JP5361433B2 - A method for presenting proteins on the surface of microorganism cells - Google Patents
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Description
本発明は、タンパク質を微生物の細胞表層に提示する方法に関する。 The present invention relates to a method for presenting a protein on the cell surface of a microorganism.
細胞表層は細胞の構造や形態を保持し、細胞を外界から隔離する隔壁としてだけではなく、物質の認識、シグナルの変換や伝達、および酵素反応の場として重要な役割を果たしている。近年、酵母や細菌の細胞表層に有用なタンパク質を発現させる、細胞表層提示技術が注目されている。 The cell surface retains the structure and morphology of the cell and plays an important role not only as a partition that isolates the cell from the outside world, but also as a place for substance recognition, signal conversion and transmission, and enzyme reaction. In recent years, cell surface display technology for expressing useful proteins on the cell surface of yeast and bacteria has attracted attention.
例えば、酵母の細胞表層には、細胞表層局在タンパク質のＧＰＩアンカーを利用して、リパーゼ、アミラーゼ類、セルラーゼ類などの種々の酵素が提示されている（例えば、特許文献１参照）。また、酵母においては、糖鎖結合タンパク質ドメインを利用した細胞表層提示技術も開発されている（例えば、特許文献２参照）。 For example, various enzymes such as lipases, amylases, and cellulases are presented on the yeast cell surface using GPI anchors of cell surface localized proteins (see, for example, Patent Document 1). In yeast, a cell surface display technique using a sugar chain binding protein domain has also been developed (see, for example, Patent Document 2).
細菌の細胞表層へのタンパク質の提示については、グラム陽性菌であるバシラス（Bacillus）属細菌の細胞表層に局在するポリ-γ-グルタミン酸生合成酵素の一つであるＰｇｓＡを用いて種々検討され、グラム陽性菌や大腸菌などのグラム陰性菌の細胞表層に種々の外来タンパク質が提示されている。 The presentation of proteins on the bacterial cell surface has been studied in various ways using PgsA, which is one of the poly-γ-glutamate biosynthetic enzymes localized on the cell surface of the Gram-positive bacteria, the genus Bacillus. Various foreign proteins are presented on the cell surface of Gram-negative bacteria such as Gram-positive bacteria and E. coli.
例えば、ＰｇｓＡをアンカーとして用いて、ストレプトコッカス・ボヴァイス（Streptococcus bovis）１４８株由来のα−アミラーゼ（ＡｍｙＡ）を細胞表層に提示するように組換えられた、アミノ酸発酵能を有するコリネバクテリウム（Corynebacterium）属細菌が開示されている（特許文献３）。 For example, using PgsA as an anchor, Corynebacterium having an amino acid-fermenting ability recombined to display α-amylase (AmyA) derived from Streptococcus bovis strain 148 on the cell surface layer. A genus bacterium has been disclosed (Patent Document 3).
一方、ＰｇｓＡをアンカーとして用いて、上記ＡｍｙＡやカンジダ・アンタークティカ（Candida antarctica）ＣＢＳ６６７８株由来のリパーゼＢなどを細胞表層に提示するように組換えられた、大腸菌が開示されている（特許文献４）。 On the other hand, Escherichia coli that has been recombined to display the above-mentioned AmyA, lipase B derived from Candida antarctica CBS6678, etc. on the cell surface using PgsA as an anchor is disclosed (Patent Literature). 4).
しかし、上記のようなＰｇｓＡをアンカーとして用いて、コリネバクテリウム属細菌や大腸菌の細胞表層にタンパク質を提示する方法では、タンパク質の細胞表層への提示に必要とされるＰｇｓＡのアンカー部分が約１５０アミノ酸と比較的長いアミノ酸配列からなり、表層提示可能なタンパク質の大きさが制限されるという問題がある。また、細胞表層に提示されるタンパク質の一部が細胞表層から培地中に遊離するという問題がある。 However, in the method of presenting a protein on the cell surface of Corynebacterium or Escherichia coli using PgsA as an anchor as described above, the anchor portion of PgsA required for presentation of the protein to the cell surface is about 150. There is a problem that the size of a protein that is composed of an amino acid and a relatively long amino acid sequence and can be displayed on the surface is limited. In addition, there is a problem that a part of the protein presented on the cell surface is released from the cell surface into the medium.
このように、微生物の細胞表層に提示されるタンパク質の細胞表層からの遊離がなく、比較的小さいアンカータンパク質による細胞表層提示技術が望まれていた。 As described above, there has been a demand for a cell surface display technique using a relatively small anchor protein without releasing proteins from the cell surface layer of microorganisms from the cell surface layer.
本発明は、タンパク質を効率よく微生物の細胞表層に提示することを目的とする。 An object of the present invention is to efficiently present a protein on the cell surface of a microorganism.
本発明は、ポーリン（Ｐｏｒｉｎ）との融合タンパク質を細胞表層に提示した微生物を提供する。 The present invention provides a microorganism displaying a fusion protein with Porin on the cell surface.
一つの実施態様では、上記微生物は、グラム陰性菌または放線菌である。 In one embodiment, the microorganism is a gram-negative or actinomycete.
ある実施態様では、上記放線菌は、コリネバクテリウム属細菌またはマイコバクテリウム属細菌である。 In one embodiment, the actinomycetes are Corynebacterium or Mycobacterium.
別の実施態様では、上記ポーリンのアミノ酸配列は、前記微生物が本来有するポーリンに由来する。 In another embodiment, the amino acid sequence of the porin is derived from the porin inherent in the microorganism.
さらに別の実施態様では、上記ポーリンは、コリネバクテリウム属細菌由来のＰｏｒＡ、ＰｏｒＢ、ＰｏｒＣおよびＰｏｒＨからなる群から選択される少なくとも１種である。 In still another embodiment, the porin is at least one selected from the group consisting of PorA, PorB, PorC and PorH derived from Corynebacterium.
本発明はまた、タンパク質を微生物の細胞表層に提示する方法であって、（ａ）ポーリン（Ｐｏｒｉｎ）をコードするＤＮＡ、および該タンパク質をコードするＤＮＡをこの順で含む組換えＤＮＡを構築する工程、（ｂ）該組換えＤＮＡで微生物を形質転換する工程、および（ｃ）該形質転換した微生物を培養して、該タンパク質を該微生物の細胞表層に提示する工程、を含む方法を提供する。 The present invention is also a method for presenting a protein on the cell surface of a microorganism, comprising the steps of: (a) DNA encoding porin and recombinant DNA comprising DNA encoding the protein in this order (B) transforming a microorganism with the recombinant DNA, and (c) culturing the transformed microorganism and presenting the protein on the cell surface of the microorganism.
本発明によれば、タンパク質を効率よく微生物の細胞表層に提示することができる。また、本発明によれば、従来では不可能と思われていた、サイズの大きなタンパク質を効率よく細胞表層に提示した微生物が提供される。さらに、本発明によれば、ポーリンとの融合タンパク質を強固に細胞表層に固定した微生物が提供される。このような微生物は、大量に培養することが可能であり、細胞表層に提示されたタンパク質の用途に応じて、工業的に利用され得る。 According to the present invention, proteins can be efficiently presented on the cell surface of microorganisms. In addition, according to the present invention, there is provided a microorganism capable of efficiently presenting a large protein on the cell surface layer, which has been considered impossible in the past. Furthermore, according to the present invention, there is provided a microorganism in which a fusion protein with porin is firmly fixed on the cell surface. Such microorganisms can be cultured in large quantities, and can be industrially used depending on the use of the protein displayed on the cell surface.
本発明の微生物は、ポーリン（Ｐｏｒｉｎ）との融合タンパク質を細胞表層に提示するように形質転換された微生物であり、ポーリンをコードするＤＮＡ、および該タンパク質をコードするＤＮＡをこの順で含む組換えＤＮＡを該微生物中に保有する。すなわち、本発明では、目的のタンパク質を微生物の細胞表層に提示するためのアンカーとしてポーリンを用いる。 The microorganism of the present invention is a microorganism transformed so as to present a fusion protein with porin on the cell surface, and a recombination comprising DNA encoding porin and DNA encoding the protein in this order. DNA is retained in the microorganism. That is, in the present invention, porin is used as an anchor for presenting the target protein on the cell surface of the microorganism.
本発明の微生物において、目的のタンパク質は、Ｎ末端側でポーリンのＣ末端側と連結され、融合タンパク質として発現される。すなわち、目的のタンパク質は、Ｎ末端側でポーリンを介して細胞表層に固定される。 In the microorganism of the present invention, the protein of interest is linked to the C-terminal side of porin at the N-terminal side and expressed as a fusion protein. That is, the target protein is fixed to the cell surface via porin on the N-terminal side.
本発明で用いるポーリン（Ｐｏｒｉｎ）は、グラム陰性菌および放線菌の細胞表層に存在するタンパク質であり、親水性物質を通過させる機能を有する。 Porin used in the present invention is a protein present in the cell surface layer of Gram-negative bacteria and actinomycetes and has a function of allowing a hydrophilic substance to pass therethrough.
放線菌に属するコリネバクテリウム（Corynebacterium）属細菌の細胞壁は、菌体の内側から順にペプチドグリカン、アラビノガラクタンおよび長鎖脂肪酸であるミコール酸からなる三つの層を有している。ポーリンは、三つの層の最も外側に位置するミコール酸の層に局在する。コリネバクテリウム属細菌では、ポーリンは現在４種類（ＰｏｒＡ、ＰｏｒＢ、ＰｏｒＣおよびＰｏｒＨ）が同定されている。コリネバクテリウム属細菌のポーリンは、分子量が４．７〜１３．２ｋＤａと非常に小さいが、ミコール酸の層内で多量体を形成している。 The cell wall of the genus Corynebacterium belonging to Actinomyces has three layers composed of peptidoglycan, arabinogalactan and mycolic acid which is a long chain fatty acid in order from the inside of the cell. Porin is localized in the outermost layer of mycolic acid of the three layers. In the genus Corynebacterium, four types of porins (PorA, PorB, PorC, and PorH) have been identified. Porin of Corynebacterium has a very small molecular weight of 4.7 to 13.2 kDa, but forms a multimer in the mycolic acid layer.
一方、大腸菌などのグラム陰性菌では、ポーリンは１種類のみ知られている。大腸菌のポーリンは、分子量が約３７ｋＤａと比較的大きく、三量体の形態で外膜に局在している。大腸菌のポーリンをコードする遺伝子はｏｍｐＦと呼ばれている。 On the other hand, only one type of porin is known in gram-negative bacteria such as E. coli. E. coli porin has a relatively large molecular weight of about 37 kDa, and is localized in the outer membrane in the form of a trimer. The gene encoding E. coli porin is called ompF.
本発明で用いるポーリンのアミノ酸配列は、いずれの微生物のポーリンに由来してもよいが、目的のタンパク質を細胞表層に提示する微生物が本来有するポーリンに由来することが好ましい。例えば、目的のタンパク質をコリネバクテリウム・グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）の細胞表層に提示する場合には、コリネバクテリウム・グルタミカムのポーリンであるＰｏｒＡ、ＰｏｒＢ、ＰｏｒＣまたはＰｏｒＨをアンカーとして用いることが好ましい。例えば、コリネバクテリウム・グルタミカムのＰｏｒＨは、配列番号２で示されるアミノ酸配列からなる。 The amino acid sequence of porin used in the present invention may be derived from porin of any microorganism, but is preferably derived from porin originally possessed by the microorganism presenting the target protein on the cell surface. For example, when the target protein is presented on the cell surface of Corynebacterium glutamicum, it is preferable to use PorA, PorB, PorC or PorH, which is a porin of Corynebacterium glutamicum, as an anchor. For example, PorH of Corynebacterium glutamicum consists of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2.
本発明において、タンパク質を細胞表層に提示するために用いる微生物としては、特に限定されないが、グラム陰性菌または放線菌が好ましく、コリネバクテリウム属細菌またはマイコバクテリウム（Mycobacterium）属細菌がより好ましい。例えば、コリネバクテリウム・グルタミカム、コリネバクテリウム・アンモニアゲネス（Corynebacterium ammoniagenes）などが挙げられる。 In the present invention, the microorganism used for presenting the protein on the cell surface is not particularly limited, but Gram-negative bacteria or actinomycetes are preferable, and Corynebacterium bacteria or Mycobacterium bacteria are more preferable. Examples thereof include Corynebacterium glutamicum and Corynebacterium ammoniagenes.
本発明において、微生物の細胞表層に提示する目的のタンパク質としては、特に限定されないが、本来当該微生物の細胞表層に局在しないタンパク質であって、当該微生物の細胞表層に固定することを目的として配置されるタンパク質が好ましい。例えば、酵素、分泌性タンパク質、外来タンパク質（抗体、抗原、ワクチン、リガンド、蛍光タンパク質、プロテインＡおよびその誘導体など）などが挙げられる。酵素としては、アミラーゼ類、セルラーゼ類、リパーゼなどが挙げられる。 In the present invention, the target protein to be displayed on the cell surface of the microorganism is not particularly limited, but is originally a protein that is not localized on the cell surface of the microorganism and is arranged for the purpose of fixing to the cell surface of the microorganism. The protein is preferred. Examples thereof include enzymes, secretory proteins, foreign proteins (antibodies, antigens, vaccines, ligands, fluorescent proteins, protein A and derivatives thereof, etc.). Enzymes include amylases, cellulases, lipases and the like.
本発明で用いる目的のタンパク質は、分子量が７７ｋＤａ以上であってもよい。本発明では、タンパク質を微生物の細胞表層に提示するために分子量が比較的小さいポーリンをアンカーとして用いるので、たとえサイズが７７ｋＤａ以上と大きなタンパク質であってもポーリンとの融合タンパク質として容易に微生物の細胞表層へ提示することが可能である。 The target protein used in the present invention may have a molecular weight of 77 kDa or more. In the present invention, porin having a relatively small molecular weight is used as an anchor for presenting the protein on the cell surface of the microorganism. Therefore, even if the protein has a size as large as 77 kDa or more, it can be easily used as a fusion protein with porin. It can be presented to the surface layer.
本発明で用いる分子量７７ｋＤａ以上のタンパク質としては、α−アミラーゼ、グルコアミラーゼ、β−グルコシダーゼ、セロビオヒドロラーゼなどの酵素、抗体などが挙げられる。 Examples of the protein having a molecular weight of 77 kDa or more used in the present invention include enzymes such as α-amylase, glucoamylase, β-glucosidase, cellobiohydrolase, and antibodies.
本発明で用いる目的のタンパク質をコードするＤＮＡは、例えば、生物から単離する方法、適切なプローブまたはプライマーを用いて生物のゲノムＤＮＡから選抜する方法、あるいは既知の配列に基づいて化学合成する方法によって得られる。 The DNA encoding the target protein used in the present invention is, for example, a method of isolating from a living organism, a method of selecting from a genomic DNA of an organism using an appropriate probe or primer, or a method of chemically synthesizing based on a known sequence Obtained by.
本発明において、タンパク質を微生物の細胞表層に提示する方法は、（ａ）ポーリン（Ｐｏｒｉｎ）をコードするＤＮＡ、および該タンパク質をコードするＤＮＡをこの順で含む組換えＤＮＡを構築する工程、（ｂ）該組換えＤＮＡで微生物を形質転換する工程、および（ｃ）該形質転換した微生物を培養して、該タンパク質を該微生物の細胞表層に提示する工程、を含む。 In the present invention, the method of presenting a protein on the cell surface of a microorganism comprises the steps of: (a) constructing a DNA encoding porin and a recombinant DNA containing the DNA encoding the protein in this order; (C) transforming a microorganism with the recombinant DNA; and (c) culturing the transformed microorganism and presenting the protein on the cell surface of the microorganism.
ポーリンをコードするＤＮＡとしては、例えば、コリネバクテリウム・グルタミカムのポーリンの一つであるＰｏｒＨの遺伝子（ｐｏｒＨ）のＤＮＡは、配列番号１で示される塩基配列からなる。本発明で用いるポーリンをコードするＤＮＡは、ポーリンの遺伝子ＤＮＡそのものはもちろん、ポーリンとして機能するタンパク質またはポリペプチドをコードする限り、（Ａ）ポーリンの遺伝子ＤＮＡの塩基配列において１または数個の塩基の置換、欠失または付加を有する塩基配列、（Ｂ）ポーリンの遺伝子ＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡの塩基配列、および（Ｃ）ポーリンの遺伝子ＤＮＡと少なくとも８０％の配列相同性を有する塩基配列、からなる群より選択される１つの塩基配列に由来する。 As DNA encoding porin, for example, the DNA of PorH gene (porH), which is one of the porins of Corynebacterium glutamicum, consists of a base sequence represented by SEQ ID NO: 1. As long as the DNA encoding porin used in the present invention encodes a protein or polypeptide that functions as a porin as well as the porin gene DNA itself, (A) the base sequence of the porin gene DNA has one or several bases. A base sequence having substitutions, deletions or additions, (B) a base sequence of DNA that hybridizes under stringent conditions with the gene DNA of porin, and (C) at least 80% sequence homology with the gene DNA of porin. The base sequence is derived from one base sequence selected from the group consisting of:
本明細書において、ストリンジェントな条件とは、例えば、６×ＳＳＣ（１×ＳＳＣは、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、０．０１５Ｍ クエン酸ナトリウム、ｐＨ７．０）、０．５％ ＳＤＳ、５×Ｄｅｎｈａｒｄ’ｔ（０．１％ウシ血清アルブミン、０．１％ポリビニルピロリドン、０．１％フィコール４００）、および１００μｇ／ｍＬサケ精子ＤＮＡを含む溶液中で５０℃にて一晩保温する条件をいう。 In this specification, stringent conditions refer to, for example, 6 × SSC (1 × SSC is 0.15M NaCl, 0.015M sodium citrate, pH 7.0), 0.5% SDS, 5 × Denhard ' This refers to the condition of overnight incubation at 50 ° C. in a solution containing t (0.1% bovine serum albumin, 0.1% polyvinylpyrrolidone, 0.1% Ficoll 400) and 100 μg / mL salmon sperm DNA.
本明細書において、配列相同性とは、２つのポリヌクレオチド間の残基の配列類似性をいい、比較対象の塩基配列の領域にわたって、最適な状態にアラインメントされた２つの塩基配列を比較することにより決定され得る。配列相同性は、両方の塩基配列の同一の位置に存在する同一の塩基の数を決定し、次いで、この数の、比較対象領域内の塩基総数に対する比として算出され得る。最適なアラインメントおよび配列相同性を得るためのアルゴリズムとしては、当業者が通常用いる種々のアルゴリズム（例えば、BLASTアルゴリズム、FASTAアルゴリズムなど）が挙げられる。 In this specification, sequence homology refers to the sequence similarity of residues between two polynucleotides, and compares two base sequences that are aligned in an optimal state over the region of the base sequence to be compared. Can be determined. Sequence homology can be calculated as the number of identical bases present at the same position in both base sequences and then the ratio of this number to the total number of bases in the region to be compared. Algorithms for obtaining optimal alignment and sequence homology include various algorithms commonly used by those skilled in the art (eg, BLAST algorithm, FASTA algorithm, etc.).
ポーリンをコードするＤＮＡ、および目的のタンパク質をコードするＤＮＡをこの順で含む組換えＤＮＡ、すなわちポーリンと目的のタンパク質との融合タンパク質をコードする組換えＤＮＡは、例えば、上記ｐｏｒＨ遺伝子（配列番号１）を用いて構築することができる。ｐｏｒＨ遺伝子の少なくともアンカー部分（５’末端から第１６番〜１４１番目）を含む遺伝子断片の３’末端に、目的のタンパク質の遺伝子断片を連結した融合遺伝子断片を調製し、これを適切なプラスミドに挿入する。ポーリンと目的のタンパク質とは、直接連結されてもよく、あるいは数アミノ酸〜数十アミノ酸でなるスペーサーを介して連結されてもよい。 A recombinant DNA containing a DNA encoding porin and a DNA encoding the protein of interest in this order, that is, a recombinant DNA encoding a fusion protein of porin and the protein of interest, is, for example, the porH gene (SEQ ID NO: 1). ). Prepare a fusion gene fragment in which the gene fragment of the protein of interest is linked to the 3 ′ end of the gene fragment containing at least the anchor portion of the porH gene (16th to 141st from the 5 ′ end), and use this as an appropriate plasmid. insert. Porin and the protein of interest may be linked directly or via a spacer consisting of several amino acids to several tens of amino acids.
上記組換えＤＮＡを有するプラスミドは、タンパク質を細胞表層に提示するために用いる宿主微生物で複製することができれば、特に制限はない。このようなプラスミドは、発現プラスミドの形態で宿主微生物に導入されてもよく、あるいは全体または一部が宿主微生物の遺伝子に挿入され、または宿主微生物の遺伝子と相同組換えを起こして染色体に取り込まれてもよい。このようにして、上記組換えＤＮＡを有するプラスミドで、タンパク質を細胞表層に提示するために用いる微生物を形質転換する。 The plasmid having the recombinant DNA is not particularly limited as long as it can be replicated by a host microorganism used for displaying the protein on the cell surface. Such a plasmid may be introduced into the host microorganism in the form of an expression plasmid, or may be inserted in whole or in part into a gene of the host microorganism, or incorporated into the chromosome by homologous recombination with the gene of the host microorganism. May be. In this manner, a microorganism used for displaying the protein on the cell surface is transformed with the plasmid having the recombinant DNA.
上記組換えＤＮＡは、プラスミドに含まれる適切なプロモーターの下流に連結されることが好ましい。プロモーターとしては、タンパク質を細胞表層に提示するために用いる微生物で機能するものであれば、特に制限はない。例えば、コリネバクテリウム属細菌では、cspBプロモーター、ＨＣＥ（high-level constitutive expression）プロモーター、カナマイシンプロモーターなどが挙げられる。例えば、大腸菌では、T7プロモーター、lacプロモーター、tacプロモーター、trpプロモーターなどが挙げられる。このようにプロモーターの下流に組換えＤＮＡが挿入されたプラスミドは、組換えＤＮＡを宿主微生物内で発現させるための発現プラスミドとして機能する。 The recombinant DNA is preferably ligated downstream of an appropriate promoter contained in the plasmid. The promoter is not particularly limited as long as it functions in a microorganism used for presenting the protein on the cell surface. For example, in the genus Corynebacterium, cspB promoter, HCE (high-level constitutive expression) promoter, kanamycin promoter and the like can be mentioned. For example, in E. coli, examples include T7 promoter, lac promoter, tac promoter, trp promoter and the like. Thus, the plasmid in which the recombinant DNA is inserted downstream of the promoter functions as an expression plasmid for expressing the recombinant DNA in the host microorganism.
上記組換えＤＮＡを有するプラスミドは、さらに選択マーカーおよび大腸菌で複製できる遺伝子を有することが、プラスミドの調製および形質転換体の検出の観点から好ましい。選択マーカーとしては、アンピシリン耐性遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子、クロラムフェニコール耐性遺伝子などが挙げられる。また、必要に応じて分泌シグナル配列を有することが好ましい。さらに、組換えＤＮＡを効率よく発現させるために、遺伝子発現を調節するオペレーター、ターミネーター、エンハンサーなどのいわゆる調節配列をさらに含むことが好ましい。例えば、大腸菌で複製し、コリネバクテリウム属細菌において用いることのできる選択マーカーを持つプラスミドとしては、pHSG298、pHSG398などが挙げられる。 The plasmid having the recombinant DNA preferably further has a selection marker and a gene capable of replicating in E. coli from the viewpoints of preparation of the plasmid and detection of the transformant. Examples of selection markers include ampicillin resistance gene, kanamycin resistance gene, chloramphenicol resistance gene, and the like. Moreover, it is preferable to have a secretory signal sequence as needed. Furthermore, in order to efficiently express the recombinant DNA, it is preferable to further include so-called regulatory sequences such as an operator, terminator, enhancer and the like that regulate gene expression. For example, pHSG298, pHSG398 etc. are mentioned as a plasmid which has a selection marker which replicates in E. coli and can be used in Corynebacterium bacteria.
このようにして、ポーリンをコードするＤＮＡ、および目的のタンパク質をコードするＤＮＡをこの順で含む組換えＤＮＡ（目的のタンパク質をコードするＤＮＡが、アンカーとして用いるポーリンをコードするＤＮＡの３’末端側に連結した組換えＤＮＡ）を有するプラスミドが得られる。これらの組換えＤＮＡの単離、合成、連結、およびプラスミドへの挿入は、当業者が通常用いる手段により行われる。このようにして調製されたプラスミドは、当業者が通常用いる手段、例えば、エレクトロポレーション、ヒートショック法、プロトプラスト法などの方法により、タンパク質を細胞表層に提示するために用いる微生物（宿主微生物）に導入される。 Thus, recombinant DNA containing DNA encoding porin and DNA encoding the protein of interest in this order (the DNA encoding the protein of interest is the 3 ′ end of the DNA encoding porin used as an anchor) A plasmid having recombinant DNA) linked to. These recombinant DNAs are isolated, synthesized, ligated, and inserted into a plasmid by means commonly used by those skilled in the art. The plasmid prepared in this manner is used as a microorganism (host microorganism) used for displaying proteins on the cell surface by means usually used by those skilled in the art, for example, electroporation, heat shock method, protoplast method and the like. be introduced.
上記組換えＤＮＡを有するプラスミドにより形質転換された微生物は、適切な培地を用いて培養され、選択マーカーを用いて選択される。あるいは、目的のタンパク質の活性を測定することにより選択される。目的のタンパク質が細胞表層に提示されていることは、例えば、目的のタンパク質に対するＩｇＧ抗体と、蛍光標識抗ＩｇＧ抗体とを用いる免疫抗体法によって確認できる。 The microorganism transformed with the plasmid having the recombinant DNA is cultured using an appropriate medium and selected using a selection marker. Alternatively, it is selected by measuring the activity of the protein of interest. That the target protein is presented on the cell surface can be confirmed, for example, by an immunoantibody method using an IgG antibody against the target protein and a fluorescently labeled anti-IgG antibody.
さらに、本発明の方法は、ランダムに変異を導入した種々のタンパク質（酵素、抗体、リガンドなど）を個々の微生物（クローン）の細胞表層に提示させ、コンビナトリアルライブラリー（遺伝子レベルでランダムに変異を導入し、タンパク質の多様性を人為的に拡大した種々の変異体の集合）として使用することもできる。このようなライブラリーから、目的に応じた最適な性質を有するクローンを迅速かつ簡便に選択することも可能である。 Furthermore, the method of the present invention displays various proteins (enzymes, antibodies, ligands, etc.) into which random mutations have been introduced on the cell surface of individual microorganisms (clones), and a combinatorial library (random mutations at the gene level). It can also be used as a collection of various mutants introduced and artificially expanded in protein diversity. From such a library, it is also possible to quickly and easily select a clone having the optimum properties according to the purpose.
以下に実施例を挙げて本発明を説明するが、本発明がこれらの実施例に限定されることはない。 EXAMPLES The present invention will be described below with reference to examples, but the present invention is not limited to these examples.
実施例 コリネバクテリウム・グルタミカムの細胞表層へのα−アミラーゼの提示：ＰｏｒＨを用いた場合
（１）ＰｏｒＨ−ＡｍｙＡ融合タンパク質発現プラスミドの構築
図１（ａ）にＰｏｒＨ−ＡｍｙＡ融合タンパク質発現プラスミドの模式図を示す。コリネバクテリウム・グルタミカムの細胞表層に局在するタンパク質のポーリンの一つであるＰｏｒＨの遺伝子（ｐｏｒＨ）を単離するために、コリネバクテリウム・グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）ＡＴＣＣ１３０３２株のゲノムを鋳型とし、配列番号３のプライマー配列（ＢａｍＨＩ−ｐｏｒＨ−Ｆ）および配列番号４のプライマー配列（ｐｏｒＨ−ＥｃｏＲＶ−Ｒ）を用いて、ＰＣＲを行った。得られた断片を制限酵素ＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＶで消化し、ＢａｍＨＩ−ＥｃｏＲＶ断片を得た。このｐｏｒＨ遺伝子を含むＢａｍＨＩ−ＥｃｏＲＶ断片を、コリネバクテリウム・グルタミカム−大腸菌シャトルプラスミドであるプラスミドｐＣＣ（Appl. Microbiol. Biotechnol. 2007, Dec. 77: 533-541）の制限酵素ＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＶの切断部位に挿入して、Ligation-Convenience Kit（株式会社ニッポンジーン製）によって連結することにより、プラスミドｐＣＣ−ｐｏｒＨを得た。
Examples Presentation of α-amylase on the cell surface of Corynebacterium glutamicum: When PorH is used (1) Construction of PorH-AmyA fusion protein expression plasmid FIG. 1 (a) shows a schematic of the PorH-AmyA fusion protein expression plasmid. The figure is shown. In order to isolate the PorH gene (porH), which is one of the porins of proteins localized in the cell surface of Corynebacterium glutamicum, using the genome of Corynebacterium glutamicum ATCC13032 as a template, PCR was performed using the primer sequence of SEQ ID NO: 3 (BamHI-poH-F) and the primer sequence of SEQ ID NO: 4 (por-EcoRV-R). The obtained fragment was digested with restriction enzymes BamHI and EcoRV to obtain a BamHI-EcoRV fragment. The BamHI-EcoRV fragment containing the porH gene was cleaved with restriction enzymes BamHI and EcoRV of plasmid pCC (Appl. Microbiol. Biotechnol. 2007, Dec. 77: 533-541) which is a Corynebacterium glutamicum-E. Coli shuttle plasmid. And ligated by Ligation-Convenience Kit (manufactured by Nippon Gene Co., Ltd.) to obtain plasmid pCC-porH.
ストレプトコッカス・ボヴァイス（Streptococcus bovis）１４８株由来のα−アミラーゼの一つであるＡｍｙＡの遺伝子（ａｍｙＡ）が挿入されたプラスミドｐＣＣＳ−ａｍｙＡ（Appl. Microbiol. Biotechnol. 2007, Dec. 77: 533-541）を鋳型とし、配列番号５のプライマー配列（ＥｃｏＲＶ−ａｍｙＡ−Ｆ）および配列番号６のプライマー配列（ａｍｙＡ−ＸｈｏＩ−Ｒ）を用いて、ＰＣＲを行った。得られた断片を制限酵素ＥｃｏＲＶおよびＸｈｏＩで消化し、ＥｃｏＲＶ−ＸｈｏＩ断片を得た。このａｍｙＡ遺伝子を含むＥｃｏＲＶ−ＸｈｏＩ断片を、プラスミドｐＣＣ−ｐｏｒＨの制限酵素ＥｃｏＲＶおよびＸｈｏＩの切断部位に挿入して、Ligation-Convenience Kit（株式会社ニッポンジーン製）によって連結することにより、プラスミドｐＣＣ−ｐｏｒＨａｍｙＡを得た。 Plasmid pCCS-amyA (Appl. Microbiol. Biotechnol. 2007, Dec. 77: 533-541) into which the gene (amyA) of AmyA, one of the α-amylases derived from Streptococcus bovis 148 strain, has been inserted. Was used as a template and PCR was performed using the primer sequence of SEQ ID NO: 5 (EcoRV-amyA-F) and the primer sequence of SEQ ID NO: 6 (amyA-XhoI-R). The obtained fragment was digested with restriction enzymes EcoRV and XhoI to obtain an EcoRV-XhoI fragment. The EcoRV-XhoI fragment containing this amyA gene was inserted into the restriction sites EcoRV and XhoI of the plasmid pCC-poR, and ligated with a Ligation-Convenience Kit (Nippon Gene Co., Ltd.), so that the plasmid pCC-poHamyA was ligated. Obtained.
このプラスミド中のｐｏｒＨとａｍｙＡとが連結したＤＮＡの塩基配列は、ABI PRISM（登録商標）３１０ Genetic Analyzer（Applied Biosystems社製）を用いて、正しいことを確認した。 The base sequence of the DNA in which porH and amyA in this plasmid were linked was confirmed to be correct using ABI PRISM (registered trademark) 310 Genetic Analyzer (Applied Biosystems).
（２）ＰｏｒＨ−ＡｍｙＡ融合タンパク質を細胞表層に提示するコリネバクテリウム・グルタミカムの作製
上記（１）で得たプラスミドｐＣＣ−ｐｏｒＨａｍｙＡを用いて、リジン生産株であるコリネバクテリウム・グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）Ｃｍ株（Appl. Microbiol. Biotechnol. 2007, Dec. 77: 533-541）をエレクトロポレーション法により形質転換した。エレクトロポレーション法は、Gene Pulser（Bio-Rad社製）を用いて、プラスミドｐＣＣ−ｐｏｒＨａｍｙＡとコリネバクテリウム・グルタミカムＣｍ株とを含有する溶液で満たした電極間距離０．２ｃｍのキュベットに電気パルス（２．５ｋＶ、２００Ωおよび２５μＦ）を負荷することにより行った。得られたプラスミドｐＣＣ−ｐｏｒＨａｍｙＡを保有するコリネバクテリウム・グルタミカムＣｍ株形質転換体を、以下Ｃｍ−ｐｏｒＨと称する。
(2) Preparation of Corynebacterium glutamicum that presents PorH-AmyA fusion protein on the cell surface layer Using the plasmid pCC-porHamiA obtained in (1) above, a lysine-producing strain, Corynebacterium glutamicum Cm strain (Appl. Microbiol. Biotechnol. 2007, Dec. 77: 533-541) was transformed by electroporation. The electroporation method uses an electric pulse in a cuvette having a distance of 0.2 cm between electrodes filled with a solution containing the plasmid pCC-poHamyA and Corynebacterium glutamicum Cm strain using Gene Pulser (manufactured by Bio-Rad). (2.5 kV, 200Ω and 25 μF) was applied. The resulting Corynebacterium glutamicum Cm strain transformant carrying the obtained plasmid pCC-poHummyA is hereinafter referred to as Cm-porH.
（３）ＰｏｒＨ−ＡｍｙＡ融合タンパク質の細胞表層提示の確認１
上記（２）で得たＣｍ−ｐｏｒＨを、２５ｍｇ／Ｌのカナマイシンを含有するＢＨＩ（Ｂｒａｉｎ Ｈｅａｒｔ Ｉｎｆｕｓｉｏｎ）液体培地（Difco Laboratories社製）中で３０℃にて４８時間培養した。培養培地を遠心分離（４℃、３５００ｇ×５分間）して菌体を分離し、菌体を遠心分離によりＰＢＳ（ｐＨ７．２）で洗浄した。菌体から抽出した細胞壁画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥ（８ｗ／ｖ％ゲル）に供して（Appl. Microbiol. Biotechnol. 2007, Apr. 74: 1213-1220参照）、ウェスタンブロッティング法により解析した。ウェスタンブロッティング法は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ後のゲルをポリビニリデンジフルオライド膜（Millipore社製）にエレクトロブロットし、この膜に、一次抗体としてウサギ抗ＡｍｙＡ抗体（ＩｇＧ）、次いで二次抗体としてアルカリフォスファターゼで標識されたヤギ抗ウサギＩｇＧ抗体を反応させることにより行った。次いで、アルカリフォスフェートバッファー（１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ[ｐＨ９．０]，１５０ｍＭ ＮａＣｌ，１ｍＭ ＭｇＣｌ２）３０ｍＬにニトロブルーテトラゾリウム（Promega社製）１８０μＬ、次いで５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルフォスフェート（Promega社製）５０μＬを添加して染色液を調製した。ウェスタンブロッティング後の膜を染色液に浸して染色した。結果を図２に示す。
(3) Confirmation of cell surface display of PorH-
Cm-porH obtained in (2) above was cultured at 30 ° C. for 48 hours in a BHI (Brain Heart Infusion) liquid medium (Difco Laboratories) containing 25 mg / L kanamycin. The culture medium was centrifuged (4 ° C., 3500 g × 5 minutes) to separate the cells, and the cells were washed with PBS (pH 7.2) by centrifugation. The cell wall fraction extracted from the cells was subjected to SDS-PAGE (8 w / v% gel) (see Appl. Microbiol. Biotechnol. 2007, Apr. 74: 1213-1220) and analyzed by Western blotting. In Western blotting, the gel after SDS-PAGE was electroblotted onto a polyvinylidene difluoride membrane (Millipore), and then rabbit anti-AmyA antibody (IgG) as a primary antibody and then alkaline phosphatase as a secondary antibody. This was carried out by reacting with a goat anti-rabbit IgG antibody labeled with. Next, 30 mL of alkaline phosphate buffer (100 mM Tris-HCl [pH 9.0], 150 mM NaCl, 1 mM MgCl 2 ), 180 μL of nitro blue tetrazolium (Promega), and then 5-bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate A staining solution was prepared by adding 50 μL of Fate (Promega). The membrane after Western blotting was immersed in a staining solution for staining. The results are shown in FIG.
ＰｏｒＨおよびＡｍｙＡの分子量は、それぞれ約６ｋＤａおよび約７８ｋＤａであるため、ＰｏｒＨ−ＡｍｙＡ融合タンパク質は約８４ｋＤａの分子量であると予想される。図２より、予想されるＰｏｒＨ−ＡｍｙＡ融合タンパク質の分子量の位置に抗ＡｍｙＡ抗体で認識されるバンドが確認され（レーン３）、ＡｍｙＡ（レーン５）と比較した分子量の相違がＰｏｒＨの分子量の約６ｋＤａであるため、ＰｏｒＨ−ＡｍｙＡ融合タンパク質は、コリネバクテリウム・グルタミカムの細胞表層に局在していることがわかった。 Since the molecular weights of PorH and AmyA are about 6 kDa and about 78 kDa, respectively, the PorH-AmyA fusion protein is expected to have a molecular weight of about 84 kDa. FIG. 2 confirms the band recognized by the anti-AmyA antibody at the position of the expected PorH-AmyA fusion protein (lane 3), and the difference in molecular weight compared to AmyA (lane 5) is about the molecular weight of PorH. Since it was 6 kDa, it was found that the PorH-AmyA fusion protein was localized in the cell surface of Corynebacterium glutamicum.
（４）ＰｏｒＨ−ＡｍｙＡ融合タンパク質のα−アミラーゼ活性の確認１
上記（２）で得たＣｍ−ｐｏｒＨを、２５ｍｇ／Ｌのカナマイシンを含有するＢＨＩ液体培地中で３０℃にて培養し、培養開始後２４、４８および７２時間にサンプリングした。サンプリングでは、１ｍＬの培養培地を遠心分離して培養上清と菌体とに分離し、菌体は遠心分離によりＰＢＳ（ｐＨ７．２）で洗浄して、１ｍＬのＰＢＳに再懸濁した。このようにして調製した菌体および培養上清のα−アミラーゼ活性を、α−アミラーゼ測定キット（キッコーマン株式会社製）を用いて測定した（Appl. Microbiol. Biotechnol. 2007, Apr. 74: 1213-1220参照）。結果を図３に示す。
(4) Confirmation of α-amylase activity of PorH-
Cm-porH obtained in (2) above was cultured at 30 ° C. in a BHI liquid medium containing 25 mg / L kanamycin, and sampled at 24, 48 and 72 hours after the start of the culture. For sampling, 1 mL of culture medium was centrifuged to separate the culture supernatant and cells, and the cells were washed with PBS (pH 7.2) by centrifugation and resuspended in 1 mL of PBS. The α-amylase activity of the bacterial cells and culture supernatant thus prepared was measured using an α-amylase measurement kit (manufactured by Kikkoman Corporation) (Appl. Microbiol. Biotechnol. 2007, Apr. 74: 1213- 1220). The results are shown in FIG.
図３より、７２時間培養したＣｍ−ｐｏｒＨの菌体のα−アミラーゼ活性は約５０００Ｕ／Ｌであった。一方、Ｃｍ−ｐｏｒＨの培養上清からは、いずれの培養時間においてもα−アミラーゼ活性は検出されなかった。 From FIG. 3, the α-amylase activity of Cm-por cells cultured for 72 hours was about 5000 U / L. On the other hand, no α-amylase activity was detected in any culture time from the culture supernatant of Cm-porH.
（５）ＰｏｒＨ−ＡｍｙＡ融合タンパク質の細胞表層提示の確認２
上記（４）と同様に回収・分離・洗浄した菌体にＰＢＳ（ｐＨ７．２）を添加して、菌体濃度がＯＤ６００＝２となるように調整した。このように調製した菌体懸濁液１ｍＬにトリプリンを添加し、トリプシンの最終濃度を２０ｍｇ／Ｌに調整した。この菌体とトリプリンとを含む液を、３７℃にて３時間インキュベートした。このようにトリプシン処理した菌体のα−アミラーゼ活性を上記（４）と同様に測定した。
(5) Confirmation of cell surface display of PorH-
PBS (pH 7.2) was added to the cells collected, separated and washed in the same manner as in (4) above, and the cell concentration was adjusted to be OD 600 = 2. Triprin was added to 1 mL of the cell suspension thus prepared to adjust the final concentration of trypsin to 20 mg / L. The liquid containing the cells and triprin was incubated at 37 ° C. for 3 hours. The α-amylase activity of the trypsin-treated cells was measured in the same manner as in (4) above.
トリプリン処理の結果、α−アミラーゼ活性は、未処理の場合の約６４％まで低下していることがわかった。この結果、ＰｏｒＨ−ＡｍｙＡ融合タンパク質の大部分がコリネバクテリウム・グルタミカムの細胞表層に提示されていることが推定された。 As a result of the triprin treatment, it was found that the α-amylase activity was reduced to about 64% of the untreated case. As a result, it was estimated that most of the PorH-AmyA fusion protein was presented on the cell surface of Corynebacterium glutamicum.
（６）ＰｏｒＨ−ＡｍｙＡ融合タンパク質のα−アミラーゼ活性の確認２
上記（２）で得たＣｍ−ｐｏｒＨを、２５ｍｇ／Ｌのカナマイシンを含有するＢＨＩ液体培地中で３０℃にて２４時間培養した。培養培地を遠心分離して菌体を分離し、菌体を遠心分離により２０ｍＭ 酢酸ナトリウムバッファー（ｐＨ５．６）で洗浄して、−８０℃で凍結させた後、真空乾燥機を用いて凍結乾燥した。得られた凍結乾燥菌体１０ｍｇを２０ｍＭ 酢酸ナトリウムバッファー（ｐＨ５．６）４ｍＬに再懸濁し、１．２％の粗トウモロコシデンプンを含有する等量の２０ｍＭ 酢酸ナトリウムバッファー（ｐＨ５．６）と混合した。この混合液を１５０ｒｐｍで振盪しながら４５℃にて３時間インキュベートした。粗トウモロコシデンプンから遊離された還元糖の量をＳｏｍｏｇｙｉ−Ｎｅｌｓｏｎ法（Methods Enzymol. 1988, 160: 87-112）により測定して、グルコース当量にて評価した。結果を図４に示す。
(6) Confirmation of α-amylase activity of PorH-
Cm-porH obtained in (2) above was cultured at 30 ° C. for 24 hours in a BHI liquid medium containing 25 mg / L kanamycin. The culture medium is centrifuged to separate the cells, and the cells are washed with 20 mM sodium acetate buffer (pH 5.6) by centrifugation, frozen at −80 ° C., and then lyophilized using a vacuum dryer. did. 10 mg of the resulting lyophilized cells were resuspended in 4 mL of 20 mM sodium acetate buffer (pH 5.6) and mixed with an equal volume of 20 mM sodium acetate buffer (pH 5.6) containing 1.2% crude corn starch. . This mixture was incubated at 45 ° C. for 3 hours with shaking at 150 rpm. The amount of reducing sugar released from the crude corn starch was measured by the Somogyi-Nelson method (Methods Enzymol. 1988, 160: 87-112) and evaluated by glucose equivalent. The results are shown in FIG.
図４より、Ｃｍ−ｐｏｒＨの菌体のα−アミラーゼ活性は約２２μｍｏｌグルコース／ｇ−dry cell／ｈであった。 As shown in FIG. 4, the α-amylase activity of the Cm-porH cells was about 22 μmol glucose / g-dry cell / h.
比較例 コリネバクテリウム・グルタミカムの細胞表層へのα−アミラーゼの提示：ＰｇｓＡを用いた場合
（１）ＰｇｓＡ−ＡｍｙＡ融合タンパク質発現プラスミドの構築
図１（ｂ）にＰｇｓＡ−ＡｍｙＡ融合タンパク質発現プラスミドの模式図を示す。バシラス（Bacillus）属細菌の細胞表層に局在するポリ−γ−グルタミン酸生合成酵素の一つであるＰｇｓＡの遺伝子（ｐｇｓＡ）が挿入されたプラスミドｐＨＬＡ（Appl. Microbiol. Biotechnol. 2005, Aug. 20: 1-9）を鋳型とし、配列番号７のプライマー配列（ＢａｍＨＩ−ｐｇｓＡ−Ｆ）および配列番号８のプライマー配列（ｐｇｓＡ−ＳａｃＩ−Ｒ）を用いて、ＰＣＲを行った。得られた断片を制限酵素ＢａｍＨＩおよびＳａｃＩで消化し、ＢａｍＨＩ−ＳａｃＩ断片を得た。このｐｇｓＡ遺伝子を含むＢａｍＨＩ−ＳａｃＩ断片を、上記実施例で用いたプラスミドｐＣＣの制限酵素ＢａｍＨＩおよびＳａｃＩの切断部位に挿入して、Ligation-Convenience Kit（株式会社ニッポンジーン製）によって連結することにより、プラスミドｐＣＣ−ｐｇｓＡを得た。
Comparative Example Presentation of α-amylase to the cell surface of Corynebacterium glutamicum: When PgsA was used (1) Construction of PgsA-AmyA fusion protein expression plasmid FIG. 1 (b) shows a schematic diagram of a PgsA-AmyA fusion protein expression plasmid. The figure is shown. Plasmid pHLA (Appl. Microbiol. Biotechnol. 2005, Aug. 20) into which a gene for PgsA (pgsA), which is one of poly-γ-glutamate biosynthetic enzymes localized on the cell surface of Bacillus bacteria, is inserted. 1-9) was used as a template, and PCR was performed using the primer sequence of SEQ ID NO: 7 (BamHI-pgsA-F) and the primer sequence of SEQ ID NO: 8 (pgsA-SacI-R). The obtained fragment was digested with restriction enzymes BamHI and SacI to obtain a BamHI-SacI fragment. By inserting this BamHI-SacI fragment containing the pgsA gene into the cleavage sites of the restriction enzymes BamHI and SacI of the plasmid pCC used in the above Example, and ligating them with a Ligation-Convenience Kit (Nippon Gene Co., Ltd.) pCC-pgsA was obtained.
上記実施例で用いたプラスミドｐＣＣＳ−ａｍｙＡを鋳型とし、配列番号９のプライマー配列（ＳａｃＩ−ａｍｙＡ−Ｆ）および配列番号６のプライマー配列（ａｍｙＡ−ＸｈｏＩ−Ｒ）を用いて、ＰＣＲを行った。得られた断片を制限酵素ＳａｃＩおよびＸｈｏＩで消化し、ＳａｃＩ−ＸｈｏＩ断片を得た。このａｍｙＡ遺伝子を含むＳａｃＩ−ＸｈｏＩ断片を、プラスミドｐＣＣ−ｐｇｓＡの制限酵素ＳａｃＩおよびＸｈｏＩの切断部位に挿入して、Ligation-Convenience Kit（株式会社ニッポンジーン製）によって連結することにより、プラスミドｐＣＣ−ｐｇｓＡａｍｙＡを得た。 PCR was carried out using the plasmid pCCS-amyA used in the above Examples as a template and the primer sequence of SEQ ID NO: 9 (SacI-amyA-F) and the primer sequence of SEQ ID NO: 6 (amyA-XhoI-R). The obtained fragment was digested with restriction enzymes SacI and XhoI to obtain a SacI-XhoI fragment. The SacI-XhoI fragment containing this amyA gene was inserted into the restriction enzyme SacI and XhoI cleavage sites of the plasmid pCC-pgsA, and ligated with a Ligation-Convenience Kit (manufactured by Nippon Gene Co., Ltd.), so that the plasmid pCC-pgsAamyA was Obtained.
このプラスミド中のｐｇｓＡとａｍｙＡとが連結したＤＮＡの塩基配列は、ABI PRISM（登録商標）３１０ Genetic Analyzer（Applied Biosystems社製）を用いて、正しいことを確認した。 It was confirmed that the base sequence of the DNA in which pgsA and amyA were linked in this plasmid was correct using ABI PRISM (registered trademark) 310 Genetic Analyzer (Applied Biosystems).
（２）ＰｇｓＡ−ＡｍｙＡ融合タンパク質を細胞表層に提示するコリネバクテリウム・グルタミカムの作製
プラスミドｐＣＣ−ｐｏｒＨａｍｙＡの代わりに、上記比較例（１）で得たプラスミドｐＣＣ−ｐｇｓＡａｍｙＡを用いたこと以外は、実施例と同様にして、コリネバクテリウム・グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）Ｃｍ株を形質転換した。得られたプラスミドｐＣＣ−ｐｇｓＡａｍｙＡを保有するコリネバクテリウム・グルタミカムＣｍ株形質転換体を、以下Ｃｍ−ｐｇｓＡと称する。
(2) Production of Corynebacterium glutamicum presenting PgsA-AmyA fusion protein on the cell surface, except that the plasmid pCC-pgsAmyA obtained in the above Comparative Example (1) was used instead of the plasmid pCC-poHamyA Corynebacterium glutamicum Cm strain was transformed in the same manner as in the examples. The resulting Corynebacterium glutamicum Cm strain transformant carrying the obtained plasmid pCC-pgsAamyA is hereinafter referred to as Cm-pgsA.
（３）ＰｇｓＡ−ＡｍｙＡ融合タンパク質の細胞表層提示の確認１
Ｃｍ−ｐｏｒＨの代わりに、Ｃｍ−ｐｇｓＡを用いたこと以外は、実施例と同様にして、細胞壁画分を抽出し、解析した。結果を図２に示す。
(3) Confirmation of cell surface display of PgsA-
A cell wall fraction was extracted and analyzed in the same manner as in Example except that Cm-pgsA was used instead of Cm-poR. The results are shown in FIG.
ＰｇｓＡおよびＡｍｙＡの分子量は、それぞれ約４３ｋＤａおよび約７８ｋＤａであるため、ＰｇｓＡ−ＡｍｙＡ融合タンパク質は約１２１ｋＤａの分子量であると予想される。図２より、予想されるＰｇｓＡ−ＡｍｙＡ融合タンパク質の分子量の位置に抗ＡｍｙＡ抗体で認識されるバンドが確認されるため（レーン４）、ＰｇｓＡ−ＡｍｙＡ融合タンパク質は、コリネバクテリウム・グルタミカムの細胞表層に局在していることがわかった。 Since the molecular weights of PgsA and AmyA are about 43 kDa and about 78 kDa, respectively, the PgsA-AmyA fusion protein is expected to have a molecular weight of about 121 kDa. FIG. 2 confirms the band recognized by the anti-AmyA antibody at the position of the expected molecular weight of the PgsA-AmyA fusion protein (lane 4), so that the PgsA-AmyA fusion protein is the cell surface layer of Corynebacterium glutamicum. It was found to be localized at.
しかし、予想されるＰｇｓＡ−ＡｍｙＡ融合タンパク質の分子量よりも小さい位置にも抗ＡｍｙＡ抗体で認識されるバンドが複数確認されるため（図２、レーン４）、ＰｇｓＡ−ＡｍｙＡ融合タンパク質は、分解を受けているものと推定された。 However, since multiple bands recognized by the anti-AmyA antibody are confirmed at positions smaller than the expected molecular weight of the PgsA-AmyA fusion protein (FIG. 2, lane 4), the PgsA-AmyA fusion protein is subject to degradation. It was estimated that
（４）ＰｇｓＡ−ＡｍｙＡ融合タンパク質のα−アミラーゼ活性の確認１
Ｃｍ−ｐｏｒＨの代わりに、Ｃｍ−ｐｇｓＡを用いたこと以外は、実施例と同様にして、α−アミラーゼ活性を測定した。結果を図３に示す。
(4) Confirmation of α-amylase activity of PgsA-
Α-amylase activity was measured in the same manner as in Example except that Cm-pgsA was used instead of Cm-porH. The results are shown in FIG.
図３より、７２時間培養したＣｍ−ｐｇｓＡの菌体のα−アミラーゼ活性は約１６００Ｕ／Ｌであった。この活性は、７２時間培養したＣｍ−ｐｏｒＨの菌体のα−アミラーゼ活性（約５０００Ｕ／Ｌ）と比較して、約１／３であった。一方、Ｃｍ−ｐｇｓＡの培養上清からも、比較的高いα−アミラーゼ活性が検出された。したがって、Ｃｍ−ｐｇｓＡの菌体のα−アミラーゼ活性が、Ｃｍ−ｐｏｒＨの菌体のα−アミラーゼ活性と比較して低いのは、主として、ＰｇｓＡ−ＡｍｙＡ融合タンパク質が細胞表層から培地中に遊離したためと考えられる。また、ＰｇｓＡがＡｍｙＡのα−アミラーゼ活性に何らかの悪影響を与えている可能性も考えられる。 From FIG. 3, the α-amylase activity of the Cm-pgsA cells cultured for 72 hours was about 1600 U / L. This activity was about 1/3 compared to the α-amylase activity (about 5000 U / L) of Cm-por cells cultured for 72 hours. On the other hand, relatively high α-amylase activity was also detected from the culture supernatant of Cm-pgsA. Therefore, the α-amylase activity of the Cm-pgsA cells is lower than the α-amylase activity of the Cm-porH cells mainly because the PgsA-AmyA fusion protein was released from the cell surface into the medium. it is conceivable that. It is also possible that PgsA may have some adverse effect on the AmyA α-amylase activity.
（５）ＰｇｓＡ−ＡｍｙＡ融合タンパク質の細胞表層提示の確認２
Ｃｍ−ｐｏｒＨの代わりに、Ｃｍ−ｐｇｓＡを用いたこと以外は、実施例と同様にして、トリプシン処理を行ない、α−アミラーゼ活性を測定した。
(5) Confirmation of cell surface presentation of PgsA-
Trypsin treatment was performed and α-amylase activity was measured in the same manner as in Example except that Cm-pgsA was used instead of Cm-porH.
トリプリン処理の結果、α−アミラーゼ活性は、未処理の場合の約６８％まで低下していることがわかった。この結果、ＰｇｓＡ−ＡｍｙＡ融合タンパク質の大部分がコリネバクテリウム・グルタミカムの細胞表層に提示されていることが推定された。 As a result of the triprin treatment, it was found that the α-amylase activity was reduced to about 68% of the untreated case. As a result, it was estimated that most of the PgsA-AmyA fusion protein was presented on the cell surface of Corynebacterium glutamicum.
（６）ＰｇｓＡ−ＡｍｙＡ融合タンパク質のα−アミラーゼ活性の確認２
Ｃｍ−ｐｏｒＨの代わりに、Ｃｍ−ｐｇｓＡを用いたこと以外は、実施例と同様にして、α−アミラーゼ活性を測定した。結果を図４に示す。
(6) Confirmation of α-amylase activity of PgsA-
Α-amylase activity was measured in the same manner as in Example except that Cm-pgsA was used instead of Cm-porH. The results are shown in FIG.
図４より、Ｃｍ−ｐｇｓＡの菌体のα−アミラーゼ活性は約３μｍｏｌグルコース／ｇ−dry cell／ｈであった。この活性は、Ｃｍ−ｐｏｒＨの菌体のα−アミラーゼ活性（約２２μｍｏｌグルコース／ｇ−dry cell／ｈ）と比較して、約１／７であった。このように、Ｃｍ−ｐｇｓＡの菌体のα−アミラーゼ活性が、Ｃｍ−ｐｏｒＨの菌体のα−アミラーゼ活性と比較して低いのは、図３の結果を参照すると、主として、ＰｇｓＡ−ＡｍｙＡ融合タンパク質が細胞表層から培地中に遊離したためと考えられる。また、ＰｇｓＡがＡｍｙＡのα−アミラーゼ活性に何らかの悪影響を与えている可能性も考えられる。 From FIG. 4, the α-amylase activity of the Cm-pgsA cells was about 3 μmol glucose / g-dry cell / h. This activity was about 1/7 compared to the α-amylase activity (about 22 μmol glucose / g-dry cell / h) of the Cm-porH cells. Thus, the α-amylase activity of the cells of Cm-pgsA is lower than the α-amylase activity of the cells of Cm-porH. Referring to the results of FIG. 3, the PgsA-AmyA fusion is mainly used. This is probably because the protein was released from the cell surface layer into the medium. It is also possible that PgsA may have some adverse effect on the AmyA α-amylase activity.
本発明によれば、タンパク質を効率よく微生物の細胞表層に提示することができる。また、本発明によれば、従来では不可能と思われていた、サイズの大きなタンパク質を効率よく細胞表層に提示した微生物が提供される。さらに、本発明によれば、ポーリンとの融合タンパク質を強固に細胞表層に固定した微生物が提供される。このような微生物は、大量に培養することが可能であり、細胞表層に提示されたタンパク質の用途に応じて、工業的に利用され得る。 According to the present invention, proteins can be efficiently presented on the cell surface of microorganisms. In addition, according to the present invention, there is provided a microorganism capable of efficiently presenting a large protein on the cell surface layer, which has been considered impossible in the past. Furthermore, according to the present invention, there is provided a microorganism in which a fusion protein with porin is firmly fixed on the cell surface. Such microorganisms can be cultured in large quantities, and can be industrially used depending on the use of the protein displayed on the cell surface.
Claims (2)
（ａ）ポーリン（Ｐｏｒｉｎ）をコードするＤＮＡ、および該タンパク質をコードするＤＮＡをこの順で含む組換えＤＮＡを構築する工程、
（ｂ）該組換えＤＮＡで微生物を形質転換する工程、および
（ｃ）該形質転換した微生物を培養して、該タンパク質を該微生物の細胞表層に提示する工程、
を含み、
該ポーリンが、コリネバクテリウム属細菌由来のＰｏｒＡ、ＰｏｒＢ、ＰｏｒＣおよびＰｏｒＨからなる群から選択される少なくとも１種であり、そして
該微生物がコリネバクテリウム属細菌である、方法。 A method of presenting a protein on a cell surface of a microorganism,
(A) constructing a DNA encoding porin and a recombinant DNA comprising DNA encoding the protein in this order;
(B) transforming a microorganism with the recombinant DNA; and (c) culturing the transformed microorganism and presenting the protein on the cell surface of the microorganism;
Only including,
The porin is at least one selected from the group consisting of PorA, PorB, PorC and PorH from Corynebacterium, and
A method wherein the microorganism is a genus Corynebacterium .
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