JP5488594B2 - Method for producing purine ribonucleoside and ribonucleotide - Google Patents
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Description
本発明は、微生物工業に関し、更に詳しくは、プリンヌクレオチドの合成における原料として重要なプリンリボヌクレオシドの製造方法に関する。この方法は、３−ヘキスロース−６−リン酸合成酵素（3-hexulose-6-phosphate synthase）をコードする遺伝子の発現を低減させるよう改変されたバチルス（Bacillus）属細菌を使用するものである。 The present invention relates to the microbial industry, and more particularly to a method for producing a purine ribonucleoside important as a raw material in the synthesis of purine nucleotides. This method uses a bacterium belonging to the genus Bacillus that has been modified to reduce the expression of a gene encoding 3-hexulose-6-phosphate synthase.
アデニン栄養要求性株を利用するプリンヌクレオシドの発酵生産の方法は公知である。更に、プリンアナログ及びスルファグアニジンのような種々の薬剤に対する耐性をこれらの株に更に付与することができる。これらの株の例には、種々のバチルス属の株（特許文献１〜８）、ブレビバクテリウム（Brevibacterium）属の株（特許文献９、１０、非特許文献１）、及びエシュリヒア（Escherichia）属の株（特許文献１１）等が含まれる。 Methods for the fermentation production of purine nucleosides using adenine auxotrophic strains are known. In addition, resistance to various drugs such as purine analogs and sulfaguanidine can be further conferred on these strains. Examples of these strains include various strains of the genus Bacillus (patent documents 1 to 8), strains of the genus Brevibacterium (patent documents 9 and 10, non-patent document 1), and genus Escherichia. Strain (Patent Document 11) and the like.
従来、この種の変異株の取得は、微生物をＵＶ照射による変異誘発又はニトロソグアニジン（Ｎ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン）を用いた処理による変異誘発に供し、適切な選択培地を使用することにより所望の特性を備えた株を選択することによって行われている。代替的に、例えば、バチルス属（特許文献１２〜２２）及びブレビバクテリウム属（特許文献２３）の株について、遺伝子操作技術を使用する育種によって変異株が取得されている。これらのイノシン生産株の生産性は、イノシンを排出する能力を増加させることによって更に向上させることができる（特許文献２４〜２６）。 Conventionally, this type of mutant strain has been obtained by subjecting microorganisms to mutagenesis by UV irradiation or mutagenesis by treatment with nitrosoguanidine (N-methyl-N′-nitro-N-nitrosoguanidine), and an appropriate selective medium. Is used by selecting strains with the desired characteristics. Alternatively, for example, for the strains of the genus Bacillus (patent documents 12 to 22) and the genus Brevibacterium (patent document 23), mutant strains have been obtained by breeding using genetic engineering techniques. The productivity of these inosine production strains can be further improved by increasing the ability to discharge inosine (Patent Documents 24 to 26).
リブロースモノホスフェート（RuMP）経路は、１炭素単位から炭素−炭素結合を含む化合物を合成する代謝経路の１つであり、メチロトローフとして知られている多くのメタン資化性細菌及びメタノール資化性細菌に見出される。この経路の特徴的な酵素は、３−ヘキスロース−６−リン酸合成酵素（3-hexulose-6-phosphate synthase, HPS）及び６−ホスホ−３−ヘキスロイソメラーゼ（6-phospho-3-hexuloisomerase, PHI）であるが、これらはいずれもメチロトローフ以外に存在するとは考えられていなかった。しかしながら、バチルス・ズブチリス（Bacillus subtilis）の推定されるyckG遺伝子産物（YckG）は、メチロトローフHPSのものと類似する一次構造を有している。yckF遺伝子産物（YckF）とメチロトローフPHIとの間の配列の類似性についても検討されており、バチルス・ズブチリスのyckG及びyckF遺伝子は、それぞれHPS及びPHIの酵素活性を備えたタンパク質を発現することが見出されている。これらの両者の活性は共に、バチルス・ズブチリスにおいてホルムアルデヒドにより誘発され、yckH遺伝子に対して依存性を示すが、メタノール、ギ酸エステル（塩）、又はメチルアミンによっては誘発されない。いずれかの遺伝子の破壊により、ホルムアルデヒドに対する適度な感受性が引き起こされ、これらの酵素が、バチルス・ズブチリスにおいてホルムアルデヒドの解毒系として作用していることが示唆される。活性なyckG（HPS）−yckF（PHI）遺伝子構造（ここではhxlA-hxlBと名づける）が、非メチロトローフであり、本来的にRuMP経路を有するバチルス・ズブチリスにおいて見出されている（非特許文献２）。 The ribulose monophosphate (RuMP) pathway is one of metabolic pathways for synthesizing compounds containing a carbon-carbon bond from one carbon unit, and many methane-utilizing bacteria and methanol-utilizing bacteria known as methylotrophs. To be found. Characteristic enzymes of this pathway are 3-hexulose-6-phosphate synthase (HPS) and 6-phospho-3-hexuloisomerase, PHI), but none of these were thought to exist other than methylotrophs. However, the putative yckG gene product (YckG) of Bacillus subtilis has a primary structure similar to that of methylotrophic HPS. Sequence similarity between the yckF gene product (YckF) and methylotrophic PHI has also been studied, and the yckG and yckF genes of Bacillus subtilis can express proteins with the enzymatic activities of HPS and PHI, respectively. Has been found. Both of these activities are induced by formaldehyde in Bacillus subtilis and are dependent on the yckH gene, but not by methanol, formate (salt), or methylamine. The disruption of either gene causes moderate sensitivity to formaldehyde, suggesting that these enzymes act as a formaldehyde detoxification system in Bacillus subtilis. An active yckG (HPS) -yckF (PHI) gene structure (herein named hxlA-hxlB) is a non-methylotroph and is found in Bacillus subtilis that originally has a RuMP pathway (Non-patent Document 2). ).
しかしながら、プリンリボヌクレオシドの生産性を向上させる目的で３−ヘキスロース−６−リン酸合成酵素をコードする遺伝子を不活性化させることは、これまで報告されていない。 However, it has not been reported so far to inactivate a gene encoding 3-hexulose-6-phosphate synthase for the purpose of improving the productivity of purine ribonucleoside.
本発明の一態様は、発酵によってプリンヌクレオシドを生産するのに適切な微生物を改良し、微生物の株を使用してプリンヌクレオシドを製造する方法を提供することである。 One aspect of the present invention is to improve microorganisms suitable for producing purine nucleosides by fermentation and provide a method for producing purine nucleosides using strains of microorganisms.
この目的は、３−ヘキスロース−６−リン酸合成酵素をコードする遺伝子の発現を低減させることにより、イノシン、キサントシン、グアノシン、又はアデノシンのようなプリンヌクレオシドの生産を増強させることができることを見出したことによって達成された。 This aim has been found to be able to enhance the production of purine nucleosides such as inosine, xanthosine, guanosine, or adenosine by reducing the expression of the gene encoding 3-hexulose-6-phosphate synthase. Was achieved.
本発明は、プリンヌクレオシド生産能が増大したバチルス属に属する細菌、特にバチルス・ズブチリス及びバチルス・アミロリケファシエンス（Bacillus amyloliquefaciens）を提供するものである。 The present invention provides a bacterium belonging to the genus Bacillus having an increased ability to produce purine nucleosides, in particular, Bacillus subtilis and Bacillus amyloliquefaciens.
本発明の態様によれば、プリンヌクレオシドを生産能を有するバチルス属細菌であって、３−ヘキスロース−６−リン酸合成酵素（ＨＰＳ）活性が減少するよう改変されたバチルス属細菌が提供される。 According to an aspect of the present invention, there is provided a Bacillus bacterium having the ability to produce purine nucleosides, which is modified to reduce 3-hexulose-6-phosphate synthase (HPS) activity. .
本発明の更なる態様によれば、プリンヌクレオシドを生産能を有し、３−ヘキスロース−６−リン酸合成酵素をコードする遺伝子の発現が低減するよう改変された前記細菌が提供される。 According to a further aspect of the present invention, there is provided the aforementioned bacterium which has the ability to produce a purine nucleoside and has been modified to reduce the expression of a gene encoding 3-hexulose-6-phosphate synthase.
本発明の更なる態様によれば、３−ヘキスロース−６−リン酸合成酵素をコードする遺伝子の発現が、当該遺伝子を不活性化させることによって低減された前記細菌が提供される。 According to a further aspect of the present invention, there is provided the bacterium, wherein expression of a gene encoding 3-hexulose-6-phosphate synthase is reduced by inactivating the gene.
本発明の更なる態様によれば、３−ヘキスロース−６−リン酸合成酵素をコードする遺伝子がhxlA遺伝子である前記細菌が提供される。 According to a further aspect of the present invention, there is provided the bacterium as described above, wherein the gene encoding 3-hexulose-6-phosphate synthase is the hxlA gene.
本発明の更なる態様によれば、バチルス・ズブチリスである前記細菌が提供される。 According to a further aspect of the present invention, there is provided the bacterium which is Bacillus subtilis.
本発明の更なる態様によれば、バチルス・アミロリケファシエンスである前記細菌が提供される。 According to a further aspect of the present invention, there is provided the bacterium which is Bacillus amyloliquefaciens.
本発明の更なる態様によれば、プリンヌクレオシドが、イノシン、キサントシン、グアノシン、及びアデノシンからなる群から選択される前記細菌が提供される。 According to a further aspect of the invention, there is provided the bacterium, wherein the purine nucleoside is selected from the group consisting of inosine, xanthosine, guanosine, and adenosine.
本発明の更なる態様によれば、前記細菌を培養培地中で培養し、プリンヌクレオシドを培養培地中に排出させ、前記プリンヌクレオシドを培養培地から回収することを含むことを特徴とするプリンヌクレオシドの製造方法が提供される。 According to a further aspect of the present invention, there is provided a purine nucleoside comprising: culturing the bacterium in a culture medium; discharging the purine nucleoside into the culture medium; and recovering the purine nucleoside from the culture medium. A manufacturing method is provided.
本発明の更なる態様によれば、プリンヌクレオシドが、イノシン、キサントシン、グアノシン、及びアデノシンからなる群から選択される前記方法が提供される。 According to a further aspect of the invention, there is provided the method, wherein the purine nucleoside is selected from the group consisting of inosine, xanthosine, guanosine, and adenosine.
本発明の更なる態様によれば、前記細菌を培養培地中で培養し、プリンヌクレオシドを培養培地中に排出させ、プリンヌクレオシドをリン酸化し、プリンヌクレオチドを単離することを含むプリンヌクレオチドの製造方法が提供される。 According to a further aspect of the present invention, a purine nucleotide is produced comprising culturing the bacterium in a culture medium, draining the purine nucleoside into the culture medium, phosphorylating the purine nucleoside, and isolating the purine nucleotide. A method is provided.
本発明の更なる態様によれば、プリンヌクレオチドが、5'-イノシン酸、キサントシン-5'-リン酸、5'-グアニル酸、及び5'-アデニル酸からなる群から選択される前記方法が提供される。 According to a further aspect of the invention, the method wherein the purine nucleotide is selected from the group consisting of 5'-inosinic acid, xanthosine-5'-phosphate, 5'-guanylic acid, and 5'-adenylic acid. Provided.
本発明を以下に詳細に説明する。 The present invention is described in detail below.
１．本発明の細菌
この細菌は、プリンヌクレオシドを生産することができ、３−ヘキスロース−６−リン酸合成酵素活性が減少するよう改変されたものである。この細菌は、バチルス属に属する。
1. Bacteria of the Invention This bacterium is capable of producing purine nucleosides and has been modified to reduce 3-hexulose-6-phosphate synthase activity. This bacterium belongs to the genus Bacillus.
バチルス属細菌の例には、Bacillus subtilis subsp. subtilis168株（バチルス・ズブチリス168）又はバチルス・アミロリケファシエンスが含まれる。バチルス・アミロリケファシエンスは、異型遺伝子性の種である。多数のバチルス・アミロリケファシエンス株が知られており、これらにはSB、T、P、W、F、N、K、及びHが含まれる（Welker N. E., Campbell L. L., Unrelatedness of Bacillus amyloliquefaciens and Bacillus subtilis
. J. Bacteriol., 94: 1124-1130, 1967）。最近、バチルス属の株が植物から単離され、これらはバチルス・アミロリケファシエンスの別個の生態型であると考えられている（Reva et al., Taxonomic characterization and plant colonizing abilities of some bacteria related to Bacillus amyloliquefaciens and Bacillus subtilis. FEMS Microbiol. Ecol., 48:249-259, 2004）。前記の株の１つであるバチルス・アミロリケファシエンス FZB42の全ヌクレオチド配列が決定されている（Chen et al., Comparative analysis
of the complete genome sequence of the plant growth-promoting bacterium Bacillus amyloliquefaciens FZB42. Nat. Biotechnol., 25: 1007-1014, 2007）。
Examples of Bacillus bacteria include Bacillus subtilis subsp. Subtilis 168 strain (Bacillus subtilis 168) or Bacillus amyloliquefaciens. Bacillus amyloliquefaciens is a heterogeneous species. A number of Bacillus amyloliquefaciens strains are known, including SB, T, P, W, F, N, K, and H (Welker NE, Campbell LL, Unrelatedness of Bacillus amyloliquefaciens and Bacillus subtilis
J. Bacteriol., 94: 1124-1130, 1967). Recently, strains of the genus Bacillus have been isolated from plants and these are considered to be distinct ecotypes of Bacillus amyloliquefaciens (Reva et al., Taxonomic characterization and plant colonizing abilities of some bacteria related to Bacillus amyloliquefaciens and Bacillus subtilis. FEMS Microbiol. Ecol., 48: 249-259, 2004). The entire nucleotide sequence of Bacillus amyloliquefaciens FZB42, one of the aforementioned strains, has been determined (Chen et al., Comparative analysis
of the complete genome sequence of the plant growth-promoting bacterium Bacillus amyloliquefaciens FZB42. Nat. Biotechnol., 25: 1007-1014, 2007).
バチルス属に属する細菌の例には以下のものも含まれる：バチルス・リケニフォルミス（Bacillus licheniformis）、バチルス・プミリス（Bacillus pumilis）、バチルス・メガテリウム（Bacillus megaterium）、バチルス・ブレビス（Bacillus brevis）、バチルス・ポリミキサ（Bacillus polymixa）、及びバチルス・ステアロサーモフィラス（Bacillus stearothermophilus）。 Examples of bacteria belonging to the genus Bacillus also include: Bacillus licheniformis, Bacillus pumilis, Bacillus megaterium, Bacillus brevis, Bacillus brevis, Bacillus polymixa and Bacillus stearothermophilus.
既に言及した性質に加えて、これらの細菌は、種々の栄養要求性、薬剤耐性、薬剤感受性、及び薬剤依存性も有し得る。 In addition to the properties already mentioned, these bacteria can also have various auxotrophy, drug resistance, drug sensitivity, and drug dependence.
「プリンヌクレオシド」という記載は、イノシン、キサントシン、グアノシン、及びアデノシンを含み、好ましくはイノシンである。 Reference to “purine nucleoside” includes inosine, xanthosine, guanosine, and adenosine, preferably inosine.
「プリンヌクレオシド生産能」という文言は、培地中においてプリンヌクレオシドを生成して蓄積させる能力を意味する。「細菌がプリンヌクレオシド生産能を有する」という文言は、バチルス属に属する細菌が、バチルス属細菌の野生型又は非改変株、例えば、バチルス・ズブチリス168のようなバチルス・ズブチリスの野生型又は非改変株よりも多い量で、培地中においてプリンヌクレオシドなどのプリンを生成して蓄積させることが可能なことを意味する。好ましくは、この記載は、微生物が、培地中においてイノシン、キサントシン、グアノシン、及び／又はアデノシンのようなプリンヌクレオシドを10mg/l以上、更に好ましくは50mg/l以上の量で生成して蓄積させることが可能なことを意味する。 The term “purine nucleoside-producing ability” means the ability to produce and accumulate purine nucleosides in a medium. The phrase “bacteria have the ability to produce purine nucleosides” means that a bacterium belonging to the genus Bacillus is a wild-type or non-modified strain of a bacterium belonging to the genus Bacillus, for example, a wild-type or non-modified Bacillus subtilis 168 such as It means that purine such as purine nucleoside can be produced and accumulated in the medium in a larger amount than the strain. Preferably, the description states that the microorganism produces and accumulates purine nucleosides such as inosine, xanthosine, guanosine, and / or adenosine in the medium in an amount of 10 mg / l or more, more preferably 50 mg / l or more. Means that is possible.
「HPS活性」という用語は、リブロース-5-リン酸を用いるホルムアルデヒドのMg2+依存性アルドール縮合によるD-アラビノ-3-ヘキスロース-6-リン酸の形成反応を触媒する活性を意味する。HPS活性は、Yasueda, Hら（J. Bacteriology, 181(23), p. 7154-7160 (1999)）に記載されたように測定することができる。 The term “HPS activity” means an activity that catalyzes the formation reaction of D-arabino-3-hexulose-6-phosphate by Mg 2+ -dependent aldol condensation of formaldehyde with ribulose-5-phosphate. HPS activity can be measured as described in Yasueda, H et al. (J. Bacteriology, 181 (23), p. 7154-7160 (1999)).
バチルス・ズブチリス由来のHPSをコードする遺伝子、詳しくは、Bacillus subtilis subsp. subtilis 168株由来のhxlA遺伝子（yckGと同義）は、既に解明されている（GenBank Accession NC_000964の配列中のヌクレオチド374725〜375357と相補的なヌクレオチド）。バチルス・ズブチリス由来のhxlA遺伝子は、染色体上でhxlB遺伝子とhxlR遺伝子との間に位置する。バチルス・ズブチリスhxlA遺伝子のヌクレオチド配列及びhxlA遺伝子にコードされるアミノ酸配列は、それぞれ配列番号１及び配列番号２に示されている。 A gene encoding HPS derived from Bacillus subtilis, specifically, the hxlA gene (synonymous with yckG) derived from Bacillus subtilis subsp. Subtilis 168 has already been elucidated (nucleotides 374725 to 375357 in the sequence of GenBank Accession NC_000964 and Complementary nucleotides). The hxlA gene derived from Bacillus subtilis is located on the chromosome between the hxlB gene and the hxlR gene. The nucleotide sequence of the Bacillus subtilis hxlA gene and the amino acid sequence encoded by the hxlA gene are shown in SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2, respectively.
バチルス・アミロリケファシエンス由来のHPSをコードする遺伝子、更に詳しくは、バチルス・アミロリケファシエンス FZB42株由来のhxlA遺伝子は、既に解明されている（GenBank Accession NC_009725の配列中のヌクレオチド340797〜341432と相補的なヌクレオチド）。バチルス・アミロリケファシエンス由来のhxlA遺伝子は、染色体上でhxlB遺伝子とhxlR遺伝子との間に位置する。バチルス・アミロリケファシエンスhxlA遺伝子のヌクレオチド配列及びhxlA遺伝子にコードされるアミノ酸配列は、それぞれ配列番号３及び配列番号４に示されている。 The gene encoding HPS derived from Bacillus amyloliquefaciens, more specifically, the hxlA gene derived from Bacillus amyloliquefaciens strain FZB42 has already been elucidated (nucleotides 340797 to 341432 in the sequence of GenBank Accession NC_009725 and Complementary nucleotides). The hxlA gene derived from Bacillus amyloliquefaciens is located between the hxlB gene and the hxlR gene on the chromosome. The nucleotide sequence of the Bacillus amyloliquefaciens hxlA gene and the amino acid sequence encoded by the hxlA gene are shown in SEQ ID NO: 3 and SEQ ID NO: 4, respectively.
典型的には、これらの遺伝子は、細菌に導入する前に、バチルス属細菌中で機能することが可能なベクターにクローン化することができる。このような目的のためには、pHY300PLK、pMWMX1、pLF22、又はpKS1のようなシャトルベクターを使用することができる。野生型の遺伝子は、相同組換えによって変異体と置換することができる。 Typically, these genes can be cloned into a vector capable of functioning in Bacillus bacteria prior to introduction into the bacterium. For such purposes, shuttle vectors such as pHY300PLK, pMWMX1, pLF22, or pKS1 can be used. Wild-type genes can be replaced with mutants by homologous recombination.
バチルス属の株の間でDNA配列に幾分かの相異があり得るため、染色体上の不活性化されるhxlA遺伝子は、配列番号１及び配列番号３に示される遺伝子に限定されるものではなく、バリアントHPSタンパク質をコードする、配列番号１及び配列番号３と相同な遺伝子を含み得る。「バリアントHPSタンパク質」という記載は、本発明で使用するように、アミノ酸の欠失、挿入、付加、又は置換のいずれであるかに拘らず配列の変更を有するが、HPSタンパク質の活性を依然として維持するタンパク質を意味する。バリアントタンパク質における変更の数は、タンパク質の三次元構造における位置又はアミノ酸残基の種類に依存する。これは、配列番号２及び配列番号４において、１〜30、好ましくは１〜15、更に好ましくは１〜５とし得る。これらの変更は、タンパク質の機能に対して重要ではないタンパク質の領域に生じ得る。これは、幾つかのアミノ酸は互いに高い相同性を有することから、三次元構造又は活性はこのような変更によって影響を受けないからである。したがって、hxlA遺伝子によってコードされるタンパク質のバリアントは、hxlA遺伝子を不活性化する前のHPSタンパク質の活性が維持されている限り、配列番号２及び配列番号４に示す全アミノ酸配列に対して、80％以上、好ましくは90％以上、更に好ましくは95％以上、なお更に好ましくは98％以上、最も好ましくは99％以上の相同性を有するものとし得る。 Since there may be some differences in DNA sequence among strains of the genus Bacillus, the inactivated hxlA gene on the chromosome is not limited to the genes shown in SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 3 Rather, it may contain a gene homologous to SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 3 that encodes a variant HPS protein. Reference to “variant HPS protein”, as used in the present invention, has a sequence change, whether it is an amino acid deletion, insertion, addition, or substitution, but still maintains the activity of the HPS protein Means a protein that The number of changes in the variant protein depends on the position in the three-dimensional structure of the protein or the type of amino acid residue. This may be 1-30, preferably 1-15, more preferably 1-5 in SEQ ID NO: 2 and SEQ ID NO: 4. These changes can occur in regions of the protein that are not critical to protein function. This is because some amino acids are highly homologous to each other, so that the three-dimensional structure or activity is not affected by such changes. Therefore, the variant of the protein encoded by the hxlA gene is 80% of the total amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 and SEQ ID NO: 4 as long as the activity of the HPS protein prior to inactivation of the hxlA gene is maintained. % Or more, preferably 90% or more, more preferably 95% or more, still more preferably 98% or more, and most preferably 99% or more.
２つのアミノ酸配列の間の相同性は、周知の方法、例えば、コンピュータプログラムBLAST2.0を使用して決定することができ、この場合、３つのパラメータ、すなわちスコア、同一性、及び類似性を計算する。 Homology between two amino acid sequences can be determined using well-known methods, for example, the computer program BLAST 2.0, where three parameters are calculated: score, identity, and similarity To do.
更に、ｈｘｌＡ遺伝子は、不活性化する前の機能的なＨＰＳタンパク質をコードする限り、配列番号１及び配列番号３に示されるヌクレオチド配列又はこのヌクレオチド配列から調製することのできるプローブとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするバリアントとすることができる。「ストリンジェントな条件」には、特異的なハイブリッド、例えば、６０％以上、好ましくは７０％以上、更に好ましくは８０％以上、更に好ましくは９０％以上、更に好ましくは９５％以上、なお更に好ましくは９８％以上、最も好ましくは９９％以上の相同性を有するハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッド、例えば、前記より低い相同性を有するハイブリッドが形成されないものが含まれる。例えば、ストリンジェントな条件としては、６０℃において１ｘＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、好ましくは０．１ｘＳＳＣ、０．１％ＳＤＳの塩濃度での１回以上の洗浄、好ましくは２〜３回の洗浄が例示される。洗浄の持続時間は、ブロッティングに使用する膜の種類に依存するが、通例、製造業者によって推奨されるものとすることができる。例えば、ストリンジェントな条件下におけるＨｙｂｏｎｄ（商品名）Ｎ＋ナイロン膜（Amersham）についての推奨される洗浄の持続時間は１５分である。好ましくは、洗浄は２〜３回行うものとすることができる。プローブの長さは、ハイブリダイゼーションの条件に依存して適切に選択することができるが、通常は100 bp〜１kbpである。 Furthermore, as long as the hxlA gene encodes a functional HPS protein before inactivation, the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 3 or a probe that can be prepared from this nucleotide sequence and stringent conditions It can be a variant that hybridizes below. “Stringent conditions” include specific hybrids, for example 60% or more, preferably 70% or more, more preferably 80% or more, more preferably 90% or more, more preferably 95% or more, and still more preferably Includes hybrids having a homology of 98% or more, most preferably 99% or more, including non-specific hybrids such as those in which hybrids having the lower homology are not formed. For example, stringent conditions include 1 × SSC, 0.1% SDS, preferably 0.1 × SSC, 0.1% SDS at a salt concentration at 60 ° C., preferably 2-3 times. Is exemplified. The duration of the wash depends on the type of membrane used for blotting, but can typically be recommended by the manufacturer. For example, the recommended wash duration for Hybond N + nylon membrane (Amersham) under stringent conditions is 15 minutes. Preferably, the washing can be performed 2-3 times. The length of the probe can be appropriately selected depending on the hybridization conditions, but is usually 100 bp to 1 kbp.
hxlA遺伝子の発現は、遺伝子にコードされるタンパク質の細胞内の活性が、改変されていない株と比較して減少するよう、染色体上の遺伝子に変異を導入することによって低減させることができる。このような変異は、遺伝子によってコードされるタンパク質におけるアミノ酸の置換（ミスセンス変異）につながる１塩基以上の置換、ストップコドンの導入（ノンセンス変異）、フレームシフトを引き起こす１または２塩基の欠失、薬剤耐性遺伝子の挿入、又は遺伝子の一部若しくは遺伝子全体の欠失とすることができる。hxlA遺伝子の発現は、プロモータ、シャイン・ダルガーノ（Shine-Dalgarno, SD）配列等のような
発現調節配列を改変することによっても低減させることができる。
The expression of the hxlA gene can be reduced by introducing a mutation into the gene on the chromosome so that the intracellular activity of the protein encoded by the gene is reduced compared to an unmodified strain. Such mutations include substitutions of one or more bases that lead to amino acid substitutions (missense mutations) in proteins encoded by genes, introduction of stop codons (nonsense mutations), deletion of one or two bases that cause frameshifts, drugs It can be an insertion of a resistance gene or a deletion of a part of the gene or the entire gene. Expression of the hxlA gene can also be reduced by modifying expression regulatory sequences such as a promoter, Shine-Dalgarno (SD) sequence, and the like.
例えば、遺伝子組換えによって変異を導入するために、以下の方法を用いることができる。変異遺伝子を含むDNA断片を調製し、細菌に形質転換する。その後、相同組換えによって細菌染色体上の本来遺伝子（native gene）を変異遺伝子で置換し、この結果得られる株を選択する。相同組換えを使用するこのような遺伝子の置換は、「Red-driven integration」として知られている線状（linear）DNAを用いる方法（Datsenko, K. A. and Wanner, B. L.、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97, 12, p. 6640-6645 (2000)）、又は温度感受性複製開始点を含むプラスミドを用いる方法（米国特許第6,303,383号又は特開平5-007491号公報（JP 05-007491A））によって行うことができる。更に、前記したような相同組換えを使用する遺伝子置換による部位特異的変異の組込みは、宿主中で複製する能力を欠如したプラスミドを用いた形質転換によっても行うことができる。 For example, the following method can be used to introduce a mutation by genetic recombination. A DNA fragment containing the mutated gene is prepared and transformed into bacteria. Thereafter, the native gene on the bacterial chromosome is replaced with the mutant gene by homologous recombination, and the resulting strain is selected. Such gene replacement using homologous recombination is a method using linear DNA known as “Red-driven integration” (Datsenko, KA and Wanner, BL, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97, 12, p. 6640-6645 (2000)), or a method using a plasmid containing a temperature-sensitive replication origin (US Pat. No. 6,303,383 or JP-A-5-007491 (JP 05-007491A)). Can be done by. Furthermore, the incorporation of site-specific mutations by gene replacement using homologous recombination as described above can also be performed by transformation with a plasmid lacking the ability to replicate in the host.
遺伝子の発現は、遺伝子のコード領域にトランスポゾンまたはIS因子を挿入することによっても（米国特許第5,175,107号）、又はUV照射を使用する変異誘発若しくはニトロソグアニジン（Ｎ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン）を用いる処理のような従来の方法によっても低減させることができる。 Expression of the gene can also be achieved by inserting a transposon or IS element into the coding region of the gene (US Pat. No. 5,175,107), or mutagenesis using UV radiation or nitrosoguanidine (N-methyl-N′-nitro-N It can also be reduced by conventional methods such as treatment with nitrosoguanidine).
遺伝子の不活性化は、UV照射を使用する変異誘発若しくはニトロソグアニジン（Ｎ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン）を用いる処理、部位特異的変異誘発、相同組換えを使用する遺伝子の破壊、及び／又は挿入−欠失変異誘発のような従来の方法によっても行うことができる。 Gene inactivation involves mutagenesis using UV irradiation or treatment with nitrosoguanidine (N-methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine), site-directed mutagenesis, homologous recombination of genes It can also be performed by conventional methods such as disruption and / or insertion-deletion mutagenesis.
細菌は、プリンヌクレオシド生産能を本来的に有する細菌において、HPSをコードする遺伝子の発現を低減させることによって得ることができる。代替的に、細菌は、HPS遺伝子の発現が低減された細菌に対して、プリンヌクレオシド生産能を付与することによって得ることができる。 A bacterium can be obtained by reducing the expression of a gene encoding HPS in a bacterium inherently having purine nucleoside-producing ability. Alternatively, the bacterium can be obtained by imparting purine nucleoside-producing ability to a bacterium with reduced HPS gene expression.
バチルス属細菌を誘導するのに使用し得る親バチルス株の例は、バチルス・ズブチリス
イノシン生産KMBS375株（KMBS375: Ppur*-ΔattΔpurAΔpurRΔpupGΔdeoDguaB24；参考例）である。他の親バチルス株には、バチルス・ズブチリスAJ12707株(FERM P-12951)（特願昭61-13876号（JP6113876A2））、バチルス・ズブチリスAJ3772株(FERM P-2555)（特願昭62-014794号（JP62014794A2））、バチルス・プミリス（Bacillus pumilus）NA-1102
(FERM BP-289)、バチルス・ズブチリス NA-6011 (FERM BP-291)、バチルス・ズブチリス
G1136A (ATCC No. 19222)（米国特許第3,575,809号）、2005年10月３日にVKPMにバチルス・アミロリケファシエンス G1136A (VKPM B-8994)として寄託され2006年10月13日に国際寄託に移行され、再同定されたバチルス・アミロリケファシエンス AJ1991、バチルス・ズブチリス NA-6012 (FERM BP-292)（米国特許第4,701,413号）、バチルス・プミリス Gottheil No. 3218 (ATCC No. 21005)（米国特許第3,616,206号）、バチルス・アミロリケファシエンスAS115-7株 (VKPM B-6134)（ロシア特許第2003678号）等が含まれる。バチルス・サブチルスKMBS16株も使用することができる。この株は、公知のバチルス・ズブチリス 168 trpC2株の誘導体であり、プリンリプレッサー（purR::spc）をコードするpurR遺伝子、スクシニルAMP合成酵素（purA::erm）をコードするpurA遺伝子、及びプリンヌクレオシドホスホリラーゼ（deoD::kan）をコードするdeoD遺伝子全てが変異を含むものである（ロシア特許出願第2002103333号、米国特許第7,326,546号（2008））。
An example of a parental Bacillus strain that can be used to induce Bacillus bacteria is the Bacillus subtilis inosine-producing KMBS375 strain (KMBS375: Ppur * -ΔattΔpurAΔpurRΔpupGΔdeoDguaB24; Reference Example). Other parent Bacillus strains include Bacillus subtilis AJ12707 (FERM P-12951) (Japanese Patent Application No. 61-13876 (JP6113876A2)), Bacillus subtilis AJ3772 strain (FERM P-2555) (Japanese Patent Application No. Sho 62-014794). (JP62014794A2)), Bacillus pumilus NA-1102
(FERM BP-289), Bacillus subtilis NA-6011 (FERM BP-291), Bacillus subtilis
G1136A (ATCC No. 19222) (US Pat. No. 3,575,809), deposited with VKPM on 3 October 2005 as Bacillus amyloliquefaciens G1136A (VKPM B-8994) and on 10 October 2006 with international deposit Migrated and re-identified Bacillus amyloliquefaciens AJ1991, Bacillus subtilis NA-6012 (FERM BP-292) (US Pat. No. 4,701,413), Bacillus pumilus Gottheil No. 3218 (ATCC No. 21005) (US Patent No. 3,616,206), Bacillus amyloliquefaciens AS115-7 strain (VKPM B-6134) (Russian Patent No. 2003678) and the like. Bacillus subtilis KMBS16 strain can also be used. This strain is a derivative of the publicly known Bacillus subtilis 168 trpC2 strain, and purR gene encoding purine repressor (purR :: spc), purA gene encoding succinyl AMP synthase (purA :: erm), and purine All of the deoD genes encoding nucleoside phosphorylase (deoD :: kan) contain mutations (Russian patent application 2002103333, US Pat. No. 7,326,546 (2008)).
細菌は、バチルス・ズブチリスのpurオペロンを含む、プリン生合成に関与する１以上の遺伝子の発現を増強することによって更に改良することができる（Ebbole D.J. and Zalkin H. J. Biol. Chem., 262: 8274-87 (1987), Bacillus subtilis and Its Closest Relatives, Editor in Chief: A.L. Sonenshein, ASM Press, Washington D.C., 2002）。
改変されたpurオペロン調節領域を有するイノシン生産性バチルス・ズブチリス株が記載されている（米国特許第7,326,546号（2008））。
Bacteria can be further improved by enhancing the expression of one or more genes involved in purine biosynthesis, including the Bacillus subtilis pur operon (Ebbole DJ and Zalkin HJ Biol. Chem., 262: 8274- 87 (1987), Bacillus subtilis and Its Closest Relatives, Editor in Chief: AL Sonenshein, ASM Press, Washington DC, 2002).
An inosine-producing Bacillus subtilis strain having a modified pur operon regulatory region has been described (US Pat. No. 7,326,546 (2008)).
染色体DNAの調製、ハイブリダイゼーション、ＰＣＲ、プラスミドＤＮＡの調製、ＤＮＡの消化及び連結、形質転換、プライマーとしてのオリゴヌクレオチドの選択等のための方法は、当業者に周知の通常の方法とすることができる。これらの方法は、Sambrook, J.and Russell D.「Molecular Cloning A Laboratory Manual, Third Edition」、Cold Spring Harbor Laboraroty Press (2001)等に記載されている。 Methods for chromosomal DNA preparation, hybridization, PCR, plasmid DNA preparation, DNA digestion and ligation, transformation, selection of oligonucleotides as primers, etc. should be conventional methods well known to those skilled in the art. it can. These methods are described in Sambrook, J. and Russell D. “Molecular Cloning A Laboratory Manual, Third Edition”, Cold Spring Harbor Laboraroty Press (2001) and the like.
２．ヌクレオシドの製造方法
イノシン及び／又はグアノシンのようなヌクレオシドを製造する方法は、培養培地中で細菌を培養し、培養培地中でヌクレオシドを生産して蓄積させ、培養培地からヌクレオシドを回収する工程を含む。
2. Method for producing nucleoside A method for producing a nucleoside such as inosine and / or guanosine comprises culturing bacteria in a culture medium, producing and accumulating nucleosides in the culture medium, and recovering the nucleoside from the culture medium. .
培養並びに培地からのプリンヌクレオシドの回収及び精製等は、微生物を使用してプリンヌクレオシドを製造する従来の発酵と類似した様式で行うことができる。プリンヌクレオシド製造のための培養培地は、炭素源、窒素源、無機イオン、及び必要に応じて他の有機成分を含有する典型的な培地とすることができる。炭素源としては、グルコース、ラクトース、ガラクトース、フラクトース、アラビノース、マルトース、キシロース、トレハロース、リボース、及び澱粉の加水分解物のような糖類、グリセリン、マンニトール、及びソルビトールのようなアルコール、グルコン酸、フマル酸、クエン酸、及びコハク酸のような有機酸等を使用することができる。窒素源としては、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、及びリン酸アンモニウムのような無機アンモニウム塩、大豆加水分解物のような有機窒素、アンモニアガス、アンモニア水等を使用することができる。ビタミンＢ１のようなビタミン、要求物質、例えば、アデニン及びＲＮＡのような核酸のような有機窒素、又は酵母エキス等が適切な量で、又は微量であっても存在するのが望ましい。これら以外に、必要に応じて、少量のリン酸カルシウム、硫酸マグネシウム、鉄イオン、マンガンイオン等を添加することができる。 Culture, recovery and purification of purine nucleosides from the medium, and the like can be performed in a manner similar to conventional fermentation in which purine nucleosides are produced using microorganisms. The culture medium for purine nucleoside production can be a typical medium containing a carbon source, a nitrogen source, inorganic ions, and optionally other organic components. Carbon sources include sugars such as glucose, lactose, galactose, fructose, arabinose, maltose, xylose, trehalose, ribose, and starch hydrolysates, alcohols such as glycerin, mannitol, and sorbitol, gluconic acid, fumaric acid Organic acids such as citric acid and succinic acid can be used. As the nitrogen source, inorganic ammonium salts such as ammonium sulfate, ammonium chloride, and ammonium phosphate, organic nitrogen such as soybean hydrolysate, ammonia gas, aqueous ammonia, and the like can be used. It is desirable that vitamins such as vitamin B1, required substances, for example, organic nitrogen such as nucleic acids such as adenine and RNA, yeast extract, and the like are present in an appropriate amount or even in a trace amount. In addition to these, a small amount of calcium phosphate, magnesium sulfate, iron ion, manganese ion, etc. can be added as necessary.
培養は、好ましくは、好気条件下で１６〜７２時間行うことができ、培養中の培養温度は３０〜４５℃以内に制御し、pHは５〜８以内に制御する。ｐＨは、無機若しくは有機酸又はアルカリ物質並びにアンモニアガスを使用することによって調整することができる。 The culture can be preferably carried out under aerobic conditions for 16 to 72 hours. The culture temperature during the culture is controlled within 30 to 45 ° C., and the pH is controlled within 5 to 8. The pH can be adjusted by using inorganic or organic acids or alkaline substances and ammonia gas.
培養後、細胞のような固体は、遠心分離又は膜ろ過によって液体培地から除去することができ、その後にイオン交換樹脂及び沈殿のような従来の技術のいずれかの組合せによって、目的とするプリンヌクレオシドを発酵液から回収することができる。 After incubation, solids such as cells can be removed from the liquid medium by centrifugation or membrane filtration, followed by the desired purine nucleoside by any combination of conventional techniques such as ion exchange resin and precipitation. Can be recovered from the fermentation broth.
３．プリンヌクレオチドの製造方法
プリンヌクレオチドを製造する方法は、培養培地中で細菌を培養し、所望のプリンヌクレオシドをリン酸化し、細菌によって培地中に排出させ、プリンヌクレオチドを回収する工程を含む。更に、５’−イノシン酸を製造する方法は、培養培地中で細菌を培養し、イノシンをリン酸化し、細菌によって培養物中に排出させ、５’−イノシン酸を回収する工程を含む。更に、５’−キサンチル酸を製造する方法は、培養培地中で細菌を培養し、キサントシンをリン酸化し、細菌によって培養培地中に排出させ、５’−キサンチル酸を回収する工程を含む。更に、５’−グアニル酸を製造する方法は、培養培地中で細菌を培養し、グアノシンをリン酸化し、細菌によって培養培地中に排出させ、５’−グアニル酸を回収する工程を含む。そして、５’−グアニル酸を製造する方法は、培養培地中で細菌を培養し、キサントシンをリン酸化し、細菌によって培養培地中に排出させ、５’−キサンチル酸をアミノ化し、５’−グアニル酸を回収する工程を含む。
3. Method for Producing Purine Nucleotide A method for producing a purine nucleotide includes a step of culturing a bacterium in a culture medium, phosphorylating a desired purine nucleoside, allowing the bacterium to excrete it into the medium, and recovering the purine nucleotide. Furthermore, the method for producing 5′-inosinic acid includes the steps of culturing bacteria in a culture medium, phosphorylating inosine, excreting it into the culture by the bacteria, and recovering 5′-inosinic acid. Furthermore, the method for producing 5′-xanthylic acid includes a step of culturing bacteria in a culture medium, phosphorylating xanthosine, discharging the bacteria into the culture medium, and collecting 5′-xanthylic acid. Furthermore, the method for producing 5′-guanylic acid includes the steps of culturing bacteria in a culture medium, phosphorylating guanosine, discharging the bacteria into the culture medium, and recovering 5′-guanylic acid. The method for producing 5′-guanylic acid is a method of culturing bacteria in a culture medium, phosphorylating xanthosine, discharging the bacteria into the culture medium, aminating 5′-xanthylic acid, and 5′-guanyl. Recovering the acid.
リン酸化するプリンヌクレオシドは、細菌がプリンヌクレオシドを培地中に排出した培地から回収することができる。しかしながら、プリンヌクレオシドの単離又は精製を行うことなく、プリンヌクレオシドを含有する培地をリン酸化反応のために使用することができる。 The purine nucleoside that is phosphorylated can be recovered from the medium in which the bacterium excretes the purine nucleoside into the medium. However, a medium containing purine nucleoside can be used for the phosphorylation reaction without isolation or purification of the purine nucleoside.
培養並びに培地からのイノシンの回収及び精製等は、微生物を使用してイノシンを製造する従来の発酵法と類似する様式で行うことができる。更に、イノシンをリン酸化し、細菌によって培養培地中に排出させ、5'-イノシン酸を回収する工程は、5'-イノシン酸のようなプリンヌクレオチドをイノシンのようなプリンヌクレオシドから製造する従来の発酵法と類似する様式で行うことができる。 Cultivation, recovery of inosine from the medium, purification, and the like can be performed in a manner similar to conventional fermentation methods in which inosine is produced using microorganisms. Furthermore, the step of phosphorylating inosine, excreting it into the culture medium by bacteria, and recovering 5'-inosinic acid is a conventional process for producing purine nucleotides such as 5'-inosinic acid from purine nucleosides such as inosine. It can be carried out in a manner similar to the fermentation process.
プリンヌクレオシドのリン酸化は、異なるホスファターゼ、ヌクレオシドキナーゼ、又はヌクレオシドホスホトランスフェラーゼを使用して酵素的に、又はPOCl3等のようなリン酸化試薬を使用して化学的に行うことができる。ピロリン酸のホスホリル基のヌクレオシドへのC-5'位置での選択的な転移を触媒することのできるホスファターゼ（Mihara et.
al, Phosphorylation of nucleosides by the mutated acid phosphatase from Morganella morganii. Appl. Environ. Microbiol., 66:2811-2816 (2000)）又はポリリン酸（塩）、フェニルリン酸（塩）、又はカルバミルリン酸（塩）をリン酸供与体として利用する酸性ホスファターゼ（国際公開第9637603号パンフレット）等を使用することができる。また、p-ニトロフェニルリン酸（Mitsugi, K., et al, Agric. Biol. Chem., 28, 586-600 (1964)）、無機リン酸（特願昭第42-1185号又は特開昭42-1185号公報（JP42-1186））、又はアセチルリン酸（特願昭第61-41555号又は特開昭第61-41555号公報（JP61-41555））を基質として利用したヌクレオシドのC-2', 3'又は5'位置へのリン酸基（phosphoryl group）の転移を触媒することのできるホスファターゼ等も使用することができる。ヌクレオシドキナーゼの例としては、E. coli由来のグアノシン／イノシンキナーゼ（Mori, H. et. al. Cloning of a guanosine-inosine kinase gene of Escherichia coli and characterization of the purified gene product. J. Bacteriol. 177:4921-4926 (1995)；国際公開第9108286号パンフレット）等を使用することができる。Hammer-Jespersen, K.によって記載されたヌクレオシドホスホトランスフェラーゼ（Nucleoside catabolism, p. 203-258. In A Munch-Petesen (ed.), Metabolism of nucleotides, nucleosides, and nucleobases in microorganism. 1980, Academic Press, New York）等を使用することができる。POCl3のようなリン酸化試薬等を使用してヌクレオシドの化学的リン酸化を行うことができる（Yoshikawa, K. et. al. Studies of phosphorylation. III. Selective phosphorylation of unprotected nucleosides. Bull. Chem. Soc. Jpn. 42:3505-3508 (1969)）。
Phosphorylation of purine nucleosides can be performed enzymatically using different phosphatases, nucleoside kinases, or nucleoside phosphotransferases, or chemically using a phosphorylating reagent such as POCl 3 . A phosphatase that can catalyze the selective transfer of the phosphoryl group of pyrophosphate to the nucleoside at the C-5 'position (Mihara et.
al. Phosphorylation of nucleosides by the mutated acid phosphatase from Morganella morganii. Appl. Environ. Microbiol., 66: 2811-2816 (2000)) or polyphosphoric acid (salt), phenylphosphoric acid (salt), or carbamyl phosphoric acid (salt) Acid phosphatase (International Publication No. 96376603 pamphlet) that uses as a phosphate donor can be used. Furthermore, p-nitrophenyl phosphate (Mitsugi, K., et al, Agric. Biol. Chem., 28, 586-600 (1964)), inorganic phosphate (Japanese Patent Application No. 42-1185 or No. 42-1185 (JP42-1186)), or acetyl phosphate (Japanese Patent Application No. 61-41555 or JP-A-61-41555 (JP61-41555)) as a substrate. Phosphatases that can catalyze the transfer of a phosphoryl group to the 2 ', 3' or 5 'position can also be used. Examples of nucleoside kinases include guanosine / inosine kinase from E. coli (Mori, H. et. Al. Cloning of a guanosine-inosine kinase gene of Escherichia coli and characterization of the purified gene product. J. Bacteriol. 177: 4921-4926 (1995); WO 9108286 pamphlet) can be used. Nucleoside phosphotransferase described by Hammer-Jespersen, K. (Nucleoside catabolism, p. 203-258. In A Munch-Petesen (ed.), Metabolism of nucleotides, nucleosides, and nucleobases in microorganism. 1980, Academic Press, New York) etc. can be used. Chemical phosphorylation of nucleosides can be performed using phosphorylating reagents such as POCl 3 (Yoshikawa, K. et. Al. Studies of phosphorylation. III. Selective phosphorylation of unprotected nucleosides. Bull. Chem. Soc Jpn. 42: 3505-3508 (1969)).
5'-キサンチル酸のアミノ化は、例えば、E. coli由来のGMP合成酵素を使用して酵素的に行うことができる（Fujio et. al. High level of expression of XMP aminase in Escherichia coli and its application for the industrial production of 5'- guanylic acid. Biosci. Biotech. Biochem. 1977, 61: 840-845；欧州特許第0251489号）。 Amination of 5′-xanthylic acid can be carried out enzymatically using, for example, GMP synthase derived from E. coli (Fujio et. Al. High level of expression of XMP aminase in Escherichia coli and its application Biosci. Biotech. Biochem. 1977, 61: 840-845; European Patent No. 051489) for the industrial production of 5'-guanylic acid.
以下の限定的でない実施例を参照し、本発明を以下に更に具体的に説明する。 The invention will now be described more specifically with reference to the following non-limiting examples.
実施例１：不活性化したhxlA遺伝子を有する株の構築
バチルス・ズブチリスイノシン生産菌KMBS375の染色体上のhxlA遺伝子を不活性化するために（KMBS375株の構築は参考例に記載されている）、pKS1プラスミド（Shatalin K. Y.とNeyfakh A. A., FEMS Microbiology Letters, 245: 315-9 (2005)）（図１）の２つのマルチクローニングサイトにhxlA遺伝子の上流及び下流領域をクローン化した。プライマーP1（配列番号５）及びP2（配列番号６）を用いバチルス・ズブチリス KMBS375の染色体
DNAを鋳型（template）として使用するPCRによって、hxlA遺伝子の上流領域の886 bp断片の増幅を行った。プライマーP1及びP2は、それぞれエンドヌクレアーゼSacII及びPstIの認識部位を含んでいる。プライマーP3（配列番号７）及びP4（配列番号８）を用いバチルス・ズブチリス KMBS375の染色体DNAを鋳型として使用するPCRによって、hxlA遺伝子の下流領域の923 bp断片の増幅を行った。プライマーP3及びP4は、それぞれエンドヌクレアーゼClaI及びKpnIの認識部位を含んでいる。P1及びP2を使用したPCR産物を精製し、エンドヌクレアーゼSacII及びPstIを用いて消化した後、pKS1プラスミドの対応する部位にクローン化した。P3及びP4を使用したPCR産物を精製し、エンドヌクレアーゼClaI及びKpnIを用いて消化した後、同様にpKS1プラスミドの対応する部位にクローン化した。両者の断片をクローン化した後、KmRカセット並びにhxlA遺伝子の上流及び下流領域を含むプラスミドをエンドヌクレアーゼSacII及びKpnIにより消化し、この結果得られた断片（3194 bp）をバチルス由来の非複製pBluescript II KSベクター（Stratagene）にサブクローン化した。この結果得られたプラスミドを使用してバチルス・ズブチリス KMBS375を形質転換し、12のKmR形質転換体を単離した。KmRカセットの組込みによってhxlA遺伝子が不活性化されたことを確認するために、プライマーP1及びP4を使用したコントロールPCR実験を行った。プライマーP1及びP4を使用しhxlA遺伝子の野生型対立遺伝子を用いたPCRによって得られたDNA断片の大きさは2476 bpである。これに対して、3194 bpのDNA断片の存在により、hxlA遺伝子へのKmRカセットの組込みが確認される。プライマーP5（配列番号９：プライマーP5は、P1プライマーに相補的な領域の上流であって、hxlA遺伝子の翻訳開始位置から1013 bpの位置に局在する領域に相補的な20塩基を含む）及びプライマーP6（配列番号１０：プライマーP6は、KmRカセット内に局在する領域に相補的な21塩基を含む）を使用する追加的なコントロールPCR実験では、1491 bpのPCR生成断片の存在により、KMBS375染色体上のhxlA遺伝子へのKmRカセットの組込みが確認される。組込まれたKmRカセットを含むKMBS375形質転換体の１つを次のプロセスに使用した。この株は、KMBS375Δhxl::Kmと命名した。
Example 1: Construction of a strain having an inactivated hxlA gene In order to inactivate the hxlA gene on the chromosome of the Bacillus subtilisinosine-producing KMBS375 (construction of the KMBS375 strain is described in Reference Examples) The upstream and downstream regions of the hxlA gene were cloned into two multicloning sites of the pKS1 plasmid (Shatalin KY and Neyfakh AA, FEMS Microbiology Letters, 245: 315-9 (2005)) (FIG. 1). Chromosome of Bacillus subtilis KMBS375 using primers P1 (SEQ ID NO: 5) and P2 (SEQ ID NO: 6)
The 886 bp fragment in the upstream region of the hxlA gene was amplified by PCR using DNA as a template. Primers P1 and P2 contain recognition sites for endonucleases SacII and PstI, respectively. A 923 bp fragment in the downstream region of the hxlA gene was amplified by PCR using primers P3 (SEQ ID NO: 7) and P4 (SEQ ID NO: 8) and using the chromosomal DNA of Bacillus subtilis KMBS375 as a template. Primers P3 and P4 contain recognition sites for endonucleases ClaI and KpnI, respectively. PCR products using P1 and P2 were purified, digested with endonucleases SacII and PstI and then cloned into the corresponding sites of the pKS1 plasmid. The PCR product using P3 and P4 was purified, digested with endonucleases ClaI and KpnI, and similarly cloned into the corresponding sites of the pKS1 plasmid. After cloning both fragments, the plasmid containing the Km R cassette and the upstream and downstream regions of the hxlA gene was digested with endonucleases SacII and KpnI, and the resulting fragment (3194 bp) was non-replicated pBluescript derived from Bacillus. II Subcloned into KS vector (Stratagene). The resulting plasmid was used to transform Bacillus subtilis KMBS375 and 12 Km R transformants were isolated. By the incorporation of miles R cassette to ensure that the hxlA gene is inactivated, was control PCR experiments using primers P1 and P4. The size of the DNA fragment obtained by PCR using primers p1 and P4 and the wild type allele of the hxlA gene is 2476 bp. In contrast, the presence of DNA fragments of 3194 bp, integration of Km R cassette into hxlA gene is confirmed. Primer P5 (SEQ ID NO: 9: primer P5 contains 20 bases complementary to the region located upstream of the region complementary to the P1 primer and located 1013 bp from the translation start position of the hxlA gene) and In an additional control PCR experiment using primer P6 (SEQ ID NO: 10: primer P6 contains 21 bases complementary to the region located within the Km R cassette), due to the presence of the 1491 bp PCR-generated fragment, integration of the Km R cassette into hxlA gene on chromosome KMBS375 is confirmed. One of the KMBS375 transformants containing the integrated Km R cassette was used for the next process. This strain was named KMBS375Δhxl :: Km.
実施例２：バチルス・ズブチリス株KMBS375Δhxl::Kmによるイノシンの生産
イノシン生産に対するhxlAの不活性化の効果を試験するために、バチルス・ズブチリスKMBS375株及びKMBS375Δhxl::Km株をそれぞれL-ブロス中で34℃で18時間培養した後、0.3
mlの培養物を20×200 mm試験管中の３mlの発酵培地に接種し、34℃で72時間ロータリーシェーカー上で培養した。結果を表１に示す。
Example 2: Production of inosine by Bacillus subtilis strain KMBS375Δhxl :: Km To test the effect of inactivation of hxlA on inosine production, Bacillus subtilis KMBS375 and KMBS375Δhxl :: Km strains were each in L-broth. After 18 hours of incubation at 34 ° C, 0.3
ml cultures were inoculated into 3 ml fermentation medium in 20 × 200 mm tubes and cultured on a rotary shaker at 34 ° C. for 72 hours. The results are shown in Table 1.
発酵培地の組成（g/l）：
グルコース 30.0
NH4Cl 32.0
KH2PO4 1.0
MgSO4・7H2O 0.4
FeSO4・7H2O 0.01
MnSO4・5H2O 0.01
マメノ-TN (Mameno-TN) （大豆加水分解物） 1.35（全窒素として）
DL-メチオニン 0.3
アデニン 0.1
グアニン 0.05
消泡剤（アデカノール） 0.5 ml
CaCO3 50.0
pH 6.0 （KOHによる）
Composition of fermentation medium (g / l):
Glucose 30.0
NH 4 Cl 32.0
KH 2 PO 4 1.0
MgSO 4・ 7H 2 O 0.4
FeSO 4・ 7H 2 O 0.01
MnSO 4・ 5H 2 O 0.01
Mameno-TN (Soy hydrolyzate) 1.35 (as total nitrogen)
DL-methionine 0.3
Adenine 0.1
Guanine 0.05
Antifoam (Adecanol) 0.5 ml
CaCO 3 50.0
pH 6.0 (by KOH)
培養後、培地中に蓄積されたイノシンの量をHPLCによって決定した。 After incubation, the amount of inosine accumulated in the medium was determined by HPLC.
HPLC分析の条件カラム：
Luna C18(2) 250×３mm、5u（Phenomenex、米国）。
緩衝液：２％v/v C2H5OH；0.8％v/vトリエチルアミン；0.5％v/v酢酸（氷酢酸）；pH 4.5。温度：30℃。
流速：0.3 ml/分。
注入容積：５μl。
検出：UV 250 nm。
保持時間（分）：
キサントシン 13.7
イノシン 9.6
ヒポキサンチン 5.2
グアノシン 11.4
アデノシン 28.2
Condition column for HPLC analysis:
Luna C18 (2) 250x3mm, 5u (Phenomenex, USA).
Buffer: 2% v / v C 2 H 5 OH; 0.8% v / v triethylamine; 0.5% v / v acetic acid (glacial acetic acid); pH 4.5. Temperature: 30 ° C.
Flow rate: 0.3 ml / min.
Injection volume: 5 μl.
Detection: UV 250 nm.
Retention time (minutes):
Xanthosine 13.7
Inosine 9.6
Hypoxanthine 5.2
Guanosine 11.4
Adenosine 28.2
表１の通り、KMBS375Δhxl::Kmは、KMBS375と比較して、より高い量のイノシン（HxR）を生産した。 As shown in Table 1, KMBS375Δhxl :: Km produced higher amounts of inosine (HxR) compared to KMBS375.
参考例：KMBS375の構築
＜バチルス・ズブチリス 168 Marburgの原栄養株の構築＞
バチルス・ズブチリス 168 Marburg（ATCC6051）は、染色体上の変異対立遺伝子trpC2（trpC；インドール-3-グリセリンリン酸合成酵素（indole-3-glycerol phosphate synthase）遺伝子）によりTrp栄養要求株である（Albertini A. M.とA. Galizzi, 1999）。バチルス・ズブチリス 168 Marburg株は、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（American Type Culture Collection (ATCC)（住所P. O. Box 1549 Manassas, VA 20108、米国））から取得することができる。（バチルス・ズブチリス 168 (trpC2)のtrpオペロンの配列の再掲載。Microbiology, 145: 3319-3320）。trpC2開始コドンから位置328以降の３つのヌクレオチド「att」を有するtrpC2対立遺伝子を、以下のようにしてPCR増幅しバチルス・ズブチリス 168 Marburgに導入した。
Reference example: Construction of KMBS375 <Construction of prototrophic strain of Bacillus subtilis 168 Marburg>
Bacillus subtilis 168 Marburg (ATCC6051) is a Trp auxotrophic strain by a mutant allele on the chromosome trpC2 (trpC; indole-3-glycerol phosphate synthase gene) (Albertini AM And A. Galizzi, 1999). The Bacillus subtilis 168 Marburg strain can be obtained from the American Type Culture Collection (ATCC) (address PO Box 1549 Manassas, VA 20108, USA). (Reprinted sequence of the trp operon of Bacillus subtilis 168 (trpC2). Microbiology, 145: 3319-3320). The trpC2 allele having three nucleotides “att” from position 328 onwards from the trpC2 start codon was PCR amplified and introduced into Bacillus subtilis 168 Marburg as follows.
（１）組換えPCRによるtrpC+対立遺伝子の増幅
trpC+対立遺伝子の5'末端及びその上流領域を増幅するに際し、GenBank（Accession No. NC_000964）及びAlbertiniとGalizzi（Microbiology, 145: 3319-3320）からの情報に基いて、PCRプライマー７（配列番号１１）及び８（配列番号１２）を設計した。
(1) Amplification of trpC + allele by recombinant PCR
In amplifying the 5 ′ end of the trpC + allele and its upstream region, PCR primer 7 (SEQ ID NO: 7) was used based on information from GenBank (Accession No. NC_000964) and Albertini and Galizzi (Microbiology, 145: 3319-3320). 11) and 8 (SEQ ID NO: 12) were designed.
前記したプライマー及びバチルス・ズブチリス 168 Marburgの染色体DNAの鋳型を使用し、PCR（94℃で30秒、53℃で１分、72℃で１分、30サイクル、Gene Amp PCR System Model 9600 (Perkins Elmer)）を行い、trpC+対立遺伝子の5'末端領域及び上流領域を含む断片を増幅した。 PCR (94 ° C. for 30 seconds, 53 ° C. for 1 minute, 72 ° C. for 1 minute, 30 cycles, Gene Amp PCR System Model 9600 (Perkins Elmer) using the primers described above and the chromosomal DNA template of Bacillus subtilis 168 Marburg. )) To amplify a fragment containing the 5 ′ end region and upstream region of the trpC + allele.
trpC+対立遺伝子の3'末端及びその下流領域を増幅するに際し、GenBank（Accession No. NC_000964）及びAlbertiniとGalizzi（Microbiology, 145: 3319-3320）からの情報に基いて、PCRプライマー９（配列番号１３）及び１０（配列番号１４）を設計した。 In amplifying the 3 ′ end of the trpC + allele and its downstream region, PCR primer 9 (SEQ ID NO: 9) was used based on information from GenBank (Accession No. NC_000964) and Albertini and Galizzi (Microbiology, 145: 3319-3320). 13) and 10 (SEQ ID NO: 14) were designed.
前記したプライマー及びバチルス・ズブチリス 168 Marburgの染色体DNAの鋳型を使用し、PCR（94℃で30秒、53℃で１分、72℃で１分、30サイクル、Gene Amp PCR System Model 9600 (Perkins Elmer)）を行い、trpC+対立遺伝子の3'末端領域及び下流領域を含む断片を増幅した。 PCR (94 ° C. for 30 seconds, 53 ° C. for 1 minute, 72 ° C. for 1 minute, 30 cycles, Gene Amp PCR System Model 9600 (Perkins Elmer) using the primers described above and the chromosomal DNA template of Bacillus subtilis 168 Marburg. )) To amplify the fragment containing the trpC + allele 3 ′ end region and downstream region.
組換えPCRにより全trpC+対立遺伝子を増幅するに際し、MicroSpin Column S-400（Amersham Pharmacia Biotech）を使用し、前記したように増幅した２つのDNA断片を精製した。鋳型として適切な量の２つの断片の混合物並びにプライマー７（配列番号１１）及び１０（配列番号１４）を使用してPCRを行った（94℃で30秒、55℃で１分、72℃で２分、30サイクル、Gene Amp PCR System Model 9600 (Perkins Elmer)）。trpC+対立遺伝子の増幅断片（約1.2 kb）を得た。 In amplifying all trpC + alleles by recombinant PCR, MicroSpin Column S-400 (Amersham Pharmacia Biotech) was used to purify the two amplified DNA fragments as described above. PCR was performed using a mixture of the appropriate amount of the two fragments as a template and primers 7 (SEQ ID NO: 11) and 10 (SEQ ID NO: 14) (94 ° C for 30 seconds, 55 ° C for 1 minute, 72 ° C). 2 minutes, 30 cycles, Gene Amp PCR System Model 9600 (Perkins Elmer)). An amplified fragment (approximately 1.2 kb) of trpC + allele was obtained.
（２）バチルス・ズブチリス 168 Marburg株からのTrp原栄養株の構築
アガロースゲル電気泳動の後に、trpC+対立遺伝子の断片をゲルから抽出した。DubnauとDavidoff-Abelson（Dubnau, D. and R. Davidoff-Abelson, J. Mol. Biol., 56: 209-221 (1971)）によって記載されたようにして調製したバチルス・ズブチリス 168 Marburgのコンピテント細胞をDNA断片で形質転換し、最小培地寒天平板上で生育することのできるコロニーを選択した。染色体DNAをコロニーから調製した。鋳型としての染色体DNA並びに７（配列番号１１）及び１０（配列番号１４）のプライマーを使用するPCRによってDNA断片を増幅した後に配列決定し、他のPCR誘導変異が不在であるtrpC2対立遺伝子への３つのヌクレオチドの挿入を確認した。このようにして得られた形質転換体はTrp栄養要求株ではなく、この株をKMBS275と命名した。
(2) Construction of Trp prototrophic strain from Bacillus subtilis 168 Marburg strain After agarose gel electrophoresis, the trpC + allele fragment was extracted from the gel. Bacillus subtilis 168 Marburg competent prepared as described by Dubnau and Davidoff-Abelson (Dubnau, D. and R. Davidoff-Abelson, J. Mol. Biol., 56: 209-221 (1971)) Cells were transformed with DNA fragments and colonies capable of growing on minimal medium agar plates were selected. Chromosomal DNA was prepared from the colonies. A DNA fragment was amplified by PCR using chromosomal DNA as a template and primers 7 (SEQ ID NO: 11) and 10 (SEQ ID NO: 14) and then sequenced to a trpC2 allele that was absent of other PCR-induced mutations. Three nucleotide insertions were confirmed. The transformant thus obtained was not a Trp auxotrophic strain, and this strain was named KMBS275.
＜バチルス・ズブチリス 168 MarburgのHis栄養要求株の構築＞
ヒスチジノールリン酸アミノトランスフェラーゼをコードするhisC遺伝子においてフレーム内欠失（in-frame deletion）を作成し（ΔhisC：403番目〜606番目の204ヌクレオチドの欠失）、以下のようにしてバチルス・ズブチリス 168 Marburg株（trpC2）に導入した。
<Construction of His auxotrophic strain of Bacillus subtilis 168 Marburg>
An in-frame deletion was made in the hisC gene encoding histidinol phosphate aminotransferase (ΔhisC: deletion of 204 nucleotides from 403 to 606), and Bacillus subtilis was performed as follows. It was introduced into the 168 Marburg strain (trpC2).
（１）組換えPCRによるΔhisCの増幅
ΔhisCの5'末端及びその上流領域を増幅するに際し、GenBank（Accession No. NC_000964）からの情報に基いてPCRプライマー１１（配列番号１５）及び１２（配列番号１６）を設計した。プライマー３８は、その5'末端にEcoRI部位を含む。プライマー３８は、フレーム内欠失によって生成した接合部（junction）を含む。
(1) Amplification of ΔhisC by recombinant PCR When amplifying the 5 ′ end of ΔhisC and its upstream region, PCR primers 11 (SEQ ID NO: 15) and 12 (SEQ ID NO: 15) were used based on information from GenBank (Accession No. NC_000964). 16) was designed. Primer 38 includes an EcoRI site at its 5 ′ end. Primer 38 includes a junction created by an in-frame deletion.
前記したプライマー及びバチルス・ズブチリス 168 Marburgの染色体DNAの鋳型を使用し、PCR（94℃で30秒、55℃で１分、72℃で１分、30サイクル、Gene Amp PCR System Model 9600 (Perkins Elmer)）を行い、ΔhisCの5'末端領域及び上流領域を含む断片を増幅した。 PCR (94 ° C. for 30 seconds, 55 ° C. for 1 minute, 72 ° C. for 1 minute, 30 cycles, Gene Amp PCR System Model 9600 (Perkins Elmer) using the primer and Bacillus subtilis 168 Marburg chromosomal DNA template described above. )), And a fragment containing the 5 'terminal region and upstream region of ΔhisC was amplified.
ΔhisCの3'末端及びその下流領域を増幅するに際し、GenBank（Accession No. NC_000964）からの情報に基いてPCRプライマー１３（配列番号１７）及び１４（配列番号１８）を設計した。プライマー４０は、フレーム内欠失によって生成した接合部を含む。プライマー４１は、その5'末端にBamHI部位を含む。 When amplifying the 3 ′ end of ΔhisC and its downstream region, PCR primers 13 (SEQ ID NO: 17) and 14 (SEQ ID NO: 18) were designed based on information from GenBank (Accession No. NC — 000964). Primer 40 includes a junction generated by an in-frame deletion. Primer 41 contains a BamHI site at its 5 ′ end.
前記したプライマー及びバチルス・ズブチリス 168 Marburgの染色体DNAの鋳型を使用し、PCR（94℃で30秒、55℃で１分、72℃で１分、30サイクル、Gene Amp PCR System Model 9600 (Perkins Elmer)）を行い、ΔhisCの3'末端領域及び下流領域を含む断片を増幅した。 PCR (94 ° C. for 30 seconds, 55 ° C. for 1 minute, 72 ° C. for 1 minute, 30 cycles, Gene Amp PCR System Model 9600 (Perkins Elmer) using the primer and Bacillus subtilis 168 Marburg chromosomal DNA template described above. )) To amplify a fragment containing the 3 ′ end region of ΔhisC and the downstream region.
組換えPCRにより全ΔhisCを増幅するに際し、MicroSpin Column S-400（Amersham Pharmacia Biotech）を使用し、前記したように増幅した２つのDNA断片を精製した。鋳型として適切な量の２つの断片の混合物並びにプライマー１１（配列番号１５）及び１４（配列番号１８）を使用してPCRを行った（94℃で30秒、55℃で１分、72℃で２分、30サイクル、Gene Amp PCR System Model 9600 (Perkins Elmer)）。ΔhisCの増幅断片（約1.5 kb）を得た。 When amplifying total ΔhisC by recombinant PCR, MicroSpin Column S-400 (Amersham Pharmacia Biotech) was used to purify the two amplified DNA fragments as described above. PCR was performed using a mixture of two fragments in appropriate amounts as a template and primers 11 (SEQ ID NO: 15) and 14 (SEQ ID NO: 18) (94 ° C for 30 seconds, 55 ° C for 1 minute, 72 ° C). 2 minutes, 30 cycles, Gene Amp PCR System Model 9600 (Perkins Elmer)). An amplified fragment (approximately 1.5 kb) of ΔhisC was obtained.
（２）ΔhisC遺伝子のクローン化
増幅した断片をEcoRI及びBamHIにより消化し（37℃、一夜）、アガロースゲルを使用して分離した。目的断片をゲルから抽出し、同一酵素で予め消化した（37℃、３時間）バチルス・ズブチリス染色体組込みベクターpJPM1（Mueller, J. P.、G. Bukusoglu and A. L. Sonenshein. 1992. Transcriptional regulation of Bacillus subtilis glucose starvation-inducible genes: control of gsiA by the ComP-ComA signal transduction system. J. Bacteriol. 174:4361-4373.）と連結した。正しく挿入されたΔhisC遺伝子を含むプラスミドを選択し、DNA配列決定によって他のPCR誘導性変異を有さないことを確認し、pKM186と命名した。
(2) Cloning of ΔhisC gene The amplified fragment was digested with EcoRI and BamHI (37 ° C, overnight) and separated using an agarose gel. Bacillus subtilis chromosomal integration vector pJPM1 (Mueller, JP, G. Bukusoglu and AL Sonenshein. 1992. Transcriptional regulation of Bacillus subtilis glucose starvation- inducible genes: control of gsiA by the ComP-ComA signal transduction system. J. Bacteriol. 174: 4361-4373.). A plasmid containing the correctly inserted ΔhisC gene was selected and confirmed by DNA sequencing to have no other PCR-induced mutations and was named pKM186.
（３）バチルス・ズブチリス 168 Marburg株からのHis栄養要求株の構築
前記したように調製したバチルス・ズブチリス 168 Marburg株のコンピテント細胞をpKM186により形質転換し、2.5μg/mLのクロラムフェニコール（Cm）を含有するLB寒天平板上で生育することのできるコロニー（シングルクロスオーバー組換え体）を選択した。
(3) Construction of His auxotrophic strain from Bacillus subtilis 168 Marburg strain Competent cells of Bacillus subtilis 168 Marburg strain prepared as described above were transformed with pKM186, and 2.5 μg / mL chloramphenicol ( Colonies capable of growing on LB agar plates containing Cm) (single crossover recombinants) were selected.
20mg/Lのグアニンを補填した10mLのLB培地（LB+Gua培地）にシングルクロスオーバー組換え体の１つを接種し、37℃で２日間、継続的に継代培養した。Cmを含む又は含まないLB+Gua寒天培地を使用し、クロラムフェニコール感受性を示すコロニーを選択した。Cm感受性コロニーから染色体DNAを調製した。１１（配列番号１５）及び１４（配列番号１８）を使用し、前記と同様の様式でPCRを行った。ダブルクロスオーバー組換えによって染色体上のhisC遺伝子が破壊型の（disrupted-type）hisC遺伝子（ΔhisC）で置換された株を同定した。二重組換え株（double-recombinant strain）はKMBS276（ΔhisCtrpC2）と命名した。 One of the single crossover recombinants was inoculated into 10 mL of LB medium (LB + Gua medium) supplemented with 20 mg / L guanine and continuously subcultured at 37 ° C. for 2 days. LB + Gua agar medium with or without Cm was used to select colonies showing chloramphenicol sensitivity. Chromosomal DNA was prepared from Cm sensitive colonies. PCR was performed in the same manner as described above using 11 (SEQ ID NO: 15) and 14 (SEQ ID NO: 18). A strain was identified in which the hisC gene on the chromosome was replaced with a disrupted-type hisC gene (ΔhisC) by double crossover recombination. The double-recombinant strain was named KMBS276 (ΔhisCtrpC2).
＜バチルス・ズブチリス KMBS375の構築＞
１．KMBS350(ΔpurAΔpurRΔpupG)の構築
破壊型のpupG、purR、及びpurA遺伝子（それぞれグアノシン／イノシンホスホリラーゼ、プリンオペロンリプレッサー、スクシニルAMP合成酵素）をバチルス・ズブチリス 168 Marburgから誘導した組換えKMBS276株（ΔhisCtrpC2）に順次導入し、この株から以下のようにして原栄養株を得た。
<Construction of Bacillus subtilis KMBS375>
1. Construction of KMBS350 (ΔpurAΔpurRΔpupG) Destructive pupG, purR, and purA genes (guanosine / inosine phosphorylase, purine operon repressor, and succinyl AMP synthase, respectively) were recombinant KMBS276 strain (ΔhisCtrpC2) derived from Bacillus subtilis 168 Marburg Introduced sequentially, a prototrophic strain was obtained from this strain as follows.
（１）ΔpupG（334番目〜537番目の204のヌクレオチドのフレーム内欠失）のKMBS276への導入 (1) Introduction of ΔpupG (deletion of 204 nucleotides from 334th to 537th in frame) into KMBS276
（ｉ）組換えPCRによるΔpupGの増幅
ΔpupGの5'末端及びその上流領域を増幅するに際し、GenBank（Accession No. NC_000964）からの情報に基いてPCRプライマー１５（配列番号１９）及び１６（配列番号２０）を設計した。プライマー４２は、その5'末端にBamHI部位を含む。プライマー４３は、フレーム内欠失によって生成した接合部を含む。
(I) Amplification of ΔpupG by recombinant PCR When amplifying the 5 ′ end of ΔpupG and its upstream region, PCR primers 15 (SEQ ID NO: 19) and 16 (SEQ ID NO: 19) were used based on information from GenBank (Accession No. NC_000964). 20) was designed. Primer 42 contains a BamHI site at its 5 ′ end. Primer 43 includes a junction generated by in-frame deletion.
前記したプライマー及びバチルス・ズブチリス 168 Marburgの染色体DNAの鋳型を使用し、PCR（94℃で30秒、55℃で１分、72℃で1.5分、30サイクル、Gene Amp PCR System Mo
del 9600 (Perkins Elmer)）を行い、ΔpupGの5'末端領域及び上流領域を含む断片を増幅した。
PCR (94 ° C for 30 seconds, 55 ° C for 1 minute, 72 ° C for 1.5 minutes, 30 cycles, Gene Amp PCR System Mo using the primer and Bacillus subtilis 168 Marburg chromosomal DNA template described above.
del 9600 (Perkins Elmer)), and a fragment containing the 5 ′ terminal region and upstream region of ΔpupG was amplified.
ΔpupGの3'末端及びその下流領域を増幅するに際し、GenBank（Accession No. NC_000964）からの情報に基いてPCRプライマー１７（配列番号２１）及び１８（配列番号２２）を設計した。プライマー４４は、フレーム内欠失によって生成した接合部を含む。プライマー４５は、その5'末端にBamHI部位を含む。 When amplifying the 3 ′ end of ΔpupG and its downstream region, PCR primers 17 (SEQ ID NO: 21) and 18 (SEQ ID NO: 22) were designed based on information from GenBank (Accession No. NC — 000964). Primer 44 includes a junction created by an in-frame deletion. Primer 45 contains a BamHI site at its 5 ′ end.
前記したプライマー及びバチルス・ズブチリス 168 Marburgの染色体DNAの鋳型を使用し、PCR（94℃で30秒、50℃で１分、72℃で1.5分、30サイクル、Gene Amp PCR System Model 9600 (Perkins Elmer)）を行い、ΔpupGの3'末端領域及び下流領域を含む断片を増幅した。 PCR (94 ° C. for 30 seconds, 50 ° C. for 1 minute, 72 ° C. for 1.5 minutes, 30 cycles, Gene Amp PCR System Model 9600 (Perkins Elmer) using the primer and Bacillus subtilis 168 Marburg chromosomal DNA template described above. )) To amplify a fragment containing the 3 ′ terminal region and the downstream region of ΔpupG.
組換えPCRにより全ΔpupGを増幅するに際し、MicroSpin Column S-400（Amersham Pharmacia Biotech）を使用し、前記したように増幅した２つのDNA断片を精製した。鋳型として適切な量の２つの断片の混合物並びにプライマー１５（配列番号１９）及び１８（配列番号２２）を使用してPCRを行った（94℃で30秒、55℃で１分、72℃で３分、30サイクル、Gene Amp PCR System Model 9600 (Perkins Elmer)）。ΔpupGの増幅断片（約２kb）を得た。 When amplifying total ΔpupG by recombinant PCR, MicroSpin Column S-400 (Amersham Pharmacia Biotech) was used to purify the two DNA fragments amplified as described above. PCR was performed using a mixture of the two fragments in an appropriate amount as template and primers 15 (SEQ ID NO: 19) and 18 (SEQ ID NO: 22) (94 ° C. for 30 seconds, 55 ° C. for 1 minute, 72 ° C. 3 minutes, 30 cycles, Gene Amp PCR System Model 9600 (Perkins Elmer)). An amplified fragment (about 2 kb) of ΔpupG was obtained.
（ｉｉ）ΔpupG遺伝子のクローン化
増幅した断片をBamHIにより消化し（37℃、一夜）、アガロースゲルを使用して分離した。目的断片をゲルから抽出し、同一酵素で予め消化した（37℃、３時間）バチルス・ズブチリス染色体組込みベクターpJPM1（J. Bacteriol. 174: 4361-4373）と連結した後、子ウシ腸ホスファターゼを用いた処理を行った。正しく挿入されたΔpupG遺伝子を含むプラスミドを選択し、DNA配列決定によって他のPCR誘導性変異を有さないことを確認し、pKM199と命名した。
(Ii) Cloning of ΔpupG gene The amplified fragment was digested with BamHI (37 ° C, overnight) and separated using an agarose gel. The target fragment was extracted from the gel and ligated with Bacillus subtilis chromosome integration vector pJPM1 (J. Bacteriol. 174: 4361-4373) previously digested with the same enzyme (37 ° C, 3 hours), and calf intestinal phosphatase was used. The process was performed. A plasmid containing the correctly inserted ΔpupG gene was selected, confirmed to have no other PCR-induced mutations by DNA sequencing, and named pKM199.
（ｉｉｉ）ΔpupGのKMBS276への導入
前記したようにして調製したKMBS276株のコンピテント細胞をpKM199により形質転換し、2.5μg/mLのCmを含有するLB寒天平板上で生育することのできるコロニー（シングルクロスオーバー組換え体）を選択した。
(Iii) Introduction of ΔpupG into KMBS276 Colonies capable of growing on LB agar plates containing KMBS276 strain competent cells prepared as described above with pKM199 and containing 2.5 μg / mL Cm ( Single crossover recombinant) was selected.
10mLのLB+Gua培地にシングルクロスオーバー組換え体の１つを接種し、37℃で２日間、継続的に継代培養した。Cmを含む又は含まないLB+Gua寒天培地を使用し、クロラムフェニコール感受性を示すコロニーを選択した。Cm感受性コロニーから染色体DNAを調製した。プライマー１５（配列番号１９）及び１８（配列番号２２）を使用し、前記と同様の様式でPCRを行った。ダブルクロスオーバー組換えによって染色体上のpupG遺伝子が破壊型のpupG遺伝子（ΔpupG）と入れ替えられた株を同定した。二重組換え株はKMBS334（ΔpupGΔhisCtrpC2）と命名した。 10 mL of LB + Gua medium was inoculated with one of the single crossover recombinants and continuously subcultured at 37 ° C. for 2 days. LB + Gua agar medium with or without Cm was used to select colonies showing chloramphenicol sensitivity. Chromosomal DNA was prepared from Cm sensitive colonies. PCR was performed in the same manner as described above using primers 15 (SEQ ID NO: 19) and 18 (SEQ ID NO: 22). A strain in which the pupG gene on the chromosome was replaced with a disrupted pupG gene (ΔpupG) by double crossover recombination was identified. The double recombinant strain was named KMBS334 (ΔpupGΔhisCtrpC2).
（２）ΔpurR（31番目〜825番目の795のヌクレオチドのフレーム内欠失）のKMBS334への導入 (2) Introduction of ΔpurR (31st to 825th 795 nucleotide deletion in frame) into KMBS334
（ｉ）組換えPCRによるΔpurRの増幅
ΔpurRの5'末端及びその上流領域を増幅するに際し、GenBank（Accession No. NC_000964）からの情報に基いてPCRプライマー１９（配列番号２３）及び２０（配列番号２４）を設計した。プライマー４６は、その5'末端にBamHI部位を含む。プライマー４７は、フレーム内欠失によって生成した接合部を含む。
(I) Amplification of ΔpurR by recombinant PCR When amplifying the 5 ′ end of ΔpurR and its upstream region, PCR primers 19 (SEQ ID NO: 23) and 20 (SEQ ID NO: 23) based on information from GenBank (Accession No. NC_000964) 24) was designed. Primer 46 contains a BamHI site at its 5 ′ end. Primer 47 includes a junction generated by an in-frame deletion.
前記したプライマー及びバチルス・ズブチリス 168 Marburgの染色体DNAの鋳型を使用し、PCR（94℃で30秒、55℃で１分、72℃で1.5分、30サイクル、Gene Amp PCR System Model 9600 (Perkins Elmer)）を行い、ΔpurRの5'末端領域及び上流領域を含む断片を増幅した。 PCR (94 ° C. for 30 seconds, 55 ° C. for 1 minute, 72 ° C. for 1.5 minutes, 30 cycles, Gene Amp PCR System Model 9600 (Perkins Elmer) using the primers described above and the chromosomal DNA template of Bacillus subtilis 168 Marburg. )) To amplify a fragment containing the 5 'terminal region and upstream region of ΔpurR.
ΔpurRの3'末端及びその下流領域を増幅するに際し、GenBank（Accession No. NC_000964）からの情報に基いてPCRプライマー２１（配列番号２５）及び２２（配列番号２６）を設計した。プライマー４８は、フレーム内欠失によって生成した接合部を含む。プライマー４９は、その5'末端にBamHI部位を含む。 When amplifying the 3 ′ end of ΔpurR and its downstream region, PCR primers 21 (SEQ ID NO: 25) and 22 (SEQ ID NO: 26) were designed based on information from GenBank (Accession No. NC — 000964). Primer 48 includes a junction created by an in-frame deletion. Primer 49 contains a BamHI site at its 5 ′ end.
前記したプライマー及びバチルス・ズブチリス 168 Marburgの染色体DNAの鋳型を使用し、PCR（94℃で30秒、50℃で１分、72℃で1.5分、30サイクル、Gene Amp PCR System Model 9600 (Perkins Elmer)）を行い、ΔpurRの3'末端領域及び下流領域を含む断片を増幅した。 PCR (94 ° C. for 30 seconds, 50 ° C. for 1 minute, 72 ° C. for 1.5 minutes, 30 cycles, Gene Amp PCR System Model 9600 (Perkins Elmer) using the primer and Bacillus subtilis 168 Marburg chromosomal DNA template described above. )) To amplify a fragment containing the 3 ′ terminal region and downstream region of ΔpurR.
組換えPCRにより全ΔpurRを増幅するに際し、MicroSpin Column S-400（Amersham Pharmacia Biotech）を使用し、前記したように増幅した２つのDNA断片を精製した。鋳型として適切な量の２つの断片の混合物並びにプライマー１９（配列番号２３）及び２２（配列番号２６）を使用してPCRを行った（94℃で30秒、55℃で１分、72℃で2.5分、30サイクル、Gene Amp PCR System Model 9600 (Perkins Elmer)）。ΔpurRの増幅断片（約2.1 kb）を得た。 When amplifying total ΔpurR by recombinant PCR, MicroSpin Column S-400 (Amersham Pharmacia Biotech) was used to purify the two DNA fragments amplified as described above. PCR was performed using a mixture of the appropriate amount of the two fragments as a template and primers 19 (SEQ ID NO: 23) and 22 (SEQ ID NO: 26) (94 ° C. for 30 seconds, 55 ° C. for 1 minute, 72 ° C. 2.5 minutes, 30 cycles, Gene Amp PCR System Model 9600 (Perkins Elmer)). An amplified fragment (approximately 2.1 kb) of ΔpurR was obtained.
（ｉｉ）ΔpurR遺伝子のクローン化
増幅した断片をBamHIにより消化し（37℃、一夜）、アガロースゲルを使用して分離した。目的断片をゲルから抽出し、同一酵素で予め消化した（37℃、３時間）バチルス・ズブチリス染色体組込みベクターpJPM1（J. Bacteriol. 174: 4361-4373）と連結した後、子ウシ腸ホスファターゼを用いた処理を行った。正しく挿入されたΔpurR遺伝子を含むプラスミドを選択し、DNA配列決定によって他のPCR誘導性変異を有さないことを確認し、pKM200と命名した。
(Ii) Cloning of ΔpurR gene The amplified fragment was digested with BamHI (37 ° C, overnight) and separated using an agarose gel. The target fragment was extracted from the gel and ligated with Bacillus subtilis chromosome integration vector pJPM1 (J. Bacteriol. 174: 4361-4373) previously digested with the same enzyme (37 ° C, 3 hours), and calf intestinal phosphatase was used. The process was performed. A plasmid containing the correctly inserted ΔpurR gene was selected, confirmed by DNA sequencing to have no other PCR-induced mutations, and named pKM200.
（ｉｉｉ）ΔpurRのKMBS334への導入
前記したように調製したKMBS334株のコンピテント細胞をpKM200により形質転換し、2.5μg/mLのCmを含有するLB寒天平板上で生育することのできるコロニー（シングルクロスオーバー組換え体）を選択した。
(Iii) Introduction of ΔpurR into KMBS334 Colonies capable of growing on KMBS334 competent cells prepared as described above using pKM200 and growing on LB agar plates containing 2.5 μg / mL Cm (single Crossover recombinant) was selected.
10mLのLB+Gua培地にシングルクロスオーバー組換え体の１つを接種し、37℃で２日間、継続的に継代培養した。Cmを含む又は含まないLB+Gua寒天培地を使用し、クロラムフェニコール感受性を示すコロニーを選択した。Cm感受性コロニーから染色体DNAを調製した。プライマー１９（配列番号２３）及び２２（配列番号２６）を使用し、前記と同様の様式でPCRを行った。ダブルクロスオーバー組換えによって染色体上のpurR遺伝子が破壊型のpurR遺伝子（ΔpurR）で置換された株を同定した。二重組換え株はKMBS337（ΔpurRΔpupGΔhisCtrpC2）と命名した。 10 mL of LB + Gua medium was inoculated with one of the single crossover recombinants and continuously subcultured at 37 ° C. for 2 days. LB + Gua agar medium with or without Cm was used to select colonies showing chloramphenicol sensitivity. Chromosomal DNA was prepared from Cm sensitive colonies. PCR was performed in the same manner as described above using primers 19 (SEQ ID NO: 23) and 22 (SEQ ID NO: 26). A strain was identified in which the purR gene on the chromosome was replaced by a disrupted purR gene (ΔpurR) by double crossover recombination. The double recombinant strain was named KMBS337 (ΔpurRΔpupGΔhisCtrpC2).
（３）ΔpurA（307番目〜675番目の369のヌクレオチドのフレーム内欠失）のKMBS337への導入 (3) Introduction of ΔpurA (deletion of 369 nucleotides from 307th to 675th in frame) into KMBS337
（ｉ）組換えPCRによるΔpurAの増幅
ΔpurAの5'末端及びその上流領域を増幅するに際し、GenBank（Accession No. NC_000964）からの情報に基いてPCRプライマー２３（配列番号２７）及び２４（配列番号２８）を設計した。プライマー５０は、その5'末端にBamHI部位を含む。プライマー５１は、フ
レーム内欠失によって生成した接合部を含む。
(I) Amplification of ΔpurA by recombinant PCR When amplifying the 5 ′ end of ΔpurA and its upstream region, PCR primers 23 (SEQ ID NO: 27) and 24 (SEQ ID NO: 27) were used based on information from GenBank (Accession No. NC_000964). 28) was designed. Primer 50 contains a BamHI site at its 5 ′ end. Primer 51 includes a junction generated by in-frame deletion.
前記したプライマー及びバチルス・ズブチリス 168 Marburgの染色体DNAの鋳型を使用し、PCR（94℃で30秒、55℃で１分、72℃で１分、30サイクル、Gene Amp PCR System Model 9600 (Perkins Elmer)）を行い、ΔpurAの5'末端領域及び上流領域を含む断片を増幅した。 PCR (94 ° C. for 30 seconds, 55 ° C. for 1 minute, 72 ° C. for 1 minute, 30 cycles, Gene Amp PCR System Model 9600 (Perkins Elmer) using the primer and Bacillus subtilis 168 Marburg chromosomal DNA template described above. )) To amplify a fragment containing the 5 ′ terminal region and upstream region of ΔpurA.
ΔpurAの3'末端及びその下流領域を増幅するに際し、GenBank（Accession No. NC_000964）からの情報に基いてPCRプライマー２５（配列番号２９）及び２６（配列番号３０）を設計した。プライマー５２は、フレーム内欠失によって生成した接合部を含む。プライマー５３は、その5'末端にBamHI部位を含む。 When amplifying the 3 ′ end of ΔpurA and its downstream region, PCR primers 25 (SEQ ID NO: 29) and 26 (SEQ ID NO: 30) were designed based on information from GenBank (Accession No. NC — 000964). Primer 52 includes a junction generated by an in-frame deletion. Primer 53 contains a BamHI site at its 5 ′ end.
前記したプライマー及びバチルス・ズブチリス 168 Marburgの染色体DNAの鋳型を使用し、PCR（94℃で30秒、55℃で１分、72℃で１分、30サイクル、Gene Amp PCR System Model 9600 (Perkins Elmer)）を行い、ΔpurAの3'末端領域及び下流領域を含む断片を増幅した。 PCR (94 ° C. for 30 seconds, 55 ° C. for 1 minute, 72 ° C. for 1 minute, 30 cycles, Gene Amp PCR System Model 9600 (Perkins Elmer) using the primer and Bacillus subtilis 168 Marburg chromosomal DNA template described above. )) To amplify a fragment containing the 3 ′ end region of ΔpurA and the downstream region.
組換えPCRにより全ΔpurAを増幅するに際し、MicroSpin Column S-400（Amersham Pharmacia Biotech）を使用し、前記したように増幅した２つのDNA断片を精製した。鋳型として適切な量の２つの断片の混合物並びにプライマー２３（配列番号２７）及び２６（配列番号３０）を使用してPCRを行った（94℃で30秒、55℃で１分、72℃で２分、30サイクル、Gene Amp PCR System Model 9600 (Perkins Elmer)）。ΔpurAの増幅断片（約1.4 kb）を得た。 When amplifying total ΔpurA by recombinant PCR, MicroSpin Column S-400 (Amersham Pharmacia Biotech) was used to purify the two DNA fragments amplified as described above. PCR was performed using a mixture of the appropriate amount of the two fragments as a template and primers 23 (SEQ ID NO: 27) and 26 (SEQ ID NO: 30) (94 ° C. for 30 seconds, 55 ° C. for 1 minute, 72 ° C. 2 minutes, 30 cycles, Gene Amp PCR System Model 9600 (Perkins Elmer)). An amplified fragment (about 1.4 kb) of ΔpurA was obtained.
（ｉｉ）ΔpurA遺伝子のクローン化
増幅した断片をBamHIにより消化し（37℃、一夜）、アガロースゲルを使用して分離した。目的断片をゲルから抽出し、同一酵素で予め消化した（37℃、３時間）バチルス・ズブチリス染色体組込みベクターpJPM1（J. Bacteriol. 174: 4361-4373）と連結した後、子ウシ腸ホスファターゼを用いた処理を行った。正しく挿入されたΔpurA遺伝子を含むプラスミドを選択し、DNA配列決定によって他のPCR誘導性変異を有さないことを確認し、pKM208と命名した。
(Ii) Cloning of ΔpurA gene The amplified fragment was digested with BamHI (37 ° C, overnight) and separated using an agarose gel. The target fragment was extracted from the gel and ligated with Bacillus subtilis chromosome integration vector pJPM1 (J. Bacteriol. 174: 4361-4373) previously digested with the same enzyme (37 ° C, 3 hours), and calf intestinal phosphatase was used. The process was performed. A plasmid containing the correctly inserted ΔpurA gene was selected, confirmed to have no other PCR-induced mutations by DNA sequencing, and named pKM208.
（ｉｉｉ）ΔpurAのKMBS337への導入
前記したように調製したKMBS337株のコンピテント細胞をpKM208により形質転換し、2.5μg/mLのCmを含有するLB寒天平板上で生育することのできるコロニー（シングルクロスオーバー組換え体）を選択した。
(Iii) Introduction of ΔpurA into KMBS337 Colony capable of growing on a LB agar plate containing 2.5 μg / mL Cm by transforming competent cells of KMBS337 strain prepared as described above with pKM208 Crossover recombinant) was selected.
10mLのLB+Gua培地にシングルクロスオーバー組換え体の１つを接種し、37℃で２日間、継続的に継代培養した。Cmを含む又は含まないLB+Gua寒天培地を使用し、クロラムフェニコール感受性を示すコロニーを選択した。Cm感受性コロニーから染色体DNAを調製した。プライマー２３（配列番号２７）及び２６（配列番号３０）を使用し、前記と同様の様式でPCRを行った。ダブルクロスオーバー組換えによって染色体上のpurA遺伝子が破壊型のpurA遺伝子（ΔpurA）で置換された株を同定した。二重組換え株はKMBS349（ΔpurAΔpurRΔpupGΔhisCtrpC2）と命名した。 10 mL of LB + Gua medium was inoculated with one of the single crossover recombinants and continuously subcultured at 37 ° C. for 2 days. LB + Gua agar medium with or without Cm was used to select colonies showing chloramphenicol sensitivity. Chromosomal DNA was prepared from Cm sensitive colonies. PCR was performed in the same manner as described above using primers 23 (SEQ ID NO: 27) and 26 (SEQ ID NO: 30). A strain in which the purA gene on the chromosome was replaced with a disrupted purA gene (ΔpurA) by double crossover recombination was identified. The double recombinant strain was named KMBS349 (ΔpurAΔpurRΔpupGΔhisCtrpC2).
（４）trpC+及びhisC+のKMBS349への導入
前記したように調製したKMBS349株のコンピテント細胞をKMBS275由来の染色体DNA（＜バチルス・ズブチリス 168 Marburgの原栄養株の構築＞参照）により形質転換し、20mg/Lのアデニン（Ade）を含有する最小培地寒天平板上で生育することのできるコロニーを選択した。
(4) Introduction of trpC + and hisC + into KMBS349 Transformation of KMBS349 strain competent cells prepared as described above with KMBS275-derived chromosomal DNA (see <Construction of Bacillus subtilis 168 Marburg prototrophic strain>) Then, a colony capable of growing on a minimal medium agar plate containing 20 mg / L adenine (Ade) was selected.
Adeを含む又は含まない最小培地寒天平板を使用し、得られた形質転換体からアデニン栄養要求性を有する株を選択した。その後、コロニーPCRにより（対応する遺伝子、pupG、purR、及びpurAについてのPCR条件は前記した通りである）、染色体上の３つの遺伝子が破壊型の遺伝子（ΔpupG、ΔpurR、及びΔpurA）で置換された株を同定した。この株はKMBS350（ΔpurAΔpurRΔpupG）と命名した。 Using a minimal medium agar plate with or without Ade, a strain having an adenine auxotrophy was selected from the obtained transformants. Then, by colony PCR (the PCR conditions for the corresponding genes, pupG, purR, and purA are as described above), the three genes on the chromosome are replaced with the disrupted genes (ΔpupG, ΔpurR, and ΔpurA). Were identified. This strain was named KMBS350 (ΔpurAΔpurRΔpupG).
２．KMBS356（ΔpurAΔpurRΔpupGguaB24）の構築
IMPデヒドロゲナーゼをコードするguaB遺伝子におけるグアニン栄養要求性リーキー（leaky）変異guaB24（米国特許出願公開第2006275874号（US2006275874A1）に記載されたguaB(A1)と同一）を、バチルス・ズブチリス 168 Marburgから誘導した組換えKMBS349株（ΔpurAΔpurRΔpupGΔhisCtrpC2）に導入し、結果的に得られた株から以下のようにして原栄養株を取得した。
2. Construction of KMBS356 (ΔpurAΔpurRΔpupGguaB24)
Guanine auxotrophic leaky mutation guaB24 (identical to guaB (A1) described in US Patent Application Publication No. 2006275874 (US2006275874A1)) in the guaB gene encoding IMP dehydrogenase was derived from Bacillus subtilis 168 Marburg It was introduced into a recombinant KMBS349 strain (ΔpurAΔpurRΔpupGΔhisCtrpC2), and a prototrophic strain was obtained from the resulting strain as follows.
（１）KMBS349からのguaB破壊株の構築
前記したように調製したKMBS349株（ΔpurAΔpurRΔpupGΔhisCtrpC2）のコンピテント細胞を、KMBS193（guaB::kantrpC；米国特許出願公開第2006275874号明細書（US2006275874A1））由来の染色体DNAにより形質転換し、2.5μg/mlのカナマイシン（Kan）を補填したLB培地の平板上で生育することのできるコロニーを選択した。
(1) Construction of guaB disruption strain from KMBS349 Competent cells of KMBS349 strain (ΔpurAΔpurRΔpupGΔhisCtrpC2) prepared as described above were derived from KMBS193 (guaB :: kantrpC; US Patent Application Publication No. 2006275874A (US2006275874A1)). Colonies capable of growing on a plate of LB medium transformed with chromosomal DNA and supplemented with 2.5 μg / ml kanamycin (Kan) were selected.
Gua栄養要求性を有するKan耐性株を形質転換体から同定した。得られた株は、KMBS351（guaB::kanΔpurAΔpurRΔpupGΔhisCtrpC2）と命名した。 Kan resistant strains with Gua auxotrophy were identified from the transformants. The obtained strain was named KMBS351 (guaB :: kanΔpurAΔpurRΔpupGΔhisCtrpC2).
（２）KMBS349からのguaBリーキー株の構築
前記したように調製したKMBS351株（guaB::kanΔpurAΔpurRΔpupGΔhisCtrpC2）のコンピテント細胞を、YMBS9の染色体DNA（guaB24trpC2；KMBS193のコンピテント細胞を、バチルス・ズブチリス 168 Marburgの誘導株における染色体上のguaB24変異を含むguaB領域のPCR増幅により得られるDNAにより形質転換することによって、YMBS9が得られる）により形質転換し、20mg/LのAde、His、及びTrpを含有する最小培地寒天平板上で生育できるコロニーを選択した。
(2) Construction of guaB leaky strain from KMBS349 Competent cells of KMBS351 strain (guaB :: kanΔpurAΔpurRΔpupGΔhisCtrpC2) prepared as described above, chromosomal DNA of YMBS9 (guaB24trpC2; competent cells of KMBS193, Bacillus subtilis 168 Marburg YMBS9 is obtained by transformation with DNA obtained by PCR amplification of the guaB region containing the guaB24 mutation on the chromosome in the derivative strain of, and contains 20 mg / L Ade, His, and Trp Colonies that could grow on minimal medium agar plates were selected.
Ade+Hisを含む又は含まない最小培地寒天平板を使用し、Ade及びHis栄養要求性の株を組換え体から選択した。その後、コロニーPCR（対応する遺伝子pupG及びpurRについてのPCR条件は前記した通りである）及びDNA配列決定により、染色体上の２つの遺伝子が破壊型の遺伝子（ΔpupG及びΔpurR）で置換され、guaB::kanがguaB24により正しく置換された株を同定した。得られた株は、KMBS353（guaB24ΔpurAΔpurRΔpupGΔhisCtrpC2）と命名した。 Ade and His auxotrophic strains were selected from the recombinants using minimal medium agar plates with or without Ade + His. Then, by colony PCR (PCR conditions for the corresponding genes pupG and purR are as described above) and DNA sequencing, the two genes on the chromosome are replaced with disrupted genes (ΔpupG and ΔpurR), and guaB: A strain in which: kan was correctly replaced by guaB24 was identified. The obtained strain was named KMBS353 (guaB24ΔpurAΔpurRΔpupGΔhisCtrpC2).
（３）trpC+及びhisC+のKMBS353への導入
前記したように調製したKMBS353株のコンピテント細胞を、KMBS350の染色体DNAにより形質転換し（１．KMBS350（ΔpurAΔpurRΔpupG）の構築参照）、20mg/LのAdeを含有する最小培地寒天平板上で生育することのできるコロニーを選択した。
(3) Introduction of trpC + and hisC + into KMBS353 Competent cells of the KMBS353 strain prepared as described above were transformed with the chromosomal DNA of KMBS350 (see 1. Construction of KMBS350 (ΔpurAΔpurRΔpupG)), 20 mg / L Colonies capable of growing on a minimal medium agar plate containing Ade were selected.
その後、組換え体におけるguaB遺伝子のDNA配列決定により、染色体上の野生型のguaBがリーキー型のguaB24対立遺伝子で置換された株を同定した。得られた株は、KMBS356（guaB24ΔpurAΔpurRΔpupG）と命名した。 Subsequently, strains in which the wild-type guaB on the chromosome was replaced with the leaky guaB24 allele were identified by DNA sequencing of the guaB gene in the recombinant. The obtained strain was named KMBS356 (guaB24ΔpurAΔpurRΔpupG).
３．KMBS375（Ppur*-ΔattΔdeoDΔpurAΔpurRΔpupG）の構築
改変されたプリンオペロンプロモーター（Ppur）及び部分的に欠失したアテニュエータ配列（Ppur*-Δatt；Ppur1-Δattと同一、米国特許出願公開第2006275874号明細書（US20
06275874A1）に記載されている）、破壊型のpurA遺伝子、IMPデヒドロゲナーゼをコードするguaB遺伝子におけるグアニン栄養要求性リーキー変異guaB24（米国特許出願公開第2006275874号明細書（US2006275874A1）に記載されたguaB(A1)と同一）、並びに破壊型の、プリンヌクレオシドホスホリラーゼをコードするdeoD遺伝子を、以下のようにして、バチルス・ズブチリス 168 Marburgから誘導された組換え体KMBS337株（ΔpurRΔpupGΔhisCtrpC2；１．（２）ΔpurR（31番目〜825番目の795のヌクレオチドのフレーム内欠失）のKMBS334への導入参照）に順次導入した。
3. Construction of KMBS375 (Ppur * -ΔattΔdeoDΔpurAΔpurRΔpupG) Modified purine operon promoter (Ppur) and partially deleted attenuator sequence (Ppur * -Δatt; same as Ppur1-Δatt, US Patent Application Publication No. 2006275874 (US20
GuaB (A1 described in US Patent Application Publication No. 2006275874A1), a guanine auxotrophic leaky mutation guaB24 in the guaB gene encoding the disrupted purA gene and IMP dehydrogenase) )) And a disrupted deoD gene encoding a purine nucleoside phosphorylase was obtained as follows. Recombinant KMBS337 derived from Bacillus subtilis 168 Marburg (ΔpurRΔpupGΔhisCtrpC2; 1. (2) ΔpurR ( Introducing the 31st to 825th 795 nucleotides in frame) (see Introduction to KMBS334).
（１）KMBS337からのPpur破壊株の構築
前記したようにして調製したKMBS337株（ΔpurRΔpupGΔhisCtrpC2）のコンピテント細胞を、KMBS198（Ppur::cattrpC2；米国特許出願公開第2006275874号明細書（US2006275874A1））の染色体DNAにより形質転換し、LB+Gua+Cm培地上で生育することのできるコロニーを選択した。
(1) Construction of Ppur-disrupted strain from KMBS337 Competent cells of KMBS337 strain (ΔpurRΔpupGΔhisCtrpC2) prepared as described above were obtained from KMBS198 (Ppur :: cattrpC2; US Patent Application Publication No. 2006275874A (US2006275874A1)). Colonies that were transformed with chromosomal DNA and capable of growing on LB + Gua + Cm medium were selected.
Ade及びHis栄養要求性を有する株を、Ade+Hisを含む又は含まない最小培地寒天平板を使用して組換え体から選択した。その後、コロニーPCR（対応するpupG及びpurRについてのPCR条件は前記した通りである）により、染色体上の２つの遺伝子が破壊型の遺伝子（ΔpupG及びΔpurR）で置換された株を同定した。得られた株は、KMBS340（Ppur::catΔpurRΔpupGΔhisCtrpC2）と命名した。 Strains with Ade and His auxotrophy were selected from the recombinants using minimal medium agar plates with or without Ade + His. Thereafter, a strain in which two genes on the chromosome were replaced with disrupted genes (ΔpupG and ΔpurR) was identified by colony PCR (PCR conditions for the corresponding pupG and purR were as described above). The obtained strain was named KMBS340 (Ppur :: catΔpurRΔpupGΔhisCtrpC2).
（２）Ppur*-ΔattによるPpur::catの置換
前記したように調製したKMBS340株（Ppur::catΔpurRΔpupGΔhisCtrpC2）のコンピテント細胞を、KMBS261（Ppur1-ΔattpurR::spcΔpupG*trpC2；米国特許出願公開第2006275874号明細書（US2006275874A1））由来の染色体DNAにより形質転換し、20mg/LのTrp及びHisを含有する最小培地寒天平板上で生育することのできるコロニーを選択した。
(2) Substitution of Ppur :: cat by Ppur * -Δatt Competent cells of KMBS340 strain (Ppur :: catΔpurRΔpupGΔhisCtrpC2) prepared as described above were used as KMBS261 (Ppur1-ΔattpurR :: spcΔpupG * trpC2; US Patent Application Publication No. A colony capable of growing on a minimal medium agar plate containing 20 mg / L Trp and His was selected by transformation with chromosomal DNA derived from the specification of US 2006275874 (US2006275874A1).
Ade+Hisを含む又は含まない最小培地寒天平板を使用し、Ade及びHis栄養要求性を有する株を組換え体から選択した。その後、コロニーPCR（対応する遺伝子pupG及びpurRについてのPCR条件は前記した通りである）およびDNA配列決定により、染色体上の２つの遺伝子が破壊型の遺伝子（ΔpupG及びΔpurR）で置換され、Ppur*-ΔattがPpur::catにより正しく置換された株を同定した。得られた株は、KMBS352（Ppur*-ΔattΔpurRΔpupGΔhisCtrpC2）と命名した。 Strains with Ade and His auxotrophy were selected from the recombinants using minimal medium agar plates with or without Ade + His. Then, by colony PCR (PCR conditions for the corresponding genes pupG and purR are as described above) and DNA sequencing, the two genes on the chromosome are replaced with disrupted genes (ΔpupG and ΔpurR), and Ppur * A strain in which -Δatt was correctly replaced by Ppur :: cat was identified. The obtained strain was named KMBS352 (Ppur * -ΔattΔpurRΔpupGΔhisCtrpC2).
（３）ΔpurA（307番目〜675番目の369ヌクレオチドのフレーム内欠失）のKMBS352への導入
前記したようにして調製したKMBS352株（Ppur*-ΔattΔpurRΔpupGΔhisCtrpC2）のコンピテント細胞を、KMBS350の染色体DNA（ΔpurAΔpurRΔpupG；１．KMBS350（ΔpurAΔpurRΔpupG）の構築参照）により形質転換し、20mg/LのHis及びAdeを含有する最小培地寒天平板上で生育することのできるコロニーを選択した。
(3) Introduction of ΔpurA (deletion in frame of 369 nucleotides from 307 to 675) into KMBS352 Competent cells of KMBS352 strain (Ppur * -ΔattΔpurRΔpupGΔhisCtrpC2) prepared as described above were chromosomal DNA of KMBS350 ( ΔpurAΔpurRΔpupG; 1. Transformation by KMBS350 (refer to the construction of ΔpurAΔpurRΔpupG), and a colony capable of growing on a minimal medium agar plate containing 20 mg / L His and Ade was selected.
「コングレッション（congression）」により得られるAde栄養要求性を有する株を、Ade+Hisを含む又は含まない最小培地寒天平板を使用して組換え体から選択した。これらの株の１つは、ΔhisCの代わりにhisC+を有することが見出された。その後、コロニーPCR（purAについてのPCR条件は前記した通りである）及びDNA配列決定により、染色体上のpurA遺伝子が破壊型の遺伝子（ΔpurA）で置換され、Ppur*-Δattが野生型のPpurにより置換されていない株を同定した。得られた株は、KMBS359（Ppur*-ΔattΔpurAΔpurRΔpupG）と命名した。 Ade auxotrophic strains obtained by “congression” were selected from the recombinants using minimal medium agar plates with or without Ade + His. One of these strains was found to have hisC + instead of ΔhisC. Subsequently, colony PCR (PCR conditions for purA are as described above) and DNA sequencing, the purA gene on the chromosome was replaced with a disrupted gene (ΔpurA), and Ppur * -Δatt was replaced by wild-type Ppur. A strain that was not replaced was identified. The obtained strain was named KMBS359 (Ppur * -ΔattΔpurAΔpurRΔpupG).
（４）KMBS359からのguaB破壊株の構築
前記したようにして調製したKMBS359株（Ppur*-ΔattΔpurAΔpurRΔpupG）のコンピテ
ント細胞を、KMBS351（guaB::kanΔpurAΔpurRΔpupGΔhisCtrpC2；２．（１）KMBS349からのguaB破壊株の構築参照）の染色体DNAにより形質転換し、2.5μg/mlのKanを補填したLB+Gua培地の平板上で生育することのできるコロニーを選択した。
(4) Construction of guaB-disrupted strain from KMBS359 Competent cells of KMBS359 strain (Ppur * -ΔattΔpurAΔpurRΔpupG) prepared as described above were used as KMBS351 (guaB :: kanΔpurAΔpurRΔpupGΔhisCtrpC2; 2. (1) guaB-disrupted strain from KMBS349 The colonies that can be grown on the LB + Gua medium plate supplemented with 2.5 μg / ml Kan were selected.
Gua栄養要求性を有するKan耐性株を組換え体から同定した。その後、PCRにより（PpurについてのPCR条件は米国特許出願公開第2006275874号明細書（US2006275874A1）に記載されている）、Ppur*-Δattが野生型のPpurにより置換されていない株を選択した。得られた株は、KMBS364（guaB::kanPpur*-ΔattΔpurAΔpurRΔpupG）と命名した。 Kan resistant strains with Gua auxotrophy were identified from the recombinants. Thereafter, a strain in which Ppur * -Δatt was not substituted by wild-type Ppur was selected by PCR (PCR conditions for Ppur are described in US Patent Application Publication No. 2006275874 (US2006275874A1)). The obtained strain was named KMBS364 (guaB :: kanPpur * -ΔattΔpurAΔpurRΔpupG).
（５）KMBS346からのguaBリーキー株の構築
前記したようにして調製したKMBS364株（guaB::kanPpur*-ΔattΔpurAΔpurRΔpupG）のコンピテント細胞を、KMBS356の染色体DNA（guaB24ΔpurAΔpurRΔpupG；２．（３）trpC+及びhisC+のKMBS353への導入参照）により形質転換し、20mg/LのAdeを含有する最小培地寒天平板上で生育することのできるコロニーを選択した。
(5) Construction of guaB leaky strain from KMBS346 Competent cells of KMBS364 strain (guaB :: kanPpur * -ΔattΔpurAΔpurRΔpupG) prepared as described above were used as chromosomal DNA of KMBS356 (guaB24ΔpurAΔpurRΔpupG; 2. (3) trpC + and hisC + The colonies capable of growing on a minimal medium agar plate containing 20 mg / L of Ade were selected.
その後、DNA配列決定により、guaB::kan対立遺伝子がguaB24により正しく置換され、Ppur*-Δattが野生型Ppurにより置換されていない株を同定した。得られた株は、KMBS365（guaB24Ppur*-ΔattΔpurAΔpurRΔpupG）と命名した。 Subsequently, DNA sequencing identified strains in which the guaB :: kan allele was correctly replaced by guaB24 and Ppur * -Δatt was not replaced by wild-type Ppur. The obtained strain was named KMBS365 (guaB24Ppur * -ΔattΔpurAΔpurRΔpupG).
（６）ΔdeoD（262番目〜450番目の189のヌクレオチドのフレーム内欠失）のKMBS365への導入
（ｉ）組換えPCRによるΔdeoDの増幅
ΔdeoDの5'末端及びその上流領域を増幅するに際し、GenBank（Accession No. NC_000964）からの情報に基いてPCRプライマー２７（配列番号３１）及び２８（配列番号３２）を設計した。プライマー５４は、その5'末端にBamHI部位を含む。プライマー５５は、フレーム内欠失によって生成した接合部を含む。
(6) Introducing ΔdeoD (deletion of 189 nucleotides from 262 to 450) into KMBS365 (i) Amplification of ΔdeoD by recombinant PCR When amplifying the 5 ′ end of ΔdeoD and its upstream region, GenBank PCR primers 27 (SEQ ID NO: 31) and 28 (SEQ ID NO: 32) were designed based on information from (Accession No. NC — 000964). Primer 54 contains a BamHI site at its 5 ′ end. Primer 55 includes a junction generated by an in-frame deletion.
前記したプライマー及びバチルス・ズブチリス 168 Marburgの染色体DNAの鋳型を使用し、PCR（94℃で30秒、55℃で１分、72℃で1.5分、30サイクル、Gene Amp PCR System Model 9600 (Perkins Elmer)）を行い、ΔdeoDの5'末端領域及び上流領域を含む断片を増幅した。 PCR (94 ° C. for 30 seconds, 55 ° C. for 1 minute, 72 ° C. for 1.5 minutes, 30 cycles, Gene Amp PCR System Model 9600 (Perkins Elmer) using the primers described above and the chromosomal DNA template of Bacillus subtilis 168 Marburg. )) To amplify a fragment containing the 5 'terminal region and upstream region of ΔdeoD.
ΔdeoDの3'末端及びその下流領域を増幅するに際し、GenBank（Accession No. NC_000964）からの情報に基いてPCRプライマー２９（配列番号３３）及び３０（配列番号３４）を設計した。プライマー５６は、フレーム内欠失によって生成した接合部を含む。プライマー５７は、その5'末端にBamHI部位を含む。 When amplifying the 3 ′ end of ΔdeoD and its downstream region, PCR primers 29 (SEQ ID NO: 33) and 30 (SEQ ID NO: 34) were designed based on information from GenBank (Accession No. NC — 000964). Primer 56 includes a junction generated by an in-frame deletion. Primer 57 contains a BamHI site at its 5 ′ end.
前記したプライマー及びバチルス・ズブチリス168 Marburgの染色体DNAの鋳型を使用し、PCR（94℃で30秒、55℃で１分、72℃で１分、30サイクル、Gene Amp PCR System Model
9600 (Perkins Elmer)）を行い、ΔdeoDの3'末端領域及び下流領域を含む断片を増幅した。
PCR (94 ° C for 30 seconds, 55 ° C for 1 minute, 72 ° C for 1 minute, 30 cycles, Gene Amp PCR System Model, using the primer and Bacillus subtilis 168 Marburg chromosomal DNA template described above.
9600 (Perkins Elmer)), and a fragment containing the 3 ′ end region of ΔdeoD and the downstream region was amplified.
組換えPCRにより全ΔdeoDを増幅するに際し、MicroSpin Column S-400（Amersham Pharmacia Biotech）を使用し、前記したように増幅した２つのDNA断片を精製した。鋳型として適切な量の２つの断片の混合物並びにプライマー２７（配列番号３１）及び３０（配列番号３４）を使用してPCRを行った（94℃で30秒、50℃で１分、72℃で３分、30サイクル、Gene Amp PCR System Model 9600 (Perkins Elmer)）。ΔdeoDの増幅断片（約2.0 kb）を得た。 In amplifying total ΔdeoD by recombinant PCR, MicroSpin Column S-400 (Amersham Pharmacia Biotech) was used to purify the two amplified DNA fragments as described above. PCR was performed using a mixture of the two fragments in an appropriate amount as a template and primers 27 (SEQ ID NO: 31) and 30 (SEQ ID NO: 34) (94 ° C. for 30 seconds, 50 ° C. for 1 minute, 72 ° C. 3 minutes, 30 cycles, Gene Amp PCR System Model 9600 (Perkins Elmer)). An amplified fragment (about 2.0 kb) of ΔdeoD was obtained.
（ｉｉ）ΔdeoD遺伝子のクローン化
増幅した断片をBamHIにより消化し（37℃、一夜）、アガロースゲルを使用して分離した。目的断片をゲルから抽出し、同一酵素で予め消化した（37℃、３時間）バチルス・ズブチリス染色体組込みベクターpJPM1（J. Bacteriol. 174: 4361-4373）と連結した後、子ウシ腸ホスファターゼを用いた処理を行った。正しく挿入されたΔdeoD遺伝子を含むプラスミドを選択し、DNA配列決定によって他のPCR誘導性変異を有さないことを確認し、pKM201と命名した。
(Ii) Cloning of ΔdeoD gene The amplified fragments were digested with BamHI (37 ° C., overnight) and separated using an agarose gel. The target fragment was extracted from the gel and ligated with Bacillus subtilis chromosome integration vector pJPM1 (J. Bacteriol. 174: 4361-4373) previously digested with the same enzyme (37 ° C, 3 hours), and calf intestinal phosphatase was used. The process was performed. A plasmid containing the correctly inserted ΔdeoD gene was selected and confirmed by DNA sequencing to have no other PCR-induced mutations and named pKM201.
（ｉｉｉ）ΔdeoDのKMBS365への導入
前記したように調製したKMBS365株のコンピテント細胞をpKM201により形質転換し、2.5μg/mLのCmを含有するLB+Gua寒天平板上で生育することのできるコロニー（シングルクロスオーバー組換え体）を選択した。
(Iii) Introduction of ΔdeoD into KMBS365 Colonies capable of growing on LB + Gua agar plates containing competent cells of KMBS365 strain prepared as described above with pKM201 and containing 2.5 μg / mL Cm (Single crossover recombinant) was selected.
10mLのLB+Gua培地にシングルクロスオーバー組換え体の１つを接種し、37℃で２日間、継続的に継代培養した。Cmを含む又は含まないLB+Gua寒天培地を使用し、Cm感受性を示すコロニーを選択した。Cm感受性コロニーから染色体DNAを調製した。プライマー２７（配列番号３１）及び３０（配列番号３４）を使用し、前記と同様の様式でPCRを行った。ダブルクロスオーバー組換えによって染色体上のdeoD遺伝子が破壊型のdeoD遺伝子（ΔdeoD）で置換された株を同定した。二重組換え株はKMBS375（ΔdeoDguaB24Ppur*-ΔattΔpurAΔpurRΔpupG）と命名した。 10 mL of LB + Gua medium was inoculated with one of the single crossover recombinants and continuously subcultured at 37 ° C. for 2 days. LB + Gua agar medium with or without Cm was used to select colonies showing Cm sensitivity. Chromosomal DNA was prepared from Cm sensitive colonies. PCR was performed in the same manner as described above using primers 27 (SEQ ID NO: 31) and 30 (SEQ ID NO: 34). A strain in which the deoD gene on the chromosome was replaced by a disrupted deoD gene (ΔdeoD) by double crossover recombination was identified. The double recombinant strain was named KMBS375 (ΔdeoDguaB24Ppur * -ΔattΔpurAΔpurRΔpupG).
本発明をその好適な形態を参照して詳細に説明したが、本発明の範囲を逸脱することなく種々の変更を行うことができ、等価物を用いることができることは当業者に明らかであろう。前記した文書のそれぞれは、参考により全体としてここに組入れるものとする。 Although the invention has been described in detail with reference to preferred embodiments thereof, it will be apparent to those skilled in the art that various modifications can be made and equivalents can be used without departing from the scope of the invention. . Each of the aforementioned documents is incorporated herein by reference in its entirety.
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