JP5453690B2 - コラーゲン・キトサン複合繊維状多孔体及びその製造方法 - Google Patents
コラーゲン・キトサン複合繊維状多孔体及びその製造方法 Download PDFInfo
- Publication number
- JP5453690B2 JP5453690B2 JP2010139855A JP2010139855A JP5453690B2 JP 5453690 B2 JP5453690 B2 JP 5453690B2 JP 2010139855 A JP2010139855 A JP 2010139855A JP 2010139855 A JP2010139855 A JP 2010139855A JP 5453690 B2 JP5453690 B2 JP 5453690B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- collagen
- chitosan
- fiber
- gel
- buffer solution
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
Landscapes
- Nonwoven Fabrics (AREA)
- Materials For Medical Uses (AREA)
- Artificial Filaments (AREA)
Description
本発明は、コラーゲン・キトサン複合細繊維、コラーゲン・キトサン複合繊維ゲル、及びコラーゲン・キトサン複合繊維状多孔体、並びにそれらの製造方法に関する。
コラーゲンは身体の中のタンパク質の３０％を占めており、骨格支持及び細胞接着などの機能において重要な役割を担っている。このコラーゲンを用いた生体材料は、細胞培養基材、再生医療用の足場材料（例えば、軟骨、骨、皮膚、及び肝臓組織の再生材料）、移植用材料（創傷被覆材料、骨補填剤、又は止血材料）、又は薬物送達担体として有用であり、特に再生医療による大型組織再生には必要不可欠である。
コラーゲンには、Ｉ型からＸIII型までの多くの種類があるが、ほとんどのコラーゲンは３重らせん構造を有している。例えば、Ｉ型コラーゲンは分子量約１０万のポリペプチド鎖（α鎖）が３本集まり、長さ３００ｎｍ、直径１．５ｎｍの１本の硬い棒のような３重らせん構造を形成しており、トロポコラーゲンとも呼ばれる。生体内では、このトロポコラーゲンが、更に少しずつずれながら整列し、直径が数十〜百数十ｎｍのコラーゲン細繊維を形成している。そして、このコラーゲン細繊維が、更に集積して、骨基質又は軟骨基質中の結合組織を形成している。このトロポコラーゲンの３重らせん構造、及びトロポコラーゲンからなるコラーゲン細繊維の構造が、生体材料に用いる際の、コラーゲンの強靭さ、及び細胞への接着性等に寄与している。
コラーゲンは、牛皮やブタ皮などの家畜の組織又は魚の鱗などから抽出され、生体材料として利用されている。具体的には、牛皮などの原料から３重らせん構造を破壊しないように抽出し、得られたコラーゲンを可溶性コラーゲンとして酸性溶液に溶解させる。この可溶性コラーゲンの酸性溶液を中性に調整することによって再繊維化し、コラーゲン細繊維を形成させる（特許文献１）。この再繊維化したコラーゲン細繊維は、生体中のコラーゲンと同じ構造をしているため、生体親和性が高く、生体材料として有用である。しかしながら、コラーゲン細繊維のみからなる生体材料は、その力学特性が十分でないため、臨床現場における使用は限定されていた。
この問題を改善するため、カニの甲羅から抽出され、力学特性が高いキトサンを、コラーゲンに加えて、強度を上げる試みが行われている。例えば、酸性溶液に分散させたコラーゲンと有機酸に分散させたキトサンとを混合して、ｐＨを１から６の範囲に調整し、凍結乾燥、及び化学架橋（グルタルアルデヒド又はカルボジイミドなど）した生体材料が作製されている（特許文献２、特許文献３、非特許文献１、非特許文献２、非特許文献３）。しかしながら、これらの生体材料中のコラーゲンは、コラーゲン細繊維を形成していないため、生体組織中の繊維構造とは異なっている。従って、生体材料として使用する際に、生体親和性が低く、また力学特性及び操作性も十分ではなかった。
一方、生体組織と類似した繊維状構造を作製するために、コラーゲンとキトサンとを電界紡糸法（エレクトロスピニング法）により繊維化し、得られたナノ繊維からなる多孔質膜が作製されている（非特許文献４、非特許文献５、特許文献４）。しかしながら、この方法は閾値を超えた電圧を印加させ、電荷の反発力がポリマー液滴の表面張力を制御し、電場内で電荷を帯びた液滴が伸長することで強制的にコラーゲンとキトサンとを繊維化させているものであり、生体中のコラーゲン細繊維とは、根本的に異なる構造であると考えられる。また、コラーゲンやキトサンを溶解させるために、１，１，１，３，３，３−ヘキサフルオロ−２−プロパノールやトリフルオロ酢酸やジクロロメタンなどの有機溶媒が用いられており、工業的にもコストが高く、生体に与えるその毒性などに問題がある。更に、コラーゲン細繊維と異なり、その繊維密度が低いため力学強度が十分ではなく、また作製に時間がかかるなどの課題が残されている。
「バイオマテリアルズ（Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ）」（イギリス）２００３年、第２４巻、ｐ．２２１３−
「バイオマテリアルズ（Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ）」（イギリス）２００３年、第２４巻、ｐ．４８２２−
「ジャーナル・オブ・マテリアル・サイエンス：マテリアルズ・メディシン（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍａｔｅｒｉａｌｓ Ｓｃｉｅｎｃｅ：Ｍａｔｅｒｉａｌｓ ｉｎ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ）」（オランダ）２００９年、第２０巻、ｐ．７９９−
「コロイダル・アンド・サーフェシズＡ：フィジコケミカル・エンジニアリング・アスペクツ（Ｃｏｌｌｏｉｄｓ ａｎｄ Ｓｕｒｆａｃｅｓ Ａ：Ｐｈｙｓｉｃｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ａｓｐｅｃｔｓ）」（オランダ）２００８年、第３１３−３１４巻、ｐ．１８３−
「マテリアルズ・レターズ（Ｍａｔｅｒｉａｌｓ Ｌｅｔｔｅｒｓ）」（オランダ）２００７年、第６１巻、ｐ．３４９０−
従って、本発明の目的は、生体内のコラーゲン細繊維と類似した繊維状構造を有し、且つ力学強度の優れた生体材料及びその製造方法を提供することである。すなわち、医療現場から要望のある、生体親和性が高く、且つ十分な力学強度を有することによって操作性が改善された再生医療用足場材料、移植用材料、又は薬物送達担体などの生体材料を提供することである。
本発明者らは、細胞との親和性が高くカルボキシル基及びアミノ基をもつコラーゲン（両性高分子）とカニの甲羅から抽出され抗菌性を示すキチンを脱アセチル化することでアミノ基をもつキトサン（カチオン性高分子）とからなる複合繊維状多孔体について、鋭意研究した結果、驚くべきことに、酸性コラーゲン溶液と酢酸キトサン溶液とを混合し、更にアルカリ性緩衝溶液を加え、ｐＨ、塩濃度、及び温度をコントロールすることによって、生体内のコラーゲン細繊維と構造が類似し、コラーゲン及びキトサンが相互作用したコラーゲン・キトサン細繊維が得られることを見出した。前記コラーゲン・キトサン細繊維を含むコラーゲン・キトサン複合繊維ゲルは、コラーゲン細繊維のみからなる従来のコラーゲンと比較すると、高い粘弾性特性を示し、生体材料として十分な強度を有しており、且つ細胞接着性においても優れている。また、本発明者らは、前記コラーゲン・キトサン複合繊維ゲルを、凍結乾燥法又はキャスト法により乾燥させることにより、コラーゲン・キトサン複合繊維状多孔体を作製することが可能であり、更に、熱架橋又は化学架橋されたコラーゲン・キトサン複合繊維状多孔体は、優れた力学強度を有しており、生体材料として用いた場合に、操作性が改善されることを見出した。
本発明は、こうした知見に基づくものである。
本発明は、こうした知見に基づくものである。
従って、本発明は、実質的に、コラーゲン及び脱Ｎ−アセチル化度６０〜１００％のキトサンからなる、コラーゲン・キトサン複合細繊維に関する。
本発明のコラーゲン・キトサン複合細繊維の好ましい態様においては、直径が５０〜２００ｎｍであり、また前記コラーゲンが、魚類由来コラーゲンであってもよい。
また、本発明は、前記コラーゲン・キトサン複合細繊維を含むコラーゲン・キトサン複合繊維ゲルに関する。
本発明のコラーゲン・キトサン複合繊維ゲルの好ましい態様においては、１Ｈｚにおける貯蔵弾性率が、３００Ｐａ以上である。
更に、本発明は、前記コラーゲン・キトサン複合細繊維を含むコラーゲン・キトサン複合繊維状多孔体に関する。
本発明のコラーゲン・キトサン複合繊維状多孔体の好ましい態様においては、前記コラーゲン・キトサン複合細繊維が架橋されている。
本発明のコラーゲン・キトサン複合細繊維の好ましい態様においては、直径が５０〜２００ｎｍであり、また前記コラーゲンが、魚類由来コラーゲンであってもよい。
また、本発明は、前記コラーゲン・キトサン複合細繊維を含むコラーゲン・キトサン複合繊維ゲルに関する。
本発明のコラーゲン・キトサン複合繊維ゲルの好ましい態様においては、１Ｈｚにおける貯蔵弾性率が、３００Ｐａ以上である。
更に、本発明は、前記コラーゲン・キトサン複合細繊維を含むコラーゲン・キトサン複合繊維状多孔体に関する。
本発明のコラーゲン・キトサン複合繊維状多孔体の好ましい態様においては、前記コラーゲン・キトサン複合細繊維が架橋されている。
本発明は、コラーゲン及びキトサンを均一に混合し、ｐＨ６．０〜８．０及び塩濃度が１５ｍＭ以上のコラーゲン・キトサン混合緩衝溶液を調製する工程、及び前記コラーゲン・キトサン混合緩衝溶液を、繊維調整温度に上昇させることによってコラーゲン及びキトサンを繊維化する工程、を含む、コラーゲン・キトサン複合細繊維の製造方法に関する。
また、本発明は、コラーゲン及びキトサンを均一に混合し、ｐＨ６．０〜８．０及び塩濃度が１５ｍＭ以上のコラーゲン・キトサン混合緩衝溶液を調製する工程、及び前記コラーゲン・キトサン混合緩衝溶液を、繊維調整温度に上昇させることによってコラーゲン及びキトサンを繊維化し、コラーゲン・キトサン複合細繊維を含むゲルを調整する工程、を含む、コラーゲン・キトサン複合繊維ゲルの製造方法に関する。
また、本発明は、コラーゲン及びキトサンを均一に混合し、ｐＨ６．０〜８．０及び塩濃度が１５ｍＭ以上のコラーゲン・キトサン混合緩衝溶液を調製する工程、前記コラーゲン・キトサン混合緩衝溶液を、繊維調整温度に上昇させることによってコラーゲン及びキトサンを繊維化し、コラーゲン・キトサン複合繊維ゲルを調整する工程、及び前記コラーゲン・キトサン複合繊維ゲルを乾燥させる工程、を含む、コラーゲン・キトサン複合繊維状多孔体の製造方法に関する。
本発明のコラーゲン・キトサン複合繊維状多孔体の製造方法の好ましい態様においては、更に、前記コラーゲン・キトサン複合細繊維を架橋する工程を含む。
本明細書において、コラーゲン・キトサン複合細繊維の製造方法、コラーゲン・キトサン複合繊維ゲルの製造方法、及びコラーゲン・キトサン複合繊維状多孔体の製造方法を併せて、本発明の製造方法と称することがある。
また、本発明は、コラーゲン及びキトサンを均一に混合し、ｐＨ６．０〜８．０及び塩濃度が１５ｍＭ以上のコラーゲン・キトサン混合緩衝溶液を調製する工程、及び前記コラーゲン・キトサン混合緩衝溶液を、繊維調整温度に上昇させることによってコラーゲン及びキトサンを繊維化し、コラーゲン・キトサン複合細繊維を含むゲルを調整する工程、を含む、コラーゲン・キトサン複合繊維ゲルの製造方法に関する。
また、本発明は、コラーゲン及びキトサンを均一に混合し、ｐＨ６．０〜８．０及び塩濃度が１５ｍＭ以上のコラーゲン・キトサン混合緩衝溶液を調製する工程、前記コラーゲン・キトサン混合緩衝溶液を、繊維調整温度に上昇させることによってコラーゲン及びキトサンを繊維化し、コラーゲン・キトサン複合繊維ゲルを調整する工程、及び前記コラーゲン・キトサン複合繊維ゲルを乾燥させる工程、を含む、コラーゲン・キトサン複合繊維状多孔体の製造方法に関する。
本発明のコラーゲン・キトサン複合繊維状多孔体の製造方法の好ましい態様においては、更に、前記コラーゲン・キトサン複合細繊維を架橋する工程を含む。
本明細書において、コラーゲン・キトサン複合細繊維の製造方法、コラーゲン・キトサン複合繊維ゲルの製造方法、及びコラーゲン・キトサン複合繊維状多孔体の製造方法を併せて、本発明の製造方法と称することがある。
本発明のコラーゲン・キトサン複合細繊維を含むコラーゲン・キトサン複合繊維ゲル、又はコラーゲン・キトサン複合繊維状多孔体によれば、従来のコラーゲン細繊維を含むゲルと比較して高い粘弾性特性を示し、生体材料として十分な強度を得ることができる。また、従来の繊維を形成していないコラーゲンとキトサンとを含む生体材料と比較すると、生体内のコラーゲン細繊維と構造が類似しており、生体親和性に優れている。
また、本発明では、特定のゲル化剤などを用いず、均質な構造を有するコラーゲン・キトサン複合細繊維を得ることができる。
また、本発明では、特定のゲル化剤などを用いず、均質な構造を有するコラーゲン・キトサン複合細繊維を得ることができる。
［１］コラーゲン・キトサン複合細繊維
本発明のコラーゲン・キトサン複合細繊維は、コラーゲンとキトサンとがそれらの相互作用により、繊維化されたものである。
コラーゲンは、柔軟性及び生体親和性に優れているが、力学特性が低い。コラーゲンのポリペプチド鎖（以下、α鎖と称することがある）は３個のアミノ酸が並んだユニット「Ｇ−Ｘ−Ｙ」のつながりからできており、Ｇはグリシンを表し、Ｘはプロリン、そしてＹはヒドロキシプロリンであることが多い。このアミノ酸配列のためコラーゲンは、３本のα鎖からなる３重らせん構造を形成する。また、アミノ基及びカルボキシル基を有する両性高分子である。ｐＫａは９．２であり、この等電点より低い溶液中ではアミノ基は酸性溶液でＮＨ３ ＋に帯電し、この等電点より高い溶液中ではカルボキシル基はＣＯＯ−に荷電している。このためコラーゲンは、溶液のｐＨによりプラス又はマイナスの電荷をもつ。また、ｐＨ及び温度を調整することにより、３重らせん構造の分子が主に水素結合により会合し、コラーゲン細繊維を形成する。
キトサンは、多糖類の１種であり、力学特性が高く、熱に強いという性質を有している。また、抗菌性を有し、血液の凝集を促進するが、生体親和性は低い。キトサンは、脱アセチル化度によりｐＫａ５．０から６．５のカチオン性高分子であり、豊富なアミノ基を有しており、ｐＨ５．０未満ではアミノ基がＮＨ３ ＋に帯電している。
本発明のコラーゲン・キトサン複合細繊維は、コラーゲンとキトサンとがそれらの相互作用により、繊維化されたものである。
コラーゲンは、柔軟性及び生体親和性に優れているが、力学特性が低い。コラーゲンのポリペプチド鎖（以下、α鎖と称することがある）は３個のアミノ酸が並んだユニット「Ｇ−Ｘ−Ｙ」のつながりからできており、Ｇはグリシンを表し、Ｘはプロリン、そしてＹはヒドロキシプロリンであることが多い。このアミノ酸配列のためコラーゲンは、３本のα鎖からなる３重らせん構造を形成する。また、アミノ基及びカルボキシル基を有する両性高分子である。ｐＫａは９．２であり、この等電点より低い溶液中ではアミノ基は酸性溶液でＮＨ３ ＋に帯電し、この等電点より高い溶液中ではカルボキシル基はＣＯＯ−に荷電している。このためコラーゲンは、溶液のｐＨによりプラス又はマイナスの電荷をもつ。また、ｐＨ及び温度を調整することにより、３重らせん構造の分子が主に水素結合により会合し、コラーゲン細繊維を形成する。
キトサンは、多糖類の１種であり、力学特性が高く、熱に強いという性質を有している。また、抗菌性を有し、血液の凝集を促進するが、生体親和性は低い。キトサンは、脱アセチル化度によりｐＫａ５．０から６．５のカチオン性高分子であり、豊富なアミノ基を有しており、ｐＨ５．０未満ではアミノ基がＮＨ３ ＋に帯電している。
本発明のコラーゲン・キトサン複合細繊維の構造は、完全に解明されているわけではないが、コラーゲンのマイナスに荷電したカルボキシル基と、キトサンのプラスに荷電したアミノ基とが、相互作用することによって、会合しているものと推定される。すなわち、コラーゲン・キトサン複合細繊維においては、３重らせん構造のコラーゲン分子とキトサン分子が、カルボキシル基とアミノ基とのイオン結合によって繊維化し、強固な細繊維構造を形成しているものと考えられる。しかしながら、本発明は前記の説明によって限定されるものではない。
前記コラーゲン・キトサン複合細繊維の直径は、特に限定されるものではないが、５０〜２００ｎｍが好ましく、５０〜１５０ｎｍがより好ましく、７０〜１５０ｎｍが更に好ましい。５０〜２００ｎｍのコラーゲン・キトサン複合細繊維は、力学特性が、特に上昇するからである。
また、コラーゲン・キトサン複合細繊維に含まれるコラーゲン及びキトサンのモル比は、コラーゲンのみからなるコラーゲン細繊維と比較して力学特性が向上している限り、限定されるものではないが、通常１００：１〜１：１００の範囲であり、好ましくは１０：１〜１：１０であり、より好ましくは５：１〜１：５であり、更に好ましくは４：１〜１：４であり、最も好ましくは１：１である。コラーゲンとキトサンとのモル比が１：１に近いと、コラーゲンのカルボキシル基とキトサン分子のアミノ基との相互作用が、最適になると考えられるからである。
また、コラーゲン・キトサン複合細繊維に含まれるコラーゲン及びキトサンのモル比は、コラーゲンのみからなるコラーゲン細繊維と比較して力学特性が向上している限り、限定されるものではないが、通常１００：１〜１：１００の範囲であり、好ましくは１０：１〜１：１０であり、より好ましくは５：１〜１：５であり、更に好ましくは４：１〜１：４であり、最も好ましくは１：１である。コラーゲンとキトサンとのモル比が１：１に近いと、コラーゲンのカルボキシル基とキトサン分子のアミノ基との相互作用が、最適になると考えられるからである。
（コラーゲン）
前記コラーゲン・キトサン複合細繊維を構成するコラーゲンの型は、３重らせん構造を有するものであれば特に限定されるものではなく、Ｉ型からＸIII型の全てのタイプのコラーゲンを用いることができるが、入手の容易性からＩ型コラーゲンを用いることが好ましい。また、コラーゲンを取得する動物種の由来も、特に限定されるものではなく、例えば、ウシ、ヒツジ、ブタ、鶏、ダチョウ、ウサギ、ラット、及び魚類の皮膚、骨、浮袋、皮、筋肉、鱗、及び軟骨を挙げることができる。更に様々な細胞から抽出・精製されたコラーゲンや遺伝子組み換え操作により製造される人工コラーゲンなども挙げることができる。しかしながら、本発明のコラーゲン・キトサン複合細繊維を生体材料として用いる観点からは、人獣共通感染症のない魚類由来コラーゲンが好ましい。コラーゲンを取得する魚類は、特に限定されるものではなく、例えば、テラピア、タイ、ヒラメ、サメ、イワシ、マグロ、フグ、キンギョ、タラ、カレイ、コイ、クラゲ、及びサケを挙げることができる。特には、変性温度が比較的高いコラーゲンを取得できることから、水温の高い川、湖沼、又は海に生息する魚類が好ましく、例えばオレオクロミス属の魚類が好ましく、日本や中国で食用として養殖されており入手が容易であるナイルテラピア（Oreochromis niloticus）が特に好ましい。また、魚類由来コラーゲンを取得する部位も、限定されるものではなく、皮又は鱗を挙げることができるが、魚臭の原因となる脂質が少ないことから、鱗が好ましく、従って、魚鱗由来コラーゲンが好ましい。
前記コラーゲン・キトサン複合細繊維を構成するコラーゲンの型は、３重らせん構造を有するものであれば特に限定されるものではなく、Ｉ型からＸIII型の全てのタイプのコラーゲンを用いることができるが、入手の容易性からＩ型コラーゲンを用いることが好ましい。また、コラーゲンを取得する動物種の由来も、特に限定されるものではなく、例えば、ウシ、ヒツジ、ブタ、鶏、ダチョウ、ウサギ、ラット、及び魚類の皮膚、骨、浮袋、皮、筋肉、鱗、及び軟骨を挙げることができる。更に様々な細胞から抽出・精製されたコラーゲンや遺伝子組み換え操作により製造される人工コラーゲンなども挙げることができる。しかしながら、本発明のコラーゲン・キトサン複合細繊維を生体材料として用いる観点からは、人獣共通感染症のない魚類由来コラーゲンが好ましい。コラーゲンを取得する魚類は、特に限定されるものではなく、例えば、テラピア、タイ、ヒラメ、サメ、イワシ、マグロ、フグ、キンギョ、タラ、カレイ、コイ、クラゲ、及びサケを挙げることができる。特には、変性温度が比較的高いコラーゲンを取得できることから、水温の高い川、湖沼、又は海に生息する魚類が好ましく、例えばオレオクロミス属の魚類が好ましく、日本や中国で食用として養殖されており入手が容易であるナイルテラピア（Oreochromis niloticus）が特に好ましい。また、魚類由来コラーゲンを取得する部位も、限定されるものではなく、皮又は鱗を挙げることができるが、魚臭の原因となる脂質が少ないことから、鱗が好ましく、従って、魚鱗由来コラーゲンが好ましい。
（キトサン）
キトサンは、節足動物や甲殻類の外骨格から得られるキチン（ポリ−β→４−Ｎ−アセチルグルコサミン）を、脱アセチル化することによって、得ることができる。キチンの脱アセチル化度は、特に限定させるものではないが、６０〜１００％が好ましく、７０〜１００％がより好ましく、８０〜１００％が更に好ましく、９０〜１００％が最も好ましい。１００％に近いほうが、コラーゲンのカルボキシル基と相互作用するアミノ基が多くなるからである。また、キトサンの由来も、特に限定されるものではなく、カニ、エビ、オキアミ、フジツボ、及びミジンコを挙げることができるが、カニは甲羅が大きく商業的に量産化されている点から好ましい。
キトサンは、節足動物や甲殻類の外骨格から得られるキチン（ポリ−β→４−Ｎ−アセチルグルコサミン）を、脱アセチル化することによって、得ることができる。キチンの脱アセチル化度は、特に限定させるものではないが、６０〜１００％が好ましく、７０〜１００％がより好ましく、８０〜１００％が更に好ましく、９０〜１００％が最も好ましい。１００％に近いほうが、コラーゲンのカルボキシル基と相互作用するアミノ基が多くなるからである。また、キトサンの由来も、特に限定されるものではなく、カニ、エビ、オキアミ、フジツボ、及びミジンコを挙げることができるが、カニは甲羅が大きく商業的に量産化されている点から好ましい。
［２］コラーゲン・キトサン複合繊維状ゲル
本発明のコラーゲン・キトサン複合繊維状ゲルは、分散質として前記コラーゲン・キトサン複合細繊維を含むものである。本発明のコラーゲン・キトサン複合繊維状ゲルにおける分散媒は、特に限定されるものではなく、水性の分散媒でも有機溶媒系の分散媒でもよいが、生体材料として用いる場合は人体に害のない水性の分散媒を用いるほうが好ましい。
本発明のコラーゲン・キトサン複合繊維状ゲルは、分散質として前記コラーゲン・キトサン複合細繊維を含むものである。本発明のコラーゲン・キトサン複合繊維状ゲルにおける分散媒は、特に限定されるものではなく、水性の分散媒でも有機溶媒系の分散媒でもよいが、生体材料として用いる場合は人体に害のない水性の分散媒を用いるほうが好ましい。
本発明のコラーゲン・キトサン複合繊維状ゲルは、コラーゲン細繊維のみからなるゲルと比較すると、貯蔵弾性率が顕著に向上しており、３００Ｐａ（１Ｈｚ）以上である。また、コラーゲン・キトサン複合繊維状ゲルは、コラーゲン・キトサン複合細繊維が架橋されることによって、更に貯蔵弾性率が向上する。架橋は、グルタルアルデヒド又はカルボジイミドなどの架橋剤によって行うことができる。
［３］コラーゲン・キトサン複合繊維状多孔体
本発明のコラーゲン・キトサン複合繊維状多孔体は、前記コラーゲン・キトサン複合細繊維を含むものであり、前記コラーゲン・キトサン複合繊維状ゲルを凍結乾燥法又はキャスト法により乾燥させ、分散媒が除去されたものである。従って、コラーゲン・キトサン複合繊維状多孔体を、細胞培養基材、再生医療用の足場材料（例えば、軟骨、骨、皮膚、及び肝臓組織の再生材料）、移植用材料（創傷被覆材料、骨補填剤、又は止血材料）、又は薬物送達担体として使用する場合は、そのアプリケーションに適した溶媒で膨潤させて使用することが望ましい。
本発明のコラーゲン・キトサン複合繊維状多孔体は、前記コラーゲン・キトサン複合細繊維を含むものであり、前記コラーゲン・キトサン複合繊維状ゲルを凍結乾燥法又はキャスト法により乾燥させ、分散媒が除去されたものである。従って、コラーゲン・キトサン複合繊維状多孔体を、細胞培養基材、再生医療用の足場材料（例えば、軟骨、骨、皮膚、及び肝臓組織の再生材料）、移植用材料（創傷被覆材料、骨補填剤、又は止血材料）、又は薬物送達担体として使用する場合は、そのアプリケーションに適した溶媒で膨潤させて使用することが望ましい。
また、本発明のコラーゲン・キトサン複合繊維状多孔体は、熱架橋又は化学架橋により、コラーゲン・キトサン複合細繊維を架橋することによって、力学特性を更に向上させることが可能である。
（生体材料）
本発明の複合繊維状多孔体は、生体材料、例えば、細胞培養基材、再生医療用の足場材料（例えば、軟骨、骨、皮膚、及び肝臓組織の再生材料）、移植用材料（創傷被覆材料、骨補填剤、又は止血材料）、又は薬物送達担体として用いることができる。複合繊維状多孔体は、水分などの溶媒を含まないため、生体材料として用いる場合は、溶媒に浸漬させて用いることが好ましい。複合繊維状多孔体を浸漬する溶媒としては、水、アルコール、細胞培養液、リン酸緩衝溶液、炭酸緩衝溶液、及びリンゲル液などを挙げることができる。
前記コラーゲン・キトサン複合繊維状多孔体を溶媒に浸漬した場合の膨潤度は、コラーゲン細繊維のみからなる多孔体と比較すると、１／３程度であり、従って、力学特性が高く、操作性も優れている。
本発明の複合繊維状多孔体は、生体材料、例えば、細胞培養基材、再生医療用の足場材料（例えば、軟骨、骨、皮膚、及び肝臓組織の再生材料）、移植用材料（創傷被覆材料、骨補填剤、又は止血材料）、又は薬物送達担体として用いることができる。複合繊維状多孔体は、水分などの溶媒を含まないため、生体材料として用いる場合は、溶媒に浸漬させて用いることが好ましい。複合繊維状多孔体を浸漬する溶媒としては、水、アルコール、細胞培養液、リン酸緩衝溶液、炭酸緩衝溶液、及びリンゲル液などを挙げることができる。
前記コラーゲン・キトサン複合繊維状多孔体を溶媒に浸漬した場合の膨潤度は、コラーゲン細繊維のみからなる多孔体と比較すると、１／３程度であり、従って、力学特性が高く、操作性も優れている。
［４］コラーゲン・キトサン複合細繊維又はコラーゲン・キトサン複合繊維状ゲルの製造方法
本発明のコラーゲン・キトサン複合細繊維の製造方法（以下、複合細繊維製造方法と称することがある）は、コラーゲン及びキトサンを均一に混合し、ｐＨ６．０〜８．０及び塩濃度が１５ｍＭ以上のコラーゲン・キトサン混合緩衝溶液を調製する工程（以下、混合緩衝溶液調整工程と称する）、及び前記コラーゲン・キトサン混合緩衝溶液を、繊維調整温度に上昇させることによってコラーゲン及びキトサンを繊維化する工程（以下、繊維化工程と称する）を含む。本発明の複合細繊維製造方法によって、本発明のコラーゲン・キトサン複合細繊維を製造することができるが、コラーゲン・キトサン複合細繊維の製造方法は、本発明の複合細繊維製造方法に限定されるものではない。
また、コラーゲン・キトサン複合繊維状ゲルの製造方法（以下、複合繊維状ゲル製造方法と称することがある）は、コラーゲン及びキトサンを均一に混合し、ｐＨ６．１〜７．５及び塩濃度が１５ｍＭ以上のコラーゲン・キトサン混合緩衝溶液を調製する工程（以下、混合緩衝溶液調整工程と称する）、及び前記コラーゲン・キトサン混合緩衝溶液を、繊維調整温度に上昇させることによってコラーゲン及びキトサンを繊維化し、コラーゲン・キトサン複合細繊維を含むゲルを調整する工程（以下、ゲル調整工程と称する）を含む。本発明の複合繊維状ゲル製造方法によって、本発明のコラーゲン・キトサン複合繊維状ゲルを製造することができるが、コラーゲン・キトサン複合繊維状ゲルの製造方法は、本発明の複合繊維状ゲル製造方法に限定されるものではない。
本発明のコラーゲン・キトサン複合細繊維の製造方法（以下、複合細繊維製造方法と称することがある）は、コラーゲン及びキトサンを均一に混合し、ｐＨ６．０〜８．０及び塩濃度が１５ｍＭ以上のコラーゲン・キトサン混合緩衝溶液を調製する工程（以下、混合緩衝溶液調整工程と称する）、及び前記コラーゲン・キトサン混合緩衝溶液を、繊維調整温度に上昇させることによってコラーゲン及びキトサンを繊維化する工程（以下、繊維化工程と称する）を含む。本発明の複合細繊維製造方法によって、本発明のコラーゲン・キトサン複合細繊維を製造することができるが、コラーゲン・キトサン複合細繊維の製造方法は、本発明の複合細繊維製造方法に限定されるものではない。
また、コラーゲン・キトサン複合繊維状ゲルの製造方法（以下、複合繊維状ゲル製造方法と称することがある）は、コラーゲン及びキトサンを均一に混合し、ｐＨ６．１〜７．５及び塩濃度が１５ｍＭ以上のコラーゲン・キトサン混合緩衝溶液を調製する工程（以下、混合緩衝溶液調整工程と称する）、及び前記コラーゲン・キトサン混合緩衝溶液を、繊維調整温度に上昇させることによってコラーゲン及びキトサンを繊維化し、コラーゲン・キトサン複合細繊維を含むゲルを調整する工程（以下、ゲル調整工程と称する）を含む。本発明の複合繊維状ゲル製造方法によって、本発明のコラーゲン・キトサン複合繊維状ゲルを製造することができるが、コラーゲン・キトサン複合繊維状ゲルの製造方法は、本発明の複合繊維状ゲル製造方法に限定されるものではない。
また、複合細繊維製造方法における混合緩衝溶液調整工程と、複合繊維状ゲル製造方法における混合緩衝溶液調整工程とは、基本的に同じ条件で行うことができる。更に複合細繊維製造方法における繊維化工程及び複合繊維状ゲル製造方法におけるゲル調整工程も、基本的に同じ条件で行うことができる。従って、以下の説明は複合細繊維製造方法及び複合繊維状ゲル製造方法に共通するものである。
（混合緩衝溶液調整工程）
本発明の製造方法においては、コラーゲン・キトサン混合緩衝溶液のｐＨ及び塩濃度を調整することが重要である。すなわち、コラーゲン・キトサン混合緩衝溶液のｐＨを６．０〜８．０に調整し、塩濃度を１５ｍＭ以上に調整することによって、後述の繊維化工程及びゲル調整工程において、混合緩衝溶液を、繊維調整温度に上昇させた場合に、力学特性の優れたコラーゲン・キトサン複合細繊維が形成される。
本発明の製造方法においては、コラーゲン・キトサン混合緩衝溶液のｐＨ及び塩濃度を調整することが重要である。すなわち、コラーゲン・キトサン混合緩衝溶液のｐＨを６．０〜８．０に調整し、塩濃度を１５ｍＭ以上に調整することによって、後述の繊維化工程及びゲル調整工程において、混合緩衝溶液を、繊維調整温度に上昇させた場合に、力学特性の優れたコラーゲン・キトサン複合細繊維が形成される。
コラーゲン・キトサン混合緩衝溶液のｐＨは、前記のようにｐＨ６．０〜８．０であり、好ましくはｐＨ６．０〜７．５であり、最も好ましくはｐＨ６．０〜７．０である。ｐＨ６．０未満では、コラーゲン及びキトサンが可溶性であり、塩濃度や温度を調整しても、細繊維を形成することが困難であり、また、ｐＨ８．０を超えると温度を上昇させる前に繊維化が始まることがあるからである。更に、特にｐＨ６．０〜７．０においては、力学特性の優れたコラーゲン・キトサン複合繊維状ゲルを得ることができるからである。
コラーゲン・キトサン混合緩衝溶液の塩濃度は、前記のように１５ｍＭ以上であり、好ましくは２０ｍＭ以上であり、最も好ましくは２５ｍＭ以上である。塩濃度が１５ｍＭ以上であると、含まれる陰イオンがキトサンと相互作用して緩やかに反応を引き起こし、コラーゲン・キトサン複合細繊維を形成させることができるからである。また、塩濃度の上限は、特に限定されるものではないが、好ましくは２００ｍＭ以下であり、より好ましくは１００ｍＭ以下であり、最も好ましくは７０ｍＭ以下である。
前記コラーゲン・キトサン複合細繊維の形成には、ｐＨが低い領域、例えばｐＨ６．０〜ｐＨ６．５程度においては、一定以上の塩濃度、例えば１５ｍＭ以上の塩濃度が必要となる。一方、ｐＨ６．５〜８．０の領域では、コラーゲン・キトサン複合細繊維の形成には、塩濃度よりもｐＨの作用の影響が大きいが、１５ｍＭ以上でコラーゲン・キトサン複合細繊維の形成を行うことができる。
また、後述の実施例で示したように、魚類由来のＩ型コラーゲンにおいては、コラーゲン・キトサン混合緩衝溶液のｐＨを６．０〜８．０に調整し、塩濃度を１５ｍＭ以上に調整することによって、コラーゲン・キトサン複合細繊維が形成される。コラーゲンのタイプ（Ｉ型コラーゲン〜ＸIII型コラーゲン）及びコラーゲンの由来する動物種によっては、コラーゲン・キトサン複合細繊維が形成することのできるｐＨ及び／又は塩濃度が、若干変動することがある。しかしながら、本発明の属する分野の当業者であれば、本明細書の記載に従って、ｐＨ及び塩濃度の下限、又は上限を適宜決定することが可能であり、その決定されたｐＨ及び塩濃度の下限又は上限は、本発明の範囲に属するものである。
前記コラーゲン・キトサン混合緩衝溶液の温度は、混合緩衝溶液の状態でコラーゲン・キトサン複合細繊維の繊維化が開始しない温度である限り、限定されるものではないが、１℃〜２５℃が好ましく、１℃〜１５℃がより好ましく、１℃〜１０℃が更に好ましく、２℃〜６℃が最も好ましい。１℃未満では混合緩衝溶液が、凍結することがあり、２５℃を超えると、コラーゲン・キトサン複合細繊維の繊維化が開始する可能性があるからである。
混合緩衝溶液調整工程において、コラーゲン・キトサン混合緩衝溶液を作成する手順は、混合緩衝溶液のｐＨが急激にアルカリ性になることがなく、そして温度が２５℃を超えることなしに、目的のｐＨ及び塩濃度に調整される限り、特に限定されるものではない。しかしながら、コラーゲン及びキトサンは、酸性の溶液に溶解したほうが安定である。従って、好適な混合緩衝溶液調整工程としては、以下のような手順が考えられる。例えば、予めコラーゲンの溶解したコラーゲン酸性溶液、及びキトサンの溶解したキトサン酸性溶液を調整し、これらを混合してコラーゲン・キトサン混合溶液を作成して、これにアルカリ性の緩衝液を添加する手順、又はコラーゲン及びキトサンの溶解したコラーゲン・キトサン混合溶液を作製して、これにアルカリ性の緩衝液を添加する手順などである。
例えば、前者の手順に従えば、混合緩衝溶液調整工程は、コラーゲン酸性溶液及びキトサン酸性溶液を混合し、コラーゲン・キトサン混合溶液を作製する工程、及びコラーゲン・キトサン混合溶液にアルカリ性緩衝液を添加する工程の２つの工程に分けて行うことができる。
コラーゲン酸性溶液に用いる酸は、無機酸又は有機酸を用いることができる。無機酸としては、塩酸、リン酸、硝酸、及び硫酸を挙げることができ、有機酸としては、酢酸、ギ酸、クエン酸及びシュウ酸を挙げることができる。また、コラーゲン酸性溶液のｐＨは、ｐＨ２．０〜４．０が好ましい。
キトサン酸性溶液に用いる酸は、無機酸又は有機酸を用いることができるが、好ましくは有機酸である。有機酸としては、酢酸、ギ酸、クエン酸及びシュウ酸を挙げることができる。また、キトサン酸性溶液のｐＨは、ｐＨ２．０〜５．０が好ましい。
コラーゲン酸性溶液に用いる酸は、無機酸又は有機酸を用いることができる。無機酸としては、塩酸、リン酸、硝酸、及び硫酸を挙げることができ、有機酸としては、酢酸、ギ酸、クエン酸及びシュウ酸を挙げることができる。また、コラーゲン酸性溶液のｐＨは、ｐＨ２．０〜４．０が好ましい。
キトサン酸性溶液に用いる酸は、無機酸又は有機酸を用いることができるが、好ましくは有機酸である。有機酸としては、酢酸、ギ酸、クエン酸及びシュウ酸を挙げることができる。また、キトサン酸性溶液のｐＨは、ｐＨ２．０〜５．０が好ましい。
コラーゲン酸性溶液及びキトサン酸性溶液を混合し、コラーゲン・キトサン混合溶液を作製する。次に、コラーゲン・キトサン混合溶液に、ｐＨが急激に上昇しないように注意しながら、アルカリ性緩衝液を少しずつ添加する。アルカリ性緩衝液にコラーゲン・キトサン混合溶液を添加すると、局所的にコラーゲン・キトサン混合溶液のｐＨが上昇し、コラーゲン・キトサン複合細繊維の繊維化が開始することがあり、好ましくない。得られたコラーゲン・キトサン混合溶液は、０．５〜１２時間程度、２５℃未満、より好ましくは１℃〜１５℃、更に好ましくは１℃〜１０℃、最も好ましくは２℃〜６℃で撹拌し、均一に混合させる。コラーゲン及びキトサンが均一に混合されることにより、得られたコラーゲン・キトサン複合細繊維の力学特性が上昇するからである。
アルカリ性緩衝液は、特に限定されるものではなく、炭酸緩衝液、リン酸緩衝液、トリス塩酸緩衝液、ＨＥＰＥＳ緩衝液、及びグリシン−水酸化ナトリウム緩衝液などを用いることができるが、得られるコラーゲン・キトサン複合細繊維、コラーゲン・キトサン複合繊維状ゲル、及びコラーゲン・キトサン複合細繊状多孔体を生体材料として用いる場合は、炭酸緩衝液、又はリン酸緩衝液が好ましい。特に、炭酸緩衝液は、ｐＨ制御範囲が広く、炭酸イオンはキトサンと反応しｐＨを酸性側にシフトさせることができるため、より好ましい。
アルカリ性緩衝液は、特に限定されるものではなく、炭酸緩衝液、リン酸緩衝液、トリス塩酸緩衝液、ＨＥＰＥＳ緩衝液、及びグリシン−水酸化ナトリウム緩衝液などを用いることができるが、得られるコラーゲン・キトサン複合細繊維、コラーゲン・キトサン複合繊維状ゲル、及びコラーゲン・キトサン複合細繊状多孔体を生体材料として用いる場合は、炭酸緩衝液、又はリン酸緩衝液が好ましい。特に、炭酸緩衝液は、ｐＨ制御範囲が広く、炭酸イオンはキトサンと反応しｐＨを酸性側にシフトさせることができるため、より好ましい。
本発明の製造方法に用いるコラーゲンとしては、前記「コラーゲン・キトサン複合細繊維」に記載のコラーゲンを用いることができる。また、本発明の製造方法に用いるキトサンとしては、前記「コラーゲン・キトサン複合細繊維」に記載のキトサンを用いることができる。なお、キトサンの脱アセチル化度は、特に限定されるものではないが、６０〜１００％のものを用い、７０〜１００％がより好ましく、８０〜１００％が更に好ましく、９０〜１００％が最も好ましい。１００％に近いほうが、コラーゲンのカルボキシル基と相互作用する、アミノ基が多くなるからである。
コラーゲン・キトサン混合緩衝溶液中の、コラーゲンとキトサンとのモル比は、特に制限されるものではないが、通常１００：１〜１：１００の範囲であり、好ましくは１０：１〜１：１０であり、より好ましくは５：１〜１：５であり、更に好ましくは４：１〜１：４であり、最も好ましくは１：１である。コラーゲンとキトサンとのモル比が１：１に近いと、コラーゲンのカルボキシル基とキトサン分子のアミノ基との相互作用が、最適になり、貯蔵弾性率が上昇するからである。
コラーゲン・キトサン混合緩衝溶液中の、コラーゲンとキトサンとのモル比は、特に制限されるものではないが、通常１００：１〜１：１００の範囲であり、好ましくは１０：１〜１：１０であり、より好ましくは５：１〜１：５であり、更に好ましくは４：１〜１：４であり、最も好ましくは１：１である。コラーゲンとキトサンとのモル比が１：１に近いと、コラーゲンのカルボキシル基とキトサン分子のアミノ基との相互作用が、最適になり、貯蔵弾性率が上昇するからである。
（繊維化工程、及びゲル調整工程）
本発明の製造方法における繊維化工程、及びゲル調整工程では、前記コラーゲン・キトサン混合緩衝溶液を、繊維調整温度に上昇させることによって、コラーゲン及びキトサンを繊維化し、コラーゲン・キトサン複合細繊維を得ることができ、またコラーゲン・キトサン複合細繊維が分散質として、水系の分散媒などに含まれたコラーゲン・キトサン複合繊維状ゲルを得ることができる。
繊維化工程、及びゲル調整工程においては、コラーゲン・キトサン混合緩衝溶液を、繊維調整温度に上昇させることによって、コラーゲン及びキトサンの相互作用が始まり、コラーゲン・キトサン複合細繊維が形成する。
本発明の製造方法における繊維化工程、及びゲル調整工程では、前記コラーゲン・キトサン混合緩衝溶液を、繊維調整温度に上昇させることによって、コラーゲン及びキトサンを繊維化し、コラーゲン・キトサン複合細繊維を得ることができ、またコラーゲン・キトサン複合細繊維が分散質として、水系の分散媒などに含まれたコラーゲン・キトサン複合繊維状ゲルを得ることができる。
繊維化工程、及びゲル調整工程においては、コラーゲン・キトサン混合緩衝溶液を、繊維調整温度に上昇させることによって、コラーゲン及びキトサンの相互作用が始まり、コラーゲン・キトサン複合細繊維が形成する。
本発明の製造方法において、前記混合緩衝溶液調整工程における上限温度（保持温度）、並びに繊維化工程及びゲル調整工程における繊維調整温度は、コラーゲン・キトサン複合細繊維の繊維化を行う上で重要である。一般的に、混合緩衝溶液調整工程における上限温度（保持温度）は、繊維化を起こさないために、室温以下、例えば２５℃以下が好ましく、２０℃以下がより好ましい。一方、繊維調整温度は繊維化を開始し、且つコラーゲンの３重らせん構造を破壊させないために、室温から各コラーゲンの変性温度が好ましく、各コラーゲンの「（変性温度−１５℃）〜変性温度」が更に好ましく、「（変性温度−１０℃）〜（変性温度−４℃）」がより好ましく、例えば、２０℃〜３５℃で繊維化をすることができる。
前記混合緩衝溶液調整工程における上限温度（保持温度）、及び繊維調整温度は、用いるコラーゲンの由来によって繊維化を開始する温度及び変性温度が異なるため、例えば哺乳類のコラーゲンを用いた場合は高く、魚類のコラーゲンを用いた場合は低い。従って、混合緩衝溶液調整工程におけるコラーゲン・キトサン混合緩衝溶液の上限温度（保持温度）及び繊維調整温度は用いるコラーゲンによって適宜決定することができる。以下の表１にコラーゲンの由来による「混合緩衝溶液調整工程における上限温度（保持温度）」及び「繊維調整温度」の例を纏めた。なお、繊維調整温度の上限が、それぞれのコラーゲンの変性温度である。
なお、本発明の複合細繊維製造法及び複合繊維状ゲル製造方法においては、コラーゲンの３重らせん構造が破壊され、コラーゲンの変性が起きない温度で、混合緩衝溶液調整工程、繊維化工程、及びゲル調整工程を行う必要がある。変性温度以上になると、３重らせん構造が壊れ、コラーゲンがゼラチンとなるからである。
また、本発明の複合繊維状ゲル製造方法におけるゲル調整工程においては、更に前記コラーゲン・キトサン複合細繊維を架橋してもよい。ゲル調整工程における架橋は、化学架橋が好ましく、得られたゲルをグルタルアルデヒド溶液又はカルボジイミド溶液に浸漬することによって、コラーゲン・キトサン複合細繊維が架橋され、複合繊維状ゲルの力学特性が、更に向上する。
［５］コラーゲン・キトサン複合繊維状多孔体の製造方法
本発明のコラーゲン・キトサン複合繊維状多孔体の製造方法（以下、複合繊維状多孔体製造方法と称することがある）は、コラーゲン及びキトサンを均一に混合し、ｐＨ６．０〜８．０及び塩濃度が１５ｍＭ以上のコラーゲン・キトサン混合緩衝溶液を調製する工程（以下、混合緩衝溶液調整工程と称する）、前記コラーゲン・キトサン混合緩衝溶液を、繊維調整温度に上昇させることによってコラーゲン及びキトサンを繊維化し、コラーゲン・キトサン複合繊維ゲルを調整する工程（以下、ゲル調整工程と称する）、及び前記コラーゲン・キトサン複合繊維ゲルを乾燥させる工程（以下、乾燥工程と称する）を含む。本発明の複合繊維状多孔体製造方法によって、本発明のコラーゲン・キトサン複合繊維状多孔体を製造することができるが、コラーゲン・キトサン複合繊維状多孔体の製造方法は、本発明の複合繊維状多孔体製造方法に限定されるものではない。
また、複合繊維状多孔体製造方法における混合緩衝溶液調整工程及びゲル調整工程は、それぞれ、複合繊維状ゲル製造方法における混合緩衝溶液調整工程及びゲル調整工程と共通であり、前記複合繊維状ゲル製造方法において説明した操作等を用いることができる。
本発明のコラーゲン・キトサン複合繊維状多孔体の製造方法（以下、複合繊維状多孔体製造方法と称することがある）は、コラーゲン及びキトサンを均一に混合し、ｐＨ６．０〜８．０及び塩濃度が１５ｍＭ以上のコラーゲン・キトサン混合緩衝溶液を調製する工程（以下、混合緩衝溶液調整工程と称する）、前記コラーゲン・キトサン混合緩衝溶液を、繊維調整温度に上昇させることによってコラーゲン及びキトサンを繊維化し、コラーゲン・キトサン複合繊維ゲルを調整する工程（以下、ゲル調整工程と称する）、及び前記コラーゲン・キトサン複合繊維ゲルを乾燥させる工程（以下、乾燥工程と称する）を含む。本発明の複合繊維状多孔体製造方法によって、本発明のコラーゲン・キトサン複合繊維状多孔体を製造することができるが、コラーゲン・キトサン複合繊維状多孔体の製造方法は、本発明の複合繊維状多孔体製造方法に限定されるものではない。
また、複合繊維状多孔体製造方法における混合緩衝溶液調整工程及びゲル調整工程は、それぞれ、複合繊維状ゲル製造方法における混合緩衝溶液調整工程及びゲル調整工程と共通であり、前記複合繊維状ゲル製造方法において説明した操作等を用いることができる。
（乾燥工程）
前記乾燥工程におけるコラーゲン・キトサン複合繊維ゲルを乾燥させる方法としては、コラーゲンの３重らせん構造が破壊される変性温度以上の温度を使用しない限り、限定されるものではなく、例えば凍結乾燥法、キャスト法、風乾法、及び自然乾燥法を用いることができる。例えば、凍結乾燥法を用いる場合、得られたコラーゲン・キトサン複合繊維ゲルを、−２０℃〜−８０℃程度で急速に凍結し、凍結したコラーゲン・キトサン複合繊維ゲルを、真空状態で水分を昇華させることによって、乾燥したコラーゲン・キトサン複合繊維状多孔体を得ることができる。
本乾燥工程において、分散媒を含んだコラーゲン・キトサン複合繊維ゲルの状態において、変性温度以上の熱が加わった場合、コラーゲンの３重らせん構造が破壊され、得られるコラーゲン・キトサン複合繊維状多孔体の強度が低下するため、好ましくない。
前記乾燥工程におけるコラーゲン・キトサン複合繊維ゲルを乾燥させる方法としては、コラーゲンの３重らせん構造が破壊される変性温度以上の温度を使用しない限り、限定されるものではなく、例えば凍結乾燥法、キャスト法、風乾法、及び自然乾燥法を用いることができる。例えば、凍結乾燥法を用いる場合、得られたコラーゲン・キトサン複合繊維ゲルを、−２０℃〜−８０℃程度で急速に凍結し、凍結したコラーゲン・キトサン複合繊維ゲルを、真空状態で水分を昇華させることによって、乾燥したコラーゲン・キトサン複合繊維状多孔体を得ることができる。
本乾燥工程において、分散媒を含んだコラーゲン・キトサン複合繊維ゲルの状態において、変性温度以上の熱が加わった場合、コラーゲンの３重らせん構造が破壊され、得られるコラーゲン・キトサン複合繊維状多孔体の強度が低下するため、好ましくない。
（架橋）
本発明の複合繊維状多孔体の製造方法は、更にコラーゲン・キトサン複合細繊維を架橋する工程を含むことができる。架橋は、コラーゲン・キトサン複合細繊維内部の、コラーゲンの３重らせん構造（トロポコラーゲン）同士の間、及びコラーゲンの３重らせん構造（トロポコラーゲン）及びキトサンの間で起こってもよく、コラーゲン・キトサン複合細繊維同士の間で起こってもよい。
架橋方法は、公知の方法を用いることが可能であり、例えば、物理架橋又は化学架橋を挙げることができる。物理架橋としては、熱架橋（熱脱水（ＤＨＴ）架橋）、紫外線（ＵＶ）照射、又はγ線照射を挙げることができ、化学架橋に用いる架橋剤としては、グルタルアルデヒド（ＧＡ）、ポリエポキシ化合物、カルボジイミド、イソシアネート、又はゲニピンなどの化学架橋剤を用いることができる。化学架橋の場合は、架橋剤を溶媒に溶解させ、複合繊維状多孔体を浸漬することによって、架橋を行う。ＧＡ溶液を用いる場合は、濃度０．５〜２．０％の範囲を用いると均一に架橋を導入することが可能である。また、熱架橋の場合は、複合繊維状多孔体を１００℃〜１４０℃の真空中において、１〜１２時間処理することによって、架橋することができる。更に熱架橋を行った後に、前記化学架橋処理を施したり、２５％ＧＡ溶液やそれを希釈した溶液をデシケーター内に入れて熱架橋した複合繊維状多孔体をいれて２０℃〜５０℃の温度で１時間から２４時間処理を施したり、することで均一に内部まで架橋を導入することが可能である。
架橋を行うことによって、複合繊維状多孔体の強度は、３〜１０倍程度向上する。
本発明の複合繊維状多孔体の製造方法は、更にコラーゲン・キトサン複合細繊維を架橋する工程を含むことができる。架橋は、コラーゲン・キトサン複合細繊維内部の、コラーゲンの３重らせん構造（トロポコラーゲン）同士の間、及びコラーゲンの３重らせん構造（トロポコラーゲン）及びキトサンの間で起こってもよく、コラーゲン・キトサン複合細繊維同士の間で起こってもよい。
架橋方法は、公知の方法を用いることが可能であり、例えば、物理架橋又は化学架橋を挙げることができる。物理架橋としては、熱架橋（熱脱水（ＤＨＴ）架橋）、紫外線（ＵＶ）照射、又はγ線照射を挙げることができ、化学架橋に用いる架橋剤としては、グルタルアルデヒド（ＧＡ）、ポリエポキシ化合物、カルボジイミド、イソシアネート、又はゲニピンなどの化学架橋剤を用いることができる。化学架橋の場合は、架橋剤を溶媒に溶解させ、複合繊維状多孔体を浸漬することによって、架橋を行う。ＧＡ溶液を用いる場合は、濃度０．５〜２．０％の範囲を用いると均一に架橋を導入することが可能である。また、熱架橋の場合は、複合繊維状多孔体を１００℃〜１４０℃の真空中において、１〜１２時間処理することによって、架橋することができる。更に熱架橋を行った後に、前記化学架橋処理を施したり、２５％ＧＡ溶液やそれを希釈した溶液をデシケーター内に入れて熱架橋した複合繊維状多孔体をいれて２０℃〜５０℃の温度で１時間から２４時間処理を施したり、することで均一に内部まで架橋を導入することが可能である。
架橋を行うことによって、複合繊維状多孔体の強度は、３〜１０倍程度向上する。
《コラーゲン・キトサン複合細繊維の構造》
コラーゲンは、酸性溶液中でプラスに帯電し、アルカリ溶液中でマイナスに帯電する性質があり、更に中性付近では見掛け上、中性の電荷となる。コラーゲン分子は、３００ｎｍ×１．５ｎｍの大きさからなる３重らせん構造を持つ棒状の分子であり、塩濃度、塩の種類や温度に強く依存するが、中性付近でコラーゲン細繊維を形成する。一方、脱アセチル化度が高いキトサンは、酸性溶液中ではアミノ基がプラスに帯電している。
コラーゲンは、酸性溶液中でプラスに帯電し、アルカリ溶液中でマイナスに帯電する性質があり、更に中性付近では見掛け上、中性の電荷となる。コラーゲン分子は、３００ｎｍ×１．５ｎｍの大きさからなる３重らせん構造を持つ棒状の分子であり、塩濃度、塩の種類や温度に強く依存するが、中性付近でコラーゲン細繊維を形成する。一方、脱アセチル化度が高いキトサンは、酸性溶液中ではアミノ基がプラスに帯電している。
本発明のコラーゲン・キトサン複合細繊維においては、コラーゲン分子とキトサン分子との静電気的相互作用を、制御することにより、均一なコラーゲンとキトサンとからなるコラーゲン・キトサン複合細繊維の形成が可能となることを見出した。すなわち、例えば炭酸緩衝液を用いて、ｐＨ、塩濃度、及び温度を制御することで、均質で高い粘弾性特性をもつ新規なコラーゲン・キトサン複合細繊維を形成する合成方法を見出した。
コラーゲンとキトサンとからなるコラーゲン・キトサン複合細繊維は、炭酸イオン濃度（ｐＨ）を変えることにより、得られる繊維の直径が変化する。ｐＨを８以上で制御すると、繊維直径が３０〜４０ｎｍとなり、ｐＨ６．５〜７．５では直径約８０〜９０ｎｍであった。
コラーゲンとキトサンとからなるコラーゲン・キトサン複合細繊維は、炭酸イオン濃度（ｐＨ）を変えることにより、得られる繊維の直径が変化する。ｐＨを８以上で制御すると、繊維直径が３０〜４０ｎｍとなり、ｐＨ６．５〜７．５では直径約８０〜９０ｎｍであった。
以下、実施例によって本発明を具体的に説明するが、これらは本発明の範囲を限定するものではない。
《貯蔵弾性率の測定方法》
後述の実施例及び比較例において得られたコラーゲン・キトサン複合繊維状ゲルの貯蔵弾性率は、以下の方法により行った。測定に用いたゲルのサイズは、２５ｍｍ×５ｍｍである。温度２３℃、周波数１Ｈｚ、初期歪み１Ｎの条件下で、動的粘弾性装置ＲｈｅｏＳｔｒｅｓｓ１（Ｈａａｋｅ社製）を用いて、測定を行った。
後述の実施例及び比較例において得られたコラーゲン・キトサン複合繊維状ゲルの貯蔵弾性率は、以下の方法により行った。測定に用いたゲルのサイズは、２５ｍｍ×５ｍｍである。温度２３℃、周波数１Ｈｚ、初期歪み１Ｎの条件下で、動的粘弾性装置ＲｈｅｏＳｔｒｅｓｓ１（Ｈａａｋｅ社製）を用いて、測定を行った。
《実施例１》
（コラーゲン・キトサン複合細繊維及びコラーゲン・キトサン複合繊維状ゲルの製造）
テラピアのウロコから抽出したＩ型アテロコラーゲンを、ｐＨ３の塩酸に２ｗｔ％になるように加え、コラーゲン酸性溶液を調整した。また、脱Ｎ−アセチル化度９３％のキトサンを０．０９Ｍの酢酸に１．６ｗｔ％になるように加え、キトサン酸性溶液を調整した。二つの溶液を等量ずつ加え混合し、２０時間以上４℃で攪拌し、コラーゲン・キトサン混合溶液を得た。この際、コラーゲンとキトサンのモル数が同じになる比率で調整した。
次に、１ｍｏｌ／Ｌの炭酸ナトリウム（ｐＨ１１．５）と１ｍｏｌ／Ｌの炭酸水素ナトリウム（ｐＨ８．７）を調整し、等量混合して炭酸緩衝溶液（ｐＨ９．６）を調整した。この溶液を希釈し、０．３ｍｏｌ／Ｌの炭酸緩衝溶液（ｐＨ９．６）とした。
次いで、コラーゲン・キトサン混合溶液に、炭酸緩衝溶液を体積比率９：１になるように滴下し、２０時間以上４℃で攪拌し、ｐＨ６．６、塩濃度３０ｍＭのコラーゲン・キトサン混合緩衝溶液を得た。このコラーゲン・キトサン混合緩衝溶液を、更に２８℃の乾燥器中に３時間静置して繊維化を生じさせた。
炭酸緩衝溶液滴下では、得られたコラーゲン・キトサン混合緩衝溶液は透明で、２８℃に温度を上昇させることで白濁した繊維状ゲルが得られた。得られた繊維状ゲルの外観を図１に示す。また、コントロールとしてダルベッコスリン酸緩衝溶液（Ｄ−ＰＢＳ）を用いて、同じ条件で作製した純粋なコラーゲン細繊維状ゲルの外観も図１に示す。更に、得られた繊維状ゲルの貯蔵弾性率を測定した結果を、表２及び図３に示す。
（コラーゲン・キトサン複合細繊維及びコラーゲン・キトサン複合繊維状ゲルの製造）
テラピアのウロコから抽出したＩ型アテロコラーゲンを、ｐＨ３の塩酸に２ｗｔ％になるように加え、コラーゲン酸性溶液を調整した。また、脱Ｎ−アセチル化度９３％のキトサンを０．０９Ｍの酢酸に１．６ｗｔ％になるように加え、キトサン酸性溶液を調整した。二つの溶液を等量ずつ加え混合し、２０時間以上４℃で攪拌し、コラーゲン・キトサン混合溶液を得た。この際、コラーゲンとキトサンのモル数が同じになる比率で調整した。
次に、１ｍｏｌ／Ｌの炭酸ナトリウム（ｐＨ１１．５）と１ｍｏｌ／Ｌの炭酸水素ナトリウム（ｐＨ８．７）を調整し、等量混合して炭酸緩衝溶液（ｐＨ９．６）を調整した。この溶液を希釈し、０．３ｍｏｌ／Ｌの炭酸緩衝溶液（ｐＨ９．６）とした。
次いで、コラーゲン・キトサン混合溶液に、炭酸緩衝溶液を体積比率９：１になるように滴下し、２０時間以上４℃で攪拌し、ｐＨ６．６、塩濃度３０ｍＭのコラーゲン・キトサン混合緩衝溶液を得た。このコラーゲン・キトサン混合緩衝溶液を、更に２８℃の乾燥器中に３時間静置して繊維化を生じさせた。
炭酸緩衝溶液滴下では、得られたコラーゲン・キトサン混合緩衝溶液は透明で、２８℃に温度を上昇させることで白濁した繊維状ゲルが得られた。得られた繊維状ゲルの外観を図１に示す。また、コントロールとしてダルベッコスリン酸緩衝溶液（Ｄ−ＰＢＳ）を用いて、同じ条件で作製した純粋なコラーゲン細繊維状ゲルの外観も図１に示す。更に、得られた繊維状ゲルの貯蔵弾性率を測定した結果を、表２及び図３に示す。
（複合繊維状多孔体の製造）
白濁した繊維状ゲルを、更にエタノールシリーズ（５０％、６０％、７５％、９０％、１００％）を用いて脱水し、最後にｔ−ブタノールで置換後、冷蔵庫で凍結させて、Ｖｉｒｔｉｓ ＡｄｖａｎｔａｇｅのＡＤ２．０−ＥＬ−ＳＣを用いて凍結乾燥を行い、複合繊維状多孔体を得た。作製した複合繊維状多孔体の走査型電子顕微鏡像を図２に示す。
なお、コントロールとして前記の純粋なコラーゲン細繊維状ゲルから得た多孔体のコラーゲン繊維の顕微鏡像を示す。
更に、凍結乾燥により作製した複合繊維状多孔体を１３０℃の真空中で３時間処理することによって、熱架橋をコラーゲン・キトサン複合繊維内に導入することができた。
白濁した繊維状ゲルを、更にエタノールシリーズ（５０％、６０％、７５％、９０％、１００％）を用いて脱水し、最後にｔ−ブタノールで置換後、冷蔵庫で凍結させて、Ｖｉｒｔｉｓ ＡｄｖａｎｔａｇｅのＡＤ２．０−ＥＬ−ＳＣを用いて凍結乾燥を行い、複合繊維状多孔体を得た。作製した複合繊維状多孔体の走査型電子顕微鏡像を図２に示す。
なお、コントロールとして前記の純粋なコラーゲン細繊維状ゲルから得た多孔体のコラーゲン繊維の顕微鏡像を示す。
更に、凍結乾燥により作製した複合繊維状多孔体を１３０℃の真空中で３時間処理することによって、熱架橋をコラーゲン・キトサン複合繊維内に導入することができた。
《実施例２》
炭酸緩衝溶液の濃度を０．３ｍｏｌ／Ｌに代えて、０．４ｍｏｌ／Ｌとした以外は、実施例１の操作を繰り返した。コラーゲン・キトサン混合緩衝溶液はｐＨ６．８、塩濃度は４０ｍＭである。
炭酸緩衝溶液滴下では、得られたコラーゲン・キトサン混合緩衝溶液は透明で、２８℃に温度を上昇させることで白濁した繊維状ゲルが得られた。得られた繊維状ゲルの貯蔵弾性率を測定した結果を、表２及び図３に示す。
なお、実施例２においては、複合繊維状多孔体は製造しなかった。
炭酸緩衝溶液の濃度を０．３ｍｏｌ／Ｌに代えて、０．４ｍｏｌ／Ｌとした以外は、実施例１の操作を繰り返した。コラーゲン・キトサン混合緩衝溶液はｐＨ６．８、塩濃度は４０ｍＭである。
炭酸緩衝溶液滴下では、得られたコラーゲン・キトサン混合緩衝溶液は透明で、２８℃に温度を上昇させることで白濁した繊維状ゲルが得られた。得られた繊維状ゲルの貯蔵弾性率を測定した結果を、表２及び図３に示す。
なお、実施例２においては、複合繊維状多孔体は製造しなかった。
《実施例３》
炭酸緩衝溶液の濃度を０．３ｍｏｌ／Ｌに代えて、０．６ｍｏｌ／Ｌとした以外は、実施例１の操作を繰り返した。コラーゲン・キトサン混合緩衝溶液はｐＨ７．５、塩濃度は６０ｍＭである。
炭酸緩衝溶液滴下では、得られたコラーゲン・キトサン混合緩衝溶液は透明で、２８℃に温度を上昇させることで白濁した繊維状ゲルが得られた。得られた繊維状ゲルの外観を図１に示す。更に、得られた繊維状ゲルの貯蔵弾性率を測定した結果を、表２及び図３に示す。作製した複合繊維状多孔体の走査型電子顕微鏡像を図２に示す。
炭酸緩衝溶液の濃度を０．３ｍｏｌ／Ｌに代えて、０．６ｍｏｌ／Ｌとした以外は、実施例１の操作を繰り返した。コラーゲン・キトサン混合緩衝溶液はｐＨ７．５、塩濃度は６０ｍＭである。
炭酸緩衝溶液滴下では、得られたコラーゲン・キトサン混合緩衝溶液は透明で、２８℃に温度を上昇させることで白濁した繊維状ゲルが得られた。得られた繊維状ゲルの外観を図１に示す。更に、得られた繊維状ゲルの貯蔵弾性率を測定した結果を、表２及び図３に示す。作製した複合繊維状多孔体の走査型電子顕微鏡像を図２に示す。
《比較例１》
炭酸緩衝溶液の濃度を０．３ｍｏｌ／Ｌに代えて、０．１ｍｏｌ／Ｌとした以外は、実施例１の操作を繰り返した。コラーゲン・キトサン混合緩衝溶液はｐＨ５．９、塩濃度は１０ｍＭである。炭酸緩衝溶液滴下では、得られたコラーゲン・キトサン混合緩衝溶液は透明で、繊維状ゲルは得られなかった。
炭酸緩衝溶液の濃度を０．３ｍｏｌ／Ｌに代えて、０．１ｍｏｌ／Ｌとした以外は、実施例１の操作を繰り返した。コラーゲン・キトサン混合緩衝溶液はｐＨ５．９、塩濃度は１０ｍＭである。炭酸緩衝溶液滴下では、得られたコラーゲン・キトサン混合緩衝溶液は透明で、繊維状ゲルは得られなかった。
《比較例２》
炭酸緩衝溶液の濃度を０．３ｍｏｌ／Ｌに代えて、０．８ｍｏｌ／Ｌとした以外は、実施例１の操作を繰り返した。コラーゲン・キトサン混合緩衝溶液はｐＨ８．４、塩濃度は８０ｍＭである。炭酸緩衝溶液滴下直後に白濁が生じた。得られた繊維状ゲルの貯蔵弾性率を測定した結果を、表２及び図３に示す。作製した複合繊維状多孔体の走査型電子顕微鏡像を図２に示す。
炭酸緩衝溶液の濃度を０．３ｍｏｌ／Ｌに代えて、０．８ｍｏｌ／Ｌとした以外は、実施例１の操作を繰り返した。コラーゲン・キトサン混合緩衝溶液はｐＨ８．４、塩濃度は８０ｍＭである。炭酸緩衝溶液滴下直後に白濁が生じた。得られた繊維状ゲルの貯蔵弾性率を測定した結果を、表２及び図３に示す。作製した複合繊維状多孔体の走査型電子顕微鏡像を図２に示す。
《比較例３》
炭酸緩衝溶液の濃度を０．３ｍｏｌ／Ｌに代えて、１．０ｍｏｌ／Ｌとした以外は、実施例１の操作を繰り返した。コラーゲン・キトサン混合緩衝溶液はｐＨ９．０である。炭酸緩衝溶液滴下直後に白濁が生じた。得られた繊維状ゲルの外観を図１に示す。更に、得られた繊維状ゲルの貯蔵弾性率を測定した結果を、表２及び図３に示す。作製した複合繊維状多孔体の走査型電子顕微鏡像を図２に示す。
炭酸緩衝溶液の濃度を０．３ｍｏｌ／Ｌに代えて、１．０ｍｏｌ／Ｌとした以外は、実施例１の操作を繰り返した。コラーゲン・キトサン混合緩衝溶液はｐＨ９．０である。炭酸緩衝溶液滴下直後に白濁が生じた。得られた繊維状ゲルの外観を図１に示す。更に、得られた繊維状ゲルの貯蔵弾性率を測定した結果を、表２及び図３に示す。作製した複合繊維状多孔体の走査型電子顕微鏡像を図２に示す。
（ゲルの外観）
図１に、実施例１（ｐＨ６．６）、実施例３（ｐＨ７．５）及び比較例３（ｐＨ９．０）で作製した繊維状ゲルの外観を示す。図から明らかなように、コントロールである純粋なコラーゲンゲルでは端の形状が保たれていないが、キトサンを混合することで形状が保持できることが分かる。更に比較例３（ｐＨ９．０）のゲルも端の形状が維持できず、外観からも明らかなように繊維状ゲルの強度が異なることが分かる。
図１に、実施例１（ｐＨ６．６）、実施例３（ｐＨ７．５）及び比較例３（ｐＨ９．０）で作製した繊維状ゲルの外観を示す。図から明らかなように、コントロールである純粋なコラーゲンゲルでは端の形状が保たれていないが、キトサンを混合することで形状が保持できることが分かる。更に比較例３（ｐＨ９．０）のゲルも端の形状が維持できず、外観からも明らかなように繊維状ゲルの強度が異なることが分かる。
（複合繊維状多孔体の繊維）
図２に実施例１（ｐＨ６．６）、実施例３（ｐＨ７．５）、比較例２（ｐＨ８．４）及び比較例３（ｐＨ９．０）の複合繊維状多孔体の走査型電子顕微鏡像を示す。いずれの複合繊維状多孔体も、繊維が観察された。キトサンを混合して作製した実施例１及び３の繊維は、直径が８０ｎｍから９０ｎｍ程度であり、更にｐＨが高い条件で作製した比較例２及び３の繊維は、４０ｎｍ以下と明らかに直径が小さくなることが分かる。
図２に実施例１（ｐＨ６．６）、実施例３（ｐＨ７．５）、比較例２（ｐＨ８．４）及び比較例３（ｐＨ９．０）の複合繊維状多孔体の走査型電子顕微鏡像を示す。いずれの複合繊維状多孔体も、繊維が観察された。キトサンを混合して作製した実施例１及び３の繊維は、直径が８０ｎｍから９０ｎｍ程度であり、更にｐＨが高い条件で作製した比較例２及び３の繊維は、４０ｎｍ以下と明らかに直径が小さくなることが分かる。
（貯蔵弾性率）
実施例１〜３、及び比較例２と３の繊維状ゲルの貯蔵弾性率を図３に示す。ｐＨ６．５付近で作製した繊維状ゲル（実施例１）では、８００Ｐａであったが、ｐＨが高くなるにつれて貯蔵弾性率が小さくなることが明らかであった。また、Ｄ−ＰＢＳで作製したコントロールの純粋なコラーゲンゲルでは、貯蔵弾性率は３０Ｐａであり、キトサンを混合することで明かに繊維状ゲルの強度が向上することが分かる。
実施例１〜３、及び比較例２と３の繊維状ゲルの貯蔵弾性率を図３に示す。ｐＨ６．５付近で作製した繊維状ゲル（実施例１）では、８００Ｐａであったが、ｐＨが高くなるにつれて貯蔵弾性率が小さくなることが明らかであった。また、Ｄ−ＰＢＳで作製したコントロールの純粋なコラーゲンゲルでは、貯蔵弾性率は３０Ｐａであり、キトサンを混合することで明かに繊維状ゲルの強度が向上することが分かる。
（熱架橋）
実施例１、実施例２、及び実施例３において、複合繊維状多孔体を１３０℃の真空中で３時間処理することによって、熱架橋をコラーゲン・キトサン複合繊維内に導入した。熱架橋を行うことによって、複合繊維状多孔体の強度が上昇した。
実施例１、実施例２、及び実施例３において、複合繊維状多孔体を１３０℃の真空中で３時間処理することによって、熱架橋をコラーゲン・キトサン複合繊維内に導入した。熱架橋を行うことによって、複合繊維状多孔体の強度が上昇した。
《実施例４》
実施例４〜７では、炭酸緩衝溶液の効果を確かめるため、塩濃度を３０ｍＭにして、繊維状ゲルを作製した。
０．３ｍｏｌ／Ｌの炭酸ナトリウム（ｐＨ１１．５）と０．３ｍｏｌ／Ｌの炭酸水素ナトリウム（ｐＨ８．７）を調整し、二液を混合して０．３ｍｏｌ／Ｌになるように炭酸緩衝溶液（ｐＨ９．２）を調整した。
次いで、実施例１で用いたコラーゲン・キトサン混合溶液（コラーゲンとキトサンのモル数が同じ）に、炭酸緩衝溶液を体積比率９：１（最終炭酸濃度：３０ｍｍｏｌ）になるように滴下し、４℃で攪拌後、２８℃の乾燥器中に３時間静置して繊維化を生じさせた。コラーゲン・キトサン混合緩衝溶液はｐＨ６．２４である。作製したコラーゲン・キトサン混合緩衝溶液のｐＨ、及び塩濃度などの条件、並びに得られたゲル繊維の貯蔵弾性率を表２に示す。
実施例４〜７では、炭酸緩衝溶液の効果を確かめるため、塩濃度を３０ｍＭにして、繊維状ゲルを作製した。
０．３ｍｏｌ／Ｌの炭酸ナトリウム（ｐＨ１１．５）と０．３ｍｏｌ／Ｌの炭酸水素ナトリウム（ｐＨ８．７）を調整し、二液を混合して０．３ｍｏｌ／Ｌになるように炭酸緩衝溶液（ｐＨ９．２）を調整した。
次いで、実施例１で用いたコラーゲン・キトサン混合溶液（コラーゲンとキトサンのモル数が同じ）に、炭酸緩衝溶液を体積比率９：１（最終炭酸濃度：３０ｍｍｏｌ）になるように滴下し、４℃で攪拌後、２８℃の乾燥器中に３時間静置して繊維化を生じさせた。コラーゲン・キトサン混合緩衝溶液はｐＨ６．２４である。作製したコラーゲン・キトサン混合緩衝溶液のｐＨ、及び塩濃度などの条件、並びに得られたゲル繊維の貯蔵弾性率を表２に示す。
《実施例５》
炭酸緩衝液をｐＨ９．２から、ｐＨ９．６に変更した以外は、実施例４の操作を繰り返した。コラーゲン・キトサン混合緩衝溶液はｐＨ６．４０である。
炭酸緩衝液をｐＨ９．２から、ｐＨ９．６に変更した以外は、実施例４の操作を繰り返した。コラーゲン・キトサン混合緩衝溶液はｐＨ６．４０である。
《実施例６》
炭酸緩衝液をｐＨ９．２から、ｐＨ１０．６に変更した以外は、実施例４の操作を繰り返した。コラーゲン・キトサン混合緩衝溶液はｐＨ６．８５である。
炭酸緩衝液をｐＨ９．２から、ｐＨ１０．６に変更した以外は、実施例４の操作を繰り返した。コラーゲン・キトサン混合緩衝溶液はｐＨ６．８５である。
《実施例７》
炭酸緩衝液のｐＨ９．２から、ｐＨ１１．５の炭酸ナトリウムに変更した以外は、実施例４の操作を繰り返した。コラーゲン・キトサン混合緩衝溶液はｐＨ７．０４である。
炭酸緩衝液のｐＨ９．２から、ｐＨ１１．５の炭酸ナトリウムに変更した以外は、実施例４の操作を繰り返した。コラーゲン・キトサン混合緩衝溶液はｐＨ７．０４である。
《比較例４》
コラーゲン・キトサン混合溶液における、コラーゲンとキトサンとのモル比を１：１から１：０に変更したことを除いては、実施例７の操作を繰り返した。コラーゲンの緩衝溶液は、ｐＨ６．２４である。
コラーゲン・キトサン混合溶液における、コラーゲンとキトサンとのモル比を１：１から１：０に変更したことを除いては、実施例７の操作を繰り返した。コラーゲンの緩衝溶液は、ｐＨ６．２４である。
（貯蔵弾性率）
実施例４〜７で得られた繊維状ゲルの粘弾性測定を行い、その貯蔵弾性率を表２及び図４に示す。図に示すように、ｐＨ６．４に調整したコラーゲン・キトサン複合繊維ゲル（実施例５）が最も高い値、１８００Ｐａを示した。このことから調整したコラーゲン・キトサン混合緩衝溶液の最終ｐＨが複合繊維状ゲルの粘弾性特性に大きく影響していることが分かる。
実施例４〜７で得られた繊維状ゲルの粘弾性測定を行い、その貯蔵弾性率を表２及び図４に示す。図に示すように、ｐＨ６．４に調整したコラーゲン・キトサン複合繊維ゲル（実施例５）が最も高い値、１８００Ｐａを示した。このことから調整したコラーゲン・キトサン混合緩衝溶液の最終ｐＨが複合繊維状ゲルの粘弾性特性に大きく影響していることが分かる。
《実施例８》
実施例８〜１１及び比較例５では、コラーゲンへのキトサンの混合比率の影響を調べるため、コラーゲンとキトサンとのモル比を変えて、得られたコラーゲン・キトサン複合繊維ゲルの粘弾性特性を調べた。
０．０９ｍｏｌ／Ｌの酢酸溶液にキトサン濃度を１．６ｗｔ％となるように調整し、キトサン酸性溶液とした。コラーゲン酸性溶液は、ｐＨ３の酢酸溶液に２ｗｔ％になるように調整した。２つの溶液を当量ずつ混合し、２０時間以上４℃で攪拌し、コラーゲン・キトサン混合溶液を得た。コラーゲンとキトサンとのモル比は、１：１になるように調整した。
０．３ｍｏｌ／Ｌの炭酸ナトリウム（ｐＨ１１．５）と０．３ｍｏｌ／Ｌの炭酸水素ナトリウム（ｐＨ８．７）を調整し、二液を混合して０．３ｍｏｌ／Ｌになるように炭酸緩衝溶液（ｐＨ９．６）を調整した。
コラーゲン・キトサン混合溶液に炭酸緩衝溶液を滴下し、コラーゲン・キトサン混合緩衝溶液を得た。得られたコラーゲン・キトサン混合緩衝溶液を、２８℃の乾燥器中に３時間静置することで白濁・繊維化が生じた。なお、コラーゲン・キトサン混合溶液のｐＨは、５．５であり、コラーゲン・キトサン混合緩衝溶液はｐＨ６．６０である。
実施例８〜１１及び比較例５では、コラーゲンへのキトサンの混合比率の影響を調べるため、コラーゲンとキトサンとのモル比を変えて、得られたコラーゲン・キトサン複合繊維ゲルの粘弾性特性を調べた。
０．０９ｍｏｌ／Ｌの酢酸溶液にキトサン濃度を１．６ｗｔ％となるように調整し、キトサン酸性溶液とした。コラーゲン酸性溶液は、ｐＨ３の酢酸溶液に２ｗｔ％になるように調整した。２つの溶液を当量ずつ混合し、２０時間以上４℃で攪拌し、コラーゲン・キトサン混合溶液を得た。コラーゲンとキトサンとのモル比は、１：１になるように調整した。
０．３ｍｏｌ／Ｌの炭酸ナトリウム（ｐＨ１１．５）と０．３ｍｏｌ／Ｌの炭酸水素ナトリウム（ｐＨ８．７）を調整し、二液を混合して０．３ｍｏｌ／Ｌになるように炭酸緩衝溶液（ｐＨ９．６）を調整した。
コラーゲン・キトサン混合溶液に炭酸緩衝溶液を滴下し、コラーゲン・キトサン混合緩衝溶液を得た。得られたコラーゲン・キトサン混合緩衝溶液を、２８℃の乾燥器中に３時間静置することで白濁・繊維化が生じた。なお、コラーゲン・キトサン混合溶液のｐＨは、５．５であり、コラーゲン・キトサン混合緩衝溶液はｐＨ６．６０である。
《実施例９》
キトサン濃度を１．６ｗｔ％から１．２ｗｔ％に変更したことを除いては、実施例８の操作を繰り返した。コラーゲンとキトサンとのモル比は、１：３／４（１：０．７５）になるように調整し、コラーゲン・キトサン混合溶液は、ｐＨ４．８であり、コラーゲン・キトサン混合緩衝溶液はｐＨ６．２４である。
キトサン濃度を１．６ｗｔ％から１．２ｗｔ％に変更したことを除いては、実施例８の操作を繰り返した。コラーゲンとキトサンとのモル比は、１：３／４（１：０．７５）になるように調整し、コラーゲン・キトサン混合溶液は、ｐＨ４．８であり、コラーゲン・キトサン混合緩衝溶液はｐＨ６．２４である。
《実施例１０》
キトサン濃度を１．６ｗｔ％から０．８ｗｔ％に変更したことを除いては、実施例８の操作を繰り返した。コラーゲンとキトサンとのモル比は、１：１／２（１：０．５）になるように調整し、コラーゲン・キトサン混合溶液は、ｐＨ４．５であり、コラーゲン・キトサン混合緩衝溶液はｐＨ６．０９である。
キトサン濃度を１．６ｗｔ％から０．８ｗｔ％に変更したことを除いては、実施例８の操作を繰り返した。コラーゲンとキトサンとのモル比は、１：１／２（１：０．５）になるように調整し、コラーゲン・キトサン混合溶液は、ｐＨ４．５であり、コラーゲン・キトサン混合緩衝溶液はｐＨ６．０９である。
《実施例１１》
キトサン濃度を１．６ｗｔ％から０．４ｗｔ％に変更したこと、及びｐＨ９．６の炭酸緩衝溶液を、ｐＨ１０．６炭酸緩衝溶液に変更したことを除いては、実施例８の操作を繰り返した。コラーゲンとキトサンとのモル比は、１：１／４（１：０．２５）になるように調整し、コラーゲン・キトサン混合溶液は、ｐＨ４．１であり、コラーゲン・キトサン混合緩衝溶液はｐＨ６．６０である。
キトサン濃度を１．６ｗｔ％から０．４ｗｔ％に変更したこと、及びｐＨ９．６の炭酸緩衝溶液を、ｐＨ１０．６炭酸緩衝溶液に変更したことを除いては、実施例８の操作を繰り返した。コラーゲンとキトサンとのモル比は、１：１／４（１：０．２５）になるように調整し、コラーゲン・キトサン混合溶液は、ｐＨ４．１であり、コラーゲン・キトサン混合緩衝溶液はｐＨ６．６０である。
《比較例５》
キトサン濃度を１．６ｗｔ％から０ｗｔ％に変更したこと、及びコラーゲン・キトサン混合溶液における、コラーゲンとキトサンとのモル比を１：１／４から１：０に変更したことを除いては、実施例１１の操作を繰り返した。コラーゲン・キトサン混合溶液のｐＨは、３．５であり、コラーゲン・キトサン混合緩衝溶液はｐＨ６．０３である。
キトサン濃度を１．６ｗｔ％から０ｗｔ％に変更したこと、及びコラーゲン・キトサン混合溶液における、コラーゲンとキトサンとのモル比を１：１／４から１：０に変更したことを除いては、実施例１１の操作を繰り返した。コラーゲン・キトサン混合溶液のｐＨは、３．５であり、コラーゲン・キトサン混合緩衝溶液はｐＨ６．０３である。
（貯蔵弾性率）
実施例８〜１１及び比較例５で得られた繊維状ゲルの粘弾性測定を行った。図５に２８℃の乾燥器中で繊維状ゲルの貯蔵弾性率を示す。線形粘弾性領域において周波数を走査させて粘弾性測定を行った。コラーゲンとキトサンの比率が１：１で作製した繊維状ゲルからキトサンの比率が小さくなるに従って貯蔵弾性率が小さくなることが明らかであった。このように、キトサン含有量を変化させることで複合繊維状ゲルの弾性的性質を制御できることを明らかとなった。
実施例８〜１１及び比較例５で得られた繊維状ゲルの粘弾性測定を行った。図５に２８℃の乾燥器中で繊維状ゲルの貯蔵弾性率を示す。線形粘弾性領域において周波数を走査させて粘弾性測定を行った。コラーゲンとキトサンの比率が１：１で作製した繊維状ゲルからキトサンの比率が小さくなるに従って貯蔵弾性率が小さくなることが明らかであった。このように、キトサン含有量を変化させることで複合繊維状ゲルの弾性的性質を制御できることを明らかとなった。
《膨潤度の測定》
実施例１、実施例３、比較例２で得られた未架橋の複合繊維状多孔体、及びＤ−ＰＢＳを用いて作製した純粋なコラーゲン繊維からなる多孔体について、膨潤度を測定した。凍結乾燥させた試料の重量を電子天秤により秤量し、Ｄ−ＰＢＳ中にそれぞれ浸漬させた。所定時間後に試料を取り出し、キムタオル上で１０秒間静置して余剰の水分を除去してからその重量を測定した。膨潤度＝［（膨潤試料の重量（ｇ）−凍結乾燥試料の重量（ｇ））／凍結乾燥試料の重量（ｇ）］として算出した。その結果、コラーゲン・キトサン複合繊維状多孔体では、浸漬後約３時間後に平衡に達したが、コラーゲン繊維からなる多孔体では平衡に達するのに６時間必要であった。２５時間後では、コラーゲン繊維からなる多孔体は膨潤度が１７となったが、形状を維持することが困難であるほど力学特性が低下した。コラーゲン・キトサン複合繊維状多孔体は、ｐＨが低い条件で作製した試料が最も低い膨潤度、５倍となり、作製したｐＨに依存して膨潤度が高くなった。ｐＨ７．５とｐＨ９．０の試料では、約８倍、１０倍といった膨潤度を示した。このことからも、最適なｐＨで作製した試料では、コラーゲンとキトサンの相互作用が向上しており、膨潤度が低くなることが明らかとなった。
実施例１、実施例３、比較例２で得られた未架橋の複合繊維状多孔体、及びＤ−ＰＢＳを用いて作製した純粋なコラーゲン繊維からなる多孔体について、膨潤度を測定した。凍結乾燥させた試料の重量を電子天秤により秤量し、Ｄ−ＰＢＳ中にそれぞれ浸漬させた。所定時間後に試料を取り出し、キムタオル上で１０秒間静置して余剰の水分を除去してからその重量を測定した。膨潤度＝［（膨潤試料の重量（ｇ）−凍結乾燥試料の重量（ｇ））／凍結乾燥試料の重量（ｇ）］として算出した。その結果、コラーゲン・キトサン複合繊維状多孔体では、浸漬後約３時間後に平衡に達したが、コラーゲン繊維からなる多孔体では平衡に達するのに６時間必要であった。２５時間後では、コラーゲン繊維からなる多孔体は膨潤度が１７となったが、形状を維持することが困難であるほど力学特性が低下した。コラーゲン・キトサン複合繊維状多孔体は、ｐＨが低い条件で作製した試料が最も低い膨潤度、５倍となり、作製したｐＨに依存して膨潤度が高くなった。ｐＨ７．５とｐＨ９．０の試料では、約８倍、１０倍といった膨潤度を示した。このことからも、最適なｐＨで作製した試料では、コラーゲンとキトサンの相互作用が向上しており、膨潤度が低くなることが明らかとなった。
本発明のコラーゲン・キトサン複合細繊維を含むコラーゲン・キトサン複合繊維ゲル、又はコラーゲン・キトサン複合繊維状多孔体は、生体材料、すなわち細胞培養基材、再生医療用の足場材料（例えば、軟骨、骨、皮膚、及び肝臓組織の再生材料）、移植用材料（創傷被覆材料、骨補填剤、又は止血材料）、又は薬物送達担体として用いることができる。また、本発明のコラーゲン・キトサン複合細繊維の製造方法、コラーゲン・キトサン複合繊維ゲルの製造方法、及びコラーゲン・キトサン複合繊維状多孔体の製造方法によれば、前記コラーゲン・キトサン複合細繊維を含むコラーゲン・キトサン複合繊維ゲル、又はコラーゲン・キトサン複合繊維状多孔体を簡便に製造することができる。
Claims (11)
- 実質的に、コラーゲン及び脱Ｎ−アセチル化度６０〜１００％のキトサンからなる、コラーゲン・キトサン複合細繊維。
- 直径が５０〜２００ｎｍである、請求項１に記載のコラーゲン・キトサン複合細繊維。
- 前記コラーゲンが、魚類由来コラーゲンである、請求項１又は２に記載のコラーゲン・キトサン複合細繊維。
- 請求項１〜３のいずれか一項に記載のコラーゲン・キトサン複合細繊維を含む、コラーゲン・キトサン複合繊維ゲル。
- １Ｈｚにおける貯蔵弾性率が、３００Ｐａ以上である、請求項４に記載のコラーゲン・キトサン複合繊維ゲル。
- 請求項１〜３のいずれか一項に記載のコラーゲン・キトサン複合細繊維を含む、コラーゲン・キトサン複合繊維状多孔体。
- 前記コラーゲン・キトサン複合細繊維が架橋されている、請求項６に記載のコラーゲン・キトサン複合繊維状多孔体。
- コラーゲン及びキトサンを均一に混合し、ｐＨ６．０〜８．０及び塩濃度が１５ｍＭ以上のコラーゲン・キトサン混合緩衝溶液を調製する工程、及び
前記コラーゲン・キトサン混合緩衝溶液を、繊維調整温度に上昇させることによってコラーゲン及びキトサンを繊維化する工程、
を含む、コラーゲン・キトサン複合細繊維の製造方法。 - コラーゲン及びキトサンを均一に混合し、ｐＨ６．０〜８．０及び塩濃度が１５ｍＭ以上のコラーゲン・キトサン混合緩衝溶液を調製する工程、及び
前記コラーゲン・キトサン混合緩衝溶液を、繊維調整温度に上昇させることによってコラーゲン及びキトサンを繊維化し、コラーゲン・キトサン複合細繊維を含むゲルを調整する工程、
を含む、コラーゲン・キトサン複合繊維ゲルの製造方法。 - コラーゲン及びキトサンを均一に混合し、ｐＨ６．０〜８．０及び塩濃度が１５ｍＭ以上のコラーゲン・キトサン混合緩衝溶液を調製する工程、
前記コラーゲン・キトサン混合緩衝溶液を、繊維調整温度に上昇させることによってコラーゲン及びキトサンを繊維化し、コラーゲン・キトサン複合繊維ゲルを調整する工程、及び
前記コラーゲン・キトサン複合繊維ゲルを乾燥させる工程、
を含む、コラーゲン・キトサン複合繊維状多孔体の製造方法。 - 更に、前記コラーゲン・キトサン複合細繊維を架橋する工程を含む、請求項１０に記載のコラーゲン・キトサン複合繊維状多孔体の製造方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2010139855A JP5453690B2 (ja) | 2010-06-18 | 2010-06-18 | コラーゲン・キトサン複合繊維状多孔体及びその製造方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2010139855A JP5453690B2 (ja) | 2010-06-18 | 2010-06-18 | コラーゲン・キトサン複合繊維状多孔体及びその製造方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2012001859A JP2012001859A (ja) | 2012-01-05 |
| JP5453690B2 true JP5453690B2 (ja) | 2014-03-26 |
Family
ID=45534154
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2010139855A Expired - Fee Related JP5453690B2 (ja) | 2010-06-18 | 2010-06-18 | コラーゲン・キトサン複合繊維状多孔体及びその製造方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP5453690B2 (ja) |
Families Citing this family (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP6023996B2 (ja) * | 2012-08-09 | 2016-11-09 | 島根県 | コラーゲン線維からなるコラーゲン人工皮膚およびそれを用いた紫外線ダメージの評価方法 |
| JP2014166217A (ja) * | 2013-02-28 | 2014-09-11 | Tokyo Institute Of Technology | コラーゲン線維無機高分子複合体及びその製造方法 |
| CN104013995B (zh) * | 2014-06-26 | 2016-04-06 | 四川大学 | 氧化壳聚糖接枝改性猪真皮胶原微纳纤维膜及其制备方法 |
| CN104598622A (zh) * | 2015-02-02 | 2015-05-06 | 浪潮软件股份有限公司 | 一种数据修改日志的实现方法和系统及应用服务器 |
| CN108785751B (zh) * | 2018-06-08 | 2021-05-28 | 暨南大学 | 鱼鳞胶原蛋白/海藻酸钠复合多孔骨组织工程支架及其制备方法与应用 |
| CN111205492B (zh) * | 2020-01-16 | 2022-08-26 | 北京银河巴马生物技术股份有限公司 | 一种以长短纤维制备得到的凝胶类膜及其基于抄造技术的制备工艺和应用 |
Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS56131639A (en) * | 1980-03-21 | 1981-10-15 | Kureha Chem Ind Co Ltd | Protein-chitosan composition |
| JPS56133344A (en) * | 1980-03-21 | 1981-10-19 | Kureha Chem Ind Co Ltd | Novel composite material |
| CZ2007716A3 (cs) * | 2007-10-15 | 2009-04-29 | Elmarco S. R. O. | Zpusob výroby nanovláken |
-
2010
- 2010-06-18 JP JP2010139855A patent/JP5453690B2/ja not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP2012001859A (ja) | 2012-01-05 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Feroz et al. | Keratin-Based materials for biomedical applications | |
| Hernández‐Rangel et al. | Collagen based electrospun materials for skin wounds treatment | |
| Biswas et al. | Recent advancement of biopolymers and their potential biomedical applications | |
| Costa et al. | Fibrous protein-based biomaterials (silk, keratin, elastin, and resilin proteins) for tissue regeneration and repair | |
| Hardy et al. | Composite materials based on silk proteins | |
| CN105169483B (zh) | 一种脱细胞基质凝胶的制备方法及其脱细胞基质凝胶 | |
| JP5991624B2 (ja) | コラーゲン非線維化成形体及びその製造方法 | |
| CN106310380B (zh) | 一种纳米纤维化丝素蛋白凝胶及其制备方法 | |
| JP4064435B2 (ja) | コラーゲンゲルおよびその製造方法 | |
| Onder et al. | Self-assembled silk fibroin hydrogels: From preparation to biomedical applications | |
| JP5453690B2 (ja) | コラーゲン・キトサン複合繊維状多孔体及びその製造方法 | |
| JP4463702B2 (ja) | 伸縮性コラーゲン成形体、その製造方法および用途 | |
| CN103877617A (zh) | 可注射蚕丝素蛋白-海藻酸盐双交联水凝胶及其制备方法和使用方法 | |
| JP2010053080A (ja) | キトサンとコラーゲンを含む構造体 | |
| CN116966345A (zh) | 3d可打印生物凝胶及其使用方法 | |
| AU2018351873B2 (en) | Single alpha chain collagens | |
| JP2006257013A (ja) | 魚鱗由来コラーゲンゲルとその作成方法 | |
| JP2012126681A (ja) | コラーゲン線維ゲルおよびその用途 | |
| JP2007297360A (ja) | ハイドロゲル、その製造方法およびその用途 | |
| Sionkowska et al. | Preparation and characterization of new materials based on silk fibroin, chitosan and nanohydroxyapatite | |
| Wang et al. | Advanced protein composite materials | |
| WO2003094985A1 (fr) | Matrice extracellulaire artificielle et procede de fabrication associe | |
| JP5024780B2 (ja) | 一方向性多孔質複合体の製造方法および一方向性多孔質複合体 | |
| Aadil et al. | Keratin nanofibers in tissue engineering: Bridging nature and innovation | |
| CN116392646A (zh) | 一种引导骨再生屏障膜 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20130426 |
|
| A977 | Report on retrieval |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A971007 Effective date: 20130930 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20131008 |
|
| A977 | Report on retrieval |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A971007 Effective date: 20131028 |
|
| A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20131107 |
|
| TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20131203 |
|
| A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20131219 |
|
| R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 5453690 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |