされた。細胞を３回洗浄し、次に、フルオロセインをコンジュゲートさせたアビジンとともに１５分間、４℃でインキュベートした。細胞生存率は、トリパンブルー排出を用いた手法中の異なる点；９（黒色）を用いたインキュベーション後、アビジン−ＦＩＴＣインキュベーション（灰色）後、及び完全な手法（白色）後に評価された。同条件下でＣｕ１Ｃｌ（１ｍＭ）による処理は、ブランク及びＡｃ4ＭａｎＮＡｚ処理された細胞について、約９８％の細胞死をもたらした。 化合物９及びアビジン−Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ４８８で標識された細胞の態様の蛍光画像を示す。Ａｃ4ＭａｎＮＡｚ（１００μｍｏｌ濃度）の不存在（ｄ−ｆ）又は存在（ａ−ｃ）下で３日間のＣＨＯ細胞増殖は、化合物９（３０μｍｏｌ濃度）とともに１時間、４℃（ａ、ｄ）又は室温（ｂ、ｃ、ｅ、ｆ）インキュベートされた。次に、細胞は、アビジン−Ａｌｅｘａ４８８ Ｆｌｕｏｒ４８８とともに１５分間、４℃でインキュベートされ、洗浄後、固定し、遠赤色の蛍光色素ＴＯ−ＰＲＯで核を染色し、画像にし（ａ、ｂ、ｄ、ｅ）、又は洗浄後、固定前に１時間、３７℃でインキュベートし、核を染色し、画像にした（ｃ、ｆ）。Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（４８８ｎｍ）及びＴＯ−ＰＲＯ（６３３ｍｍ）で標識された細胞の画像をまとめたものを示す。 図９は、アルキン断片、切断可能なリンカー断片、及びビオチン化断片を含む例示的な化合物を示す。 スキーム４を説明する：例示的な反応条件：ａ）ＤＭＦ、８０℃、７０％；ｂ）チオ酢酸カリウム（ＫＳＡｃ）、ＤＭＦ、６０℃、９０％、ｃ）ＮＨ2ＮＨ2、エタノール（ＥｔＯＨ）、還流、９５％；ｄ）Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ）、ＤＭＦ、０℃、５６％；ｅ）ＤＩＰＥＡ、ＤＭＦ、室温、８５％。
スキーム５を説明する：例示的な反応条件：ａ）ｐ−トルエンスルホン（ＴｓＯＨ）、室温、８１％；ｂ）ＤＭＦ、８０℃、８６％；ｃ）０．１Ｎ ＨＣｌ、ＥｔＯＨ、室温、９０％；ｄ）９、ＮａＨ、ＤＭＦ、０℃、８８％；ｅ）０．１Ｎ ＨＣｌ、ＥｔＯＨ、室温、８８％；ｆ）ＣＣｌ4、ＰＰｈ３、ジクロロメタン（ＤＣＭ）、室温、９６％；ｇ）ＫＳＡｃ、ＤＭＦ、６０℃、９０％；ｈ）ＮＨ2ＮＨ2、ＥｔＯＨ、還流、９５％；次に、（Ｂｏｃ）2Ｏ、ＴＥＡ、ＥｔＯＨ、９１％；ｉ）２０％ ＴＦＡ、ＤＣＭ、室温、９５％；ｊ）ＤＩＰＥＡ、ＤＭＦ、０℃；次に、（Ｂｏｃ）2Ｏ、ＴＥＡ、ＥｔＯＨ、２工程で６０％；ｋ）２０％ ＴＦＡ、ＤＣＭ、室温、次に８ＤＩＰＥＡ、ＤＭＦ、室温、２工程で８０％。 例示的な切断可能なリンカーを示す。 例示的なアルキン及び反応性ジエンを示す。 スキーム６を説明する：例示的な反応受験：ａ）ＴＭＳＣＨ2Ｎ2、ＢＦ3ＯＥｔ2、ＤＣＭ、−１０℃、３時間、７１％；ｂ）ＮａＢＨ4、１：１のＥｔＯＨ／ＴＨＦ、室温、７時間、１００％；ｃ）Ｂｒz、ＣＨＣｌ3、室温、０．５時間、５８％；ｄ）ＬＤＡ、ＴＨＦ、０．５時間、５７％；ｅ）Ｄｅｓｓ−Ｍａｒｔｉｎ試薬、ＤＣＭ、０．５時間；ｆ）４−ニトロフェニルクロロギ酸エステル、ピリジン、ＤＣＭ、１８時間 、９２％；ｇ）ｔｒｉｓ（エチレングリコール）−１，８−ジアミン、ＴＥＡ、ＤＣＭ、室温、３時間、８０％；ｈ）ブロモ酢酸、ＮａＨ、ＴＨＦ、２２％；ｉ）ｔｒｉｓ（エチレングリコール）−１，８−ジアミン、ＨＡＴＵカップリング試薬、ＤＩＰＥＡ、ＤＭＦ、室温、２時間、７５％；ｊ）Ｎ−｛２−［２−（２−ａアミノ−エトキシ）−エトキシ］−エチル｝−２−アミノオキ−アセトアミド、ＡｃＯＨ、１：１のＤＣＭ／ＭｅＯＨ、６３％。 化合物６１〜６８及び二次定数を示す。
スキーム７を説明する：例示的な試薬及び条件：ａ）ＬｉＡｌＨ4、ＡｌＣｌ3，Ｅｔ2Ｏ、０℃、６１％；ｂ）Ｂｒ2、ＣＨＣｌ3、０℃、５８％；ｃ）カリウムｔ−ブトキシド（ｔ−ＢｕＯＫ）、ＴＨＦ、室温、２５％。 スキーム８を説明する：例示的な試薬及び条件：ａ）ＴＥＡ、ＣＨ2Ｃｌ2、室温、７７％。 スキーム９を説明する：例示的な試薬及び条件：ａ）ＮａＨ、臭化ベンジル、ＤＭＦ、室温、５９％；ｂ）無水酢酸（（Ａｃ2Ｏ）、ピリジン、室温、８１％。 スキーム１０を説明する：例示的な試薬及び条件：ａ）ＬＤＡ、Ｅｔ3ＳｉＣｌ、ＴＨＦ、ｒｏｏｍ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ、８５％；ｂ）ＳＥＬＥＣＴＦＬＵＯＲフッ素化試薬、ＤＭＦ、室温、６６％；ｃ）ＬＤＡ、Ｅｔ３ＳｉＣｌ、ＴＨＦ、室温、７９％；ｄ） ＳＥＬＥＣＴＦＬＵＯＲフッ素化試薬、ＤＭＦ、室温、５１％；ｅ）ＮａＢＨ４、ＥｔＯＨ、室温、７８％；ｆ）Ｂｒ2、ＣＨＣｌ3、０℃、４６％；ｇ）ｃ）ｔ−ＢｕＯＫ、ＴＨＦ、室温、４９％。 薬物送達のための共重合体ミセルの使用を説明する。Ａ）水中で自己凝集されたポリエステル及びポリエチレングリコール基。Ｂ）薬物送達デバイスとして、官能化された共重合体ミセル。 Ｃ）共重合ミセルのオキシム修飾されたアルキン誘導体。 ４−ジベンゾシクロオクチン官能性を有する巨大分子の製造を示す。 種々のニトロンを有する４−ジベンゾシクロオクチノールの付加環化を示す。化合物は６ｍＭの最終濃度で１：１の比率で混合され指示された時間で反応させた。
本明細書に記載されるアルキンなどのアルキンは、環化反応における少なくとも１つの１，３−双極子機能性化合物と反応させ、複素環式化合物を形成することができる。好ましい態様では、反応は、添加触媒（例えば、Ｃｕ（Ｉ））が実質的に存在せずに得ることができる。例示的な１，３−双極子機能性化合物には、限定されないが、アジド機能性化合物、ニトリル酸化物機能性化合物、ニトロン機能性化合物、アゾキシ機能性化合物、及び／又はアシルジアゾ機能性化合物が挙げられる。
例示的なアルキンには、式：
Figure 0005498952
で表されるアルキンが含まれ、式中、各Ｒ1は、独立して、水素、ハロゲン、ヒドロキシ、アルコキシ、硝酸エステル、亜硝酸エステル、硫酸エステル、及びＣ１−Ｃ１０有機基からなる群から選択され（及び好ましくはＣ１−Ｃ１０有機基である）；各Ｒ2は、独立して、水素、ハロゲン、ヒドロキシ、アルコキシ、硝酸エステル、亜硝酸エステル、硫酸エステル、及びＣ１−Ｃ１０有機基からなる群から選択され（及び好ましくはＣ１−Ｃ１０有機基である）；Ｘは、Ｃ＝Ｏ、Ｃ＝Ｎ−ＯＲ3、Ｃ＝Ｎ−ＮＲ3Ｒ4、ＣＨＯＲ3、又はＣＨＮＨＲ3を表し；並びに各Ｒ3及びＲ4は、独立して、水素又は有機基を表す（いくつかの態様では有機基である）。好ましい態様では、各Ｒ1は水素を表し、及び／又は各Ｒ2は水素を表す。場合により、Ｒ3は、共有結合した有機色素（例えば、蛍光色素）を含む。
本明細書で使用するとき、用語「有機基」は、本発明の目的で使用され、脂肪族基、環式基、又は脂肪族基と環式基の組み合わせ（例えば、アルカリル基及びアラルキル基）として分類される炭化水素基を意味する。本発明との関連で、本発明の化合物に適した有機基は、１，３−双極子機能性化合物とのアルキンの反応と干渉せずに、複素環式化合物を形成する有機基である。本発明との関連で、用語「脂肪族基」は、飽和又は不飽和の線状又は分岐状の炭化水素基を意味する。この用語は、例えば、アルキル基、アルケニル基、及びアルキニル基を含むように使用される。用語「アルキル基」は、例えば、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｔｅｒｔ−ブチル、アミル、ヘプチルなどを含む飽和の線状又は分岐状の一価炭化水素基を意味する。用語「アルケニル基」は、１以上のオレフィン系の不飽和基（即ち、炭素−炭素二重結合）を有する不飽和の線状又は分岐状の一価炭化水素基を意味する（例えばビニル基である）。用語「アルキニル基」は、１以上の炭素−炭素三重結合を有する不飽和の線状又は分岐状の一価炭化水素基を意味する。用語「環式基」は、脂環式基、芳香族基、又は複素環式基として分類される閉環炭化水素基を意味する。用語「脂環式基」は、脂環式基に似た性質を有する環式炭化水素基を意味する。用語「芳香族基」又は「アリール基」は、一価又は多核芳香族炭化水素基を意味する。用語「複素環式基」は、環の１以上の原子が炭素以外の元素（例えば、窒素、酸素、硫黄など）である閉環炭化水素を意味する。
本出願を通して使用されるある種の用語の検討及び詳述を単純化する手段として、用語「基（ｇｒｏｕｐ）」及び「部分（ｍｏｉｅｔｙ）」は、置換を可能にするか又は置換されてもよい化学種と、置換できないか及び置換されない化学種とを区別するために使用される。このようにして、用語「基」は化学置換を記載するために使用される場合、記載される化学的材料には、置換されていない基、及び例えば、鎖内で過酸化でないＯ、Ｎ、Ｓ、Ｓｉ、又はＦ原子を有する基、並びにカルボニル基又は他の慣用的な置換基を含む。用語「部分」が化学的化合物又は置換基を記載するために使用される場合、置換されていない化学的材料だけが含まれることが意図される。例えば、句「アルキル基」は、メチル、エチル、プロピル、ｔｅｒｔ−ブチルなどの純粋な開鎖の飽和炭化水素アルキル置換基だけでなく、ヒドロキシ、アルコキシ、アルキルスルホニル、ハロゲン原子、シアノ、ニトロ、アミノ、カルボキシルなど、当該技術分野において知られているさらなる置換基を有するアルキル置換基を含むことが意図される。このようにして、「アルキル基」は、エーテル基、ハロアルキル、ニトロアルキル、カルボキシアルキル、ヒドロキシアルキル、スルホアルキルなどが含まれる。他方、句「アルキル部分」は、メチル、エチル、プロピル、ｔｅｒｔ−ブチルなど、純粋な開鎖の飽和炭化水素アルキル置換基だけの含むことが意図される。
式Ｉで表されるある菌は、典型的には、歪んだ環状アルキンである。驚くべきことに、本明細書に記載される式Ｉで表されるアルキン（例えば、ＸはＣ＝Ｏ、Ｃ＝Ｎ−ＯＲ3、Ｃ＝Ｎ−ＮＲ3Ｒ4、ＣＨＯＲ3、又はＣＨＮＨＲ3を表し；各Ｒ3及びＲ4は、独立して、水素又は有機基を表す）は、他の歪んだ環状アルキン（例えばＸはＣＨ2を表す）よりも１，３−双極子機能性化合物に対して高い反応性を有することを見出したことが判明した。
式Ｉで表されるアルキンのある種の態様では、Ｘは、Ｃ＝Ｎ−ＯＲ3（ここで、Ｒ3は有機基である）を表すことができる。例えば、Ｒ3は、式−（ＣＨ2）aＣ（Ｏ）Ｙを有することができ、ここで、ａは１〜３であり；ＹはＯＨ又はＮＨＲ5を表し；Ｒ5は水素又は１級アミン含有有機基のビオチン化生成物を表す。１級アミン含有基は、例えば、式−（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）b（ＣＨ2）c−Ｌd−（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）e（ＣＨ2）fＮＨ2及び／又は−（ＣＤ2ＣＤ2Ｏ）b（ＣＤ2）c−Ｌｄ−（ＣＤ2ＣＤ2Ｏ）e（ＣＤ2）fＮＨ2であってもよく、ここで、ｂ＝０〜１００（好ましくは１〜１０）；ｃ＝０〜１００（好ましくは１〜１０）；ｄ＝０〜１００（好ましくは１〜１０）；ｅ＝０〜１００（例えば、１０〜１００）；ｆ＝０〜１００（好ましくは１〜１０）；Ｌは任意の切断可能なリンカー（例えばジスルフィド）である。
式Ｉで表されるアルキンのある種の態様では、ＸはＣＨＯＲ3を表すことができ、ここで、Ｒ3は、アルキル基、アリール基、アルカリル基、及びアラルキル基からなる群から選択される。例えば、Ｒ3は式−Ｃ（Ｏ）Ｚを有することができ、ここで、Ｚはアルキル基、ＯＲ6、又はＮＨＲ7を表し；Ｒ6及びＲ7は、各々、独立して、アルキル基、アリール基、アルカリル基、及びアラルキル基からなる群から選択される。ある種の態様では、Ｒ7は、１級アミン含有有機基のビオチン化生成物であってもよい。１級アミン含有基は、例えば、式−（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）b（ＣＨ2）Ｃ−Ｌd−（ＣＨ2ＣＨ2ＣＯ）e（ＣＨ2）fＮＨ2及び／又は−（ＣＤ2ＣＤ2Ｏ）b（ＣＤ2）c−Ｌd−（ＣＤ2ＣＤ2Ｏ）e（ＣＤ2）fＮＨ2であってもよく、ここで、ｂ＝０〜１００（好ましくは１〜１０）；ｃ＝０〜１００（好ましくは１〜１０）；ｄ＝０〜１００（好ましくは１〜１０）；ｅ＝０〜１００（例えば、１０〜１００）；ｆ＝０〜１００（好ましくは１〜１０）；Ｌは任意の切断可能なリンカー（例えばジスルフィド）である。
式Ｉで表される例示的なアルキンは、ＸがＣ＝Ｏを表す種であり、式：
Figure 0005498952
で表されるアルキンである。
式Ｉで表される別の例示的なアルキンは、ＸがＣＨＯＨを表す種であり、式：
Figure 0005498952
で表されるアルキンである。
式Ｉで表される別の例示的なアルキンは、ＸがＣＨＮＨ2を表す種であり、式：
Figure 0005498952
で表されるアルキンである。
式Ｉで表される別の例示的なアルキンは、ＸはＣ＝Ｎ−ＯＲ3を表す種であり、式：
Figure 0005498952
で表されるアルキンであり、ここで、Ｒ3は、水素又は有機を表す（いくつかの態様では有機部分である）。
更なる例示的なアルキンは、少なくとも２つの末端を含む切断可能なリンカー断片；その切断可能なリンカー断片の第１末端に結合されたアルキン断片；及び切断可能なリンカー断片の第２末端に結合されたビオチン化断片を含むアルキンを含む。ある種の態様では、アルキン断片は、歪んだ環状アルキン断片を含む。ある種の態様では、アルキンは、さらに、少なくとも１つの重質量アイソトープを含む。場合により、アルキンは、少なくとも１つの検出可能な標識（例えば、蛍光標識）を含む。
式Ｉで表されるアルキンのある種の態様では、Ｘは、重合体基又は共重合体基を表すことができる。Ｘが共重合体基を表す態様については、共重合体基は、親水性セグメント及び疎水性セグメントを含むことができる。例えば、共重合体基は、式−［ＣＨ2ＣＨ2Ｏ］n−［Ｃ（Ｏ）（ＣＨ2）5Ｏ］m−Ｈで表される断片を含むことができ、ここで、ｎ＝０〜１００（例えば、１０〜１００）、及びｍ＝０〜１００（例えば、１０〜１００）である。水又は水性溶液の液滴が９０°未満の接触角を示す表面は、通常、「親水性」と呼ばれる。疎水性材料と水との接触角は、典型的には９０°を超える。
また、式Ｉで表されるアルキンを調製する典型的な方法を本明細書に開示する。一態様では、この方法は、式：
Figure 0005498952
で表されるアルケンを臭素化して、式：
Figure 0005498952
で表される二臭化物を提供し、式ＸＶで表される二臭化物を脱臭化水素化し、式：
Figure 0005498952
で表されるアルキンを提供することを含み、ここで、各Ｒ1は、独立して、水素、ハロゲン、ヒドロキシ、アルコキシ、硝酸エステル、亜硝酸エステル、硫酸エステル、及びＣ１−Ｃ１０有機基からなる群から選択され；各Ｒ2は、独立して、水素、ハロゲン、ヒドロキシ、アルコキシ、硝酸エステル、亜硝酸エステル、硫酸エステル、及びＣ１−Ｃ１０有機基からなる群から選択され；Ｘは、Ｃ＝Ｏ、Ｃ＝Ｎ−ＯＲ3、Ｃ＝Ｎ−ＮＲ3Ｒ4、ＣＨＯＲ3、又はＣＨＮＨＲ3を表し；並びに各Ｒ3及びＲ4は、独立して、水素又は有機基を表す（例えば、切断可能なリンカーを含むことができる）。
様々な１，３−双極子機能性化合物を用いて、本明細書に開示されるアルキンと反応させることができる。本明細書で使用するとき、「１，３−双極子機能性化合物」は、そこに結合された少なくとも１つの１，３−双極子基を有する化合物を含むことを意味する。本明細書で使用するとき、「１，３−双極子基」は、３つの原子の全体で非局在化した４つの電子を含む３原子π電子系を有する基を指すことが意図される。例示的な１，３−双極子基は、限定されないが、アジド、ニトリル酸化物、ニトロン、アゾキシ基、及びアシルジアゾ基が含まれる。ある種の態様では、１，３−双極子機能性化合物は、そこに結合した少なくとも１つ１，３−双極子基を有する生体分子であってもよい。場合により、少なくとも１つの１，３−双極子機能性化合物は、検出可能な標識（例えば、免疫圧政又はアフィニティーラベル）を含むことができる。
１以上の１，３−双極子機能性化合物（例えば、アジド機能性化合物、ニトリル酸化物機能性化合物、ニトロン機能性化合物、アゾキシ機能性化合物、及び／又はアシルジアゾ機能性化合物）は、環化反応において反応し、複素環式化合物を形成するのに有効な条件下で、本明細書に記載されるアルキンと組み合わせることができる。好ましくは、複素環式化合物を形成させるのに有効な条件は、添加触媒が実質的には存在しないことを含むことができる。複素環式化合物を形成するのに有効な条件はまた、様々な溶媒（例えば、限定されないが、水性溶媒（例えば水）及び非水性溶媒；プロトン性溶媒及び非プロトン性溶媒；極性溶媒及び非極性溶媒；並びにそれらの組み合わせを含む）の存在又は不存在を含むことができる。複素環式化合物は、様々な温度範囲で形成することができ、０℃〜４０℃（いくつかの態様では２３℃〜３７℃）の温度範囲は、生体分子が関与する場合に特に有用である。好都合には、反応時間は、１日未満であってもよく、場合により、１時間又はそれ未満である。
ある種の態様では、１以上の１，３−双極子機能性化合物とアルキンとの間の環化反応は、生細胞内又は生細胞の表面上で行うことができる。このような反応はインビボ又はエクスビボで行うことができる。本明細書で使用するとき、用語「インビボ」は、対象の生体である反応を指す。本明細書で使用するとき、用語「エクスビボ」は、対象の生体から取り出された、例えば、単離された組織（例えば、細胞）での反応を指す。取り出すことができる組織には、例えば、初代細胞（例えば、直近に対象から取り出された細胞であり、組織培地で制限された増殖又は維持が可能である細胞）、培養細胞（例えば、組織培地で拡張された増殖又は維持が可能である細胞）、並びにそれらの組み合わせが含まれる。
１，３−双極子機能性化合物の例示的な態様は、式Ｒ8−Ｎ3（例えば、原子価構造Ｒ8−-Ｎ−Ｎ＝Ｎ+によって表される）で表されるアジド機能性化合物であり、ここで、Ｒ8は、有機基（例えば、生体分子）を表す。場合により、Ｒ8は、検出可能な標識（例えば、アフィニティー標識）を含むことができる。
式Ｉの例示的なアルキンとの式Ｒ8−Ｎ3で表されるアジド機能性化合物の環化反応は、式：
Figure 0005498952
で表される１以上の複素環式化合物を得ることができ、ここで、各Ｒ1は、独立して、水素、ハロゲン、ヒドロキシ、アルコキシ、硝酸エステル、亜硝酸エステル、硫酸エステル、及びＣ１−Ｃ１０有機基からなる群から選択され；各Ｒ2は、独立して、水素、ハロゲン、ヒドロキシ、アルコキシ、硝酸エステル、亜硝酸エステル、硫酸エステル、及びＣ１−Ｃ１０有機基からなる群から選択され；Ｘは、Ｃ＝Ｏ、Ｃ＝Ｎ−ＯＲ3、Ｃ＝Ｎ−ＮＲ3Ｒ4、ＣＨＯＲ3、又はＣＨＮＨＲ3を表し；各Ｒ3及びＲ4は、独立して、水素又は有機基（例えば、切断可能なリンカーを含むことができる）を表し；並びに、Ｒ8は、有機基（例えば、生体分子、及び、場合により切断可能なリンカーを含むことができる）を表す。
１，３−双極子機能性化合物の別の例示的な態様は、式Ｒ8−ＣＮＯ（例えば、原子価構造Ｒ8−+Ｃ＝Ｎ−Ｏ-によって表される）で表されるニトリル酸化物機能性化合物であり、ここで、Ｒ8は、有機基（例えば、生体分子）を表す。場合により、Ｒ8は、検出可能な標識（例えば、アフィニティー標識）を含むことができる。
式Ｉの例示的なアルキンとの式Ｒ8−ＣＮＯで表されるニトリル酸化物機能性化合物の環化反応は、式：
Figure 0005498952
で表される１以上の複素環式化合物を得ることができ、ここで、各Ｒ1は、独立して、水素、ハロゲン、ヒドロキシ、アルコキシ、硝酸エステル、亜硝酸エステル、硫酸エステル、及びＣ１−Ｃ１０有機基からなる群から選択され；各Ｒ2は、独立して、水素、ハロゲン、ヒドロキシ、アルコキシ、硝酸エステル、亜硝酸エステル、硫酸エステル、及びＣ１−Ｃ１０有機基からなる群から選択され；Ｘは、Ｃ＝Ｏ、Ｃ＝Ｎ−ＯＲ3、Ｃ＝Ｎ−ＮＲ3Ｒ4、ＣＨＯＲ3、又はＣＨＮＨＲ3を表し；各Ｒ3及びＲ4は、独立して、水素又は有機基（例えば、切断可能なリンカーを含むことができる）を表し；並びに、Ｒ8は、有機基（例えば、生体分子、及び、場合により切断可能なリンカーを含むことができる）を表す。
１，３−双極子機能性化合物の別の例示的な態様は、式（Ｒ10）2ＣＮ（Ｒ10）Ｏ（例えば、原子価構造（Ｒ10）2Ｃ＝+Ｎ（Ｒ10）−Ｏ-によって表される）で表されるニトロン機能性化合物であり、ここで、各Ｒ10は、独立して、水素又は有機基を表し、ただし、少なくとも１つのＲ10は、有機（例えば、生体分子）を表す。場合により、少なくとも１つのＲ10は、検出可能な標識（例えば、アフィニティー標識）を含むことができる。
式Ｉの例示的なアルキンとの式（Ｒ10）2ＣＮ（Ｒ10）Ｏで表されるニトロン機能性化合物の環化反応は、式：
Figure 0005498952
で表される１以上の複素環式化合物を得ることができ、ここで、各Ｒ1は、独立して、水素、ハロゲン、ヒドロキシ、アルコキシ、硝酸エステル、亜硝酸エステル、硫酸エステル、及びＣ１−Ｃ１０有機基からなる群から選択され；各Ｒ2は、独立して、水素、ハロゲン、ヒドロキシ、アルコキシ、硝酸エステル、亜硝酸エステル、硫酸エステル、及びＣ１−Ｃ１０有機基からなる群から選択され；Ｘは、Ｃ＝Ｏ、Ｃ＝Ｎ−ＯＲ3、Ｃ＝Ｎ−ＮＲ3Ｒ4、ＣＨＯＲ3、又はＣＨＮＨＲ3を表し；各Ｒ3、Ｒ4、及びＲ10は、独立して、水素又は有機基を表し、ただし、少なくとも１つのＲ10は有機基（例えば、生体分子、及び、場合により切断可能なリンカーを含むことができる）を表す。
１，３−双極子機能性化合物の別の例示的な態様は、式Ｒ10−ＮＮ（Ｒ10）Ｏ（例えば、原子価構造Ｒ10−Ｎ＝+Ｎ（Ｒ10）−Ｏ-によって表される）で表されるアゾキシ機能性化合物であり、ここで、各Ｒ10は、独立して、水素又は有機基を表し、ただし、少なくとも１つのＲ10は、有機（例えば、生体分子）を表す。場合により、少なくとも１つのＲ10は、検出可能な標識（例えば、アフィニティー標識）を含むことができる。
式Ｉの例示的なアルキンとの式Ｒ10−ＮＮ（Ｒ10）Ｏで表されるアゾキシ機能性化合物の環化反応は、式：
Figure 0005498952
で表される１以上の複素環式化合物を得ることができ、ここで、各Ｒ1は、独立して、水素、ハロゲン、ヒドロキシ、アルコキシ、硝酸エステル、亜硝酸エステル、硫酸エステル、及びＣ１−Ｃ１０有機基からなる群から選択され；各Ｒ2は、独立して、水素、ハロゲン、ヒドロキシ、アルコキシ、硝酸エステル、亜硝酸エステル、硫酸エステル、及びＣ１−Ｃ１０有機基からなる群から選択され；Ｘは、Ｃ＝Ｏ、Ｃ＝Ｎ−ＯＲ3、Ｃ＝Ｎ−ＮＲ3Ｒ4、ＣＨＯＲ3、又はＣＨＮＨＲ3を表し；各Ｒ3、Ｒ4、及びＲ10は、独立して、水素又は有機基を表し、ただし、少なくとも１つのＲ10は有機基（例えば、生体分子、及び、場合により切断可能なリンカーを含むことができる）を表す。
アルキンと１以上の１，３−双極子機能性化合物との間の環化反応から形成される複素環式化合物が検出可能な標識を含む態様については、複素環式化合物は検出可能な標識を用いて検出することができる。例えば、検出可能な標識がアフィニティー標識である態様については、アフィニティー結合（例えば、アフィニティークロマトグラフィー）を用いて、複素環式化合物を検出することができる。
さらに、アルキンと１以上の１，３−双極子機能性化合物との間の環化反応から形成される複素環式化合物がビオチン化断片を含む態様については、複素環式化合物は、ビオチンと結合する化合物（例えば、アビジン及び／又はストレプトアビジン）と複素環式化合物との接触によって結合することができる。さらに、結合された複素環式化合物は、本明細書に記載される方法によって検出することができる。
本明細書に開示されるアルキンと１，３−双極子機能性化合物との間の環化反応は、様々な応用に使用可能である。例えば、本明細書に開示されるアルキンは、基質の表面に結合することができる。ある種の態様では、アルキンのＸ基は、基質の表面への結合点を表す。当業者は、Ｘ基が、好都合には、官能性（例えば、ビオチン、活性化エステル、活性化カーボネートなど）を含むように選択され、様々な反応を介して機能性基質（例えば、アミン官能性、チオール官能性など）へのアルキンの結合を可能にすることを認識する。
基質の表面に結合されたアルキンを有する基質は、１，３−双極子機能性化合物と反応し、基質に１，３−双極子機能性化合物を有効に化学的に結合している複素環式化合物を形成することができる。このような基質は、例えば、レジン、ゲル、ナノ粒子（例えば、磁性ナノ粒子を含む）、又はそれらの組み合わせの形態であってもよい。ある種の態様では、このような基質は、マイクロアレイ又はさらには３次元マトリックス若しくは足場の形態であってもよい。例示的な３次元マトリックスには、限定されないが、全てがＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）から入手可能である商品名ＡＬＧＩＭＡＴＲＩＸ ３Ｄ培養システム、ＧＥＬＴＲＩＸマトリックス、及びＧＩＢＣＯ３次元足場で利用可能であるマトリックスが含まれる。このような３次元マトリックスは、細胞培養を含む応用に特に有用であり得る。
１，３−双極子機能性生体分子（例えば、１，３−双極子機能性ペプチド、タンパク質、糖タンパク質、核酸、脂質、単糖、オリゴ糖、及び／又は多糖）は、複素環式化合物を形成させるための環化反応に有効な条件下で、その表面に結合されたアルキンを有する基質と１，３−双極子機能性生体分子との接触によって、基質表面に固定、好ましくは共有結合することができる。好ましくは、複素環式化合物を形成させるために有効な条件は、添加触媒が実質的に存在しないことを含んでもよい。また、複素環式化合物を形成させるための条件は、限定されないが、水性溶媒（例えば、水及び他の生物学的流体）及び非水性溶媒；プロトン性溶媒及び非プロトン性溶媒；極性溶媒及び非極性溶媒；並びにそれらの組み合わせをすくむ様々な溶媒の存在又は不存在を含んでもよい。複素環式化合物は、様々な温度範囲で形成することができ、０℃〜４０℃（いくつかの態様では２３℃〜３７℃）の温度範囲が特に有用である。好都合には、反応時間は、１日未満であってもよく、場合により、１時間又はそれ未満である。
例えば、基質が３次元マトリックスの形態であり、１，３−双極子機能性生体分子が１，３−双極子機能性タンパク質（例えば、アジド機能性タンパク質）である場合、環化反応は、３次元マトリックスに固定されたタンパク質を有する製品をもたらすことができる。このようなマトリックスは、限定されないが、細胞株の分離及び／又は固定を含む様々な使用を有することができる。これらの応用に特に有用なタンパク質には、限定されないが、コラーゲン、フィブロネクチン、ゼラチン、ラミニン、ビトロネクチン、及び／又は細胞播種に一般に使用される他のタンパク質が含まれる。
別の例について、１，３−双極子機能性化合物と式Ｉで表されるアルキン（式中、Ｘは重合体基又は共重合体基を表す）との間の環化反応は、例えば、以下に本明細書に記載される薬物送達を制御するために使用することができる。例えば、式Ｉで表されるアルキン（式中、Ｘは親水性セグメント及び疎水性セグメントを含む共重合体基を表す）は、重合体又は共重合体と混和することができる。さらに、式Ｉで表されるアルキン（式中、Ｘは親水性セグメント及び疎水性セグメントを含む共重合体基を表す）が親水性セグメント及び疎水性セグメントを有する共重合体と混和される場合、共重合体ミセルを形成することができる。親水性セグメント及び疎水性セグメントを有する、特に有用な共重合体は、式Ｒ9Ｏ−［ＣＨ2ＣＨ2Ｏ］p−［Ｃ（Ｏ）（ＣＨ2）5Ｏ］o−Ｈの共重合体を含み、ここで、Ｒ９は、アルキル基（例えば、メチル）、ｐ＝０〜１００（例えば、１〜１００）、及びｏ＝０〜１００（例えば、１〜１００）を表す。
上記に本明細書中に記載される式１であらわさアルキンを含む共重合体ミセルは、好都合には、薬物送達を制御するために用いることができる。例えば、式１で表されるアルキンを含む共重合体ミセルは、少なくとも１つの１，３−双極子機能性薬物と組み合わせることができ、複素環式化合物を形成し、薬物を共重合体ミセルに結合させるのに有効な条件下で反応させることができる。例えば、Ｎｉｓｈｉｙａｍａ ｅｔ ａｌ．，Ａｄｖ．Ｐｏｌｙｍ．Ｓｃｉ．２００６，１９３：６７−１０１；Ｇａｕｃｈｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌ．Ｒｅｌｅａｓｅ ２００５，１０９：１６９−１８８；Ｃｈｏｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｄｉｓｐｅｒｓｉｏｎ Ｓｃｉ．Ｔｅｃｈ．２００３，２４：４７５−４８７；Ｌａｖａｓａｎｉｆａｒ ｅｔ ａｌ．，Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｒｅｖ．２００２，５４：１６９−１９０；Ｒｏｓｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｒｅｖ．２００１，５３：９５−１０８を参照されたい。
さらに、銅などの毒性触媒を必要としないため、本発明によって提供される新規な付加環化反応は生細胞の標識に使用することができる。例えば、細胞は、最初に、アジド機能性前躯体で代謝的に標識し、アジド機能性糖タンパク質（糖コンジュゲートとも呼ばれる）などのアジド機能性生体分子（バイオコンジュゲートとも呼ばれる）を生成することができる。次に、細胞は、細胞表面でアジド機能性生体分子の標識（付加環化反応を介する）を可能にする条件下で、上記で検討された溶液中で又は基質上で、式Ｉで表されるアルキンと接触させることができる。得られるトリアゾールコンジュゲートは、細胞表面で検出することができ、又は細胞によって取り込まれ、細胞内で検出することができる。
また、式Ｉで表されるアルキンは、例えば、核磁気共鳴画像（ＭＲＩ）用の試薬として、画像応用に有用性を有することができる。別の例について、式Ｉで表されるアルキンは蛍光性タグを含んでもよい。また、式Ｉで表されるアルキンは、質量分析を利用する定性的又は定量的なプロテオミクル及びグライコミクス応用において有用であり得る。式Ｉで表されるアルキンは、デューテリウム、13Ｃ、15Ｎ、35Ｓなどの１以上の重質量アイソトープを含むように選択することができ、次に、本明細書に記載されるように、アジド機能性生体分子を標識し、及び／又は固定するために使用することができる。
また、式Ｉで表されるアルキンは、ワクチンなどの応用に有用性を有することができる。例えば、式Ｉで表されるアルキンは、アジド機能性タンパク質（例えば、アジド機能性炭化水素、アジド機能性ペプチド、及び／又はアジド機能性糖ペプチド）と反応することができ、得られるトリアゾールはワクチン用の担体タンパク質として用いることができる。
本発明は、以下の実施例によって例証される。特定の実施例、材料、量、及び手法は、本明細書に記載される本発明の範囲及び精神に従って広く解釈されなければならない。
実施例１
銅不含及び迅速Ｈｕｉｓｇｅｎ付加環化による生細胞の代謝的に標識された糖コンジュゲートの視覚化
アジドは、生物系においてごく稀であり、バイオコンジュゲートのための魅力的な化学的操作として明らかとなっている（Ｋｏｌｂ ａｎｄ Ｓｈａｒｐｌｅｓｓ，Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ Ｔｏｄａｙ ２００３，８：１１２８−１ １３７；Ｄｅｄｏｌａ ｅｔ ａｌ．，Ｏｒｇ．Ｂｉｏｍｏｌ．Ｃｈｅｍ．２００７ ５：１００６−１０１７；Ｍｏｓｅｓ ａｎｄ Ｍｏｏｒｈｏｕｓｅ，Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｒｅｖ．２００７，３６：１２４９−１２６２；Ｎａｎｄｉｖａｄａ ｅｔ ａｌ．，Ａｄｖ．Ｍａｔｅｒ．２００７，１９：２１９７−２２０８；Ｗｕ ａｎｄ Ｆｏｋｉｎ，Ａｌｄｒｉｃｈｉｍｉｃａ Ａｃｔａ ２００７，４０：７−１７）。特に、安定したチアゾールを与える、末端アルケンを用いたＣｕ１触媒の１，３−双極子付加環化（Ｒｏｓｔｏｖｔｓｅｖ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．２００２，１ １４：２７０８−２７１ １；Ｒｏｓｔｏｖｔｓｅｖ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．２００２，４１：２５９６−２５９９；Ｔｏｒｎｏｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．２００２，６７：３０５７−３０６４）は、様々な生体分子は、様々な生体分子のタグ化（Ｃｈｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２００３，３０１：９６４−９６７；Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２００３，１２５：３１９２−３１９３；Ｋｈｏ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ ＵＳＡ ２００４，１０１：１２４７９−１２４８４；Ｇｉｅｒｌｉｃｈ ｅｔ ａｌ．，Ｏｒｇ．Ｌｅｔｔ．２００６，８：３６３９−３６４２；Ｌｉｎｋ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ ＵＳＡ ２００６，１０３：１０１８０−１０１８５）、活性基準のタンパク質プロファイリング（Ｓｐｅｅｒｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２００３，１２５：４６８６−４６８７）、並びにマイクロアレイ及び低分子ライブラリーの化学合成（Ｓｕｎ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．２００６，１７：５２−５７）用に使用されている。
アジドを生体分子に挿入するという魅力的なアプローチは代謝的標識に基づき、それにより、アジドを含む生合成前躯体は、細胞の生合成機構を用いることによって生体分子に組み込まれる（Ｐｒｅｓｃｈｅｒ ａｎｄ Ｂｅｒｔｏｚｚｉ，Ｎａｔ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．２００５，１：１３−２１）。このアプローチは、種々の反応性プローブを用いた生物系のタンパク質、グリカン、及び脂質をタグ化するために使用されている。これらのプローブは、単糖選択的な糖タンパク質のマッピングを促進し、グリコシル化部位を特定することができる（Ｈａｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２００７，１２９：７２６６−７２６７）。また、アルキンプローブは、アジド修飾された生体分子の細胞表面の画像用に使用され、特に魅力的なアプローチは、［３＋２］付加環化による非蛍光性前躯体からの蛍光性プローブの発生を伴う（Ｓｉｖａｋｕｍａｒ ｅｔ ａｌ．，Ｏｒｇ．Ｌｅｔｔ．２００４，６：４６０３−４６０６）。
Ｃｕ1触媒の細胞毒性は、細胞が生存し続けなければならない応用を妨げ（Ｌｉｎｋ ａｎｄ Ｔｉｒｒｅｌ，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２００３，１２５：１１１６４−１１１６５）、したがって、Ｃｕ１なしの［３＋２］付加環化の開発が非常に必要である（Ｔｕｒｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１９７３，９５：７９０−７９２；Ａｇａｒｄ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２００４，１２６：１５０４６−１５０４７；ｖａｎ Ｂｅｒｋｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｃｈｅｍ−ＢｉｏＣｈｅｍ ２００７，８：１５０４−１５０８）。この点において、アルキンは、環の歪みによって活性化することができ、例えば、８員環内のアルキンを律則することにおり１８ｋｃａｌ／ｍｏｌの歪みが生じ、その大部分は、アジドを用いた［３＋２］付加環化に基づいて、遷移状態で放出される（Ｔｕｒｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１９７３，９５：７９０−７９２；Ａｇａｒｄ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２００４，１２６：１５０４６−１５０４７）。結果として、１などの付加環化は、触媒を必要とせずに室温でアジドと反応する。歪みを促進した付加環化は、目立った細胞毒性なしに生体分子を標識するために使用されている（Ａｇａｒｄ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２００４，１２６：１５０４６−１５０４７）。しかしながら、このアプローチの範囲は、反応の遅速性のために制限されている（Ａｇａｒｄ ｅｔ ａｌ．，ＡＣＳ Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．２００６，１：６４４−６４８）。オクチン環への電子求引基の付加は、歪みを促進した付加環化の速度を高めることができる；しかしながら、ホスフィン２とのＳｔａｕｄｉｎｇｅｒ連結は、アジドによる細胞表面標識に最も魅力的な試薬を提供する。
化合物３などの４−ジベンゾシクロオクチノールは、アジドによる生細胞の標識にとって理想的であることが予測されたが、それは、芳香族環が更なる環の歪みを強制し、アルキンとコンジュゲートすることが期待されるためであり、それにより、アジドによる金属不含の［２＋３］付加環化におけるアルキンの反応性を増加させる。しかしながら、化合物は優れた安定性を有するべきであり、これは、芳香族環のオルトの水素原子が求核攻撃からアルキンを保護するためである。さらに、３のヒドロキシ基は、蛍光性プローブ及びビオチンなどのタグの取り込みの操作を提供する。
化合物３は、既知の（Ｊｕｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．１９７８，４３：３６９８−３７０１；Ｊｕｎｇ ａｎｄ Ｍｉｌｌｅｒ，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１９８１，１０３：１９８４−１９９２）３−ヒドロキシ−１，２：５，６−ジベンゾシクロオクタ−１，５，７−トリエン（４）から、ＴＢＳエーテルなどのヒドロキシ基の保護によって容易に調製し、５を得ることができ、それを臭素化し、収率６０％で二臭化物６を得た（スキーム１；図２）。ＴＢＳ保護基は、後者の変換中に失われたが、臭素化は、アルコール４に行うと低収率であった。０℃でＴＨＦ中のＬＤＡを用いた処置による６の脱臭化水素化（Ｓｅｉｔｚ ｅｔ ａｌ，Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．１９６９，８１：４２７−４２８；Ｓｅｉｔｚ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．１９６９，８：４４７−４４８）により、収率４５％で標的シクロオクチンを得た。
化合物３は優れた長期の保存期間を有し、処理後、チオール及びアミンなどの求核試薬と反応しなかった。しかしながら、アジドへの曝露により、高速反応が起こり、高収率で対応するチアゾールを得た。例えば、チアゾール１０〜１３は、メタノール中で対応するアジド含有糖及びアミノ酸誘導体と、３とを３０分間反応させることによって、位置異性体の混合物として定量的収率で得られた（スキーム２；図３及び図４）。メタノール及び水／アセトニトリル（１：４ｖ／ｖ）中の３とベンジルアジドとの反応の進行は、ベンジルのプロトンシグナルの積分によって、１Ｈ ＮＭＲ分光によってモニターされ、それぞれ０．１７と２．３ｍ-1ｓ-1の二次速度定数を決定した。アセトニトリル／水中での３との反応の速度定数は、シクロオクチン１との反応の速度定数よりも約３桁高い。
３の優れた反応性を確立したので、本発明者らは、ビオチンで修飾される、４−ジベンゾシクロオクチノールの誘導体（９；スキーム１；図２）の製造に注意を当てた。このような試薬は、アジド含有生合成前駆体を用いて細胞を代謝的に標識し、その後、９を用いて付加環化し、蛍光プローブで修飾されたアビジンによって処理した後に生体分子を視覚化することを可能にすべきである。あるいは、９を用いた糖コンジュゲートのビオチン化は、固体支持体に固定されたアビジンを用いて、グライコミクスのためのこれらの誘導体を単離することを可能にすべきである。化合物９は、活性化した中間体７を得るために、４−ニトロフェニルクロロギ酸エステルを用いた３の処理を伴う２工程反応、その後、即座の８との反応によって容易に調製することができる。また、４−ジベンゾシクロオクチノール（９）は、蛍光性タグで官能化され、蛍光性誘導体を得てもよい（スキーム３；図５）。
次に、Ｎ−アジドアセチルシアル酸（ＳｉａＮＡｚ）部分を糖タンパク質に代謝的に導入するために、３日間、２５μｍｏｌ濃度のＮ−アジドアセチルマンノサミン（Ａｃ4ＭａｎＮＡｚ）の存在下でＪｕｒｋａｔ細胞を培養した（Ｌｕｃｈａｎｓｋｙ ａｎｄ Ｂｅｒｔｏｚｚｉ，Ｃｈｅｍ−ＢｉｏＣｈｅｍ ２００４，５：１７０６−１７０９）。負の対照として、Ａｃ4ＭａｎＮＡｚの不存在下で増殖するＪｕｒｋａｔ細胞を使用した。種々の期間、化合物９の３０μｍｏｌ濃度溶液に細胞を晒し、洗浄後、細胞をアビジン−フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）で１５分間、４℃で染色した。２工程の細胞表面標識の効率は、細胞溶解物の蛍光強度を測定することによって決定された。比較のために、細胞表面のアジド部分はまた、ビオチン修飾されたホスフィン２を用いたＳｔａｕｄｉｎｇｅｒ標識によって標識され、その後、アビジン−ＦＩＴＣで処理された。９による標識は、６０分のインキュベーション時間後、ほぼ完了した（図６ａ）。
興味深いことに、同一の条件下で、ホスフィン２（Ａｇａｒｄ ｅｔ ａｌ．，ＡＣＳ Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．２００６，１：６４４−６４８）は有意に低い蛍光強度を与え、これは、Ｓｔａｕｄｉｎｇｅｒ連結による細胞表面標識がゆっくりであり、有効でないことを示す。各ケースでは、対照細胞は、非常に低い蛍光強度を示し、それは、バックグラウンド標識が無視されることを示す。９を用いた２工程標識アプローチは、形態及びトリパンブルーの排出によって決定される、細胞の生存率に影響はないことが判明した（データ示さず、図７）。
細胞表面標識の濃度依存性は、２及び９の種々の濃度で細胞をインキュベーションすることによって試験し、その後、アビジン−ＦＩＴＣで染色した（図６ｂ）。予期されるとおり、アジド部分を示す細胞は、蛍光強度の用量依存的な増加を示した。信頼性のある蛍光標識は、９の３μｍｏｌ濃度で達成された；しかしながら、最適な結果は、３０〜１００μｍｏｌ濃度の範囲の濃度で得られた。標識の増加は、９の制限された溶解性のために１００μｍｏｌ濃度を超える濃度では観察されなかった。
次に、共焦点顕微鏡によって生細胞のアジド含有糖コンジュゲートの視覚化に注意を集中させた。したがって、付着したチャイニーズ・ハムスター・オバリー（ＣＨＯ）細胞をＡｃ４ＭａｎＮＡｚ（１００μｍｏｌ濃度）の存在下で３日間培養した。得られた細胞表面アジド部分を９（３０μｍｏｌ濃度）で１時間処理し、次に、アビジン−ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８で１５分間、４℃で処理した。予期されるように、染色は、表面でのみ観察され（図８）、標識手法は、周囲温度又は４℃で行った場合に等しく効果的であった。さらに、ブランク細胞は、非常に低い蛍光染色を示し、これは、バックグラウンド標識が無視し得ることが確認された。細胞表面の糖コンジュゲートは、エンドサイトーシスにおって定常的にリサイクルされ、この手順をモニターするために、代謝てきに標識された細胞は、標準的なプロトコールに従って、９及びアビジン−Ａｌｅｘａ４８８で反応され、３７℃で１時間インキュベートし、その後、共焦点顕微鏡によって調べられた。本出願人は、標識された有意量の糖タンパク質は小胞状コンパートメントに内在化されていたことを観察した。
これらの試験の終了時、Ｂｅｒｔｏｚｚｉ及び共同研究者らは、化合物３と同じ反応速度でアジドと反応するジフッ素化シクロオクチン（ＤＩＦＯ）を報告した（Ｂａｓｋｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ２００７，１０４：１６７９３−１６７９７）。ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒに連結されたＤＩＦＯは、グリカン輸送（ｔｒａｆｆｉｃｋｉｎｇ）の動力学を調査するために使用された。１時間のインキュベーション後、標識されたグリカンは、エンドソームとゴルジ体のマーカーとともに共局在化したことが分かった。
３及び９などの４−ジベンゾシクロオクチノールは、化学合成の容易さ、及び芳香族部分の官能化による付加環化の速度をさらに高める可能性などの、研究者によっていくつかの好都合な特徴を有する。また、芳香族環の修飾は、糖タンパク質、及び生細胞の他の生体分子の輸送をリアルタイムでモニターすることを可能にする、アジド含有化合物を用いた［３＋２］付加環化に基づいて蛍光性となる試薬を得るための絶好の機会を提供することができる。
一般法及び材料
化学物質はＡｌｄｒｉｃｈ及びＦｌｕｋａから購入され、さらに精製せずに使用した。ジクロロメタンはＣａＨ2から蒸留され、モレキュラーシーブ４Å上で保存された。ピリジンはＰ2Ｏ5から蒸留され、モレキュラーシーブ４Å上で保存された。ＴＨＦはナトリウムから蒸留された。全ての反応は、アルゴン雰囲気下で無水条件で行われた。反応物は、Ｋｉｅｓｅｌｇｅｌ ６０ Ｆ２５４（Ｍｅｒｃｋ）上の薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）によってモニターされた。検出は、紫外線（ＵＶ）光（２５４ｎｍ）による試験によるか又はメタノール中の５％硫酸による炭化によった。フラッシュクロマトグラフィーは、シリカゲル（Ｍｅｒｃｋ、７０〜２３０メッシュ）上で行われた。イアトロビーズ（Ｉａｔｒｏｂｅａｄｓ）（６０μｍ）をＢｉｏｓｃａｎから購入した。1Ｈ ＮＭＲ（１Ｄ、２Ｄ）及び13Ｃ ＮＭＲは、Ｓｕｎワークステーションを備えたＶａｒｉａｎ Ｍｅｒｃ ３００分光計、及びＶａｒｉａｎ ５００及び６００ＭＨｚ分光計で記録された。1Ｈ及び13Ｃ ＮＭＲスペクトルは、ＣＤＣｌ3で記録され、ケミカルシフト（δ）は、保護された化合物に対する内部標準として、溶媒ピーク（1Ｈ、δ７．２４；13Ｃ、δ７７．０）と比較したｐｐｍで与えられる。陰イオンマトリックス支援レーザー脱離イオン化−飛行時間（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）は、マトリックスとしてジヒドロ安息香酸を用いて、ＶＯＹＡＧＥＲ−ＤＥ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓで記録された。高分解能質量スペクトルは、マトリックスとしてＴＨＦ中の２，５−ジヒドロキシ−安息香酸を用いることによって、ポジティブモードでＶＯＹＡＧＥＲ−ＤＥ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ上で得られた。
３−ｔｅｒｔ−ブチル−ジメチルシリル−オキシ−１，２：５，６−ジベンゾシクロオクタ−１，５，７−トリエン（５）
ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル塩化物（３．０ｇ、２０ｍｍｏｌ）は、ＣＨ2Ｃｌ2（２０ｍＬ）及びピリジン（５ｍＬ）の混合物中の４（２．２ｇ、１０ｍｍｏｌ）の撹拌された溶液に添加された。６時間室温で撹拌した後、反応混合物を水で希釈し、ＣＨ2Ｃｌ2（４０ｍＬ）で抽出した。合わせた有機抽出物を水及びブラインで洗浄し、次に乾燥（ＭｇＳＯ4）させた。溶媒を減圧下で蒸発させ、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘキサン／酢酸エチル、７／１、ｖ／ｖ）によって精製し、５（２．９ｇ、８７％）を得た。
Figure 0005498952
３−ヒドロキシ−７，８−ジブロモ−１，２：５，６−ジベンゾシクロオクテン（６）
ＣＨＣｌ3中の臭素（０．８ｇ、５ｍｍｏｌ）の溶液を０℃でＣＨＣｌ3（３０ｍＬ）中の５（１．７ｇ、５ｍｍｏｌ）に滴下した添加した。反応混合物は、反応が完了する（ＴＬＣによってモニターされる）まで、室温で１２時間撹拌された。得られた混合物を水性飽和チオ硫酸ナトリウム溶液（１５ｍＬ）で洗浄し、乾燥（ＭｇＳＯ4）させた。溶媒を減圧下で蒸発させ、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘキサン／ＣＨ2Ｃｌ2、７／１、ｖ／ｖ）によって精製し、６（１．２ｇ、６０％）を得た。
Figure 0005498952
３−ヒドロキシ−７，８−ジデヒドロ−ｌ，２：５，６−ジベンゾシクロオクテン（３）
テトラヒドロフラン（５０ｍＬ）中の６（１．１ｇ、３ｍｍｏｌ）の溶液に、アルゴン雰囲気下、室温でテトラヒドロフラン（２．０Ｍ）（５ｍＬ）中のリチウム・ジイソプロピルアミドを滴下して添加した。反応混合物を２時間室温で撹拌し、その後、氷水（５０ｍＬ）上に注ぎ、得られた混合物をＣＨ2Ｃｌ2（２×１００ｍＬ）で抽出した。合わせた抽出物を水及びブラインで洗浄し、次に乾燥（ＭｇＳＯ4）させた。溶媒を減圧下で蒸発させ、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘキサン／酢酸エチル、５／１、ｖ／ｖ）によって精製し、３（０．３０ｇ、４５％）を得た。
Figure 0005498952
カルボン酸７，８−ジデヒドロ−１，２：５，６−ジベンゾシクロオクテン−３−イルエステル４−ニトロフェニルエステル（７）
ＣＨ2Ｃｌ2（３０ｍＬ）中の３（０．２２ｇ、１ｍｍｏｌ）の溶液に、４−ニトロ−フェニルクロロギ酸塩（０．４ｇ、２ｍｍｏｌ）及びピリジン（０．４ｍｌ、５ｍｍｏｌ）を添加した。４時間、周囲温度で撹拌後、得られた混合物をブライン（２×１０ｍＬ）で洗浄し、有機層を乾燥（ＭｇＳＯ4）した。溶媒を減圧下で蒸発させ、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘキサン／酢酸エチル、１０／１、ｖ／ｖ）によって精製し、７（０．３４ｇ、８９％）を得た。
Figure 0005498952
カルボン酸７，８−ジデヒドロ−１，２：５，６−ジベンゾシクロオクテン−３−イルエステル、８’−ビトチニルアミン−３’，６’−ジオキサオクタン１’−アミド（９）
ＤＭＦ（１０ｍＬ）中の８（３７ｍｇ、０．１ｍｍｏｌ）及びＮＥｔ３（３０ｍｇ、０．３ｍｍｏｌ）の溶液に７（３９ｍｇ、０．１ｍｍｏｌ）をアルゴン雰囲気下で添加された。 反応混合物を一晩周囲温度で撹拌後、溶媒を減圧下で蒸発させ、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ＣＨ2Ｃｌ2／ＣＨ3ＯＨ、２０／１、ｖ／ｖ）によって精製し、９（４４ｍｇ、７１％）を得た。
Figure 0005498952
糖質及びペプチドを用いたクリック反応のための一般法
３−ヒドロキシ−７，８−ジデヒドロ−１，２：５，６−ジベンゾシクロオクテン（２．２ｍｇ、０．０１ｍｍｏｌ）をＣＨ3ＯＨ（１ｍＬ）に溶解し、アジド（３−アジドプロピル２，３，４，６−テトラ−Ｏ−アセテート−α−Ｄ−マンノピラノシド、１−Ｏ−［ジメチル（１，１，２−トリメチルプロピル）シリル］−４，６−Ｏ−イソプロピリジン−２−アジド−２−デオキシ−β−Ｄグルコピラノース、４，７，８−トリ−Ｏ−アセチル−５−アセトアミド−９−アジド−２，３−アンヒドロ−３，５，９−トリ−デオキシ−Ｄ−グリセロ−Ｄ−ガラクト−非−２−エノン酸メチルエステル、及び４−アジド−Ｎ−［（１，１−ジメチルエトキシ）カルボニル］−Ｌフェニルアラニン、１．０当量）に添加した。反応をＴＬＣによってモニターし、反応混合物を３０分間、室温で撹拌後、反応は完了した。溶媒を減圧下で蒸発させ、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーによって精製し、定量的収率でそれぞれ所望の生成物１０〜１３を得た。
化合物１０；
Figure 0005498952
化合物１１；
Figure 0005498952
化合物１２；
Figure 0005498952
化合物１３；
Figure 0005498952
Ｎ−Ｂｏｃ−３，６−ジオキサオクタン−１，８−ジアミン
ＣＨ2Ｃｌ2（１００ｍＬ）中のジ−ｔｅｒｔ−ブチルジカーボネート（ｄｉ−Ｂｏｃ）（６ｇ、２８ｍｍｏｌ、０．５当量）の溶液をトリス（エチレングリコール）−１，８−ジアミン（７．６ｇ、５６ｍｍｏｌ）及びジイソプロピルエチルアミン（１０ｍＬ、５７ｍｍｏｌ）の混合物に、室温で２時間かけて滴下して添加した。反応混合物を６時間撹拌し、その後、真空中で濃縮した。フラッシュシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ＣＨ２Ｃｌ２／ＣＨ３ＯＨ、１０／１、ｖ／ｖ）による精製によって、Ｎ−Ｂｏｃ−３，６−ジオキサオクタン−１，８−ジアミン（４．１ｇ、５８％）を得た。
Figure 0005498952
Ｎ−Ｂｏｃ−Ｎ’−ビオチニル−３，６−ジオキサオクタン−１，８−ジアミン
ＤＭＦ（１００ｍｌ）中のビタミンＨ（ビオチン）（２．２ｇ，９ｍｍｏｌ），Ｏ−ベンゾトリアゾール−１−イル−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート（ＨＢＴＵ）（３ｇ、８ｍｍｏｌ）、及びＤＩＰＥＡ（１．８ｍＬ、１０ｍｍｏｌ）の溶液を室温で１０分間撹拌し、その後、Ｎ−Ｂｏｃ−３，６−ジオキサオクタン−１，８−ジアミン（１．５ｇ、６ｍｍｏｌ、１）の溶液に滴下して添加した。反応混合物を１時間室温で撹拌し、その後、ＤＭＦを真空中で除去し、油性残渣を得た。それをフラッシュシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ＣＨ2Ｃｌ2／ＣＨ3ＯＨ、２５／１、ｖ／ｖ）によって精製し、Ｎ−Ｂｏｃ−Ｎ’−ビオチニル−３，６−ジオキサオクタン−１，８−ジアミン（２．０ｇ、９０％）を得た。
Figure 0005498952
Ｎ−ビオチニル−３，６−ジオキサオクタン−１，８−ジアミン（８）
Ｎ−Ｂｏｃ−Ｎ’−ビオチニル−３，６−ジオキサオクタン−１，８−ジアミン（１．９ｇ、４ｍｍｏｌ）をＣＨ2Ｃｌ2（２０ｍＬ）中の５０％ＲＦＡに溶解し、１時間室温で撹拌した。溶媒を減圧下で蒸発させ、油性残渣を得て、それをフラッシュシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ＣＨ2Ｃｌ2／ＣＨ３ＯＨ、１０／１、ｖ／ｖ）によって精製し、７（１．３ｇ、９２％）を得た。
Figure 0005498952
生物学的実験のための試薬
合成化合物２及び９をＤＭＦ中で再構成し、８０℃で保存した。ＤＭＦの最終濃度は、毒性効果を避けるために０．５６％を超えることはなかった。
細胞表面アジド標識及び蛍光強度による検出
重炭酸ナトリウム（１．５ｇＬ-1）、グルコース（４．５ｇＬ-1）、ＨＥＰＥＳ（１０ｍＭ）、及びピルビン酸ナトリウム（１．０ｍＭ）を含むように調整され、ペニシリン（１００ｕｍＬ-1）／ストレプトアビジン（１００μｇｍＬ-1；Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ）及びウシ胎児血清（ＦＢＳ、１０％；Ｈｙｃｏｎｅ）を補足された、Ｌ−グルタミン（２ｍＭ）を含むＲＰＭＩ１６４０培地（ＡＴＣＣ）中でヒトＪｕｒｋａｔ細胞（クローンＥ６−１；ＡＴＣＣ）を培養した。湿度のある５％ＣＯ2雰囲気下、３７℃で細胞を維持した。ペルアセチル化されたＮ−アジドアセチルマンノサミン（Ａｃ４ＭａｎＮＡｚ；２５μｍｏｌの最終濃度）の存在下で３日間、Ｊｕｒｋａｔ細胞を培養し、細胞表面の糖タンパク質への対応するＮ−アジドアセチルシアル酸（ＳｉａＮＡｚ）の代謝的な組込みをもたらした。アジドを有するＪｕｒｋａｔ細胞と未処理の対照細胞を標識バッファー（ＤＰＢＳ、ＦＢＳ（１％）を補足されている）中の化合物２及び９（０〜１００μｍｏｌ濃度）とともに、０〜１８０分間室温でインキュベートした。標識バッファーで細胞を３回洗浄し、その後、フルオレセインをコンジュゲートさせたアビジン（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）とともに１５分間４℃でインキュベートした。３回の洗浄及び細胞溶解後、細胞溶解物は、マイクロプレートリーダー（ＢＭＧ Ｌａｂｔｅｃｈ）を用いて、蛍光強度（４８５ｅｘ／５２０ｅｍ）について分析された。データ点は、３点測定で集め、３つの別々の実験を代表する。細胞の生存率は、トリパンブルーの排出を用いた手法で異なる点で評価された。
細胞標識及び蛍光顕微鏡による検出
重炭酸ナトリウム（１．５ｇｍＬ-1）を含むように調整され、ペニシリン（１００ｕｍＬ−１）／ストレプトアビジン（１００μｇｍＬ-1）及びＦＢＳ（１０％）を補足された、Ｌ−グルタミン（２ｍＭ）を含むＫａｉｇｈｎ変法のＨａｍ’ｓ Ｆ−１２培地（Ｆ−１２Ｋ）中でチャイニーズ・ハムスター・オバリー（ＣＨＯ）細胞（クローンＫ１；ＡＴＣＣ）を培養した。湿度のある５％ＣＯ2雰囲気下、３７℃で細胞を維持した。ＣＨＯ細胞は、細胞表面の糖タンパク質に代謝的にＳｉａＮＡｚ（１００μｍｏｌ最終濃度）の存在下で３日間増殖させた。次に、アジドを有するＣＨＯ細胞及び未処理の対照細胞をカバーガラスに移し、３６時間、元の培地中で培養した。ＣＨＯ生細胞は、標識バッファー（ＤＰＢＳ、ＦＢＳ（１％）を補足してある）で１時間４℃又は室温でビオチン化された化合物９（３０マイクロモル濃度）で処理され、次に、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）がコンジュゲートされたアビジンとともに１５分間４℃でインキュベートされた。標識バッファーで細胞を３回洗浄し、ホルムアルデヒド（ＰＢＳ中３．７％）で固定するか又は固定前に１時間３７℃でインキュベートした。遠赤色蛍光ＴＯ−ＰＲＯ−３色素（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）で核を標識した。細胞は、画像化前にＰｅｒｍａＦｌｏｕｒ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｅｌｅｃｔｒｏｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）に備えつけた。初期の解析は、Ｚｅｉｓｓ Ａｘｉｏｐｌａｎ２蛍光顕微鏡で行った。共焦点画像は、６０×（Ｎａ１．４２）油浸対物レンズを用いて得た。光学的断片の積層をｚ次元で集めた。各対物のために計算された最適条件に基づくステップサイズは、０．２５〜０．５μｍであった（ｚ−プロジェクション）。その後、各スタックを１つの画像にまとめられた。解析は、ＩｍａｇｅＪ １．３９ｆソフトウェア（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，ＵＳＡ）及びＡｄｏｂｅ Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐ ＣＳ３拡張バージョン１０．０（Ａｄｏｂｅ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ）を用いてオフラインで行い、それにより全ての画像を等しく処理した。
実施例２
ビオチン及び切断可能なリンカーを含むアルキン試薬
アジドは、生物系においてごく稀であり、バイオコンジュゲートのための魅力的な化学的操作として明らかとなっている（Ｄｅｄｏｌａ ｅｔ ａｌ．，Ｏｒｇ．Ｂｉｏｍｏｌ．Ｃｈｅｍ．２００７，５，１００６；Ｋｏｌｂ ａｎｄ Ｓｈａｒｐｌｅｓｓ，Ｄｒｕｇ Ｄ ｉｓ．Ｔｏｄａｙ ２００３，８，１ １２８；Ｍｏｓｅｓ ａｎｄ Ｍｏｏｒｈｏｕｓｅ，Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｒｅｖ．２００７，３６，１２４９；Ｎａｎｄｉｖａｄａ ｅｔ ａｌ．，Ａｄｖ．Ｍａｔｅｒ．２００７，１９，２１９７；Ｗｕ ａｎｄ Ｆｏｋｉｎ，Ａｌｄｒｉｃｈｉｍｉｃａ ＡＣＴＡ ２００７，４０，７；Ａｇａｒｄ ｅｔ ａｌ．，ＡＣＳ Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．２００６ １，６４４）。特に、末端アルケンを用いたアジドの１，３−双極子環化を触媒して、安定したトリアゾールを与えるＣｕ（Ｉ）は、タンパク質、核酸、脂質、及び単糖を含む様々な生体分子にタグを付けるために使用されている（Ｃｈｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２００３，３０１，９６４；Ｇｉｅｒｌｉｃｈ ｅｔ ａｌ．，Ｏｒｇ．Ｌｅｔｔ．２００６，８，３６３９；Ｋｈｏ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．２００４，１０１，１２４７９；Ｌｉｎｋ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．２００６，１０３，１０１８０；Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２００３，１２５，３１９２）。また、付加環化は、活性に基づくタンパク質プロファイリング（Ｓｐｅｅｒｓ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ． ２００３， １２５， ４６８６）、酵素活性のモニターリング、並びにマイクロアレイ及び低分子ライブラリーの化学合成（Ｓｕｎ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．２００６，１７，５２）に使用されている。
アジドを生体分子に組み込むための魅力的なアプローチは、代謝的標識に基づき、それによりアジドを含む生合成前躯体は、細胞の生合成機構を用いて生体分子に組み込まれる （Ｐｒｅｓｃｈｅｒ ａｎｄ Ｂｅｒｔｏｚｚｉ，Ｎａｔ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．２００５，１，１３）。このアプローチは、様々な反応性プローブを用いて、生物系のタンパク質、グリカン、及び脂質に使用されている。これらのプローブは、単糖選択的な糖タンパク質のマッピングを促進し、グリコシル化部位を同定することができる（Ｈａｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２００７，１２９，７２６６）。また、アルキンプローブは、アジド修飾された生体分子の細胞表面画像に使用され、特に魅力的なアプローチは、［３＋２］付加環化による非蛍光性前躯体からの蛍光性プローブの生成を伴う（Ｓｉｖａｋｕｍａｒ ｅｔ ａｌ．，Ｏｒｇ．Ｌｅｔｔ．２００４，６，４６０３）。
本出願人は、本明細書に、アルキン断片、切断可能なリンカー断片、及びビオチンを含む試薬を記載する。このような化合物は、生物学的研究に価値があることは予期される。このようにして、この試薬のアルキン断片は、アジド断片を含む種々の生体分子と反応して、安定したトリアゾール付加物を提供することができる。ビオチン談判は、固定されたアビジンを用いるアフィニティークロマトグラフィーによって、タグ化された化合物を回収する機会を与える。切断可能なリンカーは、分析用のタグ化され、捕捉された生体分子の放出を可能にする。例えば、放出されたタンパク質又は糖タンパク質は、標準的なプロテオミクル及びグライコミクス分析によって特徴付けることができる（Ｔｏｏ，Ｅｘｐｅｒｔ Ｒｅｖ．Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ ２００７，４，６０３；Ｂａｎｔｓｃｈｅｆｆ ｅｔ ａｌ．，Ａｎａｌ．Ｂｉｏａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．２００７，３８９，１０１７；Ｌａｕ ｅｔ ａｌ，Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ ２００７，７，２７８７）。タンパク質又は糖タンパク質の放出は、固定されたアビジンに結合された生体分子の従来報告されていた分析よりも非常に実践的である（Ｈａｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２００７，１２９，７２６６）。化合物２１は、新しい種類の試薬の例である（図９）。それは、アジドとの反応のための４−ジベンゾシクロオクチノール断片、ジチオトレイトール（ＤＴＴ）などの試薬を還元することを伴う切断可能なジスルフィド、及びビオチンを含む。
生物系の生理的状態の相違の定量は、プロテオミクスにおいて技術的にチャレンジな作業である（Ｔｏｏ，Ｅｘｐｅｒｔ Ｒｅｖ．Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ ２００７，４，６０３； ａｎｔｓｃｈｅｆｆ ｅｔ ａｌ．，Ａｎａｌ．Ｂｉｏａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．２００７，３８９，１０１７；Ｌａｕ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ ２００７，７，２７８７）。さらに、色素及びフルオロフォアによる差動タンパク質ゲル又はブロット染色の伝統的な方法と比較して、質量分析に基づく定量方法が流行している。後者の方法の大部分は、質量分析計によって認識され得る特異的な質量タグを生み出し、同時に定量化のための基本を提供するために、差動安定なアイソトープ標識を使用する。これらの質量タグは、（ｉ）代謝的標識によって、（ｉｉ）化学的手段によって、（ｉｉｉ）酵素的に、又は（ｉｖ）合成ペプチド標準を用いたスパイクによって、タンパク質又はペプチドに導入することができる。
アルキン、切断可能なリンカー及びビオチンで構成させる試薬は、タンパク質、糖タンパク質及びアジド断片を含む他の生体分子に質量タグを導入するために使用することができる。このようにして、２１及び２２などの試薬を使用することによって、様々な質量タグが、タンパク質、糖タンパク質、糖ペプチド、ペプチド及び糖質を定量するために導入することができる。２１及び２２の化学合成は、それぞれスキーム４及び５に示される（図１０及び１１）。種々のアルキン部分、切断可能なリンカー及びビオチン誘導体は図１２に示され、アルキン及び反応性ジエン誘導体は図１３に示される。
実施例３
生細胞及びナノ粒子の標識のための急速クリック反応
４−ジベンゾシクロオクチノールを調製し、アミン含有クリック試薬の調製のための化合物を使用する代替アプローチ
４−ジベンゾシクロオクチノール４５は、代替の合成経路によって調製することができた（スキーム６；図１４）。このようにして、既知のジベンゾスベレノン（４１）は、ＣＨ2Ｃｌ2（２０ｍｌ）中のＢＦ3・ＯＥｔ2の存在下、−１０℃でチリメチルシリルジアゾメタンで処理され、６Ｈ−ジベンゾ［ａ，ｅ］シクロオクタトリエン−５−オン（４２）を良好な収率で得た。４２のケトンは、エタノール及びＴＨＦの混合物中で水素化ホウ素ナトリウムで還元され、アルコール４３を得て、それは、二重結合のホウ素化によって４−ジベンゾシクロオクチノール４５に変換することができ、その後、ＴＨＦ中のＬＤＡを用いた処理によって、得られた化合物４４を取り出した。化合物４５は、Ｄｅｓｓ−Ｍａｒｔｉｎ試薬の使用によって、対応するケトン４６に酸化することができた。
化合物４５及び４６は、アミン含有誘導体４９、５０及び５１に変換された。これらの化合物の魅力は、蛍光性タグ及びビオチンなどの種々のプローブで容易に誘導することができることである。さらに、アミンは、高分子支持体への結合のために、容易な化学的操作を当てる。このようにして、アルコール４５は、４−ニトロ−フェニルクロロギ酸エステル（０．４ｇ、２ｍｍｏｌ）及びピリジンとの反応によってｐ−ニトロフェニルエステル４９に変換された。標的化合物４９は、過剰のトリス（エチレングリコール）−１，８−ジアミンと４９との反応によって得られた。化合物５０は、テトラヒドロフラン中のリチウム・ジイソプロピルアミドの存在下でブロモ酢酸と４６との反応によって、その後、カップリング試薬ＨＡＴＵ及び塩基ＤＩＰＥＡの存在下、得られた酸４８とＤＭＦ中のトリス（エチレングリコール）−１，８−ジアミンとの縮合によって得られた。最後に、誘導体５１は、酢酸の存在下、メタノールとジクロロメタンの混合物中で、ケトン５１とＮ−｛２−［２−（２−アミノ−エトキシ）−エトキシ］−エチル｝−２−アミノオキシ−アセトアミド（８４ｍｇ、０．２５１ｍｍｏｌ）との反応によるオキシム形成によって形成される。５１の特徴は、オキシム連結が酸性水溶液による処理によって切断され、クリック試薬から補足された化合物を脱着することができるということである。
実験
６Ｈ−ジベンゾ［ａ，ｅ］シクロオクタトリエン−５−オン（４２）。ＣＨ2Ｃｌ2（３０ｍｌ）中のジベンゾスベレノン４１（２．８８８ｇ、１４．０ｍｍｏｌ）及びＢＦ3ＯＥｔ2（２．５９ｍｌ、２１．０ｍｍｏｌ）の撹拌溶液に、ＣＨ2Ｃｌ2（２０ｍｌ）中のトリメチルシリルジアゾメタン（１０．５ｍｌ、２１．９ｍｍｏｌ）野溶液を−１０℃で１時間かけて滴下して添加した。混合物を−１０℃で２時間撹拌し、その後、氷水上に注いだ。水層をＣＨ2Ｃｌ2（３×１００ｍｌ）で抽出し、有機層を合わせた。合わせた有機層をブラインで洗浄し、乾燥（ＭｇＳＯ4）させた。溶媒を減圧下で蒸発させ、粗製生成物は、シリカゲル上のフラッシュクロマトグラフィー（２：１〜１：２ｖ／ｖヘキサン／ＣＨ2Ｃｌ2）によって精製し、青白い固体として生成物を得た（２．２２０ｇ、７２％）。
Figure 0005498952
５，６−ジヒドロ−ジベンゾ［ａ，ｅ］シクロオクテナ−５−オール（４３）。室温で１：１のＥｔＯＨ／ＴＨＦ（１２０ｍ）中の４２（２．２０３ｇ、１０ｍｍｏｌ）の撹拌溶液に、水素化ホウ素ナトリウム（０．７５７ｇ、２０ｍｍｏｌ）をゆっくり添加し、反応混合物を室温で７時間撹拌した。ＴＬＣは、反応が完了していることを指示し、反応混合物は酢酸（１ｍｌ）をゆっくり添加することによってクエンチされた。溶媒を蒸発し、残渣をＣＨ2Ｃｌ2（１００ｍｌ）及びブライン（１００ｍｌ）に溶解し、ＣＨ2Ｃｌ2（４×１００ｍｌ）で抽出した。有機層を合わせ、乾燥（ＭｇＳＯ4）させ、蒸発して、白色の固体として生成物を得た（２．２２３ｇ、１００％）。それは、さらに精製せずに次の工程反応に直接使用される。
Figure 0005498952
１１，１２−ジブロモ−５，６，１１，１２−テトラヒドロ−ジベンゾ［ａ，ｅ］シクロオクテナ−５−オール（４４）。室温で１：１のＣＨＣｌ３（５０ｍｌ）中の４３（２．２２３ｇ、１０ｍｍｏｌ）の撹拌溶液に、臭素（０．５１２ｍｌ、１０ｍｍｏｌ）を滴下して添加し、反応混合物を室温で０．５時間撹拌した。ＴＬＣは、反応が完了したことを指示し、溶媒は減圧下で室温で除去された。残渣をシリカゲル上のフラッシュクロマトグラフィー（２：１〜１：２ｖ／ｖヘキサン／ＣＨ2Ｃｌ2）によって精製し、黄色味がかった油状物として生成物を得た（２．２２０ｇ、５８％）。
Figure 0005498952
５，６−ジヒドロ−１１，１２−ジデヒドロ−ジベンゾ［ａ，ｅ］シクロオクテナ−５−オール（４５）。テトラヒドロフラン（４０ｍｌ）中の４４（１．５２８ｇ、４ｍｍｏｌ）の撹拌溶液に、アルゴン雰囲気下、室温で、テトラヒドロフラン（２．０Ｍ）中のリチウム・ジイソプロピルアミドを滴下して添加した。反応混合物を０．５時間、室温で撹拌し、その後、滴下した水（０．５ｍｌ）の添加によりクエンチした。溶媒は減圧下で蒸発させ、残渣をシリカゲル上のフラッシュクロマトグラフィー（２：１〜０：１ｖ／ｖヘキサン／ＣＨ2Ｃｌ2）によって精製し、白色固体として生成物を得た（０．５０３ｇ、５７％）。
Figure 0005498952
６Ｈ−１１，１２−ジデヒドロ−ジベンゾ［ａ，ｅ］シクロオクタトリエン−５−オン（４６）。ＣＨ2Ｃｌ2（４０ｍｌ）中の４５（０．１７２ｇ、０．７８１ｍｍｏｌ）の撹拌溶液に、Ｄｅｓｓ−Ｍａｒｔｉｎ試薬（０．３９７ｇ、０．９３７ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を０．５時間、室温で撹拌した。ＴＬＣは、反応が完了したことを指示した。反応混合物を短いパッドのシリカゲルを通じてろ過し、ＣＨ2Ｃｌ2で洗浄した。ろ液を濃縮し、残渣をシリカゲル上のフラッシュクロマトグラフィー（１：１〜０：１ｖ／ｖヘキサン／ＣＨ２Ｃｌ２）によって精製し、白色固体として生成物を得た（０．１５８ｇ、９３％）。
Figure 0005498952
炭酸５，６−ジヒドロ−１１，１２−ジベンゾ［ａ，ｅ］シクロオクテナ−５−オールエステル４−ニトロ−フェニルエステル（４７）。 ＣＨ２Ｃｌ２（３０ｍＬ）中の４５（０．２２ｇ、１ｍｍｏｌ）の溶液に、４−ニトロ−フェニルクロロギ酸エステル（０．４ｇ、２ｍｍｏｌ）及びピリジン（０．４ｍｌ、５ｍｍｏｌ）を添加した。周囲温度で４時間撹拌後、反応混合物をブライン（２×１０ｍＬ）で洗浄し、有機層を乾燥させた（ＭｇＳＯ4）。溶媒は減圧下で蒸発し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘキサン／酢酸エチル、１０／１、ｖ／ｖ）によって精製し、４７（０．３４ｇ、８９％）を得た。
Figure 0005498952
（５，６−ジヒドロ−１１，１２−ジデヒドロ−ジベンゾ［ａ，ｅ］シクロオクテナ−５−イルオキシ）−酢酸（４８）。０℃でテトラヒドロフラン（４０ｍｌ）中のブロモ酢酸（０．２８０ｇ、２ｍｍｏｌ）の撹拌溶液に、水素化ナトリウム（６０％油分散、０．１２０ｇ、３．０ｍｍｏｌ）をゆっくり添加した。混合物を０℃で１０分間撹拌し、次に４５（０．２２０ｇ、１．０ｍｍｏｌ）を添加した。混合物を０℃でさらに１０分間撹拌し、その後、室温まで温め、１日撹拌した。反応を１滴のＨＯＡｃによってクエンチし、ＥｔＯＡｃで洗浄された短いパッドのシリカゲルを通してろ過し、次に減圧下で濃縮した。残渣をシリカゲル上のフラッシュクロマトグラフィー（１：０〜１：１のＣＨ２Ｃｌ２／ＥｔＯＡｃ）によって精製し、白色固体として生成物を得た（０．６０ｇ、２２％）。
Figure 0005498952
｛２−［２−（２−アミノ−エトキシ）−エトキシ］−エチル｝−カルバミン酸５，６−ジヒドロ−１１，１２−ジデヒドロ−ジベンゾ［ａ，ｅ］シクロオクテナ−５−イルエステル（４９）。室温で、ＣＨ2Ｃｌ2（２０ｍｌ）中の４７（０．０７７ｇ、０．２ｍｍｏｌ）及びトリス（エチレングリコール）−１，８−ジアミン（０．２９３ｍｌ、２ｍｍｏｌ）の撹拌溶液に、Ｅｔ３Ｎ（０．１３９ｍｌ、１．０ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を３時間、室温で撹拌し、その後、溶媒を減圧下で除去した。残渣は、イアトロビーズ（８〜２９％ｖ／ｖ ＭｅＯＨ／ＣＨ2Ｃｌ2）上のフラッシュクロマトグラフィーによって精製され、黄色味がかった固体として生成物を得た（０．０６３ｇ、８０％）。
Figure 0005498952
Ｎ−｛２−［２−（２−アミノ−エオキシ）−エトキシ］−エチル｝−２−（５，６−ジヒドロ−１１，１２−ジデヒドロ−ジベンゾ［ａ，ｅ］シクロオクテナ−５−イルオキシ）−アセトアミド（５０）。室温で、ＤＭＦ（３ｍｌ）中の４８（５．６ｍｇ、０．０２ｍｍｏｌ）及びトリス（エチレングリコール）−１，８−ジアミン（０．０２９２ｍｌ、０．２ｍｍｏｌ）の撹拌溶液に、ＨＡＴＵカップリング試薬（７．６ｍｇ、０．０２ｍｍｏｌ）及びＤＩＰＥＡ（０．０３４８ｍｌ、０．２ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を２時間室温で撹拌し、その後、溶媒を減圧下で除去した。残渣をイアトロビーズ上のフラッシュクロマトグラフィー（８〜３０％ｖ／ｖ ＭｅＯＨ／ＣＨ2Ｃｌ2）によって精製し、無色の油状物として生成物を得た。ＭＡＬＤＩ ＨＲＭＳ：ｍ／ｚ。
Ｎ−｛２−［２−（２−アミノ−エトキシ）−エトキシ］−エチル｝−２−（６Ｈ−１１，１２−ジデヒドロ−ジベンゾ［ａ，ｅ］シクロオクテナ−５−イリデンアミノオキシ）−アセトアミド（５１）。１：１ｖ／ｖのＭｅＯＨ／ＣＨ2Ｃｌ2（４ｍｌ）中の４６（４６ｍｇ、０．２１１ｍｍｏｌ）、Ｎ−｛２−［２−（２−アミノ−エトキシ）−エトキシ］−エチル｝−２−アミノオキシ−アセトアミド（８４ｍｇ、０．２５１ｍｍｏｌ）及び酢酸（０．１ｍｌ）の溶液を室温で２日間撹拌した。溶媒を減圧下で除去し、残渣をイアトロビーズ上のフラッシュクロマトグラフィー（４〜１５％ｖ／ｖＭｅＯＨ／ＣＨ2Ｃｌ2）によって精製し、黄色味がかった固体として生成物をｗ多（５６ｍｇ、６３％）。ＭＡＬＤＩ ＨＲＭＳ：ｍ／ｚ４４４．１８３５［Ｍ＋Ｎａ+］．Ｃａｌｃｄ ｆｏｒ Ｃ24Ｈ27Ｎ3ＮａＯ4：４４４．１８９９．
４−ジベンゾシクロオクチノールの誘導体の付加環化の反応動力学
４−ジベンゾシクロオクチノール（６１）の多数の類似体（６３〜６８）を調製し、ベンジルアジドによる付加環化の反応速度に対するこれらの修飾の影響は、１Ｈ ＮＭＲスペクトルのベンジル型プロトンシグナルの積分によって決定された。図１５は、化合物６１〜６８の二次定数を示す。驚くべき見解は、化合物６２は、ヒドロキシル機能を持たないが、類似の４−ジベンゾシクロオクチノール（６１）よりも約７０倍遅く反応するということであった。化合物６３及び６４におけるなどの６１のヒドロキシルのアシル化は、反応速度のゆっくりとした減少をもたらした。また、化合物６５などにおける、６１のアルカリ化は反応のより遅い速度をもたらした。化合物６６は、ジェミナル−二フッ化物を有するが、化合物６１と同じ速度で反応した。興味深いことに、ケトン６７は、１よりも僅かに高い反応速度で反応する。オキシム６８は６１と類似の反応を有する。これらの結果は、６１のヒドロキシルの修飾が付加環化の速度に劇的に影響を与え得ることを示す。
実験
７０の合成。Ｅｔ2Ｏ（１００ｍＬ）のＬｉＡｌＨ4（０．３８ｇ、１０ｍｍｏｌ） 及びＡｌＣｌ3（１．３ｇ、１０ｍｍｏｌ）の撹拌溶液に、６９（１．１ｇ、５ｍｍｏｌ）を添加した。ml). 反応を０℃で１２時間保持し、その後、水（１００ｍｌ）でクエンした。水層をエーテル（４×１００ｍｌ）で抽出し、合わせた有機抽出物を水（１００ｍｌ）及びブライン（１００ｍｌ）で洗浄した。粗製生成物は、カラムクロマトグラフィー（ヘキサン／ＣＨ2Ｃｌ2、２／１、ｖ／ｖ）によって精製され、２つの７０を得た（０．６３ｇ、６１％；スキーム７；図１６）。
Figure 0005498952
７１の合成。ＣＨＣｌ３（１０ｍＬ）中の臭素の溶液は、０℃でＣＨＣｌ3（２０ｍＬ）中の７０（０．５ｇ、２．５ｍｍｏｌ）の溶液に滴下して添加された。反応混合物は、反応が完了するまで（ＴＬＣによってモニターされる）、室温で１２時間撹拌された。得られた混合物は、水性飽和チオ硫酸ナトリウム溶液（１５ｍＬ）で洗浄され、乾燥（ＭｇＳＯ4）された。溶媒を減圧下で蒸発させ、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘキサン／ＣＨ2Ｃｌ2、１０／１、ｖ／ｖ）によって精製し、７１（０．５３ｇ、５８％；スキーム７；図１６）を得た。
Figure 0005498952
６２の合成。テトラヒドロフラン（２０ｍＬ）中の７１（０．３６ｇ、１ｍｍｏｌ）の溶液に、アルゴン雰囲気下、室温でテトラヒドロフラン（２．０Ｍ）（２ｍＬ）中のｔ−ＢｕＯＫを滴下して添加した。反応混合物そ２時間室温で撹拌し、その後、氷水（１０ｍＬ）上に注ぎ、得られた混合物をＣＨ2Ｃｌ2（２×５０ｍＬ）で抽出した。合わせた抽出物を水、ブラインで洗浄し、乾燥（ＭｇＳＯ4）させ、溶媒を減圧下で蒸発させた。残渣は、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘキサン／ＣＨ2Ｃｌ2、２／１、ｖ／ｖ）によって精製され、６２（５０ｍｇ、２５％；スキーム７；図１６）を得た。
Figure 0005498952
６３の合成。ＣＨ2Ｃｌ2（１５ｍＬ）中の７２（３８ｍｇ、０．１ｍｍｏｌ）の撹拌溶液に、７３（１５ｍｇ、０．２ｍｍｏｌ）及びＴＥＡ（１０μＬ）を添加した。反応混合物を室温で１２時間撹拌した。溶媒を減圧下で蒸発させ、残渣は、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（ＣＨ2Ｃｌ2／ＣＨ3ＯＨ、２０／１、ｖ／ｖ）によって精製され、６３（２５ｍｇ、７７％；スキーム８；図１７）を得た。
Figure 0005498952
６４の合成。ピリジン（４ｍＬ）中の６１（２２ｍｇ、０．１ｍｍｏｌ）の撹拌溶液にＡｃ2Ｏ（１ｍＬ）を添加した。反応混合物を室温で１２時間撹拌した。溶媒を減圧下で蒸発させ、残渣は、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘキサン／ＣＨ2Ｃｌ2、１／１、ｖ／ｖ）によって精製され、６４（２１ｍｇ、８１％；スキーム９；図１８）を得た。
Figure 0005498952
６５の合成。ＤＭＦ（２ｍＬ）中の６１（２２ｍｇ、０．１ｍｍｏｌ）の撹拌溶液にＮａＨ（８ｍｇ、０．２ｍｍｏｌ）を添加した。混合物を室温で１時間撹拌し、次に臭化ベンジル（ＢｎＢｒ、３４ｍｇ、０．２ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を室温で１２時間撹拌した。溶媒を減圧下で蒸発させ、残渣は、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘキサン／ＣＨ2Ｃｌ2、２／１、ｖ／ｖ）によって精製され、６５（１８ｍｇ、５９％；スキーム９；図１８）を得た。
Figure 0005498952
７４の合成。室温でＴＨＦ（２００ｍＬ）中のＬＤＡ（２０ｍｌ、４０ｍｍｏｌ、２．０Ｍ溶液（ＴＨＦ中））の撹拌溶液に、ＴＨＦ（４０ｍＬ）中のケトン６９（４．４ｇ、２０ｍｍｏｌ）の溶液をシリンジポンプを用いて１時間かけて添加した。室温でさらに２０分間撹拌した後、クロロトリエチルシラン（６．７ｍｌ、４０ｍｍｏｌ）を添加した。溶液を室温で１時間撹拌した。反応混合物をロータリーエバポレーターで濃縮し、粗製生成物をカラムクロマトグラフィー（ヘキサン／ＣＨ２Ｃｌ２、１０／１、ｖ／ｖ）によって直接精製し、透明な油状物７４（５．８ｇ、８５％；スキーム１０；図１９）を得た。
Figure 0005498952
７５の合成。０℃でＤＭＦ（２０ｍｌ）中の、Ａｉｒ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ（Ａｌｌｅｎｔｏｗｎ，ＰＡ）から商品名ＳＥＬＥＣＴＦＬＵＯＲとして利用可能であるフッ素化試薬（１−クロロメチル−４−フルオロ−１，４−ジアゾニアビシクロ［２．２．２］オクタンビス−（テトラフルオロボレート））の撹拌溶液に、添加ろ過器を介して１０分かけて、ＤＭＦ（２０ｍｌ）中のシリルエノールエーテル７４（５．０ｇ、１５ｍｍｏｌ）の溶液を添加した。反応は、３０分間撹拌しながら室温まで徐々に温め、次に水（１００ｍＬ）でクエンチした。水層をエーテル（４×１００ｍｌ）で抽出し、合わせた有機抽出物を水（３×１００ｍＬ）及びブライン（１×２００ｍＬ）で洗浄した。粗製生成物をカラムクロマトグラフィー（ヘキサン／ＣＨ2Ｃｌ2、１／１、ｖ／ｖ）によって精製し、７５（２．４ｇ、６６％；スキーム１０；図１９）を得た。
Figure 0005498952
７６の合成。室温でＴＨＦ（１００ｍＬ）中のＬＤＡ（１０ｍｌ、２０ｍｍｏｌ、２．０Ｍ溶液（ＴＨＦ中））の撹拌溶液にＴＨＦ（２０ｍＬ）中のケトン７５（２．４ｇ、１０ｍｍｏｌ）を１時間かけてシリンジポンプを用いて添加した。室温でさらに２０分間撹拌した後、クロロトリエチルシラン（３．３ｍｌ、２０ｍｍｏｌ）を添加した。溶液を室温で１時間撹拌した。反応混合物をロータリーエバポレーターで濃縮し、粗製生成物をカラムクロマトグラフィー（ヘキサン／ＣＨ2Ｃｌ2、５／１、ｖ／ｖ）によって直接精製し、透明な油状物７６（２．８ｇ、７９％；スキーム１０；図１９）を得た。
Figure 0005498952
７７の合成。０℃でＤＭＦ（１５ｍｌ）中のＳＥＬＥＣＴＦＬＵＯＲフッ素化試薬（３．５ｇ、１０ｍｍｏｌ）の撹拌溶液にＤＭＦ（１０ｍｌ）中のシリルエノールエーテル７６（２．８ｇ、８ｍｍｏｌ）の溶液を１０分かけて添加ろ過器を用いて添加した。反応は、３０分間撹拌しながら室温まで徐々に温め、次に水（１００ｍＬ）でクエンチした。水層をエーテル（４×１００ｍｌ）で抽出し、合わせた有機抽出物を水（３×１００ｍＬ）及びブライン（１×２００ｍＬ）で洗浄した。粗製生成物をカラムクロマトグラフィー（ＣＨ2Ｃｌ2）によって精製し、７７（１．０ｇ、５１％；スキーム１０；図１９）を得た。
Figure 0005498952
７８の合成。ＥｔＯＨ（３０ｍＬ）中の７７（１．０ｇ、４ｍｍｏｌ）の撹拌溶液にＮａＢＨ4（０．３ｇ、８ｍｍｏｌ）を５分かけて添加した。反応を室温で２時間維持し、次に水（１００ｍｌ）でクエンチした。水層をＣＨ2Ｃｌ2（３×１００ｍＬ）で抽出し、合わせた有機抽出物を水（１００ｍＬ）及びブライン（１００ｍＬ）で洗浄した。粗製生成物をカラムクロマトグラフィー（ヘキサン／ＥｔＯＨ、５／１、ｖ／ｖ）によって精製し、７８（０．７８ｇ、７８％；スキーム１０；図１９）を得た。
Figure 0005498952
７９の合成。ＣＨＣｌ3（１０ｍＬ）中の臭素（０．１６ｇ、１．０ｍｍｏｌ）の撹拌溶液に、０℃でＣＨＣｌ3（１０ｍＬ）中の７８（０．２５ｇ、１．０ｍｍｏｌ）の溶液を滴下して添加した。反応混合物は、反応が完了する（ＴＬＣによってモニターされる）まで、室温で１２時間撹拌された。 得られた混合物を水性飽和チオ硫酸ナトリウム溶液（１０ｍＬ）で洗浄し、乾燥（ＭｇＳＯ4）させた。溶媒を減圧下で蒸発し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘキサン／ＥｔＯＡｃ、８／１、ｖ／ｖ）によって精製し、７９（０．１９ｇ、４６％；スキーム１０；図１９）を得た。
Figure 0005498952
６６の合成。テトラヒドロフラン（１０ｍＬ）中の７９（４０ｍｇ、０．１ｍｍｏｌ）の撹拌溶液に、アルゴン雰囲気下、室温でテトラヒドロフラン（２．０Ｍ）（０．５ｍＬ）中のｔ−ＢｕＯＫを滴下して添加した。反応混合物を６時間室温で撹拌し、その後、氷水（１０ｍＬ）上に注ぎ、得られた混合物をＣＨ2Ｃｌ2（２×５０ｍＬ）で抽出した。合わせた抽出物を水、ブラインで洗浄し、乾燥（ＭｇＳＯ4）させ、溶媒を減圧下で蒸発させた。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘキサン／ＥｔＯＡｃ、５／１、ｖ／ｖ）によって精製し、６６（１０ｍｇ、４９％；スキーム１０；図１９）を得た。
Figure 0005498952
（６Ｈ−１１，１２−ジデヒドロ−ジベンゾ［ａ，ｅ］シクロオクテナ−５−イリデンアミノオキシ）−酢酸（６８）。１：１：０．０２ｖ／ｖ／ｖのＭｅＯＨ／ＣＨ2Ｃｌ2／ＨＯＡｃ（８ｍｌ）中の６Ｈ−１１，１２−ジデヒドロ−ジベンゾ［ａ，ｅ］シクロオクテナ−５−オン６７（２１．８ｍｇ、０．１ｍｍｏｌ）及びカルボキシメチル）ヒドロキシルアミンヘミヒドロクロリド（２１．８ｍｇ、０．２ｍｍｏｌ）を室温で２日間撹拌した。溶媒を減圧下で除去し、残渣をシリカゲル上のフラッシュクロマトグラフィー（ＥｔＯＡｃ）によって精製し、白色固体として生成物を得た（１７．８ｍｇ、６１％）。
Figure 0005498952
付加環化を用いた４−ジベンゾシクロオクチノールによる高分子及びナノ材料の修飾
安定したトリアゾールを与える、末端アルキンを有するアジドの１，３−双極子付加環化を触媒するＣｕ（Ｉ）は、タンパク質、核酸、脂質、及び単糖を含む様々な生体分子にタグを付けるために使用されている。また、この反応は、高分子及びナノスケールの材料を修飾するために使用されている。非常に毒性のあるＣｕ（Ｉ）を取り除くという潜在的な困難性は、生物学的又は医学的応用のための化合物又は材料のコンジュゲーション用に１，３−双極子付加環化の使用を複雑にする。アジドを用いた付加環化のために末端アルキンの変わりに４−ジベンゾシクロオクチノールを使用することにより、この問題が克服されるべきである。
バイオコンジュゲーションにおける４−ジベンゾシクロオクチノールの使用を示すために、コブロック共重合体８３及び８４を調製した。これらの材料を使用して、水中で有機ミセルを形成し、これらの材料の４−ジベンゾシクロオクチン断片がアジドを含む分子と反応することができることが示された（図２０Ａ、Ｂ）。
ポリエステルとポリエチレングリコール断片で構成されるコブロック重合体は水中で自己凝集し、有機ミセルを形成することは周知である。これらのナノ材料は、薬物送達デバイスとして注目を浴びている。例えば組織又は腫瘍標的部分を用いた有機ミセルの誘導化は、洗練された薬物送達デバイスをもたらすことができる。さらに、ビオチンなどの蛍光性タグ又はＭＲＩ試薬を用いた有機ミセルの修飾は、目的を画像化するのに価値がある（図２０Ｃ）。
ＳｎＯｃｔの触媒量の存在下でポリエチレングリコールメチルエーテル（８１）又はアジド（８２）（ＭＷ約２０００Ｄａ）とカプロラクトンの共重合は、それぞれ８３及び８４を与える（スキーム１１；図２１）。８４のアジド断片は、トリフェニルホスフィンで減少され、得られたポリマー８５のアミンは、８６及び８７と反応して、それぞれジベンゾシクロオクチル誘導体８８及び８９を得た。少量のＴＨＦに溶解した８３及び８８又は８９（９／１、ｗ／ｗ）の混合物を水に添加した。低温ＴＥＭは、約４０Ａの径を有する有機ミセルが形成したことを示した。得られたミセルをアジド含有単糖９０とともにインキュベートし、２４時間の反応後、未反応の単糖を透析によって除去した。ミセルは、ＴＦＡを用いた加水分解によって糖含有量について解析され、その後、高ｐＨ陰イオン交換クロマトグラフィーによって定量された。約４５％のシクロオクチンが単糖によって修飾されたことが確認された。
化合物８４はまた、ミセル形成に使用することができ、得られたアジドのアジド部分は、ジベンゾシクロオクチル断片で修飾された化合物を用いた付加環化に使用することができることが予期されるべきである。
実験
ＰＥＧ44−ｂ−ＰＣＬ２６８３の合成。ＰＥＧ45−Ｏ−ＰＣＬ２３ブロック共重合体は記載されるように合成された。所定体積（１２．０ｍＬ）のε−カプロラクトンモノマーをアルゴン雰囲気下、ある量（９．０ｇ）のＰＥＧ８１を含むフラスコに入れた。次に、１滴のＳｎＯｃｔを添加した。液体窒素温度まで冷却後、フラスコを１２時間空にし、密封し、１３０℃で２４時間放置した。合成されたポリマーをＴＨＦに溶解し、冷ヘキサンによる沈殿によって回収し、真空下、室温で乾燥させた。ＰＣＬの重合度は、ＰＥＧ８１の重合度と比較して、1Ｈ ＮＭＲによって計算された。
アジド−ＰＥＧ44−ｂ−ＰＣＬ26８４の合成。アジド−ＰＥＧ−ｂ−ＰＣＬは、１３０℃、アルゴンの気流下のワンポットのカチオン開環重合によって合成され、いくつかの変更を含む、ＰＥＧ−ｂ−ＰＣＬの調製のための従来報告されている方法を適用した。簡潔には、所定体積（３．３ｍＬ）のε−カプロラクトンモノマーを窒素雰囲気下で、アジド−ＰＥＧ−ＯＨ８２の予め計量した量（２．５ｇ）を含むフラスコに入れた。次に、１滴のＳｎＯｃｔを添加した。液体窒素の温度まで冷却後、フラスコを空にし、密封し、１３０℃で２４時間放置した。次に、合成されたポリマーをＴＨＦに溶解し、冷ヘキサン中に沈殿することによって回収し、真空下、室温で乾燥させた。アジド−ＰＥＯ44−ｂ−ＰＣＬ−26８４ブロック共重合体の数平均分子量（Ｍｎ）を1Ｈ ＮＭＲによって決定した。
アミン−ＰＥＧ44−ｂ−ＰＣＬ26８５の合成。ＥｔＯＨ及びＨＯＡｃ（５０μＬ）中のアジド−ＰＥＧ44−ｂ−ＰＣＬ26８４（２００ｍｇ）の溶液にＰｄ／Ｃ（活性炭上１０ｗｔ％、５０ｍｇ）を添加し、Ｈ2を１時間溶液を通じて泡立て、その後、Ｈ2雰囲気下で１６時間撹拌した。混合物をろ過し、真空中で濃縮した。次に、残渣をＴＨＦに溶解し、冷ヘキサン中に沈殿させて回収し、真空下、室温で乾燥させて、アミン−ＰＥＧ44−ｂ−ＰＣＬ26８５を得た。
ＤＩＤＯ−ＰＥＯ−ＰＣＬ共重合体（８８）。室温でＣＨ２Ｃｌ２（１０ｍｌ）中のカルボン酸５，６−ジヒドロ−１１，１２−ジベンゾ［ａ，ｅ］シクロオクテナ−５−イルエーテル４−ニトロ−フェニルエステル８６（１１．６ｍｇ、０．０３ｍｍｏｌ）及び共重合体８５（９８ｍｇ、０．０２ｍｍｏｌ）の撹拌溶液に、Ｅｔ3Ｎ（０．０１４ｍｌ、０．１ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を一晩室温で撹拌し、その後、溶媒を減圧下で除去した。残渣をＬＨ−２０カラム上のサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）（１：１ｖ／ｖ ＭｅＯＨ／ＣＨ2Ｃｌ2）によって精製し、黄色味がかった固体として生成物を得た（１０１ｍｇ、９７％）。
ＤＩＤＯ−ＰＥＯ−ＰＣＬ共重合体（８９）。室温でＤＭＦ（１５ｍｌ）中の（５，６−ジヒドロ−１１，１２−ジデヒドロ−ジベンゾ［ａ，ｅ］シクロオクテナ−５−イルオキシ）−酢酸８８（８．３ｍｇ、０．０３ｍｍｏｌ）及び共重合体８５（９８ｍｇ、０．０２ｍｍｏｌ）にＨＡＴＵカップリング試薬（１１．４ｍｇ、０．０３ｍｍｏｌ）及びＤＩＰＥＡ（０．０１０４ｍｌ、０．０６ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を５時間室温で撹拌し、その後、溶媒を減圧下で除去した。残渣をＬＨ−２０カラム上のＳＥＣクロマトグラフィー（１：１ｖ／ｖ ＭｅＯＨ／ＣＨ2Ｃｌ2）によって精製し、黄色味がかった固体として生成物を得た（１００ｍｇ、９６％）。
種々の１，３−双極子を用いたジベンゾシクロオクタノールの付加環化
４−ジベンゾシクロオクチノールは、ニトロン及びアシルジアゾ誘導体などの１，３−双極子とともに周囲温度で触媒及びプロモーターなしに反応することができ、バイオコンジュゲーション反応に独特の機会を与え得ることが分かった。
ニトロンは、Ｄｉｃｋｅｎ ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．１９８２，４７，２０４７−２０５１；Ｉｎｏｕｙｅ ｅｔ ａｌ．，Ｂｕｌｌ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｊｐｎ．１９８３，５６，３５４１−３５４２に開示される手法の修飾によって調製された。トルエン（２０ｍｌ）中のＮ−アルキルヒドロキシルアミンヒドロクロリド（１０．０ｍｍｏｌ）、グリオキシル酸（０．９２ｇ、１０．０ｍｍｏｌ）、及び重炭酸ナトリウム（１．６８ｇ、２０．０ｍｍｏｌ）を室温で一晩撹拌した。固体をろ過し、ろ過物を濃縮してニトロンを得た。次に、このニトロンを精製せずに直接使用した。
このようにして、ニトロン９１〜９５を４−ジベンゾシクロオクチノールと混合し、３分から３．５時間の反応時間後、対応する２，３−ジヒドロ−イソオキサゾール付加環化生成物をほぼ定量的収率で単離された。ニトロンの化学的性質は反応速度の劇的な衝撃を有することが図１８において見ることができる。特に、電子不足のニトロン９３及び９４は、対応するアジドよりも非常に高速で反応する。
実験
ＮＭＲによる秒オーダーの速度定数を計算するための方法。基質を別々に適切な溶媒に溶解し、６ｍＭの濃度で１：１に混合した。転換率は、複数のケミカルシフトでの積分によって決定されるように、出発物質の消失及び２つの位置異性生成物の出現の両方によってモニターされた。反応の秒オーダーの速度定数は、１／［基質］対時間をプロットし、線形回帰による解析によって決定された。秒オーダーの速度定数は、決定された傾きの２分の１に対応する。
本明細書中で引用された全ての特許、特許出願、及び刊行物、並びに電子的に利用可能な基材（例えば、ＧｅｎＢａｎｋアミノ酸及び核酸配列寄託；タンパク質データバンク（ｐｄｂ）寄託）の完全な開示は、参照により援用される。前記で詳述な記載及び実施例は、理解を明確にするためにだけ提供された。不要な限定はそこから解釈されてはならない。本発明は、特許請求の範囲に定義される発明に含まれるであろう、当業者に明らかであるように示され、記載された正確な詳細に限定されない。

Claims (15)

  1. 式：
    Figure 0005498952
     ［式中、
    各Ｒ1は、独立して、水素、ハロゲン、ヒドロキシ、アルコキシ、硝酸エステル、亜硝酸エステル、硫酸エステル、及びＣ１−Ｃ１０有機基からなる群から選択され；
    各Ｒ2は、独立して、水素、ハロゲン、ヒドロキシ、アルコキシ、硝酸エステル、亜硝酸エステル、硫酸エステル、及びＣ１−Ｃ１０有機基からなる群から選択され；
    Ｘは、Ｃ＝Ｏ、Ｃ＝Ｎ−ＯＲ3、Ｃ＝Ｎ−ＮＲ3Ｒ4、ＣＨＯＲ3、又はＣＨＮＨＲ3を表し；並びに
    各Ｒ3及びＲ4は、独立して、水素又は有機基を表す］
    で表されるアルキン。
  2. ＸがＣ＝Ｎ−ＯＲ3を表し、Ｒ3が式：
    −（ＣＨ2）aＣ（Ｏ）Ｙ
    ［式中、
    ａは、１〜３であり；
    Ｙは、ＯＨ又はＮＨＲ5を表し；及び
    Ｒ5は、水素又は１級アミンを含む有機基のビオチン化生成物を表す］
    を有する有機基を表す、請求項１に記載のアルキン。
  3. ビオチン化生成物が、−（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）b（ＣＨ2）c−Ｌd−（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）e（ＣＨ2）fＮＨ2及び／又は−（ＣＤ2ＣＤ2Ｏ）b（ＣＤ2）c−Ｌd−（ＣＤ2ＣＤ2Ｏ）e（ＣＤ2）fＮＨ2［式中、ｂ＝０〜１００；ｃ＝０〜１００；ｄ＝０〜１００；ｅ＝０〜１００；ｆ＝０〜１００；及びＬは切断可能なリンカーであり、ここで該切断可能なリンカーは、ジスルフィドリンカー、オキシムリンカー、ヒドラゾンリンカー、ジアゾリンカー、カルボニルオキシエチルスルホンリンカー、ジ−Ｏ−イソ−プロピリデン酒石酸アミドリンカー、Ｎ−［２（９−フルオレニルメトキシカルボニルメチル）ベンジル］−Ｎ−ピポカ−６−アミノヘキサン酸エステルリンカー、３−アミノ−メチル−４−ヒドロキシベンジルアルコールリンカー、スクアリン酸ジアミドリンカー、シス−１，２−ジチオエチレンリンカー、ニトロベンジルリンカー、エーテル−光リンカー、Ｏ−ニトロベンジルリンカー、フェナシルエステルリンカー、オキサビシクロ［２．２．１］ノルボルネンリンカー、スルホキシド／セレノキシドリンカー、アミノ酸リンカー、及びフェニルアセトアミドリンカーからなる群から選択される］の１級アミン含有基のビオチン化生成物である、請求項２に記載のアルキン。
  4. ＸがＣＨＯＲ3を表し、Ｒ3がアルキル基、アリール基、アルカリル基、及びアラルキル基から選択される、請求項１に記載のアルキン。
  5. Ｒ3が、
    −Ｃ（Ｏ）Ｚ
    ［式中、
    Ｚは、アルキル基、ＯＲ6、又はＮＨＲ7を表し；
    Ｒ6及びＲ7は、独立して、アルキル基、アリール基、アルカリル基、及びアラルキル基からなる群から選択される］
    を表す、請求項４に記載のアルキン。
  6. Ｒ7が、１級アミンを含む有機基のビオチン化生成物である、請求項５に記載のアルキン。
  7. ビオチン化生成物が、−（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）b（ＣＨ2）c−Ｌd−（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）e（ＣＨ2）fＮＨ2及び／又は−（ＣＤ2ＣＤ2Ｏ）b（ＣＤ2）c−Ｌd−（ＣＤ2ＣＤ2Ｏ）e（ＣＤ2）fＮＨ2［式中、ｂ＝０〜１００；ｃ＝０〜１００；ｄ＝０〜１００；ｅ＝０〜１００；ｆ＝０〜１００；及びＬは切断可能なリンカーであり、ここで該切断可能なリンカーは、ジスルフィドリンカー、オキシムリンカー、ヒドラゾンリンカー、ジアゾリンカー、カルボニルオキシエチルスルホンリンカー、ジ−Ｏ−イソ−プロピリデン酒石酸アミドリンカー、Ｎ−［２（９−フルオレニルメトキシカルボニルメチル）ベンジル］−Ｎ−ピポカ−６−アミノヘキサン酸エステルリンカー、３−アミノ−メチル−４−ヒドロキシベンジルアルコールリンカー、スクアリン酸ジアミドリンカー、シス−１，２−ジチオエチレンリンカー、ニトロベンジルリンカー、エーテル−光リンカー、Ｏ−ニトロベンジルリンカー、フェナシルエステルリンカー、オキサビシクロ［２．２．１］ノルボルネンリンカー、スルホキシド／セレノキシドリンカー、アミノ酸リンカー、及びフェニルアセトアミドリンカーからなる群から選択される］の１級アミン含有基のビオチン化生成物である、請求項６に記載のアルキン。
  8. Ｒ3が、重合体基又は共重合体基を表す、請求項１に記載のアルキン。
  9. 請求項８に記載のアルキンと重合体又は共重合体との混和物を含む組成物。
  10. 組成物が共重合体ミセルを形成する、請求項９に記載の組成物。
  11. 薬物送達を調節する方法であって、
    少なくとも１つの１，３−双極子機能性薬物とアルキンを含む請求項１０に記載の共重合体ミセルとを組み合わせ；及び
    少なくとも１つの１，３−双極子機能性薬物とアルキンを含む共重合体ミセルとが複素環式化合物を形成するのに有効な条件下で反応できるようにする
    ことを含む方法。
  12. 複素環式化合物を製造する方法であって、
    少なくとも１つの１，３−双極子機能性化合物と請求項１〜８のいずれか１項に記載の少なくとも１つのアルキンとを組み合わせ；
    少なくとも１つの１，３−双極子機能性化合物と少なくとも１つのアルキンが複素環式化合物を形成させるのに有効な条件下で反応できるようにする
    ことを含む方法。
  13. 請求項１〜８のいずれか１項に記載のアルキンを表面上に有する基質。
  14. 生体分子を基質上に固定する方法であって、
    請求項１３に記載の基質を提供し：
    複素環式化合物を形成するのに有効な条件下で基質と１，３−双極子機能性生体分子とを接触させる
    ことを含む方法。
  15. 細胞を固定する方法であって、
    請求項１３に記載の基質を用意し；
    複素環式化合物を形成するのに有効な条件下で基質と、１，３−双極子機能性生体分子を含む細胞とを接触させる
    ことを含む方法。
JP2010535090A 2007-11-21 2008-11-21 アルキン類及び１，３−双極子機能性化合物とアルキン類を反応させる方法 Active JP5498952B2 (ja)

Applications Claiming Priority (7)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US402107P 2007-11-21 2007-11-21
US61/004,021 2007-11-21
US767407P 2007-12-14 2007-12-14
US61/007,674 2007-12-14
US13706108P 2008-07-25 2008-07-25
US61/137,061 2008-07-25
PCT/US2008/084345 WO2009067663A1 (en) 2007-11-21 2008-11-21 Alkynes and methods of reacting alkynes with 1,3-dipole-functional compounds

Related Child Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2014046551A Division JP5956487B2 (ja) 2007-11-21 2014-03-10 アルキン類及び１，３−双極子機能性化合物とアルキン類を反応させる方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
JP2011504507A JP2011504507A (ja) 2011-02-10
JP5498952B2 true JP5498952B2 (ja) 2014-05-21

Family

ID=40510055

Family Applications (4)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2010535090A Active JP5498952B2 (ja) 2007-11-21 2008-11-21 アルキン類及び１，３−双極子機能性化合物とアルキン類を反応させる方法
JP2014046551A Active JP5956487B2 (ja) 2007-11-21 2014-03-10 アルキン類及び１，３−双極子機能性化合物とアルキン類を反応させる方法
JP2016030875A Active JP6659397B2 (ja) 2007-11-21 2016-02-22 アルキン類及び１，３−双極子機能性化合物とアルキン類を反応させる方法
JP2017231659A Pending JP2018039841A (ja) 2007-11-21 2017-12-01 アルキン類及び１，３−双極子機能性化合物とアルキン類を反応させる方法

Family Applications After (3)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2014046551A Active JP5956487B2 (ja) 2007-11-21 2014-03-10 アルキン類及び１，３−双極子機能性化合物とアルキン類を反応させる方法
JP2016030875A Active JP6659397B2 (ja) 2007-11-21 2016-02-22 アルキン類及び１，３−双極子機能性化合物とアルキン類を反応させる方法
JP2017231659A Pending JP2018039841A (ja) 2007-11-21 2017-12-01 アルキン類及び１，３−双極子機能性化合物とアルキン類を反応させる方法

Country Status (6)

Country Link
US (5) US8133515B2 (ja)
EP (2) EP2907525B1 (ja)
JP (4) JP5498952B2 (ja)
CN (2) CN104529711B (ja)
DK (2) DK2222341T3 (ja)
WO (1) WO2009067663A1 (ja)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2014177458A (ja) * 2007-11-21 2014-09-25 Univ Of Georgia Research Foundation Inc アルキン類及び１，３−双極子機能性化合物とアルキン類を反応させる方法
US10905678B2 (en) 2014-04-08 2021-02-02 University Of Georgia Research Foundation, Inc. Site-specific antibody-drug glycoconjugates and methods

Families Citing this family (86)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US9005577B2 (en) 2008-04-30 2015-04-14 Siemens Medical Solutions Usa, Inc. Substrate based PET imaging agents
CA2737661C (en) 2008-09-23 2019-08-20 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Chemical modifications of monomers and oligonucleotides with cycloaddition
US8258347B2 (en) 2009-02-19 2012-09-04 University Of Georgia Research Foundation, Inc. Cyclopropenones and the photochemical generation of cyclic alkynes therefrom
US8426649B2 (en) 2009-02-19 2013-04-23 University Of Georgia Research Foundation, Inc. Cyclopropenones and the photochemical generation of cyclic alkynes therefrom
FR2951449B1 (fr) * 2009-10-15 2011-11-25 Commissariat Energie Atomique Procede de fonctionnalisation de molecules biologiques
US9198972B2 (en) 2010-01-28 2015-12-01 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Monomers and oligonucleotides comprising cycloaddition adduct(s)
WO2011118394A1 (ja) * 2010-03-26 2011-09-29 Jnc株式会社 環状化合物、環状化合物の製造方法および生体分子の修飾法
CN107235828B (zh) 2010-04-27 2024-06-07 西纳福克斯股份有限公司 稠合的环辛炔化合物及其在无金属点击反应中的应用
US20120028335A1 (en) 2010-07-28 2012-02-02 Life Technologies Corporation Anti-viral azide-containing compounds
US20130209550A1 (en) 2010-07-28 2013-08-15 Life Technologies Corporation Anti-Viral Azide Containing Compounds
US8912322B2 (en) 2010-07-29 2014-12-16 University Of Georgia Research Foundation, Inc. Aza-dibenzocyclooctynes and methods of making and using same
WO2012016188A2 (en) * 2010-07-30 2012-02-02 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Methods and compositions for delivery of active agents
WO2012047663A2 (en) * 2010-09-27 2012-04-12 University Of Georgia Reaserch Foundation, Inc. Methods including latent 1,3-dipole-functional compounds and materials prepared thereby
US20120208722A1 (en) * 2010-10-19 2012-08-16 Richard Dluhy Surface enhanced raman spectroscopy platforms and methods
EP2630196B1 (en) 2010-10-20 2017-09-06 Li-Cor, Inc. Cyanine dyes and their conjugates
EP2966061B1 (en) 2011-03-04 2017-05-03 Life Technologies Corporation Compounds and methods for conjugation of biomolecules
US9145361B2 (en) 2011-03-25 2015-09-29 Life Technologies Corporation SDP-containing heterobifunctional agents
US20140170653A1 (en) 2011-04-15 2014-06-19 Life Technologies Corporation Chemical ligation
US9675561B2 (en) 2011-04-28 2017-06-13 President And Fellows Of Harvard College Injectable cryogel vaccine devices and methods of use thereof
EP2532639A1 (en) * 2011-06-09 2012-12-12 ModiQuest B.V. Method for preparing a reactive coating
US9764038B2 (en) 2011-12-23 2017-09-19 Innate Pharma Enzymatic conjugation of antibodies
WO2014004278A1 (en) * 2012-06-26 2014-01-03 The Curators Of The University Of Missouri Photocleavable drug conjugates
US10132799B2 (en) 2012-07-13 2018-11-20 Innate Pharma Screening of conjugated antibodies
CA2878059A1 (en) 2012-07-31 2014-02-06 The University Of Akron Polymeric structures containing strained cycloalkyne functionality for post-fabrication azidealkyne cycloaddition functionalization
JP6211084B2 (ja) * 2012-08-21 2017-10-11 アカデミア シニカＡｃａｄｅｍｉａ Ｓｉｎｉｃａ ベンゾシクロオクチン化合物およびその使用
HUE038285T2 (hu) 2012-10-23 2018-10-29 Synaffix Bv Módosított antitest, antitest-konjugátum és eljárás ezek elõállítására
CN104704359A (zh) 2012-10-25 2015-06-10 生命科技公司 糖蛋白酶介导位点特异性放射性标记的方法和组合物
EP3564259A3 (en) 2012-11-09 2020-02-12 Innate Pharma Recognition tags for tgase-mediated conjugation
GB201300707D0 (en) * 2013-01-15 2013-02-27 Novartis Ag Compounds and processes
US10611824B2 (en) 2013-03-15 2020-04-07 Innate Pharma Solid phase TGase-mediated conjugation of antibodies
EP3462174B1 (en) * 2013-03-15 2021-12-29 Arizona Board of Regents on behalf of Arizona State University Biosensor microarray compositions and methods
JP6245707B2 (ja) * 2013-03-28 2017-12-13 静岡県公立大学法人 ［１８ｆ］ｆまたは蛍光色素で標識されたｐｅｇ化生物活性物質の製造方法、ならびにその体内動態解析
WO2014177771A1 (en) 2013-05-02 2014-11-06 Glykos Finland Oy Conjugates of a glycoprotein or a glycan with a toxic payload
US20160107999A1 (en) 2013-05-24 2016-04-21 Synaffix B.V. Substituted azadibenzocyclooctyne compounds and their use in metal-free click reactions
WO2014202773A1 (en) 2013-06-20 2014-12-24 Innate Pharma Enzymatic conjugation of polypeptides
CA2914189C (en) 2013-06-21 2023-03-14 Innate Pharma Enzymatic conjugation of polypeptides
EP2818867A1 (en) 2013-06-27 2014-12-31 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Antibodies conjugated to at least one nucleic acid molecule and their use in multiplex immuno-detection assays
JP6327547B2 (ja) * 2013-08-02 2018-05-23 国立研究開発法人理化学研究所 新規化合物及びその利用
EP3057618B1 (en) 2013-10-14 2022-12-14 SynAffix B.V. Glycoengineered antibody, antibody-conjugate and methods for their preparation
WO2015057066A1 (en) 2013-10-14 2015-04-23 Synaffix B.V. Glycoengineered antibody, antibody-conjugate and methods for their preparation
WO2015057064A1 (en) 2013-10-14 2015-04-23 Synaffix B.V. Modified glycoprotein, protein-conjugate and process for the preparation thereof
EP3080137A4 (en) 2013-12-12 2017-07-19 The University Of Georgia Research Foundation, Inc Prodrug for release of cisplatin and cyclooxygenase inhibitor
EP3925951A1 (en) 2014-01-24 2021-12-22 SynAffix B.V. Process for the cycloaddition of a(hetero)aryl 1,3-dipole compound with a (hetero)cycloalkyne
CN103983764B (zh) * 2014-04-17 2016-06-29 深圳先进技术研究院 对细胞进行原位标记的方法和应用
EP3137105A4 (en) 2014-04-30 2017-12-27 President and Fellows of Harvard College Combination vaccine devices and methods of killing cancer cells
EP3270903B1 (en) 2015-03-17 2020-05-06 Arrowhead Pharmaceuticals, Inc. Disulfide-containing alkyne linking agents
WO2017136837A1 (en) 2016-02-06 2017-08-10 President And Fellows Of Harvard College Recapitulating the hematopoietic niche to reconstitute immunity
WO2017137458A1 (en) 2016-02-08 2017-08-17 Synaffix B.V. Antibody-conjugates with improved therapeutic index for targeting cd30 tumours and method for improving therapeutic index of antibody-conjugates
WO2017137457A1 (en) 2016-02-08 2017-08-17 Synaffix B.V. Antibody-conjugates with improved therapeutic index for targeting cd30 tumours and method for improving therapeutic index of antibody-conjugates
WO2017191817A1 (ja) 2016-05-02 2017-11-09 味の素株式会社 アジド基含有Ｆｃタンパク質
JP2017218422A (ja) 2016-06-08 2017-12-14 ソニー株式会社 物質固定化基板及びその製造方法、物質固定化基板に用いられる物質固定化剤
EP3472210A1 (en) 2016-06-17 2019-04-24 Life Technologies Corporation Site-specific crosslinking of antibodies
WO2018002016A1 (en) * 2016-06-28 2018-01-04 Ventana Medical Systems, Inc. Application of click chemistry for signal amplification in ihc and ish assays
EP4606890A3 (en) 2016-07-13 2025-12-03 President and Fellows of Harvard College Antigen-presenting cell-mimetic scaffolds and methods for making and using the same
KR102638898B1 (ko) 2016-08-02 2024-02-22 프레지던트 앤드 펠로우즈 오브 하바드 칼리지 면역 반응을 조정하기 위한 생체재료
CN110366428B (zh) 2016-12-30 2024-05-17 Vaxcyte公司 具有非天然氨基酸的多肽-抗原缀合物
US11951165B2 (en) 2016-12-30 2024-04-09 Vaxcyte, Inc. Conjugated vaccine carrier proteins
CA3082231A1 (en) 2017-11-09 2019-05-16 National Research Council Of Canada Antibody glycoconjugates and methods of production and use
WO2019092148A1 (en) 2017-11-10 2019-05-16 Innate Pharma Antibodies with functionalized glutamine residues
WO2019151128A1 (ja) * 2018-02-05 2019-08-08 国立大学法人 宮崎大学 細胞標識剤及び細胞標識キット
EP4491743A3 (en) 2018-03-02 2025-03-19 Life Technologies Corporation Novel quencher and reporter dye combinations
WO2019240219A1 (ja) * 2018-06-14 2019-12-19 持田製薬株式会社 新規な架橋アルギン酸
US20210402002A1 (en) 2018-06-19 2021-12-30 Glykos Biomedical Oy Conjugate
US20210138080A1 (en) 2018-06-29 2021-05-13 Glykos Biomedical Oy Conjugates
WO2020061129A1 (en) 2018-09-19 2020-03-26 President And Fellows Of Harvard College Compositions and methods for labeling and modulation of cells in vitro and in vivo
EP3936501B1 (en) * 2019-03-08 2025-12-31 ABTIS Co., Ltd. SITE-SPECIFIC ANTIBODY CONJUGATION AND ANTIBODY-DRUG conjugate serving as a specific example thereof
US20220409773A1 (en) * 2019-06-28 2022-12-29 Mochida Pharmaceutical Co., Ltd. Transplantation device using chemically crosslinked alginic acid
WO2021041372A1 (en) 2019-08-26 2021-03-04 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Universal orthogonal network bioinks for three-dimensional bioprinting
GB201913598D0 (en) * 2019-09-20 2019-11-06 Univ Birmingham Labelling of biomolecules
EP4034148A4 (en) 2019-09-23 2025-09-10 Harvard College BIOMATERIAL-BASED ANTIGEN-FREE VACCINE AND ITS USE
WO2021116037A1 (en) 2019-12-09 2021-06-17 F. Hoffmann-La Roche Ag Dicationic fluorescent dyes
WO2021123506A1 (en) 2019-12-18 2021-06-24 Glykos Biomedical Oy Stabile conjugate
CN121378533A (zh) * 2019-12-18 2026-01-23 持田制药株式会社 新型交联海藻酸
WO2021155297A1 (en) * 2020-01-29 2021-08-05 President And Fellows Of Harvard College Methods for labeling and targeting cells
US20230099149A1 (en) 2020-01-31 2023-03-30 Innate Pharma Treatment of cancer
CN111620848A (zh) * 2020-04-29 2020-09-04 华东师范大学 含吡喃和中环骨架的三环稠合芳香体系化合物及其合成和应用
AR122020A1 (es) * 2020-05-05 2022-08-03 Genentech Inc Sistemas y métodos para la conjugación específica de sitio de proteínas mediada por tirosinasa
WO2022040266A1 (en) 2020-08-19 2022-02-24 Vaxcyte, Inc. Carrier-protein polysaccharide conjugation methods
AU2021387795A1 (en) 2020-11-25 2023-06-01 Innate Pharma Treatment of cancer
US11377424B1 (en) 2021-05-27 2022-07-05 Massachusetts Institute Of Technology Cyclooctynes for click chemistry
WO2022250679A1 (en) * 2021-05-27 2022-12-01 Massachusetts Institute Of Technology Cyclooctynes for click chemistry
CN116102403B (zh) * 2021-11-11 2024-06-11 中国科学院福建物质结构研究所 一种联烯醇类化合物的制备方法
JP2025517476A (ja) 2022-05-25 2025-06-05 イナート・ファルマ・ソシエテ・アノニム ネクチン－４結合剤
CN114853556B (zh) * 2022-06-14 2023-08-29 绍兴文理学院 一种5H-二苯并[a,d]环庚烯骨架的新合成方法
US20260034230A1 (en) 2022-07-29 2026-02-05 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for transferrin receptor (tfr)-mediated delivery to the brain and muscle
KR20250116795A (ko) 2022-11-14 2025-08-01 리제너론 파마슈티칼스 인코포레이티드 별아교세포로의 섬유아세포 성장 인자 수용체 3-매개된 전달을 위한 조성물 및 방법

Family Cites Families (22)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3711489A (en) * 1971-03-31 1973-01-16 Pfizer Certain 8,9-dihydro(3,4,7,8)cycloocta(1,2-d)imidazoles
SE403775B (sv) * 1973-11-21 1978-09-04 Du Pont Nya etenoantracenderivat (bensenobens(e)isoindolderivat) avsedda till anvendning som inhibitorer vid friradikal-polymerisation av vinylforeningar
US5723289A (en) 1990-06-11 1998-03-03 Nexstar Pharmaceuticals, Inc. Parallel selex
DE69108356T2 (de) 1990-11-17 1995-07-20 Nihon Nohyaku Co Ltd Hydrazonderivate, Verfahren zu ihrer Herstellung und ihre Verwendung.
US5767259A (en) 1994-12-27 1998-06-16 Naxcor Oligonucleotides containing base-free linking groups with photoactivatable side chains
SE9500342D0 (sv) 1995-01-31 1995-01-31 Marek Kwiatkowski Novel chain terminators, the use thereof for nucleic acid sequencing and synthesis and a method of their preparation
US5843650A (en) 1995-05-01 1998-12-01 Segev; David Nucleic acid detection and amplification by chemical linkage of oligonucleotides
US5874532A (en) 1997-01-08 1999-02-23 Nexstar Pharmaceuticals, Inc. Method for solution phase synthesis of oligonucleotides and peptides
US6737236B1 (en) 1997-01-08 2004-05-18 Proligo, Llc Bioconjugation of macromolecules
US7427678B2 (en) 1998-01-08 2008-09-23 Sigma-Aldrich Co. Method for immobilizing oligonucleotides employing the cycloaddition bioconjugation method
DE20122767U1 (de) 2000-10-06 2007-08-09 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Massives Parallelverfahren zur Dekodierung von DNA und RNA
DK2226316T3 (en) 2002-05-30 2016-04-11 Scripps Research Inst Copper catalyzed ligation of azides and acetylenes
US7597876B2 (en) * 2007-01-11 2009-10-06 Immunomedics, Inc. Methods and compositions for improved F-18 labeling of proteins, peptides and other molecules
EP1530578B1 (en) 2002-08-23 2013-03-13 Illumina Cambridge Limited Modified nucleotides for polynucleotide sequencing
AU2003297859A1 (en) 2002-12-13 2004-07-09 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Biomolecular coupling methods using 1,3-dipolar cycloaddition chemistry
CN101068577A (zh) 2004-10-07 2007-11-07 皇家飞利浦电子股份有限公司 施陶丁格连接在用于显像和治疗的显像和治疗目的试剂盒中的应用
US20060147963A1 (en) 2004-12-30 2006-07-06 Affymetrix, Inc. Detection of polynucleotides on nucleic acid arrays using azido-modified triphosphate nucleotide analogs
ATE479699T1 (de) 2005-05-02 2010-09-15 Baseclick Gmbh Neue markierungsstrategien für den empfindlichen nachweis von analyten
WO2007039858A2 (en) * 2005-10-04 2007-04-12 Koninklijke Philips Electronics N.V. Targeted imaging and/or therapy using the [3+2] azide-alkyne cycloaddition
US8114636B2 (en) 2006-02-10 2012-02-14 Life Technologies Corporation Labeling and detection of nucleic acids
JP5498952B2 (ja) 2007-11-21 2014-05-21 ユニバーシティ・オブ・ジョージア・リサーチ・ファウンデイション・インコーポレイテッド アルキン類及び１，３−双極子機能性化合物とアルキン類を反応させる方法
JP2010122071A (ja) * 2008-11-19 2010-06-03 Okayama Univ 物質を固定化した物質固定化担体および物質固定化担体を作製する方法

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2014177458A (ja) * 2007-11-21 2014-09-25 Univ Of Georgia Research Foundation Inc アルキン類及び１，３−双極子機能性化合物とアルキン類を反応させる方法
JP2016145221A (ja) * 2007-11-21 2016-08-12 ユニバーシティ・オブ・ジョージア・リサーチ・ファウンデイション・インコーポレイテッド アルキン類及び１，３−双極子機能性化合物とアルキン類を反応させる方法
JP2018039841A (ja) * 2007-11-21 2018-03-15 ユニバーシティ・オブ・ジョージア・リサーチ・ファウンデイション・インコーポレイテッド アルキン類及び１，３−双極子機能性化合物とアルキン類を反応させる方法
US10905678B2 (en) 2014-04-08 2021-02-02 University Of Georgia Research Foundation, Inc. Site-specific antibody-drug glycoconjugates and methods
US11872215B2 (en) 2014-04-08 2024-01-16 University Of Georgia Research Foundation, Inc. Site-specific antibody-drug glyconjugates and methods

Also Published As

Publication number Publication date
JP5956487B2 (ja) 2016-07-27
US8133515B2 (en) 2012-03-13
JP2014177458A (ja) 2014-09-25
DK2222341T3 (en) 2015-03-09
US9932297B2 (en) 2018-04-03
US20120322974A9 (en) 2012-12-20
CN101925366B (zh) 2015-02-04
EP2222341B1 (en) 2015-02-25
US20100297250A1 (en) 2010-11-25
DK2907525T3 (en) 2018-08-06
JP2018039841A (ja) 2018-03-15
US20160159732A1 (en) 2016-06-09
WO2009067663A8 (en) 2009-07-23
US20120172575A1 (en) 2012-07-05
US20170320815A1 (en) 2017-11-09
EP2907525B1 (en) 2018-05-16
US20150126706A1 (en) 2015-05-07
US8940859B2 (en) 2015-01-27
EP2907525A3 (en) 2015-12-02
CN101925366A (zh) 2010-12-22
JP2016145221A (ja) 2016-08-12
US20120040011A9 (en) 2012-02-16
US9227943B2 (en) 2016-01-05
JP6659397B2 (ja) 2020-03-04
US9725405B2 (en) 2017-08-08
EP2222341A1 (en) 2010-09-01
EP2907525A2 (en) 2015-08-19
JP2011504507A (ja) 2011-02-10
CN104529711A (zh) 2015-04-22
CN104529711B (zh) 2020-02-07
WO2009067663A1 (en) 2009-05-28

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP5498952B2 (ja) アルキン類及び１，３−双極子機能性化合物とアルキン類を反応させる方法
JP5920936B2 (ja) 縮合シクロオクチン化合物及び無金属クリック反応におけるそれらの使用
CN102268191B (zh) 七甲川吲哚花菁染料及其合成方法和应用
TW202026300A (zh) 反應性標記化合物及其用途
CN110128666B (zh) 功能化聚乙烯亚胺包裹纳米金颗粒复合材料及其制备方法
US8541604B2 (en) Process for the functionalization of biological molecules
Nickels et al. Functionalization of iron oxide nanoparticles with a versatile epoxy amine linker
RU2713151C1 (ru) Конъюгат флуоресцентного красителя с веществом пептидной природы, включающим псма-связывающий лиганд на основе производного мочевины для визуализации клеток, экспрессирующих псма, способ его получения и применения
Bhatta et al. Recyclable cell-surface chemical tags for repetitive cancer targeting
EP3831888B1 (en) Drug that reacts with acrolein, use thereof and novel compound
Lakshmi et al. Role of hydrophobicity in tuning the intracellular uptake of dendron-based fluorophores for in vitro metal ion sensing
Wang et al. Synthesis, characterization and cell imaging of a new polythiophene derivative
CN114574194B (zh) 一种pH荧光探针、其合成方法及其应用
CN114478304A (zh) 一种具有肿瘤乏氧检测的指示剂及其制备方法用途
Russo Chemical site-selective functionalization of proteins with boronic acids
JPH10330346A (ja) 直鎖状ニトロン誘導体並びにこれを含有する医薬および試薬
Luong Development of acid-sensitive N-ethoxybenzylimidazoles for use as linkers in drug delivery systems

Legal Events

Date Code Title Description
A621 Written request for application examination

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621

Effective date: 20110322

A977 Report on retrieval

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A971007

Effective date: 20130509

A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20130514

A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20130910

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20131209

TRDD Decision of grant or rejection written
A01 Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01

Effective date: 20140107

A601 Written request for extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601

Effective date: 20140206

A602 Written permission of extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A602

Effective date: 20140217

A61 First payment of annual fees (during grant procedure)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61

Effective date: 20140310

R150 Certificate of patent or registration of utility model

Ref document number: 5498952

Country of ref document: JP

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250