JP5444544B2 - 血管新生誘導剤及びそれに用いられるポリペプチド - Google Patents

Description

本発明は、血管新生誘導剤及びそれに用いられるポリペプチドに関する。

褥瘡、創傷、皮膚潰瘍、閉塞性動脈疾患及び閉塞性動脈硬化症等の種々の疾患又は傷害の治療においては、血管の新生が有効である。幾つかの血管新生誘導活性を有する血管新生誘導剤が知られている。
血管新生誘導活性を有するポリペプチドとしては、LL−37が知られている。LL−37は、血管新生活性のみならず、抗菌活性および動脈形成活性を有するペプチドである（非特許文献１および２）。

本願発明者らは、先に血管内皮増殖活性、ひいては血管新生誘導活性を有するポリペプチドを発明し、さらに該ペプチドがLL−37より高い血管新生誘導活性を有していることを見いだし、これを特許出願した（特許文献１）。特許文献１には、該ポリペプチドが抗菌活性を有することも示唆されている。

WO 2005/090564 A1 Koczulla R, von Degenfeld G, Kupatt C, Krotz F, Zahler S, Gloe T, Issbrucker K, Unterberger P, Zaiou M, Lebherz C, Karl A, Raake P, Pfosser A, Boekstegers P, Welsch U, Hiemstra PS, Vogelmeier C, Gallo RL, Clauss M, Bals R., "An angiogenic role for the human peptide antibiotic LL-37/hCAP-18.", J Clin Invest. 2003 Jun;111(11):1665-72 Zanetti M., "Cathelicidins, multifunctional peptides of the innate immunity.," J Leukoc Biol. 2004 Jan;75(1):39-48. Epub 2003 Jul 22.

本発明の目的は、優れた血管新生誘導活性を有する新規な血管新生誘導剤及びその有効成分として用いられる新規なポリペプチドを提供することである。

本願発明者らは、鋭意研究の結果、特許文献１に記載されたポリペプチドを修飾することにより、該ポリペプチドよりも高い血管新生誘導活性を有するか又は該ポリペプチドと血管新生誘導活性は同等であるがより高い抗菌活性を有するポリペプチドが得られることを見出し本発明を完成した。

すなわち、本発明は、配列番号１ないし４のいずれかで示されるアミノ酸配列から成るポリペプチドを有効成分として含有する血管新生誘導剤を提供する。

また、本発明は、上記ポリペプチドを有効成分として含有する、褥瘡、創傷、皮膚潰瘍、閉塞性動脈疾患及び閉塞性動脈硬化症から成る群から選択される疾患の処置のための予防、改善又は治療剤を提供する。

本発明により、優れた血管新生誘導活性を有するポリペプチド系の新規な血管新生誘導剤が提供された。また、この血管新生誘導剤の有効成分として用いられる新規なポリペプチドが提供された。

本発明の実施例及び比較例の血管新生誘導活性を示す図である。

特許文献１に記載されているF2ペプチド（本願明細書において「AG-30」と呼ぶ）のアミノ酸配列を配列番号５に示す。AG-30は、特許文献１に記載され、また、下記実施例において具体的に記載するように抗菌活性及び血管新生誘導活性を有する。AG-30の種々の修飾体を作製し、その血管新生誘導活性及び抗菌活性を調べた。その結果、上記した本発明のポリペプチドが、血管新生誘導活性を有することが明らかになった。下記実施例に具体的に記載するように、本発明の実施例になるポリペプチドは、AG-30よりも血管新生誘導活性が高いか、又はAG-30と血管新生誘導活性が同等の場合には、AG-30よりも抗菌活性が高かった。

一般に、ポリペプチドから成る医薬において、生体内でのポリペプチドの安定性を高めるために、ポリペプチドに糖鎖やポリエチレングリコール(PEG)鎖を付加したり、ポリペプチドを構成するアミノ酸の少なくとも一部としてＤ体アミノ酸を用いたりする技術が広く知られており、用いられている。糖鎖やPEG鎖を付加したり、ポリペプチドを構成するアミノ酸の少なくとも一部としてＤ体アミノ酸を用いたりすることにより、生体内でのペプチダーゼによる分解を受けにくくなり、生体内におけるポリペプチドの半減期が長くなる。本発明のポリペプチドは、抗菌活性を有する限り、生体内安定化のためのこれらの公知の修飾を施したものであってもよく、本明細書及び特許請求の範囲における「ポリペプチド」という語は、文脈上そうでないことが明らかな場合を除き、生体内安定化のための修飾を施したものも包含する意味で用いている。

ポリペプチドに対する糖鎖付加は周知であり、例えば、Sato M, Furuike T, Sadamoto R, Fujitani N, Nakahara T, Niikura K, Monde K, Kondo H, Nishimura S., "Glycoinsulins: dendritic sialyloligosaccharide-displaying insulins showing a prolonged blood-sugar-lowering activity.",J Am Chem Soc. 2004 Nov 3;126(43):14013-22やSato M, Sadamoto R, Niikura K, Monde K, Kondo H, Nishimura S,"Site-specific introduction of sialic acid into insulin.", Angew Chem Int Ed Engl. 2004 Mar 12;43(12):1516-20等に記載されている。糖鎖は、Ｎ末端、Ｃ末端又はそれらの間のアミノ酸に結合可能であるが、ポリペプチドの活性を阻害しないためにＮ末端又はＣ末端に結合することが好ましい。また、付加する糖鎖の個数は、１個又は２個が好ましく、１個が好ましい。糖鎖は、単糖から４糖が好ましく、さらには２糖又は３糖が好ましい。糖鎖は、ポリペプチドの遊離のアミノ基又はカルボキシル基に直接又は例えば炭素数１〜１０程度のメチレン鎖等のスペーサー構造を介して結合することができる。

ポリペプチドに対するPEG鎖の付加も周知であり、例えば、Ulbricht K, Bucha E, Poschel KA, Stein G, Wolf G, Nowak G., "The use of PEG-Hirudin in chronic hemodialysis monitored by the Ecarin Clotting Time: influence on clotting of the extracorporeal system and hemostatic parameters.", Clin Nephrol. 2006 Mar;65(3):180-90.やDharap SS, Wang Y, Chandna P, Khandare JJ, Qiu B, Gunaseelan S, Sinko PJ, Stein S, Farmanfarmaian A, Minko T., "Tumor-specific targeting of an anticancer drug delivery system by LHRH peptide.", Proc Natl Acad Sci USA. 2005 Sep 6;102(36):12962-7."等に記載されている。PEG鎖は、Ｎ末端、Ｃ末端又はそれらの間のアミノ酸に結合可能であり、通常、１個又は２個のPEG鎖が、ポリペプチド上の遊離のアミノ基やカルボキシル基に結合される。PEG鎖の分子量は、特に限定されないが、通常3000〜7000程度、好ましくは5000程度のものが用いられる。

ポリペプチドを構成するアミノ酸の少なくとも一部をＤ体とする方法も周知であり、例えば、Brenneman DE, Spong CY, Hauser JM, Abebe D, Pinhasov A, Golian T, Gozes I., "Protective peptides that are orally active and mechanistically nonchiral.", J Pharmacol Exp Ther. 2004 Jun;309(3):1190-7やWilkemeyer MF, Chen SY, Menkari CE, Sulik KK, Charness ME., "Ethanol antagonist peptides: structural specificity without stereospecificity.", J Pharmacol Exp Ther. 2004 Jun;309(3):1183-9.等に記載されている。ポリペプチドを構成するアミノ酸の一部をＤ体としてもよいが、ポリペプチドの活性をできるだけ阻害しないため、ポリペプチドを構成するアミノ酸の全てをＤ体アミノ酸とすることが好ましい。

本発明の血管新生誘導剤の有効成分であるポリペプチドは、市販のペプチド合成機を用いた化学合成等の常法により容易に製造することができる。また、上記安定化修飾も、上記各文献に記載されているような周知の方法により容易に行なうことができる。

本発明のポリペプチドは、高い血管新生誘導活性を有するので、血管新生誘導剤として用いることができる。血管新生誘導剤としての使用方法は公知のポリペプチド系の血管新生誘導剤と同様であり、溶液剤、乳剤、懸濁剤、粉剤、散剤、顆粒剤、ゲル、軟膏、または経皮パッチとして、特に好ましくは溶液剤、粉剤、あるいは経皮パッチとして投与することができる。溶液剤として好ましくは緩衝液、特に好ましくは生理食塩緩衝液等の水系媒体に溶解した溶液を投与することができる。溶液中のポリペプチドの濃度は、特に限定されないが、通常、0.01mg /mL〜100mg/mL程度、好ましくは0.1mg /mL〜100mg/mL程度、特に好ましくは1mg/mL〜10mg/mL程度である。投与経路は、通常、血管新生が必要な部位への塗布や注射等の局所投与である。投与量は、症状や患部の大きさ等に応じて適宜選択されるが、通常、ポリペプチド量として0.01mg〜100mg程度、好ましくは0.1mg〜100mg程度、特に好ましくは0.1mg〜10mg程度であるが、もちろん、これらの範囲に限定されるものではない。なお、本発明の血管新生誘導剤を製剤する際に用いられる薬剤的に許容できる担体としては、上記した水系媒体の他にも、製剤分野で常用されている担体を用いることができ、例えば、軟膏のような外用剤の場合には、炭化水素類（親水ワセリン、白色ワセリン、精製ラノリン、流動パラフィン等）、酸化亜鉛、高級脂肪酸及びそのエステル（アジピン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、オレイン酸、アジピン酸エステル、ミリスチン酸エステル、パルミチン酸エステル、セバシン酸ジエチル、ラウリン酸ヘキシル、イソオクタン酸セチル等）、ロウ類（鯨ロウ、ミツロウ、セレシン等）、高級アルコール（セタノール、ステアリルアルコール、セトステアリルアルコール等）などが挙げられる。溶液剤の場合には、例えば、水、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水等を挙げることができ、経口剤の場合には、乳糖、デンプン等を挙げることができる。その他、必要に応じ、乳化剤、界面活性剤、等張化剤、pH調整剤等の各種医薬添加剤を配合することもできる。なお、これらの薬剤的に許容できる担体及び医薬添加剤は、製剤分野において周知であり、広く用いられているものである。

生体に投与する場合の具体的な疾患及び障害の例として、褥瘡、創傷、皮膚潰瘍、閉塞性動脈疾患及び閉塞性動脈硬化症等を挙げることができるがこれらに限定されるものではない。本発明の血管新生誘導剤は、これらの疾患又は障害に対する予防、改善又は治療剤として用いることができる。なお、上記の通り、上記(2)のポリペプチドは、高い血管新生誘導活性を有する一方、抗菌活性を有しているので、抗菌活性を併有することが望まれる疾患又は障害の予防、改善又は治療剤として特に適しており、このような疾患又は障害として、上記の疾患又は障害のうち褥瘡、創傷、皮膚潰瘍等を挙げることができる。

本発明の血管新生誘導剤は、単独で使用することもできるし、抗菌性が望まれる場合には他の抗菌剤又は抗生物質と併用することもできる。これらの抗菌剤又は抗生物質の例として、セフェム系、カルバペネム系、アミノグリコシト系、ニューキノロン系、β-ラクタム系、ペニシリン系及びグリコペプチド系抗生物質等を挙げることができ、より具体的には、セフタジジム、メロペネム、トブラマイシン、シプロフロキサシン、メチシリン、アンピシリン及びバンコマイシン等を挙げることができるがこれらに限定されるものではない。

以下、本発明を実施例に基づきより具体的に説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定されるものではない。

実施例１〜４、比較例１
１． ポリペプチドの作製
市販のペプチド合成機を用いて、tBoc法、Fmoc法のいずれかを用い固相合成法でポリペプチドを化学合成した。Fmoc法には Applied Biosystems社 433A 型全自動固相合成機を、tBoc法には Applied Biosystems社 430A 型全自動固相合成機をそれぞれ使用した。化学合成したポリペプチドは、AG-30（配列番号５、比較例１）、AG30-5C（配列番号１、実施例１）、AG30-5Hb（配列番号２、実施例２）、AG30-2C（配列番号３、実施例３）、AG30-2Hb（配列番号４、実施例４）であった。

２． ポリペプチドの血管新生誘導活性
AG-30（比較例１）、AG30-5C（実施例１）、AG30-5Hb（実施例２）及びAG30-2C（実施例３）、AG30-2Hb（実施例４）の血管新生誘導活性を調べた。クラボウの血管新生キット(Angiogenesis Kit, KZ-1000, 倉敷紡績株式会社)を用いて管腔形成を調べた。陰性対照として、ブランク（NC、ペプチドなし）を用いた。

血管新生専用培地（倉敷紡績（株）KZ-1400）中へ、各ポリペプチド10μg/Lの濃度になるように添加して培養した。培養は37℃、5%CO₂インキュベーターにて行った。培地は、培養４日目、７日目および９日目に同じ添加物を含有するものと交換した。培養開始１１日目に培地を除き、管腔染色キット（CD31抗体染色用：倉敷紡績（株）KZ-1225）を用いて以下の手順に従い染色した。

CD31(PECAM-1)染色１次抗体（マウス抗ヒトCD31抗体）をブロッキング液（1%-BSAを含むダルベッコリン酸緩衝液（PBS(-)）で4,000倍希釈した。各ウェルにこの１次抗体溶液0.5mlを添加し、60分間37℃でインキュベートした。インキュベート終了後、1mlのブロッキング液で各ウエルを計３回洗浄した。

次いでブロッキング液で500倍希釈した２次抗体溶液（ヤギ抗マウスIgGアルカリホスファターゼ複合体）0.5mlを各ウエルに添加し、60分間37℃でインキュベートした後、1mlの蒸留水で３回洗浄した。その間に、BCIP/NBTの錠剤２錠を蒸留水20mlに溶解し、ポアサイズ0.2μmのフィルターで濾過して基質溶液を準備した。調製したBCIP/NBT基質溶液0.5mlを各ウエルに添加し、管腔が深紫色になるまで（通常５〜１０分間）37℃でインキュベートした。インキュベート終了後、蒸留水1mlで、各ウエルを３回洗浄した後洗浄液を吸引除去し、自然乾燥するため静置した。乾燥後、顕微鏡下で各ウエルを観察した。

各ウエルを顕微鏡で倍率40倍で観察し、写真を撮影した。得られた各画像を血管新生定量ソフトウェア(KSW-5000U, 倉敷紡績株式会社)を用い定量化した。様々な指標でコンピューター解析をして、このスケールをもとに各視野中に形成された管腔の面積（図左欄）、長さ（図右欄）を測定した。

結果を図１に示す。図１に示されるように、本発明のポリペプチドは、いずれも血管新生誘導活性を有しており、特に、AG30-5C（実施例１）及びAG30-5Hb（実施例２）は、AG-30（比較例１）よりも血管新生誘導活性が高かった。

３． ポリペプチドの抗菌活性
AG-30（比較例１）、AG30-5C（実施例１）、AG30-5Hb（実施例２）及びAG30-2C（実施例３）、AG30-2Hb（実施例４）の抗菌活性を調べた。抗菌活性は、米国National Committee for Clinical Laboratory Standard(NCCL Documents M7-A3)に従って評価した。すなわち、マイクロタイタープレートあるいは試験管を用いて、菌の増殖を阻害するペプチドの最小濃度を求めた。対象菌株には、黄色ブドウ球菌ATCC29213 (S. aureus ATCC29213)を用いた。細菌を培地で１６時間培養した後、A₆₀₀における吸光度を測定した。予め求めた濁度とcolony forming unit(CFU)との相関から、規定のCFUになるように培地で希釈した。各菌株を1×10⁵CFU/ml（最終濃度）程度になるようにミューラー・ヒントン・ブロス（Mueller-Hinton broth：MHB）に懸濁し、添加した。各ペプチドは任意の濃度に調製し、そこから段階希釈を行った。菌液を分注したマイクロプレートあるいは試験管に各濃度段階のポリペプチドを添加した。ペプチド無添加のものを陰性対照とした。プレートを37℃で16時間培養し、菌の増殖を阻害する最小濃度（最小発育阻止濃度：MIC）を求めた。結果を下記表１に示す。

表１に示されるように、AG30-5C（実施例１）は、抗菌活性もAG-30（比較例１）よりも優れていた。従って、AG30-5Cは、血管新生誘導活性も抗菌活性もAG-30よりも優れており、抗菌活性も併せて望まれる用途において優れた性能を発揮する。また、AG30-2C（実施例３）及びAG30-2Hb（実施例４）は、血管新生誘導活性はAG-30と同等（図１）であったが、抗菌活性はAG-30よりも優れていた。

実施例５： ポリペプチドの血流量増加活性
AG30-5C（実施例１）の血流量増加活性を調べた。

動物：C57Bl/6マウスおよび糖尿病マウス（db/db）はオリエンタルバイオサービスより購入した。8〜10週齢の雄のマウスを用いた。

方法：マウスの尾の背面側の先端部に、滅菌した＃10ゲージのメス（ベクトンディッキンソン）を用いて0.5〜1.0ｃｍ長の傷をつけた。出血は、圧迫することによって止めた。AG30-5Cポリペプチドをそれぞれ1, 10, 50μg /mlになるようPBSに溶解し、サンプル溶液とした。創傷部位に当該サンプル溶液を50μlずつ塗布した。コントロールとしては、PBSのみを同量塗布した。マウスは１群に3匹を用いた（ｎ＝3）。術２日後、マウスにケタミン（80mg/kg）およびキシラジン（12mg/kg）を筋肉内投与し、麻酔した。レーザードップラー流量計（Moor Instruments (Devon, United Kingdom)）を用いて創傷部の血流量を測定し、得られたデータを相対値に換算することにより各サンプルの効果を判定した。

結果を下記表２及び表３に示す。

何れのマウスにおいてもAG30-5C 投与群において有意に血流量の増加が認められた。

Claims (5)

1. 配列番号１ないし４のいずれかで示されるアミノ酸配列から成るポリペプチドを有効成分として含有する血管新生誘導剤。
2. 前記ポリペプチドが、配列番号１で示されるアミノ酸配列から成る請求項１記載の血管新生誘導剤。
3. 抗菌活性を有する請求項１又は２記載の血管新生誘導剤。
4. 緑膿菌及び／又は黄色ブドウ球菌に対して抗菌活性を有する請求項３記載の血管新生誘導剤。
5. 配列番号１ないし４のいずれかで示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドを有効成分として含有する、褥瘡、創傷、皮膚潰瘍、閉塞性動脈疾患及び閉塞性動脈硬化症から成る群から選択される疾患の処置のための予防、改善又は治療剤。

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