JP5239978B2 - センサおよびシーケンサー - Google Patents

Description

本発明は核酸やタンパク質などを測定するセンサおよび核酸配列を解析するシーケンサーに関するものである。

従来のセンサとして、例えば図８に示すようなＤＮＡセンサがある。このＤＮＡセンサは、基板１と、この基板１上に固定された機能性分子２としてのＤＮＡプローブからなる。この機能性分子２は、リガンド分子である相補的ＤＮＡ３と二本鎖を形成するものであり、この機能性分子２に各種ＤＮＡ３を含んでいる可能性のある、血液、唾液、河川水、農産加工物等の被験体材料を暴露した後、二本鎖形成の有無を検知することで、これらの被験体材料中に検知対象のＤＮＡ３が存在しているかどうかを検出出来る。

分析方法としては、例えば予め暴露する各種ＤＮＡ３に蛍光物質４を標識しておき、それぞれを前述の機能性分子２と反応させた後、この反応領域の蛍光を測定することによって、機能性分子２と相補的ＤＮＡ３との二本鎖形成領域を検出する方法がある。

このようなＤＮＡセンサに類似する例は、下記の特許文献１、２に開示されている。

また従来のシーケンサーは、基板上に測定したい核酸を固定し、増幅させて、核酸配列を読み取るものである。このようなシーケンサーに関連する例は、下記の特許文献３に開示されている。
特表平４−５０５７６３号公報 特開２００７−２８５９２７号公報 特表２００２−５２５１２５号公報

従来のセンサやシーケンサーでは、測定感度が低くなることがあった。

その理由は、基板１の表面積が小さいからである。

すなわち従来は、基板１の表面積を増やすため、基板１として例えば多孔質アルミナを用いていたが、それでもその表面積の拡大には不十分であった。したがって基板１の所定領域に十分な量の機能性分子２（ＤＮＡプローブ）や核酸を固定することができず、機能性分子２とリガンド分子（ＤＮＡ３）との結合により発する信号や、拡散配列を読み取る際の検出信号が小さかった。そしてその結果、測定感度が低下するのであった。

そこで、本発明の目的は、測定感度を向上させたセンサおよびシーケンサーを提供することである。

そしてこの目的を達成するため本発明は、基材と、この基材上に枝分かれするように積み重なり、一体的に結合した複数の粒子からなる蒸着層と、それぞれの粒子の表面に接合した複数の機能性分子とを備え、それぞれの粒子の表面は、酸化アルミニウムを主成分とするセンサ、あるいは基材と、この基材上に枝分かれするように積み重なり、一体的に結合した複数の粒子からなる蒸着層とを備え、それぞれの粒子の表面は、酸化アルミニウムを主成分とし、これらの粒子の表面に核酸を固定して増幅させ、その核酸配列を測定するシーケンサーとした。

これにより本発明は、センサまたはシーケンサーの測定感度を向上させることができる。

その理由は、蒸着層の表面積が大きいからである。

したがって狭いスペースにも機能性分子や核酸を高密度に固定することができ、各機能性分子とリガンド分子との反応信号や核酸配列を読み取る際の検出信号を増大させることができる。そしてその結果、センサあるいはシーケンサーの測定感度を向上させることができる。

（実施の形態１）
実施の形態１では、本発明の一実施の形態としてＤＮＡセンサを例に挙げ説明する。

本発明のＤＮＡセンサは、図１に示すように、基材５と、この基材５の表面に形成された蒸着層６と、この蒸着層６の表面に接合された複数のＤＮＡプローブ（図２の符号７）とを備えている。このＤＮＡプローブ７は、測定したいＤＮＡと相補的塩基配列を有し、このＤＮＡとハイブリタイゼーションを起こす機能性分子である。

蒸着層６は、図１に示すように、基材５から表層に向かって立ち上がるツリー状の柱が多数密集し、霜柱状になっている。そして夫々のツリー状の柱は、複数の粒子８が一体に結合して、海ぶどう状に枝分かれしながら積み重なった形状である。なお、図３は蒸着層６をＳＥＭ（走査電子顕微鏡）で３万倍に拡大して撮影した写真である。

粒子８は核となる部分がアルミニウムで構成され、その上に陽極酸化膜（酸化アルミニウムの膜）が形成されている。微小な粒子８には、全体が酸化アルミニウムで構成されているものもある。

そして図１に示すように、この蒸着層６は、基材５の表面と接する第一の蒸着層６ａと、この第一の蒸着層６ａ上に積層された第二の蒸着層６ｂとで構成されている。また第一の蒸着層６ａの粒子径は、第二の蒸着層６ｂの粒子径よりも大きくなるように形成されている。第一の蒸着層６ａは、厚みが数μｍであり、第二の蒸着層６ｂの厚み（数十μｍ）よりも薄くした。

なお、本実施の形態においては、基材５として厚みが０．５ｍｍ〜１ｍｍのガラス基板を用いた。ガラス以外にも、シリコン基板やアルミ基板などを用いてもよいが、ガラス基板は光を透過するため、ＤＮＡプローブ７と測定物質との結合を、基材５を透過した光によって測定することができ、分析が容易である。また基材５の形状は、平板状でなくても、球状や多角形状でもよい。

以下に、本実施の形態における蒸着層６の蒸着方法を説明する。図４、図５は本実施の形態の製造方法によって形成された蒸着層６であって、後述する陽極化成前の状態のＳＥＭ写真である。図４は５千倍に拡大したものであり、図５は更に３万倍に拡大して撮影したものである。
１）基材５を蒸着槽内に配置して０．０１〜０．００１Ｐａの真空に保つ。
２）基材５周辺に酸素ガスに対してアルゴンガスの流量比を４〜６にした不活性ガスを流入して基材５の周辺の圧力を１０〜２０Ｐａの状態にする。
３）基材５の温度を２００〜３００℃の範囲に保つ。
４）蒸着源にアルミニウムを配設した状態で真空蒸着により第一の蒸着層６ａ（陽極化成前）を形成していく。
５）基材５周辺に酸素ガスに対してアルゴンガスの流量比を２〜４にした不活性ガスを流入して基材５の周辺の圧力を２０〜３０Ｐａの状態にする。
６）基材５の温度を１５０〜２００℃の範囲に保つ。
７）蒸着源にアルミニウムを配設した状態で真空蒸着により第二の蒸着層６ｂ（陽極化成前）を形成していく。

なお、本実施の形態では、１）の工程で、真空雰囲気は０．００４Ｐａに調整した。また、第一の蒸着層６ａとなる層の形成時において、酸素ガスに対してアルゴンガスの流量比を４とし、基材５周辺の圧力が２０Ｐａになるように不活性ガスの流量を調整した。更に、基材５の温度を３００℃に設定した。また、第二の蒸着層６ｂとなる層の形成時において、酸素ガスに対してアルゴンガスの流量比を４とし、基材５周辺の圧力が２０Ｐａになるように不活性ガスの流量を調整した。更に、基材５の温度を２００℃に設定した。

この結果、第一の蒸着層６ａは、この層を構成する粒子８の平均粒子径が０．２μｍとなり、第二の蒸着層６ｂより大きな粒子８で構成されている。また図４からも明らかなように、第一の蒸着層６ａは、粒子８が持つエネルギーが大きく、表面の活性度が高いため、粒子８が大きく成長し、基材５と複数のツリー構造体の根元部分の接触面積が大きくなる。そしてその結果、蒸着層６の機械的強度が増し、センサの信頼性を高めることができる。

なお、第一の蒸着層６ａの平均粒子径は０．１μｍ以上であれば、上記のとおりツリー構造体の根元部分と基材５との接触面積を十分大きくすることができる。また、第一の蒸着層６ａを形成する前に、例えばＯ₂アッシング処理で基材５の表面を清浄化することで、基材５と第一の蒸着層６ａとの密着性が増す。また基材５は、この蒸着工程時での変形を抑制するため、耐熱温度が５００度〜６００度程度のガラス基板を用いることが好ましい。

なお、第一の蒸着層６ａを厚くしても、粒子８の小さい第二の蒸着層６ｂを厚くする場合と比較して表面積の増大に寄与しにくいことから、第一の蒸着層６ａは極力薄い方がよい。

さらに本実施の形態では、平均粒子径の小さい粒子８からなる第二の蒸着層６ｂを形成したことにより、空孔径の最頻値が約０．０３μｍと極めて微細なものとなる。これは、比較用に示したエッチングによるアルミニウム箔の空孔径の最頻値である約０．１５μｍと比較して極めて微細化されたものであり、これにより、表面積を大きく拡大することができる。またこの蒸着層６は、微小な粒子８がランダムに枝分かれして積み重なり、ある程度の厚みを持った層であるから、直線的な穴が規則的に形成された多孔質アルミナと比較して、表面積が大きくなり、センサの感度を向上させることができる。

なお、第二の蒸着層６ｂの厚みは表面積増大に大きく寄与するため、第一の蒸着層６ａより厚く形成することが好ましい。また、第一の蒸着層６ａと第二の蒸着層６ｂとは、同種の金属を用い、同一真空内で形成したため、第一の蒸着層６ａと第二の蒸着層６ｂの境界は明確に現れない。

また、本実施の形態では、上記形成方法５）〜７）に示すように、第二の蒸着層６ｂを形成する工程では、酸素ガスとアルゴンガスの流量比、周辺の圧力、基材５の温度を、第一の蒸着層６ａを形成する工程とは変えたことで、金属粒子８の運動エネルギーおよび粒子８表面の活性度が抑えられ、金属粒子８が成長しにくくなり、第二の蒸着層６ｂの粒子８を第一の蒸着層６ａよりも小さくなるように形成できたと考えられる。

そして本実施の形態では、複数のツリー構造体の第一の蒸着層６ａおよび第二の蒸着層６ｂが基材５から表層に向かってアルミニウムの複数の微粒子８が連なって形成され、かつ、夫々複数の枝に枝分かれして形成されているために、毛細管現象が起こりやすい状態となり、これにより測定したいＤＮＡを含む溶液の含浸性に優れる。

さらに、上記複数のツリー構造体が、個々の粒子８が複数に枝分かれして一体に結合した構造に形成されているために、応力負荷が分散され、破壊されにくくなる。そしてその結果、センサの機械的強度を高めることができる。

なお、上記２）の工程では、その他の例として、酸素ガスおよびアルゴンガスを流入させずに蒸着を行ってもよい。

また、別の製造方法として、上記５）〜７）の工程では、第二の蒸着層６ｂが第一の蒸着層６ａの表面から段階的に粒子径が小さくなるように形成するため、上記２）、３）の条件から酸素ガスに対してアルゴンガスの流量比を２〜４、不活性ガスを流入して基材５周辺の圧力を２０〜３０Ｐａ、基材５の温度を１５０〜２００℃の範囲に段階的に変化させてもよい。

以上のように蒸着層６を形成した後、それぞれの粒子８の表面に酸化被膜を形成する。酸化被膜は自然酸化によっても形成することができるが、本実施の形態では、この蒸着層６を電解液中において陽極で電解し、厚み数ｎｍ程度の酸化被膜（陽極酸化膜）を効率よく生成した（図３）。

本実施の形態の陽極化成条件は、化成電圧５Ｖ、保持時間２０分、７％アジピン酸アンモニウム水溶液、７０℃、０．０５Ａ／ｃｍ²で化成を行い、測定条件としては、インピーダンスアナライザーを用い、８％ホウ酸アンモニウム水溶液、３０℃、測定面積１０ｃｍ²、測定周波数１２０Ｈｚで行ったものであるが、本発明はこれに限定されるものではない。

そしてさらに図２に示すように、粒子８表面の陽極酸化膜（図示せず）にＤＮＡプローブ７と結合する適当な官能基を導入し、粒子８にＤＮＡプローブ７を固定した。

粒子８とＤＮＡプローブ７との結合反応には、表面にアミノ基を導入した粒子８とＤＮＡプローブ７とをイオン結合させる方法、アルデヒド基を導入した粒子８とアミノ化したＤＮＡプローブ７とを共有結合させる方法、また架橋剤を用いて、粒子８上の官能基とＤＮＡプローブ７に修飾した官能基とを結合させる方法などが知られている。

これらいずれの結合方法においても、ＤＮＡプローブ７を適当な水溶液に溶解して粒子８上へスポットし、その微小な液滴中で結合反応を進行させ、その後水洗浄によって余剰のＤＮＡプローブ７を除去してマイクロアレイを作製する。

本実施の形態における効果を以下に説明する。

本実施の形態のＤＮＡセンサは、ＤＮＡセンサの感度を向上させることができる。

その理由は、基材５上に機能性分子（ＤＮＡプローブ７）を高密度に固定することができるからである。すなわち本実施の形態は、蒸着層６が枝分かれするように積み重なり、一体的に結合した複数の粒子からなるため、表面積が大きくなり、狭いスペースにもＤＮＡプローブ７を高密度に形成することができる。したがって、各ＤＮＡプローブ７とリガンド分子である相補的ＤＮＡとの反応を十分得ることができ、大きな信号として検出することができる。そしてその結果、センサの感度を向上させることができる。

なお、本実施の形態では、平均粒子径の小さい第二の蒸着層６ｂを形成したことにより、図６の空孔径分布を示した特性図から明らかなように、空孔径の最頻値が約０．０３μｍと極めて微細なものとなる。これは、エッチングしたアルミニウム箔の空孔径の最頻値が約０．１５μｍであることと比べて分かるように、極めて微細化されたものであり、これにより、表面積を大きく拡大することができる。

また本実施の形態の蒸着層６は、複数の粒子８がランダムに枝分かれしながら成長した形状であるため、直線的な穴が規則的に形成された多孔質アルミナよりも表面積を大きくすることができる。

なお蒸着層６の粒子径は均一でもよいが、本実施の形態では、蒸着層６の根元に粒子径の大きい第一の蒸着層６ａを設けたことにより、基材５と蒸着層６の密着性に優れ、剥離を抑制できる。

このように本実施の形態で示す蒸着層６は、表面積が大きく、さらに基材５との密着性も高いことから、この蒸着層６を用いることで、高精度かつ高信頼性のＤＮＡセンサを実現できる。

上記実施の形態では、センサとしてＤＮＡセンサを例に挙げ、機能性分子はＤＮＡプローブ７としたが、機能性分子をＲＮＡにしてもよい。ＲＮＡもＤＮＡと同様に、保護基を用いて容易に所定領域に形成することができる。

さらにセンサとしては、ＤＮＡセンサ以外にも、タンパク質センサや糖センサ、抗原抗体センサ等の各種センサに用いることが出来る。これら各種センサに用いる機能性分子としては、それぞれ検出したいリガンド分子を捕捉可能な受容体や反応性物質を選択すればよい。また場合によっては測定したい物質を機能性分子として蒸着層６に固定し、これらの物質と特異的に結合する受容体や反応性物質を蒸着層６上に注入して反応をセンシングすることもできる。

（実施の形態２）
実施の形態２では、本発明の一実施の形態として、ＤＮＡやＲＮＡなどの核酸配列を測定するシーケンサーを例に挙げ説明する。

図７に示すように、本実施の形態のシーケンサーも、実施の形態１のＤＮＡセンサと同様に、基材９と、この基材９の表面に接合された蒸着層１０とを備えている。なお、基材９は複数の領域１１〜１３に区分けされており、蒸着層１０は、この領域１１〜１３毎に形成されている。

そして蒸着層１０は、実施の形態１と同様に、複数の粒子１４が一体的に結合したツリー状の構造体であり、すくなくともその表面は酸化アルミニウム膜で被覆されている。

また本実施の形態における蒸着層１０は、実施の形態１と同様に、基材９と接する第一の蒸着層１０ａと、この第一の蒸着層１０ａ上に形成された第二の蒸着層１０ｂを有し、第一の蒸着層１０ａを構成する粒子１４の平均粒子径は、第二の蒸着層１０ｂを構成する粒子１４の平均粒子径より大きいものとした。

本実施の形態では、まず配列を測定したいＤＮＡやＲＮＡなどの核酸を複数に分断した核酸鋳型を、基材９の各領域１１〜１３に一つずつ固定する。そしてこの固定された核酸鋳型をもとに核酸を増幅させ、これらの増幅した核酸鎖（核酸鋳型）とヌクレオチド前躯体とのハイブリタイズによる蛍光を分析するか、あるいは固定された核酸鎖とヌクレオチド前駆体とのハイブリタイズ反応によって変化する電磁場状態を、光、あるいは電気的な信号の変化として分析し、核酸配列を読み取っていく。

本実施の形態のシーケンサーは単位領域における核酸の密度が増し、核酸配列の測定精度を高めることができる。

その理由は、基材９上に、複数の粒子１４が海ぶどう状に積み重なって一体化した蒸着層１０を形成し、この粒子１４上で核酸を増幅させたからである。

これにより本実施の形態では、基材９の表面積が増え、一領域における核酸の増幅量が多くなる。そしてその結果、核酸コロニー全体から検出できる信号が大きくなり、核酸配列の測定精度を高めることができる。

また本実施の形態では、蒸着層１０の根元は、粒子径の大きい粒子１４からなる第一の蒸着層１０ａで構成したため、蒸着層１０と基材９との密着性が高まり、信頼性の高いシーケンサーを実現できる。

本発明によるセンサおよびシーケンサーは、測定精度の高いＤＮＡセンサあるいはＤＮＡシーケンサー等に用いられる。

本発明の一実施の形態におけるセンサの模式断面図 同ＤＮＡセンサの要部を拡大した模式断面図 同ＤＮＡセンサの陽極化成後の蒸着層を示したＳＥＭ写真 同ＤＮＡセンサの陽極化成前の蒸着層を示したＳＥＭ写真 図４の要部を拡大したＳＥＭ写真 本発明の一実施の形態における蒸着層の空孔径分布を示した特性図 本発明の一実施の形態におけるシーケンサーの模式断面図 従来のＤＮＡセンサの模式断面図

５ 基材
６ 蒸着層
６ａ 第一の蒸着層
６ｂ 第二の蒸着層
７ ＤＮＡプローブ（機能性分子）
８ 粒子
９ 基材
１０ 蒸着層
１０ａ 第一の蒸着層
１０ｂ 第二の蒸着層
１１〜１３ 領域
１４ 粒子

Claims (2)

1. 基材と、
   この基材上に枝分かれするように積み重なり、一体的に結合した複数の粒子からなる蒸着層と、
   それぞれの前記粒子の表面に接合した複数の機能性分子とを備え、
   前記蒸着層は、
   前記基材と接する第一の蒸着層と、
   前記第一の蒸着層上に形成された第二の蒸着層とを有し、
   前記第一の蒸着層を構成する粒子の平均粒子径は、
   前記第二の蒸着層を構成する粒子の平均粒子径より大きく、
   それぞれの前記粒子の表面は、酸化アルミニウムを主成分とする
   センサ。
2. 基材と、
   この基材上に枝分かれするように積み重なり、一体的に結合した複数の粒子からなる蒸着層とを備え、
   前記蒸着層は、
   前記基材と接する第一の蒸着層と、
   前記第一の蒸着層上に形成された第二の蒸着層とを有し、
   前記第一の蒸着層を構成する粒子の平均粒子径は、
   前記第二の蒸着層を構成する粒子の平均粒子径より大きく、
   それぞれの前記粒子の表面は、酸化アルミニウムを主成分とし、
   これらの粒子の表面に核酸を固定して増幅させ、その核酸配列を測定するシーケンサー。