JP5211790B2

JP5211790B2 - Ｄｎａメチル化測定方法

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Publication number: JP5211790B2
Application number: JP2008077970A
Authority: JP
Inventors: 祥隆冨ヶ原; 日出夫佐藤; 弘和樽井
Original assignee: Sumitomo Chemical Co Ltd
Current assignee: Sumitomo Chemical Co Ltd
Priority date: 2007-03-26
Filing date: 2008-03-25
Publication date: 2013-06-12
Anticipated expiration: 2028-03-25
Also published as: AU2008230349A1; EP2143806B1; US20100120033A1; JP2008263963A; EP2143806A1; WO2008117888A1; EP2143806A4; KR20100015873A; CA2682260A1

Description

本発明は、生物由来検体中に含まれるゲノムＤＮＡが有する目的とするＤＮＡ領域においてメチル化されたＤＮＡを検出若しくは定量する方法等に関する。

生物由来検体中に含まれるゲノムＤＮＡが有する目的とするＤＮＡ領域においてＤＮＡのメチル化状態を評価するための方法としては、例えば、生物由来検体中に含まれるゲノムＤＮＡが有する目的とするＤＮＡ領域においてメチル化されたＤＮＡを検出若しくは定量する方法が存在している（例えば、非特許文献１及び２参照）。
当該測定方法では、まず、生物由来検体中に含まれるゲノムＤＮＡ由来のＤＮＡ試料から、目的とするＤＮＡ領域を含むＤＮＡを抽出する必要がある。当該抽出方法としては、例えば、ゲル濾過、シリカ担体、有機溶媒等による抽出方法等が知られているが、いずれの抽出方法も操作が煩雑である。
次いで、抽出されたＤＮＡの目的領域におけるメチル化されたＤＮＡの検出若しくは定量する方法としては、例えば、（１）亜硫酸塩等を用いて当該ＤＮＡを修飾した後、ＤＮＡポリメラーゼによるＤＮＡ合成の連鎖反応（Polymerase Chain Reaction；以下、ＰＣＲと記すこともある。）に供することにより目的領域を増幅する方法、（２）メチル化感受性制限酵素を用いて当該ＤＮＡを消化した後、ＰＣＲに供することにより、目的領域を増幅する方法等を挙げることができる。

Clark SJ, Harrison J, Paul CL, Frommer M., High sensitivity mapping of methylated cytosines. Nucleic Acids Res. 1994 Aug 11;22(15):2990-7. Ushijima T, Morimura K, Hosoya Y, Okonogi H, Tatematsu M, Sugimura T, Nagao M., Establishment of methylation-sensitive- representational difference analysis and isolation of hypo- and hypermethylated genomic fragments in mouse liver tumors.Proc Natl Acad Sci U S A. 1997 Mar 18;94(6):2284-9.

上記のいずれの方法とも、ＰＣＲに供するまでの操作（具体的には例えば、メチル化検出のためのＤＮＡの修飾及びその後の生成物の精製等）に非常に時間と労力とを要し、さらに、ＰＣＲが増幅しようとする目的領域のＤＮＡの塩基配列に対して相補的な１組のオリゴヌクレオチドプライマー（以下、プライマー対と記すこともある。）を用いて液相中にて行われるために、増幅されたＤＮＡ断片を精製した後、これをＰＣＲのための反応容器へ移し換える操作、また目的領域を増幅させるための前記のプライマー対を含む反応試薬を反応系に添加するための操作等も必要である。更に、増幅しようとする目的領域のＤＮＡの増幅を確認するために、電気泳動等の分析操作に供する必要もあり、しかもその操作は極めて繁雑である。
このように、生物由来検体中に含まれるゲノムＤＮＡが有する目的とするＤＮＡ領域においてメチル化されたＤＮＡを検出若しくは定量するための一連の操作には、多大な手間が存在していた。

本発明者らは、かかる状況下鋭意検討した結果、本発明に至った。
即ち、本発明は、
１．生物由来検体中に含まれるゲノムＤＮＡが有する目的とするＤＮＡ領域においてメチル化されたＤＮＡを検出若しくは定量する方法であって、
（１）生物由来検体中に含まれるゲノムＤＮＡ由来のＤＮＡ試料から一本鎖ＤＮＡを取得する第一工程、
（２）(i)第一工程で取得された一本鎖ＤＮＡ、(ii)メチル化ＤＮＡ抗体、及び、(iii)前記のメチル化ＤＮＡ抗体と目的とするＤＮＡ領域においてメチル化されたＤＮＡとの結合を阻害せず且つ前記の一本鎖ＤＮＡと結合し得るオリゴヌクレオチド、を混合することによりメチル化された目的とするＤＮＡ領域を含む一本鎖ＤＮＡと、メチル化ＤＮＡ抗体と、前記のオリゴヌクレオチドとの複合体を形成させると同時に若しくは形成させた後、当該複合体を分離する第二工程、及び、
（３）分離された複合体に含まれる前記のメチル化ＤＮＡ抗体、又は、前記のオリゴヌクレオチドを、当該メチル化ＤＮＡ抗体又は当該オリゴヌクレオチドが有する検出に利用し得る識別機能に基づき検出若しくは定量することにより、生物由来検体中に含まれる目的とするＤＮＡ領域においてメチル化されたＤＮＡを検出若しくは定量する第三工程、
を有することを特徴とする方法（以下、本発明測定方法と記すこともある。）；
２．第二工程で混合される、メチル化ＤＮＡ抗体と目的とするＤＮＡ領域を含む一本鎖ＤＮＡの中に存在するメチル化された塩基との結合を阻害しないオリゴヌクレオチドとして、２種類以上のオリゴヌクレオチドが用いられることを特徴とする前項１の方法；
３．第二工程で形成される複合体、又は、第二工程の複合体を形成させる過程において生じる第一工程で取得された一本鎖ＤＮＡと、メチル化ＤＮＡ抗体と目的とするＤＮＡ領域を含む一本鎖ＤＮＡの中に存在するメチル化された塩基との結合を阻害しないオリゴヌクレオチドとの結合体、を二価陽イオンを含有する反応系中で形成させることを特徴とする前項１記載の方法；
４．二価陽イオンがマグネシウムイオンであることを特徴とする前項３記載の方法；
５．第二工程における複合体の分離操作として、形成された複合体に含まれるメチル化ＤＮＡ抗体を支持体に結合させる工程を有することを特徴とする前項１〜４のいずれかの前項記載の方法；
６．第二工程における複合体の分離操作として、形成された複合体に含まれる前記のオリゴヌクレオチドを支持体に結合させる工程を有することを特徴とする前項１〜４のいずれかの前項記載の方法；
７．第一工程の終了直後から第三工程の開始直前までの間に、第一工程で取得された一本鎖ＤＮＡを、少なくとも１種類の一本鎖ＤＮＡを消化できるメチル化感受性制限酵素により消化する工程を、追加的に有することを特徴とする前項１〜６のいずれかの前項記載の方法；
８．第一工程の終了直後から第三工程の開始直前までの間に、(i)第一工程で取得された一本鎖ＤＮＡ、及び、少なくとも１種類のメチル化感受性制限酵素の認識配列をその一部として有するマスキング用オリゴヌクレオチド、を混合する工程、及び、(ii)前工程により得られた混合物（の中に存在する目的とするＤＮＡ領域においてＤＮＡがメチル化されていない一本鎖ＤＮＡ）を前記のメチル化感受性制限酵素により消化する工程を、追加的に有することを特徴とする前項１〜６のいずれかの前項記載の方法；
９．少なくとも１種類の一本鎖ＤＮＡを消化できるメチル化感受性制限酵素が、一本鎖ＤＮＡを消化できるメチル化感受性制限酵素であるHhaIであることを特徴とする前項７記載の方法；
１０．少なくとも１種類のメチル化感受性制限酵素が、メチル化感受性制限酵素であるHpaII又はHhaIであることを特徴とする前項８記載の方法；
１１．メチル化ＤＮＡ抗体が、メチルシトシン抗体であることを特徴とする前項１〜１０のいずれかの前項記載の方法；
１２．生物由来検体が、哺乳動物の血清又は血漿であることを特徴とする前項１〜１１のいずれかの前項記載の方法；
１３．生物由来検体が、哺乳動物の血液又は体液であることを特徴とする前項１〜１１のいずれかの前項記載の方法；
１４．生物由来検体が、細胞溶解液又は組織溶解液であることを特徴とする前項１〜１１のいずれかの前項記載の方法；
１５．生物由来検体中に含まれるゲノムＤＮＡ由来のＤＮＡ試料が、当該ゲノムＤＮＡが有する目的とするＤＮＡ領域を認識切断部位としない制限酵素で予め消化処理されてなるＤＮＡ試料であることを特徴とする前項１〜１４のいずれかの前項記載の方法；
１６．生物由来検体中に含まれるゲノムＤＮＡ由来のＤＮＡ試料が、少なくとも１種類のメチル化感受性制限酵素で消化処理されてなるＤＮＡ試料であることを特徴とする前項１〜１５のいずれかの前項記載の方法；
１７．生物由来検体中に含まれるゲノムＤＮＡ由来のＤＮＡ試料が、マスキング用オリゴヌクレオチドを添加した後に、少なくとも１種類のメチル化感受性制限酵素で消化処理されてなるＤＮＡ試料であることを特徴とする前項１〜１５のいずれかの前項記載の方法；
１８．少なくとも１種類のメチル化感受性制限酵素が、メチル化感受性制限酵素であるHpaII又はHhaIであることを特徴とする前項１６又は１７記載の方法；
１９．生物由来検体中に含まれるゲノムＤＮＡ由来のＤＮＡ試料が、予め精製されてなるＤＮＡ試料であることを特徴とする前項１〜１８のいずれかの前項記載の方法；
２０．ゲノムＤＮＡが有する目的とするＤＮＡ領域が、少なくとも１種類のメチル化感受性制限酵素が認識する切断部位を有するＤＮＡ領域であることを特徴とする前項１〜１９のいずれかの前項記載の方法；
２１．第一工程でゲノムＤＮＡ由来のＤＮＡ試料から一本鎖ＤＮＡを取得する際に、カウンターオリゴヌクレオチドを添加する前項１〜２０のいずれか一項に記載の方法；
２２．第一工程におけるゲノムＤＮＡ由来のＤＮＡ試料からの一本鎖ＤＮＡの取得が、二価陽イオンあるいはマグネシウムイオンを含有する反応系中で行われる前項１〜２０のいずれか一項に記載の方法；
等を提供するものである。

本発明により、生物由来検体中に含まれるゲノムＤＮＡが有する目的とするＤＮＡ領域においてメチル化されたＤＮＡを簡便に検出若しくは定量する方法等を提供することが可能となる。

以下に本発明を詳細に説明する。
各種疾患（例えば、癌）においてＤＮＡのメチル化異常が起こることが知られており、このＤＮＡメチル化異常を検出することにより、各種疾患の度合いを測定することが可能と考えられている。
例えば、疾患由来の検体中で100％メチル化されている領域があり、その領域について、本発明測定方法を実施すれば、メチル化ＤＮＡ量は多くなり、例えば、疾患由来の検体中で100%メチル化されていない領域があり、その領域について、本発明測定方法を実施すれば、メチル化ＤＮＡ量はほぼ0に近い値となるであろう。また、例えば、健常者の検体で、メチル化割合が低く、疾患患者の検体で、メチル化割合が高い領域があり、その領域について、本発明測定方法を実施すれば、健常者では、メチル化ＤＮＡ量は、0に近い値を示し、疾患患者では、健常者の値よりも有意に高い値を示すため、この値の差異に基づき、「疾患の度合い」を判定することができる。ここでの「疾患の度合い」とは、一般に当該分野において使用される意味と同様であって、具体的には、例えば、検体が細胞である場合には当該細胞の悪性度を意味し、また、例えば、検体が組織である場合には当該組織における疾患細胞の存在量等を意味している。さらに、検体が血漿・血清である場合にはその個体が疾患を有する確率を意味している。従って、本発明測定方法は、メチル化異常を調べることにより、各種疾患を診断することを可能にする。

本発明測定方法における「生物由来検体」としては、例えば、細胞溶解液、組織溶解液（ここでの組織とは、血液、リンパ節等を含む広義の意味である。）若しくは、哺乳動物においては、血漿、血清、リンパ液等の体液、体分泌物（尿や乳汁等）等の生体試料及びこれら生体試料から抽出して得られたゲノムＤＮＡを挙げることができる。また当該生物由来検体としては、例えば、微生物、ウイルス等由来の試料も挙げられ、この場合には、本発明測定方法における「ゲノムＤＮＡ」とは、微生物、ウイルスのゲノムＤＮＡを意味するものである。また前記検体がメチル化感受性制限酵素等で処理した後の検体であっても良い。
哺乳動物由来の検体が血液である場合には、定期健康診断や簡便な検査等での本発明測定方法の利用が期待できる。
ゲノムＤＮＡを哺乳動物由来の検体から得るには、例えば、市販のＤＮＡ抽出用キット等を用いてＤＮＡを抽出すれば良い。
因みに、血液を検体として用いる場合には、血液から通常の方法に準じて血漿又は血清を調製し、調製された血漿又は血清を検体として、その中に含まれる遊離ＤＮＡ（胃癌細胞等の癌細胞由来のＤＮＡが含まれる）を分析すると、血球由来のＤＮＡを避けて胃癌細胞等の癌細胞由来のＤＮＡを解析することができ、胃癌細胞等の癌細胞、それを含む組織等を検出する感度を向上させることができる。

本発明測定方法における「メチル化されたＤＮＡ」とは、下記のようなＤＮＡを意味するものである。通常、遺伝子（ゲノムＤＮＡ）を構成する塩基は４種類である。これらの塩基のうち、シトシンのみがメチル化されるという現象が知られており、このようなＤＮＡのメチル化修飾は、５’−ＣＧ−３’で示される塩基配列（Ｃはシトシンを表し、Ｇはグアニンを表す。以下、当該塩基配列を「ＣｐＧ」と記すこともある。）中のシトシンに限られている。シトシンにおいてメチル化される部位は、その５位である。細胞分裂に先立つＤＮＡ複製に際して、複製直後は鋳型鎖の「ＣｐＧ」中のシトシンのみがメチル化された状態となるが、メチル基転移酵素の働きにより即座に新生鎖の「ＣｐＧ」中のシトシンもメチル化される。従って、ＤＮＡのメチル化の状態は、ＤＮＡ複製後も、新しい２組のＤＮＡにそのまま引き継がれることになる。このようなメチル化修飾により生じたＤＮＡを意味するものである。

本発明測定方法における「目的とするＤＮＡ領域」（以下、目的領域と記すこともある。）は、当該領域に含まれるシトシンのメチル化有無を調べたいＤＮＡ領域であって、例えば、Lysyl oxidase、HRAS-like suppressor、bA305P22.2.1、Gamma filamin、HAND1、Homologue of RIKEN 2210016F16、FLJ32130、PPARG angiopoietin-related protein、Thrombomodulin、p53-responsive gene 2、Fibrillin2、Neurofilament3、disintegrin and metalloproteinase domain 23、G protein-coupled receptor 7、G-protein coupled somatostatin and angiotensin-like peptide receptor、Solute carrier family 6 neurotransmitter transporter noradrenalin member 2等の有用タンパク質遺伝子のプロモーター領域、非翻訳領域又は翻訳領域（コーディング領域）の塩基配列中に存在する一つ以上のＣｐＧで示される塩基配列中のシトシンを含むＤＮＡの領域等を挙げることができる。前記「目的とするＤＮＡ領域」においてメチル化されたＤＮＡを個々に検出若しくは定量することは勿論であるが、例えば、１つの検出系において、当該「目的とするＤＮＡ領域」をより多く用いれば、それだけ定量精度及び検出感度が向上する。

具体的には例えば、有用タンパク質遺伝子がLysyl oxidase遺伝子である場合には、そのプロモーター領域、非翻訳領域又は翻訳領域（コーディング領域）の塩基配列中に存在する一つ以上のＣｐＧで示される塩基配列としては、ヒト由来のLysyl oxidase遺伝子のエクソン１と、その５’上流に位置するプロモーター領域とが含まれるゲノムＤＮＡの塩基配列を挙げることができ、より具体的には、配列番号１で示される塩基配列（Genbank Accession No.AF270645に記載される塩基配列の塩基番号16001〜18661で示される塩基配列に相当する。）が挙げられる。配列番号１で示される塩基配列においては、ヒト由来のLysyl oxidaseタンパク質のアミノ末端のメチオニンをコードするATGコドンが、塩基番号2031〜2033に示されており、上記エクソン１の塩基配列は、塩基番号1957〜2661に示されている。配列番号１で示される塩基配列中に存在するＣｐＧで示される塩基配列中のシトシン、とりわけ配列番号１で示される塩基配列においてＣｐＧが密に存在する領域中に存在するＣｐＧ中のシトシンは、例えば、胃癌細胞等の癌細胞において高いメチル化頻度（即ち、高メチル化状態（hypermethylation））を示す。さらに具体的には、胃癌細胞においてメチル化頻度が高いシトシンとしては、例えば、配列番号１で示される塩基配列において、塩基番号1539、1560、1574、1600、1623、1635、1644、1654、1661、1682、1686、1696、1717、1767、1774、1783、1785、1787、1795等で示される塩基番号であるシトシンを挙げることができる。

また具体的には例えば、有用タンパク質遺伝子がHRAS-like suppressor遺伝子である場合には、そのプロモーター領域、非翻訳領域又は翻訳領域（コーディング領域）の塩基配列中に存在する一つ以上のＣｐＧで示される塩基配列としては、ヒト由来のHRAS-like suppressor遺伝子のエクソン１と、その５’上流に位置するプロモーター領域とが含まれるゲノムＤＮＡの塩基配列を挙げることができ、より具体的には、配列番号２で示される塩基配列（Genbank Accession No.AC068162に記載される塩基配列の塩基番号172001〜173953で示される塩基配列に相当する。）が挙げられる。配列番号２で示される塩基配列においては、ヒト由来のHRAS-like suppressor遺伝子のエクソン１の塩基配列は、塩基番号1743〜1953に示されている。配列番号２で示される塩基配列中に存在するＣｐＧで示される塩基配列中のシトシン、とりわけ配列番号２で示される塩基配列においてＣｐＧが密に存在する領域中に存在するＣｐＧ中のシトシンは、例えば、胃癌細胞等の癌細胞において高いメチル化頻度（即ち、高メチル化状態（hypermethylation））を示す。さらに具体的には、胃癌細胞においてメチル化頻度が高いシトシンとしては、例えば、配列番号２で示される塩基配列において、塩基番号1316、1341、1357、1359、1362、1374、1390、1399、1405、1409、1414、1416、1422、1428、1434、1449、1451、1454、1463、1469、1477、1479、1483、1488、1492、1494、1496、1498、1504、1510、1513、1518、1520等で示される塩基番号であるシトシンを挙げることができる。

また具体的には例えば、有用タンパク質遺伝子が、bA305P22.2.1遺伝子である場合には、そのプロモーター領域、非翻訳領域又は翻訳領域（コーディング領域）の塩基配列中に存在する一つ以上のＣｐＧで示される塩基配列としては、ヒト由来のbA305P22.2.1遺伝子のエクソン１と、その５’上流に位置するプロモーター領域とが含まれるゲノムＤＮＡの塩基配列を挙げることができ、より具体的には、配列番号３で示される塩基配列（Genbank Accession No.AL121673に記載される塩基配列の塩基番号13001〜13889で示される塩基配列に相当する。）が挙げられる。配列番号３で示される塩基配列においては、ヒト由来のbA305P22.2.1タンパク質のアミノ末端のメチオニンをコードするATGコドンが、塩基番号849〜851に示されており、上記エクソン１の塩基配列は、塩基番号663〜889に示されている。配列番号３で示される塩基配列中に存在するＣｐＧで示される塩基配列中のシトシン、とりわけ配列番号３で示される塩基配列においてＣｐＧが密に存在する領域中に存在するＣｐＧ中のシトシンは、例えば、胃癌細胞等の癌細胞において高いメチル化頻度（即ち、高メチル化状態（hypermethylation））を示す。さらに具体的には、胃癌細胞においてメチル化頻度が高いシトシンとしては、例えば、配列番号３で示される塩基配列において、塩基番号329、335、337、351、363、373、405、424、427、446、465、472、486等で示される塩基番号であるシトシンを挙げることができる。

また具体的には例えば、有用タンパク質遺伝子が、Gamma filamin遺伝子である場合には、そのプロモーター領域、非翻訳領域又は翻訳領域（コーディング領域）の塩基配列中に存在する一つ以上のＣｐＧで示される塩基配列としては、ヒト由来のGamma filamin遺伝子のエクソン１と、その５’上流に位置するプロモーター領域とが含まれるゲノムＤＮＡの塩基配列を挙げることができ、より具体的には、配列番号４で示される塩基配列（Genbank Accession No.AC074373に記載される塩基配列の塩基番号63528〜64390で示される塩基配列の相補的配列に相当する。）が挙げられる。配列番号４で示される塩基配列においては、ヒト由来のGamma filaminタンパク質のアミノ末端のメチオニンをコードするATGコドンが、塩基番号572〜574に示されており、上記エクソン１の塩基配列は、塩基番号463〜863に示されている。配列番号４で示される塩基配列中に存在するＣｐＧで示される塩基配列中のシトシン、とりわけ配列番号４で示される塩基配列においてＣｐＧが密に存在する領域中に存在するＣｐＧ中のシトシンは、例えば、胃癌細胞等の癌細胞において高いメチル化頻度（即ち、高メチル化状態（hypermethylation））を示す。さらに具体的には、胃癌細胞においてメチル化頻度が高いシトシンとしては、例えば、配列番号４で示される塩基配列において、塩基番号329、333、337、350、353、360、363、370、379、382、384、409、414、419、426、432、434、445、449、459、472、474、486、490、503、505等で示される塩基番号であるシトシンを挙げることができる。

また具体的には例えば、有用タンパク質遺伝子が、HAND1遺伝子である場合には、そのプロモーター領域、非翻訳領域又は翻訳領域（コーディング領域）の塩基配列中に存在する一つ以上のＣｐＧで示される塩基配列としては、ヒト由来のHAND1遺伝子のエクソン１と、その５’上流に位置するプロモーター領域とが含まれるゲノムＤＮＡの塩基配列を挙げることができ、より具体的には、配列番号５で示される塩基配列（Genbank Accession No.AC026688に記載される塩基配列の塩基番号24303〜26500で示される塩基配列の相補的配列に相当する。）が挙げられる。配列番号５で示される塩基配列においては、ヒト由来のHAND1タンパク質のアミノ末端のメチオニンをコードするATGコドンが、塩基番号1656〜1658に示されており、上記エクソン１の塩基配列は、塩基番号1400〜2198に示されている。配列番号５で示される塩基配列中に存在するＣｐＧで示される塩基配列中のシトシン、とりわけ配列番号５で示される塩基配列においてＣｐＧが密に存在する領域中に存在するＣｐＧ中のシトシンは、例えば、胃癌細胞等の癌細胞において高いメチル化頻度（即ち、高メチル化状態（hypermethylation））を示す。さらに具体的には、胃癌細胞においてメチル化頻度が高いシトシンとしては、例えば、配列番号５で示される塩基配列において、塩基番号1153、1160、1178、1187、1193、1218、1232、1266、1272、1292、1305、1307、1316、1356、1377、1399、1401、1422、1434等で示される塩基番号であるシトシンを挙げることができる。

また具体的には例えば、有用タンパク質遺伝子が、Homologue of RIKEN 2210016F16遺伝子である場合には、そのプロモーター領域、非翻訳領域又は翻訳領域（コーディング領域）の塩基配列中に存在する一つ以上のＣｐＧで示される塩基配列としては、ヒト由来のHomologue of RIKEN 2210016F16遺伝子のエクソン１と、その５’上流に位置するプロモーター領域とが含まれるゲノムＤＮＡの塩基配列を挙げることができ、より具体的には、配列番号６で示される塩基配列（Genbank Accession No.AL354733に記載される塩基配列の塩基番号157056〜159000で示される塩基配列の相補的塩基配列に相当する。）が挙げられる。配列番号６で示される塩基配列においては、ヒト由来のHomologue of RIKEN 2210016F16タンパク質のエクソン１の塩基配列は、塩基番号1392〜1945に示されている。配列番号６で示される塩基配列中に存在するＣｐＧで示される塩基配列中のシトシン、とりわけ配列番号６で示される塩基配列においてＣｐＧが密に存在する領域中に存在するＣｐＧ中のシトシンは、例えば、胃癌細胞等の癌細胞において高いメチル化頻度（即ち、高メチル化状態（hypermethylation））を示す。さらに具体的には、胃癌細胞においてメチル化頻度が高いシトシンとしては、例えば、配列番号６で示される塩基配列において、塩基番号1172、1175、1180、1183、1189、1204、1209、1267、1271、1278、1281、1313、1319、1332、1334、1338、1346、1352、1358、1366、1378、1392、1402、1433、1436、1438等で示される塩基番号であるシトシンを挙げることができる。

また具体的には例えば、有用タンパク質遺伝子が、FLJ32130遺伝子である場合には、そのプロモーター領域、非翻訳領域又は翻訳領域（コーディング領域）の塩基配列中に存在する一つ以上のＣｐＧで示される塩基配列としては、ヒト由来のFLJ32130遺伝子のエクソン１と、その５’上流に位置するプロモーター領域とが含まれるゲノムＤＮＡの塩基配列を挙げることができ、より具体的には、配列番号７で示される塩基配列（Genbank Accession No.AC002310に記載される塩基配列の塩基番号1〜2379で示される塩基配列の相補的塩基配列に相当する。）が挙げられる。配列番号７で示される塩基配列においては、ヒト由来のFLJ32130タンパク質のアミノ酸末端のメチオニンをコードするATGコドンが、塩基番号2136〜2138に示されており、上記エクソン１と考えられる塩基配列は、塩基番号2136〜2379に示されている。配列番号７で示される塩基配列中に存在するＣｐＧで示される塩基配列中のシトシン、とりわけ配列番号７で示される塩基配列においてＣｐＧが密に存在する領域中に存在するＣｐＧ中のシトシンは、例えば、胃癌細胞等の癌細胞において高いメチル化頻度（即ち、高メチル化状態（hypermethylation））を示す。さらに具体的には、胃癌細胞においてメチル化頻度が高いシトシンとしては、例えば、配列番号７で示される塩基配列において、塩基番号1714、1716、1749、1753、1762、1795、1814、1894、1911、1915、1925、1940、1955、1968等で示される塩基番号であるシトシンを挙げることができる。

また具体的には例えば、有用タンパク質遺伝子が、PPARG angiopoietin-related protein遺伝子である場合には、そのプロモーター領域、非翻訳領域又は翻訳領域（コーディング領域）の塩基配列中に存在する一つ以上のＣｐＧで示される塩基配列としては、ヒト由来のPPARG angiopoietin-related protein遺伝子のエクソン１と、その５’上流に位置するプロモーター領域とが含まれるゲノムＤＮＡの塩基配列を挙げることができ、より具体的には、配列番号８で示される塩基配列が挙げられる。配列番号８で示される塩基配列においては、ヒト由来のPPARG angiopoietin-related proteinタンパク質のアミノ末端のメチオニンをコードするATGコドンが、塩基番号717〜719に示されており、上記エクソン１の５’側部分の塩基配列は、塩基番号1957〜2661に示されている。配列番号８で示される塩基配列中に存在するＣｐＧで示される塩基配列中のシトシン、とりわけ配列番号８で示される塩基配列においてＣｐＧが密に存在する領域中に存在するＣｐＧ中のシトシンは、例えば、胃癌細胞等の癌細胞において高いメチル化頻度（即ち、高メチル化状態（hypermethylation））を示す。さらに具体的には、胃癌細胞においてメチル化頻度が高いシトシンとしては、例えば、配列番号８で示される塩基配列において、塩基番号35、43、51、54、75、85、107、127、129、143、184、194、223、227、236、251、258等で示される塩基番号であるシトシンを挙げることができる。

また具体的には例えば、有用タンパク質遺伝子が、Thrombomodulin遺伝子である場合には、そのプロモーター領域、非翻訳領域又は翻訳領域（コーディング領域）の塩基配列中に存在する一つ以上のＣｐＧで示される塩基配列としては、ヒト由来のThrombomodulin遺伝子のエクソン１と、その５’上流に位置するプロモーター領域とが含まれるゲノムＤＮＡの塩基配列を挙げることができ、より具体的には、配列番号９で示される塩基配列（Genbank Accession No.AF495471に記載される塩基配列の塩基番号1〜6096で示される塩基配列に相当する。）が挙げられる。配列番号９で示される塩基配列においては、ヒト由来のThrombomodulinタンパク質のアミノ末端のメチオニンをコードするATGコドンが、塩基番号2590〜2592に示されており、上記エクソン１の塩基配列は、塩基番号2048〜6096に示されている。配列番号９で示される塩基配列中に存在するＣｐＧで示される塩基配列中のシトシン、とりわけ配列番号９で示される塩基配列においてＣｐＧが密に存在する領域中に存在するＣｐＧ中のシトシンは、例えば、胃癌細胞等の癌細胞において高いメチル化頻度（即ち、高メチル化状態（hypermethylation））を示す。さらに具体的には、胃癌細胞においてメチル化頻度が高いシトシンとしては、例えば、配列番号９で示される塩基配列において、塩基番号1539、1551、1571、1579、1581、1585、1595、1598、1601、1621、1632、1638、1645、1648、1665、1667、1680、1698、1710、1724、1726、1756等で示される塩基番号であるシトシンを挙げることができる。

また具体的には例えば、有用タンパク質遺伝子が、p53-responsive gene 2遺伝子である場合には、そのプロモーター領域、非翻訳領域又は翻訳領域（コーディング領域）の塩基配列中に存在する一つ以上のＣｐＧで示される塩基配列としては、ヒト由来のp53-responsive gene 2遺伝子のエクソン１と、その５’上流に位置するプロモーター領域とが含まれるゲノムＤＮＡの塩基配列を挙げることができ、より具体的には、配列番号１０で示される塩基配列（Genbank Accession No.AC009471に記載される塩基配列の塩基番号113501〜116000で示される塩基配列の相補的配列に相当する。）が挙げられる。配列番号１０で示される塩基配列においては、ヒト由来のp53-responsive gene 2遺伝子のエクソン１の塩基配列は、塩基番号1558〜1808に示されている。配列番号１０で示される塩基配列中に存在するＣｐＧで示される塩基配列中のシトシンは、例えば、膵臓癌細胞等の癌細胞において高いメチル化頻度（即ち、高メチル化状態（hypermethylation））を示す。さらに具体的には、膵臓癌細胞においてメチル化頻度が高いシトシンとしては、例えば、配列番号１０で示される塩基配列において、塩基番号1282、1284、1301、1308、1315、1319、1349、1351、1357、1361、1365、1378、1383等で示される塩基番号であるシトシンを挙げることができる。

また具体的には例えば、有用タンパク質遺伝子が、Fibrillin2遺伝子である場合には、そのプロモーター領域、非翻訳領域又は翻訳領域（コーディング領域）の塩基配列中に存在する一つ以上のＣｐＧで示される塩基配列としては、ヒト由来のFibrillin2遺伝子のエクソン１と、その５’上流に位置するプロモーター領域とが含まれるゲノムＤＮＡの塩基配列を挙げることができ、より具体的には、配列番号１１で示される塩基配列（Genbank Accession No.AC113387に記載される塩基配列の塩基番号118801〜121000で示される塩基配列の相補的配列に相当する。）が挙げられる。配列番号１１で示される塩基配列においては、ヒト由来のFibrillin2遺伝子のエクソン１の塩基配列は、塩基番号1091〜1345に示されている。配列番号１１で示される塩基配列中に存在するＣｐＧで示される塩基配列中のシトシンは、例えば、膵臓癌細胞等の癌細胞において高いメチル化頻度（即ち、高メチル化状態（hypermethylation））を示す。さらに具体的には、膵臓癌細胞においてメチル化頻度が高いシトシンとしては、例えば、配列番号１１で示される塩基配列において、塩基番号679、687、690、699、746、773、777、783、795、799、812、823、830、834、843等で示される塩基番号であるシトシンを挙げることができる。

また具体的には例えば、有用タンパク質遺伝子が、Neurofilament3遺伝子である場合には、そのプロモーター領域、非翻訳領域又は翻訳領域（コーディング領域）の塩基配列中に存在する一つ以上のＣｐＧで示される塩基配列としては、ヒト由来のNeurofilament3遺伝子のエクソン１と、その５’上流に位置するプロモーター領域とが含まれるゲノムＤＮＡの塩基配列を挙げることができ、より具体的には、配列番号１２で示される塩基配列（Genbank Accession No.AF106564に記載される塩基配列の塩基番号28001〜30000で示される塩基配列の相補的配列に相当する。）が挙げられる。配列番号１２で示される塩基配列においては、ヒト由来のNeurofilament3遺伝子のエクソン１の塩基配列は、塩基番号614〜1694に示されている。配列番号１２で示される塩基配列中に存在するＣｐＧで示される塩基配列中のシトシンは、例えば、膵臓癌細胞等の癌細胞において高いメチル化頻度（即ち、高メチル化状態（hypermethylation））を示す。さらに具体的には、膵臓癌細胞においてメチル化頻度が高いシトシンとしては、例えば、配列番号１２で示される塩基配列において、塩基番号428、432、443、451、471、475、482、491、499、503、506、514、519、532、541、544、546、563、566、572、580等で示される塩基番号であるシトシンを挙げることができる。

また具体的には例えば、有用タンパク質遺伝子が、disintegrin and metalloproteinase domain 23遺伝子である場合には、そのプロモーター領域、非翻訳領域又は翻訳領域（コーディング領域）の塩基配列中に存在する一つ以上のCpGで示される塩基配列としては、ヒト由来のdisintegrin and metalloproteinase domain 23遺伝子のエクソン１と、その５’上流に位置するプロモーター領域とが含まれるゲノムＤＮＡの塩基配列を挙げることができ、より具体的には、配列番号１３で示される塩基配列（Genbank Accession No.AC009225に記載される塩基配列の塩基番号21001〜23300で示される塩基配列に相当する。）が挙げられる。配列番号１３で示される塩基配列においては、ヒト由来のdisintegrin and metalloproteinase domain 23遺伝子のエクソン１の塩基配列は、塩基番号1194〜1630に示されている。配列番号１３で示される塩基配列中に存在するＣｐＧで示される塩基配列中のシトシンは、例えば、膵臓癌細胞等の癌細胞において高いメチル化頻度（即ち、高メチル化状態（hypermethylation））を示す。さらに具体的には、膵臓癌細胞においてメチル化頻度が高いシトシンとしては、例えば、配列番号１３で示される塩基配列において、塩基番号998、1003、1007、1011、1016、1018、1020、1026、1028、1031、1035、1041、1043、1045、1051、1053、1056、1060、1066、1068、1070、1073、1093、1096、1106、1112、1120、1124、1126等で示される塩基番号であるシトシンを挙げることができる。

また具体的には例えば、有用タンパク質遺伝子が、G protein-coupled receptor 7遺伝子である場合には、そのプロモーター領域、非翻訳領域又は翻訳領域（コーディング領域）の塩基配列中に存在する一つ以上のＣｐＧで示される塩基配列としては、ヒト由来のG protein-coupled receptor 7遺伝子のエクソン１と、その５’上流に位置するプロモーター領域とが含まれるゲノムＤＮＡの塩基配列を挙げることができ、より具体的には、配列番号１４で示される塩基配列（Genbank Accession No.AC009800に記載される塩基配列の塩基番号75001〜78000で示される塩基配列に相当する。）が挙げられる。配列番号１４で示される塩基配列においては、ヒト由来のG protein-coupled receptor 7遺伝子のエクソン１の塩基配列は、塩基番号1666〜2652に示されている。配列番号１４で示される塩基配列中に存在するＣｐＧで示される塩基配列中のシトシンは、例えば、膵臓癌細胞等の癌細胞において高いメチル化頻度（即ち、高メチル化状態（hypermethylation））を示す。さらに具体的には、膵臓癌細胞においてメチル化頻度が高いシトシンとしては、例えば、配列番号１４で示される塩基配列において、塩基番号1480、1482、1485、1496、1513、1526、1542、1560、1564、1568、1570、1580、1590、1603、1613、1620等で示される塩基番号であるシトシンを挙げることができる。

また具体的には例えば、有用タンパク質遺伝子が、G-protein coupled somatostatin and angiotensin-like peptide receptor遺伝子である場合には、そのプロモーター領域、のプロモーター領域、非翻訳領域又は翻訳領域（コーディング領域）の塩基配列中に存在する一つ以上のＣｐＧで示される塩基配列としては、ヒト由来のG-protein coupled somatostatin and angiotensin-like peptide receptor遺伝子のエクソン１と、その５’上流に位置するプロモーター領域とが含まれるゲノムＤＮＡの塩基配列を挙げることができ、より具体的には、配列番号１５で示される塩基配列（Genbank Accession No.AC008971に記載される塩基配列の塩基番号57001〜60000で示される塩基配列の相補的配列に相当する。）が挙げられる。配列番号１５で示される塩基配列においては、ヒト由来のG-protein coupled somatostatin and angiotensin-like peptide receptor遺伝子のエクソン１の塩基配列は、塩基番号776〜2632に示されている。配列番号１５で示される塩基配列中に存在するＣｐＧで示される塩基配列中のシトシンは、例えば、膵臓癌細胞等の癌細胞において高いメチル化頻度（即ち、高メチル化状態（hypermethylation））を示す。さらに具体的には、膵臓癌細胞においてメチル化頻度が高いシトシンとしては、例えば、配列番号１５で示される塩基配列において、塩基番号470、472、490、497、504、506、509、514、522、540、543、552、566、582、597、610、612等で示される塩基番号であるシトシンを挙げることができる。

また具体的には例えば、有用タンパク質遺伝子が、Solute carrier family 6 neurotransmitter transporter noradrenalin member 2遺伝子である場合には、そのプロモーター領域、非翻訳領域又は翻訳領域（コーディング領域）の塩基配列中に存在する一つ以上のＣｐＧで示される塩基配列としては、ヒト由来のSolute carrier family 6 neurotransmitter transporter noradrenalin member 2遺伝子のエクソン１と、その５’上流に位置するプロモーター領域とが含まれるゲノムＤＮＡの塩基配列を挙げることができ、より具体的には、配列番号１６で示される塩基配列（Genbank Accession No.AC026802に記載される塩基配列の塩基番号78801〜81000で示される塩基配列の相補的配列に相当する。）が挙げられる。配列番号１６で示される塩基配列においては、ヒト由来のSolute carrier family 6 neurotransmitter transporter noradrenalin member 2遺伝子のエクソン１の塩基配列は、塩基番号1479〜1804に示されている。配列番号１６で示される塩基配列中に存在するＣｐＧで示される塩基配列中のシトシンは、例えば、膵臓癌細胞等の癌細胞において高いメチル化頻度（即ち、高メチル化状態（hypermethylation））を示す。さらに具体的には、膵臓癌細胞においてメチル化頻度が高いシトシンとしては、例えば、配列番号１６で示される塩基配列において、塩基番号1002、1010、1019、1021、1051、1056、1061、1063、1080、1099、1110、1139、1141、1164、1169、1184等で示される塩基番号であるシトシンを挙げることができる。

本発明測定方法における「メチル化されたＤＮＡを検出若しくは定量」の検出とは、メチル化ＤＮＡ抗体又は本オリゴヌクレオチドが検出されたか否かにより、目的とするＤＮＡ領域においてメチル化されたＤＮＡが存在しているか否の判別が可能であるということであり、メチル化ＤＮＡ抗体又は本オリゴヌクレオチドが検出された場合、検体中に、目的とするＤＮＡ領域においてメチル化されたＤＮＡが存在していたことを示しており、メチル化ＤＮＡ抗体又は本オリゴヌクレオチドが検出されなかった場合、検体中に、目的とするＤＮＡ領域においてメチル化されたＤＮＡの存在量が検出限界未満であることを示している。

本発明測定方法における「メチル化されたＤＮＡを検出若しくは定量」の定量とは、定量されたメチル化ＤＮＡ抗体又は本オリゴヌクレオチドの量から、検体中での目的とするＤＮＡ領域においてメチル化されたＤＮＡの量を概算したものであり、例えば、検体が１mLの血清であった場合、血清１mL中に含まれるメチル化された目的領域のＤＮＡの量を意味する。

本発明測定方法の第一工程において、生物由来検体中に含まれるゲノムＤＮＡ由来のＤＮＡ試料から一本鎖ＤＮＡを取得する。この場合、例えば生物由来検体中に含まれるゲノムＤＮＡ由来のＤＮＡ試料に含まれる二本鎖ＤＮＡを一本鎖状態に分離して、この一本鎖ＤＮＡを取得してもよく、或いは生物由来検体中に元来存在する一本鎖ＤＮＡを取得してもよい。更に具体的には例えば、二本鎖ＤＮＡにアニーリングバッファーを添加することにより、混合物を得る。次いで、得られた混合物を９５℃で約３０秒間ボイルし、その後、数分間、氷冷水上で急冷する。例えば、血液等に含まれる遊離ＤＮＡが一本鎖ＤＮＡの可能性がある。従って、生物由来検体中に含まれるゲノムＤＮＡが一本鎖ＤＮＡである場合には、この操作は必要ではない。

本発明測定方法の第二工程における「メチル化ＤＮＡ抗体」とは、ＤＮＡ中のメチル化された塩基を抗原として結合する抗体を意味する。具体的にば、メチルシトシン抗体であり、一本鎖ＤＮＡ中の５位がメチル化されたシトシンを認識して結合する性質を有している抗体を挙げることができ、よく、より具体的には、メチルシトシン抗体が挙げられる。また、市販されているメチル化ＤＮＡ抗体であっても、本特許記載のメチル化状態のＤＮＡを特異的に認識して、特異的に結合できる抗体であればよい。
メチル化ＤＮＡ抗体は、メチル化された塩基を抗原として、通常の免疫学的手法により作製できる。具体的にメチルシトシン抗体を作成するためには、５−メチルシチジン、５−メチルシトシン又は５−メチルシトシンを含むＤＮＡ等を抗原として作製された抗体からＤＮＡ中のメチルシトシンへの特異的な結合を指標として選抜することにより得ることができる。
動物に抗原を免疫して得られる抗体としては、精製した抗原を免疫した後、ＩｇＧ画分の抗体（ポリクローナル抗体）を利用する方法と、単一のクローンを生産する抗体（モノクローナル抗体）を利用する方法がある。本発明測定方法ではメチル化塩基を特異的に認識できる抗体であることが望ましいため、モノクローナル抗体を利用することが望ましい。
モノクローナル抗体を作製する方法としては、細胞融合法による方法を挙げることができる。例えば、細胞融合法は免疫したマウス由来の脾細胞（Ｂ細胞）と骨髄腫細胞とを細胞融合させることでハイブリドーマを作製し、作製されたハイブリドーマの生産する抗体を選抜して、メチルシトシン抗体（モノクローナル抗体）を作製すれば良い。細胞融合法でモノクローナル抗体を作製する場合には、抗原を精製する必要がなく、例えば、５−メチルシチジン、５−メチルシトシン又は５−メチルシトシンを含むＤＮＡ等の混合物を抗原として、免疫に用いる動物に投与できる。投与方法としては、５−メチルシチジン、５−メチルシトシン又は５−メチルシトシンを含むＤＮＡ等を、直接、抗体を産生させるマウスへ投与する。抗体が産生されにくい場合には、抗原を支持体へ結合させて免疫しても良い。また、アジュバント溶液（例えば、流動パラフィンとＡｒａｃｅｌＡを混合し、アジュバントとして結核菌の死菌を混合したもの）と抗原とをよく混合することや、リポソームに組み入れて免疫することで、抗原の免疫性を向上させることができる。また、抗原を含む溶液とアジュバント溶液とを等量添加し、十分に乳液状にした後、当該混合物をマウスの皮下若しくは腹腔内に注射する方法や、ミョウバン水とよく混合してから百日咳死菌をアジュバントとして添加する方法がある。尚、最初の免疫をしてから適当な期間の後、マウスの腹腔内又は静脈内に追加免疫することもできる。また、抗原の量が少ない場合には、抗原が浮遊する溶液を直接マウス脾臓に注入して免疫しても良い。
最終免疫から数日後に脾臓を摘出し脂肪組織を剥離してから、脾細胞浮遊液を作製する。この脾細胞と、例えば、ＨＧＰＲＴ欠損骨髄腫細胞とを細胞融合してハイブリドーマを作製する。細胞融合剤としては脾細胞（Ｂ細胞）と骨髄腫細胞とを効率的に融合できる方法ならば何でもよく、例えば、センダイウイルス（ＨＶＪ）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を用いる方法等が挙げられる。また、高電圧パルスを用いる方法で細胞融合をしても良い。
細胞融合操作の後、ＨＡＴ培地で培養し、脾細胞と骨髄腫細胞とが融合したハイブリドーマのクローンを選択し、スクリーニングが可能になるまで細胞が成育するのを待つ。目的とする抗体を生産するハイブリドーマを選択するための抗体の検出法や抗体力価の測定法には、抗原抗体反応系を利用できる。具体的には、可溶性抗原に対する抗体測定法で、放射性同位元素免疫定量法（ＲＩＡ）、酵素免疫定量法（ＥＬＩＳＡ）等が挙げられる。
メチル化ＤＮＡ抗体の性質（１つのメチル化された塩基（シトシン）に１つの抗体が結合すること）から考えると、目的とするＤＮＡ領域としては、数多くのメチル化された塩基（シトシン）、即ちＣｐＧ、が存在する領域を選抜することが望ましく、定量精度及び検出感度の向上が期待できる。

本発明測定方法の第二工程における「本オリゴヌクレオチド」は、メチル化ＤＮＡ抗体と目的とするＤＮＡ領域においてメチル化されたＤＮＡとの結合を阻害せず且つ前記の一本鎖ＤＮＡと結合し得るオリゴヌクレオチドであり、例えば、目的とするＤＮＡ領域を含む一本鎖ＤＮＡと結合しうる塩基配列を有しており、且つ、目的とするＤＮＡ領域を含む一本鎖ＤＮＡと結合した際、メチル化ＤＮＡ抗体の目的とするＤＮＡ領域を含む一本鎖ＤＮＡ中のメチル化された塩基（シトシン）への結合を阻害しないオリゴヌクレオチドである。
「目的とするＤＮＡ領域を含む一本鎖ＤＮＡと結合しうる塩基配列」とは、目的とするＤＮＡ領域を含む一本鎖ＤＮＡとの結合体（二本鎖）を形成するために必要な塩基配列、即ち、目的とするＤＮＡ領域の塩基配列の一部に相補的な塩基配列を含む塩基配列、又は、目的とするＤＮＡ領域の５’末端よりさらに５’末端側ＤＮＡ領域の塩基配列の一部に相補的な塩基配列を含む塩基配列、又は、目的とするＤＮＡ領域の３’末端よりさらに３’末端側の塩基配列の一部に相補的な塩基配列を含む塩基配列、であることを意味する。
また「メチル化ＤＮＡ抗体と目的とするＤＮＡ領域においてメチル化されたＤＮＡとの結合を阻害せず」とは、本オリゴヌクレオチドの塩基配列が、メチル化ＤＮＡ抗体がメチル化された一本鎖ＤＮＡへの結合に要する占有空間内で、本オリゴヌクレオチドと前記一本鎖ＤＮＡの相補的な結合がおこらないような塩基配列であることを意味する。即ち、メチル化ＤＮＡ抗体がメチル化された塩基（シトシン）に結合するには、直接結合するメチル化された塩基（シトシン）のみならず、メチル化された塩基（シトシン）の存在する周辺空間も占有すると考えられる。故に、本オリゴヌクレオチドは、メチル化ＤＮＡ抗体がメチル化されたＤＮＡに結合する際に要する占有空間で、前記一本鎖ＤＮＡと相補的な結合をしないものであれば良い。前記一本鎖ＤＮＡに結合させる本オリゴヌクレオチドは、１種類である必要は無く、メチル化ＤＮＡ抗体の結合を阻害しなければ、２種類以上用いても良い。複数の本オリゴヌクレオチドを使用すれば、定量精度及び検出感度を向上させることができる。

本発明測定方法の第二工程で形成される複合体、又は、第二工程の複合体を形成させる過程において生じる第一工程で取得された一本鎖ＤＮＡと、メチル化ＤＮＡ抗体と目的とするＤＮＡ領域を含む一本鎖ＤＮＡの中に存在するメチル化された塩基との結合を阻害しないオリゴヌクレオチドとの結合体、を形成させる際の好ましい態様としては、二価陽イオンを含有する反応系中で形成させることを挙げることができる。より好ましくは、二価陽イオンがマグネシウムイオンであることが挙げられる。ここで「二価陽イオンを含有する反応系」とは、本発明測定方法の第二工程で形成される複合体、又は、第二工程の複合体を形成させる過程において生じる第一工程で取得された一本鎖ＤＮＡと、メチル化ＤＮＡ抗体と目的とするＤＮＡ領域を含む一本鎖ＤＮＡの中に存在するメチル化された塩基との結合を阻害しないオリゴヌクレオチドとの結合体、を形成させるために用いられるアニーリングバッファーの中に二価陽イオンを含有するような反応系を意味し、具体的には例えば、マグネシウムイオンを構成要素とする塩（例えば、ＭｇＯＡｃ_２、ＭｇＣｌ_２等）を１ｍＭ〜６００ｍＭの範囲の濃度で含むことが良い。

本発明測定方法の第二工程における「複合体を形成」とは、第一工程で取得された一本鎖ＤＮＡと、本オリゴヌクレオチドと、メチル化ＤＮＡ抗体とが結合した状態の混合物を意味する。

本発明測定方法の第二工程における「複合体を分離する」には、前記の複合体を支持体に結合させて固定することで可能となる。支持体としては、複合体が結合可能な支持体であれば、材質及び形状は何でも良い。例えば、形状は、使用目的に適っていればよく、チューブ状、テストプレート状、フィルター状、ディスク状、ビーズ状等が挙げられる。また、材質としては、通常の免疫測定法用支持体として用いられるもの、例えば、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリアクリルアミド、ポリメタクリル酸メチル、ポリスルホン、ポリアクリロニトリル、ナイロン等の合成樹脂、又は、前記合成樹脂にスルホン基、アミノ基等の反応性官能基を導入したものでも良い。また、ガラス、多糖類若しくはその誘導体（セルロース、ニトロセルロース等）、シリカゲル、多孔性セラミックス、金属酸化物等でも良い。

複合体を分離するための、複合体を支持体に結合させて固定する方法としては、メチル化ＤＮＡ抗体を支持体に固定化する方法と、本オリゴヌクレオチドを支持体に固定化する方法の２種類が挙げられる。従って、本発明測定方法の第二工程における「複合体を形成させると同時に若しくは形成させた後、当該複合体を分離する」とは、具体的には、「目的とするＤＮＡ領域においてメチル化されたＤＮＡを含む一本鎖ＤＮＡと、本オリゴヌクレオチドと、支持体に固定化可能なメチル化ＤＮＡ抗体とを同時若しくは順次結合させ、複合体を形成させると同時に若しくは形成させた後、当該複合体に含まれる、支持体に固定化可能なメチル化ＤＮＡ抗体を支持体に固定化し、複合体を分離する」か、又は、「目的とするＤＮＡ領域においてメチル化されたＤＮＡを含む一本鎖ＤＮＡと、支持体に固定化可能な本オリゴヌクレオチドと、メチル化ＤＮＡ抗体とを同時若しくは順次結合させ、複合体を形成させると同時に若しくは形成させた後、当該複合体に含まれる支持体に固定化可能な本オリゴヌクレオチドを支持体に固定化し、複合体を分離する」ことを意味する。尚、目的とするＤＮＡ領域においてメチル化されたＤＮＡを含む一本鎖ＤＮＡをメチル化ＤＮＡ抗体を介して支持体に結合する場合には、本オリゴヌクレオチドをその機能（後述）により検出若しくは定量し、目的とするＤＮＡ領域においてメチル化されたＤＮＡを含む一本鎖ＤＮＡを本オリゴヌクレオチドを介して支持体に結合した場合には、メチル化ＤＮＡ抗体をその機能（後述）により検出若しくは定量することとなる。

メチル化ＤＮＡ抗体が支持体に固定化され得るものとして使用される場合には、メチル化ＤＮＡ抗体が、最終的に、目的とするＤＮＡ領域においてメチル化されたＤＮＡを含む一本鎖ＤＮＡと、本オリゴヌクレオチドとの複合体を形成した状態で支持体に固定化できればよく、
（１）前記一本鎖ＤＮＡとメチル化ＤＮＡ抗体との結合前の段階で、メチル化ＤＮＡ抗体が支持体へ固定化されていても良く、また、
（２）前記一本鎖ＤＮＡとメチル化ＤＮＡ抗体との結合後の段階で、メチル化ＤＮＡ抗体が支持体へ固定化されていても良い。
メチル化ＤＮＡ抗体を支持体へ固定するためには、具体的には、メチル化ＤＮＡ抗体をビオチン化して得られたビオチン化メチル化ＤＮＡ抗体をストレプトアビジンで被覆した支持体（例えば、ストレプトアビジンで被覆したＰＣＲチューブ、ストレプトアビジンで被覆した磁気ビーズ、ストレプトアビジンで一部を被覆したクロマトストリップ等）に固定する方法を挙げることができる。
また、メチル化ＤＮＡ抗体に、アミノ基、チオール基、アルデヒド基等の活性官能基を有する分子を共有結合させた後、これをシランカップリング剤等で表面を活性化させたガラス、多糖類誘導体、シリカゲル、又は前記合成樹脂等或いは耐熱性プラスチック製の支持体に共有結合させる方法もある。尚、前記の共有結合は、例えば、メチル化ＤＮＡ抗体に前記の活性官能基を有する分子を、トリグリセライドを５個直列に連結して成るようなスペーサー、クロスリンカー等を用いて共有結合させればよい。
尚、メチル化ＤＮＡ抗体を直接支持体に固定化してもよく、また、メチル化ＤＮＡ抗体に対する抗体（二次抗体）を支持体に固定化し、二次抗体にメチル化抗体を結合させることで支持体に固定しても良い。

本オリゴヌクレオチドが支持体に固定化され得るものとして使用される場合には、本オリゴヌクレオチドが、最終的に、目的とするＤＮＡ領域においてメチル化されたＤＮＡを含む一本鎖ＤＮＡとメチル化ＤＮＡ抗体との複合体を形成した状態で支持体に固定化できればよく、
（１）前記一本鎖ＤＮＡと本オリゴヌクレオチドとの結合前の段階で、本オリゴヌクレオチドが支持体へ固定化されていても良く、また、
（２）前記一本鎖ＤＮＡと本オリゴヌクレオチドとの結合後の段階で、本オリゴヌクレオチドが支持体へ固定化されても良い。
本オリゴヌクレオチドを支持体に固定化するためには、具体的には、本オリゴヌクレオチドの５’末端若しくは３’末端をビオチン化して得られたビオチン化オリゴヌクレオチドをストレプトアビジンで被覆した支持体支持体（例えば、ストレプトアビジンで被覆したＰＣＲチューブ、ストレプトアビジンで被覆した磁気ビーズ、ストレプトアビジンで一部を被覆したクロマトストリップ等）に固定する方法を挙げることができる。
また、本オリゴヌクレオチドの５’末端若しくは３’末端に、アミノ基、チオール基、アルデヒド基等の活性官能基を有する分子を共有結合させた後、これをシランカップリング剤等で表面を活性化させたガラス、多糖類誘導体、シリカゲル、又は前記合成樹脂等或いは耐熱性プラスチック製の支持体に共有結合させる方法もある。尚、前記の共有結合は、例えば、トリグリセライドを５個直列に連結して成るようなスペーサー、クロスリンカー等を用いて共有結合させればよい。またさらに、ガラス若しくはシリコン製の支持体の上で直接、本オリゴヌクレオチドの末端側から化学合成させる方法であってもよい。

本発明測定方法の第二工程において「複合体を形成させると同時に若しくは形成させた後、当該複合体を分離する」には、「目的とするＤＮＡ領域においてメチル化されたＤＮＡを含む一本鎖ＤＮＡと、本オリゴヌクレオチドと、支持体に固定化可能なメチル化ＤＮＡ抗体を結合させ、複合体を形成させると同時に若しくは形成させた後、支持体に固定化可能なメチル化ＤＮＡ抗体を支持体に固定化し、複合体を分離する」場合、具体的には例えば、支持体に固定化可能なメチル化ＤＮＡ抗体として、「ビオチン標識されたビオチン化メチル化ＤＮＡ抗体」を使用して、以下のように実施すれば良い。
（ａ）ビオチン化メチル化ＤＮＡ抗体を適当量（例えば、4μg/mL溶液を100μL/ウエル）アビジン被覆プレートに添加し、その後、室温で、例えば、約２時間静置することにより、ビオチン化メチル化ＤＮＡ抗体とストレプトアビジンとの固定化を促す。その後、残溶液の除去及び洗浄を行う。洗浄バッファー（例えば、0.05% Tween20含有リン酸バッファー（1mM KH₂PO₄、3mM Na2HPO 7H2O、154mM NaCl pH7.4））を、例えば３００μＬ/ウエルの割合で添加し、溶液を取り除く。この洗浄操作を数回繰り返し、支持体に固定化されたビオチン化メチルシトシン抗体をウエル上に残す。
（ｂ）生物由来検体中に含まれるゲノムＤＮＡ由来のＤＮＡ試料に含まれる二本鎖ＤＮＡを分離させて得られた一本鎖ＤＮＡと、本オリゴヌクレオチドと、アニーリングバッファー（例えば、33mM Tris-Acetate pH 7.9、66mM KOAc、10mM MgOAc₂、0.5mM Dithothreitol）とを混合して、９５℃で例えば数分間加熱する。その後、目的とするＤＮＡ領域を含む一本鎖ＤＮＡと本オリゴヌクレオチドとの結合体を形成させるために、本オリゴヌクレオチドのＴｍ値の約１０〜２０℃低い温度まで速やかに冷却し、その温度で例えば数分間保温し、その後、室温に戻す（この段階で形成された結合体は、目的とするＤＮＡ領域においてメチル化されたＤＮＡを含む一本鎖ＤＮＡと本オリゴヌクレオチドとの結合体の他、目的とするＤＮＡ領域においてメチル化されたＤＮＡを含まない一本鎖ＤＮＡと本オリゴヌクレオチドとの結合体を含んでいる。）。
（ｃ）形成された一本鎖ＤＮＡと本オリゴヌクレオチドとの結合体を、ビオチン化メチル化ＤＮＡ抗体が固定化されたアビジン被覆プレートに添加し、その後、室温で約３時間静置し、ビオチン化メチル化ＤＮＡ抗体と、前記一本鎖ＤＮＡのうち目的とするＤＮＡ領域においてメチル化されたＤＮＡを含む一本鎖ＤＮＡと、本オリゴヌクレオチドとの複合体の形成を促す（複合体の形成）（この段階で、メチル化されてない目的とするＤＮＡ領域を含む一本鎖ＤＮＡと本オリゴヌクレオチドとの結合体は、複合体を形成しない。）。その後、残溶液の除去及び洗浄を行う。洗浄バッファー（例えば、0.05% Tween20含有リン酸バッファー（1mM KH₂PO₄、3mM Na2HPO 7H2O、154mM NaCl pH7.4））を、例えば３００μＬ/ウエルの割合で添加し、溶液を取り除く。この洗浄操作を数回繰り返すことにより、複合体をウエル上に残す（複合体の分離）。
（ｂ）において使用するアニーリングバッファーとしては、本オリゴヌクレオチドと、目的とするＤＮＡ領域を含む一本鎖ＤＮＡとを結合させるのに適していれば良く、前記アニーリングバッファーに限られるわけではない。二価イオン、望ましくはマグネシウムイオンが１〜６００ｍＭの濃度で溶解しているものを使用すれば結合の安定性が増加する。
（ａ）及び（ｃ）における洗浄操作は、溶液中に浮遊している固定化されていないメチル化ＤＮＡ抗体と、メチル化ＤＮＡ抗体に結合しなかった溶液中に浮遊しているメチル化されていない一本鎖ＤＮＡと、本オリゴヌクレオチドとの結合体を形成しなかった目的とする領域以外の一本鎖ＤＮＡ、又は、後述の制限酵素で消化された溶液中に浮遊しているＤＮＡ等を反応溶液から取り除くため重要である。尚、洗浄バッファーは、上記の遊離のメチル化ＤＮＡ抗体、溶液中に浮遊している一本鎖ＤＮＡ等の除去に適していれば良く、前記洗浄バッファーに限らず、ＤＥＬＦＩＡバッファー（Perkin Elmer社製、Tris-HCl pH 7.8 with Tween 80）、ＴＥバッファー等でも良い。
因みに、前述の如く、上記（ａ）〜（ｃ）では、前記の目的とするＤＮＡ領域を含む一本鎖ＤＮＡと、本オリゴヌクレオチドとの結合の後、生じる結合体にビオチン化メチル化ＤＮＡ抗体を結合させ、複合体を形成しているが、この順番に限られるわけではない。即ち、前記の目的とするＤＮＡ領域を含む一本鎖ＤＮＡとビオチン化メチル化ＤＮＡ抗体とを結合させた後、生じる結合体に本オリゴヌクレオチドを結合させ、複合体を形成しても良い。例えば、ストレプトアビジンで被覆した支持体に固定化されたビオチン化メチル化ＤＮＡ抗体に、生物由来検体中に含まれるゲノムＤＮＡ由来のＤＮＡ試料に含まれる二本鎖ＤＮＡを分離して得られた一本鎖ＤＮＡを添加することにより、支持体に固定化されたビオチン化メチル化ＤＮＡ抗体と当該一本鎖ＤＮＡとの結合体を形成させる（この段階で形成された結合体は、目的とするＤＮＡ領域においてメチル化されたＤＮＡを含む一本鎖ＤＮＡとメチル化抗体との結合体の他、目的とするＤＮＡ領域以外のメチル化された一本鎖ＤＮＡとメチル化抗体との結合体を含んでいる。）。その後、これに本オリゴヌクレオチドを添加して、前記結合体のうち目的とするＤＮＡ領域においてメチル化されたＤＮＡを含む一本鎖ＤＮＡを有する結合体との複合体を形成させ、分離しても良い（この段階で、目的とするＤＮＡ領域以外の領域におけるメチル化されたＤＮＡを含む一本鎖ＤＮＡとメチル化抗体との結合体は複合体を形成しない。）。

上記（ａ）〜（ｃ）の操作を、クロマトストリップを用いて行うことも可能である。その場合には、具体的には以下のように実施する。例えば、まず、ビオチン化メチル化ＤＮＡ抗体の適当量を、ストレプトアビジンで一部を被覆したクロマトストリップにより展開する。当該操作により、ビオチン化メチル化ＤＮＡ抗体が、ストレプトアビジンで被覆された部分に固定化されることになる。次いで、（ｂ）で得られた前記一本鎖ＤＮＡと本オリゴヌクレオチドとの結合体（この段階で形成された結合体は、目的とするＤＮＡ領域においてメチル化されたＤＮＡを含む一本鎖ＤＮＡと本オリゴヌクレオチドとの結合体の他、目的とするＤＮＡ領域においてメチル化されたＤＮＡを含まない一本鎖ＤＮＡと本オリゴヌクレオチドとの結合体を含んでいる。）を、前記のクロマトストリップにより展開する。これら操作により、生物由来検体中に含まれるゲノムＤＮＡ由来のＤＮＡ試料に含まれる二本鎖ＤＮＡを分解して得られた一本鎖ＤＮＡと、本オリゴヌクレオチドと、ビオチン化メチル化ＤＮＡ抗体とからなる複合体が、ストレプトアビジンで被覆した部分に固定化されることになる（複合体の形成・選択）（この段階で、目的とするＤＮＡ領域においてメチル化されたＤＮＡを含まない一本鎖ＤＮＡと本オリゴヌクレオチドとの結合体は、複合体を形成しない。）。複合体形成の順番については、これら操作の順に限られるわけではない。例えば、目的とするＤＮＡ領域においてメチル化されたＤＮＡを含む一本鎖ＤＮＡと、本オリゴヌクレオチドと、ビオチン化メチル化ＤＮＡ抗体とからなる複合体を形成させた後、これをクロマトストリップで展開し、ストレプトアビジンで被覆した部分に、当該複合体を固定化しても良い。これら操作では、溶液をクロマトストリップにより展開することで不要な成分を除去することができ、洗浄操作を省略することが可能となる。勿論、各操作間に、洗浄操作（洗浄バッファー（例えば、0.05% Tween20含有リン酸バッファー（1mM KH₂PO₄、3mM Na2HPO 7H2O、154mM NaCl pH7.4）によるクロマトストリップの展開）を実施しても何ら問題はない。

また他として、本発明測定方法の第二工程において「複合体を形成させると同時に若しくは形成させた後、当該複合体を分離する」には、「目的とするＤＮＡ領域においてメチル化されたＤＮＡを含む一本鎖ＤＮＡと、本オリゴヌクレオチドと、支持体に固定化可能なメチル化ＤＮＡ抗体を結合させ、複合体を形成させると同時に若しくは形成させた後、支持体に固定化可能なメチル化ＤＮＡ抗体を支持体に固定化し、複合体を分離する」場合、具体的には例えば、支持体に固定化可能なメチル化ＤＮＡ抗体として、「ビオチン標識されたビオチン化メチル化ＤＮＡ抗体」を使用して、以下のように実施すれば良い。
（ａ）生物由来検体中に含まれるゲノムＤＮＡ由来のＤＮＡ試料に、アニーリングバッファー（例えば、33mM Tris-Acetate pH 7.9、66mM KOAc、10mM MgOAc₂、0.5mM Dithothreitol）及びビオチン化本オリゴヌクレオチドを添加することにより、混合物を得る。次いで、得られた混合物を、生物由来検体中に含まれるゲノムＤＮＡ由来のＤＮＡ試料に含まれる二本鎖ＤＮＡを分離して一本鎖ＤＮＡを得るために、９５℃で例えば数分間加熱する。その後、目的とするＤＮＡ領域を含む一本鎖ＤＮＡとビオチン化本オリゴヌクレオチドとの結合体を形成させるために、ビオチン化本オリゴヌクレオチドのＴｍ値の約１０〜２０℃低い温度まで速やかに冷却し、その温度で例えば数分間保温し、その後、室温に戻す（この段階で形成された結合体は、目的とするＤＮＡ領域においてメチル化されたＤＮＡを含む一本鎖ＤＮＡと本オリゴヌクレオチドとの結合体の他、目的とするＤＮＡ領域においてメチル化されたＤＮＡを含まない一本鎖ＤＮＡと本オリゴヌクレオチドとの結合体を含んでいる。）。
（ｂ）ストレプトアビジンで被覆した支持体に、上記（ａ）で得られた混合物を添加し、さらに、これを３７℃で例えば数分間保温することにより、目的とするＤＮＡ領域を含む一本鎖ＤＮＡとビオチン化本オリゴヌクレオチドとの結合体をストレプトアビジンで被覆した支持体に固定する。その後、残溶液の除去及び洗浄を行う。洗浄バッファー（例えば、0.05% Tween20含有リン酸バッファー（1mM KH₂PO₄、3mM Na2HPO 7H2O、154mM NaCl pH7.4））を、例えば３００μＬ/ウエルの割合で添加し、溶液を取り除く。この洗浄操作を数回繰り返し、支持体に固定化されたビオチン化本オリゴヌクレオチドと目的とするＤＮＡ領域を含む一本鎖ＤＮＡとの結合体をウエル上に残す（この段階でも結合体は、目的とするＤＮＡ領域においてメチル化されたＤＮＡを含む一本鎖ＤＮＡと本オリゴヌクレオチドとの結合体の他、目的とするＤＮＡ領域においてメチル化されたＤＮＡを含まない一本鎖ＤＮＡと本オリゴヌクレオチドとの結合体を含んでいる。）。
（ｃ）メチル化ＤＮＡ抗体を適当量（例えば、4μg/mL溶液を100μL/ウエル）ウエルに添加し、その後、室温で、例えば、約３時間静置することにより、メチル化ＤＮＡ抗体と、前記一本鎖ＤＮＡのうち目的とするＤＮＡ領域においてメチル化されたＤＮＡを含む一本鎖ＤＮＡと、ビオチン化本オリゴヌクレオチドとの複合体の形成を促す（複合体の形成）（この段階で、目的とするＤＮＡ領域においてメチル化されたＤＮＡを含まない一本鎖ＤＮＡと本オリゴヌクレオチドとの結合体は、複合体を形成しない。）。その後、残溶液の除去及び洗浄を行う。洗浄バッファー（例えば、0.05% Tween20含有リン酸バッファー（1mM KH₂PO₄、3mM Na2HPO 7H2O、154mM NaCl pH7.4））を、例えば３００μＬ/ウエルの割合で添加し、溶液を取り除く。この洗浄操作を数回繰り返すことにより、複合体をウエル上に残す（複合体の分離）。
（ａ）において使用するアニーリングバッファーとしては、本オリゴヌクレオチドと、目的とするＤＮＡ領域を含む一本鎖ＤＮＡとを結合させるのに適していれば良く、前記アニーリングバッファーに限られるわけではない。二価イオン、望ましくはマグネシウムイオンが１〜６００ｍＭの濃度で溶解しているものを使用すれば結合の安定性が増加する。
（ｂ）及び（ｃ）における洗浄操作は、溶液中に浮遊している固定化されていないメチル化ＤＮＡ抗体、メチル化ＤＮＡ抗体に結合しなかった溶液中に浮遊しているメチル化されていない一本鎖ＤＮＡ、又は、後述の制限酵素で消化された溶液中に浮遊しているＤＮＡ等を反応溶液から取り除くため重要である。尚、洗浄バッファーは、上記の遊離のメチル化ＤＮＡ抗体、溶液中に浮遊している一本鎖ＤＮＡ等の除去に適していれば良く、前記洗浄バッファーに限らず、ＤＥＬＦＩＡバッファー（PerkinElmer社製、Tris-HCl pH 7.8 with Tween 80）、ＴＥバッファー等でも良い。
因みに、前述の如く、上記（ａ）〜（ｃ）では、前記の目的とするＤＮＡ領域を含む一本鎖ＤＮＡと、ビオチン化本オリゴヌクレオチドとの結合の後、生じる結合体に含まれるビオチン化本オリゴヌクレオチドとストレプトアビジンで被覆した支持体とを結合させ、複合体を形成しているが、この順番に限られるわけではない。即ち、ビオチン化本オリゴヌクレオチドとストレプトアビジンで被覆した支持体とを結合させた後、生じる結合体に前記の目的とするＤＮＡ領域を含む一本鎖ＤＮＡを結合させ、複合体を形成しても良い。例えば、ストレプトアビジンで被覆した支持体に固定化されたビオチン化本オリゴヌクレオチドに、生物由来検体中に含まれるゲノムＤＮＡ由来のＤＮＡ試料に含まれる二本鎖ＤＮＡを添加することにより、支持体に固定化されたビオチン化本オリゴヌクレオチドと当該二本鎖ＤＮＡとの混合物を得る。得られた混合物に含まれる当該二本鎖ＤＮＡを分離して一本鎖ＤＮＡを得るために、当該混合物を９５℃で、例えば、数分間加熱する。得られた一本鎖ＤＮＡとビオチン化本オリゴヌクレオチドとの結合体を形成させるために、ビオチン化本オリゴヌクレオチドのＴｍ値の約１０〜２０℃低い温度まで速やかに冷却し、その温度で、例えば、数分間保温する。その後、（ｃ）の操作を実施し複合体を形成・分離しても良い（この段階で、目的とするＤＮＡ領域においてメチル化されたＤＮＡを含まない一本鎖ＤＮＡと本オリゴヌクレオチドとの結合体は、複合体を形成しない。）。

上記（ａ）〜（ｃ）の操作を、クロマトストリップを用いて行うことも可能である。その場合には、具体的には、以下のように実施する。例えば、まず、生物由来検体中に含まれるゲノムＤＮＡ由来のＤＮＡ試料に含まれる二本鎖ＤＮＡを分解して得られた一本鎖ＤＮＡとビオチン化本オリゴヌクレオチドとの結合体を含む溶液を、ストレプトアビジンで一部を被覆したクロマトストリップにより展開する。当該操作により、生物由来検体中に含まれるゲノムＤＮＡ由来のＤＮＡ試料に含まれる二本鎖ＤＮＡを分解して得られた一本鎖ＤＮＡとビオチン化本オリゴヌクレオチドとの結合体が、ストレプトアビジンで被覆された部分に固定化されることになる（この段階で形成された結合体は、目的とするＤＮＡ領域においてメチル化されたＤＮＡを含む一本鎖ＤＮＡとメチル化抗体との結合体の他、目的とするＤＮＡ領域以外のメチル化された一本鎖ＤＮＡとメチル化抗体との結合体を含んでいる。）。次いで、メチル化ＤＮＡ抗体の適当量を、前記のクロマトストリップにより展開する。当該操作により、生物由来検体中に含まれるゲノムＤＮＡ由来のＤＮＡ試料に含まれる二本鎖ＤＮＡを分解して得られた一本鎖ＤＮＡと、ビオチン化本オリゴヌクレオチドと、メチル化ＤＮＡ抗体とからなる複合体が、ストレプトアビジンで被覆した部分に固定化されることになる（複合体の形成・選択）（この段階で、目的とするＤＮＡ領域においてメチル化されたＤＮＡを含まない一本鎖ＤＮＡと本オリゴヌクレオチドとの結合体は、複合体を形成しない。）。複合体形成の順番については、これら操作の順に限られるわけではない。例えば、目的とするＤＮＡ領域においてメチル化されたＤＮＡを含む一本鎖ＤＮＡと、ビオチン化本オリゴヌクレオチドと、メチル化ＤＮＡ抗体とからなる複合体を形成させた後、これをクロマトストリップで展開し、ストレプトアビジンで被覆した部分に、当該複合体を固定化しても良い。これら操作では、溶液をクロマトストリップにより展開することで、不要な成分を除去することができ、洗浄操作を省略することが可能となる。勿論、各操作間に、洗浄操作（洗浄バッファー（例えば、0.05% Tween20含有リン酸バッファー（1mM KH₂PO₄、3mM Na2HPO 7H2O、154mM NaCl pH7.4）によるクロマトストリップの展開）を実施しても何ら問題はない。

本発明測定方法の第三工程における「識別機能」とは、検出若しくは定量のために利用される標識に基づく機能であり、具体的には、メチル化ＤＮＡ抗体の場合には、ユーロピウム標識、金コロイド標識、ラテックスビーズ標識、放射性同位体標識、蛍光物質（ＦＩＴＣ等）標識、horseradish Peroxidase（ＨＲＰ）標識、アルカリホスファターゼ標識、ビオチン標識等がなされたメチル化ＤＮＡ抗体の蛍光・発色等の特性を挙げることができ、また、抗体自身の特性（抗体自身が二次抗体と結合する特性等）等も当該機能として挙げられる。一方、本オリゴヌクレオチドの場合には、その５’末端若しくは３’末端にユーロピウム標識、金コロイド標識、ラテックスビーズ標識、放射性同位体標識、蛍光物質（ＦＩＴＣ等）標識、horseradish Peroxidase（ＨＲＰ）標識、アルカリホスファターゼ標識等がなされた本オリゴヌクレオチドの蛍光・発色等の特性を挙げることができる。これら機能に基づく検出若しくは定量には、例えば、放射線検出器、分光光度計等による測定又は目視等を利用すれば良い。
メチル化ＤＮＡ抗体の場合、前記の通り、抗体自身の特性を機能して考えても良く、抗体自身が標識されていなくとも、検出若しくは定量可能な機能が付加された二次抗体を使用することにより、メチル化ＤＮＡ抗体を間接的に検出若しくは定量することができる。

目的とするＤＮＡ領域を含む一本鎖ＤＮＡをメチル化ＤＮＡ抗体を介して支持体に結合する場合には、本オリゴヌクレオチドを、その機能により検出若しくは定量し、また目的とするＤＮＡ領域を含む一本鎖ＤＮＡを本オリゴヌクレオチドを介して支持体に結合した場合には、メチル化ＤＮＡ抗体を、その機能により検出若しくは定量することとなる。

メチル化ＤＮＡ抗体を、その機能により検出若しくは定量する場合には、具体的には例えば、抗体自身の特性を機能として用いる際には、以下のように操作を行えば良い。複合体にメチル化ＤＮＡ抗体に対する二次抗体（例えば、Eu-N1標識マウスIgG抗体：PerkinElmer社製）を添加し、室温で約１時間静置し、二次抗体の複合体への結合を促す。その後、Enhancement Solution（PerkinElmer社製）を添加・混合し、例えば約４５分間室温で静置する。その後、蛍光検出器で蛍光（励起340nm/蛍光612nm）を測定することにより、メチル化ＤＮＡ抗体を検出若しくは定量する。
二次抗体としてＦＩＴＣを結合させた抗体を用いる場合、公知の方法により、ＦＩＴＣの蛍光を測定し、メチル化ＤＮＡ抗体を検出若しくは定量することもできる。
また、例えば、本オリゴヌクレオチドの固定化にビオチンを利用しない場合、ビオチン化メチル化ＤＮＡ抗体を検出若しくは定量に用いることができる。ビオチン化メチル化ＤＮＡ抗体を検出若しくは定量する場合には、例えば、ＨＲＰ標識ストレプトアビジンをビオチン化メチル化ＤＮＡ抗体に添加・混合し、ビオチン化メチル化ＤＮＡ抗体とＨＲＰ標識ストレプトアビジンとの結合体を形成・分離した後、公知の方法によりＨＲＰの活性を測定することによりビオチン化メチル化ＤＮＡ抗体を検出若しくは定量できる。

本オリゴヌクレオチドを、その機能により検出若しくは定量する場合には、具体的には例えば、複合体を形成するために必要な本オリゴヌクレオチドとして、ＦＩＴＣ標識したＦＩＴＣ化オリゴヌクレオチドを用いて、前述の方法に準じて、複合体を形成させ、複合体を分離する。得られた複合体について、公知の方法により、ＦＩＴＣの蛍光を測定し、本オリゴヌクレオチドを検出若しくは定量する。また、ＦＩＴＣに対する二次抗体（例えば、ＨＲＰ標識抗ＦＩＴＣ抗体：Jackson ImmunoResearch Laboratories社製）を添加し、室温で約２時間静置し、二次抗体の複合体への結合を促す。その後、適切な基質（例えば、Substrate Reagent Pack #DY999：R&D SYSTEMS社製）を添加・混合し、例えば５〜２０分間室温で静置する。その後、Stop Solution（1N H₂SO₄）を添加する。添加後、３０分以内に、吸光度検出器にて、450nmの吸光度を測定し、本オリゴヌクレオチドを検出若しくは定量するといった方法も可能である。
また、メチル化ＤＮＡ抗体の固定化にビオチンを利用しない場合、ビオチン化本オリゴヌクレオチドを検出若しくは定量に用いることができる。ビオチン化本オリゴヌクレオチドを検出若しくは定量する場合には、例えば、ＨＲＰ標識ストレプトアビジンをビオチン化本オリゴヌクレオチドを添加・混合し、ビオチン化本オリゴヌクレオチドとＨＲＰ標識ストレプトアビジンとの結合体を形成・分離した後、公知の方法によりＨＲＰの活性を測定によりビオチン化メチル化ＤＮＡ抗体を検出若しくは定量できる。

本発明は、本発明測定方法の第一工程の終了直後から、第三工程の開始直前までの間に、第一工程で取得された一本鎖ＤＮＡを、少なくとも１種類の一本鎖ＤＮＡを消化できるメチル化感受性制限酵素により消化する工程を、追加的に有する変法（変法１）、及び、本発明測定方法の第一工程の終了直後から、第三工程の開始直前までの間に、追加的に有する変法（変法２）を含む。

当該変法（変法１及び変法２）における「メチル化感受性制限酵素」とは、例えば、メチル化されたシトシンを含む認識配列を消化せず、メチル化されていないシトシンを含む認識配列のみを消化することのできる制限酵素等を意味する。即ち、メチル化感受性制限酵素が本来認識することができる認識配列に含まれるシトシンがメチル化されているＤＮＡの場合には、当該メチル化感受性制限酵素を当該ＤＮＡに作用させても、当該ＤＮＡは切断されない。これに対して、メチル化感受性制限酵素が本来認識することができる認識配列に含まれるシトシンがメチル化されていないＤＮＡの場合には、当該メチル化感受性制限酵素を当該ＤＮＡに作用させれば、当該ＤＮＡは切断される。このようなメチル化感受性酵素の具体的な例としては、例えば、HpaII、BstUI、NarI、SacII、HhaI等を挙げることができる。尚、前記のメチル化感受性制限酵素は、ヘミメチル状態のＣｐＧを含む二本鎖ＤＮＡ（即ち、前記ＣｐＧ対のうち、一方の鎖のシトシンがメチル化されており、他方の鎖のシトシンがメチル化されていないような二本鎖ＤＮＡ）を切断しないものであり、すでにGruenbaumらにより明らかにされている（Nucleic Acid Research, 9、 2509-2515）。また、「一本鎖ＤＮＡを消化できるメチル化感受性制限酵素」とは、例えば、一本鎖ＤＮＡ中の、メチル化されたシトシンを含む認識配列を消化せず、メチル化されていないシトシンを含む認識配列のみを消化することのできる制限酵素等を意味する。即ち、メチル化感受性制限酵素の中には、一本鎖ＤＮＡを消化するものもある。例えば、HhaI等を挙げることができる。

メチル化感受性制限酵素による消化処理での懸念点として、メチル化されていないシトシンを含む認識配列を完全に消化できない（所謂「ＤＮＡの切れ残し」）虞を挙げることができる。このような虞が問題となる場合には、メチル化感受性制限酵素の認識部位が多く存在すれば、「ＤＮＡの切れ残し」を最小限に抑えることができるので、目的とするＤＮＡ領域としては、メチル化感受性制限酵素の認識部位を少なくとも１つ以上有しており、その認識部位が多ければ多いほど良いと考えられる。

前記の通り、目的とするＤＮＡ領域としては、メチル化ＤＮＡ抗体の性質（１つのメチル化された塩基（シトシン）に１つの抗体が結合すること）から考えると、目的とするＤＮＡ領域としては、数多くのメチル化された塩基（シトシン、ＣｐＧ）が存在する領域を、また「ＤＮＡの切れ残し」を最小限に抑えるという観点から、メチル化感受性制限酵素の認識部位が数多く存在する領域を選抜することが望ましい。
変法２における「マスキング用オリゴヌクレオチド」とは、メチル化感受性制限酵素の認識部位の塩基配列と相補的な塩基からなるオリゴヌクレオチドであり、一本鎖ＤＮＡの中の目的とするＤＮＡ領域に含まれる数箇所あるメチル化感受性制限酵素の認識配列のうち、少なくとも１箇所（全ての箇所でも良く、目的とする領域の塩基配列によっては、下記の８〜３０塩基長に、１箇所以上が同時に含まれる場合もある。）と相補的に結合することで二本鎖ＤＮＡを形成し（即ち、前記箇所を二本鎖ＤＮＡ状態にして）、二本鎖ＤＮＡのみを基質とするメチル化感受性酵素でも前記箇所を消化できるように、また、一本鎖ＤＮＡを消化できるメチル化感受性制限酵素（一本鎖ＤＮＡを消化できるメチル化感受性制限酵素は二本鎖ＤＮＡも消化でき、その消化効率は、二本鎖ＤＮＡに対する方が一本鎖ＤＮＡに対するよりも高い。）での前記箇所の消化効率を向上させることができるようにするためのオリゴヌクレオチドであり、且つ、目的とする領域のＤＮＡを含む一本鎖ＤＮＡと本オリゴヌクレオチドとの結合体の形成を阻害しないオリゴヌクレオチドを意味する。
マスキング用オリゴヌクレオチドとしては、さらに具体的には、一本鎖ＤＮＡ中の目的ＤＮＡ領域に含まれる数箇所あるメチル化感受性制限酵素の認識配列のうち１箇所の特定箇所（目的領域の塩基配列によっては、下記の８〜３０塩基長に、１箇所以上が同時に含まれる場合もある）を含んだ８〜３０塩基長の塩基配列に対して、相補性のある塩基配列を有し、且つ、目的とする領域のＤＮＡを含む一本鎖ＤＮＡと本オリゴヌクレオチドとの結合体の形成を阻害しないオリゴヌクレオチドが挙げられる。
ゲノムＤＮＡ由来のＤＮＡ試料に含まれる目的とするＤＮＡ領域を含む一本鎖ＤＮＡ（正鎖）と混合させるマスキング用オリゴヌクレオチドは、１種類でもよく複数種類でも良い。複数種類を用いると、目的とする領域のＤＮＡを含む一本鎖ＤＮＡのメチル化感受性制限酵素の認識部位の多くが二本鎖ＤＮＡ状態になり、メチル化感受性制限酵素での、前記の「ＤＮＡの切れ残し」を最小限に抑えることができる。但し、マスキング用オリゴヌクレオチドが二本鎖ＤＮＡを形成した箇所には、メチル化ＤＮＡ抗体が結合できなくなるため、マスキング用オリゴヌクレオチドを、あまりに数多くのメチル化感受性制限酵素認識部位に対して用いることは適切ではなく、適度な種類を用いることが好ましい。もし、目的とするＤＮＡ領域に含まれる全てのメチル化感受性制限酵素の認識部位にマスキング用オリゴヌクレオチドを使用すると、当該認識部位におけるメチル化されている塩基（シトシン）とメチル化ＤＮＡ抗体との結合が阻害され、所望の複合体の形成確立が低くなる可能性がある（当該認識部位以外のＣｐＧに、メチル化ＤＮＡ抗体は勿論結合するが、メチル化ＤＮＡ抗体を検出若しくは定量する場合、その検出感度及び定量精度は低くなる）。マスキング用オリゴヌクレオチドは、例えば、目的とするＤＮＡ領域に含まれる数箇所あるメチル化感受性制限酵素の認識配列のうち、メチル化している場合には消化せずにメチル化していない場合には消化したい箇所（例えば、疾患患者検体では100%メチル化されており、健常者検体では100%メチル化されていない箇所等）に応じて設計し、これを使用することが特に有用である。

当該変法（変法１及び変法２）において、第一工程後から、第三工程の開始直前までの間に、第一工程で取得された一本鎖ＤＮＡを、少なくとも１種類の一本鎖ＤＮＡを消化できるメチル化感受性制限酵素により消化する工程を追加的に実施することにより、目的とするＤＮＡ領域においてメチル化されたＤＮＡを含まない一本鎖ＤＮＡ（正鎖）を有する複合体の形成を最小限に抑える（排除する）ことができ、目的とするＤＮＡ領域においてメチル化されたＤＮＡの検出感度及び定量精度が向上する。

変法１における、第一工程の終了直後から第三工程の開始直前までの間に追加的に実施する、第一工程で取得された一本鎖ＤＮＡを、少なくとも１種類の一本鎖ＤＮＡを消化できるメチル化感受性制限酵素により消化処理する工程は、具体的には例えば、以下のように実施すれば良い。第一工程で取得された一本鎖ＤＮＡを含む溶液１０μＬに、最適な１０×緩衝液を３μＬ、一本鎖を消化できるメチル化感受性酵素（HhaI）を１５Ｕ、その他、必要に応じてＢＳＡ等を適量加え、次いで当該混合物に滅菌超純水を加えて液量を３０μＬとし、３７℃で例えば１時間〜１晩インキュベーションする。これにより、目的とするＤＮＡ領域においてメチル化されていないHhaI認識部位は消化されることになる（処理溶液）。例えば、当該工程を複合体形成前に実施する場合には、複合体形成、及び／又は、分離時に洗浄操作を実施するため、前記の処理溶液を複合体形成に直接使用すれば良い。また当該工程を複合体分離後に実施する場合には、処理溶液中に存在する浮遊の一本鎖ＤＮＡ（当該メチル化感受性制限酵素の認識部位がメチル化されておらず、そのため消化され生成した一本鎖ＤＮＡ）を処理溶液中から取り除く必要があるので、複合体形成、及び／又は、分離時に実施する洗浄操作と同様の洗浄操作を、当該工程終了後に再度実施する必要がある。

変法２における、第一工程の終了直後から第三工程の開始直前までの間に、追加的に実施する、(i)第一工程で取得された一本鎖ＤＮＡ、及び、少なくとも１種類のメチル化感受性制限酵素の認識配列をその一部として有するマスキング用オリゴヌクレオチド、を混合する工程、及び、(ii)前工程により得られた混合物（の中に存在する目的とするＤＮＡ領域においてＤＮＡがメチル化されていない一本鎖ＤＮＡ）を前記のメチル化感受性制限酵素により消化する工程は、具体的には例えば、以下のように実施すれば良い。第一工程で取得された一本鎖ＤＮＡを含む溶液１０μLに、最適な１０×緩衝液を３μL、メチル化感受性酵素（HhaI、HhaI等）を１５Ｕ、前記メチル化感受性酵素の認識配列のうち１箇所の特定箇所に対するマスキング用オリゴヌクレオチドを約１０pmol、その他、必要に応じてＢＳＡ等を適量加え、次いで当該混合物に滅菌超純水を加えて液量を３０μLとし、３７℃で例えば１時間〜１晩インキュベーションする。これにより、目的とするＤＮＡ領域においてメチル化されていない当該箇所は消化されることになる（処理溶液）。例えば、当該操作を複合体形成前に実施する場合には、複合体形成、及び／又は、分離時に洗浄操作を実施するため、前記の処理溶液を複合体形成に直接使用すれば良い。また、当該操作を複合体分離後に実施する場合には、処理溶液中に存在する浮遊の一本鎖ＤＮＡ（当該メチル化感受性制限酵素の認識部位がメチル化されておらず、そのため消化され生成した一本鎖ＤＮＡ）を処理溶液中から取り除く必要があるので、複合体形成、及び／又は、分離時に実施する洗浄操作と同様の洗浄操作を、当該工程終了後に再度実施する必要がある。

また本発明測定方法において、「生物由来検体中に含まれるゲノムＤＮＡ由来のＤＮＡ試料」が、当該ゲノムＤＮＡが有する目的とするＤＮＡ領域を認識切断部位としない制限酵素で予め消化処理されてなるＤＮＡ試料であることを好ましい態様の一つとして挙げることができる。第一工程で取得された一本鎖ＤＮＡと本オリゴヌクレオチドとの結合体を形成させる場合には、当該一本鎖ＤＮＡは、目的とするＤＮＡ領域においてメチル化されたＤＮＡを含んでいれば短い方がより複合体を形成させ易いだけでなく、操作性も良いと考えられる。当該一本鎖ＤＮＡを短くするには、元のゲノムＤＮＡの時点で短くしておくことが効率的である。従って、目的とするＤＮＡ領域を認識切断部位としない制限酵素を生物由来検体中に含まれるゲノムＤＮＡ由来のＤＮＡ試料に直接使用し消化処理を前処理として実施しておくことが良い。目的とするＤＮＡ領域を認識切断部位としない制限酵素により消化処理する方法としては、一般的な制限酵素処理法を用いれば良い。尚、上記ＤＮＡ試料が予め精製されてなるＤＮＡ試料である場合には、一般的に用いられる量の制限酵素を用い消化処理を実施すれば良く、生物由来検体が、組織溶解液、細胞溶解液等の場合には、大過剰の制限酵素、例えば、ＤＮＡ量に対して５００倍量又はそれ以上の制限酵素を用いて消化処理を実施すれば良い。

また「生物由来検体中に含まれるゲノムＤＮＡ由来のＤＮＡ試料」が、少なくとも１種類以上のメチル化感受性制限酵素で消化処理されてなるＤＮＡ試料であることを好ましい態様の一つとして挙げることができる。生物由来検体そのものを予めメチル化感受性制限酵素で消化処理しておくことにより、第三工程のメチル化されたＤＮＡの検出若しくは定量の精度良くすることができる。当該方法は、上記のような「ＤＮＡの切れ残し」を無くすのに有用である。生物由来検体そのものをメチル化感受性制限酵素により消化処理する方法としては、生物由来検体中に含まれるゲノムＤＮＡが二本鎖ＤＮＡとして存在している場合には、メチル化感受性制限酵素を用いて、一般的な制限酵素処理を実施すれば良い。また生物由来検体中に含まれるゲノムＤＮＡが一本鎖ＤＮＡとして存在している場合又は生物由来検体中に含まれるゲノムＤＮＡが二本鎖ＤＮＡと一本鎖ＤＮＡとの両者として混在している場合には、変法１及び変法２に準じた方法で消化処理を実施すれば良い。具体的には例えば、検体液１０μLに、最適な１０×緩衝液を５μL、一本鎖ＤＮＡを消化できるメチル化感受性制限酵素（HhaI）を１５Ｕ、その他、必要に応じてＢＳＡ等を適量加え、次いで当該混合物に滅菌超純水を加えて液量を５０μLとし、３７℃で例えば１時間〜１晩インキュベーションする。又は、検体液１０μLに、最適な１０×緩衝液を５μL、メチル化感受性制限酵素（HpaII、HhaI等）を１５Ｕ、前記メチル化感受性酵素の認識配列のうち１箇所の特定箇所に対するマスキング用オリゴヌクレオチドを約１５pmol、その他、必要に応じてＢＳＡ等を適量加え、次いで当該混合物に滅菌超純水を加えて液量を５０μLとし、３７℃で例えば１時間〜１晩インキュベーションする。尚、生物由来検体が、予め精製されてなる検体である場合には、一般的に用いられる量の制限酵素を用いて消化処理を実施すれば良く、生物由来検体が、組織溶解液、細胞溶解液等の場合には、大過剰のメチル化感受性制限酵素、例えば、ＤＮＡ量に対して５００倍量又はそれ以上のメチル化感受性制限酵素を用い消化処理を実施すれば良い。

他に第一工程において、ゲノムＤＮＡ由来のＤＮＡ試料に含まれる二本鎖ＤＮＡを一本鎖ＤＮＡに取得する際の好ましい態様としては、カウンターオリゴヌクレオチドを添加すること等を挙げることができる。カウンターオリゴヌクレオチドとは、目的とするＤＮＡ領域と同じ塩基配列を短いオリゴヌクレオチドに分割したものである。通常１０〜１００塩基、より好ましくは、２０〜５０塩基の長さに設計したものであればよい。尚、カウンターオリゴヌクレオチドは、前記メチル化された目的とするＤＮＡ領域を含む一本鎖ＤＮＡと、前記のオリゴヌクレオチドが相補的な結合するために必要な前記オリゴヌクレオチド上の塩基配列と相補的に結合する塩基配列を含まないように設計することが望ましい。カウンターオリゴヌクレオチドは、ゲノムＤＮＡに比し、大過剰で添加され、目的とするＤＮＡ領域を一本鎖（正鎖）にした後、固定化メチル化ＤＮＡ抗体と結合させる際に、目的とするＤＮＡ領域の相補鎖（負鎖）と目的とするＤＮＡ領域を一本鎖（正鎖）が相補性により再結合することを妨げるために添加する。尚、カンウターオリゴヌクレオチドは、目的とするＤＮＡ領域に比べて、少なくとも１０倍、通常は１００倍以上の量が添加されることが望ましい。

「第一工程でゲノムＤＮＡ由来のＤＮＡ試料に含まれる二本鎖ＤＮＡを一本鎖ＤＮＡに取得する際に、カウンターオリゴヌクレオチドを添加する」とは、具体的には、生物由来検体中に含まれるゲノムＤＮＡ由来のＤＮＡ試料をカウンターオリゴヌクレオチドと混合して、目的とするＤＮＡ領域の相補鎖とカウンターオリゴヌクレオチドが二本鎖を形成することにより、目的とするＤＮＡ領域を一本鎖とすることを目的として添加されるものである。目的とするＤＮＡ領域が一本鎖状態であれば、第二工程で、(ii)メチル化ＤＮＡ抗体、及び、(iii)前記のメチル化ＤＮＡ抗体と目的とするＤＮＡ領域においてメチル化されたＤＮＡとの結合を阻害せず且つ前記の一本鎖ＤＮＡと結合し得るオリゴヌクレオチドと結合しやすくすることを目的とする。尚、カウンターオリゴヌクレオチドは、(iii)前記のメチル化ＤＮＡ抗体と目的とするＤＮＡ領域においてメチル化されたＤＮＡとの結合を阻害せず且つ前記の一本鎖ＤＮＡと結合し得るオリゴヌクレオチドが前記メチル化されたＤＮＡと相補的に結合する塩基配列上には設計しない。
すなわち、カウンターオリゴヌクレオチドは、(i)第一工程で取得された一本鎖ＤＮＡ、(ii)メチル化ＤＮＡ抗体、及び、(iii)前記のメチル化ＤＮＡ抗体と目的とするＤＮＡ領域においてメチル化されたＤＮＡとの結合を阻害せず且つ前記の一本鎖ＤＮＡと結合し得るオリゴヌクレオチド、を混合することによりメチル化された目的とするＤＮＡ領域を含む一本鎖ＤＮＡと、メチル化ＤＮＡ抗体と、前記のオリゴヌクレオチドとの複合体を形成しやするものであって、第一工程で一本鎖ＤＮＡを取得する際に添加しても構わないし、第二工程で前記複合体を形成させる際に添加しても構わない。

カウンターオリゴヌクレオチドを、例えば、第一工程で添加する場合には、生物由来検体中に含まれるゲノムＤＮＡ由来のＤＮＡ試料に含まれる二本鎖ＤＮＡを一本鎖ＤＮＡに取得する第一工程で添加すればよい。具体的には、前記ＤＮＡ試料と、前記カウンターオリゴヌクレオチドを、緩衝液（330mM Tris-Acetate pH 7.9、660mM KOAc、100mM MgOAc₂、5mM Dithiothreitol）５μＬと、100ｍＭのＭｇＣｌ_２溶液５μＬと、1ｍｇ/ｍＬのＢＳＡ溶液５μＬを添加し、さらに当該混合物に滅菌超純水を加えて液量を５０μＬとし、混合して、９５℃で１０分間加熱し、７０℃まで速やかに冷却し、その温度で１０分間保温し、次いで、５０℃まで冷却し１０分間保温し、さらに３７℃で１０分間保温した後、室温に戻せばよい。

カウンターオリゴヌクレオチドを添加する際の好ましい態様としては、二価陽イオンを含有する反応系中で結合させることを挙げることができる。より好ましくは、二価陽イオンがマグネシウムイオンであることが挙げられる。ここで「二価陽イオンを含有する反応系」とは、前記一本鎖ＤＮＡ（正鎖）と前記一本鎖固定化オリゴヌクレオチドとを結合させるために用いられるアニーリングバッファー中に二価陽イオンを含有するような反応系を意味し、具体的には例えば、マグネシウムイオンを構成要素とする塩（例えば、ＭｇＯＡｃ２、ＭｇＣｌ２等）を１ｍＭ〜６００ｍＭの濃度で含まれることがよい。

血液、尿等の生体試料中に含まれる微量物質の検出若しくは定量する方法として、免疫学的測定方法が汎用されている。当該免疫学的測定方法のうち、クロマトグラフィーを用いた所謂イムノクロマト法は操作が簡単であり、検定に要する時間も短いため、現在、例えば、病院における臨床検査、研究室における検定試験等の多くの場面で広く利用されている。また、近年、標識されたＤＮＡ（遺伝子）をクロマトストリップ上で展開し、目的ＤＮＡ（遺伝子）を捕獲できるプローブを用いてハイブリダイゼーションすることにより、目的ＤＮＡ（遺伝子）を検出する、所謂ハイブリッドクロマト法が利用されるようになってきた。この方法も操作が簡便であり、検定に要する時間も短いため、現在、病院における臨床検査、研究室における検定試験等の場面で広く利用され始められている。本発明測定方法は、上記のイムノクロマト法とハイブリッドクロマト法とを混合した方法を概念的に可能としている。本発明測定方法では、複合体形成及び複合体分離に関して、その順序は特に限定されないため、種々の方法が可能である。具体的には例えば、以下のように実施すれば良い。
方法１：第一工程終了直後の試料に、ビオチン化本オリゴヌクレオチドを添加し、目的とするＤＮＡ領域を含む一本鎖ＤＮＡとビオチン化本オリゴヌクレオチドとの結合体を形成させ（この段階で形成された結合体は、目的とするＤＮＡ領域においてメチル化されたＤＮＡを含む一本鎖ＤＮＡと本オリゴヌクレオチドとの結合体の他、目的とするＤＮＡ領域においてメチル化されたＤＮＡを含まない一本鎖ＤＮＡと本オリゴヌクレオチドとの結合体を含んでいる。）、次いで、識別機能を有するメチル化抗体を添加し、目的とするＤＮＡ領域においてメチル化されたＤＮＡを含む一本鎖ＤＮＡと、ビオチン化本オリゴヌクレオチドと、識別機能を有するメチル化ＤＮＡ抗体とが結合した複合体を形成させる（この段階で、目的とするＤＮＡ領域においてメチル化されたＤＮＡを含まない一本鎖ＤＮＡと本オリゴヌクレオチドとの結合体は、複合体を形成しない。）。得られた試料を、クロマトストリップの導入部に滴下（導入）すると、前記複合体が、展開部を毛細管現象により移動し、予めストレプトアビジンで被覆しておいた部分に捕獲される。その後、分離された複合体に含まれるメチル化ＤＮＡ抗体を、その識別機能に基づき検出若しくは定量することにより、目的とするＤＮＡ領域においてメチル化されたＤＮＡを検出若しくは定量できる。
方法２：第一工程終了直後の試料に、ビオチン化本オリゴヌクレオチドを添加し、目的とするＤＮＡ領域を含む一本鎖ＤＮＡとビオチン化本オリゴヌクレオチドとの結合体を形成させる（この段階で形成された結合体は、目的とするＤＮＡ領域においてメチル化されたＤＮＡを含む一本鎖ＤＮＡと本オリゴヌクレオチドとの結合体の他、目的とするＤＮＡ領域においてメチル化されたＤＮＡを含まない一本鎖ＤＮＡと本オリゴヌクレオチドとの結合体を含んでいる。）。得られた試料を、クロマトストリップの導入部に滴下（導入）すると、前記結合体が、展開部を毛細管現象により移動し、予めストレプトアビジンで被覆しておいた部分に捕獲される（この段階でも結合体は、目的とするＤＮＡ領域においてメチル化されたＤＮＡを含む一本鎖ＤＮＡと本オリゴヌクレオチドとの結合体の他、目的とするＤＮＡ領域においてメチル化されたＤＮＡを含まない一本鎖ＤＮＡと本オリゴヌクレオチドとの結合体を含んでいる。）。その後、識別機能を有するメチル化抗体を導入部に滴下（導入）すると、展開部を移動し、結合体のメチル化されたシトシンに結合し、目的とするＤＮＡ領域においてメチル化されたＤＮＡを含む一本鎖ＤＮＡと、ビオチン化本オリゴヌクレオチドと、識別機能を有するメチル化ＤＮＡ抗体とが結合した複合体を形成する（この段階で、目的とするＤＮＡ領域においてメチル化されたＤＮＡを含まない一本鎖ＤＮＡと本オリゴヌクレオチドとの結合体は、複合体を形成しない。）。得られた複合体に含まれるメチル化ＤＮＡ抗体を、その識別機能に基づき検出若しくは定量することにより、目的とするＤＮＡ領域においてメチル化されたＤＮＡを検出若しくは定量できる。
方法３：ビオチン化本オリゴヌクレオチドをクロマトストリップの導入部に滴下（導入）すると、前記オリゴヌクレオチドが、展開部を毛細管現象により移動し、予めストレプトアビジンで被覆しておいた部分に捕獲される。次いで、第一工程終了直後の試料を導入部に滴下（導入）すると、展開部を移動し、既に捕獲されているビオチン化本オリゴヌクレオチドに、目的とするＤＮＡ領域を含む一本鎖ＤＮＡが結合体を形成した形で捕獲される（この段階で形成された結合体は、目的とするＤＮＡ領域においてメチル化されたＤＮＡを含む一本鎖ＤＮＡと本オリゴヌクレオチドとの結合体の他、目的とするＤＮＡ領域においてメチル化されたＤＮＡを含まない一本鎖ＤＮＡと本オリゴヌクレオチドとの結合体を含んでいる。）。その後、識別機能を有するメチル化抗体を導入部に滴下（導入）すると、展開部を移動し、結合体のメチル化されたシトシンに結合し、目的とするＤＮＡ領域においてメチル化されたＤＮＡを含む一本鎖ＤＮＡと、ビオチン化本オリゴヌクレオチドと、識別機能を有するメチル化ＤＮＡ抗体とが結合した複合体を形成する（この段階で、目的とするＤＮＡ領域においてメチル化されたＤＮＡを含まない一本鎖ＤＮＡと本オリゴヌクレオチドとの結合体は、複合体を形成しない。）。得られた複合体に含まれるメチル化ＤＮＡ抗体を、その識別機能に基づき検出若しくは定量することにより、目的とするＤＮＡ領域においてメチル化されたＤＮＡを検出若しくは定量できる。
方法４：ビオチン化本オリゴヌクレオチドをクロマトストリップの導入部に滴下（導入）すると、前記オリゴヌクレオチドが、展開部を毛細管現象により移動し、予めストレプトアビジンで被覆しておいた部分に捕獲される。第一工程終了直後の試料に、識別機能を有するメチル化ＤＮＡ抗体を添加し、メチル化されたシトシンを有する一本鎖ＤＮＡ（この中には、目的とするＤＮＡ領域を含む一本鎖ＤＮＡと目的以外の一本鎖ＤＮＡが存在する）と識別機能を有するメチル化ＤＮＡ抗体との結合体を形成させる（この段階で形成された結合体は、目的とするＤＮＡ領域においてメチル化されたＤＮＡを含む一本鎖ＤＮＡとメチル化抗体との結合体の他、目的とするＤＮＡ領域以外のメチル化された一本鎖ＤＮＡとメチル化抗体との結合体を含んでいる。）。得られた結合体を導入部に滴下（導入）すると、展開部を移動し、既に捕獲されているビオチン化本オリゴヌクレオチドに、目的とするＤＮＡ領域においてメチル化されたＤＮＡを含む一本鎖ＤＮＡが結合し、目的とするＤＮＡ領域においてメチル化されたＤＮＡを含む一本鎖ＤＮＡと、ビオチン化本オリゴヌクレオチドと、識別機能を有するメチル化ＤＮＡ抗体とが結合した複合体を形成する（この段階で、目的とするＤＮＡ領域以外のメチル化された一本鎖ＤＮＡとメチル化抗体との結合体は、複合体を形成しない。）。得られた複合体に含まれるメチル化ＤＮＡ抗体を、その識別機能に基づき検出若しくは定量することにより、目的とするＤＮＡ領域においてメチル化されたＤＮＡを検出若しくは定量できる。
方法５：第一工程終了直後の試料に、識別機能を有する本オリゴヌクレオチドを添加し、目的とするＤＮＡ領域を含む一本鎖ＤＮＡと識別機能を有する本オリゴヌクレオチドとの結合体を形成させ（この段階で形成された結合体は、目的とするＤＮＡ領域においてメチル化されたＤＮＡを含む一本鎖ＤＮＡと本オリゴヌクレオチドとの結合体の他、目的とするＤＮＡ領域においてメチル化されたＤＮＡを含まない一本鎖ＤＮＡと本オリゴヌクレオチドとの結合体を含んでいる。）、次いで、ビオチン化メチル化抗体を添加し、目的とするＤＮＡ領域においてメチル化されたＤＮＡを含む一本鎖ＤＮＡと、識別機能を有する本オリゴヌクレオチドと、ビオチン化メチル化ＤＮＡ抗体とが結合した複合体を形成させる（この段階で、目的とするＤＮＡ領域においてメチル化されたＤＮＡを含まない一本鎖ＤＮＡと本オリゴヌクレオチドとの結合体は、複合体を形成しない。）。得られた試料を、クロマトストリップの導入部に滴下（導入）すると、前記複合体が、展開部を毛細管現象により移動し、予めストレプトアビジンで被覆しておいた部分に捕獲される。その後、得られた複合体に含まれる本オリゴヌクレオチドを、その識別機能に基づき検出若しくは定量することにより、目的とするＤＮＡ領域においてメチル化されたＤＮＡを検出若しくは定量できる。
方法６：第一工程終了直後の試料に、ビオチン化メチル化ＤＮＡ抗体を添加し、メチル化されたシトシンを有する一本鎖ＤＮＡ（この中には、目的とするＤＮＡ領域を含む一本鎖ＤＮＡと目的以外の一本鎖ＤＮＡが存在する）とビオチン化メチル化ＤＮＡ抗体との結合体を形成させる（この段階で形成された結合体は、目的とするＤＮＡ領域においてメチル化されたＤＮＡを含む一本鎖ＤＮＡとメチル化抗体との結合体の他、目的とするＤＮＡ領域以外のメチル化された一本鎖ＤＮＡとメチル化抗体との結合体を含んでいる。）。得られた試料を、クロマトストリップの導入部に滴下（導入）すると、前記結合体が、展開部を毛細管現象により移動し、予めストレプトアビジンで被覆しておいた部分に捕獲される（この段階でも結合体は、目的とするＤＮＡ領域においてメチル化されたＤＮＡを含む一本鎖ＤＮＡとメチル化抗体との結合体の他、目的とするＤＮＡ領域以外のメチル化された一本鎖ＤＮＡとメチル化抗体との結合体を含んでいる。）。その後、識別機能を有する本オリゴヌクレオチドを導入部に滴下（導入）すると、展開部を移動し、結合体のうち目的とするＤＮＡ領域を含むメチル化された一本鎖ＤＮＡにのみ結合し、目的とするＤＮＡ領域においてメチル化されたＤＮＡを含む一本鎖ＤＮＡと、識別機能を有する本オリゴヌクレオチドと、ビオチン化メチル化ＤＮＡ抗体とが結合した複合体を形成する（この段階で、目的とするＤＮＡ領域以外のメチル化された一本鎖ＤＮＡとメチル化抗体との結合体は、複合体を形成しない。）。得られた複合体に含まれる本オリゴヌクレオチドを、その識別機能に基づき検出若しくは定量することにより、目的とするＤＮＡ領域においてメチル化されたＤＮＡを検出若しくは定量できる。
方法７：ビオチン化メチル化ＤＮＡ抗体をクロマトストリップの導入部に滴下（導入）すると、前記メチル化ＤＮＡ抗体が、展開部を毛細管現象により移動し、予めストレプトアビジンで被覆しておいた部分に捕獲される。次いで、第一工程終了直後の試料を導入部に滴下（導入）すると、展開部を移動し、既に捕獲されているメチル化ＤＮＡ抗体に、メチル化されたシトシンを有する一本鎖ＤＮＡが結合体として捕獲される（この段階で形成された結合体は、目的とするＤＮＡ領域においてメチル化されたＤＮＡを含む一本鎖ＤＮＡとメチル化抗体との結合体の他、目的とするＤＮＡ領域以外のメチル化された一本鎖ＤＮＡとメチル化抗体との結合体を含んでいる。）。その後、識別機能を有する本オリゴヌクレオチドを導入部に滴下（導入）すると、展開部を移動し、結合体のうち目的とするＤＮＡ領域を含むメチル化された一本鎖ＤＮＡにのみ結合し、目的とするＤＮＡ領域においてメチル化されたＤＮＡを含む一本鎖ＤＮＡと、識別機能を有する本オリゴヌクレオチドと、ビオチン化メチル化ＤＮＡ抗体とが結合した複合体を形成する（この段階で、目的とするＤＮＡ領域以外のメチル化された一本鎖ＤＮＡとメチル化抗体との結合体は、複合体を形成しない。）。得られた複合体に含まれる本オリゴヌクレオチドを、その識別機能に基づき検出若しくは定量することにより、目的とするＤＮＡ領域においてメチル化されたＤＮＡを検出若しくは定量できる。
方法８：ビオチン化メチル化ＤＮＡ抗体をクロマトストリップの導入部に滴下（導入）すると、前記メチル化ＤＮＡ抗体が、展開部を毛細管現象により移動し、予めストレプトアビジンで被覆しておいた部分に捕獲される。第一工程終了直後の試料に、識別機能を有する本オリゴヌクレオチドを添加し、目的とするＤＮＡ領域を含む一本鎖ＤＮＡと識別機能を有する本オリゴヌクレオチドとの結合体を形成させる（この段階で形成された結合体は、目的とするＤＮＡ領域においてメチル化されたＤＮＡを含む一本鎖ＤＮＡと本オリゴヌクレオチドとの結合体の他、目的とするＤＮＡ領域においてメチル化されたＤＮＡを含まない一本鎖ＤＮＡと本オリゴヌクレオチドとの結合体を含んでいる。）。次いで、得られた結合体を導入部に滴下（導入）すると、展開部を移動し、既に捕獲されているメチル化ＤＮＡ抗体に、結合体のうち目的とするＤＮＡ領域においてメチル化されたＤＮＡを含む一本鎖ＤＮＡのみが結合し、目的とするＤＮＡ領域においてメチル化されたＤＮＡを含む一本鎖ＤＮＡと、識別機能を有する本オリゴヌクレオチドと、ビオチン化メチル化ＤＮＡ抗体とが結合した複合体を形成する（この段階で、目的とするＤＮＡ領域においてメチル化されたＤＮＡを含まない一本鎖ＤＮＡと本オリゴヌクレオチドとの結合体は、複合体を形成しない。）。得られた複合体に含まれる本オリゴヌクレオチドを、その識別機能に基づき検出若しくは定量することにより、目的とするＤＮＡ領域においてメチル化されたＤＮＡを検出若しくは定量できる。
一つのクロマトストリップ上に複数の検出部位（それぞれ異なる目的とするＤＮＡ領域を捕獲できるような本オリゴヌクレオチドを支持体に固定する）を存在させ、各目的とするＤＮＡ領域を順次検出若しくは定量することも可能であり、また、１つの検出部位に複数の目的とするＤＮＡ領域を捕獲できるように、即ち、１つの検出部位に、複数の目的とするＤＮＡ領域を捕獲できるような本オリゴヌクレオチドを数多く固定化しておけば、検出感度を飛躍的に上げることができる。また、複数の目的とするＤＮＡ領域と複合体を形成できるように、複数の目的とするＤＮＡ領域を捕獲できるような識別機能を有する本オリゴヌクレオチドを数多く用いても、検出感度を飛躍的に上げることができる。さらに、１つの目的領域の中でも、数多くの本オリゴヌクレオチドを設計し、それらを支持体側又は検出側で用いても、検出感度を飛躍的に上げることができる。

このような本発明測定方法で使用し得る制限酵素、本オリゴヌクレオチド、又は、メチル化ＤＮＡ抗体は、検出用キットの試薬として有用である。本発明測定方法は、これら制限酵素、本オリゴヌクレオチド、又は、メチル化ＤＮＡ抗体等を試薬として含有する検出用キットや、これら本オリゴヌクレオチド、又は、メチル化ＤＮＡ抗体等が支持体上に固定化されてなる検出用チップも提供しており、本発明測定方法の権利範囲は、当該方法の実質的な原理を利用してなる前記のような検出用キットや検出用チップのような形態での使用ももちろん含むものである。

以下に実施例により本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。

実施例１
５’末端をビオチン標識した配列番号１７、１８，１９，２０で示される塩基配列からなるメチル化オリゴヌクレオチドＭ１、Ｍ２、Ｍ３、Ｍ４、及び、配列番号２１、２２、２３、２４で示される塩基配列からなるアンメチル化オリゴヌクレオチドＵ１、Ｕ２、Ｕ３、Ｕ４を合成し、夫々について、以下のＴＥバッファー（10mM Tris、1mM EDTA、pH 8.0）溶液を調製した。
溶液Ａ： 2.5pmol/100μL TEバッファー溶液
溶液Ｂ： 0.25pmol/100μL TEバッファー溶液
溶液Ｃ： 0.025pmol/100μL TEバッファー溶液
溶液Ｄ： 0.0025pmol/100μL TEバッファー溶液
溶液Ｅ： 0.00025pmol/100μL TEバッファー溶液
溶液Ｆ： 0pmol/100μL TEバッファー溶液（ネガティブコントロール液）
次いで、夫々の溶液（溶液Ａ〜溶液Ｆ）について、前記のメチル化オリゴヌクレオチドＭ１、Ｍ２、Ｍ３、Ｍ４の夫々の溶液を等量ずつ混合したメチル化オリゴヌクレオチド混合溶液Ｍ０、及び、前記のアンメチル化オリゴヌクレオチドＵ１、Ｕ２、Ｕ３、Ｕ４の夫々の溶液を等量ずつ混合したメチル化オリゴヌクレオチド混合溶液Ｕ０を調製した。

＜５’末端ビオチン標識メチル化オリゴヌクレオチド＞ Nは5-メチルシトシンを示す。
M1: 5’-ANGAANGTANGGANGC-3’（配列番号１７）
M2: 5’-TNGATNGTTNGGTNGC-3’（配列番号１８）
M3: 5’-GNGAGNGTGNGGGNGC-3’（配列番号１９）
M4: 5’-CNGACNGTCNGGCNGC-3’（配列番号２０）
＜５’末端ビオチン標識アンメチル化オリゴヌクレオチド＞
U1: 5’-ACGAACGTACGGACGC-3’（配列番号２１）
U2: 5’-TCGATCGTTCGGTCGC-3’（配列番号２２）
U3: 5’-GCGAGCGTGCGGGCGC-3’（配列番号２３）
U4: 5’-CCGACCGTCCGGCCGC-3’（配列番号２４）

得られた夫々の溶液について、以下の処理を施した（各溶液について２本ずつ調製）。

前記で調製した５’末端ビオチン標識オリゴヌクレオチド混合溶液（Ｍ０及びＵ０の溶液Ａ〜溶液Ｆ）各１００μLを、ストレプトアビジン被覆済み９６ウエルプレートに添加した後、プレートシェーカーに約１０秒供し、次いで約３０分間室温で放置することにより、当該プレートに前記５’末端ビオチン標識メチル化オリゴヌクレオチド、又は、５’末端ビオチン標識アンメチル化オリゴヌクレオチドを固定化した。放置後、前記プレート内の溶液をデカンテーションにて取り除き、次いで、前記プレート内の各ウエルを洗浄バッファー[0.05% Tween20含有リン酸バッファー（1mM KH₂PO₄、3mM Na2HPO 7H2O、154mM NaCl pH7.4）]３００μLで３回洗浄した。

前記の各ウエルにメチルシトシン抗体[Aviva Systems Biology社製、1又は 10μg/mL 0.1%BSA含有リン酸バッファー（1mM KH₂PO₄、3mM Na2HPO 7H2O、154mM NaCl pH7.4）溶液]１００μLを添加した後、２時間室温で放置した。放置後、当該各ウエルを洗浄バッファー[0.05% Tween20含有リン酸バッファー（1mM KH₂PO₄、3mM Na2HPO 7H2O、154mM NaCl pH7.4）]３００μLで３回洗浄した。

次に、ＨＲＰ標識マウスＩｇＧ抗体[Santa Cruz Biotechnology社製、0.05μg/100μL 0.1%BSA含有リン酸バッファー（1mM KH₂PO₄、3mM Na2HPO 7H2O、154mM NaCl pH7.4）溶液]１００μLを前記の各ウエルに添加した後、２時間室温で放置した。放置後、当該各ウエルを洗浄バッファー[0.05% Tween20含有リン酸バッファー（1mM KH₂PO₄、3mM Na2HPO 7H2O、154mM NaCl pH7.4）]３００ μLで３回洗浄し、次いで基質（R&D社製、#DY999）１００μLを、前記の各ウエルに添加・混合することにより、反応を開始した。

次いで約２０分間室温で放置した後、当該各ウエルにストップ溶液(1N H₂SO₄水溶液)５０μLを添加することにより、反応を停止した。反応停止後３０分以内に得られた試料の４５０nmの吸光度を測定した。

その結果を図１及び図２に示した。固定化した５’末端ビオチン標識メチル化オリゴヌクレオチドＭ０が、固定化した５’末端ビオチン標識アンメチル化オリゴヌクレオチドＵ０よりも非常に感度良く検出・定量されることが明らかとなった。また、使用するメチル化抗体量を多くしずぎると（１０μg/ｍＬ、図２）、固定化した５’末端ビオチン標識アンメチル化オリゴヌクレオチドの量が多い溶液Ａ及び溶液Ｂで、非特異的な結合が起こることが示唆された。
以上より、メチルシトシン抗体を用いた本発明測定方法において、メチル化されたＤＮＡフラグメントの検出・定量が可能であることが確認された。

実施例２
配列番号２５で示される塩基配列からなるメチル化オリゴヌクレオチドＵＢＣ−Ｍ８、及び、配列番号２６で示される塩基配列からなるアンメチル化オリゴヌクレオチドＵＢＣ−ＵＭ８を合成し、夫々について、以下のＴＥバッファー溶液を調製した。
溶液Ａ： 0.1pmol/10μL TEバッファー溶液
溶液Ｂ： 0.01pmol/10μL TEバッファー溶液
溶液Ｃ： 0.001pmol/10μL TEバッファー溶液
溶液Ｄ： 0pmol/10μL TEバッファー溶液（ネガティブコントロール液）

＜メチル化オリゴヌクレオチド＞ Nは5-メチルシトシンを示す。
UBC-M8：5’- ANGAANGTANGGANGCTNGATNGTTNGGTNGCCTGTCTGACTACAACATCCAGA -3’（配列番号２５）
＜アンメチル化オリゴヌクレオチド＞
UBC-U8：5’- ACGAACGTACGGACGCTCGATCGTTCGGTCGCCTGTCTGACTACAACATCCAGA -3’（配列番号２６）

また、配列番号２７で示される塩基配列からなる５’末端ビオチン標識オリゴヌクレオチドＢ１を合成し、０．００２μM ＴＥバッファー溶液を調製した。

＜５’末端ビオチン標識オリゴヌクレオチド＞
B1：5’- TCTGGATGTTGTAGTCAGACAG -3’（配列番号２７）

得られたメチル化オリゴヌクレオチド、又は、アンメチル化オリゴヌクレオチドの夫々の溶液について、以下の処理を施した（各溶液について１本ずつ調製）。

ＰＣＲチューブに、前記で調製したオリゴヌクレオチド溶液1０μLと、前記の５’末端ビオチン標識オリゴヌクレオチド溶液５０μLと、緩衝液（330mM Tris-Acetate pH 7.9、660mM KOAc、100mM MgOAc₂、5mM Dithiothreitol）１０μＬとを添加し、さらに当該混合物に滅菌超純水を加えて液量を１００μＬとし、混合した。次いで、当該ＰＣＲチューブを９５℃で１０分間加熱し、７０℃まで速やかに冷却し、その温度で１０分間保温した。更にこれを５０℃まで冷却し１０分間保温し、次いで３７℃で１０分間保温した後、室温に戻すことにより、５’末端ビオチン標識オリゴヌクレオチドとオリゴヌクレオチドとの結合体の形成を促した。

得られた混合物全てをストレプトアビジン被覆済み９６ウエルプレートに移し、約３０分間室温で放置することにより、当該プレートに前記５’末端ビオチン標識オリゴヌクレオチドとオリゴヌクレオチドとの結合体を固定化した。放置後、前記プレート内の溶液をデカンテーションにて取り除き、次いで前記のプレート内の各ウエルを洗浄バッファー[0.05% Tween20含有リン酸バッファー（1mM KH₂PO₄、3mM Na2HPO 7H2O、154mM NaCl pH7.4）]２００μLで３回洗浄した。

前記の各ウエルにメチルシトシン抗体[Aviva Systems Biology社製、1μg/mL 0.1% BSA含有リン酸バッファー（1mM KH₂PO₄、3mM Na2HPO 7H2O、154mM NaCl pH7.4）溶液]１００μLを添加した後、１時間室温で放置した。放置後、当該各ウエルを洗浄バッファー[0.05% Tween20含有リン酸バッファー（1mM KH₂PO₄、3mM Na2HPO 7H2O、154mM NaCl pH7.4）]２００μLで３回洗浄した。

次に、Ｅｕ−Ｎ１標識マウスＩｇＧ抗体[Perkin Elmer社製、0.25μg/mL 0.1% BSA含有リン酸バッファー（1mM KH₂PO₄、3mM Na2HPO 7H2O、154mM NaCl pH7.4）溶液]１００μLを前記の各ウエルに添加した後、１時間室温で放置した。放置後、当該各ウエルを洗浄バッファー[0.05% Tween20含有リン酸バッファー（1mM KH₂PO₄、3mM Na2HPO 7H2O、154mM NaCl pH7.4）]２００ μLで３回洗浄した。

Enhancement Solution（Perkin Elmer社製）２００μLを前記の各ウエルに添加・混合することにより、反応を開始した。次いで、約３分間室温で放置した後、得られた試料の蛍光を励起３４０nm／蛍光６１２nmで測定した。

その結果を図３に示した。メチル化オリゴヌクレオチドＵＢＣ−Ｍ８が、アンメチル化オリゴヌクレオチドＵＢＣ−Ｕ８よりも、固定化した５’末端ビオチン標識オリゴヌクレオチドＢ１により精度よく選択され、感度良く検出・定量されることが明らかとなった。

以上より、メチルシトシン抗体と、メチル化されたＤＮＡフラグメントと、固定化した５’末端ビオチン標識オリゴヌクレオチドとの複合体を形成・分離し、複合体の中のメチルシトシン抗体を、その識別機能に基づき検出・定量が可能であり、本発明測定方法においてメチル化されたＤＮＡフラグメントの検出・定量が可能であることが確認された。

実施例３
配列番号２８で示される塩基配列からなるメチル化オリゴヌクレオチドＵＢＣ−Ｍ、配列番号２９で示される塩基配列からなる部分メチル化オリゴヌクレオチドＵＢＣ−ＨＭ、及び、配列番号３０で示される塩基配列からなるアンメチル化オリゴヌクレオチドＵＢＣ−ＵＭを合成し、夫々について、以下のＴＥバッファー溶液を調製した。
溶液Ａ：0.1pmoL/10μL TEバッファー溶液
溶液Ｂ：0.01pmoL/10μL TEバッファー溶液
溶液Ｃ：0.001pmoL/10μL TEバッファー溶液
溶液Ｄ：TEバッファー溶液（ネガティブコントロール液）

＜メチル化オリゴヌクレオチド＞ Nは5-メチルシトシンを示す。
UBC-M：5’-AGTGACACCATNGAGAATGTCAGATCNGGATCAGAGNGCCATCTAGATGGACATGTCACTGTCTGACTACAACATCCAGA-3’（配列番号２８）
＜部分メチル化オリゴヌクレオチド＞ Nは5-メチルシトシンを示す。
UBC-HM：5’-AGTGACACCATNGAGAATGTCAGATCCGGATCAGAGCGCCATCTAGATGGACATGTCACTGTCTGACTACAACATCCAGA-3’（配列番号２９）
＜アンメチル化オリゴヌクレオチド＞
UBC-UM：5’-AGTGACACCATCGAGAATGTCAGATCCGGATCAGAGCGCCATCTAGATGGACATGTCACTGTCTGACTACAACATCCAGA-3’（配列番号３０）

得られた夫々の溶液について、以下の処理を施した（各溶液について１本ずつ調製）。

Ａ群（無処理群）：ＰＣＲチューブに、前記で調製したオリゴヌクレオチド溶液１０μＬと、緩衝液（330mM Tris-Acetate pH 7.9、660mM KOAc、100mM MgOAc₂、5mM Dithiothreitol）５μＬと、ＢＳＡ（Bovine serum albumin 1mg/mL）５μＬとを添加した後、これに配列番号３１で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドＭＡをマスキング用オリゴヌクレオチドとして５ｐｍｏｌ添加して、さらに当該混合物に滅菌超純水を加えて液量を５０μＬとし、混合した。

Ｂ群（ＨｈａＩ処理群）：ＰＣＲチューブに、前記で調製したオリゴヌクレオチド溶液１０μＬと、ＨｈａＩ５Ｕと、緩衝液（330mM Tris-Acetate pH 7.9、660mM KOAc、100mM MgOAc₂、5mM Dithiothreitol）５μＬと、ＢＳＡ（Bovine serum albumin 1mg/mL）５μＬとを添加した後、これに配列番号３１で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドＭＡをマスキング用オリゴヌクレオチドとして５ｐｍｏｌ添加し、さらに当該混合物に滅菌超純水を加えて液量を５０μＬとし、混合した。

＜マスキング用オリゴヌクレオチド＞
MA：5’-GATGGCGCTCTG-3’（配列番号３１）

各々の反応液を３７℃で１５時間インキュベーションした後、これらに配列番号３２で示される塩基配列を有する５’末端ビオチン標識オリゴヌクレオチドＢ１の０．００２μＭＴＥバッファー溶液５０μLを添加し混合した。

＜５’末端ビオチン標識オリゴヌクレオチド＞
B1：5’- TCTGGATGTTGTAGTCAGACAG -3’（配列番号３２）

次いで、当該ＰＣＲチューブを９５℃で１０分間加熱し、７０℃まで速やかに冷却し、その温度で１０分間保温した。更に、これを５０℃まで冷却し１０分間保温し、次いで３７℃で１０分間保温した後、室温に戻することにより、５’末端ビオチン標識オリゴヌクレオチドとオリゴヌクレオチドとの結合体の形成を促した。

得られた混合物全てをストレプトアビジン被覆済み９６ウエルプレートに移し、約３０分間室温で放置することにより、当該プレートに前記５’末端ビオチン標識オリゴヌクレオチドとオリゴヌクレオチドとの結合体を固定化した。放置後、前記プレート内の溶液をデカンテーションにて取り除き、次いで前記プレート内の各ウエルを洗浄バッファー[0.05% Tween20含有リン酸バッファー（1mM KH₂PO₄、3mM Na2HPO 7H2O、154mM NaCl pH7.4）]２００μLで３回洗浄した。

前記の各ウエルにメチルシトシン抗体[Aviva Systems Biology社製、1μg/mL 0.1% BSA含有リン酸バッファー（1mM KH₂PO₄、3mM Na2HPO 7H2O、154mM NaCl pH7.4）溶液]１００μLを添加した後、１時間室温で放置した。放置後、当該各ウエルから溶液をデカンテーションにて取り除いた後、当該各ウエルを洗浄バッファー[0.05% Tween20含有リン酸バッファー（1mM KH₂PO₄、3mM Na2HPO 7H2O、154mM NaCl pH7.4）]２００μLで３回洗浄した。

次に、Ｅｕ−Ｎ１標識マウスＩｇＧ抗体[Perkin Elmer社製、0.25μg/mL 0.1% BSA含有リン酸バッファー（1mM KH₂PO₄、3mM Na2HPO 7H2O、154mM NaCl pH7.4）溶液]１００μLを前記の各ウエルに添加した後、１時間室温で放置した。放置後、当該各ウエルから溶液をデカンテーションにて取り除き、次いで当該各ウエルを洗浄バッファー[0.05% Tween20含有リン酸バッファー（1mM KH₂PO₄、3mM Na2HPO 7H2O、154mM NaCl pH7.4）]２００μLで３回洗浄した。

Enhancement Solution（Perkin Elmer社製）２００μLを前記の各ウエルに添加・混合することにより、反応を開始した。約４５分間室温で放置した後、得られた試料の蛍光を励起３４０nm／蛍光６１２nmで測定した。

その結果を図４及び図５に示した。Ａ群（無処理群）の場合（図４）、ＣＧ配列の３箇所のうち３箇所ともメチル化されているメチル化オリゴヌクレオチドＵＢＣ−Ｍでは、固定化した５’末端ビオチン標識オリゴヌクレオチドＢ１と、メチルシトシン抗体との複合体を形成・分離し、複合体の中のビオチン標識により、非常に感度良く検出・定量されることが明らかとなった。一方、ＣＧ配列の３箇所のうち１箇所だけメチル化されている部分メチル化オリゴヌクレオチドＵＢＣ−ＨＭでは、固定化した５’末端ビオチン標識オリゴヌクレオチドＢ１とメチルシトシン抗体との複合体を形成・分離し、上記のＵＢＣ−Ｍにおける感度の約１/３の感度で検出・定量されることが明らかとなった。ＣＧ配列の３箇所のうち１箇所もメチル化されていないアンメチル化オリゴヌクレオチドＵＢＣ−ＵＭでは、固定化した５’末端ビオチン標識オリゴヌクレオチドＢ１とメチルシトシン抗体との複合体を形成・分離しないため、略バックグラウンド値（溶液Ｄのデータ）と同様の値を示した。Ｂ群（ＨｈａＩ処理群）の場合（図５）、ＣＧ配列の３箇所のうち３箇所ともメチル化されているメチル化オリゴヌクレオチドＵＢＣ−Ｍでは、メチル化感受性制限酵素（ＨｈａＩ）で消化されないので、固定化した５’末端ビオチン標識オリゴヌクレオチドＢ１とメチルシトシン抗体との複合体を形成・分離し、複合体の中のビオチン標識によりＡ群（無処理群）と略同様、感度良く検出・定量されることが明らかとなった。ＣＧ配列の３箇所のうち１箇所だけメチル化されている部分メチル化オリゴヌクレオチドＵＢＣ−ＨＭでは、メチル化感受性制限酵素（ＨｈａＩ）による消化によって、メチル化されたＣＧ配列は無くなってしまう。従って、複合体を形成・分離しないため、バックグラウンド値（溶液Ｄのデータ）と略同様の値であった。ＣＧ配列の３箇所のうち１箇所もメチル化されていないアンメチル化オリゴヌクレオチドＵＢＣ−ＵＭでは、Ａ処理群（無処理群）と同様、複合体を形成・分離しないため、バックグラウンド値と略同様の値であった。

以上より、メチル化感受性制限酵素で消化処理することにより、部分的にメチル化されているＤＮＡフラグメントを消化できること、且つ、メチルシトシン抗体とメチル化されたＤＮＡフラグメントと固定化した５’末端ビオチン標識オリゴヌクレオチドとの複合体を形成・分離し、複合体の中のメチルシトシン抗体を、その識別機能に基づき検出・定量することにより、メチル化されたＤＮＡフラグメントの検出・定量が可能であることが明らかとなった。

実施例４
配列番号３３で示される塩基配列からなるメチル化オリゴヌクレオチドＵＢＣ８６−Ｍ、及び、配列番号３４で示される塩基配列からなる部分メチル化オリゴヌクレオチドＵＢＣ１１８−ＨＭを合成し、夫々について、以下のＴＥバッファー溶液を調製した。
溶液Ａ：0.1pmoL/10μL TEバッファー溶液
溶液Ｂ：0.01pmoL/10μL TEバッファー溶液
溶液Ｃ：0.001pmoL/10μL TEバッファー溶液
溶液Ｄ：TEバッファー溶液（ネガティブコントロール液）

＜メチル化オリゴヌクレオチド＞ Nは5-メチルシトシンを示す。
UBC86-M：5’- AGTGACACCATNGAGAATGTCAGATCNGGATCAGAGNGCCATCTACNGGATGGACATGNGCTCACTGTCTGACTACAACATCCAGA -3’（配列番号３３）
＜部分メチル化オリゴヌクレオチド＞ Nは5-メチルシトシンを示す。
UBC118-HM：5’- AGTGACACCATNGAGAATGTCAGANGATNGATNGTANGTANGGANGCTNGGTNGCATCNGGATCAGAGCGCCATCTACNGGATGGACATGNGCTCACTGTCTGACTACAACATCCAGA -3’（配列番号３４）

Ａ群（無処理群）：ＰＣＲチューブに、前記で調製したオリゴヌクレオチド溶液１０μＬと、緩衝液（330mM Tris-Acetate pH 7.9、660mM KOAc、100mM MgOAc₂、5mM Dithiothreitol）５μＬと、ＢＳＡ（Bovine serum albumin 1mg/mL）５μＬとを添加した後、これに配列番号３５で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドＭＡをマスキング用オリゴヌクレオチドとして５ｐｍｏｌ添加し、さらに当該混合物に滅菌超純水を加えて液量を５０μＬとし、混合した。

Ｂ群（ＨｈａＩ処理群）：ＰＣＲチューブに、前記で調製したオリゴヌクレオチド溶液１０μLと、ＨｈａＩ５Ｕと、緩衝液（330mM Tris-Acetate pH 7.9、660mM KOAc、100mM MgOAc₂、5mM Dithiothreitol）５μＬと、ＢＳＡ（Bovine serum albumin 1mg/mL）５μＬとを添加した後、これに配列番号３５で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドＭＡをマスキング用オリゴヌクレオチドとして５ｐｍｏｌ添加し、さらに当該混合物に滅菌超純水を加えて液量を５０μＬとし、混合した。

＜マスキング用オリゴヌクレオチド＞
MA：5’-GATGGCGCTCTG-3’（配列番号３５）

各々の反応液を３７℃で１６時間インキュベーションした後、これに配列番号３６で示される塩基配列を有する５’末端ビオチン標識オリゴヌクレオチドＢ１の０．００２μＭＴＥバッファー溶液５０μLを添加し混合した。

＜５’末端ビオチン標識オリゴヌクレオチド＞
B1：5’- TCTGGATGTTGTAGTCAGACAG -3’（配列番号３６）

次いで、当該ＰＣＲチューブを９５℃で１０分間加熱し、７０℃まで速やかに冷却し、その温度で１０分間保温した。更に、これを５０℃まで冷却し１０分間保温し、次いで３７℃で１０分間保温した後、室温に戻すことにより、５’末端ビオチン標識オリゴヌクレオチドとオリゴヌクレオチドとの結合体の形成を促した。

得られた混合物全てをストレプトアビジン被覆済み９６ウエルプレートに移し、約３０分間、室温で放置することにより、当該プレートに前記５’末端ビオチン標識オリゴヌクレオチドとオリゴヌクレオチドとの結合体を固定化した。放置後、前記プレート内の溶液をデカンテーションにて取り除き、次いで前記プレート内の各ウエルを洗浄バッファー[0.05% Tween20含有リン酸バッファー（1mM KH₂PO₄、3mM Na2HPO 7H2O、154mM NaCl pH7.4）]２００μLで３回洗浄した。

次に、Ｅｕ−Ｎ１標識マウスＩｇＧ抗体[Perkin Elmer社製、0.25μg/mL 0.1% BSA含有リン酸バッファー（1mM KH₂PO₄、3mM Na2HPO 7H2O、154mM NaCl pH7.4）溶液]１００ μLを前記の各ウエルに添加した後、１時間室温で放置した。放置後、当該各ウエルから溶液をデカンテーションにて取り除き、次いで当該各ウエルを洗浄バッファー[0.05% Tween20含有リン酸バッファー（1mM KH₂PO₄、3mM Na2HPO 7H2O、154mM NaCl pH7.4）]２００μLで３回洗浄した。

Enhancement Solution（Perkin Elmer社製）２００μLを前記の各ウエルに添加・混合することにより、反応を開始した。その後、約４５分間、室温で放置した後、得られた試料の蛍光を励起３４０nm／蛍光６１２nmで測定した。

その結果を図６及び図７に示した。Ａ群（無処理群）の場合（図６）、ＣＧ配列の５箇所のうち５箇所ともメチル化されているメチル化オリゴヌクレオチドＵＢＣ８６−Ｍでは、固定化した５’末端ビオチン標識オリゴヌクレオチドとメチルシトシン抗体との複合体を形成・分離し、複合体の中のビオチン標識により、感度良く検出・定量されることが明らかとなった。一方、ＣＧ配列の１３箇所のうち１２箇所だけメチル化されている部分メチル化オリゴヌクレオチドＵＢＣ１１８−ＨＭでは、ＵＢＣ８６−Ｍにおける感度の約１．４倍の感度で検出・定量されることが明らかとなった。Ｂ群（ＨｈａＩ処理群）の場合（図７）、ＣＧ配列の５箇所のうち５箇所ともメチル化されているメチル化オリゴヌクレオチドＵＢＣ８６−Ｍでは、メチル化感受性制限酵素（ＨｈａＩ）で消化されないので、固定化した５’末端ビオチン標識オリゴヌクレオチドとメチルシトシン抗体との複合体を形成・分離し、複合体の中のビオチン標識により、Ａ群（無処理群）と略同様、感度良く検出・定量されることが明らかとなった。一方、ＣＧ配列の１３箇所のうち１２箇所だけメチル化されている部分メチル化オリゴヌクレオチドＵＢＣ１１８−ＨＭでは、メチル化感受性制限酵素（ＨｈａＩ）による消化によって、メチル化されたＣＧは２箇所しか残っていない。従って、ＵＢＣ１１８−ＨＭの検出・定量結果は、ＵＢＣ８６−Ｍよりも低い結果となった。

以上より、メチル化感受性制限酵素で処理することにより、部分的にメチル化されているＤＮＡフラグメントを消化できること、且つ、メチルシトシン抗体と、メチル化されたＤＮＡフラグメントと、固定化した５’末端ビオチン標識オリゴヌクレオチドとの複合体を形成・分離し、複合体の中のメチルシトシン抗体を、その識別機能に基づき検出・定量することにより、メチル化されたＤＮＡフラグメントの検出・定量が可能であることが明らかとなった。

実施例５
配列番号３７で示される塩基配列からなるメチル化オリゴヌクレオチドＵＢＣ−Ｍ８、
配列番号３８で示される塩基配列からなるメチル化オリゴヌクレオチドＦＢＮ−Ｍ８、
配列番号３９で示される塩基配列からなるメチル化オリゴヌクレオチドＧＰＲ−Ｍ８、
配列番号４０で示される塩基配列からなるアンメチル化オリゴヌクレオチドＵＢＣ−Ｕ８、
配列番号４１で示される塩基配列からなるアンメチル化オリゴヌクレオチドＦＢＮ−Ｕ８、及び、
配列番号４２で示される塩基配列からなるアンメチル化オリゴヌクレオチドＧＰＲ−Ｕ８を合成して、メチル化オリゴヌクレオチドおよびアンメチル化オリゴヌクレオチド夫々につき以下のＴＥバッファー溶液を調製した。
溶液Ａ：0.3pmol/10μL TEバッファー溶液
溶液Ｂ：0.03pmol/10μL TEバッファー溶液
溶液Ｃ：0.003pmol/10μL TEバッファー溶液
溶液Ｄ：0pmol/10μL TEバッファー溶液（ネガティブコントロール液）
次いで、夫々の溶液（溶液Ａ〜溶液Ｄ）について、前記のメチル化オリゴヌクレオチドＵＢＣ−Ｍ８、ＦＢＮ−Ｍ８、ＧＰＲ−Ｍ８の夫々の溶液を等量ずつ混合したメチル化オリゴヌクレオチド混合溶液Ｍ０、及び、前記のアンメチル化オリゴヌクレオチドＵＢＣ−Ｕ８、ＦＢＮ−Ｕ８、ＧＰＲ−Ｕ８の夫々の溶液を等量ずつ混合したメチル化オリゴヌクレオチド混合溶液Ｕ０を調製した。

＜メチル化オリゴヌクレオチド＞ Nは5-メチルシトシンを示す。
UBC-M8：5’- ANGAANGTANGGANGCTNGATNGTTNGGTNGCCTGTCTGACTACAACATCCAGA -3’（配列番号３７）
FBN-M8：5’- ANGAANGTANGGANGCTNGATNGTTNGGTNGCCAGCCGACGAAGGGCTTATTAG -3’（配列番号３８）
GPR-M8：5’- ANGAANGTANGGANGCTNGATNGTTNGGTNGCCTGCCGAGAACGAGGCGTTGTC -3’（配列番号３９）
＜アンメチル化オリゴヌクレオチド＞
UBC-U8：5’- ACGAACGTACGGACGCTCGATCGTTCGGTCGCCTGTCTGACTACAACATCCAGA -3’（配列番号４０）
FBN-U8：5’- ACGAACGTACGGACGCTCGATCGTTCGGTCGCCAGCCGACGAAGGGCTTATTAG -3’（配列番号４１）
GPR-U8：5’- ACGAACGTACGGACGCTCGATCGTTCGGTCGCCTGCCGAGAACGAGGCGTTGTC -3’（配列番号４２）

配列番号４３、配列番号４４、及び、配列番号４５で示される塩基配列を有する５’末端ビオチン標識オリゴヌクレオチドＵＢＣ、ＦＢＮ、及び、ＧＰＲの０．１ｐｍｏｌ/５０μL ＴＥバッファー溶液を調製した（夫々、ＵＢＣ−Ｂ溶液、ＦＢＮ−Ｂ溶液、及び、ＧＰＲ−Ｂ溶液）。また、配列番号４３、配列番号４４、及び、配列番号４５で示される塩基配列を有する５’末端ビオチン標識オリゴヌクレオチドＵＢＣ、ＦＢＮ、及び、ＧＰＲを等量ずつ混合した（各０．１ｐｍｏｌ/５０μL）ＴＥバッファー溶液であるビオチン標識オリゴヌクレオチド溶液（ビオチン標識オリゴヌクレオチド混合溶液）を調製した。

＜５’末端ビオチン標識オリゴヌクレオチド＞
UBC：5’- TCTGGATGTTGTAGTCAGACAG -3’（配列番号４３）
FBN：5’- CTAATAAGCCCTTCGTCGGCT -3’（配列番号４４）
GPR：5’- GACAACGCCTCGTTCTCGG -3’（配列番号４５）

前記のメチル化オリゴヌクレオチド混合溶液Ｍ０、及び、アンメチル化オリゴヌクレオチド混合溶液Ｕ０の夫々の溶液（溶液Ａ〜溶液Ｄ）について、以下の処理を施した（各４本ずつ調製）。

ＰＣＲチューブに、前記で調製したオリゴヌクレオチド溶液１０μＬと、緩衝液（330mM Tris-Acetate pH 7.9、660mM KOAc、100mM MgOAc₂、5mM Dithothreitol）１０μＬとを添加した後、上記の５’末端ビオチン標識オリゴヌクレオチドの各溶液（ＵＢＣ−Ｂ溶液、ＦＢＮ−Ｂ溶液、ＧＰＲ−Ｂ溶液、及び、ビオチン標識オリゴヌクレオチド混合溶液）を各反応液に５０μLを添加した後、さらに当該混合物に滅菌超純水を加えて液量を１００μＬとし、混合した。

得られた溶液中混合物全てをストレプトアビジン被覆済み９６ウエルプレートに移し、約３０分間室温で放置することにより、当該プレートに前記５’末端ビオチン標識オリゴヌクレオチドとオリゴヌクレオチドとの結合体を固定化した。放置後、前記プレート内の溶液をデカンテーションにて取り除き、次いで前記プレート内の各ウエルを洗浄バッファー[0.05% Tween20含有リン酸バッファー（1mM KH₂PO₄、3mM Na2HPO 7H2O、154mM NaCl pH7.4）]２００μLで３回洗浄した。

前記の各ウエルにメチルシトシン抗体[Aviva Systems Biology社製、1μg/mL 0.1% BSA含有リン酸バッファー（1mM KH₂PO₄、3mM Na2HPO 7H2O、154mM NaCl pH7.4）溶液]１００μLを添加した後、１時間室温で放置した。その後、当該各ウエルを洗浄バッファー[0.05% Tween20含有リン酸バッファー（1mM KH₂PO₄、3mM Na2HPO 7H2O、154mM NaCl pH7.4）]２００μLで３回洗浄した。

次に、Ｅｕ−Ｎ１標識マウスＩｇＧ抗体[Perkin Elmer社製、0.25μg/μL 0.1% BSA含有リン酸バッファー（1mM KH₂PO₄、3mM Na2HPO 7H2O、154mM NaCl pH7.4）溶液]１００ μLを前記の各ウエルに添加した後、１時間室温で放置した。放置後、当該各ウエルを洗浄バッファー[0.05% Tween20含有リン酸バッファー（1mM KH₂PO₄、3mM Na2HPO 7H2O、154mM NaCl pH7.4）]２００μLで３回洗浄した。

その結果を図８〜図１１に示した。メチル化オリゴヌクレオチド混合溶液Ｍ０では、固定化した５’末端ビオチン標識オリゴヌクレオチドＵＢＣ（図８）、ＦＢＮ（図９）、ＧＰＲ（図１０）及び、前記３種を混合したオリゴヌクレオチド（図１１）と、メチルシトシン抗体との複合体を形成・分離し、複合体の中のビオチン標識により、感度良く検出・定量されることが明らかとなった。特に３種のオリゴヌクレオチドを混合した場合（図１１）では、単独オリゴヌクレオチドでの検出（図８〜図１０）に比べて感度良く検出・定量されることが明らかとなった。アンメチル化オリゴヌクレオチド混合溶液Ｕ０では、固定化した５’末端ビオチン標識オリゴヌクレオチドＵＢＣ（図８）、ＦＢＮ（図９）、ＧＰＲ（図１０）及び、前記３種を混合したオリゴヌクレオチド（図１１）と、メチルシトシン抗体との複合体を形成しないため、いずれにおいても、略バックグラウンド値と同様の値を示した。

以上より、メチルシトシン抗体と、メチル化されたＤＮＡフラグメントと、固定化した５’末端ビオチン標識オリゴヌクレオチドとの複合体を形成・分離し、複合体の中のメチルシトシン抗体を、その識別機能に基づき検出・定量することにより、メチル化されたＤＮＡフラグメントの検出・定量が可能であることが明らかとなった。さらに複数の固定化した５’末端ビオチン標識オリゴヌクレオチドを用いることによって１種の固定化した５’末端ビオチン標識オリゴヌクレオチドを用いる場合よりも（即ち、１つの目的とするＤＮＡ領域を用いるだけでなく、同時に、複数の目的とするＤＮＡ領域を用いることによって）、感度良く検出・定量できることが明らかとなった。

実施例６
市販のメチルシトシン抗体（Aviva Systems Biology社製）を、市販ビオチン化キット（Biotin Labeling Kit-NH2、同仁化学研究所製）を用いて、カタログに記載された方法に準じて、ビオチン標識した。得られたビオチン標識メチルシトシン抗体を溶液[抗体約0.1μg/100μL 0.1% BSA含有リン酸バッファー（1mM KH₂PO₄、3mM Na2HPO 7H2O、154mM NaCl pH7.4）溶液]として冷蔵保存した。

合成して得られたビオチン標識メチルシトシン抗体溶液を、ストレプトアビジン被覆済み９６ウエルプレートに１００μL/ウエルを添加した後、約１時間室温で放置することによりウエルに固定化した。放置後、当該各ウエルから溶液をデカンテーションにより取り除き、次いで、前記の各ウエルに２００μＬの洗浄バッファー[0.05% Tween20含有リン酸バッファー（1mM KH₂PO₄、3mM Na2HPO 7H2O、154mM NaCl pH7.4）]を添加した後、当該各ウエルから当該バッファーをデカンテーションにより取り除いた。この操作をさらに２回繰り返した。

配列番号４６で示される塩基配列からなるメチル化オリゴヌクレオチドＵＢＣ−Ｍ８、配列番号４７で示される塩基配列からなるメチル化オリゴヌクレオチドＦＢＮ−Ｍ８、配列番号４８で示される塩基配列からなるメチル化オリゴヌクレオチドＧＰＲ−Ｍ８、配列番号４９で示される塩基配列からなるアンメチル化オリゴヌクレオチドＵＢＣ−Ｕ８、配列番号５０で示される塩基配列からなるアンメチル化オリゴヌクレオチドＦＢＮ−Ｕ８、及び、配列番号５１で示される塩基配列からなるアンメチル化オリゴヌクレオチドＧＰＲ−Ｕ８を合成して夫々につき以下の溶液を調製した。
溶液Ａ：0.1pmoL/10μL TEバッファー溶液
溶液Ｂ：0.01pmoL/10μL TEバッファー溶液
溶液Ｃ：0.001pmoL/10μL TEバッファー溶液
溶液Ｄ：0pmoL/10μL TEバッファー溶液（ネガティブコントロール液）

＜メチル化オリゴヌクレオチド＞ Nは5-メチルシトシンを示す。
UBC-M8：5’- ANGAANGTANGGANGCTNGATNGTTNGGTNGCCTGTCTGACTACAACATCCAGA -3’（配列番号４６）
GPR-M8：5’- ANGAANGTANGGANGCTNGATNGTTNGGTNGCCTGCCGAGAACGAGGCGTTGTC -3’（配列番号４７）
FBN-M8：5’- ANGAANGTANGGANGCTNGATNGTTNGGTNGCCAGCCGACGAAGGGCTTATTAG -3’（配列番号４８)
＜アンメチル化オリゴヌクレオチド＞
UBC-UM8：5’- ACGAACGTACGGACGCTCGATCGTTCGGTCGCCTGTCTGACTACAACATCCAGA -3’（配列番号４９）
GPR-UM8：5’- ACGAACGTACGGACGCTCGATCGTTCGGTCGCCTGCCGAGAACGAGGCGTTGTC -3’（配列番号５０）
FBN-UM8：5’- ACGAACGTACGGACGCTCGATCGTTCGGTCGCCAGCCGACGAAGGGCTTATTAG -3’（配列番号５１）

次に、５’末端をＦＩＴＣ標識した配列番号５２で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドＵＢＣ、５’末端をＦＩＴＣ標識した配列番号５３で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドＧＰＲ、及び、５’末端をＦＩＴＣ標識した配列番号５４で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドＦＢＮを合成し、１ｐｍｏｌ/５０μＬＴＥバッファー溶液を調製した（夫々、ＵＢＣ-ＦＩＴＣ溶液、ＦＢＮ-ＦＩＴＣ溶液、及び、ＧＰＲ-ＦＩＴＣ溶液）。

＜５’末端FITC標識オリゴヌクレオチド＞
UBC：5’- TCTGGATGTTGTAGTCAGACAG -3’（配列番号５２）
GPR：5’- GACAACGCCTCGTTCTCGG -3’（配列番号５３）
FBN：5’- CTAATAAGCCCTTCGTCGGCT -3’（配列番号５４）

ＵＢＣ混合溶液の調製：ＰＣＲチューブに、前記で調製したオリゴヌクレオチド溶液（ＵＢＣ−Ｍ８又はＵＢＣ−Ｕ８溶液）１０μLと、前記で調製した５’末端ＦＩＴＣ標識オリゴヌクレオチド溶液（ＵＢＣ-ＦＩＴＣ溶液）５０μLと、緩衝液（330mM Tris-Acetate pH 7.9、660mM KOAc、100mM MgOAc2、5mM Dithothreitol）５μＬとを添加し、さらに当該混合物に滅菌超純水を加えて液量を１００μＬとし、混合した。

ＦＢＮ混合溶液の調製：ＰＣＲチューブに、前記で調製したオリゴヌクレオチド溶液（ＦＢＮ−Ｍ８又はＦＢＮ−Ｕ８溶液）１０μLと、前記で調製した５’末端ＦＩＴＣ標識オリゴヌクレオチド溶液（ＦＢＮ-ＦＩＴＣ溶液）５０μLと、緩衝液（330mM Tris-Acetate pH 7.9、660mM KOAc、100mM MgOAc2、5mM Dithothreitol）５μＬとを添加し、さらに当該混合物に滅菌超純水を加えて液量を１００μＬとし、混合した。

ＧＰＲ混合溶液の調製：ＰＣＲチューブに、前記で調製したオリゴヌクレオチド溶液（ＧＰＲ−Ｍ８又はＧＰＲ−Ｕ８溶液）１０μLと、前記で調製した５’末端ＦＩＴＣ標識オリゴヌクレオチド溶液（ＧＰＲ-ＦＩＴＣ溶液）５０μLと、緩衝液（330mM Tris-Acetate pH 7.9、660mM KOAc、100mM MgOAc₂、5mM Dithothreitol）５μＬとを添加し、さらに当該混合物に滅菌超純水を加えて液量を１００μＬとし、混合した。

各々のＰＣＲチューブを９５℃で１０分間加熱し、７０℃まで速やかに冷却し、その温度で１０分間保温した。更に、これを５０℃まで冷却し１０分間保温し、次いで３７℃で１０分間保温した後、室温に戻すことにより、５’末端ＦＩＴＣ標識オリゴヌクレオチドとメチル化又はアンメチル化オリゴヌクレオチドとの結合体の形成を促した。

５’末端ＦＩＴＣ標識オリゴヌクレオチドとメチル化又はアンメチル化オリゴヌクレオチドとの結合体の入ったＰＣＲチューブの溶液全量を、先に調製しておいたビオチン標識メチルシトシン抗体が固定化されたプレートに移し代え、室温で約１時間放置した。放置後、前記プレート内の溶液をデカンテーションにより取り除き、次いで、前記プレート内の各ウエルに２００μＬの洗浄バッファー[0.05% Tween20含有リン酸バッファー（1mM KH₂PO₄、3mM Na2HPO 7H2O、154mM NaCl pH7.4）]を添加した後、当該各ウエルから当該バッファーをデカンテーションにより取り除いた。この操作をさらに２回繰り返した。

その後、ＨＲＰ標識ＦＩＴＣ抗体溶液[Jackson ImmunoResearch Laboratories社製、0.01μg/100μL 0.1% BSA含有リン酸バッファー（1mM KH₂PO₄、3mM Na2HPO 7H2O、154mM NaCl pH7.4）溶液]１００ μLを前記の各ウエルに添加した後、１時間室温で放置した。放置後、各ウエルに２００μＬの洗浄バッファー[0.05% Tween20含有リン酸バッファー（1mM KH₂PO₄、3mM Na2HPO 7H2O、154mM NaCl pH7.4）]を添加した後、当該各ウエルから当該バッファーをデカンテーションにより取り除いた。この操作をさらに２回繰り返した。

次いで、基質（R&D社製、#DY999）１００μLを、各ウエルに添加・混合することにより、反応を開始した。

次いで、約５分間室温で放置した後、当該各ウエルにストップ溶液(1N H2SO4水溶液)５０μLを各ウエルに添加し混合することにより、反応を停止した。反応停止後３０分以内に得られた試料の４５０nmの吸光度を測定した。

その結果を図１２〜図１４に示した。ＵＢＣ（図１２）、ＧＰＲ（図１３）、及び、ＦＢＮ（図１４）の全ての場合において、メチル化フラグメントＵＢＣ−Ｍ８、ＧＰＲ−Ｍ８、及び、ＦＢＮ−Ｍ８では、固定化したメチルシトシン抗体と、５’末端ＦＩＴＣ標識オリゴヌクレオチドとの複合体を形成・分離し、複合体の中の５’末端ＦＩＴＣ標識オリゴヌクレオチドを、その識別機能に基づき検出・定量することにより、メチル化オリゴヌクレオチドＵＢＣ−Ｍ８、ＧＰＲ−Ｍ８、及び、ＦＢＮ−Ｍ８が、いずれの濃度においても感度良く検出・定量されることが明らかとなった。アンメチル化フラグメントＵＢＣ−Ｕ８、ＧＰＲ−Ｕ８、及び、ＦＢＮ−ＭＵでは、固定化したメチルシトシン抗体と、５’末端ＦＩＴＣ標識オリゴヌクレオチドとの複合体を形成・分離しないため、いずれにおいても、略バックグラウンド値と同様の値を示した。

以上より、固定化したメチルシトシン抗体と、メチル化されたＤＮＡフラグメントと、５’末端ＦＩＴＣ標識オリゴヌクレオチドとの複合体を形成・分離し、複合体の中の５’末端ＦＩＴＣ標識オリゴヌクレオチドを、その識別機能に基づき検出・定量することにより、メチル化されたＤＮＡフラグメントの検出・定量が可能であることが明らかとなった。

実施例７
市販のメチルシトシン抗体（Aviva Systems Biology社製）を、市販ビオチン化キット（Biotin Labeling Kit-NH2、同仁化学研究所製）を用いて、カタログに記載された方法に準じて、ビオチン標識した。得られたビオチン標識メチルシトシン抗体を溶液[抗体約0.1μg/100μL 0.1% BSA含有リン酸バッファー（1mM KH₂PO₄、3mM Na2HPO 7H2O、154mM NaCl pH7.4）溶液]として冷蔵保存した。

合成して得られたビオチン標識メチルシトシン抗体溶液を、ストレプトアビジン被覆済み９６ウエルプレートに１００μL/ウエルを添加した後、約１時間室温で放置することによりウエルに固定化した。放置後、当該各ウエルから溶液をデカンテーションにより取り除き、次いで３００μＬの滅菌超純水で２５倍希釈されたDELFIA Wash Concentrate（Perkin Elmer社製、Tris-HCl pH 7.8 with Tween 80）を添加した後、当該各ウエルから当該バッファーをデカンテーションにより取り除いた。この操作をさらに２回繰り返した。

配列番号５５で示される塩基配列からなるメチル化オリゴヌクレオチドＵＢＣ−Ｍ、配列番号５６で示される塩基配列からなる部分メチル化オリゴヌクレオチドＵＢＣ−ＨＭ、及び、配列番号５７で示される塩基配列からなるアンメチル化オリゴヌクレオチドＵＢＣ−ＵＭを合成し、夫々について、以下の溶液を調製した。
溶液Ａ：0.1pmoL/10μL TEバッファー溶液
溶液Ｂ：0.01pmoL/10μL TEバッファー溶液
溶液Ｃ：0.001pmoL/10μL TEバッファー溶液
溶液Ｄ：0pmoL/10μL TEバッファー溶液（ネガティブコントロール液）

＜メチル化オリゴヌクレオチド＞ Nは5-メチルシトシンを示す。
UBC-M：5’-AGTGACACCATNGAGAATGTCAGATCNGGATCAGAGNGCCATCTAGATGGACATGTCACTGTCTGACTACAACATCCAGA-3’（配列番号５５）
＜部分メチル化オリゴヌクレオチド＞ Nは5-メチルシトシンを示す。
UBC-HM：5’-AGTGACACCATNGAGAATGTCAGATCCGGATCAGAGCGCCATCTAGATGGACATGTCACTGTCTGACTACAACATCCAGA-3’（配列番号５６）
＜アンメチル化オリゴヌクレオチド＞
UBC-UM：5’-
AGTGACACCATCGAGAATGTCAGATCCGGATCAGAGCGCCATCTAGATGGACATGTCACTGTCTGACTACAACATCCAGA-3’（配列番号５７）

Ａ群（無処理群）：得られた溶液１０μLに、緩衝液（330mM Tris-Acetate pH 7.9、660mM KOAc、100mM MgOAc₂、5mM Dithothreitol）５μＬと、ＢＳＡ（Bovine serum albumin 1mg/ml）５μＬとを添加した後、これに配列番号５８で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドＣＡ１をマスキング用オリゴヌクレオチドとして１０ｐｍｏｌを添加し、さらに当該混合物に滅菌超純水を加えて液量を５０μＬとし、混合した。

Ｂ群（HhaI処理群）：得られた溶液１０μLに、ＨｈａＩを６Ｕと、緩衝液（330mM Tris-Acetate pH 7.9、660mM KOAc、100mM MgOAc₂、5mM Dithothreitol）５μＬと、１０×ＢＳＡ（Bovine serum albumin 1mg/ml）５μＬとを添加した後、これに配列番号５８で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドＣＡ１をマスキング用オリゴヌクレオチドとして１０ｐｍｏｌを添加し、さらに当該混合物に滅菌超純水を加えて液量を５０μＬとし、混合した。

＜マスキング用オリゴヌクレオチド＞
CA1：5’- GATGGCGCTCTG -3’（配列番号５８）

各々の反応液を３７℃で３時間インキュベーションした後、予め合成された５’末端がＦＩＴＣ標識されてなる配列番号５９で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドＵＢＣの１ｐｍｏｌ/５０μＬＴＥバッファー溶液５０μLを前記のＰＣＲチューブに添加した。

＜５’末端FITC標識オリゴヌクレオチド＞
UBC：5’- TCTGGATGTTGTAGTCAGACAG -3’（配列番号５９）

次いで、当該ＰＣＲチューブを９５℃で１０分間加熱し、７０℃まで速やかに冷却し、その温度で１０分間保温した。更に、これを５０℃まで冷却し１０分間保温し、次いで３７℃で１０分間保温した後、室温に戻すことにより、５’末端ＦＩＴＣ標識オリゴヌクレオチドとオリゴヌクレオチドとの結合体の形成を促した。

５’末端ＦＩＴＣ標識オリゴヌクレオチドとオリゴヌクレオチドとの結合体の入ったＰＣＲチューブの溶液全量を、先に調製しておいたビオチン標識メチルシトシン抗体が固定化されたプレートに移し代え、室温で約１時間放置した。放置後、前記プレート内の溶液をデカンテーションにより取り除き、次いで前記プレート内の各ウエルに３００μＬの滅菌超純水で２５倍希釈されたDELFIA Wash Concentrate（Perkin Elmer社製、Tris-HCl pH 7.8 with Tween 80）を添加した後、当該各ウエルから当該バッファーをデカンテーションにより取り除いた。この操作をさらに２回繰り返した。

次いで、約１０分間室温で放置した後、当該各ウエルにストップ溶液(1N H2SO4水溶液)５０μLを各ウエルに添加し混合することにより、反応を停止した。反応停止後３０分以内に得られた試料の４５０nmの吸光度を測定した。

その結果を図１５及び図１６に示した。Ａ群（無処理群）の場合（図１５）、ＣＧ配列の３箇所のうち３箇所ともメチル化されているメチル化オリゴヌクレオチドＵＢＣ−Ｍでは、５’末端ＦＩＴＣ標識オリゴヌクレオチドＵＢＣと、固定化したメチルシトシン抗体との複合体を形成・分離し、感度良く検出・定量されることが明らかとなった。一方、ＣＧ配列の３箇所のうち１箇所だけメチル化されている部分メチル化オリゴヌクレオチドＵＢＣ−ＨＭでは、５’末端ＦＩＴＣ標識オリゴヌクレオチドＵＢＣと、固定化したメチルシトシン抗体との複合体を形成・分離するが、メチル化されている部分が一箇所だけのため複合体形成率がＵＢＣ−Ｍに比して低いものと考えられ、ＵＢＣ−Ｍよりも低い検出・定量結果となった。ＣＧ配列の３箇所のうち１箇所もメチル化されていないアンメチル化オリゴヌクレオチドＵＢＣ−ＵＭでは、複合体を形成・分離しないため、略バックグラウンド値（溶液Ｄのデータ）と同様の値を示した。Ｂ群（ＨｈａＩ処理群）の場合（図１６）、ＣＧ配列の３箇所のうち３箇所ともメチル化されているメチル化オリゴヌクレオチドＵＢＣ−Ｍでは、メチル化感受性制限酵素（ＨｈａＩ）で消化されないので、５’末端ＦＩＴＣ標識オリゴヌクレオチドＵＢＣと、固定化したメチルシトシン抗体との複合体を形成・分離し、略Ａ群（無処理群）での値と同様に、感度良く検出・定量されることが明らかとなった。ＣＧ配列の３箇所のうち１箇所だけメチル化されている部分メチル化オリゴヌクレオチドＵＢＣ−ＨＭでは、メチル化感受性制限酵素（ＨｈａＩ）による消化によって、メチル化されたＣＧ配列はなくなってしまう。従って、複合体を形成・分離しないため、バックグラウンド値（溶液Ｄのデータ）と同様の値を示した。ＣＧ配列の３箇所のうち１箇所もメチル化されていないアンメチル化オリゴヌクレオチドＵＢＣ−ＵＭでは、略Ａ処理群（無処理群）での値と同様に、複合体を形成・分離しないため、略バックグラウンド値と同様の値を示した。

以上より、メチル化感受性制限酵素で処理することにより、部分的にメチル化されているＤＮＡフラグメントを消化できること、且つ、固定化したメチルシトシン抗体と、メチル化されたＤＮＡフラグメントと、５’末端ＦＩＴＣ標識オリゴヌクレオチドとの複合体を形成・分離し、複合体の中の５’末端ＦＩＴＣ標識オリゴヌクレオチドを、その識別機能に基づき検出・定量することにより、メチル化されたＤＮＡフラグメントの検出・定量が可能であることが明らかとなった。

実施例８
市販のメチルシトシン抗体（Aviva Systems Biology社製）を、市販ビオチン化キット（Biotin Labeling Kit-NH2、同仁化学研究所製）を用いて、カタログに記載された方法に準じて、ビオチン標識した。得られたビオチン標識メチルシトシン抗体を溶液[抗体約0.1μg/100μL 0.1% BSA含有リン酸バッファー（1mM KH₂PO₄、3mM Na2HPO 7H2O、154mM NaCl pH7.4）溶液]として冷蔵保存した。

配列番号６０で示される塩基配列からなるメチル化オリゴヌクレオチドＵＢＣ/ＧＰＲ/ＦＢＮ−Ｍ、及び、配列番号６１で示される塩基配列からなるアンメチル化オリゴヌクレオチドＵＢＣ/ＧＰＲ/ＦＢＮ−ＵＭを合成し、夫々について、以下の溶液を調製した。
溶液Ａ：0.1pmoL/10μL TEバッファー溶液
溶液Ｂ：0.01pmoL/10μL TEバッファー溶液
溶液Ｃ：0.001pmoL/10μL TEバッファー溶液
溶液Ｄ：0pmoL/10μL TEバッファー溶液（ネガティブコントロール液）

＜メチル化オリゴヌクレオチド＞ Nは5-メチルシトシンを示す。
UBC/GPR/FBN-M：5’-
CTGTCTGACTACAACATCCAGANGCCGAGAACGAGGCGTTGTCNGAGCCGACGAAGGGCTTATTAG -3’（配列番号６０）
＜アンメチル化オリゴヌクレオチド＞
UBC/GPR/FBN-UM：5’- CTGTCTGACTACAACATCCAGACGCCGAGAACGAGGCGTTGTCCGAGCCGACGAAGGGCTTATTAG -3’（配列番号６１）

次に、配列番号６２、配列番号６３、及び、配列番号６４で示される塩基配列を有する５’末端をＦＩＴＣ標識したオリゴヌクレオチドＵＢＣ、ＦＢＮ、及び、ＧＰＲの１ｐｍｏｌ/５０μL ＴＥバッファー溶液を調製した（ＵＢＣ−ＦＩＴＣ溶液、ＦＢＮ−ＦＩＴＣ溶液、及び、ＧＰＲ−ＦＩＴＣ溶液）。また、配列番号６２、配列番号６３、及び、配列番号６４で示される塩基配列を有する５’末端ＦＩＴＣ標識オリゴヌクレオチドＵＢＣ、ＦＢＮ、及び、ＧＰＲのＴＥバッファー溶液を混合したＦＩＴＣ標識オリゴヌクレオチド溶液（ＦＩＴＣ標識オリゴヌクレオチド混合溶液）を調製した（各1pmol/50μL）。

＜５’末端FITC標識オリゴヌクレオチド＞
UBC：5’- TCTGGATGTTGTAGTCAGACAG -3’（配列番号６２）
GPR：5’- GACAACGCCTCGTTCTCGG -3’（配列番号６３）
FBN：5’- CTAATAAGCCCTTCGTCGGCT -3’（配列番号６４）

得られた夫々の溶液について、以下の処理を施した。

新しいＰＣＲチューブに、前記で調製したメチル化オリゴヌクレオチド溶液又はアンメチル化オリゴヌクレオチド溶液１０μL（各溶液について８本ずつ調製）と、緩衝液（330mM Tris-Acetate pH 7.9、660mM KOAc、100mM MgOAc2、5mM Dithothreitol）１０μＬと、上記で調製した５’末端ＦＩＴＣ標識オリゴヌクレオチド溶液（ＵＢＣ−ＦＩＴＣ溶液、ＦＢＮ−ＦＩＴＣ溶液、ＧＰＲ−ＦＩＴＣ溶液、及び、ＦＩＴＣ標識オリゴヌクレオチド混合溶液）５０μLと、さらに当該混合物に滅菌超純水を加えて液量を１００μＬとし、混合した。

５’末端ＦＩＴＣ標識オリゴヌクレオチドとオリゴヌクレオチドとの結合体の入ったＰＣＲチューブの溶液全量を、先に調製しておいたビオチン標識メチルシトシン抗体が固定化されたプレートに移し代え、室温で約２時間放置した。放置後、前記プレート内の溶液をデカンテーションにより取り除き、次いで、前記プレート内の各ウエルに２００μＬの洗浄バッファー[0.05% Tween20含有リン酸バッファー（1mM KH₂PO₄、3mM Na2HPO 7H2O、154mM NaCl pH7.4）]を添加した後、当該各ウエルから当該バッファーをデカンテーションにより取り除いた。この操作をさらに２回繰り返した。

その後、ＨＲＰ標識ＦＩＴＣ抗体溶液[Jackson ImmunoResearch Laboratories社製、0.01μg/100μL 0.1% BSA含有リン酸バッファー（1mM KH₂PO₄、3mM Na2HPO 7H2O、154mM NaCl pH7.4）溶液]１００ μLを前記の各ウエルに添加した後、約1時間室温で放置した。放置後、各ウエルに２００μＬの洗浄バッファー[0.05% Tween20含有リン酸バッファー（1mM KH₂PO₄、3mM Na2HPO 7H2O、154mM NaCl pH7.4）]を添加した後、当該各ウエルから当該バッファーをデカンテーションにより取り除いた。この操作をさらに２回繰り返した。

その結果を図１７〜図２０に示した。メチル化オリゴヌクレオチドＵＢＣ/ＧＰＲ/ＦＢＮ−Ｍ、及び、アンメチル化オリゴヌクレオチドＵＢＣ/ＧＰＲ/ＦＢＮ−Ｕでは、５’末端ＦＩＴＣ標識オリゴヌクレオチドＵＢＣ、ＧＰＲ、及び、ＦＢＮが二本鎖を形成できる（それぞれ相補する塩基配列をオリゴヌクレオチド内に有する）オリゴヌクレオチドである。５’末端ＦＩＴＣ標識オリゴヌクレオチドＵＢＣ（図１７）、ＧＰＲ（図１８）、及び、ＦＢＮ（図１９）、前記５’末端ＦＩＴＣ標識オリゴヌクレオチドの混合（図２０）を用いた全ての場合において、メチル化フラグメントＵＢＣ/ＧＰＲ/ＦＢＮ−Ｍでは、固定化したメチルシトシン抗体と、５’末端ＦＩＴＣ標識オリゴヌクレオチドとの複合体を形成・分離し、複合体の中の５’末端ＦＩＴＣ標識オリゴヌクレオチドを、その識別機能に基づき検出・定量することにより、メチル化オリゴヌクレオチド/ＧＰＲ/ＦＢＮ−Ｍが、いずれの濃度においても感度良く検出・定量されることが明らかとなった。アンメチル化フラグメントＵＢＣ/ＧＰＲ/ＦＢＮ−Ｕでは、固定化したメチルシトシン抗体と、５’末端ＦＩＴＣ標識オリゴヌクレオチドとの複合体を形成・分離しないため、略バックグラウンド値と同様の値を示した。さらに、複数の５’末端ＦＩＴＣ標識オリゴヌクレオチドを用いることによって（図２０）、１種（単独）の固定化した５’末端ビオチン標識オリゴヌクレオチドを用いる場合（図１７〜図１９）よりも、感度良く検出・定量できることが明らかとなった。

以上より、固定化したメチルシトシン抗体と、メチル化されたＤＮＡフラグメントと、５’末端ＦＩＴＣ標識オリゴヌクレオチドとの複合体を形成・分離し、複合体の中の５’末端ＦＩＴＣ標識オリゴヌクレオチドを、その識別機能に基づき検出・定量することにより、メチル化されたＤＮＡフラグメントの検出・定量が可能であることが明らかとなった。また、１つの目的とするＤＮＡ領域に対して、複数の５’末端ＦＩＴＣ標識オリゴヌクレオチドを用いることによって、１種（単独）の５’末端ＦＩＴＣ標識オリゴヌクレオチドを用いる場合よりも（即ち、１つの目的とするＤＮＡ領域に対して、同時に複数の本オリゴヌクレオチドを用いたほうが）、より感度良く検出・定量できることが明らかとなった。

実施例９
市販のメチルシトシン抗体（Aviva Systems Biology社製）を、市販ビオチン化キット（Biotin Labeling Kit-NH2、同仁化学研究所製）を用いて、カタログに記載された方法に準じて、ビオチン標識した。得られたビオチン標識メチルシトシン抗体を溶液[抗体約0.1μg/100μL 0.1% BSA含有リン酸バッファー（1mM KH₂PO₄、3mM Na2HPO 7H2O、154mM NaCl pH7.4）溶液]として冷蔵保存した。

配列番号６５で示される塩基配列からなるメチル化オリゴヌクレオチドＵＢＣ−Ｍ８、配列番号６６で示される塩基配列からなるメチル化オリゴヌクレオチドＦＢＮ−Ｍ８、配列番号６７で示される塩基配列からなるメチル化オリゴヌクレオチドＧＰＲ−Ｍ８、配列番号６８で示される塩基配列からなるアンメチル化オリゴヌクレオチドＵＢＣ−Ｕ８、配列番号６９で示される塩基配列からなるアンメチル化オリゴヌクレオチドＦＢＮ−Ｕ８、及び、配列番号７０で示される塩基配列からなるアンメチル化オリゴヌクレオチドＧＰＲ−Ｕ８を合成して、メチル化オリゴヌクレオチドおよびアンメチル化オリゴヌクレオチド夫々につき以下の溶液を調製した。
溶液Ａ：0.3pmol/10μL TEバッファー溶液
溶液Ｂ：0.03pmol/10μL TEバッファー溶液
溶液Ｃ：0.003pmol/10μL TEバッファー溶液
溶液Ｄ：TEバッファー溶液（ネガティブコントロール液）
次いで、夫々の溶液（溶液Ａ〜溶液Ｄ）について、前記のメチル化オリゴヌクレオチドＵＢＣ−Ｍ８、ＦＢＮ−Ｍ８、ＧＰＲ−Ｍ８の夫々の溶液を等量ずつ混合したメチル化オリゴヌクレオチド混合溶液Ｍ０、及び、前記のアンメチル化オリゴヌクレオチドＵＢＣ−Ｕ８、ＦＢＮ−Ｕ８、ＧＰＲ−Ｕ８の夫々の溶液を等量ずつ混合したメチル化オリゴヌクレオチド混合溶液Ｕ０を調製した。

＜メチル化オリゴヌクレオチド＞ Nは5-メチルシトシンを示す。
UBC-M8：5’- ANGAANGTANGGANGCTNGATNGTTNGGTNGCCTGTCTGACTACAACATCCAGA -3’（配列番号６５）
FBN-M8：5’- ANGAANGTANGGANGCTNGATNGTTNGGTNGCCAGCCGACGAAGGGCTTATTAG -3’（配列番号６６）
GPR-M8：5’- ANGAANGTANGGANGCTNGATNGTTNGGTNGCCTGCCGAGAACGAGGCGTTGTC -3’（配列番号６７）
＜アンメチル化オリゴヌクレオチド＞
UBC-U8：5’- ACGAACGTACGGACGCTCGATCGTTCGGTCGCCTGTCTGACTACAACATCCAGA -3’（配列番号６８）
FBN-U8：5’- ACGAACGTACGGACGCTCGATCGTTCGGTCGCCAGCCGACGAAGGGCTTATTAG -3’（配列番号６９）
GPR-U8：5’- ACGAACGTACGGACGCTCGATCGTTCGGTCGCCTGCCGAGAACGAGGCGTTGTC -3’（配列番号７０）

配列番号７１、配列番号７２、及び、配列番号７３で示される塩基配列を有する５’末端をＦＩＴＣ標識したオリゴヌクレオチドＵＢＣ、ＦＢＮ、及び、ＧＰＲの１pmol/５０μL ＴＥバッファー溶液を調製した（ＵＢＣ−ＦＩＴＣ溶液、ＦＢＮ−ＦＩＴＣ溶液、及び、ＧＰＲ−ＦＩＴＣ溶液）。また、配列番号７１、配列番号７２、配列番号７３で示される塩基配列を有する５’末端ＦＩＴＣ標識オリゴヌクレオチドＵＢＣ、ＦＢＮ、及び、ＧＰＲを等量ずつ混合したＦＩＴＣ標識オリゴヌクレオチド溶液（ＦＩＴＣ標識オリゴヌクレオチド混合溶液）を調製した（各１ｐｍｏｌ/５０μL）。

＜５’末端FITC標識オリゴヌクレオチド＞
UBC：5’- TCTGGATGTTGTAGTCAGACAG -3’（配列番号７１）
GPR：5’- GACAACGCCTCGTTCTCGG -3’（配列番号７２）
FBN：5’- CTAATAAGCCCTTCGTCGGCT -3’（配列番号７３）

得られた夫々の溶液について、以下の処理を施した。

新しいＰＣＲチューブに、前記で調製したオリゴヌクレオチド溶液(ＭＡ、ＭＢ、ＭＣ、ＭＤ、ＵＡ、ＵＢ、ＵＣ、ＵＤ)を１０μLと、緩衝液（330mM Tris-Acetate pH 7.9、660mM KOAc、100mM MgOAc₂、5mM Dithothreitol）１０μＬと、上記で調製した５’末端ＦＩＴＣ標識オリゴヌクレオチド溶液（ＵＢＣ−ＦＩＴＣ溶液、ＦＢＮ−ＦＩＴＣ溶液、ＧＰＲ−ＦＩＴＣ溶液、及び、ＦＩＴＣ標識オリゴヌクレオチド混合溶液）５０μＬと、さらに当該混合物に滅菌超純水を加えて液量を１００μＬとし、混合した。

５’末端ＦＩＴＣ標識オリゴヌクレオチドとオリゴヌクレオチドとの結合体の入ったＰＣＲチューブの溶液全量を、先に調製しておいたビオチン標識メチルシトシン抗体が固定化されたプレートに移し代え、室温で約１時間放置した。放置後、前記プレート内の溶液をデカンテーションにより取り除き、次いで、前記プレート内の各ウエルに２００μＬの洗浄バッファー[0.05% Tween20含有リン酸バッファー（1mM KH₂PO₄、3mM Na2HPO 7H2O、154mM NaCl pH7.4）]を添加した後、当該各ウエルから当該バッファーをデカンテーションにより取り除いた。この操作をさらに２回繰り返した。

その後、ＨＲＰ標識ＦＩＴＣ抗体溶液[Jackson ImmunoResearch Laboratories社製、 0.01μg/100μL 0.1% BSA含有リン酸バッファー（1mM KH₂PO₄、3mM Na2HPO 7H2O、154mM NaCl pH7.4）溶液]100 μLを各ウエルに添加した後、約１時間室温で放置した。放置後、当該各ウエルから溶液をデカンテーションにより取り除き、次いで、前記の各ウエルに２００μＬの洗浄バッファー[0.05% Tween20含有リン酸バッファー（1mM KH₂PO₄、3mM Na2HPO 7H2O、154mM NaCl pH7.4）]を添加した後、当該各ウエルから当該バッファーをデカンテーションにより取り除いた。この操作をさらに２回繰り返した

その結果を図２１〜図２４に示した。メチル化オリゴヌクレオチド混合溶液Ｍ０では、５’末端ＦＩＴＣ標識オリゴヌクレオチドＵＢＣ（図２１）、ＦＢＮ（図２２）、ＧＰＲ（図２３）、及び、前記３種を混合したオリゴヌクレオチド（図２４）と、メチルシトシン抗体との複合体を形成・分離し、感度良く検出・定量されることが明らかとなった。特に３種のオリゴヌクレオチドを混合した場合（図２４）では、単独オリゴヌクレオチドでの検出（図２１〜図２３）に比べて感度良く検出・定量されることが明らかとなった。アンメチル化オリゴヌクレオチド混合溶液Ｕ０では、固定化した５’末端ビオチン標識オリゴヌクレオチドＵＢＣ（図２１）、ＦＢＮ（図２２）、ＧＰＲ（図２３）及び、前記３種を混合したオリゴヌクレオチド（図２４）と、メチルシトシン抗体との複合体を形成しないため、いずれにおいても、略バックグラウンド値と同様の値を示した。

以上より、固定化したメチルシトシン抗体と、メチル化されたＤＮＡフラグメントと、５’末端ＦＩＴＣ標識オリゴヌクレオチドとの複合体を形成・分離し、複合体の中の５’末端ＦＩＴＣ標識オリゴヌクレオチドを、その識別機能に基づき検出・定量することにより、メチル化されたＤＮＡフラグメントの検出・定量が可能であることが明らかとなった。さらに複数の５’末端ＦＩＴＣ標識オリゴヌクレオチドを用いることによって１種の５’末端ＦＩＴＣ標識オリゴヌクレオチドを用いる場合よりも（即ち、１つの目的とするＤＮＡ領域を用いるだけでなく、同時に、複数の目的とするＤＮＡ領域を用いることによって）、感度良く検出・定量できることが明らかとなった。

実施例１０
市販されているタカラバイオ社のBed-Side ICAN(TM) Legionella Detection Kitのストレプトアビジン被覆クロマトストリップ、コンジュゲート（金ナノ粒子標識ＦＩＴＣ抗体）溶液を利用して、以下の実験を実施した。

配列番号７４で示される塩基配列からなるメチル化オリゴヌクレオチドＵＢＣ−Ｍ８、及び、配列番号７５で示される塩基配列からなるアンメチル化オリゴヌクレオチドＵＢＣ−Ｕ８を合成して夫々につき、０．１ｐｍｏｌ/μＬＴＥバッファー溶液を調製した。また、ネガティブコントロールとしてＴＥバッファー溶液を準備した。

＜メチル化オリゴヌクレオチド＞ Nは5-メチルシトシンを示す。
UBC-M8：5’- ANGAANGTANGGANGCTNGATNGTTNGGTNGCCTGTCTGACTACAACATCCAGA -3’（配列番号７４）
＜アンメチル化オリゴヌクレオチド＞
UBC-U8：5’- ACGAACGTACGGACGCTCGATCGTTCGGTCGCCTGTCTGACTACAACATCCAGA -3’（配列番号７５）

配列番号７６で示される塩基配列を有する５’末端ビオチン標識オリゴヌクレオチドＵＢＣの０．５ｐｍｏｌ/μＬＴＥバッファー溶液を調製した（ＵＢＣ溶液）。

＜５’末端ビオチン標識オリゴヌクレオチド＞
UBC：5’- TCTGGATGTTGTAGTCAGACAG -3’（配列番号７６）

前記のメチル化オリゴヌクレオチド溶液、及び、アンメチル化オリゴヌクレオチド溶液を用いて、以下の処理を施した（各１本ずつ調製）。

ＰＣＲチューブに、前記で調製したオリゴヌクレオチド溶液（ＵＢＣ−Ｍ８、ＵＢＣ−Ｕ８溶液、ＴＥバッファー溶液）２μLと、前記で調製した５’末端ビオチン標識オリゴヌクレオチド溶液（ＵＢＣ−Ｂ溶液）２μLと、緩衝液（330mM Tris-Acetate pH 7.9、660mM KOAc、100mM MgOAc₂、5mM Dithothreitol）２μＬと、ＢＳＡ（Bovine serum albumin 1mg/mL）２μＬとを添加した後、これに配列番号７７で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドＣＡ１をキャリアーＤＮＡ（サンプルＤＮＡの非特異的な吸着を防ぐために添加する）として５ｐｍｏｌ添加し、さらに当該混合物に滅菌超純水を加えて液量を２０μＬとし、混合した。

＜キャリアーＤＮＡ＞
CA1：5’-GATGGCGCTCTG-3’（配列番号７７）

得られた反応溶液全てを、夫々、平底プレートのウエルに移し、ストレプトアビジン被覆クロマトストリップの先端を各ウエルの底まで差し込み、展開した（溶液全部をストリップに吸わせた）。

別の平底プレートのウエルに、メチルシトシン抗体[Aviva Systems Biology社製、0.1μg/20μL 0.1% BSA含有リン酸バッファー（1mM KH₂PO₄、3mM Na2HPO 7H2O、154mM NaCl pH7.4）溶液]２０μＬを入れておき、それに前記で得られたストレプトアビジン被覆クロマトストリップの先端を各ウエルの底まで差し込み、さらに展開した。

別の平底プレートのウエルに、ＦＩＴＣ標識マウスＩｇＧ抗体（Medical & Biological Laboratories社製）溶液[0.2μg/20μL 0.1% BSA含有リン酸バッファー（1mM KH₂PO₄、3mM Na2HPO 7H2O、154mM NaCl pH7.4）]２０μＬを入れておき、それに前記で得られたストレプトアビジン被覆クロマトストリップの先端を各ウエルの底まで差し込み、さらに展開した。

次いで、別の平底プレートの各ウエルに０．１％ＢＳＡ含有リン酸バッファー（1mM KH₂PO₄、3mM Na2HPO 7H2O、154mM NaCl pH7.4）溶液]２０μＬを入れておき、それに前記で得られたストレプトアビジン被覆クロマトストリップの先端を各ウエルの底まで差し込み、さらに展開した。

その後、別の平底プレートのウエルにコンジュゲート溶液（金ナノ粒子標識ＦＩＴＣ抗体溶液）２０μLを入れておき、それに前記で得られたストレプトアビジン被覆クロマトストリップの先端を各ウエルの底まで差し込み、さらに展開した。

展開終了後、ストレプトアビジン被覆クロマトストリップを目視し、赤紫色ラインの有無を確認した。

その結果を図２５に示した。メチル化オリゴヌクレオチドＵＢＣ−Ｍ８の場合、ストレプトアビジン被覆クロマトストリップ上に、赤紫色のラインが確認された。従って、メチル化ＤＮＡ抗体と、固定化した５’末端ビオチン標識オリゴヌクレオチドと、メチル化されたＤＮＡフラグメントとの複合体を形成・分離することが明らかとなった。アンメチル化オリゴヌクレオチドＵＢＣ−Ｕ８、及び、ネガティブコントロール（ＴＥバッファー溶液）では、複合体を形成しないため、赤紫色のラインは確認できなかった。

以上より、メチルシトシン抗体と、メチル化されたＤＮＡフラグメントと、固定化した５’末端ビオチン標識オリゴヌクレオチドとの複合体を形成・分離し、複合体の中のメチルシトシン抗体を、その識別機能に基づき検出・定量することにより、メチル化されたＤＮＡフラグメントの検出・定量が可能であることが、クロマトストリップ上でできることが明らかとなった。

実施例１１
市販されているタカラバイオ社のBed-Side ICAN(TM) Legionella Detection Kitのストレプトアビジン被覆クロマトストリップ、コンジュゲート（金ナノ粒子標識FITC抗体）溶液を利用して、以下の実験を実施した。

市販のメチルシトシン抗体（Aviva Systems Biology社製）を、市販ビオチン化キット（Biotin Labeling Kit-NH2、同仁化学研究所製）を用いて、カタログに記載された方法に準じて、ビオチン標識した。得られたビオチン標識メチルシトシン抗体を溶液[抗体約0.1μg/20μL 0.1% BSA含有リン酸バッファー（1mM KH₂PO₄、3mM Na2HPO 7H2O、154mM NaCl pH7.4）溶液]として冷蔵保存した。

配列番号７８で示される塩基配列からなるメチル化オリゴヌクレオチドＵＢＣ−Ｍ８、配列番号７９で示される塩基配列からなるメチル化オリゴヌクレオチドＦＢＮ−Ｍ８、配列番号８０で示される塩基配列からなるメチル化オリゴヌクレオチドＧＰＲ−Ｍ８、配列番号８１で示される塩基配列からなるアンメチル化オリゴヌクレオチドＵＢＣ−Ｕ８、配列番号８２で示される塩基配列からなるアンメチル化オリゴヌクレオチドＦＢＮ−Ｕ８、及び、配列番号８３で示される塩基配列からなるアンメチル化オリゴヌクレオチドＧＰＲ−Ｕ８を合成して夫々につき０．１ｐｍｏｌ/μL ＴＥバッファー溶液を調製した。また、ネガティブコントロールとしてＴＥバッファー溶液を用いた。

＜メチル化オリゴヌクレオチド＞ Nは5-メチルシトシンを示す。
UBC-M8：5’- ANGAANGTANGGANGCTNGATNGTTNGGTNGCCTGTCTGACTACAACATCCAGA -3’（配列番号７８）
FBN-M8：5’- ANGAANGTANGGANGCTNGATNGTTNGGTNGCCAGCCGACGAAGGGCTTATTAG -3’（配列番号７９）
GPR-M8：5’- ANGAANGTANGGANGCTNGATNGTTNGGTNGCCTGCCGAGAACGAGGCGTTGTC -3’（配列番号８０）
＜アンメチル化オリゴヌクレオチド＞
UBC-U8：5’- ACGAACGTACGGACGCTCGATCGTTCGGTCGCCTGTCTGACTACAACATCCAGA -3’（配列番号８１）
FBN-U8：5’- ACGAACGTACGGACGCTCGATCGTTCGGTCGCCAGCCGACGAAGGGCTTATTAG -3’（配列番号８２）
GPR-U8：5’- ACGAACGTACGGACGCTCGATCGTTCGGTCGCCTGCCGAGAACGAGGCGTTGTC -3’（配列番号８３）

配列番号８４、配列番号８５、及び、配列番号８６で示される塩基配列を有する５’末端ＦＩＴＣ標識オリゴヌクレオチドＵＢＣ、ＦＢＮ、及び、ＧＰＲの０．５ｐｍｏｌ/μＬＴＥ溶液を調製した（それぞれ、ＵＢＣ-ＦＩＴＣ溶液、ＦＢＮ-ＦＩＴＣ溶液、及び、ＧＰＲ-ＦＩＴＣ溶液）。

＜５’末端FITC標識オリゴヌクレオチド＞
UBC：5’- TCTGGATGTTGTAGTCAGACAG -3’（配列番号８４）
FBN：5’- CTAATAAGCCCTTCGTCGGCT -3’（配列番号８５）
GPR：5’- GACAACGCCTCGTTCTCGG -3’（配列番号８６）

前記のメチル化オリゴヌクレオチド溶液、及び、アンメチル化オリゴヌクレオチド溶液の夫々の溶液について、以下の処理を施した（各１本ずつ調製）。

ＵＢＣ混合溶液の調製：ＰＣＲチューブに、前記で調製したオリゴヌクレオチド溶液（ＵＢＣ−Ｍ８又はＵＢＣ−Ｕ８溶液）２μLと、前記で調製した５’末端ＦＩＴＣ標識オリゴヌクレオチド溶液（ＵＢＣ-ＦＩＴＣ溶液）２μLと、緩衝液（330mM Tris-Acetate pH 7.9、660mM KOAc、100mM MgOAc2、5mM Dithothreitol）２μＬと、ＢＳＡ（Bovine serum albumin 1mg/mL）２μＬとを添加した後、これに配列番号８７で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドＣＡ１をキャリアーＤＮＡ（サンプルＤＮＡの非特異的な吸着を防ぐために添加する）として５ｐｍｏｌ添加し、さらに当該混合物に滅菌超純水を加えて液量を２０μＬとし、混合した。

ＦＢＮ混合溶液の調製：ＰＣＲチューブに、前記で調製したオリゴヌクレオチド溶液（ＦＢＮ−Ｍ８又はＦＢＮ−Ｕ８溶液）２μLと、前記で調製した５’末端ＦＩＴＣ標識オリゴヌクレオチド溶液（ＦＢＮ-ＦＩＴＣ溶液）２μLと、緩衝液（330mM Tris-Acetate pH 7.9、660mM KOAc、100mM MgOAc2、5mM Dithothreitol）２μＬと、ＢＳＡ（Bovine serum albumin 1mg/mL）２μＬとを添加した後、これに配列番号８７で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドＣＡ１をキャリアーＤＮＡ（サンプルＤＮＡの非特異的な吸着を防ぐために添加する）として５ｐｍｏｌ添加し、さらに当該混合物に滅菌超純水を加えて液量を２０μＬとし、混合した。

ＧＰＲ混合溶液の調製：ＰＣＲチューブに、前記で調製したオリゴヌクレオチド溶液（ＧＰＲ−Ｍ８又はＧＰＲ−Ｕ８溶液）２μLと、前記で調製した５’末端ＦＩＴＣ標識オリゴヌクレオチド溶液（ＧＰＲ-ＦＩＴＣ溶液）２μLと、緩衝液（330mM Tris-Acetate pH 7.9、660mM KOAc、100mM MgOAc₂、5mM Dithothreitol）２μＬと、ＢＳＡ（Bovine serum albumin 1mg/mL）２μＬとを添加した後、これに配列番号８７で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドＣＡ１をキャリアーＤＮＡとして５ｐｍｏｌ添加し、さらに当該混合物に滅菌超純水を加えて液量を２０μＬとし、混合した。

＜キャリアーＤＮＡ＞
CA1：5’-GATGGCGCTCTG-3’（配列番号８７）

別の平底プレートのウエルにビオチン標識メチルシトシン抗体溶液２０μＬを入れ、ストレプトアビジン被覆クロマトストリップの先端を各ウエルの底まで差し込み、展開した（溶液全部をストリップに吸わせた）。

５’末端ＦＩＴＣ標識オリゴヌクレオチドとオリゴヌクレオチドとを結合体を形成させた反応溶液全てを、夫々、平底プレートのウエルに移し代え、それに前記で得られたストレプトアビジン被覆クロマトストリップの先端を各ウエルの底まで差し込み、展開した（溶液全部をストリップに吸わせた）。

別の平底プレートのウエルに０．１％ＢＳＡ含有リン酸バッファー（1mM KH₂PO₄、3mM Na2HPO 7H2O、154mM NaCl pH7.4）溶液２０μLを入れておき、それに前記で得られたストレプトアビジン被覆クロマトストリップの先端を各ウエルの底まで差し込み、さらに展開した。

別の平底プレートのウエルにコンジュゲート溶液（金ナノ粒子標識ＦＩＴＣ抗体溶液）２０μLを入れておき、それに前記で得られたストレプトアビジン被覆クロマトストリップの先端を各ウエルの底まで差し込み、さらに展開した。

その結果を図２６〜図２８に示した。メチル化オリゴヌクレオチドＵＢＣ−Ｍ８、ＦＢＮ−Ｍ８、及び、ＧＰＲ−Ｍ８の場合、ストレプトアビジン被覆クロマトストリップ上に、赤紫色のラインが確認された。従って、固定化したメチル化ＤＮＡ抗体と、５’末端ＦＩＴＣビオチン標識オリゴヌクレオチドと、メチル化されたＤＮＡフラグメントとの複合体を形成・分離することが明らかとなった。アンメチル化オリゴヌクレオチドＵＢＣ−Ｕ８、ＦＢＮ−Ｍ８、及び、ＧＰＲ−Ｍ８、並びに、ネガティブコントロール（ＴＥバッファー溶液）では、複合体を形成しないため、赤紫色のラインは確認できなかった。

以上より、固定化したメチルシトシン抗体と、メチル化されたＤＮＡフラグメントと、５’末端ＦＩＴＣ標識オリゴヌクレオチドとの複合体を形成・分離し、複合体の中の５’末端ＦＩＴＣ標識オリゴヌクレオチドを、その識別機能に基づき検出・定量することにより、メチル化されたＤＮＡフラグメントの検出・定量が可能であることが、クロマトストリップ上でできることが明らかとなった。

実施例１２
市販されているタカラバイオ社のBed-Side ICAN(TM) Legionella Detection Kitのストレプトアビジン被覆クロマトストリップ、コンジュゲート（金ナノ粒子標識ＦＩＴＣ抗体）溶液を利用して、以下の実験を実施した。

市販のメチルシトシン抗体（Aviva Systems Biology社製）を、市販ビオチン化キット（Biotin Labeling Kit-NH2、同仁化学研究所製）を用いて、カタログに記載された方法に準じて、ビオチン標識した。得られたビオチン標識メチルシトシン抗体を溶液[抗体約0.1μg/10μL 0.1% BSA含有リン酸バッファー（1mM KH₂PO₄、3mM Na2HPO 7H2O、154mM NaCl pH7.4）溶液]として冷蔵保存した。

配列番号８８で示される塩基配列からなるメチル化オリゴヌクレオチドＵＢＣ−Ｍ８、配列番号８９で示される塩基配列からなるメチル化オリゴヌクレオチドＦＢＮ−Ｍ８、配列番号９０で示される塩基配列からなるメチル化オリゴヌクレオチドＧＰＲ−Ｍ８、配列番号９１で示される塩基配列からなるアンメチル化オリゴヌクレオチドＵＢＣ−Ｕ８、配列番号９２で示される塩基配列からなるアンメチル化オリゴヌクレオチドＦＢＮ−Ｕ８、及び、配列番号９３で示される塩基配列からなるアンメチル化オリゴヌクレオチドＧＰＲ−Ｕ８を合成して夫々につき０．２ｐｍｏｌ/μL ＴＥバッファー溶液を調製した。また、ネガティブコントロールとしてＴＥ溶液を用いた。

＜メチル化オリゴヌクレオチド＞ Nは5-メチルシトシンを示す。
UBC-M8：5’- ANGAANGTANGGANGCTNGATNGTTNGGTNGCCTGTCTGACTACAACATCCAGA -3’（配列番号８８）
FBN-M8：5’- ANGAANGTANGGANGCTNGATNGTTNGGTNGCCAGCCGACGAAGGGCTTATTAG -3’（配列番号８９）
GPR-M8：5’- ANGAANGTANGGANGCTNGATNGTTNGGTNGCCTGCCGAGAACGAGGCGTTGTC -3’（配列番号９０）
＜アンメチル化オリゴヌクレオチド＞
UBC-U8：5’- ACGAACGTACGGACGCTCGATCGTTCGGTCGCCTGTCTGACTACAACATCCAGA -3’（配列番号９１）
FBN-U8：5’- ACGAACGTACGGACGCTCGATCGTTCGGTCGCCAGCCGACGAAGGGCTTATTAG -3’（配列番号９２）
GPR-U8：5’- ACGAACGTACGGACGCTCGATCGTTCGGTCGCCTGCCGAGAACGAGGCGTTGTC -3’（配列番号９３）

配列番号９４、配列番号９５、及び、配列番号９６で示される塩基配列を有する５’末端ＦＩＴＣ標識オリゴヌクレオチドＵＢＣ、ＦＢＮ、及び、ＧＰＲの０．５ｐｍｏｌ/μＬＴＥ溶液を調製した（ＵＢＣ-ＦＩＴＣ溶液、ＦＢＮ-ＦＩＴＣ溶液、及び、ＧＰＲ-ＦＩＴＣ溶液）。

＜５’末端FITC標識オリゴヌクレオチド＞
UBC：5’- TCTGGATGTTGTAGTCAGACAG -3’（配列番号９４）
FBN：5’- CTAATAAGCCCTTCGTCGGCT -3’（配列番号９５）
GPR：5’- GACAACGCCTCGTTCTCGG -3’（配列番号９６）

ＵＢＣ混合溶液の調製：ＰＣＲチューブに、前記で調製したオリゴヌクレオチド溶液（ＵＢＣ−Ｍ８又はＵＢＣ−Ｕ８溶液）２μLと、前記で調製した５’末端ＦＩＴＣ標識オリゴヌクレオチド溶液（ＵＢＣ-ＦＩＴＣ溶液）２μLと、緩衝液（330mM Tris-Acetate pH 7.9、660mM KOAc、100mM MgOAc2、5mM Dithothreitol）1μＬと、ＢＳＡ（Bovine serum albumin 1mg/mL）1μＬとを添加した後、これに配列番号９７で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドＣＡ１をキャリアーＤＮＡ（サンプルＤＮＡの非特異的な吸着を防ぐために添加する）として５ｐｍｏｌ添加し、さらに当該混合物に滅菌超純水を加えて液量を１０μＬとし、混合した。

ＦＢＮ混合溶液の調製：ＰＣＲチューブに、前記で調製したオリゴヌクレオチド溶液（ＦＢＮ−Ｍ８又はＦＢＮ−Ｕ８溶液）２μLと、前記で調製した５’末端ＦＩＴＣ標識オリゴヌクレオチド溶液（ＦＢＮ-ＦＩＴＣ溶液）２μLと、緩衝液（330mM Tris-Acetate pH 7.9、660mM KOAc、100mM MgOAc2、5mM Dithothreitol）１μＬと、ＢＳＡ（Bovine serum albumin 1mg/mL）１μＬとを添加した後、これに配列番号９７で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドＣＡ１をキャリアーＤＮＡ（サンプルＤＮＡの非特異的な吸着を防ぐために添加する）として５ｐｍｏｌ添加し、さらに当該混合物に滅菌超純水を加えて液量を１０μＬとし、混合した。

ＧＰＲ混合溶液の調製：ＰＣＲチューブに、前記で調製したオリゴヌクレオチド溶液（ＧＰＲ−Ｍ８又はＧＰＲ−Ｕ８溶液）２μLと、前記で調製した５’末端ＦＩＴＣ標識オリゴヌクレオチド溶液（ＧＰＲ-ＦＩＴＣ溶液）２μLと、緩衝液（330mM Tris-Acetate pH 7.9、660mM KOAc、100mM MgOAc₂、5mM Dithothreitol）１μＬと、ＢＳＡ（Bovine serum albumin 1mg/mL）１μＬとを添加した後、これに配列番号９７で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドＣＡ１をキャリアーＤＮＡ（サンプルＤＮＡの非特異的な吸着を防ぐために添加する）として５ｐｍｏｌ添加し、さらに当該混合物に滅菌超純水を加えて液量を１０μＬとし、混合した。

＜キャリアーＤＮＡ＞
CA1：5’-GATGGCGCTCTG-3’（配列番号９７）

得られた溶液に、ビオチン標識メチルシトシン抗体溶液１０μLを添加した後、室温で１時間放置した。

得られた反応溶液全てを、夫々、平底プレートのウエルに移し代え、ストレプトアビジン被覆クロマトストリップの先端を各ウエルの底まで差し込み、展開した（溶液全部をストリップに吸わせた）。

その結果を図２９〜図３１に示した。メチル化オリゴヌクレオチドＵＢＣ−Ｍ８、ＦＢＮ−Ｍ８、及び、ＧＰＲ−Ｍ８の場合、ストレプトアビジン被覆クロマトストリップ上に、赤紫色のラインが確認された。従って、固定化したメチル化ＤＮＡ抗体と、５’末端ＦＩＴＣビオチン標識オリゴヌクレオチドと、メチル化されたＤＮＡフラグメントとの複合体を形成・分離することが明らかとなった。アンメチル化オリゴヌクレオチドＵＢＣ−Ｕ８、ＦＢＮ−Ｍ８、及び、ＧＰＲ−Ｍ８、並びに、ネガティブコントロール（ＴＥバッファー溶液）では、複合体を形成しないため、赤紫色のラインは確認できなかった。

実施例１３
市販のメチルシトシン抗体（Aviva Systems Biology社製）を、市販ビオチン化キット（Biotin Labeling Kit-NH2、同仁化学研究所製）を用いて、カタログに記載された方法に準じて、ビオチン標識した。得られたビオチン標識メチルシトシン抗体を溶液[抗体約0.1μg/100μL 0.1% BSA含有リン酸バッファー（1mM KH₂PO₄、3mM Na2HPO 7H2O、154mM NaCl pH7.4）溶液]として冷蔵保存した。

合成して得られたビオチン標識メチルシトシン抗体溶液を、ストレプトアビジン被覆済み９６ウエルプレートに１００μL/ウエルを添加した後、約１時間室温で放置することにより、ウエルに固定化した。放置後、当該各ウエルから溶液をデカンテーションにより取り除き、次いで各ウエルに３００μＬの滅菌超純水で２５倍希釈されたDELFIA Wash Concentrate（Perkin Elmer社製、Tris-HCl pH 7.8 with Tween 80）を添加した後、当該各ウエルから当該バッファーをデカンテーションにより取り除いた。この操作をさらに２回繰り返した。

配列番号９８で示される塩基配列からなるメチル化オリゴヌクレオチドＦＢＮ−Ｍ８、及び、配列番号９９で示される塩基配列からなるアンメチル化オリゴヌクレオチドＦＢＮ−Ｕ８を合成して、夫々につき以下のＴＥバッファー溶液を調製した。
溶液Ａ： 0.1pmol/10μL TEバッファー溶液
溶液Ｂ： 0.01pmol/10μL TEバッファー溶液
溶液Ｃ： 0.001pmol/10μL TEバッファー溶液
溶液Ｄ： 0pmol/10μL TEバッファー溶液（ネガティブコントロール液）

＜メチル化オリゴヌクレオチド＞ Nは5-メチルシトシンを示す。
FBN-M8：5’- ANGAANGTANGGANGCTNGATNGTTNGGTNGCCAGCCGACGAAGGGCTTATTAG -3’（配列番号９８）
＜アンメチル化オリゴヌクレオチド＞
FBN-U8：5’- ACGAACGTACGGACGCTCGATCGTTCGGTCGCCAGCCGACGAAGGGCTTATTAG -3’（配列番号９９）

配列番号１００で示される塩基配列を有する５’末端ＦＩＴＣ標識オリゴヌクレオチドＦＢＮの１ｐｍｏｌ/５０μＬＴＥバッファー溶液を調製した（ＵＢＣ-ＦＩＴＣ溶液）。

＜５’末端FITC標識オリゴヌクレオチド＞
FBN：5’- CTAATAAGCCCTTCGTCGGCT -3’（配列番号１００）

また、５’末端ＦＩＴＣ標識オリゴヌクレオチドとオリゴヌクレオチドとの結合体の形成を促す溶液として、以下の緩衝溶液を準備した。
緩衝液１：100mM Tris-HCl pH 7.5、100mM MgCl2、10mM Dithothreitol
緩衝液２：1mM KH₂PO₄ pH7.4、3mM Na2HPO 7H2O、154mM NaCl
緩衝液３：10mM Tris-HCl pH 8.0、1mM EDTA
緩衝液４：330mM Tris-Acetate pH 7.9、660mM KOAc、100mM MgOAc₂、5mM Dithothreitol
緩衝液５：超純水

ＰＣＲチューブに、前記で調製したオリゴヌクレオチド溶液（ＦＢＮ−Ｍ８又はＦＢＮ−Ｕ８溶液）１０μLと、前記で調製した５’末端ＦＩＴＣ標識オリゴヌクレオチド溶液（ＦＢＮ-ＦＩＴＣ溶液）５０μLと、緩衝溶液１〜５のうちいずれか１種の緩衝液を５μＬと、ＢＳＡ（Bovine serum albumin 1mg/mL）５μＬとを添加した後、これに配列番号１０１で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドＣＡ１をキャリアーＤＮＡ（サンプルＤＮＡの非特異的な吸着を防ぐために添加する）として５ｐｍｏｌ添加し、さらに当該混合物に滅菌超純水を加えて液量を５０μＬとし、混合した。

＜キャリアーＤＮＡ＞
CA1：5’-GATGGCGCTCTG-3’（配列番号１０１）

５’末端ＦＩＴＣ標識オリゴヌクレオチドとオリゴヌクレオチドとの結合体の入ったＰＣＲチューブの溶液全量を、先に調製しておいたビオチン標識メチルシトシン抗体が固定化されたプレートに移し代え、室温で約２時間放置した。放置後、前記プレート内の溶液をデカンテーションにより取り除き、次いで前記プレート内の各ウエルに３００μＬの滅菌超純水で２５倍希釈されたDELFIA Wash Concentrate（Perkin Elmer社製、Tris-HCl pH 7.8 with Tween 80）を添加した後、当該各ウエルから当該バッファーをデカンテーションにより取り除いた。この操作をさらに２回繰り返した。

その結果を図３２〜３６に示した。マグネシウムイオンを含有する緩衝液中（緩衝液１及び緩衝液４、図３２及び図３５）において、メチル化オリゴヌクレオチドＦＢＮ−Ｍが、５’末端ビオチン標識オリゴヌクレオチドＦＢＮとの結合体を形成しやすく、それら緩衝液を用いた検体では、固定化したメチル化ＤＮＡ抗体と、５’末端ＦＩＴＣビオチン標識オリゴヌクレオチドと、メチル化されたＤＮＡフラグメントとの複合体を形成・分離し、感度良く検出・定量されることが明らかとなった。

以上より、目的とするＤＮＡ領域を含む一本鎖ＤＮＡと、本オリゴヌクレオチドの結合体を形成させる際には、マグネシウムイオンを含有する反応系を用いるのが好ましいことが確認された。

実施例１４
配列番号１０２で示される塩基配列からなるメチル化オリゴヌクレオチドＵＢＣ−Ｍ８、及び、配列番号１０３で示される塩基配列からなるアンメチル化オリゴヌクレオチドＵＢＣ−Ｕ８を合成し、夫々について、０．０１ｐｍｏｌ/１０μＬＴＥバッファー溶液を調製した。

＜メチル化オリゴヌクレオチド＞ Nは5-メチルシトシンを示す。
UBC-M8：5’- ANGAANGTANGGANGCTNGATNGTTNGGTNGCCTGTCTGACTACAACATCCAGA -3’（配列番号１０２）
＜アンメチル化オリゴヌクレオチド＞
UBC-U8：5’- ACGAACGTACGGACGCTCGATCGTTCGGTCGCCTGTCTGACTACAACATCCAGA -3’（配列番号１０３）

また、配列番号１０４で示される塩基配列からなる５’末端ビオチン標識オリゴヌクレオチドＢ１を合成し、０．０２μM ＴＥバッファー溶液を調製した。

＜５’末端ビオチン標識オリゴヌクレオチド＞
B1：5’- TCTGGATGTTGTAGTCAGACAG -3’（配列番号１０４）

また、５’末端ビオチン標識オリゴヌクレオチドとオリゴヌクレオチドとの結合体の形成を促す溶液調製用として、以下の金属塩水溶液を準備した。
金属塩溶液Ｍｇ：１００ｍＭＭｇＣｌ_２水溶液
金属塩溶液Ｂａ：１００ｍＭＢａＣｌ_２水溶液
金属塩溶液Ｈ２Ｏ：超純水

前記のメチル化オリゴヌクレオチド、又は、アンメチル化オリゴヌクレオチドの夫々の溶液について、以下の処理を施した（各１本ずつ調製）。

ＰＣＲチューブに、前記で調製したオリゴヌクレオチド溶液1０μLと、前記の５’末端ビオチン標識オリゴヌクレオチド溶液５μLと、リン酸バッファー（1mM KH₂PO₄、3mM Na2HPO 7H2O、154mM NaCl pH7.4）１０μＬと、金属塩溶液（金属塩溶液Ｍｇ、金属塩溶液Ｂａ、又は、金属塩溶液Ｈ２Ｏ）６０μＬとを添加し、さらに当該混合物に滅菌超純水を加えて液量を１００μＬとし、混合した。次いで、当該ＰＣＲチューブを９５℃で１０分間加熱し、７０℃まで速やかに冷却し、その温度で１０分間保温した。更に、これを５０℃まで冷却し１０分間保温し、次いで３７℃で１０分間保温した後、室温に戻すことにより、５’末端ビオチン標識オリゴヌクレオチドとオリゴヌクレオチドとの結合体の形成を促した。

次に、Ｅｕ−Ｎ１標識マウスＩｇＧ抗体[Perkin Elmer社製、0.25μg/mL 0.1% BSA含有リン酸バッファー（1mM KH₂PO₄、3mM Na2HPO 7H2O、154mM NaCl pH7.4）溶液]１００ μLを前記の各ウエルに添加した後、１時間室温で放置した。放置後、当該各ウエルを洗浄バッファー[0.05% Tween20含有リン酸バッファー（1mM KH₂PO₄、3mM Na2HPO 7H2O、154mM NaCl pH7.4）]２００ μLで３回洗浄した。

Enhancement Solution（Perkin Elmer社製）２００μLを前記の各ウエルに添加・混合することにより、反応を開始した。その後、約３分間室温で放置した後、得られた試料の蛍光を励起３４０nm／蛍光６１２nmで測定した。

その結果を図３７に示した。二価陽イオンを含有する金属塩溶液中（金属塩溶液Ｍｇ及び金属塩溶液Ｂａ）において、メチル化オリゴヌクレオチドＵＢＣ−Ｍが、５’末端ビオチン標識オリゴヌクレオチドＵＢＣとの結合体を形成しやすく、それら金属塩溶液を用いた検体では、固定化したメチル化ＤＮＡ抗体と、５’末端ＦＩＴＣビオチン標識オリゴヌクレオチドと、メチル化されたＤＮＡフラグメントとの複合体を形成・分離し、感度良く検出・定量されることが明らかとなった。

以上より、目的とするＤＮＡ領域を含む一本鎖ＤＮＡと、本オリゴヌクレオチドの結合体を形成させる際には、二価陽イオンを含有する反応系を用いるのが好ましいことが確認された。

実施例１５
配列番号１０５で示される塩基配列からなるメチル化オリゴヌクレオチドＦＢＮ−Ｍ８、及び、配列番号１０６で示される塩基配列からなるアンメチル化オリゴヌクレオチドＦＢＮ−Ｕ８を合成し、夫々について、０．０１ｐｍｏｌ/１０μＬＴＥバッファー溶液を調製した。

＜メチル化オリゴヌクレオチド＞ Nは5-メチルシトシンを示す。
FBN-M8：5’- ANGAANGTANGGANGCTNGATNGTTNGGTNGCCAGCCGACGAAGGGCTTATTAG -3’（配列番号１０５）
＜アンメチル化オリゴヌクレオチド＞
FBN-U8：5’- ACGAACGTACGGACGCTCGATCGTTCGGTCGCCAGCCGACGAAGGGCTTATTAG -3’（配列番号１０６）

また、配列番号１０７で示される塩基配列からなる５’末端ビオチン標識オリゴヌクレオチドＦＢＮを合成し、０．０２μM ＴＥバッファー溶液を調製した（ＦＢＮ−Ｂ溶液）。

＜５’末端ビオチン標識オリゴヌクレオチド＞
FBN：5’- CTAATAAGCCCTTCGTCGGCT -3’（配列番号１０７）

また、５’末端ビオチン標識オリゴヌクレオチドとオリゴヌクレオチドとの結合体の形成を促す溶液調製用として、以下の０、１０、２０、３０、４０、６０、８０、１００ｍＭＭｇＣｌ_２水溶液を準備した。

ＰＣＲチューブに、前記で調製したオリゴヌクレオチド溶液1０μLと、前記の５’末端ビオチン標識オリゴヌクレオチド溶液５μLと、緩衝液（330mM Tris-Acetate pH 7.9、660mM KOAc、100mM MgOAc₂、5mM Dithothreitol）１０μＬと、ＭｇＣｌ_２水溶液（０〜１０００ｍＭ）６０μＬとを添加し、さらに当該混合物に滅菌超純水を加えて液量を１００μＬとし、混合した。

その結果を図３８に示した。マグネシウムイオンを最終濃度１０ｍＭ〜７０ｍＭ含有する緩衝液において、メチル化オリゴヌクレオチドＦＢＮ−Ｍが、５’末端ビオチン標識オリゴヌクレオチドＦＢＮとの結合体を形成しやすく、それら緩衝液を用いた検体では、固定化したメチル化ＤＮＡ抗体と、５’末端ＦＩＴＣビオチン標識オリゴヌクレオチドと、メチル化されたＤＮＡフラグメントとの複合体を形成・分離し、感度良く検出・定量されることが明らかとなった。特に、マグネシウムイオンの最終濃度が５８ｍＭ以上で、よりメチル化オリゴヌクレオチドＦＢＮ−Ｍが、５’末端ビオチン標識オリゴヌクレオチドＦＢＮとの結合体を形成しやすいものと考えられた。

実施例１６
配列番号１０８で示される塩基配列からなるメチル化オリゴヌクレオチドＦＢＮ−Ｍ８、及び、配列番号１０９で示される塩基配列からなるアンメチル化オリゴヌクレオチドＦＢＮ−Ｕ８を合成し、夫々について、０．０１ｐｍｏｌ/１０μＬＴＥバッファー溶液を調製した。

＜メチル化オリゴヌクレオチド＞ Nは5-メチルシトシンを示す。
FBN-M8：5’- ANGAANGTANGGANGCTNGATNGTTNGGTNGCCAGCCGACGAAGGGCTTATTAG -3’（配列番号１０８）
＜アンメチル化オリゴヌクレオチド＞
FBN-U8：5’- ACGAACGTACGGACGCTCGATCGTTCGGTCGCCAGCCGACGAAGGGCTTATTAG -3’（配列番号１０９）

また、配列番号１１０で示される塩基配列からなる５’末端ビオチン標識オリゴヌクレオチドＦＢＮを合成し、０．０２μM ＴＥバッファー溶液を調製した（ＦＢＮ−Ｂ溶液）。

＜５’末端ビオチン標識オリゴヌクレオチド＞
FBN：5’- CTAATAAGCCCTTCGTCGGCT -3’（配列番号１１０）

また、５’末端ビオチン標識オリゴヌクレオチドとオリゴヌクレオチドとの結合体の形成を促す溶液調製用として、以下の０、１００、２００、３００、４００、６００、８００、１０００ｍＭＭｇＣｌ_２水溶液を準備した。

その結果を図３９に示した。マグネシウムイオンを最終濃度１０ｍＭ〜６１０ｍＭ含有する緩衝液において、メチル化オリゴヌクレオチドＦＢＮ−Ｍが、５’末端ビオチン標識オリゴヌクレオチドＦＢＮとの結合体を形成しやすく、それら緩衝液を用いた検体では、固定化したメチル化ＤＮＡ抗体と、５’末端ＦＩＴＣビオチン標識オリゴヌクレオチドと、メチル化されたＤＮＡフラグメントとの複合体を形成・分離し、感度良く検出・定量されることが明らかとなった。マグネシウムイオンの最終濃度が７０ｍＭ〜６１０ｍＭで、よりメチル化オリゴヌクレオチドＦＢＮ−Ｍが、５’末端ビオチン標識オリゴヌクレオチドＦＢＮとの結合体を形成しやすいものと考えられた。

実施例１７

クロンテック社より購入されたヒト血液由来ゲノムＤＮＡについて、以下の配列番号１１１及び配列番号１１２で示されるＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマープライマー（ＰＦ１及びＰＲ１）及び反応条件を用いてＰＣＲを行うことにより、供試サンプルとして用いられるＤＮＡフラグメント（Ｘ、配列番号１１３、Genbank Accession No. NT_029419等に示される塩基番号25687390-25687775に相当する領域）を増幅した。

＜ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー＞
ＰＦ１：5’- CTCAGCACCCAGGCGGCC -3’ （配列番号１１１）
ＰＲ１：5’- CTGGCCAAACTGGAGATCGC -3’ （配列番号１１２）

＜DNAフラグメント＞
Ｘ：5’- CTCAGCACCCAGGCGGCCGCGATCATGAGGCGCGAGCGGCGCGCGGGCTGTTGCAGAGTCTTGAGCGGGTGGCACACCGCGATGTAGCGGTCGGCTGTCATGACTACCAGCATGTAGGCCGACGCAAACATGCCGAACACCTGCAGGTGCTTCACCACGCGGCACAGCCAGTCGGGGCCGCGGAAGCGGTAGGTGATGTCCCAGCACATTTGCGGCAGCACCTGGAAGAATGCCACGGCCAGGTCGGCCAGGCTGAGGTGTCGGATGAAGAGGTGCATGCGGGACGTCTTGCGCGGCGTCCGGTGCAGAGCCAGCAGTACGCTGCTGTTGCCCAGCACGGCCACCGCGAAAGTCACCGCCAGCACGGCGATCTCCAGTTTGGCCAG（配列番号１１３）

ＰＣＲの反応液としては、鋳型とするゲノムＤＮＡを５ｎｇと、5μＭに調製されたオリゴヌクレオチドプライマー溶液各３μｌと、each ２ｍＭｄＮＴＰを５μlと、１０×緩衝液(100mM Tris-HCl pH 8.3、500mM KCl、15mM MgCl₂、0.01％ Gelatin)を５μｌと、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ（AmpliTaq Gold、ＡＢＩ社製）5U/μlを０．２５μｌとを混合し、これに滅菌超純水を加えて液量を５０μｌとしたものを用いた。当該反応液を、９５℃にて１０分間保温した後、９５℃にて３０秒間次いで６１℃にて３０秒間更に７２℃にて４５秒間を１サイクルとする保温を４０サイクル行う条件でＰＣＲを行った。
ＰＣＲを行った後、１．５％アガロースゲル電気泳動により増幅を確認し、Wizard SV Gel/PCR Kit（PROMEGA社）により、ＤＮＡフラグメントＸを精製した。

得られたＤＮＡフラグメント溶液の一部について、SssI methylase (NEB社製)を１μｌと、１０ｘNEBuffer２(NEB社製)を１０μlと、S-adenosyl methionine (3.2 mM, NEB社製)を１μｌとを混合し、これに滅菌超純水を加えて液量を１００μｌとしたものを調製した。当該反応液を、37℃にて１５-３０分間インキュベーションし、さらにS-adenosyl methionine (3.2 mM, NEB社製)を１μｌを追加して37℃にて１５-３０分間インキュベーションした。これをWizard SV Gel/PCR Kit（PROMEGA社）により精製した。さらにこれらの操作を５回繰り返し、メチル化したＤＮＡフラグメント（ＭＸ、配列番号１１４）を得た。

＜ＤＮＡフラグメント＞（Ｎは5-メチルシトシンを示す）
ＭＸ：5’- CTCAGCACCCAGGNGGCNGNGATCATGAGGNGNGAGNGGNGNGNGGGCTGTTGCAGAGTCTTGAGNGGGTGGCACACNGNGATGTAGNGGTNGGCTGTCATGACTACCAGCATGTAGGCNGANGCAAACATGCNGAACACCTGCAGGTGCTTCACCANGNGGCACAGCCAGTNGGGGCNGNGGAAGNGGTAGGTGATGTCCCAGCACATTTGNGGCAGCACCTGGAAGAATGCCANGGCCAGGTNGGCCAGGCTGAGGTGTNGGATGAAGAGGTGCATGNGGGANGTCTTGNGNGGNGTCNGGTGCAGAGCCAGCAGTANGCTGCTGTTGCCCAGCANGGCCACNGNGAAAGTCACNGCCAGCANGGNGATCTCCAGTTTGGCCAG -3’（配列番号１１４）

得られたＤＮＡフラグメントＸについて、以下の溶液を夫々２連で調製した。
溶液Ａ：10ng/10μL TE溶液
溶液Ｂ：1ng/10μL TE溶液
溶液Ｃ：TE溶液（ネガティブコントロール液）

得られたＤＮＡフラグメントＭＸについて、以下の溶液を夫々２連で調製した。
溶液ＭＡ：10ng/10μL TE溶液
溶液ＭＢ：1ng/10μL TE溶液
溶液ＭＣ：TE溶液（ネガティブコントロール液）

また、配列番号１１５で示される塩基配列からなる目的とするＤＮＡ領域Ｘ’に相補性により結合可能な配列番号１１６で示される塩基配列からなる５’末端ビオチン標識オリゴヌクレオチドＢ１を合成し、その濃度が０．０２μＭであるＴＥバッファー溶液を調製した。

＜目的とするＤＮＡ領域＞
Ｘ’：5’- CTCAGCACCCAGGCGGCCGCGATCATGAGGCGCGAGCGGCGCGCGGGCTGTTGCAGAGTCTTGAGCGGGTGGCACACCGCGATGTAGCGGTCGGCTGTCATGACTACCAGCATGTAGGCCGACGCAAACATGCCGAACACCTGCAGGTGCTTCACCACGCGGCACAGCCAGTCGGGGCCGCGGAAGCGGTAGGTGATGTCCCAGCACATTTGCGGCAGCACCTGGAAGAATGCCACGGCCAGGTCGGCCAGGCTGAGGTGTCGGATGAAGAGGTGCATGCGGGACGTCTTGCGCGGCGTCCGGTGCAGAGCCAGCAGTACGCTGCTGTTGCCCAGCACGGCCACCGCGAAAGTCACCGCCAGCACGGCGATCTCCAGTTTGGCCAG -3’ （配列番号１１５）

＜５’末端ビオチン標識オリゴヌクレオチド＞
Ｂ１：5’Biotin- CTGGCCAAACTGGAGATCGC -3’ （配列番号１１６）

また、配列番号１１５で示される塩基配列からなる目的とするＤＮＡ領域Ｘ’の負鎖に相補性により結合可能な配列番号１１７〜配列番号１２８で示される塩基配列からなるカウンターオリゴヌクレオチドＣ１〜Ｃ１２を合成し、夫々の濃度が０．０１μＭであるＴＥバッファー溶液を調製した。

＜カウンターオリゴヌクレオチド＞
Ｃ１：5’- GCCACCGCGAAAGTCACCGCCAGCACGGCG -3’ （配列番号１１７）
Ｃ２：5’- GCCAGCAGTACGCTGCTGTTGCCCAGCACG -3’ （配列番号１１８）
Ｃ３：5’- CGGGACGTCTTGCGCGGCGTCCGGTGCAGA -3’ （配列番号１１９）
Ｃ４：5’- AGGCTGAGGTGTCGGATGAAGAGGTGCATG -3’ （配列番号１２０）
Ｃ５：5’- ACCTGGAAGAATGCCACGGCCAGGTCGGCC -3’ （配列番号１２１）
Ｃ６：5’- TAGGTGATGTCCCAGCACATTTGCGGCAGC -3’ （配列番号１２２）
Ｃ７：5’- CGGCACAGCCAGTCGGGGCCGCGGAAGCGG -3’ （配列番号１２３）
Ｃ８：5’- ATGCCGAACACCTGCAGGTGCTTCACCACG -3’ （配列番号１２４）
Ｃ９：5’- ATGACTACCAGCATGTAGGCCGACGCAAAC -3’ （配列番号１２５）
Ｃ１０：5’- TGGCACACCGCGATGTAGCGGTCGGCTGTC -3’ （配列番号１２６）
Ｃ１１：5’- CGCGCGGGCTGTTGCAGAGTCTTGAGCGGG -3’ （配列番号１２７）
Ｃ１２：5’- CAGGCGGCCGCGATCATGAGGCGCGAGCGG -3’ （配列番号１２８）

前記のＤＮＡフラグメントＸの溶液及びメチル化したＤＮＡフラグメントＭＸの溶液の夫々について、以下の処理を施した。

ＰＣＲチューブに、前記で調製したＤＮＡフラグメント溶液１０μLと、前記で調製した５’末端ビオチン標識オリゴヌクレオチド溶液１０μLと、前記で調製したカウンターオリゴヌクレオチド溶液１０μLと、緩衝液（330mM Tris-Acetate pH 7.9、660mM KOAc、100mM MgOAc₂、5mM Dithiothreitol）１０μＬと、100ｍＭのＭｇＣｌ_２溶液１０μＬと、1ｍｇ/ｍＬのＢＳＡ溶液１０μＬを添加し、さらに当該混合物に滅菌超純水を加えて液量を１００μＬとし、混合した。その後、本ＰＣＲチューブを９５℃で１０分間加熱し、７０℃まで速やかに冷却し、その温度で１０分間保温した。次いで、５０℃まで冷却し１０分間保温し、さらに３７℃で１０分間保温した後、室温に戻した（以上、本発明測定方法の第一工程に相当する）。

前記で調製したＤＮＡフラグメントの反応液１００μLを、ストレプトアビジン被覆済み８ウェルストリップ（Perkin Elmer社製、計１２ウェル）に添加し、30分間室温で放置してウェルに固定化した。その後、溶液をピペッティングにより取り除き、２００μＬの洗浄バッファー[0.05% Tween20含有リン酸バッファー（1mM KH₂PO₄、3mM Na2HPO 7H2O、154mM NaCl pH7.4）]を添加した後、当該バッファーをデカンテーションにより取り除いた。この操作をさらに２回繰り返した（以上、本発明測定方法の第二工程に相当する）。

配列番号１１６で示される塩基配列からなる５’末端ビオチン標識オリゴヌクレオチドＢ１に相補性により結合可能な配列番号１２９で示される塩基配列からなるマスキング用オリゴヌクレオチドＭ１を合成し、その濃度が０．１μＭであるＴＥバッファー溶液を調製した。

＜マスキング用オリゴヌクレオチド＞
Ｍ１：5’- ATCTCCAGTTTGGCCAG -3’ （配列番号１２９）

各ウェルにメチルシトシン抗体[Aviva Systems Biology社製、0.5μg/mL 0.1% BSA含有リン酸バッファー（1mM KH₂PO₄、3mM Na2HPO 7H2O、154mM NaCl pH7.4）溶液]を１００μLと前記のマスキング用オリゴヌクレオチド溶液１μLを添加し、１時間室温で放置した。その後、各ウェルを洗浄バッファー[0.05% Tween20含有リン酸バッファー（1mM KH₂PO₄、3mM Na2HPO 7H2O、154mM NaCl pH7.4）]２００μLで３回洗浄した。

その後、Ｅｕ−Ｎ１標識マウスＩｇＧ抗体[Perkin Elmer社製、0.05μg/mL 0.1% BSA含有リン酸バッファー（1mM KH₂PO₄、3mM Na2HPO 7H2O、154mM NaCl pH7.4）溶液]を各ウエルに１００μLの割合で添加後、１時間室温で放置した。その後、溶液をデカンテーションにて取り除き、各ウェルを洗浄バッファー[0.05% Tween20含有リン酸バッファー（1mM KH2PO4、3mM Na2HPO 7H2O、154mM NaCl pH7.4）]２００μLで３回洗浄した。

Enhancement Solution（Perkin Elmer社製）を各ウェルに１５０μLの割合で添加し、5分間撹拌後、１５分間室温で放置した。その後、励起３４０nm／蛍光６１２nmで蛍光を測定した（以上、本発明測定方法の第三工程に相当する）。

その結果を図４０に示した。メチル化されたＤＮＡフラグメントＭＸの溶液ＭＡ及びＭＢでは、蛍光強度の増加が確認され、その強度は濃度依存的であった。ネガティブコントロール溶液ＭＣでは、蛍光強度の増加が確認されなかった。メチル化されていないＤＮＡフラグメントＸの溶液Ａ、Ｂ及びＣでは、蛍光強度の増加が確認されなかった。

以上より、ビオチン標識オリゴヌクレオチド及びメチルシトシン抗体で、メチル化された目的とするＤＮＡ領域を含むＤＮＡを選択し固定化することが可能であること、また、メチル化されたＤＮＡを高感度に検出・定量できることが確認された。

実施例１８

クロンテック社より購入されたヒト血液由来ゲノムＤＮＡについて、以下の配列番号１３０及び配列番号１３１で示されるＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー（ＰＦ２及びＰＲ２）及び反応条件を用いてＰＣＲを行うことにより、供試サンプルとして用いられるＤＮＡフラグメント（Ｙ、配列番号１３２、Genbank Accession No. ac009800等に示される塩基番号76606-76726に相当する領域）を増幅した。

＜ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー＞
ＰＦ２：5’- TGAGCTCCGTAGGGCGTCC -3’ （配列番号１３０）
ＰＲ２：5’- GCGCCGGGTCCGGGCCC -3’ （配列番号１３１）

＜DNAフラグメント＞
Ｙ：5’- GCGCCGGGTCCGGGCCCGATGCGTTGGCGGGCCAGGGCTCCGAGAACGAGGCGTTGTCCATCTCAACGAGGGCAGAGGAGCCGGCGACCTGGCGTCCCCCAAGGACGCCCTACGGAGCTCA -3’（配列番号１３２）

ＰＣＲの反応液としては、鋳型とするゲノムＤＮＡを５ｎｇと、5μＭに調製されたオリゴヌクレオチドプライマー溶液各３μｌと、each ２ｍＭｄＮＴＰを５μlと、１０×緩衝液(100mM Tris-HCl pH 8.3、500mM KCl、15mM MgCl₂、0.01％ Gelatin)を５μｌと、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ（AmpliTaq Gold、ＡＢＩ社製）5U/μlを０．２５μｌとを混合し、これに滅菌超純水を加えて液量を５０μｌとしたものを用いた。当該反応液を、９５℃にて１０分間保温した後、９５℃にて３０秒間次いで６０℃にて３０秒間更に７２℃にて４５秒間を１サイクルとする保温を５０サイクル行う条件でＰＣＲを行った。
ＰＣＲを行った後、１．５％アガロースゲル電気泳動により増幅を確認し、Wizard SV Gel/PCR Kit（PROMEGA社）により、ＤＮＡフラグメントＹを精製した。

得られたＤＮＡフラグメント溶液の一部について、SssI methylase (NEB社製)を１μｌと、１０ｘNEBuffer２(NEB社製)を１０μlと、S-adenosyl methionine (3.2 mM, NEB社製)を１μｌとを混合し、これに滅菌超純水を加えて液量を１００μｌとしたものを調製した。当該反応液を、37℃にて１５-３０分間インキュベーションし、さらにS-adenosyl methionine (3.2 mM, NEB社製)を１μｌを追加して37℃にて１５-３０分間インキュベーションした。これをWizard SV Gel/PCR Kit（PROMEGA社）により精製した。さらにこの操作を５回繰り返し、メチル化ＤＮＡフラグメント（ＭＹ、配列番号１３３）を得た。

＜メチル化ＤＮＡフラグメント＞（Ｎは5-メチルシトシンを示す）
ＭＹ：5’- GNGCNGGGTCNGGGCCNGATGNGTTGGNGGGCCAGGGCTCNGAGAANGAGGNGTTGTCCATCTCAANGAGGGCAGAGGAGCNGGNGACCTGGNGTCCCCCAAGGANGCCCTANGGAGCTCA -3’（配列番号１３３）

得られたＤＮＡフラグメントＹについて、以下の溶液を夫々２連で調製した。
溶液Ａ：10ng/10μL TE溶液
溶液Ｂ：TE溶液（ネガティブコントロール液）

得られたＤＮＡフラグメントＭＹについて、以下の溶液を夫々２連で調製した。
溶液ＭＡ：10ng/10μL TE溶液
溶液ＭＢ：TE溶液（ネガティブコントロール液）

また、配列番号１３４で示される塩基配列からなる目的とするＤＮＡ領域Ｙ’に相補性により結合可能な配列番号１３５で示される塩基配列からなる５’末端ビオチン標識オリゴヌクレオチドＢ２を合成し、その濃度が０．０２μＭであるＴＥバッファー溶液を調製した。

＜目的とするＤＮＡ領域＞
Ｙ’：5’- GCGCCGGGTCCGGGCCCGATGCGTTGGCGGGCCAGGGCTCCGAGAACGAGGCGTTGTCCATCTCAACGAGGGCAGAGGAGCCGGCGACCTGGCGTCCCCCAAGGACGCCCTACGGAGCTCA -3’（配列番号１３４）

＜５’末端ビオチン標識オリゴヌクレオチド＞
Ｂ２：5’Biotin- GACAACGCCTCGTTCTCGG -3’ （配列番号１３５）

また、配列番号１３４で示される塩基配列からなる目的とするＤＮＡ領域Ｙ’の負鎖に相補性により結合可能な配列番号１３６、塩基配列２７及び配列番号１３８で示される塩基配列からなるカウンターオリゴヌクレオチドＣ１３、Ｃ１４、及びＣ１５を合成し、夫々の濃度が０．０１μＭであるＴＥバッファー溶液を調製した。

＜カウンターオリゴヌクレオチド＞
Ｃ１３：5’- GCGTCCCCCAAGGACGCCCTACGGAGCTCA -3’ （配列番号１３６）
Ｃ１４：5’- CTCAACGAGGGCAGAGGAGCCGGCGACCTG -3’ （配列番号１３７）
Ｃ１５：5’- CGCCGGGTCCGGGCCCGATGCGTTGGCGGG -3’ （配列番号１３８）

前記のＤＮＡフラグメントＹの溶液及びメチル化したＤＮＡフラグメントＭＹの溶液の夫々について、以下の処理を施した。

ＰＣＲチューブに、前記で調製したＤＮＡフラグメント溶液１０μLと、前記で調製したビオチン標識オリゴヌクレオチド溶液１０μLと、前記で調製したカウンターオリゴヌクレオチド溶液１０μLと、緩衝液（330mM Tris-Acetate pH 7.9、660mM KOAc、100mM MgOAc₂、5mM Dithiothreitol）１０μＬと、100ｍＭのＭｇＣｌ_２溶液１０μＬと、1ｍｇ/ｍＬのＢＳＡ溶液１０μＬを添加し、さらに当該混合物に滅菌超純水を加えて液量を１００μＬとし、混合した。その後、本ＰＣＲチューブを９５℃で１０分間加熱し、７０℃まで速やかに冷却し、その温度で１０分間保温した。次いで、５０℃まで冷却し１０分間保温し、さらに３７℃で１０分間保温した後、室温に戻した（以上、本発明測定方法の第一工程に相当する）。

前記で調製したＤＮＡフラグメントの反応液１００μLを、ストレプトアビジン被覆済み８ウェルストリップ（Perkin Elmer社製、計８ウェル）に添加し、30分間室温で放置してウェルに固定化した。その後、溶液をピペッティングにより取り除き、２００μＬの洗浄バッファー[0.05% Tween20含有リン酸バッファー（1mM KH₂PO₄、3mM Na2HPO 7H2O、154mM NaCl pH7.4）]を添加した後、当該バッファーをデカンテーションにより取り除いた。この操作をさらに２回繰り返した（以上、本発明測定方法の第二工程に相当する）。

配列番号１３５で示される塩基配列からなる５’末端ビオチン標識オリゴヌクレオチドＢ２に相補性により結合可能な配列番号１３９で示される塩基配列からなるマスキング用オリゴヌクレオチドＭ２を合成し、その濃度が０．１μＭであるＴＥバッファー溶液を調製した。

＜マスキング用オリゴヌクレオチド＞
M２：5’- CCGAGAACGAGGCGTTGTCT -3’ （配列番号１３９）

その後、Ｅｕ−Ｎ１標識マウスＩｇＧ抗体[Perkin Elmer社製、0.05μg/mL 0.1% BSA含有リン酸バッファー（1mM KH₂PO₄、3mM Na2HPO 7H2O、154mM NaCl pH7.4）溶液]を各ウェルに１００μLの割合で添加後、１時間室温で放置した。その後、溶液をデカンテーションにて取り除き、各ウェルを洗浄バッファー[0.05% Tween20含有リン酸バッファー（1mM KH₂PO4、3mM Na2HPO 7H2O、154mM NaCl pH7.4）]２００μLで３回洗浄した。

その結果を図４１に示した。メチル化されたＤＮＡフラグメントＭＹの溶液ＭＡでは、蛍光強度の増加が確認された。ネガティブコントロール溶液ＭＢでは、蛍光強度の増加が確認されなかった。メチル化されていないＤＮＡフラグメントＹの溶液Ａ及びＢでは、蛍光強度の増加が確認されなかった。

以上より、ビオチン標識オリゴヌクレオチド及びメチルシトシン抗体で、メチル化された目的とするＤＮＡ領域を含むＤＮＡを選択し固定化することが可能であること、また、メチル化されたＤＮＡを高感度に検出できることが確認された。

実施例１９

パン酵母酵母株Ｘ２１８０−１ＡをＹＰＤ培地（1% Yeast extract、2% Peptone、2% Glucose, pH 5.6-6.0）で、濁度がOD₆₀₀ 0.6-1.0 になるまで培養し、10,000g で10分間遠心して、1ｘ10⁷の酵母細胞を調製した。調製した酵母細胞から、Methods in Yeast Genetics(Cold Spring Harbor Laboratory)に記載されているような、一般的な酵母ゲノムの調製法を用いて酵母ゲノムを取得した。
調製した酵母細胞を、バッファーＡ（1M ソルビトール、 0.1M EDTA、pH 7.4）に懸濁し、2-メルカプトエタノール（終濃度14mM）及び100U zymolase（10 mg/ml）を添加して、溶液が透明になるまで 30°C で１時間、撹拌しながらインキュベートした。550gで10分間遠心してプロトプラストを回収後、バッファーＢ（50 mM Tris-HCl、pH 7.4、 20 mM EDTA）に懸濁してから、ドデシル硫酸ナトリウムを１％（ｗ／ｖ）になるように加えた後、65℃で30分間インキュベートした。続いて、体積比2/5量の5M CH₃COOKを添加して混和してから30分間氷冷後、15,000gで30分間遠心して上清を回収した。回収した上清に体積比1/10量の3M CH3COONaと等量のイソプロパノ−ルを加えてよく混和し、15,000g ４℃で30分間遠心して得られた沈澱を７０％エタノールでリンスして回収した。沈澱を乾燥させてから、１ｍl のTEバッファー（10 mM Tris-HCl、pH 8.0、1 mM EDTA）に溶解し、40μg/mlになるようにＲＮａｓｅＡ（Sigma社製）を加えて３７℃で１時間インキュベートし、続いて、混合液にproteinase K（Sigma社製）を５００μｇ／ｍｌ及びドデシル硫酸ナトリウムを１％（ｗ／ｖ）になるように加えた後、これを５５℃で約１６時間振とうした。振とう終了後、当該混合物をフェノール[1M Tris-HCl（pH 8.0）にて飽和］・クロロホルム抽出処理した。水層を回収し、これにＮａＣｌを０．５Ｎとなるよう加えた後、これをエタノール沈澱処理して生じた沈澱を回収した。回収された沈澱を７０％エタノールでリンスすることにより、ゲノムＤＮＡを得た。
得られたゲノムＤＮＡから、以下の配列番号１４０及び配列番号１４１で示されるプライマー（ＰＦ３及びＰＲ３）及び反応条件を用いてＰＣＲを行うことにより、供試サンプルとして用いられるＤＮＡフラグメント（Ｓ、配列番号１４２、Genbank Accession No. NC_001139等に示される酵母染色体VIIの塩基番号271743-272083に相当する領域）を増幅した。

ＰＦ３：5’- AGGTGAGCTACGTGTGTTTGG -3’ （配列番号１４０）
ＰＲ３：5’- AGACATGTGCTCACGTACGGT -3’ （配列番号１４１）

＜ＤＮＡフラグメント＞
Ｓ：5’- AGGTGAGCTACGTGTGTTTGGGCGTCGTGCACTGGCTCACTTGTACGCGCAGAAATGGCAGCTTGTACGATTGGTGACCCGCCTTTTCGACACTGGACCGCTATGGACGTGGCGGCGGTGTGGCGGCGGCTCAATGACCTGTGGCGCCCGTTTGTGGCGTGCGATAGTCGAGCCGCCTGTCACGTGCGCGGCCGCCCTGCTCCGTTTGACGCGATGCATAGCATGCGACCACCCAGTAATCATACTGCTGACGCTATTGGTCACGTGGTTATGGCAGCTGCTGTTGACTGCGGTGGCGTCCCGTTTCCACACCGTACGTGAGCACATGTCT -3’（配列番号１４２）

ＰＣＲの反応液としては、鋳型とするゲノムＤＮＡを10ｎｇと、5μＭの上記プライマー溶液各３μｌと、each ２ｍＭｄＮＴＰを５μlと、１０×緩衝液(100mM Tris-HCl pH 8.3、500mM KCl、15mM MgCl₂、0.01％ Gelatin)を５μｌと、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ（AmpliTaq Gold）5U/μlを０．２５μｌとを混合し、これに滅菌超純水を加えて液量を５０μｌとしたものを用いた。当該反応液を、９５℃にて１０分間保温した後、９５℃にて２０秒間次いで５８℃にて３０秒間さらに７２℃にて３０秒間を１サイクルとする保温を４０サイクル行う条件でＰＣＲを行った。
ＰＣＲを行った後、２％アガロースゲル電気泳動により増幅を確認し、Wizard SV Gel/PCR Kit（PROMEGA社）により、ＤＮＡフラグメントＳを精製した。

得られたＤＮＡフラグメント溶液の一部について、SssI methylase (NEB社製)を１μｌと、１０ｘNEBuffer２(NEB社製)を１０μlと、S-adenosyl methionine (3.2 mM, NEB社製)を１μｌとを混合し、これに滅菌超純水を加えて液量を１００μｌとしたものを調製した。当該反応液を、37℃にて１５-３０分間インキュベーションし、さらにS-adenosyl methionine (3.2 mM, NEB社製)を１μｌを追加して37℃にて１５-３０分間インキュベーションした。これをWizard SV Gel/PCR Kit（PROMEGA社）により精製した。さらにこの操作を５回繰り返し、メチル化ＤＮＡフラグメント（ＭＳ、配列番号１４３）を得た。

＜メチル化ＤＮＡフラグメント＞（Ｎは5-メチルシトシンを示す）
ＭＳ：5’- AGGTGAGCTANGTGTGTTTGGGNGTNGTGCACTGGCTCACTTGTANGNGCAGAAATGGCAGCTTGTANGATTGGTGACCNGCCTTTTNGACACTGGACNGCTATGGANGTGGNGGNGGTGTGGNGGNGGCTCAATGACCTGTGGNGCCNGTTTGTGGNGTGNGATAGTNGAGCNGCCTGTCANGTGNGNGGCNGCCCTGCTCNGTTTGANGNGATGCATAGCATGNGACCACCCAGTAATCATACTGCTGANGCTATTGGTCANGTGGTTATGGCAGCTGCTGTTGACTGNGGTGGNGTCCNGTTTCCACACNGTAOGTGAGCACATGTCT -3’（配列番号１４３）

得られたＤＮＡフラグメントＳについて、以下の溶液を夫々２連で調製した。
溶液Ａ：10ng/10μL TE溶液
溶液Ｂ：1ng/10μL TE溶液
溶液Ｃ：0.1ng/10μL TE溶液
溶液Ｄ：TE溶液（ネガティブコントロール液）

得られたＤＮＡフラグメントＭＳについて、以下の溶液を夫々２連で調製した。
溶液ＭＡ：10ng/10μL TE溶液
溶液ＭＢ：1ng/10μL TE溶液
溶液ＭＣ：0.1ng/10μL TE溶液
溶液ＭＤ：TE溶液（ネガティブコントロール液）

また、配列番号１４４で示される塩基配列からなる目的とするＤＮＡ領域Ｓ’に相補性により結合可能な配列番号１４５で示される塩基配列からなる５’末端ビオチン標識オリゴヌクレオチドＢ３を合成し、その濃度が０．０２μＭであるＴＥバッファー溶液を調製した。

＜目的とするＤＮＡ領域＞
Ｓ’：5’- AGGTGAGCTACGTGTGTTTGGGCGTCGTGCACTGGCTCACTTGTACGCGCAGAAATGGCAGCTTGTACGATTGGTGACCCGCCTTTTCGACACTGGACCGCTATGGACGTGGCGGCGGTGTGGCGGCGGCTCAATGACCTGTGGCGCCCGTTTGTGGCGTGCGATAGTCGAGCCGCCTGTCACGTGCGCGGCCGCCCTGCTCCGTTTGACGCGATGCATAGCATGCGACCACCCAGTAATCATACTGCTGACGCTATTGGTCACGTGGTTATGGCAGCTGCTGTTGACTGCGGTGGCGTCCCGTTTCCACACCGTACGTGAGCACATGTCT -3’ （配列番号１４４）

＜５’末端ビオチン標識オリゴヌクレオチド＞
Ｂ３：5’Biotin- AGACATGTGCTCACGTACGGT -3’ （配列番号１４５）

また、配列番号１４４で示される塩基配列からなる目的とするＤＮＡ領域Ｓ’の負鎖に相補性により結合可能な配列番号１４６〜配列番号１５５で示される塩基配列からなるカウンターオリゴヌクレオチドＣ１６〜Ｃ２５を合成し、夫々の濃度が０．０１μＭであるＴＥバッファー溶液を調製した。

＜カウンターオリゴヌクレオチド＞
Ｃ１６：5’- AGGTGAGCTACGTGTGTTTGG -3’ （配列番号１４６）
Ｃ１７：5’- GCGTCGTGCACTGGCTCACTTGTACGCGCA -3’ （配列番号１４７）
Ｃ１８：5’- CTTGTACGATTGGTGACCCGCCTTTTCGAC -3’ （配列番号１４８）
Ｃ１９：5’- ACTGGACCGCTATGGACGTGGCGGCGGTGT -3’ （配列番号１４９）
Ｃ２０：5’- GGCGGCGGCTCAATGACCTGTGGCGCCCGT -3’ （配列番号１５０）
Ｃ２１：5’- TTGTGGCGTGCGATAGTCGAGCCGCCTGTC -3’ （配列番号１５１）
Ｃ２２：5’- ACGTGCGCGGCCGCCCTGCTCCGTT -3’ （配列番号１５２）
Ｃ２３：5’- TGACGCGATGCATAGCATGCGACCACCCAG -3’ （配列番号１５３）
Ｃ２４：5’- ACTGCTGACGCTATTGGTCACGTGGTTATG -3’ （配列番号１５４）
Ｃ２５：5’- CTGCTGTTGACTGCGGTGGCGTCCCGTTTC -3’ （配列番号１５５）

前記のＤＮＡフラグメントＳの溶液及びメチル化したＤＮＡフラグメントＭＳの溶液の夫々について、以下の処理を施した。

配列番号１４５で示される塩基配列からなる５’末端ビオチン標識オリゴヌクレオチドＢ３に相補性により結合可能な配列番号１５６で示される塩基配列からなるマスキング用オリゴヌクレオチドＭ３を合成し、その濃度が０．０２μＭであるＴＥバッファー溶液を調製した。

前記で調製したＤＮＡフラグメントの反応液１００μLを、ストレプトアビジン被覆済み８ウェルストリップ（Perkin Elmer社製）に添加し、30分間室温で放置してウェルに固定化した。その後、溶液をピペッティングにより取り除き、２００μＬの洗浄バッファー[0.05% Tween20含有リン酸バッファー（1mM KH₂PO₄、3mM Na2HPO 7H2O、154mM NaCl pH7.4）]を添加した後、当該バッファーをデカンテーションにより取り除いた。この操作をさらに２回繰り返した（以上、本発明測定方法の第二工程に相当する）。

＜マスキング用オリゴヌクレオチド＞
Ｍ３：5’- ACCGTACGTGAGCACATGTCT -3’ （配列番号１５６）

その後、Ｅｕ−Ｎ１標識マウスＩｇＧ抗体[Perkin Elmer社製、0.05μg/mL 0.1% BSA含有リン酸バッファー（1mM KH₂PO₄、3mM Na2HPO 7H2O、154mM NaCl pH7.4）溶液]を各ウェルに１００μLの割合で添加後、１時間室温で放置した。その後、溶液をデカンテーションにて取り除き、各ウェルを洗浄バッファー[0.05% Tween20含有リン酸バッファー（1mM KH₂PO₄、3mM Na2HPO 7H2O、154mM NaCl pH7.4）]２００μLで３回洗浄した。

Enhancement Solution（Perkin Elmer社製）を各ウェルに１５０μLの割合で添加、混合し、約４５分間室温で放置した。その後、励起３４０nm／蛍光６１２nmで蛍光を測定した（以上、本発明測定方法の第三工程に相当する）。

その結果を図４２に示した。メチル化されたＤＮＡフラグメントＭＳの溶液ＭＡ、ＭＢ及びＭＣでは、蛍光強度の増加が確認され、その強度は濃度依存的であった。ネガティブコントロール溶液ＭＤでは、蛍光強度の増加が確認されなかった。メチル化されていないＤＮＡフラグメントＳの溶液Ａ、Ｂ、Ｃ及びＤでは、蛍光強度の増加が確認されなかった。

以上より、ビオチン化オリゴヌクレオチド及びメチルシトシン抗体で、メチル化された目的とするＤＮＡ領域を含むＤＮＡを選択し固定化することが可能であること、また、メチル化されたＤＮＡを高感度に検出・定量できることが確認された。

実施例２０

パン酵母酵母株Ｘ２１８０−１ＡをＹＰＤ培地（1% Yeast extract、2% Peptone、2% Glucose, pH 5.6-6.0）で、濁度がOD₆₀₀ 0.6-1.0 になるまで培養し、10,000g で10分間遠心して、1ｘ10⁷の酵母細胞を調製した。調製した酵母細胞から、Methods in Yeast Genetics(Cold Spring Harbor Laboratory)に記載されているような、一般的な酵母ゲノムの調製法を用いて酵母ゲノムを取得した。
調製した酵母細胞を、バッファーＡ（1M ソルビトール、 0.1M EDTA、pH 7.4）に懸濁し、2-メルカプトエタノール（終濃度14mM）及び100U zymolase（10 mg/ml）を添加して、溶液が透明になるまで 30°C で１時間、撹拌しながらインキュベートした。550gで10分間遠心してプロトプラストを回収後、バッファーＢ（50 mM Tris-HCl、pH 7.4、 20 mM EDTA）に懸濁してから、ドデシル硫酸ナトリウムを１％（ｗ／ｖ）になるように加えた後、65℃で30分間インキュベートした。続いて、体積比2/5量の5M CH₃COOKを添加して混和してから30分間氷冷後、15,000gで30分間遠心して上清を回収した。回収した上清に体積比1/10量の3M CH3COONaと等量のイソプロパノ−ルを加えてよく混和し、15,000g ４℃で30分間遠心して得られた沈澱を７０％エタノールでリンスして回収した。沈澱を乾燥させてから、１ｍl のTEバッファー（10 mM Tris-HCl、pH 8.0、1 mM EDTA）に溶解し、40μg/mlになるようにＲＮａｓｅＡ（Sigma社製）を加えて３７℃で１時間インキュベートし、続いて、混合液にproteinase K（Sigma社製）を５００μｇ／ｍｌ及びドデシル硫酸ナトリウムを１％（ｗ／ｖ）になるように加えた後、これを５５℃で約１６時間振とうした。振とう終了後、当該混合物をフェノール[1M Tris-HCl（pH 8.0）にて飽和]・クロロホルム抽出処理した。水層を回収し、これにＮａＣｌを０．５Ｎとなるよう加えた後、これをエタノール沈澱処理して生じた沈澱を回収した。回収された沈澱を７０％エタノールでリンスすることにより、ゲノムＤＮＡを得た。
得られたゲノムＤＮＡから、以下の配列番号１５７及び配列番号１５８で示されるＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー（ＰＦ４及びＰＲ４）及び反応条件を用いてＰＣＲを行うことにより、供試サンプルとして用いられるＤＮＡフラグメント（Ｔ、配列番号１５９、Genbank Accession No. NC_001139等に示される酵母染色体VIIの塩基番号384569-384685に相当する領域）を増幅した。

＜ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー＞
ＰＦ４：5’- GGACCTGTGTTTGACGGGTAT -3’ （配列番号１５７）
ＰＲ４：5’- AGTACAGATCTGGCGTTCTCG -3’ （配列番号１５８）

＜DNAフラグメント＞
Ｔ：5’- GGACCTGTGTTTGACGGGTATAACACTAAGTTGCGCAATTTGCTGTATTGCGAAATCCGCCCGGACGATATCACTCTTGAGCGCATGTGCCGTTTCCGAGAACGCCAGATCTGTACT -3’（配列番号１５９）

ＰＣＲの反応液としては、鋳型とするゲノムＤＮＡを10ｎｇと、5μＭに調製されたオリゴヌクレオチドプライマー溶液各３μｌと、each ２ｍＭｄＮＴＰを５μlと、１０×緩衝液(100mM Tris-HCl pH 8.3、500mM KCl、15mM MgCl₂、0.01％ Gelatin)を５μｌと、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ（AmpliTaq Gold、ＡＢＩ社製）5U/μlを０．２５μｌとを混合し、これに滅菌超純水を加えて液量を５０μｌとしたものを用いた。当該反応液を、９５℃にて１０分間保温した後、９５℃にて２０秒間次いで５８℃にて３０秒間更に７２℃にて３０秒間を１サイクルとする保温を４０サイクル行う条件でＰＣＲを行った。
ＰＣＲを行った後、１．５％アガロースゲル電気泳動により増幅を確認し、Wizard SV Gel/PCR Kit（PROMEGA社）により、ＤＮＡフラグメントＴを精製した。

得られたＤＮＡフラグメント溶液の一部について、SssI methylase (NEB社製)を１μｌと、１０ｘNEBuffer２(NEB社製)を１０μlと、S-adenosyl methionine (3.2 mM, NEB社製)を１μｌとを混合し、これに滅菌超純水を加えて液量を１００μｌとしたものを調製した。当該反応液を、37℃にて１５-３０分間インキュベーションし、さらにS-adenosyl methionine (3.2 mM, NEB社製)を１μｌを追加して37℃にて１５-３０分間インキュベーションした。これをWizard SV Gel/PCR Kit（PROMEGA社）により精製した。さらにこの操作を５回繰り返し、メチル化ＤＮＡフラグメント（ＭＴ、配列番号１６０）を得た。

＜メチル化ＤＮＡフラグメント＞（Ｎは5-メチルシトシンを示す）
ＭＴ：5’- GGACCTGTGTTTGANGGGTATAACACTAAGTTGNGCAATTTGCTGTATTGNGAAATCNGCCNGGANGATATCACTCTTGAGNGCATGTGCNGTTTCNGAGAANGCCAGATCTGTACT -3’（配列番号１６０）

得られたＤＮＡフラグメントＴについて、以下の溶液を調製した。
溶液Ａ：10ng/10μL TE溶液
溶液Ｂ：1ng/10μL TE溶液
溶液Ｃ：0.1ng/10μL TE溶液
溶液Ｄ：TE溶液（ネガティブコントロール液）

得られたＤＮＡフラグメントＭＴについて、以下の溶液を調製した。
溶液ＭＡ：10ng/10μL TE溶液
溶液ＭＢ：1ng/10μL TE溶液
溶液ＭＣ：0.1ng/10μL TE溶液
溶液ＭＤ：TE溶液（ネガティブコントロール液）

また、配列番号１６１で示される塩基配列からなる目的とするＤＮＡ領域Ｔ’に相補性により結合可能な配列番号１６２で示される塩基配列からなる５’末端ビオチン標識オリゴヌクレオチドＢ４を合成し、その濃度が０．０２μＭであるＴＥバッファー溶液を調製した。

＜目的とするＤＮＡ領域＞
Ｔ’：5’- GGACCTGTGTTTGACGGGTATAACACTAAGTTGCGCAATTTGCTGTATTGCGAAATCCGCCCGGACGATATCACTCTTGAGCGCATGTGCCGTTTCCGAGAACGCCAGATCTGTACT -3’ （配列番号１６１）

＜５’末端ビオチン標識オリゴヌクレオチド＞
Ｂ４：5’Biotin- AGTACAGATCTGGCGTTCTCG -3’ （配列番号１６２）

また、配列番号１６１で示される塩基配列からなる目的とするＤＮＡ領域Ｔ’の負鎖に相補性により結合可能な配列番号１６３、配列番号１６４、配列番号１６５、及び配列番号１６６で示される塩基配列からなるカウンターオリゴヌクレオチドＣ２６、Ｃ２７、Ｃ２８、及びＣ２９を合成し、夫々の濃度が０．０１μＭであるＴＥバッファー溶液を調製した。

＜目的とするＤＮＡ領域＞
Ｔ’：5’- GGACCTGTGTTTGACGGGTATAACACTAAGTTGCGCAATTTGCTGTATTGCGAAATCCGCCCGGACGATATCACTCTTGAGCGCATGTGCCGTTTCCGAGAACGCCAGATCTGTACT -3’（配列番号１６１）

＜カウンターオリゴヌクレオチド＞
Ｃ２６：5’- GGACCTGTGTTTGACGGGTAT -3’ （配列番号１６３）
Ｃ２７：5’- AACACTAAGTTGCGCAATTTGCTGT -3’ （配列番号１６４）
Ｃ２８：5’- ATTGCGAAATCCGCCCGGACGATAT -3’ （配列番号１６５）
Ｃ２９：5’- CACTCTTGAGCGCATGTGCCGTTTC -3’ （配列番号１６６）

前記のＤＮＡフラグメントＴの溶液及びメチル化したＤＮＡフラグメントＭＴの溶液の夫々について、以下の処理を施した。

配列番号１６２で示される塩基配列からなる５’末端ビオチン標識オリゴヌクレオチドＢ４に相補性により結合可能な配列番号１６７で示される塩基配列からなるマスキング用オリゴヌクレオチドＭ４を合成し、その濃度が０．０２μＭであるＴＥバッファー溶液を調製した。

＜マスキング用オリゴヌクレオチド＞
Ｍ４：5’- CGAGAACGCCAGATCTGTACT -3’ （配列番号１６７）

その結果を図４３に示した。メチル化されたＤＮＡフラグメントＭＴの溶液ＭＡ、ＭＢ及びＭＣでは、蛍光強度の増加が確認され、その強度は濃度依存的であった。ネガティブコントロール溶液ＭＤでは、蛍光強度の増加が確認されなかった。メチル化されていないＤＮＡフラグメントＴの溶液Ａ、Ｂ、Ｃ及びＤでは、蛍光強度の増加が確認されなかった。

以上より、ビオチン化オリゴヌクレオチド及びメチルシトシン抗体で、メチル化された目的とするＤＮＡ領域Ｔ’を含むＤＮＡを選択し固定化することが可能であること、また、メチル化されたＤＮＡを高感度に検出・定量できることが確認された。

実施例２１

市販のメチルシトシン抗体（Aviva Systems Biology社製）を、市販ビオチン化キット（Biotin Labeling Kit-NH₂、同仁化学研究所製）を用いて、カタログに記載された方法に準じて、ビオチン標識した。得られたビオチン標識メチルシトシン抗体を溶液[抗体約0.1μg/100μL 0.1% BSA含有リン酸バッファー（1mM KH₂PO₄、3mM Na2HPO 7H2O、154mM NaCl pH7.4）溶液]として冷蔵保存した。

合成して得られたビオチン標識メチルシトシン抗体の0.5μg/mL溶液を調製し、これを各１００μLの割合でストレプトアビジン被覆済み８ウェルストリップ（Perkin Elmer社製）に添加し、約１時間室温で放置してウェルに固定化した。その後、溶液をピペッティングにより取り除き、２００μＬの洗浄バッファー[0.05% Tween20含有リン酸バッファー（1mM KH₂PO₄、3mM Na2HPO 7H2O、154mM NaCl pH7.4）]を添加した後、当該バッファーをデカンテーションにより取り除いた。この操作をさらに２回繰り返した（以上、本発明測定方法で使用する固定化メチル化ＤＮＡ抗体の調製に相当する）。

得られたＤＮＡフラグメントＸについて、以下の溶液を調製した。
溶液Ａ：10ng/10μL TE溶液
溶液Ｂ：1ng/10μL TE溶液
溶液Ｃ：0.1ng/10μL TE溶液
溶液Ｄ：TE溶液（ネガティブコントロール液）

得られたＤＮＡフラグメントＭＸについて、以下の溶液を調製した。
溶液ＭＡ：10ng/10μL TE溶液
溶液ＭＢ：1ng/10μL TE溶液
溶液ＭＣ：0.1ng/10μL TE溶液
溶液ＭＤ：TE溶液（ネガティブコントロール液）

また、配列番号１１５で示される塩基配列からなる目的とするＤＮＡ領域Ｘ’に相補性により結合可能な配列番号１６８で示される塩基配列からなる５’末端ＦＩＴＣ標識オリゴヌクレオチドＦ１を合成し、その濃度が０．０２μＭである１０ｍＭのＴｒｉｓ-ＨＣｌバッファー溶液を調製した。

＜５’末端ＦＩＴＣ標識オリゴヌクレオチド＞
Ｆ１：5’ＦＩＴＣ- CTGGCCAAACTGGAGATCGC -3’ （配列番号１６８）

ＰＣＲチューブに、前記で調製したＤＮＡフラグメント溶液１０μLと、前記で調製した５’末端ＦＩＴＣ標識オリゴヌクレオチド溶液１０μLと、前記で調製したカウンターオリゴヌクレオチド溶液１０μLと、緩衝液（330mM Tris-Acetate pH 7.9、660mM KOAc、100mM MgOAc₂、5mM Dithiothreitol）１０μＬと、100ｍＭのＭｇＣｌ_２溶液１０μＬと、1ｍｇ/ｍＬのＢＳＡ溶液１０μＬを添加し、さらに当該混合物に滅菌超純水を加えて液量を１００μＬとし、混合した。その後、本ＰＣＲチューブを９５℃で１０分間加熱し、７０℃まで速やかに冷却し、その温度で１０分間保温した。次いで、５０℃まで冷却し１０分間保温し、さらに３７℃で１０分間保温した後、室温に戻した（以上、本発明測定方法の第一工程に相当する）。

前記のビオチン標識メチルシトシン抗体が固定化されたストレプトアビジン被覆済み８ウェルストリップに、前記で調製したＤＮＡフラグメントの反応液１００μLを加え、室温で１時間放置した。その後、溶液をピペッティングにより取り除き、２００μＬの洗浄バッファー[0.05% Tween20含有リン酸バッファー（1mM KH₂PO₄、3mM Na2HPO 7H2O、154mM NaCl pH7.4）]を添加した後、当該バッファーをピペッティングにより取り除いた。この操作をさらに２回繰り返した（以上、本発明測定方法の第二工程に相当する）。

その後、ＨＲＰ標識ＦＩＴＣ抗体溶液[Jackson ImmunoResearch Laboratories社製、0.005μg/100μL 0.1% BSA含有リン酸バッファー（1mM KH₂PO₄、3mM Na2HPO 7H2O、154mM NaCl pH7.4）溶液]を各ウェルに１００μLの割合で添加後、１時間室温で放置した。放置後、各ウェルを２００μＬの洗浄バッファー[0.05% Tween20含有リン酸バッファー（1mM KH₂PO₄、3mM Na2HPO 7H2O、154mM NaCl pH7.4）]を添加した後、当該バッファーをデカンテーションにより取り除いた。この操作をさらに２回繰り返した。

基質（R&D社製、#DY999）を、各ウェルに１００μLの割合で添加・混合し、反応を開始した。

約３０分間室温で放置し、ストップ溶液 (1N H₂SO₄水溶液)を各ウェルに５０μLの割合で添加し、反応を停止した。反応停止後３０分以内に４５０nmの吸光度を測定した。（以上、本発明測定方法の第三工程に相当する）

その結果を図４４に示した。メチル化されたＤＮＡフラグメントＭＸの溶液ＭＡ、ＭＢ及びＭＣでは、発色強度の増加が確認され、その強度は濃度依存的であった。ネガティブコントロール溶液ＭＤでは、発色強度の増加が確認されなかった。メチル化されていないＤＮＡフラグメントＸの溶液Ａ、Ｂ、Ｃ及びＤでは、発色強度の増加が確認されなかった。

以上より、固定化したメチルシトシン抗体で、メチル化された目的とするＤＮＡ領域を含むＤＮＡを選択することが可能であること、また、メチル化されたＤＮＡを高感度に検出・定量できることが確認された。

実施例２２
市販のメチルシトシン抗体（Aviva Systems Biology社製）を、市販ビオチン化キット（Biotin Labeling Kit-NH₂、同仁化学研究所製）を用いて、カタログに記載された方法に準じて、ビオチン標識した。得られたビオチン標識メチルシトシン抗体を溶液[抗体約0.1μg/100μL 0.1% BSA含有リン酸バッファー（1mM KH₂PO₄、3mM Na2HPO 7H2O、154mM NaCl pH7.4）溶液]として冷蔵保存した。

得られたＤＮＡフラグメント溶液の一部について、SssI methylase (NEB社製)を１μｌと、１０ｘNEBuffer２(NEB社製)を１０μlと、S-adenosyl methionine (3.2 mM, NEB社製)を１μｌとを混合し、これに滅菌超純水を加えて液量を１００μｌとしたものを調製した。当該反応液を、37℃にて１５-３０分間インキュベーションし、さらにS-adenosyl methionine (3.2 mM, NEB社製)を１μｌを追加して37℃にて１５-３０分間インキュベーションした。これをWizard SV Gel/PCR Kit（PROMEGA社）により精製した。さらにこの操作を５回繰り返し、メチル化したＤＮＡフラグメント（ＭＳ、配列番号１４３）を得た。

＜ＤＮＡフラグメント＞（Ｎは5-メチルシトシンを示す）
ＭＳ：5’- AGGTGAGCTANGTGTGTTTGGGNGTNGTGCACTGGCTCACTTGTANGNGCAGAAATGGCAGCTTGTANGATTGGTGACCNGCCTTTTNGACACTGGACNGCTATGGANGTGGNGGNGGTGTGGNGGNGGCTCAATGACCTGTGGNGCCNGTTTGTGGNGTGNGATAGTNGAGCNGCCTGTCANGTGNGNGGCNGCCCTGCTCNGTTTGANGNGATGCATAGCATGNGACCACCCAGTAATCATACTGCTGANGCTATTGGTCANGTGGTTATGGCAGCTGCTGTTGACTGNGGTGGNGTCCNGTTTCCACACNGTANGTGAGCACATGTCT -3’（配列番号１４３）

また、配列番号１４４で示される塩基配列からなる目的とするＤＮＡ領域Ｓ’に相補性により結合可能な配列番号１６９で示される塩基配列からなる５’末端ＦＩＴＣ標識オリゴヌクレオチドＦ２を合成し、その濃度が０．０２μＭである１０ｍＭのＴｒｉｓ-ＨＣｌバッファー溶液を調製した。

＜５’末端ＦＩＴＣ標識オリゴヌクレオチド＞
Ｆ２：5’ＦＩＴＣ- AGACATGTGCTCACGTACGGT -3’ （配列番号１６９）

約１５分間室温で放置し、ストップ溶液 (1N H₂SO₄水溶液)を各ウェルに５０μLの割合で添加し、反応を停止した。反応停止後３０分以内に４５０nmの吸光度を測定した。（以上、本発明測定方法の第三工程に相当する）

その結果を図４５に示した。メチル化されたＤＮＡフラグメントＭＳの溶液ＭＡ、ＭＢ及びＭＣでは、発色強度の増加が確認され、その強度は濃度依存的であった。ネガティブコントロール溶液ＭＤでは、発色強度の増加が確認されなかった。メチル化されていないＤＮＡフラグメントＳの溶液Ａ、Ｂ、Ｃ及びＤでは、発色強度の増加が確認されなかった。

実施例２３
市販のメチルシトシン抗体（Aviva Systems Biology社製）を、市販ビオチン化キット（Biotin Labeling Kit-NH2、同仁化学研究所製）を用いて、カタログに記載された方法に準じて、ビオチン標識した。得られたビオチン標識メチルシトシン抗体を溶液[抗体約0.1μg/100μL 0.1% BSA含有リン酸バッファー（1mM KH₂PO₄、3mM Na2HPO 7H2O、154mM NaCl pH7.4）溶液]として冷蔵保存した。

パン酵母酵母株Ｘ２１８０−１ＡをＹＰＤ培地（1% Yeast extract、2% Peptone、2% Glucose, pH 5.6-6.0）で、濁度がOD₆₀₀ 0.6-1.0 になるまで培養し、10,000g で10分間遠心して、1ｘ10⁷の酵母細胞を調製した。調製した酵母細胞から、Methods in Yeast Genetics(Cold Spring Harbor Laboratory)に記載されているような、一般的な酵母ゲノムの調製法を用いて酵母ゲノムを取得した。
調製した酵母細胞を、バッファーＡ（1M ソルビトール、 0.1M EDTA、pH 7.4）に懸濁し、2-メルカプトエタノール（終濃度14mM）及び100U zymolase（10 mg/ml）を添加して、溶液が透明になるまで 30°C で１時間、撹拌しながらインキュベートした。550gで10分間遠心してプロトプラストを回収後、バッファーＢ（50 mM Tris-HCl、pH 7.4、 20 mM EDTA）に懸濁してから、ドデシル硫酸ナトリウムを１％（ｗ／ｖ）になるように加えた後、65℃で30分間インキュベートした。続いて、体積比2/5量の5M CH₃COOKを添加して混和してから30分間氷冷後、15,000gで30分間遠心して上清を回収した。回収した上清に体積比1/10量の3M CH3COONaと等量のイソプロパノ−ルを加えてよく混和し、15,000g ４℃で30分間遠心して得られた沈澱を７０％エタノールでリンスして回収した。沈澱を乾燥させてから、１ｍl のTEバッファー（10 mM Tris-HCl、pH 8.0、1 mM EDTA）に溶解し、40μg/mlになるようにＲＮａｓｅＡ（Sigma社製）を加えて３７℃で１時間インキュベートし、続いて、混合液にproteinase K（Sigma社製）を５００μｇ／ｍｌ及びドデシル硫酸ナトリウムを１％（ｗ／ｖ）になるように加えた後、これを５５℃で約１６時間振とうした。振とう終了後、当該混合物をフェノール[1M Tris-HCl（pH 8.0）にて飽和］・クロロホルム抽出処理した。水層を回収し、これにＮａＣｌを０．５Ｎとなるよう加えた後、これをエタノール沈澱処理して生じた沈澱を回収した。回収された沈澱を７０％エタノールでリンスすることにより、ゲノムＤＮＡを得た。
得られたゲノムＤＮＡから、以下の配列番号１５７及び配列番号１５８で示されるＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー（ＰＦ４及びＰＲ４）及び反応条件を用いてＰＣＲを行うことにより、供試サンプルとして用いられるＤＮＡフラグメント（Ｔ、配列番号１５９、Genbank Accession No. NC_001139等に示される酵母染色体VIIの塩基番号384569-384685に相当する領域）を増幅した。

得られたＤＮＡフラグメント溶液の一部について、SssI methylase (NEB社製)を１μｌと、１０ｘNEBuffer２(NEB社製)を１０μlと、S-adenosyl methionine (3.2 mM, NEB社製)を１μｌとを混合し、これに滅菌超純水を加えて液量を１００μｌとしたものを調製した。当該反応液を、37℃にて１５-３０分間インキュベーションし、さらにS-adenosyl methionine (3.2 mM, NEB社製)を１μｌを追加して37℃にて１５-３０分間インキュベーションした。これをWizard SV Gel/PCR Kit（PROMEGA社）により精製した。さらにこの操作を５回繰り返し、メチル化したＤＮＡフラグメント（ＭＴ、配列番号１６０）を得た。

＜ＤＮＡフラグメント＞（Ｎは5-メチルシトシンを示す）
ＭＴ：5’- GGACCTGTGTTTGANGGGTATAACACTAAGTTGNGCAATTTGCTGTATTGNGAAATCNGCCNGGANGATATCACTCTTGAGNGCATGTGCNGTTTCNGAGAANGCCAGATCTGTACT -3’（配列番号１６０）

得られたＤＮＡフラグメントＴについて、以下の溶液を夫々２連で調製した。
溶液Ａ：10ng/10μL TE溶液
溶液Ｂ：1ng/10μL TE溶液
溶液Ｃ：0.1ng/10μL TE溶液
溶液Ｄ：TE溶液（ネガティブコントロール液）

得られたＤＮＡフラグメントＭＴについて、以下の溶液を夫々２連で調製した。
溶液ＭＡ：10ng/10μL TE溶液
溶液ＭＢ：1ng/10μL TE溶液
溶液ＭＣ：0.1ng/10μL TE溶液
溶液ＭＤ：TE溶液（ネガティブコントロール液）

また、配列番号１６１で示される塩基配列からなる目的とするＤＮＡ領域Ｔ’に相補性により結合可能な配列番号１７０で示される塩基配列からなる５’末端ＦＩＴＣ標識オリゴヌクレオチドＦ３を合成し、その濃度が０．０２μＭである１０ｍＭのＴｒｉｓ-ＨＣｌバッファー溶液を調製した。

＜５’末端ＦＩＴＣ標識オリゴヌクレオチド＞
Ｆ３：5’ＦＩＴＣ- AGTACAGATCTGGCGTTCTCG -3’ （配列番号１７０）

ＰＣＲチューブに、前記で調製したＤＮＡフラグメント溶液１０μLと、前記で調製したＦＩＴＣ標識オリゴヌクレオチド溶液１０μLと、前記で調製したカウンターオリゴヌクレオチド溶液１０μLと、緩衝液（330mM Tris-Acetate pH 7.9、660mM KOAc、100mM MgOAc₂、5mM Dithiothreitol）１０μＬと、100ｍＭのＭｇＣｌ_２溶液１０μＬと、1ｍｇ/ｍＬのＢＳＡ溶液１０μＬを添加し、さらに当該混合物に滅菌超純水を加えて液量を１００μＬとし、混合した。その後、本ＰＣＲチューブを９５℃で１０分間加熱し、７０℃まで速やかに冷却し、その温度で１０分間保温した。次いで、５０℃まで冷却し１０分間保温し、さらに３７℃で１０分間保温した後、室温に戻した（以上、本発明測定方法の第一工程に相当する）。

約１時間室温で放置し、ストップ溶液 (1N H₂SO₄水溶液)を各ウェルに５０μLの割合で添加し、反応を停止した。反応停止後３０分以内に４５０nmの吸光度を測定した。（以上、本発明測定方法の第三工程に相当する）

その結果を図４６に示した。メチル化されたＤＮＡフラグメントＭＴの溶液ＭＡ、ＭＢ及びＭＣでは、発色強度の増加が確認され、その強度は濃度依存的であった。ネガティブコントロール溶液ＭＤでは、発色強度の増加が確認されなかった。メチル化されていないＤＮＡフラグメントＴの溶液Ａ、Ｂ、Ｃ及びＤでは、発色強度の増加が確認されなかった。

以上より、目的とするＤＮＡ領域を含む一本鎖ＤＮＡと、本オリゴヌクレオチドとの結合体を形成させる際には、マグネシウムイオンを含有する反応系を用いるのが好ましいことが確認された。また、以上より、固定化したメチルシトシン抗体で、メチル化された目的とするＤＮＡ領域を含むＤＮＡを選択することが可能であること、また、メチル化されたＤＮＡを高感度に検出・定量できることが確認された。

図１は、実施例１において、メチルシトシン抗体１ μｇ/ｍＬを用いて実施した結果を示した図である。溶液Ａ(2.5 pmol/100 μL TEバッファー溶液)、溶液Ｂ (0.25 pmol/100 μL TEバッファー溶液)、溶液Ｃ(0.025 pmol/100 μL TEバッファー溶液)、溶液Ｄ(0.0025 pmol/100 μL TEバッファー溶液)、溶液Ｅ(0.00025 pmol/100 μL TEバッファー溶液)、溶液Ｆ (0 pmol/100 μL TEバッファー溶液(ネガティブコントロール液))のそれぞれについて、左から順に、メチル化オリゴヌクレオチドの残存量、アンメチル化オリゴヌクレオチドの残存量、を吸光度（４５０ｎｍ）で測定した値を示している。図２は、実施例１において、メチルシトシン抗体１０ μｇ/ｍＬを用いて実施した結果を示した図である。溶液Ａ(2.5 pmol/100 μL TEバッファー溶液)、溶液Ｂ (0.25 pmol/100 μL TEバッファー溶液)、溶液Ｃ(0.025 pmol/100 μL TEバッファー溶液)、溶液Ｄ(0.0025 pmol/100 μL TEバッファー溶液)、溶液Ｅ(0.00025 pmol/100 μL TEバッファー溶液)、溶液Ｆ (0 pmol/100 μL TEバッファー溶液(ネガティブコントロール液))のそれぞれについて、左から順に、メチル化オリゴヌクレオチドの残存量、アンメチル化オリゴヌクレオチドの残存量、を吸光度（４５０ｎｍ）で測定した値を示している。図３は、実施例２の結果を示した図である。溶液Ａ(0.1 pmol/100 μL TEバッファー溶液)、溶液Ｂ(0.01 pmol/100 μL TEバッファー溶液)、溶液Ｃ (0.001 pmol/100 μL TEバッファー溶液)、溶液Ｄ (0 pmol/100 μL TEバッファー溶液(ネガティブコントロール液))のそれぞれについて、左から順に、配列番号２５で示される塩基配列からなるメチル化オリゴヌクレオチドＵＢＣ−Ｍ８の残存量（複合体の形成量）、配列番号２６で示される塩基配列からなるアンメチル化オリゴヌクレオチドＵＢＣ−ＵＭ８の残存量（複合体の形成量）、を蛍光（６１２ｎｍ）で測定した値を示している。図４は、実施例３におけるＡ群（無処理群）についての結果を示した図である。溶液Ａ(0.1 pmol/100 μL TEバッファー溶液)、溶液Ｂ(0.01 pmol/100 μL TEバッファー溶液)、溶液Ｃ(0.001 pmol/100 μL TEバッファー溶液)、溶液Ｄ (0 pmol/100 μL TEバッファー溶液(ネガティブコントロール液))のそれぞれについて、左から順に、配列番号２８で示される塩基配列からなるメチル化オリゴヌクレオチドＵＢＣ−Ｍの残存量（複合体形成量）、配列番号２９で示される塩基配列からなる部分メチル化オリゴヌクレオチドＵＢＣ−ＨＭの残存量（複合体形成量）、及び、配列番号３０で示される塩基配列からなるアンメチル化オリゴヌクレオチドＵＢＣ−ＵＭの残存量（複合体形成量）を、蛍光（６１２ｎｍ）で測定した値を示している。図５は、実施例３におけるＢ群（Ｈｈａ処理群）についての結果を示した図である。溶液Ａ(0.1 pmol/100 μL TEバッファー溶液)、溶液Ｂ(0.01 pmol/100 μL TEバッファー溶液)、溶液Ｃ(0.001 pmol/100 μL TEバッファー溶液)、溶液Ｄ (0 pmol/100 μL TEバッファー溶液(ネガティブコントロール液))のそれぞれについて、左から順に、配列番号２８で示される塩基配列からなるメチル化オリゴヌクレオチドＵＢＣ−Ｍの残存量（複合体形成量）、配列番号２９で示される塩基配列からなる部分メチル化オリゴヌクレオチドＵＢＣ−ＨＭの残存量（複合体形成量）、及び、配列番号３０で示される塩基配列からなるアンメチル化オリゴヌクレオチドＵＢＣ−ＵＭの残存量（複合体形成量）を、蛍光（６１２ｎｍ）で測定した値を示している。図６は、実施例４におけるＡ群（無処理群）についての結果を示した図である。溶液Ａ(0.1 pmol/100 μL TEバッファー溶液)、溶液Ｂ(0.01 pmol/100 μL TEバッファー溶液)、溶液Ｃ(0.001 pmol/100 μL TEバッファー溶液)、溶液Ｄ (0 pmol/100 μL TEバッファー溶液(ネガティブコントロール液))のそれぞれについて、左から順に、配列番号３３で示される塩基配列からなるメチル化オリゴヌクレオチドＵＢＣ８６−Ｍの残存量（複合体形成量）、及び、配列番号３４で示される塩基配列からなる部分メチル化オリゴヌクレオチドＵＢＣ１１８−ＨＭの残存量（複合体形成量）を、蛍光（６１２ｎｍ）で測定した値を示している。図７は、実施例４におけるＢ群（ＨｈａＩ処理群）についての結果を示した図である。溶液Ａ(0.1 pmol/100 μL TEバッファー溶液)、溶液Ｂ(0.01 pmol/100 μL TEバッファー溶液)、溶液Ｃ(0.001 pmol/100 μL TEバッファー溶液)、溶液Ｄ (0 pmol/100 μL TEバッファー溶液(ネガティブコントロール液))のそれぞれについて、左から順に、配列番号３３で示される塩基配列からなるメチル化オリゴヌクレオチドＵＢＣ８６−Ｍの残存量（複合体形成量）、及び、配列番号３４で示される塩基配列からなる部分メチル化オリゴヌクレオチドＵＢＣ１１８−ＨＭの残存量（複合体形成量）を、蛍光（６１２ｎｍ）で測定した値を示している。図８は、実施例５における、配列番号４３で示される塩基配列を有する５’末端ビオチン標識オリゴヌクレオチドＵＢＣを用いた実験についての結果を示した図である。溶液Ａ(0.1 pmol/100 μL TEバッファー溶液)、溶液Ｂ(0.01 pmol/100 μL TEバッファー溶液)、溶液Ｃ(0.001 pmol/100 μL TEバッファー溶液)、溶液Ｄ (0 pmol/100 μL TEバッファー溶液(ネガティブコントロール液))のそれぞれについて、左から順に、メチル化オリゴヌクレオチド混合溶液での複合体形成量、アンメチル化オリゴヌクレオチド混合溶液での複合体形成量、を蛍光（６１２ｎｍ）で測定した値を示している。図９は、実施例５における、配列番号４４で示される塩基配列を有する５’末端ビオチン標識オリゴヌクレオチドＦＢＮを用いた実験についての結果を示した図である。溶液Ａ(0.1 pmol/100 μL TEバッファー溶液)、溶液Ｂ(0.01 pmol/100 μL TEバッファー溶液)、溶液Ｃ(0.001 pmol/100 μL TEバッファー溶液)、溶液Ｄ (0 pmol/100 μL TEバッファー溶液(ネガティブコントロール液))のそれぞれについて、左から順に、メチル化オリゴヌクレオチド混合溶液での複合体形成量、アンメチル化オリゴヌクレオチド混合溶液での複合体形成量、を蛍光（６１２ｎｍ）で測定した値を示している。図１０は、実施例５における、配列番号４５で示される塩基配列を有する５’末端ビオチン標識オリゴヌクレオチドＧＰＲを用いた実験についての結果を示した図である。溶液Ａ(0.1 pmol/100 μL TEバッファー溶液)、溶液Ｂ(0.01 pmol/100 μL TEバッファー溶液)、溶液Ｃ(0.001 pmol/100 μL TEバッファー溶液)、溶液Ｄ (0 pmol/100 μL TEバッファー溶液(ネガティブコントロール液))のそれぞれについて、左から順に、メチル化オリゴヌクレオチド混合溶液での複合体形成量、アンメチル化オリゴヌクレオチド混合溶液での複合体形成量、を蛍光（６１２ｎｍ）で測定した値を示している。図１１は、実施例５における、配列番号４３に示される塩基配列からなる５’末端ビオチン標識オリゴヌクレオチドＵＢＣ、配列番号４４に示される塩基配列からなる５’末端ビオチン標識オリゴヌクレオチドＦＢＮ、配列番号４５に示される塩基配列からなる５’末端ビオチン標識オリゴヌクレオチドＧＰＲの混合溶液を用いた実験についての結果を示した図である。溶液Ａ(0.1 pmol/100 μL TEバッファー溶液)、溶液Ｂ(0.01 pmol/100 μL TEバッファー溶液)、溶液Ｃ(0.001 pmol/100 μL TEバッファー溶液)、溶液Ｄ (0 pmol/100 μL TEバッファー溶液(ネガティブコントロール液))のそれぞれについて、左から順に、メチル化オリゴヌクレオチド混合溶液での複合体形成量、アンメチル化オリゴヌクレオチド混合溶液での複合体形成量、を蛍光（６１２ｎｍ）で測定した値を示している。図１２は、実施例６における、配列番号４６で示される塩基配列からなるメチル化オリゴヌクレオチドＵＢＣ−Ｍ８、及び、配列番号４９で示される塩基配列からなるアンメチル化オリゴヌクレオチドＵＢＣ−Ｕ８を用いた実験についての結果を示した図である。溶液Ａ(0.1 pmol/100 μL TEバッファー溶液)、溶液Ｂ(0.01 pmol/100 μL TEバッファー溶液)、溶液Ｃ(0.001 pmol/100 μL TEバッファー溶液)、溶液Ｄ (0 pmol/100 μL TEバッファー溶液(ネガティブコントロール液))のそれぞれについて、左から順に配列番号４６で示される塩基配列からなるメチル化オリゴヌクレオチドＵＢＣ−Ｍ８の残存量（複合体形成量）、配列番号４９で示される塩基配列からなるアンメチル化オリゴヌクレオチドＵＢＣ−Ｕ８の残存量（複合体形成量）を、吸光度（４５０ｎｍ）で測定した値を示している。図１３は、実施例６における、配列番号４７で示される塩基配列からなるメチル化オリゴヌクレオチドＧＰＲ-Ｍ８、及び、配列番号５０で示される塩基配列からなるアンメチル化オリゴヌクレオチドＧＰＲ−Ｕ８を用いた実験についての結果を示した図である。溶液Ａ(0.1 pmol/100 μL TEバッファー溶液)、溶液Ｂ(0.01 pmol/100 μL TEバッファー溶液)、溶液Ｃ(0.001 pmol/100 μL TEバッファー溶液)、溶液Ｄ (0 pmol/100 μL TEバッファー溶液(ネガティブコントロール液))のそれぞれについて、左から順に配列番号４７で示される塩基配列からなるメチル化オリゴヌクレオチドＧＰＲ−Ｍ８の残存量（複合体形成量）、配列番号５０で示される塩基配列からなるアンメチル化オリゴヌクレオチドＧＰＲ−Ｕ８の残存量（複合体形成量）を、吸光度（４５０ｎｍ）で測定した値を示している。図１４は、実施例６における、配列番号４８で示される塩基配列からなるメチル化オリゴヌクレオチドＦＢＮ−Ｍ８、及び、配列番号５１で示される塩基配列からなるアンメチル化オリゴヌクレオチドＦＢＮ−Ｕ８を用いた実験についての結果を示した図である。溶液Ａ(0.1 pmol/100 μL TEバッファー溶液)、溶液Ｂ(0.01 pmol/100 μL TEバッファー溶液)、溶液Ｃ(0.001 pmol/100 μL TEバッファー溶液)、溶液Ｄ (0 pmol/100 μL TEバッファー溶液(ネガティブコントロール液))のそれぞれについて、左から順に配列番号４８で示される塩基配列からなるメチル化オリゴヌクレオチドＦＢＮ−Ｍ８の残存量（複合体形成量）、配列番号５１で示される塩基配列からなるアンメチル化オリゴヌクレオチドＦＢＮ−Ｕ８の残存量（複合体形成量）を、吸光度（４５０ｎｍ）で測定した値を示している。図１５は、実施例７におけるＡ群（無処理群）の結果を示した図である。溶液Ａ(0.1 pmol/100 μL TEバッファー溶液)、溶液Ｂ(0.01 pmol/100 μL TEバッファー溶液)、溶液Ｃ(0.001 pmol/100 μL TEバッファー溶液)、溶液Ｄ (0 pmol/100 μL TEバッファー溶液(ネガティブコントロール液))のそれぞれについて、左から順に配列番号５５で示される塩基配列からなるメチル化オリゴヌクレオチドＵＢＣ−Ｍの残存量（複合体形成量）、配列番号５６で示される塩基配列からなる部分メチル化オリゴヌクレオチドＵＢＣ−ＨＭの残存量（複合体形成量）、及び、配列番号５７で示される塩基配列からなるアンメチル化オリゴヌクレオチドＵＢＣ−ＵＭの残存量（複合体形成量）を、吸光度（４５０ｎｍ）で測定した値を示している。図１６は、実施例７におけるＢ群（ＨｈａＩ処理群）の結果を示した図である。溶液Ａ(0.1 pmol/100 μL TEバッファー溶液)、溶液Ｂ(0.01 pmol/100 μL TEバッファー溶液)、溶液Ｃ(0.001 pmol/100 μL TEバッファー溶液)、溶液Ｄ (0 pmol/100 μL TEバッファー溶液(ネガティブコントロール液))のそれぞれについて、左から順に配列番号５５で示される塩基配列からなるメチル化オリゴヌクレオチドＵＢＣ−Ｍの残存量（複合体形成量）、配列番号５６で示される塩基配列からなる部分メチル化オリゴヌクレオチドＵＢＣ−ＨＭの残存量（複合体形成量）、及び、配列番号５７で示される塩基配列からなるアンメチル化オリゴヌクレオチドＵＢＣ−ＵＭの残存量（複合体形成量）を、吸光度（４５０ｎｍ）で測定した値を示している。図１７は、実施例８における、配列番号６２で示される塩基配列を有する５’末端をＦＩＴＣ標識したオリゴヌクレオチドＵＢＣを用いた実験についての結果を示した図である。溶液Ａ(0.1 pmol/100 μL TEバッファー溶液)、溶液Ｂ(0.01 pmol/100 μL TEバッファー溶液)、溶液Ｃ(0.001 pmol/100 μL TEバッファー溶液)、溶液Ｄ (0 pmol/100 μL TEバッファー溶液(ネガティブコントロール液))のそれぞれについて、左から順に配列番号６０で示される塩基配列からなるメチル化オリゴヌクレオチドＵＢＣ/ＧＰＲ/ＦＢＮ−Ｍの複合体形成量、及び、配列番号６１で示される塩基配列からなるアンメチル化オリゴヌクレオチドＵＢＣ/ＧＰＲ/ＦＢＮ−ＵＭの複合体形成量を、吸光度（４５０ｎｍ）で測定した値を示している。図１８は、実施例８における、配列番号６３で示される塩基配列を有する５’末端をＦＩＴＣ標識したオリゴヌクレオチドＧＰＲを用いた実験についての結果を示した図である。溶液Ａ(0.1 pmol/100 μL TEバッファー溶液)、溶液Ｂ(0.01 pmol/100 μL TEバッファー溶液)、溶液Ｃ(0.001 pmol/100 μL TEバッファー溶液)、溶液Ｄ (0 pmol/100 μL TEバッファー溶液(ネガティブコントロール液))のそれぞれについて、左から順に配列番号６０で示される塩基配列からなるメチル化オリゴヌクレオチドＵＢＣ/ＧＰＲ/ＦＢＮ−Ｍの複合体形成量、及び、配列番号６１で示される塩基配列からなるアンメチル化オリゴヌクレオチドＵＢＣ/ＧＰＲ/ＦＢＮ−ＵＭの複合体形成量を、吸光度（４５０ｎｍ）で測定した値を示している。図１９は、実施例８における、配列番号６４で示される塩基配列を有する５’末端をＦＩＴＣ標識したオリゴヌクレオチドＦＢＮを用いた実験についての結果を示した図である。溶液Ａ(0.1 pmol/100 μL TEバッファー溶液)、溶液Ｂ(0.01 pmol/100 μL TEバッファー溶液)、溶液Ｃ(0.001 pmol/100 μL TEバッファー溶液)、溶液Ｄ (0 pmol/100 μL TEバッファー溶液(ネガティブコントロール液))のそれぞれについて、左から順に配列番号６０で示される塩基配列からなるメチル化オリゴヌクレオチドＵＢＣ/ＧＰＲ/ＦＢＮ−Ｍの複合体形成量、及び、配列番号６１で示される塩基配列からなるアンメチル化オリゴヌクレオチドＵＢＣ/ＧＰＲ/ＦＢＮ−ＵＭの複合体形成量を、吸光度（４５０ｎｍ）で測定した値を示している。図２０は、実施例８における、配列番号６２で示される塩基配列を有する５’末端をＦＩＴＣ標識したオリゴヌクレオチドＵＢＣ、配列番号６３で示される塩基配列を有する５’末端をＦＩＴＣ標識したオリゴヌクレオチドＧＰＲ、配列番号６4で示される塩基配列を有する５’末端をＦＩＴＣ標識したオリゴヌクレオチドＦＢＮの混合溶液を用いた実験についての結果を示した図である。溶液Ａ(0.1 pmol/100 μL TEバッファー溶液)、溶液Ｂ(0.01 pmol/100 μL TEバッファー溶液)、溶液Ｃ(0.001 pmol/100 μL TEバッファー溶液)、溶液Ｄ (0 pmol/100 μL TEバッファー溶液(ネガティブコントロール液))のそれぞれについて、左から順に配列番号６０で示される塩基配列からなるメチル化オリゴヌクレオチドＵＢＣ/ＧＰＲ/ＦＢＮ−Ｍの複合体形成量、及び、配列番号６１で示される塩基配列からなるアンメチル化オリゴヌクレオチドＵＢＣ/ＧＰＲ/ＦＢＮ−ＵＭの複合体形成量を、吸光度（４５０ｎｍ）で測定した値を示している。図２１は、実施例９における、配列番号７１で示される塩基配列を有する５’末端をＦＩＴＣ標識したオリゴヌクレオチドＵＢＣを用いた実験についての結果を示した図である。溶液Ａ(0.1 pmol/100 μL TEバッファー溶液)、溶液Ｂ(0.01 pmol/100 μL TEバッファー溶液) 溶液Ｃ(0.001 pmol/100 μL TEバッファー溶液)、溶液Ｄ (0 pmol/100 μL TEバッファー溶液(ネガティブコントロール液))のそれぞれについて、左から順にメチル化オリゴヌクレオチド混合溶液Ｍ０での複合体形成量、アンメチル化オリゴヌクレオチド混合溶液Ｕ０での複合体形成量を、吸光度（４５０ｎｍ）で測定した値を示している。図２２は、実施例９における、配列番号７３で示される塩基配列を有する５’末端をＦＩＴＣ標識したオリゴヌクレオチドＦＢＮを用いた実験についての結果を示した図である。溶液Ａ(0.1 pmol/100 μL TEバッファー溶液)、溶液Ｂ(0.01 pmol/100 μL TEバッファー溶液) 溶液Ｃ(0.001 pmol/100 μL TEバッファー溶液)、溶液Ｄ (0 pmol/100 μL TEバッファー溶液(ネガティブコントロール液))のそれぞれについて、左から順にメチル化オリゴヌクレオチド混合溶液Ｍ０での複合体形成量、アンメチル化オリゴヌクレオチド混合溶液Ｕ０での複合体形成量を、吸光度（４５０ｎｍ）で測定した値を示している。図２３は、実施例９における、配列番号７２で示される塩基配列を有する５’末端をＦＩＴＣ標識したオリゴヌクレオチドＧＰＲを用いた実験についての結果を示した図である。溶液Ａ(0.1 pmol/100 μL TEバッファー溶液)、溶液Ｂ(0.01 pmol/100 μL TEバッファー溶液) 溶液Ｃ(0.001 pmol/100 μL TEバッファー溶液)、溶液Ｄ (0 pmol/100 μL TEバッファー溶液(ネガティブコントロール液))のそれぞれについて、左から順にメチル化オリゴヌクレオチド混合溶液Ｍ０での複合体形成量、アンメチル化オリゴヌクレオチド混合溶液Ｕ０での複合体形成量を、吸光度（４５０ｎｍ）で測定した値を示している。図２４は、実施例９における、配列番号７１で示される塩基配列を有する５’末端をＦＩＴＣ標識したオリゴヌクレオチドＵＢＣ、配列番号７２で示される塩基配列を有する５’末端をＦＩＴＣ標識したオリゴヌクレオチドＧＰＲ、配列番号７３で示される塩基配列を有する５’末端をＦＩＴＣ標識したオリゴヌクレオチドＦＢＮの混合溶液を用いた実験についての結果を示した図である。溶液Ａ(0.1 pmol/100 μL TEバッファー溶液)、溶液Ｂ(0.01 pmol/100 μL TEバッファー溶液) 溶液Ｃ(0.001 pmol/100 μL TEバッファー溶液)、溶液Ｄ (0 pmol/100 μL TEバッファー溶液(ネガティブコントロール液))のそれぞれについて、左から順にメチル化オリゴヌクレオチド混合溶液Ｍ０での複合体形成量、アンメチル化オリゴヌクレオチド混合溶液Ｕ０での複合体形成量を、吸光度（４５０ｎｍ）で測定した値を示している。図２５は、実施例１０の結果を示した図である。図の左から順に、配列番号７４で示される塩基配列からなるメチル化オリゴヌクレオチドＵＢＣ−Ｍ８の溶液を用いて実験し展開したクロマトストリップ（Ｍ）、配列番号７５で示される塩基配列からなるアンメチル化オリゴヌクレオチドＵＢＣ−Ｕ８の溶液を用いて実験し展開したクロマトストリップ (Ｕ)、ＴＥバッファー溶液を用いて実験し展開したクロマトストリップ(Ｏ)を示している。図２６は、実施例１１における、５’末端ＦＩＴＣ標識オリゴヌクレオチドとして、配列番号８４で示される塩基配列を有する５’末端ＦＩＴＣ標識オリゴヌクレオチドＵＢＣを用いた場合の結果を示した図である。図の左から順に、配列番号７８で示される塩基配列からなるメチル化オリゴヌクレオチドＵＢＣ−Ｍ８の溶液を用いて実験し展開したクロマトストリップ (Ｍ)、配列番号８１で示される塩基配列からなるアンメチル化オリゴヌクレオチドＵＢＣ−Ｕ８の溶液を用いて実験し展開したクロマトストリップ (Ｕ)、ＴＥバッファー溶液用いて実験し展開したクロマトストリップ (Ｏ)を示している。図２７は、実施例１１における、５’末端ＦＩＴＣ標識オリゴヌクレオチドとして、配列番号８５で示される塩基配列を有する５’末端ＦＩＴＣ標識オリゴヌクレオチドＦＢＮを用いた場合の結果を示した図である。図の左から順に、配列番号７９で示される塩基配列からなるメチル化オリゴヌクレオチドＦＢＮ−Ｍ８の溶液を用いて実験し展開したクロマトストリップ (Ｍ)、配列番号８２で示される塩基配列からなるアンメチル化オリゴヌクレオチドＦＢＮ−Ｕ８の溶液を用いて実験し展開したクロマトストリップ (Ｕ)、ＴＥバッファー溶液用いて実験し展開したクロマトストリップ (Ｏ)を示している。図２８は、実施例１１における、５’末端ＦＩＴＣ標識オリゴヌクレオチドとして、配列番号８６で示される塩基配列を有する５’末端ＦＩＴＣ標識オリゴヌクレオチドＧＰＲを用いた場合の結果を示した図である。図の左から順に、配列番号８０で示される塩基配列からなるメチル化オリゴヌクレオチドＧＰＲ−Ｍ８の溶液を用いて実験し展開したクロマトストリップ (Ｍ)、配列番号８３で示される塩基配列からなるアンメチル化オリゴヌクレオチドＧＰＲ−Ｕ８の溶液を用いて実験し展開したクロマトストリップ (Ｕ)、ＴＥバッファー溶液用いて実験し展開したクロマトストリップ (Ｏ)を示している。図２９は、実施例１２における、５’末端ＦＩＴＣ標識オリゴヌクレオチドとして、配列番号９４で示される塩基配列を有する５’末端ＦＩＴＣ標識オリゴヌクレオチドＵＢＣを用いた場合の結果を示した図である。図の左から順に、配列番号８８で示される塩基配列からなるメチル化オリゴヌクレオチドＵＢＣ−Ｍ８の溶液を用いて実験し展開したクロマトストリップ (Ｍ)、配列番号９１で示される塩基配列からなるアンメチル化オリゴヌクレオチドＵＢＣ−Ｕ８の溶液を用いて実験し展開したクロマトストリップ (Ｕ)、ＴＥバッファー溶液用いて実験し展開したクロマトストリップ (Ｏ)を示している。図３０は、実施例１２における、５’末端ＦＩＴＣ標識オリゴヌクレオチドとして、配列番号９５で示される塩基配列を有する５’末端ＦＩＴＣ標識オリゴヌクレオチドＦＢＮを用いた場合の結果を示した図である。図の左から順に、配列番号８９で示される塩基配列からなるメチル化オリゴヌクレオチドＦＢＮ−Ｍ８の溶液を用いて実験し展開したクロマトストリップ (Ｍ)、配列番号９２で示される塩基配列からなるアンメチル化オリゴヌクレオチドＦＢＮ−Ｕ８の溶液を用いて実験し展開したクロマトストリップ (Ｕ)、ＴＥバッファー溶液用いて実験し展開したクロマトストリップ (Ｏ)を示している。図３１は、実施例１２における、５’末端ＦＩＴＣ標識オリゴヌクレオチドとして、配列番号９６で示される塩基配列を有する５’末端ＦＩＴＣ標識オリゴヌクレオチドＧＰＲを用いた場合の結果を示した図である。図の左から順に、配列番号９０で示される塩基配列からなるメチル化オリゴヌクレオチドＧＰＲ−Ｍ８の溶液を用いて実験し展開したクロマトストリップ (Ｍ)、配列番号９３で示される塩基配列からなるアンメチル化オリゴヌクレオチドＧＰＲ−Ｕ８の溶液を用いて実験し展開したクロマトストリップ (Ｕ)、ＴＥバッファー溶液用いて実験し展開したクロマトストリップ (Ｏ)を示している。図３２は、実施例１３における、緩衝液１を用いた実験についての結果を示した図である。溶液Ａ(0.1 pmol/100 μL TEバッファー溶液)、溶液Ｂ(0.01 pmol/100 μL TEバッファー溶液)、溶液Ｃ(0.001 pmol/100 μL TEバッファー溶液)、溶液Ｄ (0 pmol/100 μL TEバッファー溶液(ネガティブコントロール液))のそれぞれについて、左から順に配列番号９８で示される塩基配列からなるメチル化オリゴヌクレオチドＦＢＮ−Ｍ８の残存量（複合体形成量）、及び、配列番号９９で示される塩基配列からなるアンメチル化オリゴヌクレオチドＦＢＮ−Ｕ８の残存量（複合体形成量）を、吸光度（４５０ｎｍ）で測定した値を示している。図３３は、実施例１３における、緩衝液２を用いた実験についての結果を示した図である。溶液Ａ(0.1 pmol/100 μL TEバッファー溶液)、溶液Ｂ(0.01 pmol/100 μL TEバッファー溶液)、溶液Ｃ(0.001 pmol/100 μL TEバッファー溶液)、溶液Ｄ (0 pmol/100 μL TEバッファー溶液(ネガティブコントロール液))のそれぞれについて、左から順に配列番号９８で示される塩基配列からなるメチル化オリゴヌクレオチドＦＢＮ−Ｍ８の残存量（複合体形成量）、及び、配列番号９９で示される塩基配列からなるアンメチル化オリゴヌクレオチドＦＢＮ−Ｕ８の残存量（複合体形成量）を、吸光度（４５０ｎｍ）で測定した値を示している。図３４は、実施例１３における、緩衝液３を用いた実験についての結果を示した図である。溶液Ａ(0.1 pmol/100 μL TEバッファー溶液)、溶液Ｂ(0.01 pmol/100 μL TEバッファー溶液)、溶液Ｃ(0.001 pmol/100 μL TEバッファー溶液)、溶液Ｄ (0 pmol/100 μL TEバッファー溶液(ネガティブコントロール液))のそれぞれについて、左から順に配列番号９８で示される塩基配列からなるメチル化オリゴヌクレオチドＦＢＮ−Ｍ８の残存量（複合体形成量）、及び、配列番号９９で示される塩基配列からなるアンメチル化オリゴヌクレオチドＦＢＮ−Ｕ８の残存量（複合体形成量）を、吸光度（４５０ｎｍ）で測定した値を示している。図３５は、実施例１３における、緩衝液４を用いた実験についての結果を示した図である。溶液Ａ(0.1 pmol/100 μL TEバッファー溶液)、溶液Ｂ(0.01 pmol/100 μL TEバッファー溶液)、溶液Ｃ(0.001 pmol/100 μL TEバッファー溶液)、溶液Ｄ (0 pmol/100 μL TEバッファー溶液(ネガティブコントロール液))のそれぞれについて、左から順に配列番号９８で示される塩基配列からなるメチル化オリゴヌクレオチドＦＢＮ−Ｍ８の残存量（複合体形成量）、及び、配列番号９９で示される塩基配列からなるアンメチル化オリゴヌクレオチドＦＢＮ−Ｕ８の残存量（複合体形成量）を、吸光度（４５０ｎｍ）で測定した値を示している。図３６は、実施例１３における、緩衝液５を用いた実験についての結果を示した図である。溶液Ａ(0.1 pmol/100 μL TEバッファー溶液)、溶液Ｂ(0.01 pmol/100 μL TEバッファー溶液)、溶液Ｃ(0.001 pmol/100 μL TEバッファー溶液)、溶液Ｄ (0 pmol/100 μL TEバッファー溶液(ネガティブコントロール液))のそれぞれについて、左から順に配列番号９８で示される塩基配列からなるメチル化オリゴヌクレオチドＦＢＮ−Ｍ８の残存量（複合体形成量）、及び、配列番号９９で示される塩基配列からなるアンメチル化オリゴヌクレオチドＦＢＮ−Ｕ８の残存量（複合体形成量）を、吸光度（４５０ｎｍ）で測定した値を示している。図３７は、実施例１４の結果を示した図である。金属塩溶液Ｍｇ (100 mM MgCl₂水溶液)、金属塩溶液Ba (100 mM BaCl₂水溶液)、金属塩溶液H₂O (超純水)のそれぞれについて、左から順に配列番号１０２で示される塩基配列からなるメチル化オリゴヌクレオチドＵＢＣ−Ｍ８の残存量（複合体形成量）、配列番号１０３で示される塩基配列からなるアンメチル化オリゴヌクレオチドＵＢＣ−Ｕ８の残存量（複合体形成量）を、蛍光（６１２ｎｍ）で測定した値を示している。図３８は、実施例１５の結果を示した図である。１０、１６、２２、２８、３４、４６、５８、７０ｍＭＭｇＣｌ_２溶液（最終濃度）のそれぞれについて、左から順に配列番号１０５で示される塩基配列からなるメチル化オリゴヌクレオチドＦＢＮ−Ｍ８の残存量（複合体形成量）、配列番号１０６で示される塩基配列からなるアンメチル化オリゴヌクレオチドＦＢＮ−Ｕ８の残存量（複合体形成量）を、蛍光（６１２ｎｍ）で測定した値を示している。図３９は、実施例１６の結果を示した図である。１０、７０、１３０、１９０、２５０、３７０、４９０、６１０ｍＭＭｇＣｌ_２溶液（最終濃度）のそれぞれについて、左から順に配列番号１０８で示される塩基配列からなるメチル化オリゴヌクレオチドＦＢＮ−Ｍ８の残存量（複合体形成量）、配列番号１０９で示される塩基配列からなるアンメチル化オリゴヌクレオチドＦＢＮ−Ｕ８の残存量（複合体形成量）を、蛍光（６１２ｎｍ）で測定した値を示している。図４０は、実施例１７の結果を示した図である。左から順に、溶液ＭＡ(10 ng/10 μL TEバッファー溶液)、溶液Ａ(10 ng/10 μL TEバッファー溶液)、溶液ＭＢ(1 ng/10 μL TEバッファー溶液)、溶液Ｂ(1 ng/10 μL TEバッファー溶液)、溶液ＭＣ (0 ng/10 μL TEバッファー溶液 (ネガティブコントロール液))、溶液Ｃ (0 ng/10 μL TEバッファー溶液 (ネガティブコントロール液))のそれぞれについて、複合体の形成量を蛍光（励起340nm/検出612nm）にて測定した値を示している。図４１は、実施例１８の結果を示した図である。左から順に、溶液ＭＡ(10 ng/10 μL TEバッファー溶液)、溶液Ａ(10 ng/10 μL TEバッファー溶液)、溶液ＭＢ (0 ng/10 μL TEバッファー溶液 (ネガティブコントロール液))、溶液Ｂ (0 ng/10 μL TEバッファー溶液 (ネガティブコントロール液))のそれぞれについて、複合体の形成量を蛍光（励起340nm/検出612nm）にて測定した値を示している。図４２は、実施例１９の結果を示した図である。左から順に、溶液ＭＡ(10 ng/10 μL TEバッファー溶液)、溶液Ａ(10 ng/10 μL TEバッファー溶液)、溶液ＭＢ(1 ng/10 μL TEバッファー溶液)、溶液Ｂ(1 ng/10 μL TEバッファー溶液)、溶液ＭＣ(0.1 ng/10 μL TEバッファー溶液)、溶液Ｃ(0.1 ng/10 μL TEバッファー溶液)、溶液ＭＤ(0 ng/10 μL TEバッファー溶液 (ネガティブコントロール液))、溶液Ｄ(0 ng/10 μL TEバッファー溶液 (ネガティブコントロール液))のそれぞれについて、複合体の形成量を蛍光（励起340nm/検出612nm）にて測定した値を示している。図４３は、実施例２０の結果を示した図である。左から順に、溶液ＭＡ(10 ng/10 μL TEバッファー溶液)、溶液Ａ(10 ng/10 μL TEバッファー溶液)、溶液ＭＢ(1 ng/10 μL TEバッファー溶液)、溶液Ｂ(1 ng/10 μL TEバッファー溶液)、溶液ＭＣ(0.1 ng/10 μL TEバッファー溶液)、溶液Ｃ(0.1 ng/10 μL TEバッファー溶液)、溶液ＭＤ(0 ng/10 μL TEバッファー溶液 (ネガティブコントロール液))、溶液Ｄ(0 ng/10 μL TEバッファー溶液 (ネガティブコントロール液))のそれぞれについて、複合体の形成量を蛍光（励起340nm/検出612nm）にて測定した値を示している。図４４は、実施例２１の結果を示した図である。左から順に、溶液ＭＡ(10 ng/10 μL TEバッファー溶液)、溶液Ａ(10 ng/10 μL TEバッファー溶液)、溶液ＭＢ(1 ng/10 μL TEバッファー溶液)、溶液Ｂ(1 ng/10 μL TEバッファー溶液)、溶液ＭＣ(0.1 ng/10 μL TEバッファー溶液)、溶液Ｃ(0.1 ng/10 μL TEバッファー溶液)、溶液ＭＤ(0 ng/10 μL TEバッファー溶液 (ネガティブコントロール液))、溶液Ｄ(0 ng/10 μL TEバッファー溶液 (ネガティブコントロール液))のそれぞれについて、複合体の形成量を発色（吸光450nm）にて測定した値を示している。図４５は、実施例２２の結果を示した図である。左から順に、溶液ＭＡ(10 ng/10 μL TEバッファー溶液)、溶液Ａ(10 ng/10 μL TEバッファー溶液)、溶液ＭＢ(1 ng/10 μL TEバッファー溶液)、溶液Ｂ(1 ng/10 μL TEバッファー溶液)、溶液ＭＣ(0.1 ng/10 μL TEバッファー溶液)、溶液Ｃ(0.1 ng/10 μL TEバッファー溶液)、溶液ＭＤ(0 ng/10 μL TEバッファー溶液 (ネガティブコントロール液))、溶液Ｄ(0 ng/10 μL TEバッファー溶液 (ネガティブコントロール液))のそれぞれについて、複合体の形成量を発色（吸光450nm）にて測定した値を示している。図４６は、実施例２３の結果を示した図である。左から順に、溶液ＭＡ(10 ng/10 μL TEバッファー溶液)、溶液Ａ(10 ng/10 μL TEバッファー溶液)、溶液ＭＢ(1 ng/10 μL TEバッファー溶液)、溶液Ｂ(1 ng/10 μL TEバッファー溶液)、溶液ＭＣ(0.1 ng/10 μL TEバッファー溶液)、溶液Ｃ(0.1 ng/10 μL TEバッファー溶液)、溶液ＭＤ(0 ng/10 μL TEバッファー溶液 (ネガティブコントロール液))、溶液Ｄ(0 ng/10 μL TEバッファー溶液 (ネガティブコントロール液))のそれぞれについて、複合体の形成量を発色（吸光450nm）にて測定した値を示している。

配列番号１７
実験のために設計された５’末端ビオチン標識メチル化オリゴヌクレオチド
配列番号１８
実験のために設計された５’末端ビオチン標識メチル化オリゴヌクレオチド
配列番号１９
実験のために設計された５’末端ビオチン標識メチル化オリゴヌクレオチド
配列番号２０
実験のために設計された５’末端ビオチン標識メチル化オリゴヌクレオチド
配列番号２１
実験のために設計された５’末端ビオチン標識アンメチル化オリゴヌクレオチド
配列番号２２
実験のために設計された５’末端ビオチン標識アンメチル化オリゴヌクレオチド
配列番号２３
実験のために設計された５’末端ビオチン標識アンメチル化オリゴヌクレオチド
配列番号２４
実験のために設計された５’末端ビオチン標識アンメチル化オリゴヌクレオチド
配列番号２５
実験のために設計されたメチル化オリゴヌクレオチド
配列番号２６
実験のために設計されたアンメチル化オリゴヌクレオチド
配列番号２７
実験のために設計された５’末端ビオチン標識オリゴヌクレオチド
配列番号２８
実験のために設計されたメチル化オリゴヌクレオチド
配列番号２９
実験のために設計された部分メチル化オリゴヌクレオチド
配列番号３０
実験のために設計されたアンメチル化オリゴヌクレオチド
配列番号３１
実験のために設計されたマスキング用オリゴヌクレオチド
配列番号３２
実験のために設計された５’末端ビオチン標識オリゴヌクレオチド
配列番号３３
実験のために設計されたメチル化オリゴヌクレオチド
配列番号３４
実験のために設計された部分メチル化オリゴヌクレオチド
配列番号３５
実験のために設計されたマスキング用オリゴヌクレオチド
配列番号３６
実験のために設計された５’末端ビオチン標識オリゴヌクレオチド
配列番号３７
実験のために設計されたメチル化オリゴヌクレオチド
配列番号３８
実験のために設計されたメチル化オリゴヌクレオチド
配列番号３９
実験のために設計されたメチル化オリゴヌクレオチド
配列番号４０
実験のために設計されたアンメチル化オリゴヌクレオチド
配列番号４１
実験のために設計されたアンメチル化オリゴヌクレオチド
配列番号４２
実験のために設計されたアンメチル化オリゴヌクレオチド
配列番号４３
実験のために設計された５’末端ビオチン標識オリゴヌクレオチド
配列番号４４
実験のために設計された５’末端ビオチン標識オリゴヌクレオチド
配列番号４５
実験のために設計された５’末端ビオチン標識オリゴヌクレオチド
配列番号４６
実験のために設計されたメチル化オリゴヌクレオチド
配列番号４７
実験のために設計されたメチル化オリゴヌクレオチド
配列番号４８
実験のために設計されたメチル化オリゴヌクレオチド
配列番号４９
実験のために設計されたアンメチル化オリゴヌクレオチド
配列番号５０
実験のために設計されたアンメチル化オリゴヌクレオチド
配列番号５１
実験のために設計されたアンメチル化オリゴヌクレオチド
配列番号５２
実験のために設計された５’末端FITC標識オリゴヌクレオチド
配列番号５３
実験のために設計された５’末端FITC標識オリゴヌクレオチド
配列番号５４
実験のために設計された５’末端FITC標識オリゴヌクレオチド
配列番号５５
実験のために設計されたメチル化オリゴヌクレオチド
配列番号５６
実験のために設計された部分メチル化オリゴヌクレオチド
配列番号５７
実験のために設計されたアンメチル化オリゴヌクレオチド
配列番号５８
実験のために設計されたマスキング用オリゴヌクレオチド
配列番号５９
実験のために設計された５’末端FITC標識オリゴヌクレオチド
配列番号６０
実験のために設計されたメチル化オリゴヌクレオチド
配列番号６１
実験のために設計されたアンメチル化オリゴヌクレオチド
配列番号６２
実験のために設計された５’末端FITC標識オリゴヌクレオチド
配列番号６３
実験のために設計された５’末端FITC標識オリゴヌクレオチド
配列番号６４
実験のために設計された５’末端FITC標識オリゴヌクレオチド
配列番号６５
実験のために設計されたメチル化オリゴヌクレオチド
配列番号６６
実験のために設計されたメチル化オリゴヌクレオチド
配列番号６７
実験のために設計されたメチル化オリゴヌクレオチド
配列番号６８
実験のために設計されたアンメチル化オリゴヌクレオチド
配列番号６９
実験のために設計されたアンメチル化オリゴヌクレオチド
配列番号７０
実験のために設計されたアンメチル化オリゴヌクレオチド
配列番号７１
実験のために設計された５’末端FITC標識オリゴヌクレオチド
配列番号７２
実験のために設計された５’末端FITC標識オリゴヌクレオチド
配列番号７３
実験のために設計された５’末端FITC標識オリゴヌクレオチド
配列番号７４
実験のために設計されたメチル化オリゴヌクレオチド
配列番号７５
実験のために設計されたアンメチル化オリゴヌクレオチド
配列番号７６
実験のために設計された５’末端ビオチン標識オリゴヌクレオチド
配列番号７７
実験のために設計されたキャリアーDNA
配列番号７８
実験のために設計されたメチル化オリゴヌクレオチド
配列番号７９
実験のために設計されたメチル化オリゴヌクレオチド
配列番号８０
実験のために設計されたメチル化オリゴヌクレオチド
配列番号８１
実験のために設計されたアンメチル化オリゴヌクレオチド
配列番号８２
実験のために設計されたアンメチル化オリゴヌクレオチド
配列番号８３
実験のために設計されたアンメチル化オリゴヌクレオチド
配列番号８４
実験のために設計された５’末端FITC標識オリゴヌクレオチド
配列番号８５
実験のために設計された５’末端FITC標識オリゴヌクレオチド
配列番号８６
実験のために設計された５’末端FITC標識オリゴヌクレオチド
配列番号８７
実験のために設計されたキャリアーDNA
配列番号８８
実験のために設計されたメチル化オリゴヌクレオチド
配列番号８９
実験のために設計されたメチル化オリゴヌクレオチド
配列番号９０
実験のために設計されたメチル化オリゴヌクレオチド
配列番号９１
実験のために設計されたアンメチル化オリゴヌクレオチド
配列番号９２
実験のために設計されたアンメチル化オリゴヌクレオチド
配列番号９３
実験のために設計されたアンメチル化オリゴヌクレオチド
配列番号９４
実験のために設計された５’末端FITC標識オリゴヌクレオチド
配列番号９５
実験のために設計された５’末端FITC標識オリゴヌクレオチド
配列番号９６
実験のために設計された５’末端FITC標識オリゴヌクレオチド
配列番号９７
実験のために設計されたキャリアーDNA
配列番号９８
実験のために設計されたメチル化オリゴヌクレオチド
配列番号９９
実験のために設計されたアンメチル化オリゴヌクレオチド
配列番号１００
実験のために設計された５’末端FITC標識オリゴヌクレオチド
配列番号１０１
実験のために設計されたキャリアーDNA
配列番号１０２
実験のために設計されたメチル化オリゴヌクレオチド
配列番号１０３
実験のために設計されたアンメチル化オリゴヌクレオチド
配列番号１０４
実験のために設計された５’末端ビオチン標識オリゴヌクレオチド
配列番号１０５
実験のために設計されたメチル化オリゴヌクレオチド
配列番号１０６
実験のために設計されたアンメチル化オリゴヌクレオチド
配列番号１０７
実験のために設計された５’末端ビオチン標識オリゴヌクレオチド
配列番号１０８
実験のために設計されたメチル化オリゴヌクレオチド
配列番号１０９
実験のために設計されたアンメチル化オリゴヌクレオチド
配列番号１１０
実験のために設計された５’末端ビオチン標識オリゴヌクレオチド
配列番号１１１
実験のために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号１１２
実験のために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号１１３
実験のために設計されたＤＮＡフラグメント
配列番号１１４
実験のために設計されたメチル化ＤＮＡフラグメント
配列番号１１５
目的とするＤＮＡ領域からなるオリゴヌクレオチド
配列番号１１６
実験のために設計された５’末端ビオチン標識オリゴヌクレオチド
配列番号１１７
実験のために設計されたカウンターオリゴヌクレオチド
配列番号１１８
実験のために設計されたカウンターオリゴヌクレオチド
配列番号１１９
実験のために設計されたカウンターオリゴヌクレオチド
配列番号１２０
実験のために設計されたカウンターオリゴヌクレオチド
配列番号１２１
実験のために設計されたカウンターオリゴヌクレオチド
配列番号１２２
実験のために設計されたカウンターオリゴヌクレオチド
配列番号１２３
実験のために設計されたカウンターオリゴヌクレオチド
配列番号１２４
実験のために設計されたカウンターオリゴヌクレオチド
配列番号１２５
実験のために設計されたカウンターオリゴヌクレオチド
配列番号１２６
実験のために設計されたカウンターオリゴヌクレオチド
配列番号１２７
実験のために設計されたカウンターオリゴヌクレオチド
配列番号１２８
実験のために設計されたカウンターオリゴヌクレオチド
配列番号１２９
実験のために設計されたマスキング用オリゴヌクレオチド
配列番号１３０
実験のために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号１３１
実験のために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号１３２
実験のために設計されたＤＮＡフラグメント
配列番号１３３
実験のために設計されたメチル化ＤＮＡフラグメント
配列番号１３４
目的とするＤＮＡ領域からなるオリゴヌクレオチド
配列番号１３５
実験のために設計された５’末端ビオチン標識オリゴヌクレオチド
配列番号１３６
実験のために設計されたカウンターオリゴヌクレオチド
配列番号１３７
実験のために設計されたカウンターオリゴヌクレオチド
配列番号１３８
実験のために設計されたカウンターオリゴヌクレオチド
配列番号１３９
実験のために設計されたマスキング用オリゴヌクレオチド
配列番号１４０
実験のために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号１４１
実験のために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号１４２
実験のために設計されたＤＮＡフラグメント
配列番号１４３
実験のために設計されたメチル化ＤＮＡフラグメント
配列番号１４４
目的とするＤＮＡ領域からなるオリゴヌクレオチド
配列番号１４５
実験のために設計された５’末端ビオチン標識オリゴヌクレオチド
配列番号１４６
実験のために設計されたカウンターオリゴヌクレオチド
配列番号１４７
実験のために設計されたカウンターオリゴヌクレオチド
配列番号１４８
実験のために設計されたカウンターオリゴヌクレオチド
配列番号１４９
実験のために設計されたカウンターオリゴヌクレオチド
配列番号１５０
実験のために設計されたカウンターオリゴヌクレオチド
配列番号１５１
実験のために設計されたカウンターオリゴヌクレオチド
配列番号１５２
実験のために設計されたカウンターオリゴヌクレオチド
配列番号１５３
実験のために設計されたカウンターオリゴヌクレオチド
配列番号１５４
実験のために設計されたカウンターオリゴヌクレオチド
配列番号１５５
実験のために設計されたカウンターオリゴヌクレオチド
配列番号１５６
実験のために設計されたマスキング用オリゴヌクレオチド
配列番号１５７
実験のために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号１５８
実験のために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号１５９
実験のために設計されたＤＮＡフラグメント
配列番号１６０
実験のために設計されたメチル化ＤＮＡフラグメント
配列番号１６１
目的とするＤＮＡ領域からなるオリゴヌクレオチド
配列番号１６２
実験のために設計された５’末端ビオチン標識オリゴヌクレオチド
配列番号１６３
実験のために設計されたカウンターオリゴヌクレオチド
配列番号１６４
実験のために設計されたカウンターオリゴヌクレオチド
配列番号１６５
実験のために設計されたカウンターオリゴヌクレオチド
配列番号１６６
実験のために設計されたカウンターオリゴヌクレオチド
配列番号１６７
実験のために設計されたマスキング用オリゴヌクレオチド
配列番号１６８
実験のために設計された５’末端ＦＩＴＣ標識オリゴヌクレオチド
配列番号１６９
実験のために設計された５’末端ＦＩＴＣ標識オリゴヌクレオチド
配列番号１７０
実験のために設計された５’末端ＦＩＴＣ標識オリゴヌクレオチド

Claims

生物由来検体中に含まれるゲノムＤＮＡが有する目的とするＤＮＡ領域においてメチル化されたＤＮＡを検出若しくは定量する方法であって、
（１）生物由来検体中に含まれるゲノムＤＮＡ由来のＤＮＡ試料から一本鎖ＤＮＡを取得する第一工程、
（２）(i)第一工程で取得された一本鎖ＤＮＡ、(ii)メチル化ＤＮＡ抗体、及び、(iii)前記のメチル化ＤＮＡ抗体と目的とするＤＮＡ領域においてメチル化されたＤＮＡとの結合を阻害せず且つ前記の一本鎖ＤＮＡと結合し得るオリゴヌクレオチド、を混合することによりメチル化された目的とするＤＮＡ領域を含む一本鎖ＤＮＡと、メチル化ＤＮＡ抗体と、前記のオリゴヌクレオチドとの複合体を形成させると同時に若しくは形成させた後、当該複合体を分離する第二工程、及び、
（３）分離された複合体に含まれる前記のメチル化ＤＮＡ抗体、又は、前記のオリゴヌクレオチドを、当該メチル化ＤＮＡ抗体又は当該オリゴヌクレオチドが有する検出に利用し得る識別機能に基づき検出若しくは定量することにより、生物由来検体中に含まれる目的とするＤＮＡ領域においてメチル化されたＤＮＡを検出若しくは定量する第三工程、
を有することを特徴とする方法。
第二工程で混合される、メチル化ＤＮＡ抗体と目的とするＤＮＡ領域を含む一本鎖ＤＮＡの中に存在するメチル化された塩基との結合を阻害しないオリゴヌクレオチドとして、２種類以上のオリゴヌクレオチドが用いられることを特徴とする請求項１の方法。
第二工程で形成される複合体、又は、第二工程の複合体を形成させる過程において生じる第一工程で取得された一本鎖ＤＮＡと、メチル化ＤＮＡ抗体と目的とするＤＮＡ領域を含む一本鎖ＤＮＡの中に存在するメチル化された塩基との結合を阻害しないオリゴヌクレオチドとの結合体、を二価陽イオンを含有する反応系中で形成させることを特徴とする請求項１記載の方法。
二価陽イオンがマグネシウムイオンであることを特徴とする請求項３記載の方法。
第二工程における複合体の分離操作として、形成された複合体に含まれるメチル化ＤＮＡ抗体を支持体に結合させる工程を有することを特徴とする請求項１〜４のいずれかの請求項記載の方法。
第二工程における複合体の分離操作として、形成された複合体に含まれる前記のオリゴヌクレオチドを支持体に結合させる工程を有することを特徴とする請求項１〜４のいずれかの請求項記載の方法。
第一工程の終了直後から第三工程の開始直前までの間に、第一工程で取得された一本鎖ＤＮＡを、少なくとも１種類の一本鎖ＤＮＡを消化できるメチル化感受性制限酵素により消化する工程を、追加的に有することを特徴とする請求項１〜６のいずれかの請求項記載の方法。
第一工程の終了直後から第三工程の開始直前までの間に、(i)第一工程で取得された一本鎖ＤＮＡ、及び、少なくとも１種類のメチル化感受性制限酵素の認識配列をその一部として有するマスキング用オリゴヌクレオチド、を混合する工程、及び、(ii)前工程により得られた混合物（の中に存在する目的とするＤＮＡ領域においてＤＮＡがメチル化されていない一本鎖ＤＮＡ）を前記のメチル化感受性制限酵素により消化する工程を、追加的に有することを特徴とする請求項１〜６のいずれかの請求項記載の方法。
少なくとも１種類の一本鎖ＤＮＡを消化できるメチル化感受性制限酵素が、一本鎖ＤＮＡを消化できるメチル化感受性制限酵素であるHhaIであることを特徴とする請求項７記載の方法。
少なくとも１種類のメチル化感受性制限酵素が、メチル化感受性制限酵素であるHpaII又はHhaIであることを特徴とする請求項８記載の方法。
メチル化ＤＮＡ抗体が、メチルシトシン抗体であることを特徴とする請求項１〜１０のいずれかの請求項記載の方法。
生物由来検体が、哺乳動物の血清又は血漿であることを特徴とする請求項１〜１１のいずれかの請求項記載の方法。
生物由来検体が、哺乳動物の血液又は体液であることを特徴とする請求項１〜１１のいずれかの請求項記載の方法。
生物由来検体が、細胞溶解液又は組織溶解液であることを特徴とする請求項１〜１１のいずれかの請求項記載の方法。
生物由来検体中に含まれるゲノムＤＮＡ由来のＤＮＡ試料が、当該ゲノムＤＮＡが有する目的とするＤＮＡ領域を認識切断部位としない制限酵素で予め消化処理されてなるＤＮＡ試料であることを特徴とする請求項１〜１４のいずれかの請求項記載の方法。
生物由来検体中に含まれるゲノムＤＮＡ由来のＤＮＡ試料が、少なくとも１種類のメチル化感受性制限酵素で消化処理されてなるＤＮＡ試料であることを特徴とする請求項１〜１５のいずれかの請求項記載の方法。
生物由来検体中に含まれるゲノムＤＮＡ由来のＤＮＡ試料が、特定マスキング用オリゴヌクレオチドを添加した後に、少なくとも１種類のメチル化感受性制限酵素で消化処理されてなるＤＮＡ試料であることを特徴とする請求項１〜１５のいずれかの請求項記載の方法。
少なくとも１種類のメチル化感受性制限酵素が、メチル化感受性制限酵素であるHpaII又はHhaIであることを特徴とする請求項１６又は１７記載の方法。
生物由来検体中に含まれるゲノムＤＮＡ由来のＤＮＡ試料が、予め精製されてなるＤＮＡ試料であることを特徴とする請求項１〜１８のいずれかの請求項記載の方法。
ゲノムＤＮＡが有する目的とするＤＮＡ領域が、少なくとも１種類のメチル化感受性制限酵素が認識する切断部位を有するＤＮＡ領域であることを特徴とする請求項１〜１９のいずれかの請求項記載の方法。
第一工程でゲノムＤＮＡ由来のＤＮＡ試料から一本鎖ＤＮＡを取得する際に、カウンターオリゴヌクレオチドを添加する請求項１〜２０のいずれかの請求項記載の方法。
第一工程におけるゲノムＤＮＡ由来のＤＮＡ試料からの一本鎖ＤＮＡの取得が、二価陽イオンあるいはマグネシウムイオンを含有する反応系中で行われる請求項１〜２０のいずれかの請求項記載の方法。