JP5442717B2

JP5442717B2 - 二置換フタラジンヘッジホッグ経路アンタゴニスト

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Publication number: JP5442717B2
Application number: JP2011507512A
Authority: JP
Inventors: フィリップ・アーサー・ヒップスカインド; ウィルソン貴子
Original assignee: イーライリリーアンドカンパニー
Priority date: 2008-04-29
Filing date: 2009-04-01
Publication date: 2014-03-12
Anticipated expiration: 2029-04-01
Also published as: ECSP10010577A; AU2009241561B2; EP2294061A2; UA102250C2; CN102066353A; WO2009134574A2; US20110046143A1; DOP2010000302A; MX2010011948A; CO6300945A2; IL208211A0; CR11741A; WO2009134574A3; MA32349B1; MY159491A; AU2009241561A1; JP2011527666A; CN102066353B; KR20100126580A; EA201071248A1

Description

本発明は、ヘッジホッグ経路アンタゴニストに関し、より具体的には、新規な二置換フタラジンおよびその治療的使用に関する。

ヘッジホッグ（Ｈｈ）シグナル伝達経路は細胞の分化および増殖に関与することで胚のパターン形成および成体組織の維持に重要な役割を果たしている。ヘッジホッグ（Ｈｈ）タンパク質ファミリーとしては、ソニックヘッジホッグ（Ｓｈｈ）、インディアンヘッジホッグ（Ｉｈｈ）、およびデザートヘッジホッグ（Ｄｈｈ）が挙げられ、これらは分泌糖タンパク質であり、自己触媒的切断およびコレステロールのアミノ末端ペプチドへの結合を含む、翻訳後修飾を受け、シグナル伝達活性を有するフラグメントを生成する。Ｈｈは１２回膜貫通型タンパク質Ｐｔｃｈ（Ｐｔｃｈ１およびＰｔｃｈ２）と結合し、それによりＰｔｃｈにより媒介されるＳｍｏｏｔｈｅｎｅｄ（Ｓｍｏ）の抑制を軽減する。Ｓｍｏの活性化が一連の細胞間イベントを引き起こし、最終的にＧｌｉの転写因子（Ｇｌｉ１、Ｇｌｉ２およびＧｌｉ３）を安定化し、細胞増殖、細胞生存、血管新生および浸潤に関与するＧｌｉ依存性遺伝子を発現させる。

Ｓｈｈシグナル伝達の異常活性化が種々の腫瘍形成（例えば、膵臓癌、髄芽腫、基底細胞癌、小細胞肺癌および前立腺癌）を引き起こす発見に基づいて、Ｈｈシグナル伝達は近年顕著に関心を集めている。例えばステロイドアルカロイド化合物ＩＰ−６０９、アミノプロリン化合物ＣＵＲ６１４１４および２，４−二置換チアゾール化合物ＪＫ１８などの複数のＨｈアンタゴニストが当該技術分野で報告されている。特許文献１では、ヘッジホッグアンタゴニストと主張されている特定の１，４−二置換フタラジン化合物が開示されている。

国際公開第２００５０３３２８８号パンフレット

有効なヘッジホッグ経路阻害剤、特に望ましい薬力学的、薬物動態学的および毒物学的特性を有するものについての必要性が依然として存在する。本発明は、有効なヘッジホッグ経路のアンタゴニストである新規な１，４−二置換フタラジンを提供する。

本発明は、式（Ｉ）の化合物

（式中、
Ｒ^１は、水素、フルオロ、シアノ、トリフルオロメチル、メトキシまたはトリフルオロメトキシであり、
Ｒ^２は、水素またはメチルであり、
Ｒ^３、Ｒ^４、Ｒ^５、Ｒ^６およびＲ^７は、独立して水素、クロロ、フルオロ、シアノ、トリフルオロメチルまたはトリフルオロメトキシであり、ただし、Ｒ^３、Ｒ^４、Ｒ^５、Ｒ^６およびＲ^７のうちの少なくとも２つは水素である）
またはその薬学的に許容される塩を提供する。

本発明の化合物が第三級アミン部分を含み、多くの無機酸および有機酸と反応して、薬学的に許容される酸付加塩を形成できることは、当業者によって理解されるだろう。そのような薬学的に許容される酸付加塩およびそれらを調製するための一般的な方法論は、当該技術分野において周知である。例えば、Ｐ．Ｓｔａｈｌら，ＨＡＮＤＢＯＯＫＯＦＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬＳＡＬＴＳ：ＰＲＯＰＥＲＴＩＥＳ，ＳＥＬＥＣＴＩＯＮＡＮＤＵＳＥ，（ＶＣＨＡ／Ｗｉｌｅｙ−ＶＣＨ，２００２）；Ｓ．Ｍ．Ｂｅｒｇｅら，「ＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＳａｌｔｓ」，ＪｏｕｒｎａｌｏｆＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ，Ｖｏｌ６６，Ｎｏ１，１９７７年１月を参照のこと。

本発明の具体的な例としては、式Ｉの化合物、またはその薬学的に許容される塩を含み、式中、
（ａ）Ｒ^１は水素であり、
（ｂ）Ｒ^２はフルオロであり、
（ｃ）Ｒ^２は水素であり、
（ｄ）Ｒ^２はメチルであり、
（ｅ）Ｒ^３はクロロ、フルオロ、トリフルオロメチルまたはトリフルオロメトキシであり、
（ｆ）Ｒ^５はフルオロ、トリフルオロメトキシまたはトリフルオロメチルであり、
（ｇ）Ｒ^１は水素であり、Ｒ^２は水素であり、
（ｈ）Ｒ^１はフルオロであり、Ｒ^２は水素であり、
（ｉ）Ｒ^１は水素であり、Ｒ^２はメチルであり、
（ｊ）Ｒ^１はフルオロであり、Ｒ^２はメチルであり、
（ｋ）Ｒ^１は水素であり、Ｒ^３はクロロ、フルオロ、トリフルオロメチルまたはトリフルオロメトキシであり、
（ｌ）Ｒ^１はフルオロであり、Ｒ^３はクロロ、フルオロ、トリフルオロメチルまたはトリフルオロメトキシであり、
（ｍ）Ｒ^２は水素であり、Ｒ^３はクロロ、フルオロ、トリフルオロメチルまたはトリフルオロメトキシであり、
（ｎ）Ｒ^２はメチルであり、Ｒ^３はクロロ、フルオロ、トリフルオロメチルまたはトリフルオロメトキシであり、
（ｏ）Ｒ^１は水素であり、Ｒ^５はフルオロ、トリフルオロメトキシまたはトリフルオロメチルであり、
（ｐ）Ｒ^１はフルオロであり、Ｒ^５はフルオロ、トリフルオロメトキシまたはトリフルオロメチルであり、
（ｑ）Ｒ^２は水素であり、Ｒ^５はフルオロ、トリフルオロメトキシまたはトリフルオロメチルであり、
（ｒ）Ｒ^２はメチルであり、Ｒ^５はフルオロ、トリフルオロメトキシまたはトリフルオロメチルであり、
（ｓ）Ｒ^３はクロロ、フルオロ、トリフルオロメチルまたはトリフルオロメトキシであり、Ｒ^５はフルオロ、トリフルオロメトキシまたはトリフルオロメチルであり、
（ｔ）Ｒ^１は水素であり、Ｒ^２は水素であり、Ｒ^３はクロロ、フルオロ、トリフルオロメチルまたはトリフルオロメトキシであり、
（ｕ）Ｒ^１は水素であり、Ｒ^２はメチルであり、Ｒ^３はクロロ、フルオロ、トリフルオロメチルまたはトリフルオロメトキシであり、
（ｖ）Ｒ^１はフルオロであり、Ｒ^２は水素であり、Ｒ^３はクロロ、フルオロ、トリフルオロメチルまたはトリフルオロメトキシであり、
（ｗ）Ｒ^１はフルオロであり、Ｒ^２はメチルであり、Ｒ^３はクロロ、フルオロ、トリフルオロメチルまたはトリフルオロメトキシであり、
（ｘ）Ｒ^１は水素であり、Ｒ^２は水素であり、Ｒ^５はフルオロ、トリフルオロメチルまたはトリフルオロメトキシであり、
（ｙ）Ｒ^１は水素であり、Ｒ^２はメチルであり、Ｒ^５はフルオロ、トリフルオロメチルまたはトリフルオロメトキシであり、
（ｚ）Ｒ^１はフルオロであり、Ｒ^２は水素であり、Ｒ^５はフルオロ、トリフルオロメチルまたはトリフルオロメトキシであり、
（ａａ）Ｒ^１はフルオロであり、Ｒ^２はメチルであり、Ｒ^５はフルオロ、トリフルオロメチルまたはトリフルオロメトキシであり、
（ｂｂ）Ｒ^１は水素であり、Ｒ^２は水素であり、Ｒ^３はクロロ、フルオロ、トリフルオロメチルまたはトリフルオロメトキシであり、Ｒ^５はフルオロ、トリフルオロメチルまたはトリフルオロメトキシであり
（ｃｃ）Ｒ^１は水素であり、Ｒ^２はメチルであり、Ｒ^３はクロロ、フルオロ、トリフルオロメチルまたはトリフルオロメトキシであり、Ｒ^５はフルオロ、トリフルオロメチルまたはトリフルオロメトキシであり
（ｄｄ）Ｒ^１はフルオロであり、Ｒ^２は水素であり、Ｒ^３はクロロ、フルオロ、トリフルオロメチルまたはトリフルオロメトキシであり、Ｒ^５はフルオロ、トリフルオロメチルまたはトリフルオロメトキシであり
（ｅｅ）Ｒ^１はフルオロであり、Ｒ^２はメチルであり、Ｒ^３はクロロ、フルオロ、トリフルオロメチルまたはトリフルオロメトキシであり、Ｒ^５はフルオロ、トリフルオロメチルまたはトリフルオロメトキシであり
（ｆｆ）Ｒ^１は水素であり、Ｒ^２は水素であり、Ｒ^３はトリフルオロメチルであり、Ｒ^５はフルオロであり
（ｇｇ）Ｒ^１はフルオロであり、Ｒ^２は水素であり、Ｒ^３はトリフルオロメチルであり、Ｒ^５はフルオロであり
（ｈｈ）Ｒ^１は水素であり、Ｒ^２はメチルであり、Ｒ^３はトリフルオロメチルであり、Ｒ^５はフルオロであり
（ｉｉ）Ｒ^１はフルオロであり、Ｒ^２はメチルであり、Ｒ^３はトリフルオロメチルであり、Ｒ^５はフルオロであり
（ｊｊ）Ｒ^３、Ｒ^４、Ｒ^５、Ｒ^６およびＲ^７のうち、３つは水素であり、
（ｋｋ）Ｒ^３、Ｒ^４、Ｒ^５、Ｒ^６およびＲ^７のうち、４つは水素である。

本発明は式Ｉの化合物またはその薬学的に許容される塩を、薬学的に許容される賦形剤、担体または希釈剤とともに含む、医薬組成物も提供する。

本発明の化合物は種々の経路で投与される医薬組成物として好ましくは処方される。このような組成物は経口または静脈内投与が好ましい。このような医薬組成物およびそれらの調製方法は当該技術分野において周知である。例えば、ＲＥＭＩＮＧＴＯＮ：ＴＨＥＳＣＩＥＮＣＥＡＮＤＰＲＡＣＴＩＣＥＯＦＰＨＡＲＭＡＣＹ（Ａ．Ｇｅｎｎａｒｏら，ｅｄｓ．，１９版，ＭａｃｋＰｕｂｌｉｓｈｉｎｇＣｏ．，１９９５年）を参照のこと。

本発明はまた、哺乳動物における髄芽腫、基底細胞癌、食道癌、胃癌、膵臓癌、胆道癌、前立腺癌、乳癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、Ｂ細胞リンパ腫、多発性骨髄腫、卵巣癌、直腸結腸癌、肝臓癌、腎臓癌または黒色腫を処置する方法も提供し、そのような処置を必要とする哺乳動物に、有効量の式Ｉの化合物、またはその薬学的に許容される塩を投与することを含む。

実際に投与する化合物の分量は、治療の条件、選択される投薬経路、実際に投与する単一または複数の化合物、個々の患者の年齢、体重および応答、ならびに患者の症状の重症度を含む、関連する状況に基づいて、医師により決定されることは、理解されるだろう。一日当たりの投薬量は、通常、体重１ｋｇに対して約０．１から１０ｍｇの範囲である。いくつかの例では、投薬レベルは、前記範囲の下限を下回るほうが望ましく、他の例ではより多くの投薬量を採用することもできる。それゆえ、上記の投薬量の範囲は、いかなる意味でも本発明の範囲を限定すると意図されるものではない。本発明は、医薬として使用するための式Ｉの化合物またはその薬学的に許容される塩も提供する。

さらに、本発明は癌を処置するための医薬の製造における式Ｉの化合物またはその薬学的に許容される塩の使用も提供する。特に、これらの癌は髄芽腫、基底細胞癌、食道癌、胃癌、膵臓癌、胆道癌、前立腺癌、乳癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、Ｂ細胞リンパ腫、多発性骨髄腫、卵巣癌、直腸結腸癌、肝臓癌、腎臓癌および黒色腫からなる群より選択される。

さらに、本発明は、式Ｉの化合物またはその薬学的に許容される塩を、髄芽腫、基底細胞癌、食道癌、胃癌、膵臓癌、胆道癌、前立腺癌、乳癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、Ｂ細胞リンパ腫、多発性骨髄腫、卵巣癌、直腸結腸癌、肝臓癌、腎臓癌または黒色腫を処置するために活性成分として含む、医薬組成物も提供する。

本明細書で用いる場合、以下の用語は次に示す意味を有する：“Ｅｔ_２Ｏ”はジエチルエーテルを示し、“ＤＭＦ”はジメチルホルムアミドを示し、“ＤＭＳＯ”はジメチルスルホキシドを示し、“ＴＦＡ”はトリフルオロ酢酸を示し、“ｂｏｃ”または“ｔ−ｂｏｃ”はｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルを示し、“ＳＣＸ”は強カチオン交換を示し、“ＰｙＢＯＰ”はベンゾトリアゾル−１−イルオキシトリピロリジノ−ホスホニウムヘキサフルオロリン酸塩を示し、“ｐｒｅｐ”は調製を示し、“ｅｘ”は実施例を示し、“ＩＣ５０”は薬剤で可能な５０％の最大阻害応答を生じるその薬剤の濃度を示す。

式Ｉの化合物は、スキーム１に描かれるような反応に従って調製できる。

１−クロロ置換フタラジン（２）を、芳香族求核置換（ＳＮＡｒ）中で４−アミノｂｏｃ保護ピペリジン（３ａ）と反応させて、式（４）のピペリジン置換フタラジンを得る。例えば、塩化物（２）を、トリエチルアミンなどの有機塩基または炭酸カリウムなどの無機塩基の存在下で、ＤＭＦまたはＤＭＳＯなどの両性非プロトン性溶媒中で式（３ａ）のピペリジンと反応させることができ、１００〜１４０℃まで加熱する。

例えば、式（４）のピペリジニルフタラジンに存在するアミン官能基を脱保護し、さらに反応させて、さらなる本発明の化合物を得ることができる。窒素および酸素保護基を導入および除去するための方法は、当該技術分野において周知である（例えば、ＧｒｅｅｎｅおよびＷｕｔｓ，ＰｒｏｔｅｃｔｉｖｅＧｒｏｕｐｓｉｎＯｒｇａｎｉｃＳｙｎｔｈｅｓｉｓ，第３版，ＪｏｈｎＷｉｌｅｙおよびＳｏｎｓ，ＮｅｗＹｏｒｋ，（１９９９）を参照のこと）。例えば、式（４）のアミノピペリジニルフタラジンのｂｏｃ脱保護は、塩化水素またはトリフルオロ酢酸などの酸性条件下で達成することができる。あるいは、０〜２０℃で、トルエン中のメタノールなどのアルコール溶媒の溶液に塩化アセチルを滴下することにより、ＨＣｌをインサイチュで生成でき、続いて、式（４）の化合物を加えて、３０〜６０℃までその溶液を加熱して、式（５）の化合物を得ることができる。式（５）の化合物がアミン塩酸塩などの塩として分離でき、工程（３）まで実施できるか、または炭酸カリウムなどの無機塩基を用いて遊離アミンに変換できることは、当業者には明白であろう。４−アミノピペリジンは、ジクロロメタンまたはジオキサンなどの不活性溶媒およびトリエチルアミンまたはピリジンなどの塩基中で置換塩化ベンゾイルを用いてアシル化して、式Ｉのアミド化合物を得ることができる。あるいは、式（５）の化合物を、ＰｙＢＯＰなどの適切なカップリング試薬およびジクロロメタンなどの不活性溶媒中のトリエチルアミンなどの適切な塩基とともに置換安息香酸を用いて、あるいはＤＭＦなどの両性非プロトン性溶媒中の１−（３−ジメチルアミノプロピル）−３−エチルカルボジイミド塩酸塩および１−ヒドロキシベンゾトリアゾールを用いてアシル化できる。

あるいは、１−クロロ置換フタラジン（２）を、工程１ａについて以前に記載されるように芳香族求核置換（ＳＮＡｒ）中の式（３ｂ）のＮ−ピペリジン−４−イル−ベンズアミドと反応させて、式Ｉの化合物を直接得る。例えば、塩化物（２）を、トリエチルアミンなどの塩基の存在下で、式（３ｂ）のＮ−ピペリジン−４−イル−ベンズアミドと、ＤＭＦまたはＤＭＳＯなどの両性非プロトン性溶媒中で反応させ、８０〜１４０℃まで加熱して、式Ｉのアミドを得ることができる。

スキーム１における式（２）の化合物は商業的に利用可能であるか、あるいは本明細書に記載されるものと同様の方法によって、または当該技術分野において確立されている手順を用いることによって容易に調製できることは、当業者により理解されるだろう。例えば、臭化フェニルと無水フタル酸とのグリニャール反応から生成した２−フェニルカルボニル安息香酸をヒドラジンで環化して、４−フェニル−２Ｈ−フタラジン−１−オンを得ることができる。続いて、オキシ塩化リンでの処理により、式（２）の１−クロロ−４−フェニル−フタラジンを得る。あるいは、１，４−ジクロロフタラジンを、Ｓｕｚｕｋｉクロスカップリング反応においてフェニルボロン酸と反応させて、式（２）の対応する１−クロロ−４−フェニル−フタラジンを得ることができる。

式Ｉの化合物は、スキーム２に描かれるような反応に従って調製できる。工程１において、１，４−ジクロロフタラジン（６）を、炭酸カリウムまたはトリエチルアミンなどの適切な塩基を用いてＮ−メチルピロリドンまたはＤＭＳＯなどの両性非プロトン性溶媒中で４−アミノｂｏｃ保護ピペリジン（３ａ）と反応させることができる。混合物を７０〜９５℃で加熱して、式（７）の化合物を得る。１つの方法において、工程５に示すように、式（７）の化合物を脱保護し、続いて、トリエチルアミンなどの塩基とともに、ジクロロメタンなどの不活性溶媒中で置換塩化ベンゾイルを用いて工程６においてアミンでアシル化して、式（９）のアミドを得ることができる。あるいは、式（７）の化合物を、室温で、ジクロロメタンなどの不活性溶媒中で置換フェニルカルボン酸およびＰｙＢＯＰなどの適切なカップリング試薬およびトリエチルアミンなどの適切な塩基を用いて、またはＤＭＦなどの適切な溶媒を含む１−ヒドロキシベンゾトリアゾールおよび１−（３−ジメチルアミノプロピル）−３−エチルカルボジイミド塩酸塩を用いてアシル化できる。工程７において、式（９）のフタラジニルクロリドを、Ｓｕｚｕｋｉ−Ｍｉｙａｕｒａクロスカップリング条件下でフェニルボロン酸と反応させる。当業者は、このようなクロスカップリング反応を促進するのに有用な様々な条件が存在することを理解するだろう。その反応条件はジオキサン／水などの適切な溶媒を利用する。その反応は、リン酸三カリウム一水和物、炭酸ナトリウム、炭酸カリウム、または炭酸セシウムなどの塩基の存在下で達成される。その反応は、約８０〜１６０℃の温度にて不活性雰囲気下で、トリシクロヘキシルホスフィンまたは（ＳＰ−４−１）−ビス［ビス（１，１−ジメチルエチル）（４−メトキシフェニル）ホスフィン−κＰ］ジクロロ−パラジウム（Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．２００７，７２，５１０４−５１１２における触媒Ｄの合成に従って調製した）とともにトリス（ジベンジリデンアセトン）ジパラジウム（０）などのパラジウム触媒の存在下で起こり、式（Ｉ）の化合物を得る。

あるいは、式（７）のフタラジニルクロリドを、以前に記載したようにＳｕｚｕｋｉ−Ｍｉｙａｕｒａ条件下で工程２に示すように、最初にフェニルボロン酸と結合させて、式（４）のフェニルフタラジンを得ることができる。工程３において、式（４）の化合物を脱保護し、次いで、以前に記載するように置換塩化ベンゾイルまたはフェニルカルボン酸を用いてアミンで工程４に示すようにアシル化して、式Ｉの化合物を得ることができる。

以下の調製例および実施例はさらに詳細に本発明を例示し、式Ｉの化合物の典型的な合成を表すために提供する。本発明の化合物の名前は、一般に、ＣｈｅｍＤｒａｗＵｌｔｒａ（登録商標）１０．０によって提供される。

調製例１
｛１−［４−（４−フルオロ−フェニル）フタラジン−１−イル］−ピペリジン−４−イル｝−メチル−カルバミン酸ｔｅｒｔ−ブチル

１−クロロ−４−（４−フルオロフェニル）−フタラジン（３．００ｇ、１１．６ｍｍｏｌ）を、ＤＭＦ（３０ｍＬ）中のメチル−ピペリジン−４−イル−カルバミン酸ｔｅｒｔ−ブチルエステル（２．９８ｇ、１３．９ｍｍｏｌ）およびトリエチルアミン（３．５２ｇ、３４．８ｍｍｏｌ）の溶液に加える。３日間、１３０℃で加熱する。ジクロロメタンに反応混合物を溶解し、ブラインで洗浄する。硫酸ナトリウムで有機相を乾燥させ、濾過し、減圧下で濃縮する。得られた残渣をフラッシュクロマトグラフィー（２０：５：１、ヘキサン：酢酸エチル：メタノール中２Ｍのアンモニア）により精製して、固体として標題の化合物を得る（４．４５ｇ、８８％）。ＥＳ／ＭＳｍ／ｚ４３７．２（Ｍ＋１）。

代替手順：
ジメチルスルホキシド（５００ｍＬ）中にメチル−ピペリジン−４−イル−カルバミン酸ｔｅｒｔ−ブチルエステル（７５ｇ、３４９ｍｍｏｌ）、１−クロロ−４−（４−フルオロ−フェニル）−フタラジン（７５ｇ、２８９ｍｍｏｌ）、および炭酸カリウム（８０ｇ、５７９ｍｍｏｌ）を合わせ、その混合物を３時間、１１０℃まで加熱する。反応物を室温まで冷却し、スラリーを水（１．０Ｌ）に注ぐ。濾過により固体を回収し、３日間、真空オーブンで乾燥させ、白色固体として標題の化合物を得る（１２０ｇ、９５％）。ＥＳ／ＭＳｍ／ｚ４３７．３（Ｍ＋１）。

適切なクロロフタラジンおよびｔＢＯＣ保護アミノピペリジンを用いて、調製例１に記載した手順に本質的に従って、以下の表のピペリジニルフタラジンを調製する。

調製例５
｛１−［４−（４−フルオロ−フェニル）フタラジン−１−イル］ピペリジン−４−イル｝メチルアミン

トリフルオロ酢酸（１００ｍＬ）を、ジクロロメタン（１００ｍＬ）中の｛１−［４−（４−フルオロ−フェニル）フタラジン−１−イル］−ピペリジン−４−イル｝−メチル−カルバミン酸ｔｅｒｔ−ブチルエステル（１１．２ｇ、１０．２ｍｍｏｌ）の溶液に加える。その反応物を室温で一晩攪拌し、減圧下で濃縮する。得られた残渣をジクロロメタンに溶解し、１ＮのＮａＯＨおよびブラインで洗浄する。有機相を硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、減圧下で濃縮する。ヘキサン／ジクロロメタンから標題の化合物を結晶化し、標題の化合物（８．４６ｇ、９８％）を得る。ＥＳ／ＭＳｍ／ｚ３３７．２（Ｍ＋１）。

代替手順（塩酸塩として単離される）
トルエン（５００ｍＬ）およびメタノール（３０ｍＬ）を１０℃で合わせる。塩化アセチル（２９ｍＬ、４１０ｍｍｏｌ）を２０分にわたって滴下する。添加の間、１５℃以下の温度に維持する。｛１−［４−（４−フルオロ−フェニル）−フタラジン−１−イル］−ピペリジン−４−イル｝−メチル−カルバミン酸ｔｅｒｔ−ブチルエステル（７１ｇ、１６４ｍｍｏｌ）を加える。スラリーを３５℃まで２時間加熱する。スラリーを室温まで冷やし、濾過により固体を回収する。１２時間、４０℃で真空オーブン中で乾燥させて、白色固体として標題の化合物（５８ｇ、９５％）を得る。ＥＳ／ＭＳｍ／ｚ３３７（Ｍ＋１）。

適切なｔＢＯＣ保護アミノピペリジニルフタラジンを用いて、調製例５に記載した手順に本質的に従って、以下の表の脱保護アミノピペリジニルフタラジンを調製する。

調製例９
ｔｅｒｔ−ブチル１−（４−クロロフタラジン−１−イル）ピペリジン−４−イル（メチル）カルバメート

Ｎ−メチルピロリドン（５０．０ｍＬ）中に１，４−ジクロロフタラジン（５．００ｇ、２４．６ｍｍｏｌ）、ｔｅｒｔ−ブチルメチル（ピペリジン−４−イル）カルバメート（５．５４ｇ、２５．８ｍｍｏｌ）、および炭酸カリウム（２９．５ｍｍｏｌ；４．０８ｇ）を合わせる。反応混合物を３日間８０℃で加熱し、その反応混合物を氷水に注ぐ。真空濾過により濾過し、黄色がかった固体を得て、真空オーブン中で室温で乾燥させる。シリカゲルクロマトグラフィー（１：１、ヘキサン：酢酸エチル）により精製して、所望の生成物（５．７９ｇ、６２％）を得る。ＥＳ／ＭＳｍ／ｚ３７７．２（Ｍ＋１）。

代替手順：
１，４−ジクロロフタラジン（７．０４ｇ、３５．４ｍｍｏｌ）、ｔｅｒｔ−ブチルメチル（ピペリジン−４−イル）カルバメート（５．５４ｇ、３７．２ｍｍｏｌ）、トリエチルアミン（７．４ｍＬ、５３．１ｍｍｏｌ）およびＤＭＳＯ（８５ｍＬ）を合わせる。出発物質の消費が完了するまで、反応混合物を３日間８５℃で加熱する。冷却後、反応混合物をジエチルエーテルとともに分液漏斗に移し、水で洗浄する。有機層を分離し、ＭｇＳＯ_４で乾燥させ、濾過し、次いで真空中で濃縮する。得られた残渣をフラッシュカラムクロマトグラフィー（ジクロロメタン中の０〜１０％のメタノール）により精製して、標題の化合物（７．６ｇ、５７％）を得る。ＥＳ／ＭＳｍ／ｚ３７７．２（Ｍ＋１）。

調製例１０
ｔｅｒｔ−ブチルメチル（１−（４−（４−（トリフルオロメチル）フェニル）フタラジン−１−イル）ピペリジン−４−イル）カルバメート

マイクロ波用容器にｔｅｒｔ−ブチル１−（４−クロロフタラジン−１−イル）ピペリジン−４−イル（メチル）カルバメート（０．２０１ｇ、０．５３４ｍｍｏｌ）、４−（トリフルオロメチル）フェニルボロン酸（１２２ｍｇ、０．６４０ｍｍｏｌ）、リン酸三カリウム一水和物（２０９ｍｇ、０．９０７ｍｍｏｌ）、トリシクロヘキシルホスフィン（１９ｍｇ、０．０６４ｍｍｏｌ）、１，４−ジオキサン（３．５ｍＬ）および水（１．５ｍＬ）を入れる。５分間、窒素を反応混合物に通して泡立てる。トリス（ジベンジリデンアセトン）ジパラジウム（０）（０．０２７ｍｍｏｌ、２５ｍｇ）を加える。さらに５分間、窒素を反応混合物に通して泡立てる。１５０℃で１時間、マイクロ波中で密閉した反応容器を加熱する。反応混合物を、酢酸エチルで溶出するシリカゲルパッドに通す。真空中で濃縮し、シリカゲルクロマトグラフィー（３０：７０、酢酸エチル：ヘキサン）を用いて得られた残渣を精製して、標題の化合物（０．１７０ｇ（６５％））を得る。ＥＳ／ＭＳｍ／ｚ４８６．８（Ｍ＋１）。

調製例１１
Ｎ−メチル−１−（４−（４−（トリフルオロメチル）フェニル）フタラジン−１−イル）ピペリジン−４−アミン二塩酸塩
塩化水素（ジオキサン中に４．０Ｎ、２０ｍＬ；８０．０ｍｍｏｌ）をｔｅｒｔ−ブチルメチル（１−（４−（４−（トリフルオロメチル）フェニル）フタラジン−１−イル）ピペリジン−４−イル）カルバメート（０．１５８ｇ、０．３２５ｍｍｏｌ）に加える。室温で一晩攪拌する。減圧下で溶媒を除去する。粗物質（０．１６９ｇ、＞１００％）をそのまま使用する。ＥＳ／ＭＳｍ／ｚ３８７．０（Ｍ＋１）。

調製例１２
ｔｅｒｔ−ブチル１−（４−（４−シアノフェニル）フタラジン−１−イル）ピペリジン−４−イル（メチル）カルバメート
圧力管にｔｅｒｔ−ブチル１−（４−クロロフタラジン−１−イル）ピペリジン−４−イル（メチル）カルバメート（４００ｍｇ、１．０６ｍｍｏｌ）、１，４−ジオキサン（１２ｍＬ）、水（４ｍＬ）、４−シアノフェニルボロン酸（４６７ｍｇ、３．１８ｍｍｏｌ）、および炭酸セシウム（１．４０ｇ、４．２４ｍｍｏｌ）を入れる。５分間、窒素を反応混合物に通して泡立てる。（ＳＰ−４−１）−ビス［ビス（１，１−ジメチルエチル）（４−メトキシフェニル）ホスフィン−κＰ］ジクロロ−パラジウム（Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．２００７，７２，５１０４−５１１２）（３６．０ｍｇ、０．０５３ｍｍｏｌ）を加える。数分間、窒素を反応混合物に通して泡立て、反応容器を密閉する。反応物を９０℃で一晩加熱する。反応混合物を、酢酸エチルで溶出するシリカゲルパッドにより濾過する。減圧下で溶媒を除去し、シリカゲルクロマトグラフィー（３０：７０、酢酸エチル：ヘキサン）を用いて得られた残渣を精製して、標題の化合物（０．３９２ｇ、８３％）を得る。ＥＳ／ＭＳｍ／ｚ４４４．２（Ｍ＋１）。

調製例１３
４−（４−（４−（メチルアミノ）ピペリジン−１−イル）フタラジン−１−イル）ベンゾニトリル二塩酸塩
ｔｅｒｔ−ブチル１−（４−（４−シアノフェニル）フタラジン−１−イル）ピペリジン−４−イル（メチル）カルバメート（０．３８５ｇ、０．８６８ｍｍｏｌ）を用いて、調製例１１に記載した手順に本質的に従って標題の化合物を調製する。次の反応において粗物質（０．３７８ｇ、＞１００％）をそのまま使用する。ＥＳ／ＭＳｍ／ｚ３４４．２（Ｍ＋１）。

調製例１４
１−（４−クロロフタラジン−１−イル）−Ｎ−メチルピペリジン−４−アミン二塩酸塩
塩化水素（ジオキサン中に４．０Ｎ、１００ｍＬ；４００ｍｍｏｌ）を、メタノール（１００ｍＬ）中のｔｅｒｔ−ブチル１−（４−クロロフタラジン−１−イル）ピペリジン−４−イル（メチル）カルバメート（７．６０ｇ；１．００当量；２０．２ｍｍｏｌ）の溶液に加える。１時間、室温で攪拌する。減圧下で溶媒を除去して、標題の化合物（７．０５ｇ、１００％）を得る。ＥＳ／ＭＳｍ／ｚ２７７．２（Ｍ＋１）。

調製例１５
Ｎ−（１−（４−クロロフタラジン−１−イル）ピペリジン−４−イル）−Ｎ−メチル−２−（トリフルオロメチル）ベンズアミド

ジクロロメタン（３０ｍＬ）中に１−（４−クロロフタラジン−１−イル）−Ｎ−メチルピペリジン−４−アミン二塩酸塩（１．０１ｇ、２．８９ｍｍｏｌ）およびトリエチルアミン（１．２ｍＬ、８．６１ｍｍｏｌ）を合わせる。窒素で反応バイアルをフラッシュし、３−トリフルオロメチルベンゾイルクロリド（０．４６ｍＬ、３．１２ｍｍｏｌ）を加える。窒素雰囲気生成装置下に反応物を置き、一晩室温で攪拌する。残渣に濃縮し、シリカゲルクロマトグラフィー（ジクロロメタン中の０〜１０％のメタノール）を用いて精製して、標題の化合物（１．１１ｇ、８６％）を得る。ＥＳ／ＭＳｍ／ｚ４４９．２（Ｍ＋１）。

適切な酸塩化物を用いて、調製例１５に記載した手順に本質的に従って以下の表のアミドを調製する。

実施例１
Ｎ−（１−（４−（４−フルオロフェニル）フタラジン−１−イル）ピペリジン−４−イル）−Ｎ−メチル−４−（トリフルオロメトキシ）ベンズアミド塩酸塩

メチル｛１−［４−（４−フルオロ−フェニル）フタラジン−１−イル］ピペリジン−４−イル｝メチルアミン（１００ｍｇ、０．３００ｍｍｏｌ）、トリエチルアミン（０．１２ｍＬ、０．８９ｍｍｏｌ）およびジクロロメタン（２ｍＬ）を室温で合わせる。４−（トリフルオロメトキシ）−塩化ベンゾイル（１００ｍｇ、０．４５ｍｍｏｌ）を混合物に加え、室温で一晩攪拌する。その反応混合物を濃縮し、得られた残渣をフラッシュクロマトグラフィー（２０：５：１、ヘキサン：酢酸エチル：メタノール中の２Ｍのアンモニア）により精製する。ジエチルエーテル中の１ＮのＨＣｌを、ジクロロメタン／メタノール中の分離した生成物の溶液に加え、窒素ガスのストリーム下で溶媒を除去して、固体として標題の化合物（９８ｍｇ、５８％）を得る。ＥＳ／ＭＳｍ／ｚ５２５．０（Ｍ＋１）。

代替手順
１，４−ジオキサン（５８０ｍＬ）に｛１−［４−（４−フルオロ−フェニル）−フタラジン−１−イル］−ピペリジン−４−イル｝−メチル−アミン塩酸塩（５８ｇ、１５５ｍｍｏｌ）を加える。トリエチルアミン（８６ｍＬ、６２２ｍｍｏｌ）を加え、２０分間、攪拌する。４−（トリフルオロメトキシ）塩化ベンゾイル（２４ｍＬ、１５５ｍｍｏｌ）を２０分の間にわたって滴下する。室温で１時間攪拌する。水（１００ｍＬ）を加え、酢酸エチル（２００ｍＬ）で抽出し、減圧下で有機物部分を濃縮する。得られた残渣を、１ｋｇのシリカプラグ上で酢酸エチルで溶出する、フラッシュカラムクロメトグラフィーにより精製して、無色の油状物として生成物（５８ｇ、７１％）を得る。トルエン（５８６ｍＬ）とエタノール（１１７ｍＬ）を合わせ、３℃まで冷却する。塩化アセチル（８ｍＬ、１１１ｍｍｏｌ）を２０分の間にわたって加える。２０分間攪拌し、次いで、トルエン（４０ｍＬ）中のＮ−｛１−［４−（４−フルオロ−フェニル）−フタラジン−１−イル］−ピペリジン−４−イル｝−Ｎ−メチル−４−トリフルオロメトキシ−ベンズアミド（５８ｇ、１１１ｍｍｏｌ）を１度に加える。１２時間攪拌する。１／３の体積まで濃縮する。濾過により沈殿物を回収する。４０℃で一晩、真空オーブン中で固体を乾燥させて、白色の固体（４２ｇ、６７％）として標題の化合物を得る。ＥＳ／ＭＳｍ／ｚ５２５．０（Ｍ＋１）。

適切な酸塩化物を用いて、実施例１に記載した手順に本質的に従って以下の表のアミドを調製する。

実施例３０に対する代替手順
水（５００ｍＬ）に｛１−［４−（４−フルオロ−フェニル）−フタラジン−１−イル］−ピペリジン−４−イル｝−メチル−アミン塩酸塩（８０ｇ、２４０ｍｍｏｌ）を加えて、スラリーを形成する。ｐＨが１０になるまで炭酸カリウムを加える。塩化メチレン（４００ｍＬ）を加える。固体が全て溶解するまで激しく攪拌する。有機層を分離し、透明な油状物（７４ｇ、２２０ｍｍｏｌ）まで濃縮して、１−［４−（４−フルオロ−フェニル）−フタラジン−１−イル］−ピペリジン−４−イル｝−メチル−アミンを得る。

｛１−［４−（４−フルオロ−フェニル）−フタラジン−１−イル］−ピペリジン−４−イル｝−メチル−アミン（１２ｇ、３５ｍｍｏｌ）、ピリジン（２０ｍＬ、２４７ｍｍｏｌ）および１，４−ジオキサン（１２０ｍＬ）を合わせる。その反応物を２０分間攪拌する。ジクロロメタン（２５ｍＬ）を加える。スラリーを２０分間攪拌する。４−フルオロ−２−（トリフルオロメチル）塩化ベンゾイル（６．５ｍＬ、４３ｍｍｏｌ）を２０分の間にわたって滴下する。２時間攪拌する。その混合物を水（１００ｍＬ）に注ぎ、ジクロロメタン（２００ｍＬ）で抽出し、減圧下で濃縮する。残渣をフラッシュクロマトグラフィー（１：１、酢酸エチル：ヘキサン）により精製して、白色の固体として生成物（１０．３ｇ、５５％）を得る。トルエン（１２５ｍＬ）に４−フルオロ−Ｎ−｛１−［４−（４−フルオロ−フェニル）−フタラジン−１−イル］−ピペリジン−４−イル｝−Ｎ−メチル−２−トリフルオロメチル−ベンズアミド（１０ｇ、１９．８５ｍｍｏｌ）を加えて、スラリーを得る。メタノール（３０ｍＬ）を加えて、均一な溶液にする。塩化水素（５．２１ｍＬ、１，４−ジオキサン中に４．０Ｎ、２０ｍｍｏｌ）を一度に加える。１時間攪拌し、１／３の体積まで濃縮する。固体を回収し、３５℃で１２時間、真空オーブン中で乾燥させて、白色の固体（９．５ｇ、８５％）として標題の化合物を得る。ＥＳ／ＭＳｍ／ｚ５２７．０（Ｍ＋１）。

実施例３１
４−フルオロ−Ｎ−メチル−Ｎ−（１−（４−フェニルフタラジン−１−イル）ピペリジン−４−イル）−２−（トリフルオロメチル）ベンズアミド塩酸塩

メチル−［１−（４−フェニルフタラジン−１−イル）ピペリジン−４−イル］−アミン（８００ｍｇ、２．５１ｍｍｏｌ）、トリエチルアミン（１．０５ｍＬ、７．５４ｍｍｏｌ）およびジクロロメタン（２０ｍＬ）を室温で合わせる。その混合物に４−フルオロ−２−（トリフルオロメチル）塩化ベンゾイル（６８３ｍｇ、３．０１ｍｍｏｌ）を加え、室温で一晩攪拌する。その反応混合物を濃縮し、得られた残渣をフラッシュクロマトグラフィー（２０：５：１、ヘキサン：酢酸エチル：メタノール中の２Ｍのアンモニア）により精製する。ジクロロメタン／メタノール中の分離した生成物の溶液にジエチルエーテル中の１ＮのＨＣｌを加える。得られた固体を濾過して、標題の化合物（１．１３ｇ、８８％）を得る。ＥＳ／ＭＳｍ／ｚ５０９．２（Ｍ＋１）。

適切な酸塩化物を用いて、実施例３１に記載した手順に本質的に従って以下の表のアミドを調製する。濾過または溶媒を蒸発させることにより、ＨＣｌ塩を分離する。

実施例４９
Ｎ−（１−（４−（４−フルオロフェニル）フタラジン−１−イル）ピペリジン−４−イル）−４−（トリフルオロメチル）ベンズアミド塩酸塩

１−（４−（４−フルオロフェニル）フタラジン−１−イル）ピペリジン−４−アミン（１１０ｍｇ、０．３４ｍｍｏｌ）、トリエチルアミン（０．１４ｍＬ、１．０２ｍｍｏｌ）およびジクロロメタン（２ｍＬ）を室温で合わせる。その混合物に４−（トリフルオロメチル）−塩化ベンゾイル（８５ｍｇ、０．４１ｍｍｏｌ）を加え、室温で一晩攪拌する。その反応混合物を濃縮し、得られた残渣をフラッシュクロマトグラフィー（２０：５：１、ヘキサン：酢酸エチル：メタノール中の２Ｍのアンモニア）により精製する。ジクロロメタン／メタノール中の分離した生成物の溶液にジエチルエーテル中の１ＮのＨＣｌを加え、窒素ガスのストリーム下で溶媒を除去して、固体として標題の化合物（５７ｍｇ、３２％）を得る。ＥＳ／ＭＳｍ／ｚ４９５．２（Ｍ＋１）。

適切な酸塩化物を用いて、実施例４９に記載した手順に本質的に従って以下の表のアミドを調製する。

実施例６８
Ｎ−（１−（４−フェニルフタラジン−１−イル）ピペリジン−４−イル）−４−（トリフルオロメチル）ベンズアミド塩酸塩

１−（４−フェニルフタラジン−１−イル）ピペリジン−４−アミン（１１０ｍｇ、０．３４ｍｍｏｌ）、トリエチルアミン（０．１４０ｍＬ、１．０２ｍｍｏｌ）、およびジクロロメタン（２ｍＬ）を室温で合わせる。その混合物に４−（トリフルオロメチル）−塩化ベンゾイル（８５ｍｇ、０．４１ｍｍｏｌ）を加え、室温で一晩攪拌する。その反応混合物を濃縮し、得られた残渣をフラッシュクロマトグラフィー（２０：５：１、ヘキサン：酢酸エチル：メタノール中の２Ｍのアンモニア）により精製する。ジクロロメタン／メタノール中の分離した生成物の溶液にジエチルエーテル中の１ＮのＨＣｌを加え、窒素ガスのストリーム下に置くことによって溶媒を取り除いて、固体として標題の化合物（１１６ｍｇ、６７％）を得る。ＥＳ／ＭＳｍ／ｚ４７７．２（Ｍ＋１）。

適切な酸塩化物を用いて、実施例６８に記載した手順に本質的に従って以下の表のアミドを調製する。

実施例８６
Ｎ−（１−（４−（４−フルオロフェニル）フタラジン−１−イル）ピペリジン−４−イル）ベンズアミド塩酸塩

１−クロロ−４−（４−フルオロフェニル）フタラジン（１５０ｍｇ、０．５８ｍｍｏｌ）、Ｎ−（ピペリジン−４−イル）ベンズアミド（１７８ｍｇ、０．８７ｍｍｏｌ）、トリエチルアミン（０．４０４ｍＬ、２．９ｍｍｏｌ）およびジメチルホルムアミド（１ｍＬ）を室温で合わせる。１００℃まで加熱し、一晩攪拌する。粗反応混合物を、強カチオン交換ＰｈｅｎｏｍｅｎｅｘＳｔｒａｔａ（登録商標）ＳＣＸ（５５μｍ、７０Å）１０ｇ／６０ｍＬカラム（ベンゼンスルホン酸官能基を有する）に注ぐ。２Ｎのメタノールアンモニア（４０ｍＬ）で所望の生成物を溶出し、濃縮する。残渣をフラッシュクロマトグラフィー（ヘキサン中の２０〜３０％［酢酸エチル中の１０％２Ｎのメタノールアンモニア］）により精製する。ジクロロメタン／メタノール中の分離した生成物の溶液にジエチルエーテル中の１Ｎの塩酸を加え、窒素ガスのストリーム下で溶媒を除去して、固体として標題の化合物（１３７ｍｇ、５１％）を得る。ＥＳ／ＭＳｍ／ｚ４２７．２（Ｍ＋１）。

実施例８７
Ｎ−（１−（４−（４−シアノフェニル）フタラジン−１−イル）ピペリジン−４−イル）−４−フルオロ−Ｎ−メチル−２−（トリフルオロメチル）ベンズアミド塩酸塩

４−（４−（４−（メチルアミノ）ピペリジン−１−イル）フタラジン−１−イル）ベンゾニトリル塩酸塩（４４．７ｍｇ、０．１０７ｍｍｏｌ）、ジクロロメタン（１ｍＬ）、およびトリエチルアミン（０．０５９８ｍＬ、０．４２９ｍｍｏｌ）を４ｍＬの反応バイアルに入れる。窒素で反応バイアルをフラッシュし、４−フルオロ−２−（トリフルオロメチル）塩化ベンゾイル（０．０３３ｇ、０．１４ｍｍｏｌ）を加える。バイアルにキャップをし、反応物を室温で一晩攪拌する。残渣を蒸発させて、シリカゲルクロマトグラフィー（４０：６０、酢酸エチル：ヘキサン、次いで酢酸エチル）を用いて精製する。ジクロロメタン／メタノール中の分離した生成物の溶液にジエチルエーテル中の１ＮのＨＣｌを加え、窒素ガスのストリーム下に置くことによって溶媒を除去する。５０℃で真空オーブン中で乾燥させて、標題の化合物（３６．０ｍｇ、５９％）を得る。ＥＳ／ＭＳｍ／ｚ５３３．８（Ｍ＋１）。

調製例１１または調製例１３からの適切な出発物質および４−（トリフルオロメトキシ）塩化ベンゾイルを用いて、実施例８７に記載した手順に本質的に従って以下の表のアミドを調製する。

実施例９０
Ｎ−メチル−２−（トリフルオロメチル）−Ｎ−（１−（４−（４−（トリフルオロメチル）フェニル）フタラジン−１−イル）ピペリジン−４−イル）ベンズアミド塩酸塩

マイクロ波用の容器にＮ−（１−（４−クロロフタラジン−１−イル）ピペリジン−４−イル）−Ｎ−メチル−２−（トリフルオロメチル）ベンズアミド（０．１０１ｇ、０．２３ｍｍｏｌ）、４−（トリフルオロメチル）フェニルボロン酸（０．１７１ｇ、０．９ｍｍｏｌ）、炭酸セシウム（０．２９５ｇ、０．９１ｍｍｏｌ）、１，４−ジオキサン（３ｍＬ）、および水（１ｍＬ）を入れる。反応バイアルを窒素で２回パージする。（ＳＰ−４−１）−ビス［ビス（１，１−ジメチルエチル）（４−メトキシフェニル）ホスフィン−κＰ］ジクロロ−パラジウム（Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．２００７，７２，５１０４−５１１２）（０．００２ｇ、０．００３ｍｍｏｌ）を加え、反応物を１６時間、９０℃で加熱する。冷却後、２層を分離し、水を除去する。窒素のストリームで有機溶媒を蒸発させる。シリカゲルクロマトグラフィー（ジクロロメタン中の０〜１０％のメタノール）を用いて有機層から残渣を精製する。メタノール中の分離した生成物の溶液にジオキサン中の４ＮのＨＣｌを加え、真空下で溶媒を除去して、標題の化合物（０．１００ｇ、７５％）を得る。ＥＳ／ＭＳｍ／ｚ５５９．２（Ｍ＋１）。

調製例１５〜１８からの適切な出発物質および適切なボロン酸を用いて、実施例９０に記載した手順に本質的に従って以下の表の化合物を調製する。

ソニックヘッジホッグ（Ｓｈｈ）経路は胚形成の間、重要であるが、大部分の組織において出生後の発育後に下方制御される。対照的に、３０％より多くのヒト髄芽腫は、高レベルのＧｌｉｌ（神経膠腫関連腫瘍遺伝子ホモログ１）発現を示し、Ｓｈｈ経路の異常活性化が小児脳腫瘍のサブセットにおいて重要であることを示す。小脳プルキンエ細胞により分泌されたＳｈｈは顆粒前駆体の増殖を促進し、ヘッジホッグ（Ｈｈ）経路の制御されない活性化が、髄芽腫の進行を維持する可能性があることを示す。この仮説は、Ｐａｔｃｈｅｄ遺伝子（Ｐｔｃｈ^−／＋）マウスにおける髄芽腫の進行によって確認される。ヘッジホッグアンタゴニストでのこれらのマウスの処置は腫瘍増殖を阻害した。さらに、ヘッジホッグアンタゴニスト処置により、これらの脳腫瘍においてＧｌｉｌ発現の阻害が生じることが実証されている。

制御されていないヘッジホッグ経路活性が、同様に多くの他の癌において報告されている。例えば、ヘッジホッグは以下の癌についての生存因子と関係がある：基底細胞癌；上部胃腸管癌（食道、胃、膵臓、および胆道）；前立腺癌；乳癌；小細胞肺癌；非小細胞肺癌；Ｂ細胞リンパ腫；多発性骨髄腫；胃癌；卵巣癌；結腸直腸癌；肝臓癌；黒色腫；腎臓癌および髄芽腫。

ヘッジホッグ経路の要素は、癌の処置についての潜在的な薬物標的であると主張されている。髄芽腫瘍から確立されたＤａｏｙ細胞株（ＡＴＣＣ、ＨＴＢ−１８６）は、Ｈｈリガンドに感受性が高い。これらの細胞が外から加えられたＳｈｈ馴化培地で処理された場合、Ｈｈシグナル伝達経路が活性化され、Ｇｌｉｌ．Ｃｙｃｌｏｐａｍｉｎｅの増加した発現を生じ、コーンリリーＶｅｒａｔｒｕｍｃａｌｉｆｏｒｎｉｃｕｍから単離されたアルカロイドは弱いヘッジホッグアンタゴニストであり、Ｓｈｈ刺激に対する応答においてＧｌｉｌの発現を抑制することが示されている。最近の観測により、シクロパミンが、培養された髄芽腫細胞および同種移植片の増殖を阻害することが示唆されている。このＤａｏｙ細胞モデル系を用いて、ヘッジホッグシグナル伝達経路の有効な阻害剤が同定され得る。本発明の化合物はヘッジホッグアンタゴニストであるため、それらは、上述の腫瘍タイプを治療するのに適切である。

生物活性ＩＣ５０の決定
本発明の化合物および方法の有用性および効果をさらに実証する以下のアッセイプロトコルおよび結果を例示の目的のために与え、決して限定することを意味しない。機能的アッセイにより、本発明の化合物がＳｈｈシグナル伝達を阻害する能力を示すという支持が与えられる。以下のアッセイに利用される全てのリガンド、溶媒、および試薬は、商業源から容易に入手可能であるか、または当業者によって容易に調製され得る。

生物活性は、Ｄａｏｙ神経癌細胞における機能的アッセイを用いて決定され、ｂＤＮＡ（分岐デオキシリボ核酸）アッセイ系（Ｐａｎｏｍｉｃｓ，Ｉｎｃ．，Ｆｒｅｍｏｎｔ，ＣＡ）によってＧｌｉｌリボ核酸のレベルを測定する。Ｇｌｉは、Ｇｌｉｏｂｌａｓｔｏｍａ細胞株において最初に発見され、Ｓｈｈシグナル伝達によって活性化されるジンクフィンガータンパク質をコードする。最大応答は、２４時間、馴化培地（ＨＥＫ−２９３細胞が組み換えＳｈｈを安定に発現する）を用いてＤａｏｙ細胞においてＧｌｉｌ転写を誘導することによって得られ、次いで、刺激されたＧｌｉｌ転写産物の量を測定する。最小応答は、２４時間、馴化培地（ヒト胚腎臓、（ＨＥＫ）−２９３細胞が組み換えＳｈｈを安定に発現する）を用いて刺激されているＤａｏｙ細胞においてコントロール化合物で阻害されるＧｌｉｌ転写産物の量である。

Ｄａｏｙ細胞においてＧｌｉｌの阻害を測定するための機能的アッセイ
ｂＤＮＡアッセイ系は、標的リボ核酸（転写産物）の増幅を可能にする分岐鎖ＤＮＡの技術を利用する。この技術は、ハイブリダイゼーションシグナルを増幅するために標的転写産物を含む複合体としてハイブリダイズする標的転写産物（捕捉増量剤（ＣＥ）、標識増量剤（ＬＥ）、および阻害剤（ＢＬ））の特異性を決定する３種類の合成ハイブリッド短Ｇｌｉｌ特異的ｃＤＮＡプローブを利用する。増幅工程の間の化学発光基質の添加により、発光を用いる検出が可能となる。

アメリカンタイプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ）から得たＤａｏｙ細胞株は、Ｓｈｈ応答性ヒト神経腫瘍細胞株であり、線維形成小脳髄芽腫瘍である、生理学的に関連する腫瘍細胞株から１９８５年に確立された。Ｇｌｉｌ転写産物レベルの内因性レベルは、Ｄａｏｙ細胞において低いが、ヒトＳｈｈを安定に過剰発現する細胞（ｈＳｈｈで安定にトランスフェクトされたＨＥＫ−２９３細胞株）から得られる馴化培地を用いることによって刺激され得る。

Ｄａｏｙ細胞を、０．１ｎＭの非必須アミノ酸および１ｍＭのピルビン酸ナトリウムを含む最小必須培地（ＭＥＭ）と１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）を含むＤａｏｙ増殖培地中で組織培養Ｔ２２５−フラスコにおいてコンフルエンシーまで増殖させる。細胞を、トリプシンエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）を用いてＴ２２５−フラスコから除去し、遠心分離し、培地に再懸濁し、次いでカウントする。

次いで、Ｄａｏｙ細胞を、Ｃｏｓｔａｒ９６ウェルの透明な組織培養プレート中で増殖培地において１つのウェルあたり５０，０００細胞で播種し、５％の二酸化炭素（ＣＯ_２）下で３７℃で一晩、インキュベートさせる。細胞をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中で１回洗浄し、続いて、１００μＬのＳｈｈ馴化培地（Ｓｈｈ−ＣＭ）を添加してＧｌｉｌ発現のレベルを刺激する。Ｓｈｈ−ＣＭを希釈して、コントロール増殖培地−０．１％ＦＢＳ／ＤＭＥＭ（ダルベッコ改変イーグル培地）を用いて最大刺激を達成する。次いで、Ｓｈｈ−ＣＭで処理したＤａｏｙ細胞を、約１μＭ〜０．１ｎＭの範囲の濃度にて、様々な濃度のヘッジホッグ阻害剤で処理する。化合物を５％ＣＯ_２下で３７℃にて２４時間、インキュベートさせる。

Ｇｌｉｌ転写産物の測定を、製造者（Ｐａｎｏｍｉｃｓ，Ｉｎｃ．）によって記載されるようにＱｕａｎｔｉｇｅｎｅ２．０Ｇｌｉｌアッセイを用いることによって実施する。プロテイナーゼＫを含む、希釈した溶解混合物（ＤＬＭ）緩衝液を調製する。化合物とともに２４時間インキュベーションした後、細胞をＰＢＳで１回洗浄し、１８０μＬのＤＬＭを細胞に加える。溶解バッファーを含む細胞プレートを密閉し、３０〜４５分間、５５℃に置く。次いで、得られた細胞溶解物を５回粉砕する。Ｇｌｉｌプローブを含む作業プローブセットを、製造者の指示に従ってＤＬＭ中にプローブを希釈することによって作製し、次いで、２０μＬの作業プローブセットを、８０μＬのＤａｏｙ溶解物とともにｂＤＮＡアッセイプレートに加える。そのプレートを密閉し、５５℃で一晩インキュベートする。次いで、ｂＤＮＡプレートを製造者の指示に従って処理する。シグナルを、発光を検出するＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒＥｎｖｉｓｉｏｎリーダーでプレートを読み取ることによって定量化する。発光シグナルは、試料に存在する標的転写産物の量と直接比例する。

機能的アッセイからの発光シグナルデータを用いて、インビトロアッセイについてのＩＣ５０を算出する。データは、最大コントロール値（Ｓｈｈ−ＣＭで処理したＤａｏｙ細胞）および最小コントロール値（Ｓｈｈ−ＣＭおよび阻害濃度のコントロール化合物、１μＭのＮ−（３−（１Ｈ−ベンゾ［ｄ］イミダゾール−２−イル）−４−クロロフェニル）−３，５−ジメトキシベンズアミドで処理したＤａｏｙ細胞）に基づいて算出する。４パラメーターロジスティック曲線フィットを使用して、ＡｃｔｉｖｉｔｙＢａｓｅソフトウェアプログラムｖｓ．５．３、式２０５を用いてＩＣ５０値を生成する（ＡｓｓａｙＤｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｎｄＨＴＳ，ｖｓ５についての指針書、Ｃｏｐｙｒｉｇｈｔ２００５，ＥｌｉＬｉｌｌｙａｎｄＣｏ．およびＴｈｅＮａｔｉｏｎａｌＩｎｓｔｉｔｕｔｅｓｏｆＨｅａｌｔｈＣｈｅｍｉｃａｌＧｅｎｏｍｉｃｓＣｅｎｔｅｒ）。４パラメーターの式は以下のとおりである：フィット＝（Ａ＋（（Ｂ−Ａ）／（１＋（（Ｃ／ｘ）＾Ｄ）））式中、Ａ＝底部、Ｂ＝上部、Ｃ＝ＩＣ５０、およびＤ＝Ｈｉｌｌ係数。記載されるプロトコルに従って、本明細書に例示された化合物は、３０ｎＭ未満のＩＣ５０を示す。実施例３６の化合物は、上記のアッセイにおいて０．１５０（ｎ＝２）の標準誤差で約２．３７ｎＭのＩＣ５０を有する。これらの結果は、本発明の化合物がヘッジホッグアンタゴニストであり、抗癌剤として有用であるという証拠を与える。

Claims

以下の式の化合物：

（式中、
Ｒ^１は、水素、フルオロ、シアノ、トリフルオロメチル、メトキシ、またはトリフルオロメトキシであり、
Ｒ^２は、水素またはメチルであり、
Ｒ^３、Ｒ^４ _、Ｒ^５ _、Ｒ^６およびＲ^７は、独立して水素、クロロ、フルオロ、シアノ、トリフルオロメチルまたはトリフルオロメトキシであり、ただし、Ｒ^３、Ｒ^４ _、Ｒ^５ _、Ｒ^６およびＲ^７のうちの少なくとも２つは水素である）
またはその薬学的に許容される塩。
Ｒ^１が水素である、請求項１に記載の化合物、またはその薬学的に許容される塩。
Ｒ^１がフルオロである、請求項１に記載の化合物、またはその薬学的に許容される塩。
Ｒ^２がメチルである、請求項１〜３のうちのいずれか１項に記載の化合物、またはその薬学的に許容される塩。
Ｒ^２が水素である、請求項１〜３のうちのいずれか１項に記載の化合物、またはその薬学的に許容される塩。
Ｒ^３がクロロ、フルオロ、トリフルオロメチルまたはトリフルオロメトキシである、請求項１〜５のうちのいずれか１項に記載の化合物、またはその薬学的に許容される塩。
Ｒ^５がフルオロ、トリフルオロメトキシまたはトリフルオロメチルである、請求項１〜６のうちのいずれか１項に記載の化合物、またはその薬学的に許容される塩。
４−フルオロ−Ｎ−（１−（４−（４−フルオロフェニル）フタラジン−１−イル）ピペリジン−４−イル）−Ｎ−メチル−２−（トリフルオロメチル）ベンズアミドである、請求項１〜７のうちのいずれか１項に記載の化合物、またはその薬学的に許容される塩。
請求項１〜８のうちのいずれか１項に記載の化合物、またはその薬学的に許容される塩を、薬学的に許容される担体、希釈剤または賦形剤とともに含む、医薬組成物。
癌の処置に使用するための請求項１〜８のうちのいずれか１項に記載の化合物、またはその薬理学的に許容される塩。
前記癌が、髄芽腫、基底細胞癌、食道癌、胃癌、膵臓癌、胆道癌、前立腺癌、乳癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、Ｂ細胞リンパ腫、多発性骨髄腫、卵巣癌、結腸直腸癌、肝臓癌、腎臓癌および黒色腫からなる群より選択される、請求項１０に記載の化合物。