JP5468299B2 - Ｉｍｐｄｈ含有組成物及びｉｍｐｄｈの安定化方法 - Google Patents

Description

本発明は、イノシン５’一リン酸脱水素酵素（ＩＭＰＤＨと略す場合がある）を安定して含む、ＩＭＰＤＨ含有組成物に関する。また、本発明は、ＩＭＰＤＨを安定化する方法に関する。

ＩＭＰＤＨは、生体内に存在し、グアニンヌクレオチドの新規合成に関与する酵素である。ＩＭＰＤＨは、典型的には、イノシン５’一リン酸（ＩＭＰと略す場合がある）を酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤと略す場合がある）の存在下、キサントシン５’一リン酸（ＸＭＰと略す場合がある）と酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤＨと略す場合がある）に変換する反応に作用する（非特許文献１）。増殖の早いヒト白血球細胞系や、その他の腫瘍細胞系において、ＩＭＰＤＨの活性上昇が観察されており、これは、ＩＭＰＤＨが免疫抑制療法や抗癌療法のための標的となり得ることを示唆する。また、ウィルスに感染した細胞系におけるウィルスの複製において、ＩＭＰＤＨが関与することも知られている。これらのことから、ＩＭＰＤＨは、種々の医薬品の開発において着目されており、例えば、ＩＭＰＤＨ阻害剤は、免疫抑制剤、抗癌剤、抗血管過増殖剤、抗炎症剤、抗真菌剤、抗乾癬、及び抗ウィルス剤となり得ると考えられる。

しかしながら、ＩＭＰＤＨは安定性が低いという問題を有する。例えば、水溶液中における哺乳類由来のＩＭＰＤＨは不安定であり、特に水溶液の塩濃度が低いときには凝集しやすいということが知られている。ＩＭＰＤＨの安定性について非特許文献２には、ＩＭＰＤＨを濃縮するか又は牛アルブミンと共存させると、室温でも安定となること、及びジチオトレイトール（ＤＴＴと略す場合がある）の添加はＩＭＰＤＨの安定性を向上することが記載されている。

酵素ハンドブック、朝倉書店、１９８７年第５刷、７８頁 Hager P. W.、Collart F. R.、Huberman E.、Mitchell B. S.、 Recombinant human inosine monophosphate dehydrogenase type I and type II proteins、 Biochem. Pharmacol.、４９巻、１３２３−１３２９頁、１９９５年

以上のように、ＩＭＰＤＨは、医薬品の開発や、試薬の開発の分野で重要視されている酵素であり、様々な条件下において、ＩＭＰＤＨを安定化する方法及び安定化されたＩＭＰＤＨを含有する組成物が求められている。

本発明者らは、ＩＭＰＤＨの安定化方法を種々検討する中で、ＩＭＰＤＨの安定化効果を有するとして非特許文献２に報告されているＤＴＴが、非特許文献２に記載されるような条件下では確かにＩＭＰＤＨの安定化効果を示すが、異なる条件下、例えばＡＴＰとマグネシウムイオンの存在下においては、ＤＴＴがＩＭＰＤＨを不安定化するという想像もしなかった効果を示すことを発見した。一方、本発明者らは、チオグリセロール及び／又はＮ−アセチル−Ｌ−システイン（ＮＡＣと略す場合がある）がＩＭＰＤＨの安定化効果を有することを発見し、さらにこれらの化合物は、ＡＴＰとマグネシウムイオンの存在下においても顕著なＩＭＰＤＨの安定化効果を示すことを発見して、本発明を完成するに至った。

すなわち、本発明の第１の態様では、以下のものが提供される。
［１］
イノシン５’一リン酸脱水素酵素（ＩＭＰＤＨ）と、チオグリセロール及び／又はＮ−アセチル−Ｌ−システイン（ＮＡＣ）とを含有する、ＩＭＰＤＨ含有組成物。
［１−２］
リン酸供与体及び／又は金属イオンが混在するＩＭＰＤＨ含有組成物であって、チオグリセロール及び／又はＮＡＣをさらに含有する、ＩＭＰＤＨ含有組成物。
［１−３］
リン酸供与体及び金属イオンが混在するＩＭＰＤＨ含有組成物であって、チオグリセロール及び／又はＮＡＣをさらに含有する、ＩＭＰＤＨ含有組成物。
［１−４］
前記リン酸供与体がＡＴＰである、［１−２］又は［１−３］に記載のＩＭＰＤＨ含有組成物。
［１−５］
前記金属イオンがマグネシウムイオンである、［１−２］〜［１−４］のいずれかに記載のＩＭＰＤＨ含有組成物。
［１−６］
水溶液の形態である、［１］〜［１−５］のいずれかに記載のＩＭＰＤＨ含有組成物。
［１−７］
ＩＭＰＤＨの含有量が、０．０１Ｕ／ｍＬ以上１０００Ｕ／ｍＬ以下である、［１］〜［１−６］のいずれかに記載のＩＭＰＤＨ含有組成物。
［１−７−１］
ＩＭＰＤＨの含有量が、０．１Ｕ／ｍＬ以上２００Ｕ／ｍＬ以下である、［１］〜［１−６］のいずれかに記載のＩＭＰＤＨ含有組成物。
［１−７−２］
ＩＭＰＤＨの含有量が、０．１Ｕ／ｍＬ以上５０Ｕ／ｍＬ以下である、［１］〜［１−６］のいずれかに記載のＩＭＰＤＨ含有組成物。
［１−８］
チオグリセロール又はＮＡＣの含有量が、０．１ｍＭ以上１００ｍＭ以下である、［１］〜［１−７−２］のいずれかに記載のＩＭＰＤＨ含有組成物。
［１−８−１］
チオグリセロール又はＮＡＣの含有量が、１ｍＭ以上５０ｍＭ以下である、［１］〜［１−７−２］のいずれかに記載のＩＭＰＤＨ含有組成物。
［１−８−２］
チオグリセロール又はＮＡＣの含有量が、１ｍＭ以上２０ｍＭ以下である、［１］〜［１−７−２］のいずれかに記載のＩＭＰＤＨ含有組成物。
［１−９］
ＩＭＰＤＨ １Ｕ当たり、チオグリセロール及び／又はＮＡＣを０．０２μｍｏｌ以上２００μｍｏｌ以下含有する、［１］〜［１−８−２］のいずれかに記載のＩＭＰＤＨ含有組成物。
［１−９−１］
ＩＭＰＤＨ １Ｕ当たり、チオグリセロール及び／又はＮＡＣを１μｍｏｌ以上２００μｍｏｌ以下含有する、［１］〜［１−８−２］のいずれかに記載のＩＭＰＤＨ含有組成物。
［１−９−２］
ＩＭＰＤＨ １Ｕ当たり、チオグリセロール及び／又はＮＡＣを１μｍｏｌ以上１２５μｍｏｌ以下含有する、［１］〜［１−８−２］のいずれかに記載のＩＭＰＤＨ含有組成物。
［１−１０］
ＩＭＰＤＨの酵素反応を利用するための組成物である、［１］〜［１−９−２］のいずれかに記載のＩＭＰＤＨ含有組成物。
［１−１１］
ＩＭＰＤＨの酵素反応を利用して、ＩＭＰＤＨの阻害剤、ＩＭＰＤＨの基質若しくはＩＭＰＤＨの補酵素又はこれらの前駆体のいずれかを測定するための試薬である、［１］〜［１−１０］のいずれかに記載のＩＭＰＤＨ含有組成物。
［１−１２］
ＩＭＰＤＨの酵素反応を利用して、ミゾリビン及び／又はリバビリンを測定するための試薬である、［１］〜［１−１１］のいずれかに記載のＩＭＰＤＨ含有組成物。
［１−１３］
ジチオトレイトール（ＤＴＴ）を実質的に含まない、［１］〜［１−１２］のいずれかに記載のＩＭＰＤＨ含有組成物。
［１−１４］
乾燥状態である、［１］〜［１−５］及び［１−９］〜［１−１３］のいずれかに記載のＩＭＰＤＨ含有組成物。
［１−１５］
凍結乾燥状態である、［１］〜［１−５］及び［１−９］〜［１−１３］のいずれかに記載のＩＭＰＤＨ含有組成物。
［１−１６］
前記ＩＭＰＤＨが、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属由来である、［１］〜［１−１５］のいずれかに記載のＩＭＰＤＨ含有組成物。
［１−１７］
前記ＩＭＰＤＨが、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ由来である、［１］〜［１−１６］のいずれかに記載のＩＭＰＤＨ含有組成物。
［１−１８］
前記ＩＭＰＤＨが、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ ＡＴＣＣ２３８５７株由来である、［１］〜［１−１７］のいずれかに記載のＩＭＰＤＨ含有組成物。
［１−１９］
ＩＭＰＤＨの酵素反応を利用して、ＩＭＰ、キサントシン５’一リン酸（ＸＭＰ）、酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド類（酸化型ＮＡＤ（Ｐ）類）、還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド類（還元型ＮＡＤ（Ｐ）類）、ミゾリビン５’一リン酸、リバビリン５’一リン酸、ミコフェノール酸及びこれらの前駆体のいずれかを測定するための試薬である、［１］〜［１−１８］のいずれかに記載のＩＭＰＤＨ含有組成物。
［１−２０］
酸化型ＮＡＤ（Ｐ）類を含有する［１］から［１−１９］のいずれかに記載のＩＭＰＤＨ含有組成物。
［１−２１］
還元型ＮＡＤ（Ｐ）類を含有する［１］から［１−２０］のいずれかに記載のＩＭＰＤＨ含有組成物。
［１−２２］
ＩＭＰを含有する［１］から［１−２１］のいずれかに記載のＩＭＰＤＨ含有組成物。
［１−２３］
ＸＭＰを含有する［１］から［１−２２］のいずれかに記載のＩＭＰＤＨ含有組成物。
［１−２４］
塩化カリウムを含有する［１］から［１−２３］のいずれかに記載の組成物。
［１−２５］
［１］〜［１−２４］のいずれかに記載のＩＭＰＤＨ含有組成物を試薬として含む、ＩＭＰＤＨの酵素反応を利用して試料を測定するためのキット。

また、本発明の第２の態様では、以下のものが提供される。
［２］
リン酸供与体及び／又は金属イオンと、イノシン５’一リン酸脱水素酵素（ＩＭＰＤＨ）とを含有するＩＭＰＤＨ含有組成物のための安定化剤であって、チオグリセロール及び／又はＮ−アセチル−Ｌ−システイン（ＮＡＣ）を有効成分とする安定化剤。
［２−２］
前記ＩＭＰＤＨ含有組成物が［１−４］〜［１−７−２］及び［１−１０］〜［１−２４］のいずれかに記載の特徴を有する［２］に記載の安定化剤。
［２−３］
１ＵのＩＭＰＤＨに対する、チオグリセロール及び／又はＮＡＣの量が０．０２μｍｏｌ以上２００μｍｏｌ以下である、［２］又は［２−２］に記載の安定化剤。
［２−３−１］
１ＵのＩＭＰＤＨに対する、チオグリセロール及び／又はＮＡＣの量が１μｍｏｌ以上２００μｍｏｌ以下である、［２］又は［２−２］に記載の安定化剤。
［２−３−２］
１ＵのＩＭＰＤＨに対する、チオグリセロール及び／又はＮＡＣの量が１μｍｏｌ以上１２５μｍｏｌ以下である、［２］又は［２−２］に記載の安定化剤。

また、本発明の第３の態様では、以下のものが提供される。
［３］
イノシン５’一リン酸脱水素酵素（ＩＭＰＤＨ）含有組成物の安定化方法であって、チオグリセロール及び／又はＮ−アセチル−Ｌ−システイン（ＮＡＣ）を前記組成物に添加する工程を含む安定化方法。
［３−２］
前記ＩＭＰＤＨ含有組成物が［１−６］〜［１−７−２］及び［１−１０］〜［１−２４］のいずれかに記載の特徴を有する［３］に記載の安定化方法。
［３−３］
１ＵのＩＭＰＤＨに対する、チオグリセロール及び／又はＮＡＣの添加量が０．０２μｍｏｌ以上２００μｍｏｌ以下である、［３］又は［３−２］に記載の安定化方法。
［３−３−１］
１ＵのＩＭＰＤＨに対する、チオグリセロール及び／又はＮＡＣの添加量が１μｍｏｌ以上２００μｍｏｌ以下である、［３］又は［３−２］に記載の安定化方法。
［３−３−２］
１ＵのＩＭＰＤＨに対する、チオグリセロール及び／又はＮＡＣの添加量が１μｍｏｌ以上１２５μｍｏｌ以下である、［３］又は［３−２］に記載の安定化方法。
［３−４］
リン酸供与体及び／又は金属イオンが混在するＩＭＰＤＨ含有組成物の安定化方法であって、チオグリセロール及び／又はＮＡＣを前記組成物に添加する工程を含む安定化方法。
［３−５］
前記ＩＭＰＤＨ含有組成物が［１−４］〜［１−７−２］及び［１−１０］〜［１−２４］のいずれかに記載の特徴を有する［３−４］に記載の安定化方法。
［３−６］
１ＵのＩＭＰＤＨに対する、チオグリセロール及び／又はＮＡＣの添加量が０．０２μｍｏｌ以上２００μｍｏｌ以下である、［３−４］又は［３−５］に記載の安定化方法。
［３−６−１］
１ＵのＩＭＰＤＨに対する、チオグリセロール及び／又はＮＡＣの添加量が１μｍｏｌ以上２００μｍｏｌ以下である、［３−４］又は［３−５］に記載の安定化方法。
［３−６−２］
１ＵのＩＭＰＤＨに対する、チオグリセロール及び／又はＮＡＣの添加量が１μｍｏｌ以上１２５μｍｏｌ以下である、［３−４］又は［３−５］に記載の安定化方法。

また、本発明の第４の態様では、以下のものが提供される。
［４］
リン酸供与体及び／又は金属イオンが混在するイノシン５’一リン酸脱水素酵素（ＩＭＰＤＨ）含有組成物の保存方法であって、チオグリセロール及び／又はＮ−アセチル−Ｌ−システイン（ＮＡＣ）を前記組成物に添加する工程、及び、前記ＩＭＰＤＨ含有組成物を２５℃以下で保存する工程、を含む保存方法。
［４−２］
前記ＩＭＰＤＨ含有組成物が［１−４］〜［１−７−２］及び［１−１０］〜［１−２４］のいずれかに記載の特徴を有する［４］に記載の保存方法。
［４−３］
１ＵのＩＭＰＤＨに対する、チオグリセロール及び／又はＮＡＣの添加量が０．０２μｍｏｌ以上２００μｍｏｌ以下である、［４］又は［４−２］に記載の保存方法。
［４−３−１］
１ＵのＩＭＰＤＨに対する、チオグリセロール及び／又はＮＡＣの添加量が１μｍｏｌ以上２００μｍｏｌ以下である、［４］又は［４−２］に記載の保存方法。
［４−３−２］
１ＵのＩＭＰＤＨに対する、チオグリセロール及び／又はＮＡＣの添加量が１μｍｏｌ以上１２５μｍｏｌ以下である、［４］又は［４−２］に記載の保存方法。

本発明によれば、様々な条件下、例えば、リン酸供与体及び／又は金属イオンの存在下であっても、ＩＭＰＤＨを安定化する方法を提供することができる。また、ＩＭＰＤＨが安定化された、ＩＭＰＤＨ含有組成物を提供することができる。これらの方法及び組成物は、例えば、医薬品の開発や、試薬の開発の分野で非常に有用である。

実施例２において、ＩＭＰＤＨ、ＡＴＰ及びマグネシウムイオンを主に含有する組成物７を１０℃にて種々の期間保存後、保存後の組成物を用いてミゾリビン標準液を測定して得た検量線を示す。 実施例２において、組成物７に１ｍＭ ＤＴＴを添加した組成物７−１を１０℃にて種々の期間保存後、保存後の組成物を用いてミゾリビン標準液を測定して得た検量線を示す。 実施例２において、組成物７に１ｍＭ チオグリセロールを添加した組成物７−２を、１０℃にて種々の期間保存後、この保存後の組成物を用いてミゾリビン標準液を測定して得た検量線を示す。 実施例２において、組成物７に１ｍＭ ＮＡＣを添加した組成物７−３を１０℃にて種々の期間保存後、保存後の組成物を用いてミゾリビン標準液を測定して得た検量線を示す。 実施例３において、ＩＭＰＤＨ、ＡＴＰ及びマグネシウムイオンを主に含有する組成物９を４℃にて種々の期間保存後、保存後の組成物を用いてミゾリビン標準液を測定して得た検量線を示す。 実施例３において、組成物９に５ｍＭ ＤＴＴを添加した組成物９−１を４℃にて種々の期間保存後、保存後の組成物を用いてミゾリビン標準液を測定して得た検量線を示す。 実施例３において、組成物９に５ｍＭ チオグリセロールを添加した組成物９−２を４℃にて種々の期間保存後、保存後の組成物を用いてミゾリビン標準液を測定して得た検量線を示す。 実施例３において、組成物９に５ｍＭ ＮＡＣを添加した組成物９−３を４℃にて種々の期間保存後、保存後の組成物を用いてミゾリビン標準液を測定して得た検量線を示す。 実施例４において、５ｍＭ チオグリセロールを添加したＩＭＰＤＨ、ＡＴＰ及びマグネシウムイオンを主に含有する組成物１０を１０℃にて種々の期間保存後、保存後の組成物を用いてミゾリビン標準液を測定して得た検量線を示す。 実施例４において、組成物１０に０．０７％マンニトールを添加した組成物１０−１を１０℃にて種々の期間保存後、保存後の組成物を用いてミゾリビン標準液を測定して得た検量線を示す。 実施例４において、組成物１０に０．１４％マンニトールを添加した組成物１０−２を１０℃にて種々の期間保存後、保存後の組成物を用いてミゾリビン標準液を測定して得た検量線を示す。 実施例４において、組成物１０に０．７５％（４０ｍＭ）マンニトールを添加した組成物１０−３を１０℃にて種々の期間保存後、保存後の組成物を用いてミゾリビン標準液を測定して得た検量線を示す。 実施例４において、組成物１０に０．１４％トレハロースを添加した組成物１０−４を１０℃にて種々の期間保存後、保存後の組成物を用いてミゾリビン標準液を測定して得た検量線を示す。

以下、本発明を実施するための形態（以下、「本実施の形態」という。）について詳細に説明する。なお、本発明は、以下の本実施の形態に限定されるものではなく、その要旨の範囲内で種々変形して実施することができる。

本実施の形態は、イノシン５’一リン酸脱水素酵素（ＩＭＰＤＨ）と、チオグリセロール及び／又はＮ−アセチル−Ｌ−システイン（ＮＡＣ）とを含有する、ＩＭＰＤＨ含有組成物に関する。

本実施の形態におけるチオグリセロール（α−チオグリセロール、α−Ｔｈｉｏｇｌｙｃｅｒｏｌともいう）は、公知の化合物であり、ＣＡＳ番号９６−２７−５と分類される場合もあり、チオール基を有する。なお、本実施の形態における「チオグリセロール」とは、所望のＩＭＰＤＨ安定化活性を有する限り、その塩、誘導体等であってもよい。

本実施の形態におけるＮＡＣ（Ｎ−アセチルシステイン、Ｎ−Ａｃｅｔｙｌ ｃｙｓｔｅｉｎｅ、（２Ｒ）−ａｃｅｔａｍｉｄｏ−３−ｓｕｌｆａｎｙｌｐｒｏｐａｎｏｉｃ ａｃｉｄともいう）は、公知の化合物であり、ＣＡＳ番号６１６−９１−１と分類される場合もあり、チオール基を有する。なお、本実施の形態における「ＮＡＣ」とは、所望のＩＭＰＤＨ安定化活性を有する限り、その塩、誘導体等であってもよい。

本実施の形態におけるＤＴＴ（ジチオトレイトール、ｄｉｔｈｉｏｔｈｒｅｉｔｏｌともいう）は、公知の化合物であり、ＣＡＳ番号３４８３−１２−３と分類される場合もあり、チオール基を２つ有する。

本実施の形態におけるＩＭＰＤＨは、正反応として、ＮＡＤ（Ｐ）類とＩＭＰからＮＡＤ（Ｐ）Ｈ類とＸＭＰを生ずる反応Ａ、又はこの逆反応に対する触媒作用を主な作用とする酵素である。正反応の場合、ＩＭＰに加えて、アデノシン５’一リン酸、５−メチルウリジン５’一リン酸、グアノシン５’一リン酸、シチジン５’一リン酸、ウリジン５’一リン酸等から選択されるいずれか一つ以上のヌクレオチドや、デオキシアデノシン５’一リン酸、デオキシチミジン５’一リン酸、デオキシグアノシン５’一リン酸、デオキシシチジン、デオキシウリジン５’一リン酸等から選択されるいずれか一つ以上のデオキシヌクレオチドに作用してもよい。一態様において、本実施の形態のＩＭＰＤＨ含有組成物を、後述のミゾリビン又はリバビリンの測定に用いるという観点からは、ＩＭＰＤＨは、ミゾリビンで阻害されず、リン酸化ミゾリビンで阻害される反応を触媒し得る理化学的性質や、リバビリンで阻害されず、リン酸化リバビリンで阻害される反応を触媒し得る理化学的性質を有することが好ましい。本実施の形態におけるＩＭＰＤＨは、上記の反応Ａ又はその逆反応に対する触媒作用を有する限り特に限定されず、また、Ｉ型、ＩＩ型のいずれのアイソザイムであってもよいが、例えば、ＥＣ １．１．１．２０５と分類される酵素を用いることができる。

本実施の形態におけるＩＭＰＤＨの由来は特に限定されず、天然の生物由来であってもよい。例えば、ヒト、大腸菌、Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ、Ｔｒｉｔｒｉｃｈｏｍｏｎａｓ ｆｏｅｔｕｓ、Ｂｒｒｅｌｉａ ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ、ラット、ウサギ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｅｒｅｕｓ由来等公知のＩＭＰＤＨであってもよいし、それらのアイソザイムであってもよく（Ｓ．Ｆ．Ｃａｒｒら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６８巻、２７２８６頁、１９９３年、Ｈ．Ｊ．Ｇｉｌｂｅｒｔら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．、１８３巻、４８１頁、１９７９年、Ｇ．Ａ．Ｋｏｅｈｌｅｒら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．、１７９巻、２３３１頁、１９９７年、Ｆ．Ｇ．Ｗｈｉｔｂｙら、３６巻、１０６６６頁、１９９７年、Ｘ．Ｚｈｏｕら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２７２巻、２１９７７頁、１９９７年等）、典型的な例としては、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属やＯｃｅａｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ属に属する微生物、好ましくは、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ又はＯｃｅａｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｉｈｅｙｅｎｓｉｓ、更に好ましくは、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ ＡＴＣＣ２３８５７株又はＯｃｅａｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｉｈｅｙｅｎｓｉｓ ＤＳＭ１４７３１株、最も好ましくはＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ ＡＴＣＣ２３８５７株由来である。他の菌株バンクで購入できる上記の株との同等株や自然界から分離した同等株由来であってもよい。

本実施の形態におけるＩＭＰＤＨのアミノ酸配列は、上記の所望の活性を有する限り特に限定されない。例えば配列番号１又は配列番号２のアミノ酸配列あるいはこれらの配列において１又は複数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列であってもよい。該アミノ酸配列は、ＩＭＰＤＨオーソログで高く保存されている配列である配列番号３のアミノ酸配列及び配列番号４のアミノ酸配列を含む配列が好ましく、更に、同様に高く保存されている配列でＩＭＰ結合に関連するとされている（J. Biol. Chem., 2004年、 279巻、 40320-40327頁）配列番号５を含む配列がより好ましく、更に、同様に高く保存されている配列で活性中心のループ配列であるとされている（J. Biol. Chem., 2004年、 279巻、 40320-40327頁）配列番号６の配列を含む配列が更に好ましく、特に好ましくは配列番号１又は配列番号２のアミノ酸配列である。配列番号１又は配列番号２におけるアミノ酸の欠失、置換若しくは付加のうち、付加の例としては、Ｎ末端側及び／又はＣ末端側にチオレドキシン酵素等の機能性酵素やその他のアミノ酸配列からなる部分の付加が挙げられる。付加アミノ酸残基としては、シグナルペプチド、ＴＥＥ配列、Ｓタグ又はＨｉｓタグ等が挙げられる。アミノ酸を融合タンパク質とすることも好ましい例として挙げられ、例えば、タンパク質の精製や確認等をすることのできるタグと呼ばれる部分を融合させることができる。場合によっては、タグ部分を削除してもよいし、タグ部分の全部又は一部を残してもよい。さらには、例えば、ＩＭＰＤＨを菌体外やペリプラズム（グラム陰性細菌等の場合）へ輸送する為の約２０個のシグナルペプチドの付加や、効率的な精製を行う為の５から１０個のＨｉｓの付加であってもよい。これらを直列して付加してもよい。これらのアミノ酸配列の間等に数個のプロテアーゼ認識アミノ酸配列を配置して付加することもできる。上記の付加の例と同様に、欠失、又は置換についても、当業者に公知の様々な欠失又は置換を行うことができる。欠失の例としては、Ｎ末端側又はＣ末端側から順にアミノ酸を削除する欠失が挙げられる。例えば、ＩＭＰＤＨの酵素の本質的な機能とは無関係の数個のアミノ酸からなるドメインが存在する場合や、配列番号１又は配列番号２のアミノ酸配列中の複数個のアミノ酸からなるギャップが存在する場合、それらの欠失を組み合わせることもできる。１つのアミノ酸配列において、欠失、置換又は付加を適宜組み合わせることも可能である。本実施の形態におけるＩＭＰＤＨは、配列番号１又は配列番号２のアミノ酸配列において、場合によっては、Ｎ末端のＭｅｔの欠失や、Ｎ末端がアシル基やアルキル基等による修飾を受ける等の翻訳後修飾を受けたものであってもよい。ＩＭＰＤＨを公知の方法で無水コハク酸やＰＥＧ等により化学修飾して、至適ｐＨや安定性等の性質を利用しやすいように変化させたものであってもよい。所望の活性を有する限り、ＩＭＰＤＨの二次構造、三次構造及び四次構造は、特に限定されない。

本実施の形態におけるＩＭＰＤＨを、塩基配列の翻訳によって得る場合に用いる塩基配列は、得られるＩＭＰＤＨが所望の活性を有する限り特に限定されない。例えば配列番号１又は配列番号２のアミノ酸配列をコードする塩基配列の場合、配列番号１又は配列番号２と実質的に均等なアミノ酸配列をコードする塩基配列であってもよく、例えば配列番号１のアミノ酸配列のうち、ＩＭＰＤＨの所望の活性に関与しない一部のアミノ酸を変異させたアミノ酸配列、例えば１又は複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列をコードする塩基配列であってもよい。好ましくは、前記の塩基配列は配列番号１又は配列番号２のいずれかのアミノ酸配列をコードする塩基配列が含まれる塩基配列である。配列番号１又は配列番号２のアミノ酸配列をコードする塩基配列としては、配列番号７又は配列番号８の塩基配列や、その塩基配列を大腸菌や放線菌等宿主のコドン使用頻度に合わせて当業者に公知の手法により変更した塩基配列が例示される。

一態様において、本実施の形態は、リン酸供与体及び／又は金属イオンが混在するＩＭＰＤＨ含有組成物であって、チオグリセロール及び／又はＮＡＣをさらに含有する、前記ＩＭＰＤＨ含有組成物に関する。特に好ましい態様において、本実施の形態は、ＡＴＰ及び／又はマグネシウムイオンが混在するＩＭＰＤＨ含有組成物であって、チオグリセロール及び／又はＮＡＣをさらに含有する、前記ＩＭＰＤＨ含有組成物に関する。

本実施の形態において、「リン酸供与体」としては、例えば、ＡＴＰ、ＩＴＰ、ＵＴＰ、ＣＴＰ、ＧＴＰ、ＴＴＰ又はポリリン酸等のいずれか一つ以上が挙げられ、好ましくはＡＴＰである。一態様において、本実施の形態におけるＩＭＰＤＨ含有組成物がミゾリビン／リバビリン測定試薬である場合、リン酸供与体は、ミゾビリン／リバビリンのリン酸化に寄与する化合物であることが好ましく、ＡＴＰが特に好ましい。

本実施の形態において、ＡＴＰ（アデノシン５’−三リン酸、Ａｄｅｎｏｓｉｎｅ Ｔｒｉ−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ、５−(６−アミノプリン−９−イル)−３，４−ジヒドロキシオキソフラン−２−イルメトキシヒドロキシホスホリルオキシヒドロキシホスホリルオキソリン酸ともいう）は、公知のＡＴＰを含み、ナトリウム塩等を形成した塩としてＩＭＰＤＨ含有組成物中に含有されてもよい。

本実施の形態において、「金属イオン」としては、例えば、マグネシウムイオン、ニッケルイオン、コバルトイオン等が挙げられ、好ましくは２価の金属イオンであり、より好ましくはマグネシウムイオンである。一態様において、本実施の形態におけるＩＭＰＤＨ含有組成物がミゾリビン／リバビリン測定試薬である場合、金属イオンは、ミゾビリン／リバビリンリン酸化酵素の補因子となる金属イオンであることが好ましく、マグネシウムイオンが特に好ましい。

本実施の形態において、例えばマグネシウム（Ｍｇ）イオンは、マグネシウムイオン（Ｍｇ^２＋等）自体及び水溶液中でマグネシウムイオンとなるマグネシウムを含み、塩を形成した塩化マグネシウム、硫酸マグネシウム、酢酸マグネシウム等としてＩＭＰＤＨ含有組成物中に含有されてもよい。本実施の形態における他の金属イオンについても同様である。

本実施の形態において、リン酸供与体及び／又は金属イオンが混在するＩＭＰＤＨ含有組成物（例えば、ＡＴＰ及び／又はマグネシウムイオンが混在するＩＭＰＤＨ含有組成物）とは、リン酸供与体及び／又は金属イオンが前記組成物に混在する場合のみならず、混在すると予想される場合も含む。好ましくは、前記組成物は、リン酸供与体及び金属イオンが混在する組成物である。また、本実施の形態において混在とは、前記組成物に意図的に混在させる場合と意図せずに混在する場合を含む。リン酸供与体及び／又は金属イオンが混在するＩＭＰＤＨ含有組成物において、リン酸供与体及び／又は金属イオンとＩＭＰＤＨとが同時に存在する限り、それぞれの量、存在比及び同時に存在している時間は限定されない。混在するリン酸供与体及び／又は金属イオンの量は特に限定されず、後述する細胞や培地中に存在する程度の量でもよいが、これらの存在下でも安定してＩＭＰＤＨを含む組成物を提供するという観点からは、ＩＭＰＤＨの１当量以上が好ましく、後述する濃度であれば更に好ましい。

なお本発明の一態様としては、ＤＴＴを実質的に含まない、前記のＩＭＰＤＨ含有組成物、特にリン酸供与体及び／又は金属イオンが混在する前記ＩＭＰＤＨ含有組成物（例えば、ＡＴＰ及び／又はマグネシウムイオンが混在するＩＭＰＤＨ含有組成物）が好ましい例として挙げられる。ＤＴＴは、一定の条件下、例えばＡＴＰとマグネシウムイオンの存在下においては、ＩＭＰＤＨの不安定化に働くことがあり、その場合には、ＤＴＴを、例えば検出限界以下とすることが好ましい。そのような場合の例として、ＤＴＴ含有量が０．１ｍＭ以下、好ましくは０．０５ｍＭ以下、より好ましくは０．０１ｍＭ以下であることが例示される。同様に、ＤＴＴの分解物や酸化されたＤＴＴも実質的に含まない前記ＩＭＰＤＨ含有組成物も、好ましい例として挙げられる。

本実施の形態におけるＩＭＰＤＨ含有組成物の用途は限定されない。例えば、該ＩＭＰＤＨ含有組成物の用途としては、前記のＩＭＰＤＨの酵素反応（逆反応）を利用した、物質変換における作用剤としての用途が挙げられ、その例としてはイノシン又はＩＭＰ（イノシン酸と呼ばれる場合がある）の合成が挙げられる。その他の用途としては試薬としての用途が挙げられ、その例としてはプリンヌクレオチド生合成経路の解析試薬、新規ＩＭＰＤＨ阻害剤のスクリーニング用の試薬等が挙げられる。好ましい試薬の例としてはＩＭＰＤＨの阻害剤（例えば、ミゾリビン５’一リン酸、リバビリン５’一リン酸、ミコフェノール酸等）、ＩＭＰＤＨの基質（例えば、ＩＭＰ、ＸＭＰ等）、ＩＭＰＤＨの補酵素（例えば、酸化型ＮＡＤ（Ｐ）類、還元型ＮＡＤ（Ｐ）類等）又はこれらの前駆体（例えば、ミゾリビン、リバビリン、後述の各種ミコフェノール酸前駆体等）等を測定するための測定試薬が挙げられる。一態様において、本実施の形態におけるＩＭＰＤＨ含有組成物の用途は、ＩＭＰ、ＸＭＰ、酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド類（酸化型ＮＡＤ（Ｐ）類）、還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド類（還元型ＮＡＤ（Ｐ）類）、ミゾリビン５’一リン酸、リバビリン５’一リン酸、ミコフェノール酸並びにミゾリビン及びリバビリンを含むこれらの前駆体からなる群から選ばれるいずれかの化合物の測定であることが好ましく、ミゾリビン及び／又はリバビリンの測定であることが更に好ましい。

本実施の形態におけるＩＭＰＤＨ含有組成物を、ＩＭＰＤＨの阻害剤を測定するための試薬として用いる際の具体例を以下に説明する。ＩＭＰＤＨは、例えば、ＩＭＰをＮＡＤの存在下、ＸＭＰとＮＡＤＨに変換する酵素であるため、測定対象とするＩＭＰＤＨ阻害剤の存在下又は非存在下で、上記の反応を行い、反応生成物の濃度変化から、ＩＭＰＤＨ阻害剤の濃度を測定することができる。

本実施の形態におけるＩＭＰＤＨ含有組成物を、ＩＭＰＤＨの基質を測定するための試薬として用いる際には、例えば、ＩＭＰＤＨの補酵素とＩＭＰＤＨを含有する溶液中、ＩＭＰＤＨの基質の存在下又は非存在下で、ＩＭＰＤＨの酵素反応を行い、反応生成物の濃度変化から、ＩＭＰＤＨの基質の濃度を測定することができる。同様に、本実施の形態におけるＩＭＰＤＨ含有組成物を、ＩＭＰＤＨの補酵素を測定するための試薬として用いる際には、例えば、ＩＭＰＤＨの基質とＩＭＰＤＨを含有する溶液中、ＩＭＰＤＨの補酵素の存在下又は非存在下で、ＩＭＰＤＨの酵素反応を行い、反応生成物の濃度変化から、ＩＭＰＤＨの補酵素の濃度を測定することができる。

また、本実施の形態におけるＩＭＰＤＨ含有組成物を、上記のＩＭＰＤＨの阻害剤、ＩＭＰＤＨの基質又はＩＭＰＤＨの補酵素の前駆体を測定するための試薬として用いる際には、前駆体を上記の各阻害剤等に変換した後、上記と同様の手法を用いることにより、それぞれの前駆体の濃度を測定することができる。

本実施の形態におけるミゾリビン（Ｍｉｚｏｒｉｂｉｎｅ、４−ｃａｒｂａｍｏｙｌ−１−β−Ｄ−ｒｉｂｏｆｕｒａｎｏｓｙｌｉｍｉｄａｚｏｌｉｕｍ−５−ｏｌａｔｅともいう）又はリバビリン（Ｒｉｂａｖｉｒｉｎ、１−β−Ｄ−ｒｉｂｏｆｕｒａｎｏｓｙｌ−１Ｈ−１，２，４−ｔｒｉ−ａｚｏｌｅ−３−ｃａｒｂｏｘａｍｉｄｅともいう）は、公知の化合物であり、それぞれＣＡＳ番号５０９２４−４９−７又は３６７９１−０４−５と分類される場合もある。ミゾリビンはブレデニン等という商品名で市販されている場合もある。

ミゾリビンは、主に免疫抑制剤として使用されている低分子化合物であるが、各個人に最適な投与を行うためには、血中ミゾビリン濃度を測定しながら投与量を調整することが必要であるという指摘がある（今日の移植 ＶＯＬ．１９ ＮＯ．５ ＳＥＰＴＥＭＢＥＲ ２００６年 ５６７頁）。従って、ミゾリビン濃度の正確な測定は非常に重要度が高い。なお、リン酸化ミゾビリン、リン酸化リバビリンは、ＩＭＰＤＨ阻害作用を有することが知られている（Biochemical Pharmacology、４９巻、９号、１３２３頁、１９９５年）。リン酸化ミゾリビン又はリン酸化リバビリンは、ミゾリビン又はリバビリンにリン酸基が結合した物質であり、リン酸基の数は１、２又は３であることができるが、好ましくは１である。すなわち、モノリン酸化ミゾリビン又はモノリン酸化リバビリンが好ましい。リン酸化され得る部位は特に限定されず、ミゾリビン又はリバビリンの糖部分、すなわちリボース部分の任意の水酸基であることができ、例えば１’位、２’位、又は５’位のリン酸化が挙げられ、場合によってはリングを形成してもよい。例えばモノリン酸化ミゾリビン又はモノリン酸化リバビリンの場合は、５’位が好ましく、すなわち、ミゾリビン５’一リン酸又はリバビリン５’一リン酸が好ましい。

本実施の形態におけるミコフェノール酸（Ｍｙｃｏｐｈｅｎｏｌｉｃ ａｃｉｄともいう）は、公知の化合物であり、ＣＡＳ番号２４２８０−９３−１と分類される場合もある。ミコフェノール酸はＩＭＰＤＨ阻害作用を有することが知られている（Biochemical Pharmacology、４９巻、９号、１３２３頁、１９９５年）。一態様において、本実施の形態におけるミコフェノール酸は、ＩＭＰＤＨの阻害活性有する限り特に限定されず、硫酸、酢酸、グルタチオン、グルクロン酸と抱合される等、代謝されたミコフェノール酸、ミコフェノール酸類縁体等を含む。ミコフェノール酸の前駆体としては、ミコフェノール酸モフェチル（（Ｅ）−６−（１，３−ジヒドロ−４−ヒドロキシ−６−メトキシ−７−メチル−３−オキソ−５−イソベンゾフラニル)−４−メチルヘキセン酸２−（４−モルフォリニル）エチルエステルともいう）という場合がある。

本実施の形態におけるＮＡＤ（Ｐ）類（ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（リン酸）ともいう）は、それ自体又はその類縁体がＩＭＰＤＨの補酵素としての活性を有する限り特に限定されず、ＮＡＤ（Ｐ）、デアミドＮＡＤ（Ｐ）、チオＮＡＤ（Ｐ）、ニコチンアミドグアニンジヌクレオチド（リン酸）、ニコチンアミドヒポキサンチンジヌクレオチド（リン酸）等が挙げられ、そのうちいずれか一つ以上であってもよいが、ＮＡＤが好ましい。本実施の形態において、還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド類（還元型ＮＡＤ（Ｐ）類）、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ類とは、上記ＮＡＤ（Ｐ）類の還元型である。

本実施の形態において、ＡＴＰ、ＮＡＣ、チオグリセロール、ミゾリビン、リバビリン、ミコフェノール酸等の化合物や添加物は、それぞれ所望の性質を有する限り、その由来、剤型、結晶型、添加物、商品名等により限定されない。

本実施の形態において、ＩＭＰＤＨ含有組成物中のＩＭＰＤＨは安定であり、特に溶液の形態のＩＭＰＤＨ含有組成物中においても安定である。また、後述するように、一態様において、本実施の形態は、ＩＭＰＤＨの安定化方法に関する。ここで、「ＩＭＰＤＨの安定化」は、Ｘ線回折や円偏光二色性スペクトルを利用したＩＭＰＤＨの立体構造、電気泳動やゲル濾過等を利用したポリペプチドの状態、又は理化学的性質を指標として確認することができるが、本実施の形態におけるＩＭＰＤＨ含有組成物を、ＩＭＰＤＨの酵素反応を利用するために用いるという観点からは、後述するＩＭＰＤＨの活性を指標として確認することが好ましい。

一態様において、本実施の形態は、ＩＭＰＤＨ含有組成物の安定化方法であって、チオグリセロール及び／又はＮＡＣを前記組成物に添加する工程を含む安定化方法に関する。該安定化方法において、ＩＭＰＤＨ含有組成物が安定であるか否かは、例えば、ＩＭＰＤＨ含有組成物において、チオグリセロール及び／又はＮＡＣを添加した場合と、添加しない場合とで、どちらの場合のＩＭＰＤＨが安定化しているかを比較することで判断することができる。例えば、ＩＭＰＤＨに温度や保存（期間）等の負荷を加えた条件下で、該比較を行うことができる。一般的には、温度は高いほど高負荷となり、保存（期間）は長いほど高負荷となる。そのような条件と、特に溶液の形態であるＩＭＰＤＨ含有組成物の安定化の指標の好ましい例を挙げれば、添加物を添加せずに、ＡＴＰ及びマグネシウムイオンの存在下、ＩＭＰＤＨ含有組成物を１０℃で７日間又は１４日間保存し、ＩＭＰＤＨの残存活性が保存前の８０％又は６９％以下になる条件において、チオグリセロール及び／又はＮＡＣ等を添加した場合には、ＩＭＰＤＨの残存活性が保存前の８５％又は７５％以上となる例が挙げられる。また、添加物を添加せずに、ＡＴＰ及びマグネシウムイオンの存在下、ＩＭＰＤＨを２５℃で７日間又は１４日間保存し、ＩＭＰＤＨの残存活性が保存前の４１％又は２３％以下になる条件において、チオグリセロール及び／又はＮＡＣ等を添加した場合には、７０％又は４１％以上となる例が挙げられる。例えば試薬として用いるという観点からは、ＡＴＰ及びマグネシウムイオンが混在するＩＭＰＤＨ含有組成物は、凍結保存した場合、１年以上安定であれば好ましく、１年半以上安定であれば更に好ましく、２年以上安定であれば最も好ましい。ＡＴＰ及びマグネシウムイオンが混在するＩＭＰＤＨ含有組成物を凍結乾燥させた場合には、その状態で、２５℃以下において１年以上安定であれば好ましく、１年半以上安定であれば更に好ましく、２年以上安定であれば最も好ましい。凍結乾燥状態である該組成物を、溶解（再構成）した溶液の形態の場合、１０℃以下において１週間以上安定であれば好ましく、１ヶ月以上安定であれば更に好ましく、２ヶ月以上安定であれば最も好ましい。

本実施の形態における、ＩＭＰＤＨ含有組成物を特定の用途に用いる場合、該組成物に温度や保存（期間）等の負荷を加えた後に、該特定の用途に該組成物を用いることができることが望ましい。例えば、ＡＴＰ及びマグネシウムイオンが混在する、特に溶液の形態である前記ＩＭＰＤＨ含有組成物を、ミゾリビンを測定する目的（ミゾリビン測定用試薬）で用いる場合、１０℃で６日間保存した後にもミゾリビンの測定が可能であることが好ましく、１１日間保存した後にも測定が可能であることがより好ましく、２１日保存した後にも測定が可能であることが更に好ましい。ミゾリビン測定用試薬に異なる条件の負荷を加えた場合の例としては、４℃で１５日間保存した後にもミゾリビンの測定でが可能であることが望ましく、２２日間保存した後にも測定が可能であることが好ましく、２９日間保存した後にも測定が可能であることがより好ましく、４９日間保存した後にも測定が可能であることが更に好ましい。なお、上記ＩＭＰＤＨ含有組成物の安定性は、通気条件、湿度、気圧等により影響される場合がある。例えば、該組成物が溶液の形態である場合は、該組成物の容器を密栓して保存する方が開栓して保存するより一般的には安定性が向上する。該組成物が凍結乾燥状態を含む固体状態である場合は、低湿度下で保存する方が高湿度下で保存するより一般的には安定性が向上し、低湿度低気圧下で保存すれば更に安定性は向上する。

本実施の形態において、ＩＭＰＤＨ含有組成物は、チオグリセロール、ＮＡＣ又はチオグリセロール及びＮＡＣを含有することで、ＩＭＰＤＨ含有組成物中のＩＭＰＤＨが安定化する。チオグリセロール及びＮＡＣ以外で、ＩＭＰＤＨ含有組成物中のＩＭＰＤＨを安定化し得る化合物として、ＩＭＰＤＨを含むＳＨ酵素に関して公知である安定化剤のうち、所望の安定化作用を示す化合物が挙げられる。例えば、セミカルバジド、ＴＣＥＰ、β−メルカプトプロピオン酸、システイン、チオグルコース、システアミン、グルタチオン、メルカプト琥珀酸、メルカプト酢酸、臭化２−アミノエチルイソチオウロニウム、２−メルカプトエタンスルホン酸、又はメルカプトエタノール等から選択される化合物、より好ましくは、システイン、グルタチオン（特に還元型）、メルカプト琥珀酸、ＴＣＥＰ塩酸塩及びチオグルコースから選択される化合物は、これら単独であっても、ＩＭＰＤＨ含有組成物に添加した際にＩＭＰＤＨの安定化作用を示しうる。より高いＩＭＰＤＨの安定化作用を得るという観点からは、これらを、チオグリセロール及び／又はＮＡＣと組み合わせて、ＩＭＰＤＨ含有組成物に添加することが好ましい。従って、本実施の形態は、一態様において、チオグリセロール及び／又はＮＡＣに加えて、上記の化合物の一種以上をさらに含む、ＩＭＰＤＨ含有組成物、ＩＭＰＤＨ含有組成物の安定化剤ならびにＩＭＰＤＨ含有組成物におけるＩＭＰＤＨの安定化方法にも関する。

本実施の形態において、ＩＭＰＤＨ含有組成物におけるＩＭＰＤＨ濃度は特に限定されず、該組成物やＩＭＰＤＨの製造方法や該組成物の用途に応じて適宜設定することができる。例えば、微生物や動物等の細胞からＩＭＰＤＨを製造する場合、該ＩＭＰＤＨは、該細胞や培地由来のリン酸供与体及び／又は金属イオンが混在するＩＭＰＤＨ含有組成物となり得る。さらに、その後の塩析や熱処理等の固液分離工程やカラムクロマトグラフィー工程等の精製工程中もＩＭＰＤＨにリン酸供与体及び／又は金属イオンが混在（残留）する可能性があるが、これらの工程後に得られるＩＭＰＤＨ含有組成物中のＩＭＰＤＨ濃度は、一般に培養スケールや製造スケール等に応じて変化する。通常、ＩＭＰＤＨ製造におけるＩＭＰＤＨ濃度は、加水濃縮脱塩工程であれば例えば０．０１Ｕ／ｍＬ程度に希釈し、硫安沈殿工程であれば例えば１００Ｕ／ｍＬ以上に濃縮する場合もある。また、ＩＭＰＤＨ濃度を、前記ＩＭＰＤＨ含有組成物の用途によって変化させる例としては、物質変換の用途の場合に望ましい濃いＩＭＰＤＨ濃度、例えば１００〜１０００Ｕ／ｍＬ等とすることが挙げられる。また、試料の測定の用途（試薬）に利用する場合、レートアッセイであれば例えば１Ｕ／ｍＬ以下、エンドポイントアッセイであれば例えば１〜１０Ｕ／ｍＬ程度のＩＭＰＤＨ濃度の組成物を使用し得る。また、ＩＭＰＤＨ活性を測定するための試薬（組成物）中にリン酸供与体及び／又は金属イオンが混在する場合も想定されるが、この場合のＩＭＰＤＨ濃度は通常０．１Ｕ／ｍＬ以下である。

本実施の形態において、特にＩＭＰＤＨ含有組成物が溶液の形態であることが好ましい。ＩＭＰＤＨ含有組成物の安定化方法における前記組成物中のＩＭＰＤＨ濃度の下限値は特に限定されないが、通常０．０１Ｕ／ｍＬ以上が例示でき、０．１Ｕ／ｍＬ以上が好ましく、１Ｕ／ｍＬ以上が更に好ましい。同様に、前記組成物中のＩＭＰＤＨ濃度の上限値は特に限定されないが、特にＩＭＰＤＨ含有組成物が溶液の形態である場合、通常１０００Ｕ／ｍＬ以下が例示でき、５００Ｕ／ｍＬ以下が好ましく、２００Ｕ／ｍＬ以下が更に好ましい。

本実施の形態において、ＩＭＰＤＨと、チオグリセロール及び／又はＮＡＣとを含有するＩＭＰＤＨ含有組成物中のチオグリセロール又はＮＡＣの濃度は特に限定されず、前記組成物の製造方法や用途に応じて適宜変更し得る。例えば、ＩＭＰＤＨ製造時のＩＭＰＤＨ含有組成物においては、該濃度は１〜５ｍＭとなり得る。凍結保存を含む低温で前記ＩＭＰＤＨ含有組成物を保存する際には、該濃度は０．５ｍＭ程度となり得る。ＩＭＰＤＨ含有組成物中のチオグリセロール又はＮＡＣの濃度は、ＩＭＰＤＨ含有組成物が溶液の形態である場合、一般的には１ｍＭ以上２０ｍＭ以下が例示でき、例えば１００ｍＭ以上では過剰な場合もある。過剰な濃度であるかどうかの判断は、例えば、前記組成物中に沈殿、濁り、発色、変色、ｐＨ変化等が発生するかどうかで判断することができる。本実施の形態の、ＩＭＰＤＨ含有組成物の安定化方法において前記組成物中に添加されるチオグリセロールやＮＡＣの濃度の下限値は特に限定されないが、特にＩＭＰＤＨ含有組成物が溶液の形態である場合、通常それぞれ０．１ｍＭ以上が例示でき、１ｍＭ以上が好ましく、５ｍＭ以上が更に好ましい。同様に、上限値は特に限定されしないが、特にＩＭＰＤＨ含有組成物が溶液の形態である場合、通常それぞれ１００ｍＭ以下が例示でき、５０ｍＭ以下が好ましく、２０ｍＭ以下が更に好ましい。

本実施の形態において、チオグリセロール及び／又はＮＡＣを含有するＩＭＰＤＨ含有組成物中のＩＭＰＤＨと、チオグリセロール又はＮＡＣとの存在比率は、ＩＭＰＤＨ含有組成物がいずれの形態であっても特に限定されないが、下限としては、ＩＭＰＤＨ １Ｕ当たりのチオグリセロール又はＮＡＣが、通常０．０２μｍｏｌ以上が例示され、０．１μｍｏｌ以上が好ましく、１μｍｏｌ以上であれば更に好ましく、１０μｍｏｌ以上であれば更により好ましく、３１．２５μｍｏｌ以上であれば最も好ましい。また上限としては、ＩＭＰＤＨ １Ｕ当たりのチオグリセロール又はＮＡＣが、２００μｍｏｌ以下であることが好ましい例として挙げられ、１２５μｍｏｌ以下が更に好ましく、１００μｍｏｌ以下が最も好ましい。

また、チオグリセロールとＮＡＣが共存する形態であってもよい。その場合は、チオグリセロールとＮＡＣの存在量がそれぞれ上述の上限及び下限の範囲となることが好ましい例として挙げられ、チオグリセロールとＮＡＣとを合算して、上述の上限及び下限の範囲となることもさらに好ましい例として挙げられる。

本実施の形態において、ＩＭＰＤＨ含有組成物が、チオグリセロール及びＮＡＣを含有する場合又はＩＭＰＤＨ含有組成物にこれらを添加する場合、２成分のそれぞれの濃度、存在比及び同時に存在している時間は限定されない。チオグリセロール及びＮＡＣの濃度は好ましくはそれぞれ上記の濃度であり、一態様において、特にＩＭＰＤＨ含有組成物が溶液の形態である場合、それぞれの濃度を合算して１ｍＭ以上２０ｍＭ以下であることが好ましい場合もある。１ｍＭ以下では十分なＩＭＰＤＨ安定化効果が得られないことがあり、２０ｍＭ以上ではＩＭＰＤＨ含有組成物に濁りやｐＨの経時変化による悪影響が生じ得る。本実施の形態において、ＩＭＰＤＨ含有組成物がチオグリセロール及びＮＡＣを含有する場合、通常は意図的に含有させるが、ＩＭＰＤＨにチオグリセロール又はＮＡＣが含有している場合など意図せずに含有する場合もある。

本実施の形態におけるＩＭＰＤＨ含有組成物は、凍結乾燥状態を含む固体状態、濾紙上や薄膜間に存在させた状態及びそれらを乾燥した状態、電極やゲル等の担体に固定化した状態等とし得る。例えば、本実施の形態のＩＭＰＤＨ含有組成物を凍結乾燥させる際の母液中のＩＭＰＤＨ並びにチオグリセロール及び／又はＮＡＣの濃度は、上記のＩＭＰＤＨ含有組成物中の濃度よりも濃くする場合がある。一般的には上記の濃度のＩＭＰＤＨ含有組成物を１倍より濃くなるように濃縮した母液を凍結乾燥し、溶解液が上記の濃度となるように、例えば純水や緩衝液で用事溶解して使用する。すなわち、本実施の形態におけるＩＭＰＤＨ含有組成物中のＩＭＰＤＨ並びにチオグリセロール及び／又はＮＡＣの濃度は、溶液の濃縮倍率に応じて濃くなるが、ＩＭＰＤＨ含有組成物中のＩＭＰＤＨ並びにチオグリセロール及び／又はＮＡＣの濃度比率は変動しない。また、凍結乾燥状態においては、ＩＭＰＤＨ並びにチオグリセロール及び／又はＮＡＣは、母液中の濃度比率で存在する。本実施の形態におけるＩＭＰＤＨ含有組成物を、濾紙上や薄膜中で乾燥させるための母液とする場合も同様である。本実施の形態におけるＩＭＰＤＨ含有組成物中に、他の物質を存在させる場合の濃度についても同様である。

本実施の形態におけるＩＭＰＤＨ含有組成物に含有される、チオグリセロール及びＮＡＣを含む上記の添加物は、前記ＩＭＰＤＨ含有組成物中のＩＭＰＤＨの安定性や、添加物の臭い、揮発性、昇華性、安定性等の添加物の性質や、添加物の価格、安全性、有害性等を考慮して適宜選択し、適切な濃度で含有させることができる。例えば複数の添加物を含有させる場合、添加物同士の存在比率についても同様に適宜決定することができる。添加物選択に考慮が必要な例としては、例えば、揮発性の高い添加物を含有する組成物を凍結乾燥する場合、凍結乾燥中に該添加物が昇華するために凍結乾燥装置内に該添加物が蒸着し、次回以降の凍結乾燥作業や凍結乾燥品の品質に影響を与える場合がある。また、揮発性の高い添加物を含有する溶液の形態の組成物（試薬）を、生化学自動分析機などの試薬庫で開栓して保存すると、試薬庫内の他の組成物（試薬）にエアーコンタミネーションにより影響を与える場合がある。

本実施の形態において、ＩＭＰＤＨ含有組成物の安定化方法は様々な場面において有用であり、例えば、上記のＩＭＰＤＨの製造時、後述するＩＭＰＤＨの保存時に用いることができる。ＩＭＰＤＨ含有組成物を、ＩＭＰＤＨの酵素反応を利用した組成物として用いる場合には、ＩＭＰＤＨの活性を安定して利用することができるため、特に好ましく上記の安定化方法を用いることができる。

本実施の形態のＩＭＰＤＨ含有組成物は、例えば、複数の試薬を組み合わせた、ＩＭＰＤＨの酵素反応を利用して試料を測定するためのキットを構成する一試薬であってもよい。例えば、ＩＭＰＤＨならびにＮＡＣ及び／又はチオグリセロールを含む本実施の形態のＩＭＰＤＨ含有組成物を試薬１とし、ＡＴＰ及びＭｇを含む試薬２と、試料を測定する際に混和して、ＩＭＰＤＨの酵素反応を利用した測定に用いてもよい。

本実施の形態において、ＩＭＰＤＨ含有組成物は水溶液、有機溶媒溶液等の溶液の形態であることができるが、利便性という観点からは、好ましくは水溶液である。ＩＭＰＤＨ含有組成物が水溶液である場合、ＩＭＰＤＨの安定化という観点から、適宜ｐＨ緩衝剤を用いることが好ましい。ｐＨ緩衝剤は、目的のｐＨを保つことができれば特に限定されないが、グッドのｐＨ緩衝液、Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ緩衝液、リン酸カリウム緩衝液、酢酸／ＮａＯＨ緩衝液、クエン酸／ＮａＯＨ緩衝液が例示できる。ＩＭＰＤＨ含有組成物が水溶液である場合、そのｐＨは、下限としてｐＨ４以上、好ましくはｐＨ４．８以上、更に好ましくはｐＨ５．２以上が例示され、上限としてはｐＨ８．５以下、好ましくはｐＨ８以下、更に好ましくはｐＨ７．５以下が例示される。ｐＨ緩衝剤の濃度は目的のｐＨを保つことができる限り特に限定されないが、下限として３ｍＭ以上、好ましくは５ｍＭ以上、更に好ましくは１０ｍＭ以上が例示され、上限としては５００ｍＭ以下、好ましくは２００ｍＭ以下、更に好ましくは１００ｍＭ以下が例示される。一態様において、本実施の形態のＩＭＰＤＨ含有組成物は、例えばゾル・ゲル又は乳濁液であることができる。ゾル・ゲルは、例えば、前記の溶液に寒天等の多糖類を添加することで得ることができる乳濁液は、例えば、当業者に公知の手法により、前記の溶液やゾル・ゲルから、有機溶媒等を用いて得ることができる。両親媒性物質を利用してミセルとして得ることもできる。一態様において、本実施の形態におけるＩＭＰＤＨ含有組成物は、組成物中の各成分の濃度を１倍より濃くなるよう濃縮した溶液の形態、該溶液又は該濃縮溶液の凍結物、乾燥物、凍結乾燥物であってもよく、長期間安定して保存する場合には、該溶液又は該濃縮溶液の凍結乾燥物が好ましい。さらには、該乾燥物又は凍結乾燥物を水や緩衝液で再溶解した溶液の形態であってもよい。濃縮、乾燥、凍結、凍結乾燥等は、当業者に公知の手法を用いて行うことができ、例えば、乾燥には、スプレードライ、加熱乾燥、風乾、減圧乾燥等の手法を用いることができる。本実施の形態におけるＩＭＰＤＨ含有組成物は、特に好ましい態様において、使用時までは凍結乾燥状態で保存し、使用時に例えば純水や緩衝液で溶解し、溶解後はそのまま水溶液として保存する。

本実施の形態において、ＩＭＰＤＨ含有組成物が、ＩＭＰＤＨの酵素反応を利用して、試料（検体ともいう）中の特定の成分を測定するための組成物（試薬）である場合、該試料は、特に限定されないが、全血、血漿、血清、血球、髄液、リンパ液、尿等の排泄物、その他体液を含む生体試料や研究用試料及びそれらの抽出物や標準液等を挙げることができる。それらの試料はＩＭＰＤＨの酵素反応を利用して測定することができる成分を含むと予想される試料であることが好ましく、一態様において、前記試料はミゾリビン及び／又はリバビリンを含有すると予想される試料であることが好ましく、正確な測定値を得るという観点からは、ミゾリビン又はリバビリンのいずれか一方を含有すると予想される試料であることが更に好ましい。例えば、試料が生体試料である場合、ミゾリビン及び／又はリバビリンの標的臓器、例えば、白血球、肝細胞、ウィルス感染細胞等を選別して試料とすることも好ましく、特に試料が白血球の場合には、更に、Ｔ細胞、Ｂ細胞、リンパ球等を選別して試料とすることも好ましい。ミゾリビン及び／又はリバビリンを含有すると予想される生体試料を取得する場合、取得方法は公知の方法を用いることができる。例えば全血を取得する場合には、分離剤や抗プラスミン剤等の使用の有無は特に限定されず、ＥＤＴＡ、フッ化ナトリウム、クエン酸ナトリウム、ヘパリンナトリウム等の抗凝固剤や解糖阻止剤の使用の有無も特に限定されない。生体試料以外の試料としては、例えば、海水、天然水、果汁、飲料、廃液等が挙げられる。

リン酸化されたミゾリビン又はリバビリンは、ＩＭＰＤＨの阻害活性を有する。本実施の形態におけるＩＭＰＤＨ含有組成物を、特に、ミゾリビン又はリバビリン等、ＩＭＰＤＨ阻害剤の前駆体を測定するための組成物として用いる場合、該組成物は［ミゾリビン、及び／又はリバビリンをリン酸化する酵素］（以下、酵素Ｐということもある）を含有することが好ましい。該酵素Ｐは、ミゾリビン及び／又はリバビリンをリン酸化し得る酵素であれば特に限定されず、例えば、リン酸供与体の存在下、ヌクレオシドをリン酸化ヌクレオシドとなす反応を触媒することが知られる酵素から選択することができ、アデノシンキナーゼやホスホフルクトキナーゼ−Ｂを含むヌクレオシドキナーゼ、又はホスファターゼ等も利用可能である。該酵素Ｐの由来は特に限定されず、例えば天然の生物由来であってもよい。微生物由来の該酵素Ｐとしては、大腸菌由来のグアノシンイノシンキナーゼ、Ｍｅｔｈａｎｏｃａｌｄｏｃｏｃｃｕｓ ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ由来のホスホフルクトキナーゼ−Ｂ、Ａｒｃｈａｅｏｇｌｏｂｕｓ ｆｕｌｇｉｄｕｓ由来のホスホフルクトキナーゼ−Ｂと予想されるタンパク質が挙げられる。その他の微生物由来の酵素Ｐとしては、パン酵母やマイコバクテリウム由来であって、ミゾリビン及び／又はリバビリンをリン酸化し得るアデノシンキナーゼが挙げられる。また、入手が困難であり必ずしも効率が高いとは言えないものの、哺乳類由来の酵素であってもよく、例えば、ヒト由来のアデノシンキナーゼやマウス、ラット、ウサギ等の、公知のアデノシンキナーゼが挙げられる。ミゾリビンに対する特異性が高いという観点からは、好ましい例として、例えばＢｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ属やその近縁のＸａｎｔｈｏｍｏｎａｓ属等、好ましくはＢｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｔｈａｉｌａｎｄｅｎｓｉｓ、最も好ましくは、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｔｈａｉｌａｎｄｅｎｓｉｓ ＤＳＭ１３２７６株由来のミゾリビン及び／又はリバビリンをリン酸化し得る酵素が挙げられる。該酵素Ｐは、ミゾリビン及び／又はリバビリンをリン酸化し得る限りそのアミノ酸配列は限定されず、例えば配列番号９のアミノ酸配列であってもよい。該アミノ酸配列は、リボースの結合に関連すると予想される配列番号１０のアミノ酸配列及びＡＴＰ、リボース、マグネシウムの結合に関連すると予想される配列番号１１のアミノ酸配列を含む配列であることが好ましく（但し、配列番号１０及び１１中、Ｘａａは任意のアミノ酸を示す）、最も好ましくはミゾリビンに対する特異性の高い配列番号９のアミノ酸配列である。酵素Ｐのアミノ酸配列におけるアミノ酸の欠失、置換、付加、翻訳後修飾、化学修飾及び高次構造の例はＩＭＰＤＨのアミノ酸配列の場合と同様、当業者に公知の様々な例を挙げることができる。

本実施の形態におけるＩＭＰＤＨ含有組成物が、ミゾリビン又はリバビリンを測定するための試薬であって、酵素Ｐを含有する場合、該酵素Ｐの量は、例えば、測定対象となる試料に含まれるミゾリビン及び／又はリバビリンの存在量が１ｍＭ以下でその全てをリン酸化しようとする場合、下限値は０．０１Ｕ／ｍＬ、好ましくは０．０５Ｕ／ｍＬ以上、更に好ましくは０．１Ｕ／ｍＬ以上であり、上限値は特に限定されないが、５Ｕ／ｍＬ以下、好ましくは２Ｕ／ｍＬ以下、更に好ましくは１Ｕ／ｍＬ以下である。

本実施の形態におけるＩＭＰＤＨ含有組成物が、ミゾリビン及び／又はリバビリンを測定するための試薬であって、ミゾリビン、及び／又はリバビリンをリン酸化するために、リン酸供与体を含有させる場合、該リン酸供与体は、ＡＴＰ、ＩＴＰ、ＵＴＰ、ＣＴＰ、ＧＴＰ、ＴＴＰ又はポリリン酸等のいずれか一つ以上であることができるが、経済性の観点からは、ＡＴＰが特に好ましい。該リン酸供与体の量は、試料中のミゾリビン又はリバビリンの量に応じて適宜変更できる。例えば、ＡＴＰの場合、下限値が０．１ｍＭ、好ましくは１ｍＭ以上、更に好ましくは５ｍＭ以上が例示され、上限値は特に限定されないが、好ましくは５００ｍＭ以下、更に好ましくは２００ｍＭ以下、特に好ましくは５０ｍＭ以下が例示され、試料中のミゾリビン又はリバビリンの量が多い場合は、ＡＴＰの濃度も高くすることが好ましい。

本実施の形態におけるＩＭＰＤＨ含有組成物に、ＩＭＰＤＨの基質であるＩＭＰを含有する場合、該ＩＭＰの量は、ＩＭＰＤＨの基質となるという観点から、その下限値は１ｍＭ、好ましくは３ｍＭ以上、更に好ましくは５ｍＭ以上が例示される。また、その上限値は特に限定されいが、好ましくは１００ｍＭ以下、更に好ましくは５０ｍＭ以下、特に好ましくは３０ｍＭ以下が例示される。本実施の形態におけるＩＭＰＤＨ含有組成物が同じくＩＭＰＤＨの基質であるＸＭＰを含有せする場合もその量は上記ＩＭＰの場合と同様である。

本実施の形態におけるＩＭＰＤＨ含有組成物がＩＭＰＤＨの補酵素として作用するＮＡＤ（Ｐ）類を含有する場合、該ＮＡＤ（Ｐ）類の量は、下限値が０．１ｍＭ、好ましくは０．５ｍＭ以上、更に好ましくは１ｍＭ以上が例示され、上限値は特に制限されないが、好ましくは５０ｍＭ以下、更に好ましくは１０ｍＭ以下、特に好ましくは７ｍＭ以下が例示される。

本実施の形態におけるＩＭＰＤＨ含有組成物が、金属イオンを含有する場合、例えばマグネシウムイオンを含有する場合、その下限値は、リン酸供与体の濃度に対して０．１当量以上、好ましくは０．５当量以上、更に好ましくは１当量以上であり、上限値は、リン酸供与体の濃度に対して１０当量以下、好ましくは５当量以下、更に好ましくは３当量以下である。最も好ましい濃度は、リン酸供与体の２当量である。金属イオンは、例えば各種酵素の補因子として機能し得る。

本実施の形態におけるＩＭＰＤＨ含有組成物を試薬として用いる場合、試薬の感度、正確性、再現性、安定性等の品質を向上する目的等で、前記組成物は、ＮａＣｌやＫＣｌ等の塩、ＴＸ−１００やＴｗｅｅｎ２０等の界面活性剤、及び／又はアジ化ナトリウムや抗性物等の防腐剤を含有してもよい。

本実施の形態におけるＩＭＰＤＨ含有組成物が塩を含有する場合、該塩の量は、例えば塩化カリウムの場合、下限値が０．１ｍＭ、好ましくは５ｍＭ以上、更に好ましくは５０ｍＭ以上が例示され、上限値は特に制限されないが、好ましくは２００ｍＭ以下、更に好ましくは１５０ｍＭ以下、特に好ましくは１２０ｍＭ以下が例示される。その他の塩の種類や濃度は限定されないが、例えば塩化ナトリウムや塩化アンモニウム等を含有する場合、通常は５ｍＭ以上２００ｍＭ以下の範囲が例示される。これらの塩は、ＩＭＰＤＨの活性化剤として作用し得る。

本実施の形態におけるＩＭＰＤＨ含有組成物が糖を含有する場合、該糖の濃度は溶解可能な範囲内であれば限定されないが、例えばシュークロースを含有する場合、下限値は全組成物の０．０５（ｗ／ｖ）％、好ましくは０．１（ｗ／ｖ）％以上、更に好ましくは０．３（ｗ／ｖ）％以上であり、上限値は全組成物の３０（ｗ／ｖ）％以下、好ましくは１０（ｗ／ｖ）％以下、更に好ましくは５（ｗ／ｖ）％以下である。例えばマンニトールを含有する場合、下限値は全組成物の０．０５（ｗ／ｖ）％以上、好ましくは０．１（ｗ／ｖ）％以上、更に好ましくは０．３（ｗ／ｖ）％以上であり、上限値は全組成物の３（ｗ／ｖ）％以下、好ましくは２（ｗ／ｖ）％以下、更に好ましくは２（ｗ／ｖ）％以下である。その他の糖としてはトレハロースやシクロデキストリン等が挙げられる。これらの糖は、酵素や組成物の安定化剤として、また、組成物を凍結乾燥する場合は凍結乾燥賦型剤として、機能し得る。

本実施の形態におけるＩＭＰＤＨ含有組成物が防腐剤を含有する場合、該防腐剤の種類や濃度は限定されないが、例えばアジ化ナトリウムの場合、下限値は全組成物の０．００５（ｗ／ｖ）％、好ましくは０．０１（ｗ／ｖ）％以上、更に好ましくは０．０３（ｗ／ｖ）％以上であり、上限値は全組成物の１（ｗ／ｖ）％以下、好ましくは０．５（ｗ／ｖ）％以下、更に好ましくは０．１（ｗ／ｖ）％以下である。例えば抗生物質の場合、下限値は５μｇ／ｍＬ以上、好ましくは１０μｇ／ｍＬ以上、更に好ましくは３０μｇ／ｍＬ以上であり、上限値は１００μｇ／ｍＬ以下、好ましくは７５μｇ／ｍＬ以下、更に好ましくは６０μｇ／ｍＬ以下である。

本実施の形態におけるＩＭＰＤＨ含有組成物が界面活性剤を含有する場合、該界面活性剤の種類や濃度は限定されないが、例えばＴＸ−１００、ＯＰ−１０、Ｔｗｅｅｎ２０等を含有する場合、通常は全組成物の０．００１（ｗ／ｖ）％以上５（ｗ／ｖ）％以下の範囲である。本実施の形態におけるＩＭＰＤＨ含有組成物が例えばＩＭＰＤＨの酵素反応を利用した試薬である場合、界面活性剤は再現性等の試薬の性能を向上し得る。

本実施の形態におけるＩＭＰＤＨ含有組成物がＥＤＴＡ等のキレート剤を含有する場合、その種類や濃度は限定されないが、例えばＥＤＴＡを含有する場合、通常は０．０５ｍＭ以上１０ｍＭ以下の範囲である。ＥＤＴＡやＥＧＴＡ等は、金属を活性発現に利用するプロテアーゼが組成物中に存在する場合、該活性を阻害する場合がある。

本実施の形態におけるＩＭＰＤＨ含有組成物が、牛アルブミン、卵アルブミン、ヒトアルブミン等のタンパク質を含有する場合、該タンパク質の種類や濃度は限定されないが、例えば牛アルブミンを含有する場合、通常は０．０１（ｗ／ｖ）％以上５（ｗ／ｖ）％以下の範囲である。これらのタンパク質は、プロテアーゼの基質となるため、酵素の安定化剤となる場合がある。また、凍結乾燥に際しては凍結乾燥賦型剤となり得る。

上記本実施の形態におけるＩＭＰＤＨ含有組成物が含有する物質は、組成物の目的や用途に応じて適宜変更することができ、例えば、該ＩＭＰＤＨ含有組成物を特定の成分の測定用試薬として用いる場合であれば、測定感度、特異度、再現性、経済的な理由、安全性目的、適用法令等に応じて適宜変更しうる。

本実施の形態におけるＩＭＰＤＨ含有組成物を、特定の成分を測定するための試薬として用いる場合、該組成物を単独で試薬として用いてもよいが、他の試薬と組み合わせて、測定用キットを構成することもできる。他の試薬は、測定対象のキャリブレーター試薬や管理血清等を含む。

本実施の形態におけるＩＭＰＤＨ含有組成物をＰＯＣのキャピラリーへ使用する場合又は酵素センサーとしての使用する場合、各成分の濃度は通常よりも濃い濃度が好ましく、例えば、固定化したり、紙や膜に染み込ませたり、ゲル・ゾル状組成物としたりして使用することが好ましい。

一態様において、本実施の形態は、リン酸供与体及び／又は金属イオンが混在するＩＭＰＤＨ含有組成物の保存方法であって、チオグリセロール及び／又はＮＡＣを前記組成物に添加する工程、及び前記ＩＭＰＤＨ含有組成物を２５℃以下で保存する工程、を含むＩＭＰＤＨ含有組成物の保存方法に関する。該チオグリセロール及び／又はＮＡＣを前記組成物に添加する行程は、上記のＩＭＰＤＨ含有組成物の安定化方法において、チオグリセロール及び／又はＮＡＣを添加する工程に関する記載を参照して行うことができる。該ＩＭＰＤＨ含有組成物を保存する工程における温度は、０℃以下の冷凍保存でもよく、後述の実施例等における０〜１０℃の冷蔵保存や生化学自動分析機などの試薬庫での保存、又は１５〜２５℃の常温や１〜３０℃の室温の保存でもよく、更に加速試験等を含む２５℃以上の保存でもよいが、一般的には低温保存ほどＩＭＰＤＨ含有組成物中のＩＭＰＤＨが安定となるため好ましい。溶液の形態であるＩＭＰＤＨ含有組成物を保存する工程における保存期間は、ＩＭＰＤＨ含有組成物中のＩＭＰＤＨが安定な期間であれば限定せず、実施例で示す４９日程度でもよいが、長期間保存できるほど好ましい。

一態様において、本実施の形態は、リン酸供与体及び／又は金属イオンと、ＩＭＰＤＨとを含有するＩＭＰＤＨ含有組成物の安定化剤であって、チオグリセロール及び／又はＮＡＣを有効成分とする安定化剤に関する。該安定化剤におけるチオグリセロール、ＮＡＣ、ＡＴＰ、マグネシウムイオン及びＩＭＰＤＨについては、上記の各成分に関する記載を参照することができる。該安定化剤はリン酸供与体及び／又は金属イオンがＩＭＰＤＨに混在すると予想される場合や、リン酸供与体及び／又は金属イオンにＩＭＰＤＨが混在すると予想される場合に使用できるが、リン酸供与体及び金属イオンが混在するＩＭＰＤＨ、特にＡＴＰ及びマグネシウムイオンが混在するＩＭＰＤＨに使用するのが好ましい。

以下、本発明を参考例及び実施例（実施例等）に基づいて説明するが、本発明の範囲は以下の実施例等に限定して解釈されるものではない。尚、「常法に従って」と記述した方法は、例えばマニアティスらの方法（Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．，ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ．Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ １９８２年、１９８９年）、非特許文献１の記載又は市販の各種酵素若しくはキット類に添付された取扱説明書等の手順に従い、当業者であれば実施できる方法である。又、以下に示した測定値等は、様々な条件、例えば、測定の条件、使用機器の精度等、使用機器の置かれた温度や気圧等の雰囲気により変化し得るが、同条件で測定した場合には以下の実施例等で得られたものと同じ傾向を示す結果が得られるであろう。

以下の実施例等で使用する試薬類は、特に断らない限り、和光純薬工業株式会社製、シグマアルドリッチ社製、タカラバイオ株式会社製等から市販され容易に入手することができる任意の試薬類を使用することができる。試薬のメーカーや純度等は特に限定されず、必要に応じて当業者であれば適宜選択して用いることができる。ＤＳＭ菌株は、Ｄｅｕｔｓｃｈｅ ＳａｍｍＬｕｎｇ ｖｏｎ Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ ｕｎｄ Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ ＧｍｂＨから入手することができる。ＡＴＣＣ菌株は、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎから入手することができる。又、以下の実施例等で使用した血清等のヒト生体材料は、市販品、又は、使用目的の情報を正しく伝えた上での合意を得て採取した検体若しくは匿名検体である。

［参考例１］ＩＭＰＤＨ活性測定方法
［反応試薬混合液］
５０ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ緩衝液ｐＨ８．０
２ｍＭ ＩＭＰ
２ｍＭ ＮＡＤ
５０ｍＭ 塩化カリウム

石英製の光路長１．０ｃｍキュベットに上記の[反応試薬混合液]２ｍＬを量りとり、３７℃で２分間予備加温した。以下の参考例３に示した方法にて調製したＩＭＰＤＨを５０ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ緩衝液(ｐＨ８．０)で希釈し、後述のＡｓ／ｍｉｎが０．０５から０．３００の範囲に収まる濃度のＩＭＰＤＨ溶液を調製した。ＩＭＰＤＨ溶液０．０３ｍＬを前述のキュベットに加えて混和し３７℃で反応を開始した。反応開始後、３４０ｎｍにおける吸光度を測定し、直線的に反応している１分間当たりの吸光変化を求めた。求められた吸光変化をＡｓ／ｍｉｎ、ＩＭＰＤＨの代わりに精製水を用いた盲検をＡｂ／ｍｉｎとして、酵素活性（Ｕ／ｍＬ）は（式１）で算出した。
（式１）
酵素活性（Ｕ／ｍＬ）＝｛（Ａｓ／ｍｉｎ−Ａｂ／ｍｉｎ）／６．２２｝×２．０３／０．０３×希釈倍数

［参考例２］ミゾリビン及び／又はリバビリンをリン酸化し得る酵素の活性測定方法
［反応試薬混合液１］
３０ｍＭ リン酸カリウム緩衝液 ｐＨ７．０
１０ｍＭ ＡＴＰ（ｐＨ７）
２０ｍＭ 塩化マグネシウム
５ｍＭ イノシン
５０ｍＭ 塩化カリウム

［反応試薬混合液２］
１００ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ緩衝液 ｐＨ９．０
１３Ｕ／ｍＬ 参考例３で製造したＩＭＰＤＨ
２０ｍＭ ＮＡＤ
５０ｍＭ 塩化カリウム
１ｍＭ ＤＴＴ
２００ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ９）

石英製の１．０ｃｍキュベットに上記の[反応試薬混合液１]１．０ｍＬを量りとり、３７℃で２分間予備加温した。後述の参考例６の方法にて調製した酵素Ｐを３０ｍＭ リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）に溶解し、後述のＡｓ／ｍｉｎが０．０５から０．４００の範囲に収まる濃度の酵素Ｐ溶液を調製した。この酵素Ｐ溶液０．０１ｍＬを前述のキュベットに加えて混和し、３７℃で反応を開始した。反応開始５分後に、上記の[反応試薬混合液２]１．０ｍＬを混和して反応を止め、３４０ｎｍの吸光度を測定した（Ａｓ）。酵素Ｐ溶液の代わりに精製水を用いた盲検をＡｂとして酵素活性（Ｕ／ｍＬ）を下記（式２）で算出した。
（式２）
酵素活性（Ｕ／ｍＬ）＝｛（Ａｓ−Ａｂ）／５）／６．２２｝×２．０１／０．０１×希釈倍数

［参考例３］ＩＭＰＤＨの製造方法１
Ｎｕｔｒｉｅｎｔ ２．３（ｗ／ｖ）％、ポテト抽出液 ０．２（ｗ／ｖ）％を含む培地を使用してＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ ＡＴＣＣ２３８５７株を２６℃１日間培養して菌体を得た。この菌体から常法に従ってＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ ＡＴＣＣ２３８５７株ＤＮＡを得た。Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ ＡＴＣＣ２３８５７株のＤＮＡをテンプレートに配列番号１２と配列番号１３のプライマーを用いてＰＣＲで遺伝子増幅した。ＰＣＲはＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼ（東洋紡社製）を用いて常法に従って行った。得られた約１．５ｋｂｐのＰＣＲ産物は常法に従って精製した。

ＰＣＲ産物をＸｂａＩ及びＳａｃＩにより常法に従って制限酵素処理しインサートとした。常法に従って精製したインサートは、ＸｂａＩ及びＳａｃＩにより制限酵素処理し精製したｐＨＳＧ３９９と常法に従ってライゲーションし、ｐＨＳＧ３９９／ＢｓｕＩＭＰＤＨを作成した。ｐＨＳＧ３９９／ＢｓｕＩＭＰＤＨを大腸菌Ｗ３１１０に常法に従って導入して形質転換し、コロニーダイレクトＰＣＲ法によるポジティブクローンから精製した組換体プラスミドについて、ＤＮＡシーケンスによりインサート配列が正しいことを確認した。

上記の形質転換体を３４μｇ／ｍＬのクロラムフェニコール及び１ｍＭ ＩＰＴＧを含むＬＢ培地に植菌し、３０℃で１日間培養した。培養液を遠心分離して集菌し、培養液の１／５倍量の１ｍＭ ＤＴＴを含む２０ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ緩衝液ｐＨ７．５に懸濁し、超音波破砕して遠心分離し、粗酵素液を得た。該粗酵素液を１ｍＭ ＤＴＴを含む１０ｍＭのＴｒｉｓ／ＨＣｌ緩衝液ｐＨ８．０で平衡化したＱ ｓｅｐ．ＢＢ（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）に吸着させた。１ｍＭ ＤＴＴを含む１０ｍＭのＴｒｉｓ／ＨＣｌ緩衝液ｐＨ８．０で充分に洗浄した後、１ｍＭ ＤＴＴ及び０又は０．５ＭのＫＣｌを含む１０ｍＭのＴｒｉｓ／ＨＣｌ緩衝液ｐＨ８．０を用いたリニアグラジェントにて溶出した。活性画分に最終濃度１５（ｗ／ｖ）％になるように硫酸アンモニウムを添加し、１ｍＭ ＤＴＴ及び１５（ｗ／ｖ）％の硫酸アンモニウムを含む１０ｍＭ リン酸カリウム緩衝液ｐＨ７．５で平衡化したＰｈｅｎｙｌ ｓｅｐ．ＦＦ（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）に吸着させて、１ｍＭ ＤＴＴ及び１５又は０％の硫酸アンモニウムを含む１０ｍＭ リン酸カリウム緩衝液ｐＨ７．５を用いたリニアグラジェントにて溶出した。活性画分は１０ｍＭ リン酸カリウム緩衝液ｐＨ７．５で平衡化したＧ−２５で脱塩して、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ由来ＩＭＰＤＨを得た。１Ｌの培養で約１０ｍｇのＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ由来ＩＭＰＤＨを得た。

［参考例４］ＩＭＰＤＨの製造方法２
ペプトン ５ｇ／Ｌ、酵母エキス １ｇ／Ｌ、塩化ナトリウム ２０ｇ／Ｌ、クエン酸鉄 ０．１ｇ／Ｌ、塩化マグネシウム ５．９ｇ／Ｌ、硫酸ナトリウム ３．２４ｇ／Ｌを工業用水で溶解しｐＨ７．６に調整した培地を使用してＯｃｅａｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｉｈｅｙｅｎｓｉｓ ＤＳＭ１４７３１株を２５℃１日間培養して菌体を得た。

この菌体から常法に従ってＯｃｅａｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｉｈｅｙｅｎｓｉｓ ＤＳＭ１４７３１株のＤＮＡを得た。Ｏｃｅａｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｉｈｅｙｅｎｓｉｓ ＤＳＭ１４７３１株のＤＮＡをテンプレートに配列番号１４と配列番号１５のプライマーを用いてＰＣＲで遺伝子増幅した。ＰＣＲはＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼを用いて常法に従って行った。得られた約１．５ｋｂｐのＰＣＲ産物は常法に従って精製した。

ＰＣＲ産物をＸｂａＩ及びＳａｃＩにより常法に従って制限酵素処理しインサートとした。常法に従って精製したインサートは、ＸｂａＩ及びＳａｃＩにより制限酵素処理し精製したｐＨＳＧ３９９と常法に従ってライゲーションし、ｐＨＳＧ３９９／ＯｂＩＭＰＤＨを作成した。ｐＨＳＧ３９９／ＯｂＩＭＰＤＨを大腸菌Ｗ３１１０に常法に従って導入して形質転換し、コロニーダイレクトＰＣＲ法によるポジティブクローンから精製した組換体プラスミドについて、ＤＮＡシーケンスによりインサート配列が正しいことを確認した。

上記の形質転換体を用いて、参考例３と同様の手法でＯｃｅａｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｉｈｅｙｅｎｓｉｓ由来ＩＭＰＤＨを得た。１Ｌの培養で約１０ｍｇのＯｃｅａｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｉｈｅｙｅｎｓｉｓ由来ＩＭＰＤＨを得た。

［参考例５］ミゾリビン及び／又はリバビリンをリン酸化する酵素（酵素Ｐ）の製造方法１
ＬＢ培地を使用して３０℃２日間培養して集菌したＢｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｔｈａｉｌａｎｄｅｎｓｉｓ ＤＳＭ１３２７６株の菌体をを得た。この菌体から常法に従ってＢｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｔｈａｉｌａｎｄｅｎｓｉｓ ＤＳＭ１３２７６株のＤＮＡを得た。

ｐＴｉｐ ＱＣ１又はｐＴｉｐ ＱＣ２（特許第３９４４５７７号公報、及び特許第３７９３８１２号公報）のマルチクローニングサイトＮｄｅＩ及びＢａｍＨＩ部位に配列番号１６の遺伝子を挿入するように、配列番号１７と配列番号１８のプライマーを設計した。ＰＣＲはＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼを用いて常法に従って行った。得られた約１．０ｋｂｐのＰＣＲ産物は、常法に従って精製した。ＰＣＲ産物をＮｄｅＩ及びＢａｍＨＩにより常法に従って制限酵素処理しインサートとした。常法に従って精製したインサートは、ＮｄｅＩ及びＢａｍＨＩにより制限酵素処理し精製したｐＴｉｐ ＱＣ１又はｐＴｉｐ ＱＣ２と常法に従ってライゲーションし、ｐＴｉｐ ＱＣ１／ＢｔｈＮＫ及びｐＴｉｐ ＱＣ２／ＢｔｈＮＫを作成した。ｐＴｉｐ ＱＣ１／ＢｔｈＮＫ及びｐＴｉｐ ＱＣ２／ＢｔｈＮＫを大腸菌 ＤＨ５αに常法に従って導入して形質転換し、コロニーダイレクトＰＣＲ法によるポジティブクローンから精製した組換体プラスミドについて、ＤＮＡシーケンスによりインサート配列が正しいことを確認した。

ｐＴｉｐ ＱＣ１／ＢｔｈＮＫ、及びｐＴｉｐ ＱＣ２／ＢｔｈＮＫのＲｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓへの形質転換は特開２００４−０７３１１６号公報等に記載の方法に従いエレクトロポレーション法（電気穿孔法）で実施した。エレクトロポレーション条件は次のとおりであった。コンピテントセルを融解し、ｐＴｉｐ ＱＣ１／ＢｔｈＮＫ、又はｐＴｉｐ ＱＣ２／ＢｔｈＮＫと混合して、２ｍｍの専用チャンバーに入れ、７．５ｍＳ、２５００Ｖ、２５μＦ、４００Ωでパルスをかけた。

上記の形質転換体を３４μｇ／ｍＬのクロラムフェニコールを含むＬＢ培地に植菌し、３０℃で２日間培養してシードとした。３４μｇ／ｍＬのクロラムフェニコールと１μｇ／ｍＬのチオストレプトンを含むＬＢ培地に上記のシードを１／１０量植菌し、３０℃で１日間培養した。培養液を遠心分離して集菌し、培養液の１／５倍量の２０ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ緩衝液ｐＨ７．５に懸濁、超音波破砕して、遠心分離し、得られた上清を粗酵素液とした。

ｐＴｉｐ ＱＣ１／ＢｔｈＮＫ形質転換体を培養して得られた粗酵素液を０．１Ｍの塩化ニッケル、及び０．３Ｍの塩化ナトリウムを含む５０ｍＭのリン酸緩衝液ｐＨ８．０で平衡化したＣｈｅｒａｔｉｎｇ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＦＦ（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）に吸着させた。０．３Ｍの塩化ナトリウムを含む５０ｍＭのリン酸緩衝液ｐＨ８．０で充分に洗浄した後、１０（ｗ／ｖ）％グリセロール及び０．３Ｍの塩化ナトリウムを含む５０ｍＭのリン酸緩衝液ｐＨ６．０で充分に洗浄した。０．４Ｍイミダゾール、１０（ｗ／ｖ）％グリセロール及び０．３Ｍの塩化ナトリウムを含む５０ｍＭのリン酸緩衝液ｐＨ６．０にて溶出した。活性画分は０．０３Ｍの塩化ナトリウム、０．０５ＭのＫＣｌ及び１ｍＭのＤＴＴを含む３０ｍＭのリン酸緩衝液ｐＨ７．０で透析して酵素Ｐを得た。１Ｌの培養で約８０ｍｇの酵素Ｐを得た。

［参考例６］ミゾリビン及び／又はリバビリンをリン酸化する酵素（酵素Ｐ）の製造方法２
参考例５のインサートを、ＮｄｅＩ及びＢａｍＨＩにより制限酵素処理し精製したｐＥＴ２１ａ（＋）と常法に従ってライゲーションし、ｐＥＴ２１ａ（＋）／ＢｔｈＮＫを作成した。ｐＥＴ２１ａ（＋）／ＢｔｈＮＫを大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）に常法に従って導入して形質転換し、コロニーダイレクトＰＣＲ法によるポジティブクローンから精製した組換体プラスミドについて、ＤＮＡシーケンスしてインサート配列が正しいことを確認した。得られた形質転換体を５０μｇ／ｍＬのアンピシリンを含むＬＢ培地に植菌した。３０℃で１日間培養してシードとした。５０μｇ／ｍＬのアンピシリンを含むＬＢ培地に上記のシードを１／１００量植菌し、３０℃で一日培養した。培養液中の濃度が１ｍＭになるようにＩＰＴＧを加え、更に３０℃で３時間培養した。培養液を遠心分離して集菌し、培養液の１／５倍量の２０ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ緩衝液ｐＨ８．５に懸濁、超音波破砕して、遠心分離し、得られた上清を粗酵素液とした。

上記の粗酵素液を１０ｍＭのＴｒｉｓ／ＨＣｌ緩衝液ｐＨ８．０で平衡化したＱ ｓｅｐ．ＢＢに吸着させた。１０ｍＭのＴｒｉｓ／ＨＣｌ緩衝液ｐＨ８．０で充分に洗浄した後、０又は０．５ＭのＫＣｌを含む１０ｍＭのＴｒｉｓ／ＨＣｌ緩衝液ｐＨ８．０を用いたリニアグラジェントにて溶出した。活性画分に最終濃度１５（ｗ／ｖ）％になるように硫酸アンモニウムを添加し、１５（ｗ／ｖ）％の硫酸アンモニウムを含む１０ｍＭ リン酸カリウム緩衝液ｐＨ７．５で平衡化したＰｈｅｎｙｌ ｓｅｐ．ＦＦに吸着させて１５又は０％の硫酸アンモニウムを含む１０ｍＭ リン酸カリウム緩衝液ｐＨ７．５を用いたリニアグラジェントにて溶出した。活性画分は１０ｍＭ リン酸カリウム緩衝液ｐＨ７．５で平衡化したＧ−２５で脱塩した後、１０ｍＭ リン酸カリウム緩衝液ｐＨ７．５で平衡化したＤＥＡＥ ｓｅｐ．ＦＦ（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）に吸着させた。１０ｍＭ リン酸カリウム緩衝液ｐＨ７．５で充分に洗浄した後、０又は０．５ＭのＫＣｌを含む１０ｍＭ リン酸カリウム緩衝液ｐＨ７．５を用いたリニアグラジェントにて溶出した。活性画分は１０ｍＭ リン酸カリウム緩衝液ｐＨ７．０で平衡化したＧ−２５で脱塩して酵素Ｐを得た。１Ｌの培養で約５０ｍｇの酵素Ｐを得た。

［実施例１］種々の溶液中におけるＩＭＰＤＨの安定性
［組成物１］
３０ｍＭ リン酸カリウム緩衝液 ｐＨ７．０
０．０５％ アジ化ナトリウム
０．１６Ｕ／ｍＬ 参考例３で製造したＩＭＰＤＨ

上記組成物１に以下のとおり添加物を添加し、組成物１−１から１−３を調製した。
組成物１−１：組成物１＋５ｍＭ ＤＴＴ
組成物１−２：組成物１＋５ｍＭ チオグリセロール
組成物１−３：組成物１＋５ｍＭ ＮＡＣ
これらの組成物を、１０℃又は２５℃で０から１２日間保存した。各期間保存した後の組成物中のＩＭＰＤＨ活性を測定して、０日目に対する割合として表１（１０℃）と表２（２５℃）に示した。

１０℃保存の場合、ＤＴＴ、チオグリセロール及びＮＡＣはそれぞれＩＭＰＤＨ安定化効果を示した。２５℃保存の場合、ＤＴＴはＩＭＰＤＨ安定化効果を示さなかったが、チオグリセロール及びＮＡＣは、ＩＭＰＤＨ安定化効果を示した。

［組成物２］
３０ｍＭ リン酸カリウム緩衝液 ｐＨ７．０
０．０５％ アジ化ナトリウム
８ｍＭ ＡＴＰ
０．１６Ｕ／ｍＬ 参考例３で製造したＩＭＰＤＨ

上記の組成物２に以下のとおり添加物を添加し、組成物２−１から２−３を調製した。
組成物２−１：組成物２＋５ｍＭ ＤＴＴ
組成物２−２：組成物２＋５ｍＭ チオグリセロール
組成物２−３：組成物２＋５ｍＭ ＮＡＣ
これらの組成物を、１０℃又は２５℃で、０から１２日間保存した。各期間保存した後の組成物中のＩＭＰＤＨ活性を測定して、０日目に対する割合として表３（１０℃）と表４（２５℃）に示した。

ＡＴＰの存在下において、ＤＴＴ、チオグリセロール及びＮＡＣはそれぞれＩＭＰＤＨ安定化効果を示した。

［組成物３］
３０ｍＭ リン酸カリウム緩衝液 ｐＨ７．０
０．０５％ アジ化ナトリウム
１６ｍＭ 塩化マグネシウム
０．１６Ｕ／ｍＬ 参考例３で製造したＩＭＰＤＨ

上記の組成物３に以下のとおり添加物を添加し、組成物３−１から３−３を調製した。
組成物３−１：組成物３＋５ｍＭ ＤＴＴ
組成物３−２：組成物３＋５ｍＭ チオグリセロール
組成物３−３：組成物３＋５ｍＭ ＮＡＣ
これらの組成物を、１０℃又は２５℃で、０から１２日間保存した。各期間保存した後の組成物中のＩＭＰＤＨ活性を測定して、０日目に対する割合として表５（１０℃）と表６（２５℃）に示した。

１０℃保存の場合、塩化マグネシウムの存在下においてＤＴＴがＩＭＰＤＨ安定化効果を示したが、２５℃保存の場合、ＤＴＴはＩＭＰＤＨ安定化効果を示さなかった。塩化マグネシウムの存在下において、１０℃及び２５℃保存の場合、チオグリセロール及びＮＡＣはそれぞれＩＭＰＤＨ安定化効果を示した。

［組成物４］
３０ｍＭ リン酸カリウム緩衝液 ｐＨ７．０
０．０５％ アジ化ナトリウム
０．１４％ マンニトール
０．１６Ｕ／ｍＬ 参考例３で製造したＩＭＰＤＨ

上記の組成物４に以下のとおり添加物を添加し、組成物４−１から４−３を調製した。
組成物４−１：組成物４＋５ｍＭ ＤＴＴ
組成物４−２：組成物４＋５ｍＭ チオグリセロール
組成物４−３：組成物４＋５ｍＭ ＮＡＣ
これらの組成物を、１０℃又は２５℃で、０から１２日間保存した。各期間保存した後の組成物中のＩＭＰＤＨ活性を測定して、０日目に対する割合として表７（１０℃）と表８（２５℃）に示した。

組成物１−１から１−３について得られた結果と比較したところ、マンニトールは、ＩＭＰＤＨの安定性とは関係がないことが明らかになった。

［組成物５］
３０ｍＭ リン酸カリウム緩衝液 ｐＨ７．０
０．０５％ アジ化ナトリウム
８ｍＭ ＡＴＰ
１６ｍＭ 塩化マグネシウム
０．１６Ｕ／ｍＬ 参考例３で製造したＩＭＰＤＨ

上記の組成物５に以下のとおり添加物を添加し、組成物５−１から５−３を調製した。
組成物５−１：組成物５＋５ｍＭ ＤＴＴ
組成物５−２：組成物５＋５ｍＭ チオグリセロール
組成物５−３：組成物５＋５ｍＭ ＮＡＣ
これらの組成物を、１０℃又は２５℃で、０から１４日間保存した。各期間保存した後の組成物中のＩＭＰＤＨ活性を測定して、０日目に対する割合として表９（１０℃）と表１０（２５℃）に示した。

ＡＴＰとマグネシウムイオンの存在下においては、ＤＴＴはＩＭＰＤＨ安定化効果を示さず、逆に不安定化効果を示した。一方、チオグリセロール及びＮＡＣはそれぞれ、ＡＴＰとマグネシウムイオンの存在下においてもＩＭＰＤＨの安定化効果を示した。

［組成物６］
３０ｍＭ リン酸カリウム緩衝液 ｐＨ７．０
０．０５％ アジ化ナトリウム
８ｍＭ ＡＴＰ
１６ｍＭ 塩化マグネシウム
０．１６Ｕ／ｍＬ 参考例３で製造したＩＭＰＤＨ
０．１４％ マンニトール

上記の組成物６に以下のとおり添加物を添加し、組成物６−１から６−３を調製した。
組成物６−１：組成物６＋５ｍＭ ＤＴＴ
組成物６−２：組成物６＋５ｍＭ チオグリセロール
組成物６−３：組成物６＋５ｍＭ ＮＡＣ
これらの組成物を、１０℃又は２５℃で、０から１４日間保存した。各期間保存した後の組成物中のＩＭＰＤＨ活性を測定して、０日目に対する割合として表１１（１０℃）と表１２（２５℃）に示した。

組成物６から組成物６−３中のＩＭＰＤＨの安定性は、組成物５から５−３と同様の傾向を示した。マンニトールの影響は無いと考えられた。

「組成物１から１−３」から「組成物６から６−３」を用いた上記の安定性試験の結果から、チオグリセロール及び／又はＮＡＣを添加することにより、ＩＭＰＤＨが安定化することが確認された。特に、少なくともＩＭＰＤＨ、ＡＴＰ及びマグネシウムイオンが存在する条件において、チオグリセロール及び／又はＮＡＣを添加することにより、ＩＭＰＤＨが安定化することが確認された。

組成物５に、下記表に示した濃度のＤＴＴを添加した各組成物を調製した。該組成物を１０℃又は２５℃で０から１４日間保存した。各期間保存した後の組成物中のＩＭＰＤＨ活性を測定して、０日目に対する割合として表１３（１０℃）と表１４（２５℃）に示した。

ＤＴＴの濃度に関わらず、ＡＴＰとマグネシウムイオンの存在下においては、ＤＴＴはＩＭＰＤＨ安定化効果を示さず、逆に不安定化効果を示した。

組成物５に、下記表に示した濃度のチオグリセロールを添加した。該組成物を１０℃又は２５℃で０から１４日間保存した。各期間保存した後の組成物中のＩＭＰＤＨ活性を測定して、０日目に対する割合として表１５（１０℃）と表１６（２５℃）に示した。

チオグリセロールは、ＤＴＴと異なり、ＡＴＰとマグネシウムイオンの存在下においても、少なくとも５から２０ｍＭの範囲で、０．１６Ｕ／ｍＬのＩＭＰＤＨの安定化効果を示した。すなわち、ＩＭＰＤＨ １Ｕ当たり、少なくとも３１．２５から１２５μｍｏｌの範囲のチオグリセロールが存在する場合には、ＩＭＰＤＨの安定化が認められた。

組成物５に、下記表に示した濃度のＮＡＣを添加した。該組成物を１０℃又は２５℃で０から１４日間保存した。各期間保存した後の組成物中のＩＭＰＤＨ活性を測定して、０日目に対する割合として表１７（１０℃）と表１８（２５℃）に示した。

ＮＡＣは、ＤＴＴと異なり、ＡＴＰとマグネシウムイオンの存在下においても、少なくとも５から２０ｍＭの範囲で、０．１６Ｕ／ｍＬのＩＭＰＤＨの安定化効果を示した。すなわち、ＩＭＰＤＨ １Ｕ当たり、少なくとも３１．２５から１２５μｍｏｌの範囲のＮＡＣが存在する場合には、ＩＭＰＤＨの安定化が認められた。

［組成物５Ａ］
３０ｍＭ リン酸カリウム緩衝液 ｐＨ７．０
０．０５％ アジ化ナトリウム
８ｍＭ ＡＴＰ
１６ｍＭ 塩化マグネシウム
０．１Ｕ／ｍＬ 参考例３で製造したＩＭＰＤＨ

上記の組成物５Ａに、下記表に示した濃度のＤＴＴ又はチオグリセロールを添加した。該組成物を２５℃で０から１６日間保存した。各期間保存した後の組成物中のＩＭＰＤＨ活性を測定して、０日目に対する割合として表１９（ＤＴＴ）及び表２０（チオグリセロール）に示した。

ＡＴＰとマグネシウムイオンの存在下においては、１から１０ｍＭの範囲のＤＴＴは０．１Ｕ／ｍＬのＩＭＰＤＨの安定化効果を示さず、逆に不安定化効果を示した。一方、少なくとも１から１０ｍＭの範囲のチオグリセロールは、ＡＴＰとマグネシウムイオンの存在下においても０．１Ｕ／ｍＬのＩＭＰＤＨの安定化効果を示した。すなわち、ＩＭＰＤＨ １Ｕ当たり、少なくとも１０から１００μｍｏｌの範囲のチオグリセロールが存在する場合には、ＩＭＰＤＨの安定化が認められた。

［組成物５Ｂ］
３０ｍＭ リン酸カリウム緩衝液 ｐＨ７．０
０．０５％ アジ化ナトリウム
８ｍＭ ＡＴＰ
１６ｍＭ 塩化マグネシウム
１Ｕ／ｍＬ 参考例３で製造したＩＭＰＤＨ

上記の組成物５Ｂに、下記表に示した濃度のＤＴＴ又はチオグリセロールを添加した。該組成物を２５℃で０から１６日間保存した。各期間保存した後の組成物中のＩＭＰＤＨ活性を測定して、０日目に対する割合として表２１（ＤＴＴ）及び表２２（チオグリセロール）に示した。

ＡＴＰとマグネシウムイオンの存在下においては、１から１０ｍＭの範囲のＤＴＴは１Ｕ／ｍＬのＩＭＰＤＨの安定化効果を示さず、逆に不安定化効果を示した。一方、少なくとも５から１０ｍＭの範囲のチオグリセロールは、ＡＴＰとマグネシウムイオンの存在下においても１Ｕ／ｍＬのＩＭＰＤＨの安定化効果を示した。すなわち、ＩＭＰＤＨ １Ｕ当たり、少なくとも５から１０μｍｏｌの範囲のチオグリセロールが存在する場合には、ＩＭＰＤＨの安定化が認められた。

［組成物５Ｃ］
３０ｍＭ リン酸カリウム緩衝液 ｐＨ７．０
０．０５％ アジ化ナトリウム
８ｍＭ ＡＴＰ
１６ｍＭ 塩化マグネシウム
１０Ｕ／ｍＬ 参考例３で製造したＩＭＰＤＨ

上記の組成物５Ｃに、下記表に示した濃度のＤＴＴ又はチオグリセロールを添加した。該組成物を２５℃で０から１６日間保存した。各期間保存した後の組成物中のＩＭＰＤＨ活性を測定して、０日目に対する割合として表２３（ＤＴＴ）及び表２４（チオグリセロール）に示した。

ＡＴＰとマグネシウムイオンの存在下においては、１から１０ｍＭの範囲のＤＴＴは１０Ｕ／ｍＬのＩＭＰＤＨ安定化効果を示さず、逆に不安定化効果を示した。一方、少なくとも１０ｍＭの範囲のチオグリセロールは、ＡＴＰとマグネシウムイオンの存在下においても１０Ｕ／ｍＬのＩＭＰＤＨの安定化効果を示した。すなわち、ＩＭＰＤＨ １Ｕ当たり、少なくとも１μｍｏｌのチオグリセロールが存在する場合には、ＩＭＰＤＨの安定化が認められた。

［実施例２］ＩＭＰＤＨを含有するミゾリビン測定用組成物の安定性１
［組成物７］
３０ｍＭ リン酸カリウム緩衝液 ｐＨ７．０
１％ シュークロース
０．１４％ マンニトール
５０ｍＭ 塩化カリウム
８ｍＭ ＡＴＰ
５ｍＭ ＮＡＤ
３０ｍＭ 塩化ナトリウム
１６ｍＭ 塩化マグネシウム
０．０５％ アジ化ナトリウム
０．０５％ ＴＸ−１００
０．１６Ｕ／ｍＬ 参考例３で製造したＩＭＰＤＨ
０．７Ｕ／ｍＬ 参考例６で製造した酵素Ｐ

［組成物８］
１５０ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ緩衝液 ｐＨ９．２
５０ｍＭ 塩化カリウム
２０ｍＭ ＩＭＰ
０．０５％ アジ化ナトリウム
０．０５％ ＴＸ−１００

［ミゾリビン標準液１から４］
生理的食塩水をミゾリビン標準液１、ミゾリビンを生理的食塩水にて溶解して調製して得たミゾリビン０．８７μｇ／ｍＬの濃度の溶液をミゾリビン標準液２とし、以下、２．６３μｇ／ｍＬ濃度の溶液をミゾリビン標準液３、４．４２μｇ／ｍＬをミゾリビン標準液４として用意した。なお、生理的食塩水をミゾリビン標準液１とした。

［日立７０８０形自動分析機パラメーター１］
分析法： ［レートＡ］［１０］［２０］[２２]［０］［０］
波長(副波長／主波長)： ［４０５］／［３４０］
検体量： 種別１
標準： ［２．０］［０．０］［０］
試薬分注量
Ｒ１： ［１２０］［０］［ ］［９９］
Ｒ２： ［０］［０］［ ］［９９］
Ｒ３： ［６０］［０］［ ］［９９］
Ｒ４： ［０］［０］［ ］［９９］
キャリブレーション
Ｓ１ Ａｂｓ．： ０
Ｋ： １００００
スタートアップキャリブレーションはしない。

［日立７０８０形自動分析機パラメーター１］と下記の［日立７０８０形自動分析機パラメーター２］は、日立７０８０形自動分析機の取扱説明書等を参考に設定した。

上記の組成物７に以下のとおり添加物を添加し、組成物７−１から７−３を調製した。
組成物７−１：組成物７＋１ｍＭ ＤＴＴ
組成物７−２：組成物７＋１ｍＭ チオグリセロール
組成物７−３：組成物７＋１ｍＭ ＮＡＣ
組成物７から７−３を１０℃で０から２２日間保存した。各期間保存した該組成物と、用事調製した組成物８とを用いて、ミゾリビン標準液１から４についてのミゾリビン量を測定した。測定には［日立７０８０形自動分析機パラメーター１］を用いて日立７０８０形自動分析機を使用した。該パラメーター中、検体はミゾリビン標準液１から４、Ｒ１は各期間保存した後の組成物７から７−３、Ｒ３は用事調製した組成物８とした。Ｒ２及びＲ４は使用しなかった。

図１に、凡例に示した期間１０℃で保存した組成物７と、用事調製した組成物８を用いてミゾリビン標準液１から４中のミゾリビンを測定した結果を、検量線として示した。図中の横軸はミゾリビン濃度（μｇ／ｍＬ）を示す。縦軸（ΔＡ３４０ｎｍ）は、感度（ＮＡＤＨの吸光変化が、直線的である部分の１分間当たりの変化量（ΔｍＡｂｓ／ｍｉｎ））を示す。

また、組成物７−１から７−３の結果は、それぞれ図２から図４に示した。０日保存の組成物７から７−３を用いて測定した場合は、図１から図４の「０日」の線（○の線）で示されているとおり、検量線が直線となりミゾリビンを正確に測定できることを示している。図１に示されるとおり、組成物７を６日間保存してもミゾリビンの測定が可能であったが、１１日間の保存後においては、検量線は直線とならず、ミゾリビンが測定できないことが確認された。すなわち、ミゾリビン測定用の組成物７は、１１日の保存ができないことが明らかになった。

図２に示した結果から、ＤＴＴを添加した組成物７−１では、０日保存の場合のみミゾリビンの測定が可能であった。すなわち、極めて不安定な組成物であった。一方、図３と図４に示されるとおり、チオグリセロール又はＮＡＣを添加した組成物７−２と７−３では、少なくとも１１日間の保存後もミゾリビンを測定することができ、充分に安定であった。

本実施例により、ＩＭＰＤＨ、ＡＴＰ、及びマグネシウムイオンが存在するミゾリビン測定用の組成物に、チオグリセロール又はＮＡＣを含有させることにより、１０℃での保存において、該組成物が安定化することが示された。

［実施例３］ＩＭＰＤＨを含有するミゾリビン測定用組成物の安定性２
［組成物９］
９０ｍＭ リン酸カリウム緩衝液 ｐＨ７．０
１％ シュークロース
０．１４％ マンニトール
５０ｍＭ 塩化カリウム
８ｍＭ ＡＴＰ
５ｍＭ ＮＡＤ
３０ｍＭ 塩化ナトリウム
１６ｍＭ 塩化マグネシウム
０．０５％ アジ化ナトリウム
０．０５％ ＴＸ−１００
０．１６Ｕ／ｍＬ 参考例３で製造したＩＭＰＤＨ
０．７Ｕ／ｍＬ 参考例６で製造した酵素Ｐ

上記の組成物９に以下のとおり添加物を添加し、組成物９−１から９−３を調製した。
組成物９−１：組成物９＋５ｍＭ ＤＴＴ
組成物９−２：組成物９＋５ｍＭ チオグリセロール
組成物９−３：組成物９＋５ｍＭ ＮＡＣ

組成物９は４℃で６０日間保存した。組成物９−１から９−３を４℃で４９日間保存した。各期間保存した後の組成物９から９−３と、用事調製した組成物８とを用いて上記ミゾリビン標準液１から４のミゾリビン量を測定した。測定には上記［日立７０８０形自動分析機パラメーター１］を用いて日立７０８０形自動分析機を使用した。該パラメーター中、検体はミゾリビン標準液１から４、Ｒ１は各期間保存した組成物９から９−３、Ｒ３は用事調製した組成物８とした。Ｒ２及びＲ４は使用しなかった。

結果を組成物７から７−３の場合と同様に検量線として図５から図８に示した。図５で示されているとおり、組成物９は０日保存の場合にはミゾリビンの測定をすることができたが、６０日保存の場合にはミゾリビンが測定できなかった。また、図６によれば、ＤＴＴを添加した組成物９−１では、２９日保存までの場合はミゾリビンの測定をすることができたが、４９日保存後はミゾリビンが測定できなかった。一方、図７と図８で示されるとおり、チオグリセロール又はＮＡＣを添加した組成物９−２と９−３では、少なくとも４９日保存後もミゾリビンを測定することができた。

本実施例により、ＩＭＰＤＨ、ＡＴＰ、及びマグネシウムイオンが存在するミゾリビン測定用の組成物に、チオグリセロール又はＮＡＣを含有させることにより、４℃での保存において、該組成物が安定化することが示された。

［実施例４］ＩＭＰＤＨを含有するミゾリビン測定用組成物の安定性３
［組成物１０］
９０ｍＭ リン酸カリウム緩衝液 ｐＨ７．０
１％ シュークロース
５０ｍＭ 塩化カリウム
８ｍＭ ＡＴＰ
５ｍＭ ＮＡＤ
３０ｍＭ 塩化ナトリウム
１６ｍＭ 塩化マグネシウム
０．０５％ アジ化ナトリウム
０．０５％ ＴＸ−１００
５ｍＭ チオグリセロール
０．１６Ｕ／ｍＬ 参考例３で製造したＩＭＰＤＨ
０．７Ｕ／ｍＬ 参考例６で製造した酵素Ｐ

上記の組成物１０に以下のとおり添加物を添加し、組成物１０−１から１０−４を調製した。
組成物１０−１：組成物１０＋０．０７％マンニトール
組成物１０−２：組成物１０＋０．１４％マンニトール
組成物１０−３：組成物１０＋０．７５％（約４０ｍＭ）マンニトール
組成物１０−４：組成物１０＋０．１４％トレハロース

組成物１０から１０−４を１０℃で１２日間保存した。各期間保存した後の組成物１０から１０−４と、用事調製した組成物８とを用いて、上記ミゾリビン標準液１〜４のミゾリビン量を測定した。測定には上記［日立７０８０形自動分析機パラメーター１］を用いて日立７０８０形自動分析機を使用した。該パラメーター中、検体はミゾリビン標準液１から４、Ｒ１は各期間保存した組成物１０から１０−４、Ｒ３は用事調製した組成物８とした。Ｒ２及びＲ４は使用しなかった。１０℃で０から１２日間保存した組成物１０から１０−４と用事調製した組成物８を用いてミゾリビン標準液１〜４のミゾリビン量を測定した結果を組成物７から７−３の場合と同様に検量線として図９から図１３に示した。図９から図１３で示すように、組成物１０から１０−４を使用した場合、検体中のミゾリビン濃度を少なくとも１２日目までは測定することができた。

［実施例５］
［日立７０８０形自動分析機パラメーター２］
分析法： ［レートＡ］［１０］［２０］[２２]［０］［０］
波長(副波長／主波長)： ［４０５］／［３４０］
検体量： 種別１
標準： ［２．０］［０．０］［０］
試薬分注量
Ｒ１： ［１２０］［０］［ ］［９９］
Ｒ２： ［０］［０］［ ］［９９］
Ｒ３： ［６０］［０］［ ］［９９］
Ｒ４： ［０］［０］［ ］［９９］
キャリブレーション
キャリブレーション方法：［リニア］
ポイント： ［２］
スパンポイント： ［０］
重み付けファクタ： ［０］
標準液 （１） （２） （３） （４）
濃度： ［０．００］ ［０．８７］ ［２．６３］ ［４．４２］
検体量： ［２．０］ ［２．０］ ［２．０］ ［２．０］
スタートアップキャリブレーションをする。

上記組成物９−２を日立７０８０形自動分析機の試薬用冷蔵庫中（４〜１０℃の範囲で温度が変動する）で０から１２日間保存した。用事調製の組成物９−２と１２日保存の組成物９−２を用いて、３人のミゾリビンを投与された患者の血清（検体１〜３）中のミゾリビンを測定して、用事調製の組成物９−２と１２日保存の組成物９−２の組成物の、ミゾリビン測定用組成物としての性能を比較した。測定には日立７０８０形自動分析機を使用し、上記［日立７０８０形自動分析機パラメーター２］を用い、キャリブレーターは上記ミゾリビン標準液１〜４を使用した。該パラメーター中、検体は検体１〜３、Ｒ１は用事調製の組成物９−２又は１２日保存の組成物９−２、Ｒ３は用事調製した組成物８とした。Ｒ２及びＲ４は使用しなかった。検体１から３中のミゾリビン濃度をそれぞれ５回測定し、平均値とＣＶ（％）を求めて、用事調製の組成物９−２の結果を表１９に、１２日保存の組成物９−２の結果を表２０に示した。

表２５と表２６に示すように、用事調製の組成物９−２を使用した測定結果に対して、１２日間保存した組成物９−２を使用した測定結果は±１０％の範囲に収まり、組成物９−２は、１２日間保存後もミゾリビン測定用の組成物として好適に用いることができることが明らかになった。さらに、用事調製及び１２日間保存した組成物９−２を使用した測定結果は、いずれもＣＶ（％）が０．５％以下であり、再現性が高いことが明らかになった。

本発明によれば、様々な条件下であっても、ＩＭＰＤＨを安定して含有するＩＭＰＤＨ含有組成物及びＩＭＰＤＨを安定化する方法が提供される。、これにより、例えば、医薬品の開発や、試薬の開発の分野で安定なＩＭＰＤＨの利用が可能になるという産業上の利用可能性を有する。

Claims (10)

1. リン酸供与体及び／又は金属イオンが混在するイノシン５'一リン酸脱水素酵素（ＩＭＰＤＨ）含有組成物であって、チオグリセロール及び／又はＮ−アセチル−Ｌ−システイン（ＮＡＣ）をさらに含有する、ＩＭＰＤＨ含有組成物。
2. リン酸供与体及び金属イオンが混在するイノシン５'一リン酸脱水素酵素（ＩＭＰＤＨ）含有組成物であって、チオグリセロール及び／又はＮ−アセチル−Ｌ−システイン（ＮＡＣ）をさらに含有する、ＩＭＰＤＨ含有組成物。
3. 前記リン酸供与体がＡＴＰである、請求項１又は２に記載のＩＭＰＤＨ含有組成物。
4. 前記金属イオンがマグネシウムイオンである、請求項１〜３のいずれかに記載のＩＭＰＤＨ含有組成物。
5. 水溶液の形態である、請求項１〜４のいずれかに記載のＩＭＰＤＨ含有組成物。
6. ＩＭＰＤＨの酵素反応を利用するための組成物である、請求項１〜５のいずれかに記載のＩＭＰＤＨ含有組成物。
7. ＩＭＰＤＨの酵素反応を利用して、ＩＭＰＤＨの阻害剤、ＩＭＰＤＨの基質若しくはＩＭＰＤＨの補酵素又はこれらの前駆体のいずれかを測定するための試薬である、請求項１〜６のいずれかに記載のＩＭＰＤＨ含有組成物。
8. ＩＭＰＤＨの酵素反応を利用して、ミゾリビン及び／又はリバビリンを測定するための試薬である、請求項１〜７のいずれかに記載のＩＭＰＤＨ含有組成物。
9. リン酸供与体及び／又は金属イオンと、イノシン５'一リン酸脱水素酵素（ＩＭＰＤＨ）とを含有するＩＭＰＤＨ含有組成物のための安定化剤であって、
   チオグリセロール及び／又はＮ−アセチル−Ｌ−システイン（ＮＡＣ）を有効成分とする安定化剤。
10. リン酸供与体及び／又は金属イオンが混在するイノシン５'一リン酸脱水素酵素（ＩＭＰＤＨ）含有組成物の安定化方法であって、
    チオグリセロール及び／又はＮ−アセチル−Ｌ−システイン（ＮＡＣ）を前記組成物に添加する工程を含む安定化方法。