JP5197013B2 - 細胞培養用振盪装置及び細胞培養方法の振盪培養方法 - Google Patents

Description

本発明は、培養容器内での細胞の培養を促進するための細胞培養用振盪装置及び細胞培養方法の振盪培養方法に関する。

細胞培養、特に免疫細胞療法に用いられる浮遊系細胞の細胞培養は、従来ほとんどが人的操作によって実施されている。例えば、患者から採取した細胞を、抗体（誘導因子）が付着したフラスコに培地とともに接種して恒温槽に収納し、このフラスコを日々恒温槽から取り出し、顕微鏡などを用いて培養状況（例えば増殖状況）を観察し、増殖等が認められたとき、または細胞接種から所定期間経過した後に、上記フラスコに培地を添加して細胞を培養（例えば増殖）している。また、大量の細胞を得たい場合にはフラスコから培養用バッグに移して培養することもある。

このフラスコやバッグで培養する場合、培養容器をそのまま静置する静置培養と、この培養容器を例えば載置する載置台等を揺らすことによる振盪培養とがある。

特開２００１‐２７５６５９号公報

ところが、細胞の静置培養においては、細胞の分布および培地の成分濃度が不均一な状態である為、培養環境の制御が難しくなり、また振盪培養に比べ酸素供給能も低い為、細胞の増殖を最大限引き出すには問題点がある。一方、振盪培養においては、培養容器内の細胞は培養容器の揺動により、培養面において細胞を転がすことになり、細胞の物理的ダメージが甚大なものとなってしまうという問題がある。

本発明の目的は、上述の事情を考慮してなされたものであり、細胞への物理的ダメージを防止しつつ細胞の培養性を向上させることができる、つまり、細胞の分布及び培地の成分濃度が均一な状態となることで培養環境の制御が容易となり、また酸素供給能も高くなることによって、細胞の増殖が促進される細胞培養用振盪装置及び細胞培養方法の振盪培養方法を提供することにある。

請求項１に記載の発明に係る細胞培養用振盪装置は、細胞が接種された培養液を収容する可撓性の培養容器内で細胞を培養する細胞培養用振盪装置において、培養容器に対して上下移動により突出部が培養容器を押圧又は押圧を解除可能な押圧手段を備え、押圧手段を移動させて突出部が培養容器を押圧し、押圧を離間して解除する動作を繰り返すことにより培養容器内の培養液を撹拌する構成としたことを特徴とするものである。
請求項２に記載の発明に係る細胞培養用振盪装置の突出部は、所定の距離離間して配設された複数の突出部でなることを特徴とするものである。
請求項３に記載の発明に係る細胞培養用振盪装置の細胞は、浮遊系細胞であることを特徴とするものである。
請求項４に記載の発明に係る細胞培養用振盪装置の細胞は、免疫細胞療法に使用されることを特徴とするものである。
請求項５に記載の発明に係る細胞培養用振盪装置の押圧手段は、押圧幅１乃至１５ｍｍで押圧することを特徴とする。
請求項６に記載の発明に係る細胞培養方法の振盪培養方法は、細胞が接種された培養液を収容する可撓性の培養容器内で細胞を培養する細胞培養方法であって、培養容器に対して上下移動により突出部が培養容器を押圧又は押圧を解除する押圧手段を移動させて培養容器を押圧し、押圧を離間して解除する動作を繰り返すことにより培養容器内で培養液を撹拌して細胞を培養することを特徴とするものである。
請求項７に記載の発明に係る細胞培養方法の突出部は、所定の距離離間して配設された複数の突出部でなることを特徴とするものである。
請求項８に記載の発明に係る細胞培養方法の振盪培養方法の細胞は、浮遊系細胞であることを特徴とするものである。
請求項９に記載の発明に係る細胞培養方法の振盪培養方法の細胞は、免疫細胞療法に使用されることを特徴とするものである。

本発明によれば、細胞が接種された培養液を収容する可撓性の培養容器を押圧手段が繰り返し押圧して、当該培養容器内の培養液を撹拌することから、つまり、細胞の分布及び培地の成分濃度が均一な状態となることで培養環境の制御が容易となり、また酸素供給能も高くなることによって、細胞の増殖が促進されて、細胞の培養効率を向上させることができる。また、細胞は、押圧手段により繰り返し押圧されて撹拌された培養液内を浮遊するだけなので、物理的ダメージを蒙ることが防止される。

以下、本発明を実施するための最良の形態を、図面に基づき説明する。
［Ａ］第１の実施の形態（図１〜図１７）
図１は、本発明に係る細胞培養用振盪装置における第１の実施の形態が適用された細胞培養装置を示す構成図である。図２は、図１の恒温槽を示す斜視図である。図５は、図２の恒温槽における一つのキャニスタと、このキャニスタ内に収納される培養カセットとからなる培養ユニットの構成を示すレイアウト図である。
図１に示す細胞培養装置１０は、特に、免疫細胞療法に用いられる浮遊系細胞を培養するものであり、複数個（例えば８個）の培養ユニット１２を備えた恒温槽１１と、この恒温槽１１及び培養ユニット１２の運転を制御する運転制御盤１３と、細胞の画像を処理するための画像処理用コンピュータ１４と、運転制御盤１３及び画像処理用コンピュータ１４に接続されて、恒温槽１１及び培養ユニット１２を監視するための監視用コンピュータ１５とを有して構成される。上記運転制御盤１３及び画像処理用コンピュータ１４が制御手段として機能する。

ここで、上記浮遊系細胞としては、末梢血単核球、ＬＡＫ細胞（Ｌｙｍｐｈｏｋｉｎｅ Ａｃｔｉｖａｔｅｄ Ｋｉｌｌｅｒ細胞）、神経幹細胞、ＥＳ細胞などが知られている。これらの浮遊系細胞を以下単に細胞と称する。なお、これらの細胞をそれぞれの細胞にあった誘導因子で刺激して培養する。各誘導因子は、細胞毎に異なり、例えばＬＡＫ細胞では抗ヒトＣＤ３抗体等であり、神経幹細胞の誘導因子ではＥＧＦ等の上皮成長因子であり、ＥＳ細胞の誘導因子ではＦＧＦ−８ｂ等の線維芽細胞増殖因子である。また、本細胞培養装置１０は、上記浮遊系細胞以外の接着依存性細胞を培養する場合にも適用可能である。

上記培養ユニット１２は、恒温槽１１内で互いに隔離して分離された複数個（例えば８個）のキャニスタ１６（図２及び図５）と、各キャニスタ１６内に収納される培養カセット１７（図２及び図３）とを有してなる。この培養カセット１７は、後に詳説するように、増殖用培養容器としての培養バッグ１８、誘導因子刺激用培養容器としての細胞接種カセット１９、及び培地貯溜手段としての培地カセット２０を備える。これらの培養容器（培養バッグ１８、細胞接種カセット１９）内の細胞は、キャニスタ１６ごとに独立した、培養環境下で培養される。

上記恒温槽１１は、図２に示すように、開閉可能な本体ドア２１を備えた恒温槽本体２２内に複数段の棚２３が設置され、各棚２３にキャニスタ１６が１個ずつ配置されてなる。この恒温槽１１は、本体ドア２１を閉じた状態で、恒温槽本体２２内の環境（温度、湿度及びＣＯ２濃度）を、細胞を培養するために必要な環境に維持する。

このため、恒温槽本体２２内には、図５及び図６に示すように、温度センサ２４、ＣＯ２センサ２５、ドアセンサ２６及びヒータ２７が配設され、更にこの恒温槽本体２２に、外部に設置されたガスボンベ２８が連結される。温度センサ２４、ＣＯ２センサ２５及びドアセンサ２６からの信号は、運転制御盤１３へ送信される。この運転制御盤１３は、温度センサ２４からの温度信号に基づいてヒータ２７を制御し、ＣＯ２センサ２５からのＣＯ２濃度信号に基づいて、ガスボンベ２８から恒温槽本体２２内へ供給されるＣＯ２ガス量を制御する。

上記キャニスタ１６は、図５及び図６に示すように、キャニスタ本体３０に開閉可能なキャニスタドア３１が取り付けられ、キャニスタ本体３０に吸気フィルタ３２及び排気フィルタ３３が設置されると共に、キャニスタ本体３０の吸気フィルタ３２側に送風ファン３４が設置されたものである。

吸気フィルタ３２及び排気フィルタ３３は、細菌を除去するフィルタであり、送風ファン３４の運転により恒温槽本体２２内の空気及びＣＯ２ガスがキャニスタ１６内へ取り込まれる際に、恒温槽本体２２からキャニスタ１６内への細菌の流入を防止する。また、送風ファン３４の運転は運転制御盤１３により制御され、恒温槽１１の本体ドア２１が開いた旨の信号がドアセンサ２６から運転制御盤１３へ送信された際に、送風ファン３４の運転が停止されて、キャニスタ１６の密閉状態が確保される。

吸気フィルタ３２及び排気フィルタ３３による恒温槽本体２２からキャニスタ１６内への細菌流入防止機能と、送風ファン３４の運転停止によるキャニスタ１６の密閉性確保とによって、各キャニスタ１６内がそれぞれ独立した培養環境となる。これにより、恒温槽１１における一つのキャニスタ１６に収納される培養カセット１７内の細胞が他のキャニスタ１６内の細胞に対して隔離されると共に、このキャニスタ１６に収納される培養カセット１７内の細胞が雑菌によって汚染されるコンタミネーションが防止される。また、他の患者の細胞によって汚染されるいわゆるクロスコンタミネーションも防止される。

キャニスタ本体３０には、更にドアセンサ３５、ドアロックセンサ３６、温度センサ３７、湿度センサ３８、ドアロック機構３９、ヒータ４０及び循環ファン４１が配設されている。運転制御盤１３は、温度センサ３７からの温度信号に基づいてヒータ４０を制御する。また、運転制御盤１３は、循環ファン４１の運転を制御して、キャニスタ１６内で空気及びＣＯ２ガスを循環させる。上記湿度センサ３８は、キャニスタ１６内の湿度を検出して運転制御盤１３へ送信し、その異常を検出する。このようにして、キャニスタ１６内は細胞を培養するための最適な環境に保持される。

また、運転制御盤１３は、一つの恒温槽１１において２以上のキャニスタドア３１が同時に開動作を行うことがないようにドアロック機構３９の動作を制御する。これにより、異なるキャニスタ１６間で細胞や培地などが取り違えて搬入されることが防止される。このドアロック機構３９のロック動作はドアロックセンサ３６により検出されて、運転制御盤１３へ送信される。また、キャニスタドア３１の開閉状態はドアセンサ３５によって検出されて、運転制御盤１３へ送信される。

図５に示すキャニスタ本体３０内の下部には、キャニスタ１６内に収納される培養カセット１７を支持するステージ４２が設けられ、このステージ４２に重量計４３が設置される。この重量計４３は、キャニスタ１６内に収納された培養カセット１７の培養バッグ１８の重量を計測するものであり、実際には、培地カセット２０から培養バッグ１８へ供給される培地量を計測する。この重量計４３の計測値も運転制御盤１３へ送信される。また、キャニスタ本体３０には、表示灯４４が設けられている。キャニスタ１６内で自動培養を行っているときに、このキャニスタ１６の表示灯４４を例えば赤色点灯させ、操作指令が出力されたキャニスタ１６と、内部に培養カセット１７が収納されていないキャニスタ１６の表示灯４４を緑色点灯させる。これにより、自動培養を行っているキャニスタ１６については他のキャニスタ１６とは独立した培養環境が確保され、他のキャニスタ１６に収納されている検体（細胞）とのクロスコンタミネーションや取り違いを防止することが可能となる。

ここで、上記培養カセット１７について説明する。
この培養カセット１７は、図３及び図５に示すように、ラージトレイ４５に培養バッグ１８、細胞接種カセット１９及び培地カセット２０が装着されたものであり、培養バッグ１８及び細胞接種カセット１９が細胞を培養する培養容器である。このうち、細胞接種カセット１９は、細胞に機能を発現させる（例えば細胞を増殖させる、細胞を分化（後述）させる等）ための機能発現用培養容器であり、本実施形態では、増殖のために誘導因子により細胞を刺激する誘導因子刺激用培養容器である。また、培養バッグ１８は、細胞接種カセット１９において誘導因子により刺激された細胞を増殖するための増殖用培養容器である。

培養バッグ１８は、細胞が接種された培養液を収容する可撓性のディスポーサブルの容器であり、載置台４６（図５）を介して、図４（Ａ）に示す培養バッグトレイ４７に載置され、この培養バッグトレイ４７が図３及び図５に示すラージトレイ４５に着脱可能に装着される。上記培養バッグ１８は、例えば酸素透過性材質からなるバッグである。上記ラージトレイ４５には、図５に示すように、第１ポンプ４８、第２ポンプ４９及び第３ポンプ５０が配置される。培養バッグ１８の一端側は、チューブ６３を用い第２ポンプ４９を経て第７コネクタ５７に接続される。また、培養バッグ１８の他端側は、チューブ６０を用いて第１コネクタ５１に接続される。上記第１ポンプ４８、第２ポンプ４９、第３ポンプ５０は、滅菌チューブ交換の利便性から、蠕動型（ペリスタルティックタイプ）ポンプが好ましい。

このラージトレイ４５では、チューブ６１の一端は第３コネクタ５３に接続され、他端は第５コネクタ５５に接続される。このチューブ６１は、第１ポンプ４８の図示しない回転駆動部に配設されている。チューブ６３の一端は、前述の如く第７コネクタ５７に接続され、他端は培養バッグ１８に接続される。このチューブ６３は、第２ポンプ４９の図示しない回転駆動部に配設されている。チューブ６２は、一端がコネクタＸによりチューブ６１に接続され、他端がコネクタＹによりチューブ６３に接続される。このチューブ６２は、第３ポンプ５０の図示しない回転駆動部に配設されている。

上記細胞接種カセット１９は、図４（Ｃ）に示すように、誘導因子刺激容器６５の底面内側に誘導因子を固層化し、この誘導因子刺激容器６５内に培地を投入し、この培地に細胞を接種し、この誘導因子刺激容器６５をカセットフレーム６６に設置して、カセット構造に構成されたものである。上記誘導因子刺激容器６５に誘導因子、培地及び細胞を入れる作業は、クリーンベンチ又は安全キャビネット（本実施の形態において以下、クリーンベンチ等という）内で無菌状態で実施される。尚、培地及び細胞の混合液を培養液と称する。

上記細胞接種カセット１９は、図３に示すように、ラージトレイ４５に着脱可能に装着される。このときには、図５に示すように、細胞接種カセット１９の第２コネクタ５２及び第４コネクタ５４がラージトレイ４５の第１コネクタ５１、第３コネクタ５３のそれぞれに無菌的に結合される。つまり、第１コネクタ５１と第２コネクタ５２は、例えば一方のゴム状結合部に他方の針状結合部が差し込まれることで無菌的に結合される。第３コネクタ５３と第４コネクタ５４との結合についても同様である。

第１コネクタ５１と第２コネクタ５２との結合によりチューブ６０を用いて、異なる培養環境の細胞接種カセット１９と培養バッグ１８、つまり細胞を誘導因子により刺激して当該細胞に増殖機能を発現させるための培養環境を有する細胞接種カセット１９と、細胞を増殖するための培養環境を有する培養バッグ１８とが接続されることになる。従って、細胞接種カセット１９において誘導因子により刺激され、増殖を開始し始めた細胞を培養バッグ１８へ移行させ、この培養バッグ１８において増殖のみを実施させることが可能となる。

前記培地カセット２０は、図４（Ｂ）に示すように、培地貯溜容器としての培地バッグ６７、及び使用済み培地貯溜容器としての使用済み培地バッグ６８が培地バッグトレイ６９に載置されて、カセット構造に構成されたものである。上記培地バッグ６７は、培養バッグ１８、細胞接種カセット１９へ供給される培地を貯溜するものである。また、上記使用済み培地バッグ６８は、培養バッグ１８から排出される使用済み培地（上澄み）を貯溜するものである。培地カセット２０がカセット構造に構成されたことにより、培養バッグ１８をキャニスタ１６内に維持した状態で、当該キャニスタ１６内の培養カセット１７に培地カセット２０を装着するだけで培地の交換、供給が可能となる。

上記培地カセット２０は、ラージトレイ４５（図３）に着脱可能に装着される。このとき、図５に示すように、培地カセット２０の第６コネクタ５６、第８コネクタ５８がラージトレイ４５の第５コネクタ５５、第７コネクタ５７のそれぞれに、第１コネクタ５１及び第２コネクタ５２の場合と同様にして無菌的に結合される。第６コネクタ５６と第５コネクタ５５との結合により、培地バッグ６７と細胞接種カセット１９とが接続される。また、第７コネクタ５７と第８コネクタ５８との結合により、使用済み培地バッグ６８と培養バッグ１８とが接続される。

培養バッグ１８、細胞接種カセット１９及び培地カセット２０が上述のように接続されることで、培地カセット２０における培地バッグ６７内の培地が、第１ポンプ４８の起動により細胞接種カセット１９を経て培養バッグ１８へ供給され、この培養バッグ１８内の使用済み培地が、第２ポンプ４９の起動により培地カセット２０の使用済み培地バッグ６８へ排出される閉鎖系が構成される。この閉鎖系の構成により、当該系統（培養バッグ１８、細胞接種カセット１９及び培地カセット２０）が無菌状態に保持される。

尚、上記細胞接種カセット１９は、内部に細胞がなくなった段階でダミーカセット７０に置き換えられる。これにより、細胞接種カセット１９内の誘導因子が培養バッグ１８内へ移行することが防止される。また、培地カセット２０は、培地バッグ６７が空になった段階で、培地が満たされた培地バッグ６７と空の使用済み培地バッグ６８とを具備する新たな培地カセット２０に交換される。この交換は操作者によって実施される。上記ダミーカセット７０は、単に、培地を流動させる流路として機能するものである。

培養バッグ１８内での培養（細胞増殖）には、第１ポンプ４８を起動させて、培地カセット２０の培地バッグ６７内の培地を培養バッグ１８へ供給（流加）することで細胞を増殖させる流加培養と、第１ポンプ４８及び第２ポンプ４９を起動させて、培養バッグ１８内の使用済み培地を培地カセット２０の使用済み培地バッグ６８へ排出し、且つ培地バッグ６７内の培地を培養バッグ１８へ供給することで細胞を増殖させる灌流培養と、後述の振盪装置８０を用いた振盪培養と、振盪を実施しない静置培養とがある。このうち灌流培養には、使用済み培地の排出と培地の供給とを交互に実施する間欠式灌流培養と、使用済み培地の排出と培地の供給とを同時に実施する連続式灌流培養とがある。この連続式灌流培養では、通常、チューブ６３のうち培養バッグ１８と第２ポンプ４９との間に、細胞の移動を阻止するフィルタ７１が配設されて、培養バッグ１８内の細胞が使用済み培地バッグ６８へ排出されることが防止される。

前記第３ポンプ５０は、培養バッグ１８内で増殖された細胞を画像により観察する場合などに起動される。つまり、培養バッグ１８内の細胞は、チューブ６３にフィルタ７１が配設されていない場合には、培養バッグ１８からチューブ６３、チューブ６２及びチューブ６１を経て、細胞接種カセット１９またはダミーカセット７０へ導かれ、後述のＣＣＤカメラ８８により撮像されて、増殖された細胞数などが観察される。上記チューブ６３にフィルタ７１が配設されている場合には、第３ポンプ５０の上流側がバイパスチューブ７３を介して培養バッグ１８に接続され、培養バッグ１８内の細胞は、上記バイパスチューブ７３及びチューブ６２を経て、細胞接種カセット１９またはダミーカセット７０内へ導かれ、ＣＣＤカメラ８８を用いて観察される。

上記培地カセット２０の使用済み培地バッグ６８へは、培養バッグ１８における細胞の増殖終了後に、培養バッグ１８内の使用済み培地が排出されて、この培養バッグ１８内の細胞が濃縮される。この使用済み培地の排出は第２ポンプ４９の起動により実施され、重量計４３の計測値に基づき運転制御盤１３の制御によって、培養バッグ１８内の培養液の容量が約１／２〜１／３程度になるまで実施される。この培養バッグ１８内での細胞の濃縮により、その後に実施される細胞洗浄・濃縮を目的とした遠心分離機による遠心分離回数が低減される。

また、培地カセット２０では、培養バッグ１８における細胞が上述のように濃縮された後に、使用済み培地バッグ６８を、遠心分離機に装着可能な細胞回収容器としての細胞回収バッグ７２に置き換え、この細胞回収バッグ７２内へ、培養バッグ１８内で細胞が濃縮された培養液を、第２ポンプ４９の起動により供給してもよい。この場合には、チューブ６３にフィルタ７１が配設されていないことが条件となる。これにより、遠心分離機に装着可能なバッグでの細胞の回収を、閉鎖系空間であるキャニスタ１６内で実施でき、細胞の回収作業が省力化される。

キャニスタ１６内に収納される培養カセット１７のラージトレイ４５には、図５及び図６に示すように、細胞接種カセット１９またはダミーカセット７０がラージトレイ４５に装着されたことを検出する細胞接種カセットセンサ７４と、培地カセット２０がラージトレイ４５に装着されたことを検出する培地カセットセンサ７５とが設置されている。これらのセンサ７４及び７５の信号は運転制御盤１３へ送信される。この運転制御盤１３は、培養カセット１７のラージトレイ４５に細胞接種カセット１９またはダミーカセット７０が装着され、且つ培地カセット２０が装着されたことを確認して、第１ポンプ４８、第２ポンプ４９及び第３ポンプ５０を起動させる。

ところで、図５に示すように、キャニスタ１６内には培養カセット１７が収納され、この培養カセット１７がキャニスタ１６のステージ４２に支持されるが、このステージ４２には、培養カセット１７の培養バッグトレイ４７が配置される下方位置に傾斜モータ７６、カム機構７９及び位置決めセンサ７７が設置される。培養バッグトレイ４７上で培養バッグ１８を直接載置する載置台４６は、その一部（図示しない昇降部）が昇降可能に構成される。上記傾斜モータ７６はカム機構７９を回動させて、載置台４６の上記昇降部を昇降させる。この昇降部の位置が位置決めセンサ７７により検出されて、運転制御盤１３へ送信される。傾斜モータ７６は運転制御盤１３により制御され、培養バッグ１８における培養初期段階で、載置台４６の昇降部を下降させるよう制御される。これにより、培養バッグ１８に液溜り部７８（図８及び図９）が形成される。

培養バッグ１８における培養初期段階で、細胞接種カセット１９からの培養液が液溜り部７８に貯溜されることにより、培養バッグ１８内の面積当たりの細胞密度が増殖に好適な密度に保持されて、培養初期に細胞が効率的に増殖される。培養バッグ１８内に培養液が所定量ａ（後述）以上になる培養中期及び後期には、傾斜モータ７６がカム機構７９を介して載置台４６の昇降部を上昇させ、培養バッグ１８を水平状態として上記液溜り部７８を解消する。

更に、キャニスタ１６内には、図５に示すように、培養カセット１７の培養バッグトレイ４７が配置される上方位置に、振盪装置８０の振盪機構９１が押圧手段として設置される。

この振盪装置８０は、上記振盪機構９１、作動モータ８１、カム機構９０及び位置決めセンサ８２を有する。振盪機構９１は、図７に示すように、装置フレーム８３に、ガイドロッド８４を介して、押圧手段としての作動板８５が上下移動自在に配設され、この作動板８５の底面に複数の突出部８６が突設されたものである。作動板８５が作動モータ８１により、カム機構９０（図５）の作用で上方または下方に交互に移動されることで、この作動板８５の突出部８６が、振盪機構９１の下方に位置する培養バッグ１８を繰り返し押圧、つまり培養バッグ１８に対し押圧と解除を繰り返す。

ここで、培養バッグ１８の容量を５００〜１５００ｍｌ、作業板８５の大きさを３０×４０ｃｍとした場合においては、図７（Ａ）に示す、振盪機構９１に突設する突出部は、例えば５〜２５個とすることが望ましい。また、図７（Ｂ）に示すように、この突出部８６の直径ｒは、例えば０．５〜７ｃｍ、より好ましくは１〜３ｃｍであり、突出部８６の高さｈは、例えば０．５〜７ｃｍ、より好ましくは１〜３ｃｍである。突出部８６の素材は、例えばプラスチック、アルムニウム、ゴム等で形成されている。このような素材で作成することにより、培養バッグ１８及び培養バッグ１８内の細胞を傷つけずに押圧することが可能となる。突出部８６の形状は、例えば半球形や円筒形等、培養バッグを傷つけない形状であればどのような形状でも構わない。更に、突出部８６の押圧は、例えば、１分間に１０〜１８０回のスピードで、押圧幅１〜１５ｍｍで押圧している。なお、これらの数値は一例であり、上記の数値に限定されるものではない。

このような構成の振盪機構９１により、培養バッグ１８内の培養液が攪拌されて、培養バッグ１８内の細胞が培養液内で浮遊して移動し、この培養バッグ１８内での細胞の分布及び培地の成分濃度が均一化され、また酸素供給能も高くなることにより細胞の増殖が促進される。

図６に示すように、上記位置決めセンサ８２により作動板８５の位置が検出されて運転制御盤１３へ送信され、この運転制御盤１３により作動モータ８１が制御される。上記振盪装置８０を用いた培養バッグ１８内での細胞培養（振盪培養）は、培養バッグ１８内に培養液が一杯程度に満たされる前に実施されてもよく、または一杯程度に満たされた後に実施されてもよい。

また、キャニスタ１６内には、図５に示すように、培養カセット１７の細胞接種カセット１９またはダミーカセット７０が配置される位置の上方に照明用ＬＥＤ８７が、下方に画像取得手段としてのＣＣＤカメラ８８が設置される。照明用ＬＥＤ８７は、細胞接種カセット１９またはダミーカセット７０を上方から照明するものである。ＣＣＤカメラ８８は、細胞接種カセット１９またはダミーカセット７０内の細胞を下方から撮影して、その画像を取得するものである。これらの照明用ＬＥＤ８７の照明動作とＣＣＤカメラ８８の撮影動作は運転制御盤１３（図６）により制御され、所定時間（例えば６時間）毎に細胞接種カセット１９またはダミーカセット７０内の細胞の画像が取得される。各時間毎の細胞画像は、画像処理用コンピュータ１４の画像メモリ回路８９に記憶される。

前記画像処理用コンピュータ１４は、画像メモリ回路８９内に記憶された各時間毎の細胞画像を画像処理、例えば２値化処理や多値化処理して、単一細胞の投影面積の平均値と、単一細胞が凝集した細胞凝集塊である非単一細胞の増加速度とを細胞培養の評価パラメータとして算出する。単一細胞の投影面積の平均値（単一細胞の平均投影面積）は、細胞接種カセット１９を培養カセット１７に装着し、この培養カセット１７をキャニスタ１６内に収納して培養を開始した時から例えば２４時間経過後の細胞画像から算出する。

また、上述の非単一細胞であるか否かは、培養初期の単一細胞の投影面積が１００μｍ^２未満であることから、投影面積が１００μｍ^２以上の場合を非単一細胞と判断する。細胞の経時的な画像（例えば、培養開始から２４時間、４８時間、７２時間経過後の画像）から、全細胞に対する非単一細胞の割合の変化を演算して、非単一細胞の増加速度を算出する。

画像処理用コンピュータ１４は、単一細胞の平均投影面積からラグタイムを算出し、当該細胞の増殖開始時期を推定する。ここで、上記ラグタイムとは、細胞接種カセット１９の誘導因子刺激容器６５に細胞を接種してから増殖開始までに要する誘導期の時間である。画像処理用コンピュータ１４は、細胞の増殖開始時期から当該細胞の培養状況、つまり当該細胞が誘導因子の刺激により増殖の可能性があるか否かを判断する。そして、画像処理用コンピュータ１４は、当該細胞の判定結果（例えば、当該細胞が増殖する可能性がある場合には「ＹＥＳ」そうでない場合には「ＮＯ」等の信号）を運転制御盤１３に対して送信する。運転制御盤１３は、細胞接種カセット１９の誘導因子刺激容器６５内の細胞について増殖の可能性が著しく低いと判断した旨の信号を受けたときには、当該細胞について、その状態を表示する。尚、ラグタイムが長すぎる細胞は、誘導因子による刺激が著しく入り難い細胞であり、増殖の可能性が低いと判断される。

また、画像処理用コンピュータ１４は、非単一細胞の増加速度から当該細胞の最小倍化時間を算出する。ここで、倍化時間とは、ある時間における細胞の細胞数が倍の細胞数になるまでに要する時間をいう。画像処理用コンピュータ１４は、この最小倍化時間から当該細胞の培養状況、つまり当該細胞の増殖能力を判断して運転制御盤１３へ送信する。そして、画像処理用コンピュータ１４から信号を受けた運転制御盤１３は、上記細胞の増殖能力に基づいて、細胞接種カセット１９から培養バッグ１８へ細胞を移動させるタイミングや、培養バッグ１８へ培地を流加させる流加速度などを決定する。尚、最小倍化時間が長すぎる細胞は、増殖能力が著しく低い細胞であると判断される。

制御手段として機能する運転制御盤１３及び画像処理用コンピュータ１４は、図示しないが、演算や制御を実行するＣＰＵと、処理プログラムやデータを記憶する記憶装置（メモリ）と、データやコマンドなどを入力するためのキーボード、マウスまたはタッチパネルなどの入力装置やモニタなどの出力装置との接続を行う入出力回路とを有して構成される。更に、画像処理用コンピュータ１４にあっては、ＣＣＤカメラ８８からの画像データを記憶する画像メモリ回路８９を備える。

画像処理用コンピュータ１４の記憶装置には、ＣＣＤカメラ８８が所定時間毎に撮影した細胞接種カセット１９内の細胞の画像を画像処理（例えば２値化処理や多値化処理）して、細胞培養の評価パラメータ（単一細胞の平均投影面積、非単一細胞の増加速度）などを算出し、この細胞培養の評価パラメータから細胞の培養状況（細胞の増殖可能性、細胞の増殖能力）を判定するためのプログラムが記憶されている。

また、運転制御盤１３の記憶装置には、細胞の培養状況に応じて恒温槽１１、キャニスタ１６及び培養カセット１７に関する機器（例えば第１ポンプ４８、第２ポンプ４９など）を制御し、培養操作を実行するためのプログラムが記憶されている。更に、この運転制御盤１３の記憶装置には、ＣＣＤカメラ８８を所定時間毎に制御して細胞の画像を取得するなど、恒温槽１１、キャニスタ１６及び培養カセット１７の各種センサからの信号に基づいて、これらの恒温槽１１、キャニスタ１６及び培養カセット１７に関する機器を制御する機器制御用のプログラムも記憶されている。

次に、運転制御盤１３及び画像処理用コンピュータ１４が上記プログラムを実行して細胞を培養する工程を、図８〜図１１の工程図及び図１２〜図１７に示すフローチャートを用いて説明する。この細胞培養工程で、運転制御盤１３及び画像処理用コンピュータ１４は、恒温槽１１のキャニスタ１６毎に独立して培養環境を設定し制御して、各キャニスタ１６に収納された培養カセット１７における細胞を培養する。

図８乃至図１３は、誘導因子刺激間欠式灌流培養工程を示し、培養バッグ１８に細胞を回収する場合である。まず、図８（Ａ）及び図１２に示すように、操作者は、空の培養バッグ１８を載置台４６を介して培養バッグトレイ４７に載置し、この培養バッグトレイ４７をラージトレイ４５に装着し、培養バッグ１８を第１ポンプ４８、第２ポンプ４９及び第３ポンプ５０に接続する。

次に、操作者は、このラージトレイ４５を恒温槽１１の、表示灯４４が例えば緑色に点灯された単一のキャニスタ１６内に搬入し、そのステージ４２に支持させる。そして、操作者は、クリーンベンチ等内で誘導因子刺激容器６５に誘導因子を固層化し、培地を投入し、細胞を接種させた細胞接種カセット１９を、図８（Ｂ）に示すように、上記キャニスタ１６内の上記ラージトレイ４５に装着する。引き続き、操作者は、クリーンベンチ等内で培地バッグ６７に培地を投入した培地カセット２０を、上記キャニスタ１６内の上記ラージトレイ４５に装着する（図１２のＳ１）。

次に、操作者は、ラージトレイ４５に培養バッグ１８、細胞接種カセット１９及び培地カセット２０が装着された培養カセット１７を収納したキャニスタ１６におけるＣＣＤカメラ８８の画像出力を確認する（図１２のＳ２）。この画像出力確認の前または後に、操作者は当該キャニスタ１６の傾斜モータ７６を起動させて載置台４６の昇降部を下降させ、培養バッグ１８に液溜り部７８を形成しておく。更に操作者は、当該キャニスタ１６の重量計４３により、空の培養バッグ１８の重量を計測しておく。

その後、図９（Ａ）に示すように、操作者は、キャニスタドア３１を閉めて当該キャニスタ１６内で細胞の培養を開始させる（図１２のＳ３）。これにより、細胞接種カセット１９の誘導因子刺激容器６５において、増殖のために誘導因子により細胞が刺激される（図１２のＳ４）。当該キャニスタ１６のＣＣＤカメラ８８は、細胞接種カセット１９の誘導因子刺激容器６５内の細胞を所定時間（例えば６時間）毎に撮影し、画像処理用コンピュータ１４は、この撮像画像から細胞培養の評価パラメータを算出する。そして画像処理用コンピュータ１４は、この評価パラメータからラグタイムを算出して、当該細胞が誘導因子により刺激を受けて増殖の可能性があるか否か判定し、更に最小倍化時間を算出して、当該細胞の増殖能力を算出する（図１２のＳ５）。

運転制御盤１３は、画像処理用コンピュータ１４から、細胞が細胞接種カセット１９の誘導因子刺激容器６５内で誘導因子により刺激されてから所定時間（例えば７２時間）経過しても増殖の可能性が認められないと判断した信号を受けたときには、その旨を表示する。また、運転制御盤１３は、画像処理用コンピュータ１４から細胞接種カセット１９の誘導因子刺激容器６５内の細胞に増殖の可能性があると判断した信号を受けたときには、当該細胞の増殖能力に基づいて、当該細胞を培養バッグ１８へ移行するタイミングや、培養バッグ１８内への培地の流加速度などを決定する。運転制御盤１３は、この決定に基づき第１ポンプ４８を作動して、図９（Ｂ）に示すように、培地カセット２０の培地バッグ６７内の培地を細胞接種カセット１９へ流加させ、この細胞接種カセット１９の誘導因子刺激容器６５内の細胞を培養バッグ１８へ移行させると共に、培地バッグ６７内の培地を培養バッグ１８へ流加させる（図１２のＳ６）。

この第１ポンプ４８の作動により、培養バッグ１８の液溜り部７８内での細胞の静置培養が開始される（図１２のＳ７）。運転制御盤１３は、プログラムに従い、培地を流加しながら流加培養し、重量計４３により計測される培養バッグ１８内の培養液の重量が所定値ａ以上となったか否かを判断する（図１２のＳ８）。運転制御盤１３は、所定値ａ以上となった時点で傾斜モータ７６を起動させ、カム機構７９を介して載置台４６の昇降部を上昇させ、図１０（Ａ）に示すように、培養バッグ１８を水平状態として液溜り部７８を解消させる（図１２のＳ９）。

その後、運転制御盤１３は、重量計４３により計測される培養バッグ１８内の培養液の重量が所定値ｂ以上になったか否かを判断し（図１２のＳ１０）、所定値ｂ以上になった時点で作動モータ８１を起動させる。これにより、図１０（Ｂ）に示すように振盪装置８０が作動して、振盪装置８０の振盪機構９１における作動板８５が培養バッグ１８を繰り返し押圧する振盪培養を開始する（図１２のＳ１１）。運転制御盤１３は、引き続き、重量計４３により計測される培養バッグ１８内の培養液の重量が所定値ｃ以上となったか否かを判断し（図１２のＳ１２）、所定値ｃ以上となった時点で、第１ポンプ４８を停止して培地カセット２０の培地バッグ６７から培養バッグ１８への培地の流加を停止し、作動モータ８１を停止して、培養バッグ１８内での振盪培養を停止する（図１３のＳ１３）。

運転制御盤１３は、培養バッグ１８内で細胞が沈降した後に、第２ポンプ４９を作動させて、図１１（Ａ）に示すように、培養バッグ１８内の使用済み培地（培養バッグ１８内の上澄み）を培地カセット２０の使用済み培地バッグ６８へ排出する（図１３のＳ１４）。その後、運転制御盤１３は、第１ポンプ４８を起動して培地カセット２０の培地バッグ６７から培養バッグ１８へ培地を流加させ、作動モータ８１を起動して、振盪装置８０により培養バッグ１８内で振盪培養を実施する（図１３のＳ１５）。所定時間経過後、運転制御盤１３は、第１ポンプ４８を停止して培地カセット２０の培地バッグ６７から培養バッグ１８への培地流加を停止し、作動モータ８１を停止して培養バッグ１８内での振盪培養を停止する（図１３のＳ１６）。

運転制御盤１３が、増殖される細胞の使用日時に依存した所望の培養期間に至ったか否かを判断し、または、画像処理用コンピュータ１４が、培養バッグ１８内での細胞が所望の細胞数に至ったか否かを判断する（図１３のＳ１７）。培養バッグ１８内で細胞が所望の細胞数に至ったか否かの判断に際しては、運転制御盤１３は、第３ポンプ５０（図１１（Ａ））を起動させ、培養バッグ１８内の細胞の一部を細胞接種カセット１９またはダミーカセット７０（ほとんどの場合にはダミーカセット７０）へ移行させ、この細胞をＣＣＤカメラ８８に撮影させる。この細胞の画像を画像処理用コンピュータ１４が画像処理し、細胞数が規定値以上であるか否かを判断して運転制御盤１３へ送信する。そして、運転制御盤１３は、これらの培養期間または細胞数に至っていない場合には、ステップＳ１４〜Ｓ１７の処理動作を繰り返す。

上記ステップＳ１３〜Ｓ１７は、培養バッグ１８内で使用済みの培地の排出と、培養バッグ１８内への新しい培地の供給（流加）とを交互に実施する間欠式灌流培養である。

また、ステップＳ９〜Ｓ１７において、細胞接種カセット１９の誘導因子刺激容器６５内での細胞の有無はＣＣＤカメラ８８で確認され、運転制御盤１３は、誘導因子刺激容器６５内に細胞が存在しない場合には、この誘導因子刺激容器６５から培養バッグ１８内へ誘導因子が流入しないように、細胞接種カセット１９をダミーカセット７０に置き換えるよう操作者に促す。このダミーカセット７０への置き換えに際しては、運転制御盤１３は、培地カセット２０から培養バッグ１８への培地の流加と、振盪装置８０による振盪培養とを、ダミーカセット７０への置き換えが完了するまで一時中断させる。

更に、ステップＳ９〜Ｓ１７において、運転制御盤１３は、重量計４３の計測値から培地カセット２０の培地バッグ６７に培地が無くなったと判断した場合には、培地カセット２０を新しい培地カセット２０に交換するように操作者に促す。この新しい培地カセット２０への交換に際しても、運転制御盤１３は、培地カセット２０から培養バッグ１８への培地の流加と、振盪装置８０による振盪培養とを、培地カセット２０への交換が完了するまで一時中断させる。

運転制御盤１３は、ステップＳ１７において所望の培養期間に至り、または所望の細胞数に至った時点で、振盪を停止し、細胞沈降の後、図１１（Ｂ）に示すように第２ポンプ４９を起動させ、培養バッグ１８内の使用済み培地を培地カセット２０の使用済み培地バッグ６８へ排出して、重量計４３の計測値に基づき、培養バッグ１８内の培養液が約１／２〜１／３程度になるまで細胞を濃縮させる（図１２のＳ１８）。

運転制御盤１３は、その後第２ポンプ４９を停止して細胞培養を終了する（図１２のＳ１９）。この培養終了後に、操作者により培養バッグ１８内の細胞がクリーンベンチ等内で遠心分離機用の容器に移され、その後、遠心分離によって細胞が回収される（図１２のＳ２０）。

次に、同様な誘導因子刺激間欠式灌流培養工程において、細胞回収バッグ７２（図５）により細胞を回収する処理が含まれる場合を図１４及び図１５に示す。従って、この図１４及び図１５に示す工程のステップＳ２１〜Ｓ３８は、図１２及び図１３のステップＳ１〜Ｓ１８と同様であるため説明を省略する。

図１５に示すステップＳ３８において、第２ポンプ４９の起動により培養バッグ１８内の細胞が濃縮された後、運転制御盤１３は、第２ポンプ４９を停止し、培地カセット２０の使用済み培地バッグ６８を細胞回収バッグ７２（図５）に交換するように操作者に促す（図１３のＳ３９）。この細胞回収バッグ７２は、遠心分離機に装着されて遠心分離に使用され得るバッグである。

培地カセット２０の使用済み培地バッグ６８が細胞回収バッグ７２に交換された後、運転制御盤１３は、第２ポンプ４９及び作動モータ８１を起動させて、振盪装置８０により培養バッグ１８内を振盪させながら、この培養バッグ１８内の細胞を培地と共に、培地カセット２０に装着された細胞回収バッグ７２へ移行させる（図１５のＳ４０）。運転制御盤１３は、その後第２ポンプ４９及び作動モータ８１を停止して細胞培養を停止する（図１５のＳ４１）。この培養終了後に、操作者により細胞回収バッグ７２が遠心分離機に装着されて、遠心分離により細胞が回収される（図１５のＳ４２）。

次に、誘導因子刺激連続式灌流培養工程を、図１６及び図１７に基づいて説明する。この図１６及び図１７に示す誘導因子刺激連続式灌流培養工程におけるステップＳ５１〜Ｓ６２は、図１２及び図１３の誘導因子刺激間欠式灌流培養工程におけるステップＳ１〜Ｓ１２と同様であるため説明を省略する。この誘導因子刺激連続式灌流培養工程では、培養バッグ１８と第２ポンプ４９との間にフィルタ７１が配設されている。

運転制御盤１３は、培養バッグ１８内へ培地カセット２０の培地バッグ６７から培地が流加されて（図１６のＳ５６）、培養バッグ１８内での振盪装置８０による振盪培養中に（図１６のＳ６１）、培養バッグ１８内の培養液の重量が所定値ｃ以上となった時点で（図１６のＳ６２）第２ポンプ４９を起動させて、培養バッグ１８内の使用済み培地を培地カセット２０の使用済み培地バッグ６８へ排出させる。これにより、培養バッグ１８への培地の流加と培養バッグ１８からの使用済み培地の排出とを同時に実施する連続式灌流培養が培養バッグ１８内で開始される（図１７のＳ６３）。このとき、培養バッグ１８内の細胞は、フィルタ７１により流動が阻止されて使用済み培地バッグ６８内へ流動することがない。上記連続式灌流培養中には、振盪装置８０による振盪培養も同時に実施されている。

運転制御盤１３が、増殖される細胞の使用日時に依存した所望の培養期間に至ったか否かを判断し、または、画像処理用コンピュータ１４が、培養バッグ１８内での細胞が所望の細胞数に至ったか否かを判断する（図１７のＳ６４）。培養バッグ１８内で細胞が所望の細胞数に至ったか否かの判断に際しては、運転制御盤１３は、第３ポンプ５０を起動させ、培養バッグ１８内の細胞の一部を細胞接種カセット１９またはダミーカセット７０（ほとんどの場合にはダミーカセット７０）へ移行させ、この細胞をＣＣＤカメラ８８に撮影させる。この細胞の画像を画像処理用コンピュータ１４が画像処理し、細胞数が規定値以上であるか否かを判断して運転制御盤１３へ送信する。そして、運転制御盤１３は、これらの培養期間または細胞数に至っていない場合には、ステップＳ６３の連続式灌流培養を繰り返す。

ここで、ステップＳ５９〜Ｓ６４において、細胞接種カセット１９の誘導因子刺激容器６５内での細胞の有無はＣＣＤカメラ８８で確認され、運転制御盤１３は、誘導因子刺激容器６５内に細胞が存在しない場合には、この誘導因子刺激容器６５から培養バッグ１８内へ誘導因子が流入しないように、細胞接種カセット１９をダミーカセット７０に置き換えるよう操作者に促す。このダミーカセット７０への置き換えに際しては、運転制御盤１３は、培地カセット２０から培養バッグ１８への培地の流加と、振盪装置８０による振盪培養とを、ダミーカセット７０への置き換えが完了するまで一時中断させる。

また、ステップＳ５９〜Ｓ６４において、運転制御盤１３は、重量計４３の計測値から培地カセット２０の培地バッグ６７に培地が無くなったと判断した場合には、培地カセット２０を新しい培地カセット２０に交換するように操作者に促す。この新しい培地カセット２０への交換に際しても、運転制御盤１３は、培地カセット２０から培養バッグ１８への培地の流加と、振盪装置８０による振盪培養とを、培地カセット２０への交換が完了するまで一時中断させる。

運転制御盤１３は、ステップＳ６４における所望の培養期間に至り、または所望の細胞数に至った時点で、第１ポンプ４８、第２ポンプ４９及び作動モータ８１を停止させて、灌流培養及び振盪培養を停止させる（図１７のＳ６５）。

運転制御盤１３は、その後第２ポンプ４９を起動させ、培養バッグ１８内の使用済み培地を培地カセット２０の使用済み培地バッグ６８へ排出させ、重量計４３の計測値に基づき、培養バッグ１８内の培養液が約１／２〜１／３程度になるまで細胞を濃縮させる（図１７のＳ６６）。

運転制御盤１３は、その後第２ポンプ４９を停止して細胞培養を終了する（図１７のＳ６７）。この培養終了後に、操作者により培養バッグ１８内の細胞がクリーンベンチ等内で遠心分離機用の容器に移され、その後、遠心分離によって細胞が回収される（図１７のＳ６８）。

以上のように構成されたことから、上記実施の形態によれば、次の効果（１）〜（８）を奏する。
（１）ＣＣＤカメラ８８が撮像した細胞接種カセット１９内の細胞の画像を、画像処理用コンピュータ１４が画像処理して細胞培養の評価パラメータ（単一細胞の平均投影面積、非単一細胞の増加速度）を取得し、当該細胞の培養状況（細胞の増殖可能性及び増殖能力）を判定評価する。運転制御盤１３はこの培養状況に応じた培養操作（細胞接種カセット１９から培養バッグ１８への細胞移行のタイミングや、培地カセット２０から培養バッグ１８への所定流加速度での培地流加等）を実施する。この結果、細胞の培養状況を非接触・非侵襲状態で判定できるので当該細胞にダメージを与えることがなく、サンプリングによるコンタミネーションの危険性及び細胞の損失を回避できる。また、培養操作を操作者が逐次実施する必要がないので操作者の労力を軽減できる。更に、一患者の細胞を単一のキャニスタ１６内に収納される培養カセット１７の細胞接種カセット１９に接種させ、この細胞ごとに、細胞の培養状況に応じた培養操作を実施できるので患者ごとに適切な培養操作を実現でき、クロスコンタミネーションを回避できる。この細胞の培養状況に応じた適切な培養操作を実現できることで、時間単位での培養操作が可能となり、培養が促進されて培養期間を短縮できる。

（２）培地カセット２０がカセット構造に構成されて、培養バッグ１８、及び同じくカセット構造に構成された細胞接種カセット１９に接続されることから、特に培養バッグ１８を培養に最適な環境のキャニスタ１６内に常に保持できる。このため、環境変化に伴う培養バッグ１８内の細胞へのダメージを低減できると共に、クリーンベンチ等内で培養バッグ１８に培地を供給する無菌操作を省略できる。

（３）培地カセット２０、細胞接種カセット１９及び培養バッグ１８が接続されて閉鎖系に構成されたことから、これらの培地カセット２０、細胞接種カセット１９及び培地カセット２０を無菌状態に保持することができる。

（４）培養バッグ１８内での培養初期段階に、この培養バッグ１８の液溜り部７８内に培養液が貯溜されることから、面積当たりの細胞密度を増殖に好適な密度に維持することで、培養初期段階に細胞を効率よく増殖させることができる。

（５）培養バッグ１８内で増殖された細胞を細胞接種カセット１９またはダミーカセット７０内へ導き、この細胞の画像がＣＣＤカメラ８８により取得される場合には、培養バッグ１８内で増殖された細胞を画像として取得することでサンプリングすることなく、その細胞数や細胞の形態を観察することができる。

（６）培養バッグ１８内の使用済み培地が培地カセット２０の使用済み培地バッグ６８に排出されて貯溜されることから、培養バッグ１８内の細胞密度を高めて濃縮することができるので、細胞回収のための遠心分離操作回数を低減できる。この結果、細胞回収作業の省力化を実現できると共に、遠心分離に伴う細胞のダメージも低減できる。

（７）培養バッグ１８内で濃縮された細胞を、培地カセット２０に装着された細胞回収バッグ７２に全量回収させる場合には、この細胞回収バッグ７２を遠心分離機に直接装着して細胞を回収することができるので、細胞回収作業の省力化を実現できる。

（８）細胞が接種された培地を収容する可撓性の培養バッグ１８を、振盪装置８０の振盪機構９１における作動板８５の突出部８６が繰り返し押圧して、当該培養バッグ１８内の培養液を撹拌することから、この培養バッグ１８内の細胞の分布及び培地の成分濃度が均一化され、また酸素供給能も高くなることにより、細胞の増殖が促進されて、細胞の培養効率を向上させることができる。また、細胞は、振盪装置８０の作動板８５により繰り返し押圧されて撹拌された培養液内を浮遊するだけなので、ダメージを蒙ることが防止される。

［Ｂ］第２の実施の形態（図１８〜図２１）
図１８は、本発明に係る細胞培養用振盪装置の第２の実施の形態が適用された培養ユニット及び細胞培養装置の構成（分化誘導状態）を示すレイアウト図である。図１９は、図１８の培養ユニットの分化誘導前状態の構成を示すレイアウト図である。この第２の実施の形態において、前記第１の実施の形態と同様な部分は、同一の符号を付すことにより説明を省略する。

この第２の実施の形態の細胞培養装置１００は、第１の実施の形態の細胞培養装置１０における細胞接種カセット１９（図５）を、分化誘導因子が予め添加された分化誘導培養容器としての分化誘導カセット１０１に置き換えたものである。そして、この細胞培養装置１００では、培地カセット２０の培地バッグ６７から培養バッグ１８へ第２ポンプ４９の起動により培地を導いて細胞を増殖させた後に、この増殖した細胞を第１ポンプ４８の起動により分化誘導カセット１０１へ導いて当該細胞に役割を与える、つまり当該細胞を分化させる。ここで、分化とは、細胞に心臓の細胞としての役割を持たせたり、肝臓の細胞としての役割を持たせたりすること等である。培養バッグ１８にて増殖された細胞を分化誘導カセット１０１にて分化させる前までは、図１９に示すように、この分化誘導カセット１０１の代わりにダミーカセット１０２が配置されて、培養バッグ１８内の使用済み培地が、第１ポンプ４８の起動によりダミーカセット１０２を経て培地カセット２０の使用済み培地バッグ６８へ排出される。上記ダミーカセット１０２は、ダミーカセット７０（図５）と同様に、単に培地を流動させるための流路として機能する。

この第２の実施の形態では、図１８に示すように、分化誘導カセット１０１内で分化されている細胞の画像をＣＣＤカメラ８８が所定時間ごとに撮影する。この撮影を実行するためのプログラムが、運転制御盤１３の記録装置に記憶されている。画像処理用コンピュータ１４は、この細胞の画像を例えば２値化処理や多値化処理して、細胞の形態を評価パラメータとして取得する。この評価パラメータの取得を実行するためのプログラムが画像処理用コンピュータ１４の記録装置に記憶されている。画像処理用コンピュータ１４は、細胞の形態の経時的変化から当該細胞が分化されたか否かを判定する。画像処理用コンピュータ１４からの信号を受けた運転制御盤１３は、この分化誘導カセット１０１による分化誘導操作を制御する。例えば運転制御盤１３は、画像処理用コンピュータ１４が、当該細胞に分化の可能性があると判断した場合には分化誘導操作を継続し、そうでない場合には、その旨を表示する。上述の分化の判定を実行するためのプログラムが画像処理用コンピュータ１４の記録装置に記録され、分化誘導操作を実行するためのプログラムが、運転制御盤１３の記録装置に記憶されている。

次に、上記細胞培養装置１００による分化誘導間欠式灌流培養工程を、図２０及び図２１を用いて説明する。

まず、操作者は、クリーンベンチ等内で培養バッグ１８に培地及び細胞を添加し（図２０のＳ７１）、この培養バッグ１８を載置台４６を介して培養バッグトレイ４７に載置し、この培養バッグトレイ４７をラージトレイ４５に取り付ける（図２０のＳ７２）。そして、操作者は、このラージトレイ４５を恒温槽１１の、表示灯４４が例えば緑色に点灯された単一のキャニスタ１６内に搬入する。

次に、操作者は、上記キャニスタ１６内のラージトレイ４５に培地カセット２０を装着し、ダミーカセット１０２（図１９）を装着する（図２０のＳ７３）。そして、操作者により上記キャニスタ１６のキャニスタドア３１が閉じられて、培養バッグ１８内での細胞の静置培養が開始される（図２０のＳ７４）。この静置培養に際し、当初培養バッグ１８内に培養液が少ない場合には、操作者は、傾斜モータ７６を起動させて載置台４６の昇降部を下降させ、培養バッグ１８に液溜り部７８（図８）を形成しておく。

静置培養開始後、運転制御盤１３は、第２ポンプ４９を起動させて、培地カセット２０の培地バッグ６７からの培地を培養バッグ１８へ流加させる（図２０のＳ７５）。運転制御盤１３は、培養バッグ１８内の培養液が所定値ａ以上となったか否かを、重量計４３の計測値から確認し（図２０のＳ７６）、重量計の計測値が上記所定値ａ以上となった場合に、傾斜モータ７６を起動させて載置台４６の昇降部を上昇させ、培養バッグ１８を水平状態として液溜り部７８を解消する（図２０のＳ７７）。

その後、運転制御盤１３は、重量計４３により計測される培養バッグ１８内の培養液の重量が所定値ｂ以上になったか否かを判断し（図２０のＳ７８）、所定値ｂ以上になった時点で作動モータ８１を起動させ、振盪装置８０を作動させて振盪培養を開始する（図２０のＳ７９）。運転制御盤１３は、引き続き、重量計４３により計測される培養バッグ１８内の培養液の重量が所定値ｃ以上となったか否かを判断し（図２０のＳ８０）、所定値ｃ以上となった時点で、第２ポンプ４９を停止して、培地カセット２０の培地バッグ６７から培養バッグ１８への培地の流加を停止し、作動モータ８１を停止して、培養バッグ１８内での振盪培養を停止する（図２０のＳ８１）。

運転制御盤１３は、培養バッグ１８内で細胞が沈降した後に、第１ポンプ４８を作動させて、培養バッグ１８内の使用済み培地（培養バッグ１８内の上澄み）を培地カセット２０の使用済み培地バッグ６８へ排出する（図２１のＳ８２）。その後、運転制御盤１３は第２ポンプ４９を起動して、培地カセット２０の培地バッグ６７から培養バッグ１８へ培地を流加させ、作動モータ８１を起動して、振盪装置８０により培養バッグ１８内で振盪培養を実施する（図２１のＳ８３）。所定時間経過後、運転制御盤１３は、第２ポンプ４９を停止して、培地カセット２０の培地バッグ６７から培養バッグ１８への培地の流加を停止し、作動モータ８１を停止して培養バッグ１８内での振盪培養を停止する（図２１のＳ８４）。

運転制御盤１３が、増殖される細胞の使用日時に依存した所望の培養期間に至ったか否かを判断し、または、画像処理用コンピュータ１４が、培養バッグ１８内での細胞が所望の細胞数に至ったか否かを判断する（図２１のＳ８５）。培養バッグ１８内で細胞が所望の細胞数に至ったか否かの判断に際しては、運転制御盤１３は、第３ポンプ５０を起動させ、培養バッグ１８内の細胞の一部をダミーカセット１０２へ移行させ、この細胞をＣＣＤカメラ８８に撮影させる。この細胞の画像を画像処理用コンピュータ１４が画像処理し、細胞数が規定値以上であるか否かを判断して運転制御盤１３へ送信する。運転制御盤１３は、これらの培養期間または細胞数に至っていない場合には、ステップＳ８２〜Ｓ８５の操作を繰り返す。

上記ステップＳ８１〜Ｓ８５は、培養バッグ１８内で使用済みの培地の排出と、培養バッグ１８内への新しい培地の供給（流加）とを交互に実施する間欠式灌流培養である。

ここで、ステップＳ７７〜Ｓ８５において、運転制御盤１３は、重量計４３の計測値から培地カセット２０の培地バッグ６７に培地が無くなったと判断した場合には、培地カセット２０を新しい培地カセットに交換するように操作者に促す。この新しい培地カセット２０への交換に際しても、運転制御盤１３は、培地カセット２０から培養バッグ１８への培地の流加と、振盪装置８０による振盪培養とを、培地カセット２０の交換が完了するまで一時中断させる。運転制御盤１３は、ステップＳ８５において所望の培養期間に至り、または所望の細胞数に至った時点で、第１ポンプ４８を起動させ、培養バッグ１８内の使用済み培地を培地カセット２０の使用済み培地バッグ６８へ排出して、重量計４３の計測値に基づき、培養バッグ１８内の培養液が約１／２〜１／３程度になるまで細胞を濃縮させる（図２１のＳ８６）。

その後、運転制御盤１３により第１ポンプ４８が停止された後に、操作者は、図１８に示すように、ダミーカセット１０２を分化誘導カセット１０１に交換する（図２１のＳ８７）。

分化誘導カセット１０１への交換完了後に、運転制御盤１３は、第２ポンプ４９を起動して、培地カセット２０の培地バッグ６７内の培地を培養バッグ１８へ流加させ、作動モータ８１を起動して培養バッグ１８内を振盪装置８０により振盪培養させる（図２１のＳ８８）。次に、運転制御盤１３は、第１ポンプ４８を起動して、培養バッグ１８内での振盪培養及び培地カセット２０からの培地の流加を継続しながら、培養バッグ１８内の培養液を分化誘導カセット１０１へ移動させる（図２１のＳ８９）。これにより、この分化誘導カセット１０１内で分化誘導培養が開始される（図２１のＳ９０）。

運転制御盤１３は、上記分化誘導培養中に、分化誘導カセット１０１内の細胞をＣＣＤカメラ８８により所定時間（例えば６時間）毎に撮影する。画像処理用コンピュータ１４は、この撮像画像を画像処理し、細胞の形態を評価パラメータとして取得し、この細胞の形態の経時的変化から、当該細胞が分化誘導カセット１０１内で分化されたか否かを判断する（図２１のＳ９１）。

運転制御盤１３は、ステップＳ９１で画像処理用コンピュータ１４から細胞が分化されたと判断した信号を受けたときに、第２ポンプ４９、第１ポンプ４８及び作動モータ８１を停止して、分化誘導培養を停止し、細胞培養を終了する（図２１のＳ９２）。この培養終了後に、操作者は、クリーンベンチ等内での細胞回収操作により、分化誘導カセット１０１内の細胞を回収する。（図２１のＳ９３）。

以上のように構成されたことから、上記第２の実施の形態によれば、前記第１の実施の形態の効果（２）〜（６）及び（８）と同様な効果（但し、細胞接種カセット１９を分化誘導カセット１０１に置き換える）を奏する他、次の効果（９）を奏する。

（９）分化誘導カセット１０１内の細胞の画像を画像処理して細胞培養の評価パラメータ（細胞の形態）を取得し、当該細胞の培養状況（細胞が分化されたか否か）を判定し、この培養状況に応じた培養操作（培地カセット２０から培養バッグ１８への所定流加速度での培地流加や培養バッグ１８から分化誘導カセット１０１への細胞移行のタイミング等）を実施することから、細胞の培養状況を非接触・非侵襲状態で判定できるので、当該細胞にダメージを与えることがなく、サンプリングによるコンタミネーションの危険性及び細胞の損失を回避でき、また、操作者の労力を軽減できる。更に、一患者の細胞を単一のキャニスタ１６内に収納される培養カセット１７の培養バッグ１８にて増殖させ、分化誘導カセット１０１において分化させるので、患者ごとに細胞の培養を適切に実施でき、クロスコンタミネーションを回避できる。

また、上記第１及び第２の実施の形態における細胞培養装置１０及び１０２によれば、
次の効果（１０）を奏する。
（１０）細胞培養装置１０及び１００は、共に、異なる培養環境で細胞を培養する複数の培養容器のうち、一の培養容器で培養された細胞が、下流側の他の培養容器へ移行されている。つまり、細胞培養装置１０では、一の培養容器である細胞接種カセット１９にて増殖のために誘導因子により細胞を刺激し、その後、この細胞接種カセット１９から他の培養容器である培養バッグ１８へ上記細胞を移行して、当該細胞を増殖させている。また、細胞培養装置１００では、一の培養容器である培養バッグ１８にて細胞を増殖した後に、この培養バッグ１８から他の培養容器である分化誘導カセット１０１へ上記細胞を移行して、当該細胞を分化させている。このように、細胞培養装置１０及び１００によれば、細胞の培養形態のバリエーションを拡大することができる。

以上、本発明を上記実施の形態に基づいて説明したが、本発明はこれに限定されるものではない。
例えば、第１、第２の実施の形態では、画像処理用コンピュータ１４がＣＣＤカメラ８８の画像を画像処理して評価パラメータを算出し、当該評価パラメータから細胞の培養状況（細胞の増殖可能性、細胞の増殖能力）を判定するものを述べたが、この画像処理用コンピュータ１４の機能を運転制御盤１３が実施してもよい。また、ＣＣＤカメラ８８による細胞画像の撮影は、培養バッグ１８において実施してもよい。更に、誘導因子刺激連続式灌流培養工程（図１６及び図１７）において、振盪装置８０による振盪培養を実施しない場合には、第２ポンプ４９と培養バッグ１８との間にフィルタ７１を配設しなくてもよい。

また、第１、第２の実施の形態では、運転制御盤１３及び画像処理用コンピュータ１４が１つの恒温槽内の各キャニスタについて制御するものを述べたが、同様な恒温槽が複数個あり、これらの恒温槽の各キャニスタについて、運転制御盤１３及び画像処理用コンピュータ１４が制御を実行しても良い。

［Ｃ］第３の実施の形態（図２２〜図３４）
図２２は、本発明に係る細胞培養用振盪装置の第３の実施の形態が適用された培養ユニット及び細胞培養装置を示す構成図である。図２３は、第３の実施の形態に係る細胞培養装置２００における一つの空間的に独立した培養室２４０と低温室２３０、この培養室２４０内に収納される培養バッグトレイ２４１と低温室２３０に収納される培地バッグトレイ２３１、廃液バッグトレイ２３２からなる培養ユニット２１２の構成を示すレイアウト図である。

図２２に示す細胞培養装置２００は、特に、免疫細胞療法に用いられる浮遊系細胞を培養するものであり、複数個（例えば３個）の培養ユニット２１２を備えた培養装置２１０と、この複数個の培養ユニット２１２の運転を制御する運転制御用ＰＬＣ（プログラマブル・ロジック・コントローラ）２２３と、細胞の画像を処理するための画像処理用ユニット２２１と、全てのデータを収集するデータ収集装置２２４と、運転制御用ＰＬＣ２２３と画像処理用ユニット２２１の情報表示および制御入力するタッチパネル２２２と、ハブ２２５を介して運転制御用ＰＬＣ２２３、画像処理用ユニット２２１、データ収集装置２２４に接続されて、細胞培養装置２００及び培養ユニット２１２を監視するための監視用コンピュータ２２６と、を有して構成される。上記運転制御用ＰＬＣ２２３及び画像処理用ユニット２２１が制御手段として機能する。複数個の培養ユニット２１２はそれぞれ観察用カメラ（ＣＣＤカメラ）３０２を備えている。

ここで、上記浮遊系細胞としては、末梢血単核球、ＬＡＫ細胞（Ｌｙｍｐｈｏｋｉｎｅ Ａｃｔｉｖａｔｅｄ Ｋｉｌｌｅｒ細胞）、神経幹細胞、ＥＳ細胞などが知られている。これらの浮遊系細胞を以下単に細胞と称する。本細胞培養装置２００は、上記浮遊系細胞以外の接着依存性細胞（例えば、間葉系幹細胞）を培養する場合にも適用可能である。

上記細胞培養装置２００は、空間的・構造的に独立した複数個（例えば３個）の培養ユニット２１２が積み重ねられた構造で、各培養ユニット２１２は図２３に示すように低温室２３０と培養室２４０に分離される。この細胞培養装置２００内には、培養バッグトレイ２４１、培地バッグトレイ２３１及び、廃液バッグトレイ２３２が収納されている。培養バッグトレイ２４１には、後に詳説するように、抗体刺激及び増殖用培養容器としての培養バッグ２４２が載置され、培地バッグトレイ２３１、及び廃液バッグトレイ２３２には、培地貯溜手段としての培地バッグ（新培地バッグ）２３３および廃液貯溜手段としての廃液バッグ（廃培地バッグ）２３４がそれぞれ載置される。

上記培養ユニット２１２は、培養室２４０および低温室２３０に開閉可能なドア（不図示）を備えている。この培養ユニット２１２は、ドアを閉じた状態で、培養室２４０内の環境（温度及びＣＯ２濃度）を、細胞を培養するために必要な環境に維持し、低温室２３０内の環境（温度）を、培地保存に最適な環境に維持する。

このため、培養ユニット２１２には、温度センサ２３６、２４３、ＣＯ２センサ２４４、ドアセンサ（不図示）及びヒータ（不図示）が配設されている。更に細胞培養装置２００（培養ユニット２１２）には、ＣＯ２供給系２４５を経由して、外部に設置されたガスボンベ（不図示）が連結される。温度センサ２３６、２４３、ＣＯ２センサ２４４及びドアセンサからの信号は、運転制御用ＰＬＣ２２３へ送信される。この運転制御ＰＬＣ２２３は、温度センサ２３６、２４３からの温度信号に基づいてヒータを制御し、ＣＯ２センサ２４４からのＣＯ２濃度信号に基づいて、ガスボンベから各培養ユニット２１２内へ供給されるＣＯ２ガス量を制御する。室内のＣＯ２は循環ポンプ２４６により、あらかじめ定めた一定量ずつ排出される。

攪拌ファン２４７の運転は運転制御用ＰＬＣ２２３により制御され、培養ユニット２１２のドアが開いた旨の信号がドアセンサから運転制御用ＰＬＣ２２３へ送信された際に、攪拌ファン２４７の運転が停止されて、培養ユニット２１２内の環境変化が緩和される。

この細胞培養装置２００は乾熱滅菌機能を有しており、培養バッグトレイ、培地バッグトレイ、廃液バッグトレイをそれぞれセットした状態で、装置内の滅菌及び各トレイを滅菌することが可能であり、培養ユニット２１２内での細菌増殖を防止することができる。また、各培養ユニット２１２がそれぞれ独立した空間構造でできているため、他の培養ユニット２１２内の細胞に対して隔離されると共に、培養ユニット２１２に収納される培養バッグ２４２、培地バッグ２３３、廃液バッグ２３４は、クリーンベンチ等内で接続された後、培養ユニット２１２に設置されるため、この培養ユニット２１２に収納される培養バッグ２４２は閉鎖系（非開放系）に確保され、培養バッグ２４２内の細胞が雑菌によって汚染されるコンタミネーションが防止される。

培養ユニット２１２には、更にドアセンサ（不図示）、ドアロックセンサ（不図示）、温度センサ２３６、２４３、ドアロック機構（不図示）、ヒータ（不図示）及び攪拌ファン２４７が配設されている。運転制御用ＰＬＣ２２３は、温度センサ２３６、２４３からの温度信号に基づいてヒータを制御する。また、運転制御用ＰＬＣ２２３は、攪拌ファン２４７の運転を制御して、培養室２４０内で空気及びＣＯ２ガスを循環させる。このようにして、培養室２４０内は細胞を培養するための最適な環境に保持される。

また、運転制御用ＰＬＣ２２３は、一つの細胞培養装置２００において２以上の培養ユニット２１２のドアが同時に開動作を行うことがないようにドアロック機構の動作を制御する。これにより、異なる培養ユニット２１２間で細胞や培地などが取り違えて搬入されることが防止される。このドアロック機構のロック動作はドアロックセンサにより検出されて、運転制御用ＰＬＣ２２３へ送信される。また、培養ユニット２１２のドアの開閉状態はドアセンサによって検出されて、運転制御用ＰＬＣ２２３へ送信される。

図２３に示す培養ユニット２１２内の下部には、培養室２４０内に収納される培養バッグトレイ２４１を支持するフレーム２５０が設けられ、このフレーム２５０を培養ユニット２１２上部に設置した重量計２５１が支持して設置される。この重量計２５１は、培養室２４０内に収納された培養バッグトレイ２４１の培養バッグ２４２の重量を計測するものであり、実際には、培地バッグ２３３から培養バッグ２４２へ供給される培地量を計測するのと、培養バッグ２４２から廃液バッグ２３４に排出される廃液量を計測する。この重量計２５１の計測値も運転制御用ＰＬＣ２２３へ送信される。また、培養ユニット２１２本体には、培養ユニット２１２内の培養バッグ２４２の有無を表示する表示灯（不図示）が設けられる。運転制御用ＰＬＣ２２３は、培養室２４０内に培養バッグ２４２が収納されているときに、表示灯を、例えば赤色点灯させ、培養室２４０内に培養バッグ２４２が収納されていないときに、表示灯を例えば緑色点灯させる。

ここで、上記培養バッグトレイ２４１について説明する。
この培養バッグトレイ２４１は、図２３に示すように培養バッグ２４２が装着されたものであり、培養バッグ２４２が細胞を培養する培養容器である。この培養バッグ２４２は、細胞に機能を発現させる（例えば細胞を増殖させる、細胞を分化させる等）ための機能発現用培養容器であり、本実施形態では、増殖のために抗体により細胞を刺激する抗体刺激用培養容器である。また、同一の培養バッグ２４２において抗体により刺激された細胞を増殖するための増殖用培養容器でもある。

培養バッグ２４２は、細胞が接種された培地を収容する可撓性の容器であり、載置台２５２を介して、培養バッグトレイ２４１に載置される。上記培養バッグ２４２は、例えば酸素透過性材質からなるバッグである。

ここで、培養ユニット２１２について説明する。
培養室２４０には、図２３に示すように、供給ポンプ２６１、排出ポンプ２７１が配置される。培養バッグ２４２は、一端側がチューブ２６２を用いて供給ポンプ２６１を経て供給系継ぎ手２６４に接続される。また、培養バッグ２４２の他端側は、チューブ２７２を用いて排出ポンプ２７１を経て排出系継ぎ手２７４に接続される。

この培養ユニット２１２では、培養バッグ２４２は、チューブ２６２により供給系継ぎ手２６４に接続されると共に、チューブ２６５により培地バッグ２３３に接続される。また、培養バッグ２４２は、チューブ２７２を介して排出系継ぎ手２７４に接続されると共に、チューブ２７５により廃液バッグ２３４に接続される。

上記培養バッグ２４２は、図２３に示すように、培養バッグ２４２の供給ポンプ２６１に接続される一部底面内側に抗体を固層化し、この培養バッグ２４２に培地を投入し、この培地に細胞を接種し、この培養バッグ２４２を培養バッグトレイ２４１に設置して、カセット構造に構成したものである。上記培養バッグ２４２に抗体を固層化し、培地及び細胞を入れる作業は、クリーンベンチ等内で無菌状態で実施される。

上記培養バッグ２４２において一部抗体を固層化したことにより、つまり細胞を抗体により刺激して当該細胞に増殖機能を発現させるための培養環境と、細胞を増殖するための培養環境を同一培養バッグ２４２で作り出すことができる。従って、培養バッグ２４２の一部で抗体により刺激され、増殖を開始し始めた細胞に、培地を供給することで効率よく同一の培養バッグ２４２で増殖を実施させることが可能となる。

前記培地バッグトレイ２３１、及び廃液バッグトレイ２３２には、培地貯溜容器としての培地バッグ２３３、及び使用済み培地貯溜容器としての廃液バッグ２３４がそれぞれ載置されて、カセット構造に構成される。上記培地バッグ２３３は、培養バッグ２４２へ供給される培地を貯溜するものである。また、上記廃液バッグ２３４は、培養バッグ２４２から排出される使用済み培地（上澄み）を貯溜するものである。培地バッグトレイ２３１がカセット構造に構成されたことにより、培養バッグ２４２を培養室２４０内に維持した状態で、当該培養ユニット２１２内の低温室２３０に培地バッグトレイ２３１を装着するだけで培地の交換、供給が可能となる。

上記培養バッグトレイ２４１は、培養ユニット２１２に着脱可能に装着される。このときには、培養バッグ２４２の供給系継ぎ手２６４は、培地バッグ２３３の継ぎ手に、排出系継ぎ手２７４は廃液バッグ２３４の継ぎ手にそれぞれに無菌的に結合される。つまり、供給系継ぎ手２６４と培地バッグ２３３の継ぎ手は、例えば一方のゴム状結合部に他方の針状結合部が差し込まれることで無菌的に結合される。排出系継ぎ手２７４と廃液バッグ２３４との結合についても同様である。上記培養バッグ２４２と、培地バッグ２３３及び廃液バッグ２３４と、を結合させる作業は、クリーンベンチ等内で無菌状態で実施される。

培養バッグ２４２、培地バッグ２３３および廃液バッグ２３４が上述のように接続されることで、培地バッグトレイ２３１における培地バッグ２３３内の培地が供給ポンプ２６１の起動により培養バッグ２４２へ供給され、この培養バッグ２４２内の使用済み培地が排出ポンプ２７１の起動により廃液バッグトレイ２３２の廃液バッグ２３４へ排出されるという閉ループが構成される。この閉ループの構成により、当該系統（培養バッグ２４２、培地バッグ２３３、廃液バッグ２３４）が無菌状態に保持される。

培養バッグ２４２内での培養（細胞増殖）には、供給ポンプ２６１を起動させて、培地バッグトレイ２３１の培地バッグ２３３内の培地を培養バッグ２４２へ供給（流加）することで細胞を増殖させる静置培養（単純流加）と、供給ポンプ２６１及び排出ポンプ２７１を起動させて、培養バッグ２４２内の使用済み培地を廃液バッグトレイ２３２の廃液バッグ２３４へ排出し、且つ培地バッグ２３３内の培地を培養バッグ２４２へ供給することで細胞を増殖させる灌流培養と、後述の振盪装置２９０を用いた振盪培養と、がある。このうち灌流培養には、使用済み培地の排出と培地の供給とを交互に実施する間欠式灌流培養と、使用済み培地の排出と培地の供給とを同時に実施する連続式灌流培養とがある。この連続式灌流培養では、通常、培養バッグ２４２と排出ポンプ２７１との間のチューブ２７２に細胞の移動を阻止するフィルタが配設されて、培養バッグ２４２内の細胞が廃液バッグ２３４へ排出されることが防止される。

上記廃液バッグトレイ２３２の廃液バッグ２３４へは、培養バッグ２４２における細胞の増殖終了後に、培養バッグ２４２内の使用済み培地が排出されて、この培養バッグ２４２内の細胞が濃縮される。この使用済み培地の排出は排出ポンプ２７１の起動により実施され、重量計２５１の計測値に基づき運転制御用ＰＬＣ２２３の制御によって、培養バッグ２４２内の培地及び細胞の容量が約１／２〜１／３程度になるまで実施される。この培養バッグ２４２内での細胞の濃縮により、その後に実施される遠心分離機による遠心分離回数が低減される。

また、廃液バッグトレイ２３２では、培養バッグ２４２における細胞が上述のように濃縮された後に、廃液バッグ２３４を、遠心分離機に装着可能な細胞回収容器としての細胞回収バッグに置き換え、この細胞回収バッグ内へ、培養バッグ２４２内で細胞が濃縮された培養液（培地及び細胞）を、排出ポンプ２７１の起動により供給してもよい。この場合には、チューブ２７２にフィルタが配設されていないことが条件となる。これにより、遠心分離機に装着可能なバッグでの細胞の回収を、閉鎖系空間である培養ユニット２１２内で実施でき、細胞の回収作業が省力化される。

ここで、図２３に示すように、培養ユニット２１２内には培養バッグトレイ２４１が収納され、この培養バッグトレイ２４１が培養室２４０のフレーム２５０に支持されるが、この培養バッグトレイ２４１上で培養バッグ２４２を直接載置する載置台２５２は、昇降しないパーツ２５２ａと、昇降可能な複数の連結した面積変化パーツ２５２ｂ、２５２ｃと、により構成される。これらの面積変化パーツ２５２ｂ、２５２ｃにより培養バッグ２４２の培養面積を制御することができる。また、培養バッグトレイ２４１の面積変化パーツ２５２ｂ、２５２ｃが配置される下方位置には傾斜モータ（昇降機構）２８０、カム機構２８１及び位置決めセンサ（不図示）が設置されている。上記傾斜モータ２８０はカム機構２８１を回動させて、載置台２５２の上記面積変化パーツ２５２ｂ、２５２ｃを互いに別個独立に昇降させる。この昇降部の位置が位置決めセンサにより検出されて、運転制御用ＰＬＣ２２３へ送信される。傾斜モータ２８０は運転制御用ＰＬＣ２２３により制御され、培養バッグ２４２における培養初期段階で、載置台２５２の面積変化パーツ２５２ｂ、２５２ｃを下降させるよう制御される。これにより、培養バッグ２４２の面積変化パーツ２５２ｂ、２５２ｃに対応する部分に液溜り部が形成される。例えば、図２４に示した載置台２５２は面積変化パーツ２５２ｂ、２５２ｃの高さをそれぞれ上下させることで培養面積を３段階に変化させることができる。なお、面積変化パーツは３以上設けても良く、これにより培養面積の調整をより微細に行うことができる。ここで、図２４は、図２３の載置台２５２の構成を示す斜視図である。

培養バッグ２４２における培養初期段階で細胞および培地が液溜り部に貯溜されることにより、抗体刺激に好適な培養条件、すなわち培養バッグ２４２内の細胞密度が増殖に好適な密度に保持される。また培養バッグ２４２内に培地及び細胞が所定量以上になる培養中期及び後期には、傾斜モータ２８０がカム機構２８１を介して載置台２５２の面積変化パーツ２５２ｂ、２５２ｃを上昇させ、培養バッグ２４２を所定の面積のパーツだけを水平状態とすることにより上記液溜り部の面積を変化させる。培養の進行に合わせて、細胞及び培地の液溜り部の面積を変化させることにより、培養バッグ２４２内の面積当たりの細胞密度が増殖に好適な密度に保持されて、細胞増殖段階に細胞が効率的に増殖される。

例えば、図２４に示すように載置台２５２が液溜まりを２段形成可能な場合、まず一番低い図２４の面積変化パーツ２５２ｃの部分に培地と細胞を保持し、細胞の密度が低くならないようにする。細胞が増殖を開始して培地量を増やした際には図２４の面積変化パーツ２５２ｃの高さを１段階上げて面積変化パーツ２５２ｂと面積変化パーツ２５２ｃを同じ高さにすることで、培養可能な培養バッグ２４２の面積を一定量拡大する。これにより、再度増殖に好適な細胞密度を一定時間保持することができる。さらに細胞が増殖して培地量を増やした際には面積変化パーツ２５２ｂと面積変化パーツ２５２ｃの高さをさらに一段階上げてパーツ２５２ａと同じ高さにし、培養バッグ２４２全体で培養することができるようにする。

更に培養室２４０内には、図２３に示すように、培養バッグトレイ２４１の培養バッグ２４２が配置される上方位置に振盪装置２９０の振盪機構２９１が押圧手段として設置される。この振盪装置２９０は、上記振盪機構２９１、作動モータ２９２、カム機構２９３及び位置決めセンサ（不図示）を有する。振盪機構２９１は、図２３に示すように、装置フレーム２５０に、ガイドロッド２５０ａを介して、押圧手段としての作動板２９１ａが上下移動自在に配設され、この作動板２９１ａの底面に複数の突出部２９１ｂが突設されたものである。作動板２９１ａが作動モータ２９２により、カム機構２９３の作用で上方または下方に交互に移動されることで、この作動板２９１ａの突出部２９１ｂが、振盪機構２９１の下方に位置する培養バッグ２４２を繰り返し押圧、つまり培養バッグ２４２に対し押圧と押圧解除を繰り返す。これにより、培養バッグ２４２内の培地が攪拌されて、培養バッグ２４２内の細胞が培地内で浮遊して移動し、この培養バッグ２４２内での細胞分布及び酸素濃度分布が均一化され、細胞の増殖が促進される。

また、図２３に示すように、上記位置決めセンサにより作動板２９１ａの位置が検出されて運転制御用ＰＬＣ２２３へ送信され、かつ重量計２５１の計測値がこのＰＬＣ２２３により作動モータ２９２が制御される。上記振盪装置２９０を用いた培養バッグ２４２内での細胞培養（振盪培養）は、培養バッグ２４２内に培地及び細胞が一杯程度に満たされる前に実施されてもよく、または一杯程度に満たされた後に実施されてもよい。この振盪装置２９０は、作動版の検出位置及び重量計２５１の計測値に基づいて、運転制御用ＰＬＣ２２３により制御される。

また、培養室２４０内には、図２３に示すように、培養バッグ２４２の抗体を固層化した部位が配置される位置の上方に照明ランプ３０１が、下方に画像取得手段としてのＣＣＤカメラ３０２が設置される。ＣＣＤカメラ３０２には、観察形態などに応じて、レンズ、プリズム、鏡筒その他の光学機器を追加使用する。照明ランプ３０１は、培養バッグ２４２を上方から照明するものである。ＣＣＤカメラ３０２は、培養バッグ２４２内の細胞を下方から撮影して、その画像を取得するものである。これらの照明ランプ３０１の照明動作とＣＣＤカメラ３０２の撮影動作は運転制御用ＰＬＣ２２３により制御され、所定時間（例えば６時間）毎に培養バッグ２４２内の細胞の画像が取得される。所定時間毎の細胞画像は画像処理用ユニット２２１の画像メモリ回路（不図示）に記憶される。

前記画像処理用ユニット２２１は、画像処理用ユニット２２１の画像メモリ回路内に記憶された所定時間毎の細胞画像を画像処理、例えば２値化処理や多値化処理して、単一細胞の投影面積の平均値と、単一細胞が凝集した細胞凝集塊である非単一細胞の増加速度とを細胞培養の評価パラメータとして算出する。単一細胞の投影面積の平均値（単一細胞の平均投影面積）は、培養バッグトレイ２４１に培養バッグ２４２を装着し、この培養バッグトレイ２４１を培養室２４０内に収納して培養を開始した時から例えば２４時間経過後の細胞画像から算出する。

また、上述の非単一細胞であるか否かの判断は投影面積が１００μｍ^２を基準として、１００μｍ^２以上の場合を非単一細胞と判断し、１００μｍ^２以下のものを単一細胞と判断している。これは、培養初期の単一細胞の投影面積を測定した結果、すべて１００μｍ^２以下であったためである。細胞の経時的な画像（例えば、培養開始から２４時間、４８時間、７２時間経過後の画像）から、全細胞に対する非単一細胞の割合の変化を演算して、非単一細胞の増加速度を算出する。この非単一細胞の増加速度と上記単一細胞の平均投影面積は、画像処理用ユニット２２１から運転制御用ＰＬＣ２２３へ出力される。

運転制御用ＰＬＣ２２３は、単一細胞の平均投影面積からラグタイムを算出し、当該細胞の増殖開始時期を推定する。ここで、上記ラグタイムとは、培養バッグトレイ２４１の抗体固層部に細胞を接種してから増殖開始までに要する誘導期の時間である。運転制御用ＰＬＣ２２３は、細胞の増殖開始時期から当該細胞の培養状況、つまり当該細胞が抗体の刺激により増殖の可能性があるか否かを判断してこの細胞の良否を判定する。この判定に基づいて、運転制御用ＰＬＣ２２３は増殖可能性が著しく低い細胞について、本細胞培養装置２００での培養を中止する。

また、運転制御用ＰＬＣ２２３は、非単一細胞の増加速度から当該細胞の最小倍化時間を算出する。ここで、上記最小倍化時間とは、ある時間における細胞の細胞数が倍の細胞数になるまでに要する時間をいう。運転制御用ＰＬＣ２２３は、この最小倍化時間から当該細胞の培養状況、つまり当該細胞の増殖能力を判断して、培養バッグ２４２へ培地を流加させるタイミングや流加速度などを決定する。

制御手段として機能する運転制御用ＰＬＣ２２３及び画像処理用ユニット２２１は、図示しないが、演算や制御を実行するＣＰＵと、処理プログラムやデータを記憶する記憶装置（メモリ）と、データやコマンドなどを入力するためのキーボード、マウスまたはタッチパネルなどの入力装置やモニタなどの出力装置との接続を行う入出力回路とを有して構成される。更に、画像処理用ユニット２２１には、ＣＣＤカメラ３０２からの画像データを記憶する画像メモリ回路を備える。

画像処理用ユニット２２１の記憶装置には、ＣＣＤカメラ３０２が所定時間毎に撮影した培養バッグ２４２内の細胞の画像を画像処理（例えば２値化処理や多値化処理）して、細胞培養の評価パラメータ（単一細胞の平均投影面積、非単一細胞の増加速度）などを算出するためのプログラムが記憶されている。

また、運転制御用ＰＬＣ２２３の記憶装置には、細胞培養の評価パラメータから細胞の培養状況（細胞の増殖可能性、細胞の増殖能力）を判定するためのプログラムと、この細胞の培養状況に応じて細胞培養装置２００及び培養ユニット２１２に関する機器（例えば供給ポンプ２６１、排出ポンプ２７１など）を制御し、培養操作を実行するためのプログラムとが記憶されている。更に、この運転制御用ＰＬＣ２２３の記憶装置には、細胞培養装置２００及び培養ユニット２１２の各種センサからの信号に基づいて、これらの培養装置２１０及び培養ユニット２１２に関する機器を制御する機器制御用のプログラムも記憶されている。画像処理用ユニット２２１の記憶装置には、ＣＣＤカメラ３０２を所定時間毎に制御して細胞の画像を取得するなどの機器制御用のプログラムも記憶されている。

次に、運転制御用ＰＬＣ２２３及び画像処理用ユニット２２１が上記プログラムを実行して細胞を培養する工程を、図２５〜図３４の工程図に示すフローチャートを用いて説明する。

図２５及び図２６は、抗体刺激間欠式灌流培養工程を示し、培養バッグ２４２に細胞を回収する場合である。まず、図２５に示すように、操作者は、クリーンベンチ等内で培養バッグ２４２に抗体を固層化し（図２５のＷ０１）、培地を投入し、細胞を接種させた培養バッグ２４２を、培養バッグトレイ２４１に装着する。引き続き、操作者はクリーンベンチ等内で培地を投入した培地バッグ２３３を培地バッグトレイ２３１に装着し、廃液バッグ２３４を廃液バッグトレイ２３２に装着し、培養バッグ２４２と、培地バッグ２３３および廃液バッグ２３４と、を供給継ぎ手２６４および廃液継ぎ手２７４によってそれぞれ連結する（図２５のＷ０２）。

次に、操作者は、この培養バッグトレイ２４１、培地バッグトレイ２３１及び廃液バッグトレイ２３２を細胞培養装置２００の、表示灯が例えば緑色に点灯された単一の培養ユニット２１２内に搬入し、培養バッグトレイ２４１は培養室２４０のフレーム２５０に支持させて、培地バッグトレイ２３１及び廃液バッグトレイ２３２は低温室２３０に設置する。そして、操作者は、培養バッグ２４２のポンプチューブ２６２、２７２を供給ポンプ２６１及び排出ポンプ２７１にそれぞれ接続する（図２５のＷ０３）。

次に、操作者は、培養ユニット２１２に収納した培養バッグ２４２におけるＣＣＤカメラ３０２の画像出力を確認する（図２５のＷ０５）。この画像出力確認の前に、操作者は当該培養ユニット２１２の傾斜モータ２８０を起動させて載置台２５２の面積変化パーツ２５２ｂ、２５２ｃを下降させ、培養バッグ２４２に液溜り部を形成しておく（図２５のＷ０４）。更に操作者は、当該培養ユニット２１２の重量計２５１により、設置された培養バッグ２４２の重量を計測しておく。

その後、操作者は、培養ユニットドアを閉めて当該培養ユニット２１２内で細胞の培養を開始させる（図２５のＷ０６）。これにより、培養バッグ２４２の液溜り部において、増殖のために抗体により細胞が刺激される（図２５のＷ０７）。当該培養ユニット２１２のＣＣＤカメラ３０２は、培養バッグ２４２の液溜り部の細胞を所定時間（例えば６時間）毎に撮影し、画像処理用ユニット２２１は、この撮像画像から細胞培養の評価パラメータを算出する。運転制御用ＰＬＣ２２３は、この評価パラメータからラグタイムを算出して、当該細胞が抗体により刺激を受けて増殖の可能性があるか否か判定し、更に最小倍化時間を算出して、当該細胞の増殖能力を判定する（図２５のＷ０８）。

運転制御用ＰＬＣ２２３は、細胞が培養バッグ２４２内で抗体により刺激されてから所定時間（例えば２４時間）経過しても増殖の可能性が認められない場合には、本細胞培養装置２００での細胞の培養を中止する（図２５のＷ０８´）。運転制御用ＰＬＣ２２３は、培養バッグ２４２内の細胞に増殖の可能性があると判断したときには、当該細胞の増殖能力に基づいて、当該培養バッグ２４２内への培地の流加速度やタイミングなどを決定する。運転制御用ＰＬＣ２２３は、この決定に基づき供給ポンプ２６１を作動して、培地バッグトレイ２３１の培地バッグ２３３内の培地を培養バッグ２４２へ流加させる（図２５のＷ０９）。

この供給ポンプ２６１の作動により、培養バッグ２４２内で所定の面積の液溜り部において細胞の静置培養が開始される（図２５のＷ１０）。運転制御用ＰＬＣ２２３は、重量計２５１により計測される培養バッグ２４２内の培地及び細胞の重量が所定値ａ以上となったか否かを判断し（図２５のＷ１１）、所定値ａ以上となった時点で傾斜モータ２８０を起動させ、カム機構２８１を介して載置台２５２の面積変化パーツ２５２ｂ、２５２ｃを上昇させ、培養バッグ２４２の所定の面積を水平状態として液溜り部を変化させる（図２５のＷ１２）。この工程は載置台２５２に形成された段差がすべて解消され、培養バッグ２４２が水平となるまで繰り返される（図２５のＷ１３）。

その後、運転制御用ＰＬＣ２２３は、重量計２５１により計測される培養バッグ２４２内の培地及び細胞の重量が所定値ｂ以上になったか否かを判断し（図２５のＷ１４）、所定値ｂ以上になった時点で作動モータ２９２を起動させる。これにより、振盪装置２９０が作動して、振盪装置２９０の振盪機構２９１が培養バッグ２４２を繰り返し押圧する振盪培養を開始する（図２５のＷ１５）。運転制御用ＰＬＣ２２３は、引き続き、重量計２５１により計測される培養バッグ２４２内の培地及び細胞の重量が所定値ｃ以上となったか否かを判断し（図２６のＷ１６）、所定値ｃ以上となった時点で、供給ポンプ２６１を停止して培地バッグトレイ２３１の培地バッグ２３３から培養バッグ２４２への培地の流加を停止し（図２６のＷ１７）、作動モータ２９２を停止して培養バッグ２４２内での振盪培養を停止する（図２６のＷ１８）。

運転制御用ＰＬＣ２２３は、培養バッグ２４２内で細胞が沈降した後に、排出ポンプ２７１を作動させて、培養バッグ２４２内の使用済み培地（培養バッグ２４２内の上澄み）を廃液バッグトレイ２３２の廃液バッグ２３４へ排出する（図２６のＷ１９）。その後、運転制御用ＰＬＣ２２３は、重量計２５１により計測される培養バッグ２４２内の培地及び細胞の重量が所定値ｄ以下になったか否かを判断し（図２６のＷ２０）、所定値ｄ以下になった時点で、排出ポンプ２７１を停止して、培養バッグ２４２からの使用済み培地の排出を停止する（図２６のＷ２１）。そして供給ポンプ２６１を起動して培地バッグトレイ２３１の培地バッグ２３３から培養バッグ２４２へ培地を流加させ、作動モータ２９２を起動して、振盪装置２９０により培養バッグ２４２内で振盪培養を実施する（図２６のＷ２２）。所定時間経過後、運転制御用ＰＬＣ２２３は、供給ポンプ２６１を停止して培地バッグトレイ２３１の培地バッグ２３３から培養バッグ２４２への培地流加を停止し、作動モータ２９２を起動したまま振盪培養を継続する（図２６のＷ２３）。

運転制御用ＰＬＣ２２３は、増殖される細胞の使用日時に依存した所望の培養期間に至ったか否かを判断し、または画像処理用ユニット２２１が、培養バッグ２４２内での細胞が所望の細胞数に到ったか否かを判断する（図２６のＷ２４）、これらの培養期間または細胞数に至っていない場合には、ステップＷ１８〜Ｗ２３の処理動作を繰り返す。細胞数の測定を行う場合は振盪装置２９０を一度停止し、細胞が沈降するまで待つ。次いで、ＣＣＤカメラ３０２で培養バッグ２４２内の画像を撮影する。画像処理用ユニット２２１は取得した画像からバッグ内に存在する細胞数を推定・算出する。

上記ステップＷ１８〜Ｗ２３は、培養バッグ２４２内で使用済みの培地の排出と、培養バッグ２４２内への新しい培地の供給（流加）とを交互に実施する間欠式灌流培養である。

運転制御用ＰＬＣ２２３は、ステップＷ２４において所望の培養期間または細胞数に至った時点で、図２６に示すように作動モータ２９２を停止して、培養バッグ２４２内での振盪培養を停止する（図２６のＷ２５）。次いで、培養バッグ２４２内で細胞が沈降した後に排出ポンプ２７１を起動させ、培養バッグ２４２内の使用済み培地を廃液バッグトレイ２３２の廃液バッグ２３４へ排出して、重量計２５１の計測値に基づき、培養バッグ２４２内の培地及び細胞が約１／２〜１／３程度になるまで細胞を濃縮させる（図２６のＷ２６）。

運転制御用ＰＬＣ２２３は、その後排出ポンプ２７１を停止して細胞培養を終了する（図２６のＷ２７）。この培養終了後に、操作者により培養バッグ２４２内の細胞がクリーンベンチ等内で遠心分離機用の容器に移され、その後、遠心分離によって細胞が回収される（図２６のＷ２８）。

次に、同様な抗体刺激間欠式灌流培養工程において、細胞回収バッグにより細胞を回収する処理が含まれる場合を図２７及び図２８に示す。従って、この図２７及び図２８に示す工程のステップＷ３１〜Ｗ５６は、図２５及び図２６のステップＷ０１〜Ｗ２６と同様であるため説明を省略する。

図２８に示すステップＷ５６において、排出ポンプ２７１の起動により培養バッグ２４２内の細胞が濃縮された後、運転制御用ＰＬＣ２２３は排出ポンプ２７１を停止し、廃液バッグトレイ２３２の廃液バッグ２３４を細胞回収バッグに交換するように操作者に促す（図２８のＷ５７）。この細胞回収バッグは、遠心分離機に装着されて遠心分離に使用され得るバッグである。

廃液バッグトレイ２３２の廃液バッグ２３４が細胞回収バッグに交換された後、運転制御用ＰＬＣ２２３は排出ポンプ２７１及び作動モータ２９２を起動する。次いで、振盪装置２９０により培養バッグ２４２内を振盪させながら、この培養バッグ２４２内の細胞を培地と共に廃液バッグトレイ２３２に装着した細胞回収バッグへ移行させる（図２８のＷ５８）。運転制御用ＰＬＣ２２３は、その後排出ポンプ２７１及び作動モータ２９２を停止して培養バッグ２４２からの細胞回収を停止し、細胞培養を終了する（図２８のＷ５９）。この細胞回収終了後に、操作者により細胞回収バッグが遠心分離機に装着されて、遠心分離により細胞が回収される（図２８のＷ６０）。

次に、抗体刺激連続式灌流培養工程を、この工程の処理動作を示す図２９及び図３０に基づいて説明する。この図２９及び図３０に示す抗体刺激連続式灌流培養工程におけるステップＸ０１〜Ｘ１５は、図２５及び図２６の抗体刺激間欠式灌流培養工程におけるステップＷ０１〜Ｗ１５と同様であるため説明を省略する。この抗体刺激連続式灌流培養工程では、培養バッグ２４２と排出ポンプ２７１との間にフィルタ（不図示）が配設されている。

運転制御用ＰＬＣ２２３は、培養バッグ２４２内へ培地バッグトレイ２３１の培地バッグ２３３から培地が流加されて、培養バッグ２４２内での振盪装置２９０による振盪培養が行われている間に、培養バッグ２４２内の培地及び細胞の重量が所定値ｃ以上となった時点（図３０のＸ１６）で排出ポンプ２７１を起動させて、培養バッグ２４２内の使用済み培地を廃液バッグトレイ２３２の廃液バッグ２３４へ排出させる。これにより、培養バッグ２４２への培地の流加と培養バッグ２４２からの培地の排出とを同時に実施する連続式灌流培養が培養バッグ２４２内で開始される（図３０のＸ１７）。このとき、培養バッグ２４２内の細胞は、フィルタにより流動が阻止されて廃液バッグ２３４内へ流動することはない。なお、上記連続式灌流培養中には、振盪装置２９０による振盪培養も同時に実施されている。

運転制御用ＰＬＣ２２３は、増殖される細胞の使用日時に依存した所望の培養期間に至ったか否かを判断し、または画像処理用ユニット２２１が、培養バッグ２４２内での細胞が所望の細胞数に到ったか否かを判断する（図３０のＸ１８）。これらの培養期間または細胞数に至っていない場合には、ステップＸ１７の連続式灌流培養を繰り返す。細胞数の測定を行う場合は振盪装置２９０を一度停止し、細胞が沈降するまで待つ。次いで、ＣＣＤカメラ３０２で培養バッグ２４２内の画像を撮影する。画像処理用ユニット２２１は取得した画像からバッグ内に存在する細胞数を推定・算出する。

運転制御用ＰＬＣ２２３は、ステップＸ１８における所望の培養期間または細胞数に至った時点で、供給ポンプ２６１、排出ポンプ２７１及び作動モータ２９２を停止させて、灌流培養及び振盪培養を停止させる（図３０のＸ１９）。運転制御用ＰＬＣ２２３は、培養バッグ２４２内で細胞が沈降した後に、排出ポンプ２７１を起動させ、培養バッグ２４２内の使用済み培地を廃液バッグトレイ２３２の廃液バッグ２３４へ排出させ、重量計２５１の計測値に基づき、培養バッグ２４２内の培地及び細胞が約１／２〜１／３程度になるまで細胞を濃縮させる（図３０のＸ２０）。濃縮過程において振盪装置を停止させるのは多量の細胞がチューブに流入し、フィルタが目詰まりするのを防ぐためである。

運転制御用ＰＬＣ２２３は、その後排出ポンプ２７１を停止して細胞培養を終了する（図３０のＸ２１）。この培養終了後に、操作者により培養バッグ２４２内の細胞がクリーンベンチ等内で遠心分離機用の容器に移され、その後、遠心分離によって細胞が回収される（図３０のＸ２２）。

次に、抗体刺激単純流加培養工程を、この工程の処理動作を示す図３１及び図３２に基づいて説明する。この図３１及び図３２に示す抗体刺激連続式灌流培養工程におけるステップＹ０１〜Ｙ１５は、図２５及び図２６の抗体刺激間欠式灌流培養工程におけるステップＷ０１〜Ｗ１５と同様であるため説明を省略する。

運転制御用ＰＬＣ２２３は、重量計２５１により計測される培養バッグ２４２内の培地及び細胞の重量が所定値ｃ以上となったか否かを判断し（図３２のＹ１６）、所定値ｃ以上となった時点で、供給ポンプ２６１を停止して培地バッグトレイ２３１の培地バッグ２３３から培養バッグ２４２への培地の流加を停止し、作動モータ２９２を起動したまま振盪培養を継続する（図３２のＹ１７）。

運転制御用ＰＬＣ２２３は、増殖される細胞の使用日時に依存した所望の培養期間に至ったか否かを判断し、または画像処理用ユニット２２１が培養バッグ２４２内での細胞が所望の細胞数に到ったか否かを判断する（図３２のＹ１８）、これらの培養期間または細胞数に至っていない場合には、振盪培養を継続する（Ｙ１８でＮｏ）。細胞数の測定を行う場合は振盪装置２９０を一度停止し、細胞が沈降するまで待つ。次いで、ＣＣＤカメラ３０２で培養バッグ２４２内の画像を撮影する。画像処理用ユニット２２１は取得した画像からバッグ内に存在する細胞数を推定・算出する。

運転制御用ＰＬＣ２２３は、ステップＹ１８において所望の培養期間または細胞数に至った時点で、図３２に示すように作動モータ２９２を停止して、培養バッグ２４２内での振盪培養を停止し（図３２のＹ１９）、培養バッグ２４２内で細胞が沈降した後に、排出ポンプ２７１を起動させ、培養バッグ２４２内の使用済み培地を廃液バッグトレイ２３２の廃液バッグ２３４へ排出して、重量計２５１の計測値に基づき、培養バッグ２４２内の培地及び細胞が約１／２〜１／３程度になるまで細胞を濃縮させる（図３２のＹ２０）。

運転制御用ＰＬＣ２２３は、その後排出ポンプ２７１を停止して細胞培養を終了する（図３２のＹ２１）。この培養終了後に、操作者により培養バッグ２４２内の細胞がクリーンベンチ等内で遠心分離機用の容器に移され、その後、遠心分離によって細胞が回収される（図３２のＹ２２）。

次に、同様な抗体刺激単純流加培養工程において、細胞回収バッグにより細胞を回収する処理が含まれる場合を、この処理動作を示す図３３及び図３４に示す。従って、この図３３及び図３４に示す工程のステップＹ３１〜Ｙ５０は、図３１及び図３２のステップＹ０１〜Ｙ２０と同様であるため説明を省略する。

図３４に示すステップＹ５０において、排出ポンプ２７１の起動により培養バッグ２４２内の細胞が濃縮された後、運転制御用ＰＬＣ２２３は、排出ポンプ２７１を停止し、廃液バッグトレイ２３２の廃液バッグ２３４を細胞回収バッグに交換するように操作者に促す（図３４のＹ５１）。この細胞回収バッグは、遠心分離機に装着されて遠心分離に使用され得るバッグである。

廃液バッグトレイ２３２の廃液バッグ２３４が細胞回収バッグに交換された後、運転制御用ＰＬＣ２２３は排出ポンプ２７１及び作動モータ２９２を起動させて、振盪装置２９０により培養バッグ２４２内を振盪させながら、この培養バッグ２４２内の細胞を培地と共に、廃液バッグトレイ２３２に装着された細胞回収バッグへ移行させる（図３４のＹ５２）。運転制御用ＰＬＣ２２３は、その後第排出ポンプ２７１及び作動モータ２９２を停止して培養バッグ２４２からの細胞回収を停止し、細胞培養を終了する（図３４のＹ５３）。この細胞回収終了後に、操作者により細胞回収バッグが遠心分離機に装着されて、遠心分離により細胞が回収される（図３４のＹ５４）。

以上のように構成されたことから、上記実施の形態によれば、次の効果（１）〜（７）を奏する。
（１）ＣＣＤカメラ３０２が撮像した培養バッグ２４２内の細胞の画像を、画像処理用ユニット２２１が画像処理して細胞培養の評価パラメータ（単一細胞の平均投影面積、非単一細胞の増加速度）を取得し、運転制御用ＰＬＣ２２３が当該細胞の培養状況（細胞の増殖可能性及び増殖能力）を判定評価し、この培養状況に応じた培養操作（培地バッグ２３３から培養バッグ２４２への所定流加速度での培地流加やタイミング）を実施する。この結果、細胞の培養状況を非接触状態で判定できるので当該細胞にダメージを与えることがなく、また、培養操作を操作者が逐次実施する必要がないので操作者の労力を軽減できる。更に、一患者の細胞を単一の培養ユニット２１２内に収納される培養バッグ２４２に接種させ、この細胞ごとに、細胞の培養状況に応じた培養操作を実施できるので適切な培養操作を実現できる。この細胞の培養状況に応じた適切な培養操作を実現できることで、時間単位での培養操作が可能となり、培養が促進されて培養期間を短縮できる。

（２）培地バッグ２３３、廃液バッグ２３４および培養バッグ２４２をクリーンベンチ等内で連結し、培養ユニット２１２に設置するため閉ループに構成されたことから、完全閉鎖系の無菌状態に保持することができる。

（３）培養バッグトレイ２４１、培地バッグトレイ２３１及び廃液バッグトレイ２３２を培養開始時に培養ユニット２１２内に設置してから、培養終了までは自動で培養工程が実施されるため、環境変化に伴う培養バッグ２４２内の細胞へのダメージを低減できると共に、クリーンベンチ等内で培養バッグ２４２に培地を供給する無菌操作を省略できる。

（４）培養バッグ２４２内での培養初期段階の抗体刺激と細胞増殖を同一培養バッグ２４２内で行い、この培養バッグ２４２内で細胞及び培地が貯溜される液溜り部を所定の面積で変化させることができることから、培養中の面積当たりの細胞密度を増殖に好適な密度に維持することで、細胞を効率よく増殖させることができる。

（５）培養バッグ２４２内の使用済み培地が廃液バッグトレイ２３２の廃液バッグ２３４に排出されて貯溜されることから、培養バッグ２４２の細胞密度を高めて濃縮することができるので、細胞回収のための遠心分離操作回数を低減できる。この結果、細胞回収作業の省力化を実現できると共に、遠心分離に伴う細胞のダメージも低減できる。

（６）培養バッグ２４２内で濃縮された細胞を、廃液バッグトレイ２３２に装着された細胞回収バッグに全量回収させる場合には、この細胞回収バッグを遠心分離機に直接装着して細胞を回収することができるので、細胞回収作業の省力化を実現できる。

（７）細胞が接種された培地を収容する可撓性の培養バッグ２４２を、振盪装置２９０の振盪機構２９１における作動板２９１ａの突出部２９１ｂが繰り返し押圧して、当該培養バッグ２４２内の培地を撹拌することから、この培養バッグ２４２内の細胞分布及び酸素濃度分布を均一化できるので、細胞の増殖が促進されて、細胞の培養効率を向上させることができる。
また、細胞は、振盪装置２９０の作動板２９１ａにより繰り返し押圧されて撹拌された培地内を浮遊するだけなので、ダメージを蒙ることが防止される。

つづいて、図３５を参照しつつ、図７の振盪装置８０を用いた細胞培養の実施例について説明する。ここで、図３５は、図７の振盪装置８０を用いた振盪方法による細胞培養の結果を、従来の振盪方法による細胞培養の結果、及び静置培養（振盪を行わないもの）による結果と対比して示すグラフである。この図３５では、横軸に培養時間（単位：時間）、縦軸に細胞数（単位：１０^６個）をとってあり、図中■は振盪装置８０を用いた場合の培養結果、◆は従来のロータリー式の振盪装置による培養結果、●は静置培養による培養結果、をそれぞれ示している。

本実施例では以下の条件・手順で細胞培養を行った。
すなわち、まず、健常人ドナーから末梢血を採取し、血球分離用比重液を用いて末梢血単核球を分離した。
得られた末梢血単核球１．０×１０^７個を、ＡＬｙＳ２０３培養液（細胞科学株式会社）３０ｍｌ（含ドナー自己血漿２．４ｍｌ）に懸濁し、抗ＣＤ３抗体を固層化した浮遊細胞用７５Ｔ−Ｆｌａｓｋ（ＳＵＭＩＬＯＮ）に播種して３７℃、５％ＣＯ_２インキュベータで培養（前培養）を行った。

前培養は３日間行い、培養４日目の対数増殖期に入った細胞を回収し、２．０×１０^７個の細胞を新しいＡＬｙＳ５０５N培養液（細胞科学株式会社製）３５０ｍｌ（含ドナー自己血漿３．５ｍｌ）に懸濁して３５０ｍｌ培養バッグ（株式会社ニプロ製）に移し変えた。この培養バッグは、同一内容のものを３つ用意した。

次に、細胞懸濁液の入った３つの３５０ｍｌ培養バッグについて、振盪装置８０を用いた振盪方法における細胞培養、従来のロータリー式による振盪方法における細胞培養、及び静置培養、のいずれかの培養を行い、これを本培養とした。

ここで、従来のロータリー式の振盪装置は回転数を３０ｒｐｍとし、ロータリーテーブルに網を渡し、培養バッグ両面から酸素透過が可能となるように設置した。

また、振盪装置８０は回転数を３０ｒｐｍとし、培養バッグを押圧・解除する突出部８６として振盪機構９１に円柱形のゴム（直径３０ｍｍ、高さ２０ｍｍ）を３個配置した。

本培養を開始してから２４時間、４８時間、７２時間後に培養バッグから２ｍｌ培養液（培地及び細胞を含む）を採取し、細胞数を測定したところ、図３５に示すように、静置培養及び従来のロータリー式の振盪装置を用いて培養したものに比べ、振盪装置８０を用いて培養したものの方が、本培養７２時間後において細胞数が多いことが明らかとなった。

本発明に係る細胞培養用振盪装置における第１の実施の形態が適用された細胞培養装置を示す構成図である。 図１の恒温槽を示す斜視図である。 図１の恒温槽におけるキャニスタ内に収納される培養カセットを示す斜視図である。 図３の培養バッグトレイ、培地カセット及び細胞接種カセットをそれぞれ示す斜視図である。 図２の恒温槽における一つのキャニスタと、このキャニスタ内に収納される培養カセットとからなる培養ユニットの構成を示すレイアウト図である。 図５の培養ユニットの制御系統を示すブロック図である。 図５の振盪装置の振盪機構を示し、（Ａ）が斜視図、（Ｂ）が側面図である。 図５の培養ユニットにおける培養手順を示す工程図である。 図５の培養ユニットにおける培養手順を示し、図８に続く工程図である。 図５の培養ユニットにおける培養手順を示し、図９に続く工程図である。 図５の培養ユニットにおける培養手順を示し、図１０に続く工程図である。 図５の培養ユニットにおける誘導因子刺激間欠式灌流培養工程の処理動作を示すフローチャートである。 図１２の処理動作の続きを示すフローチャートである。 図５の培養ユニットにおける誘導因子刺激間欠式灌流培養工程（細胞回収バッグによる細胞回収処理を含む）の処理動作を示すフローチャートである。 図１４の処理動作の続きを示すフローチャートである。 図５の培養ユニットにおける誘導因子刺激連続式灌流培養工程の処理動作を示すフローチャートである。 図１６の処理動作の続きを示すフローチャートである。 本発明に係る細胞培養用振盪装置における第２の実施の形態が適用された培養ユニット及び細胞培養装置の構成（分化誘導状態）を示すレイアウト図である。 図１８の培養ユニットの分化誘導前状態の構成を示すレイアウト図である。 図１８及び図１９の培養ユニットにおける分化誘導間欠式灌流培養工程の処理動作を示すフローチャートである。 図２０の処理動作の続きを示すフローチャートである。 本発明に係る細胞培養用振盪装置における第３の実施の形態が適用された培養ユニット及び細胞培養装置を示す構成図である。 第３の実施の形態に係る細胞培養用振盪装置が適用された細胞培養装置における一つの空間的に独立した培養室と低温室、この培養室内に収納される培養バッグトレイと低温室に収納される培地バッグ・廃液バッグトレイからなる培養ユニットの構成を示すレイアウト図である。 図２３の載置台の構成を示す斜視図である。 図２３の培養ユニットにおける抗体刺激間欠式灌流培養工程において、培養バッグに細胞を回収する処理が含まれる場合の処理動作を示すフローチャートである。 図２５の処理動作の続きを示すフローチャートである。 図２３の培養ユニットにおける抗体刺激間欠式灌流培養工程において、細胞回収バッグに細胞を回収する処理が含まれる場合の処理動作を示すフローチャートである。 図２７の処理動作の続きを示すフローチャートである。 図２３の培養ユニットにおける抗体刺激連続式灌流培養工程の処理動作を示すフローチャートである。 図２９の処理動作の続きを示すフローチャートである。 図２３の培養ユニットにおける抗体刺激単純流加培養工程の処理動作を示すフローチャートである。 図３１の処理動作の続きを示すフローチャートである。 図２３の培養ユニットにおける抗体刺激単純流加培養工程において、細胞回収バッグにより細胞を回収する処理が含まれる場合の処理動作を示すフローチャートである。 図３３の処理動作の続きを示すフローチャートである。 図７の細胞培養用振盪装置を用いた振盪方法による培養結果を、従来の振盪方法による培養結果及び静置培養による培養結果と対比して示すグラフである。

符号の説明

１０ 細胞培養装置
１１ 恒温槽
１２ 培養ユニット
１３ 運転制御盤
１４ 画像処理用コンピュータ
１５ 監視用コンピュータ
１６ キャニスタ
１７ 培養カセット
１８ 培養バッグ（増殖用培養容器）
１９ 細胞接種カセット（誘導因子刺激用培養容器）
２０ 培地カセット（培地貯溜手段）
４６ 載置台
４７ 培養バッグトレイ
４８ 第１ポンプ
４９ 第２ポンプ
６５ 誘導因子刺激容器
６７ 培地バッグ（培地貯溜容器）
６８ 使用済み培地バッグ（使用済み培地貯溜容器）
７２ 細胞回収バッグ（細胞回収容器）
８０ 振盪装置
８５ 作動板
８６ 突出部
８７ 照明用ＬＥＤ
８８ ＣＣＤカメラ（画像取得手段）
８９ 画像メモリ回路
９１ 振盪機構（押圧手段）
１００ 細胞培養装置
１０１ 分化誘導カセット（分化誘導用培養容器）
２００ 細胞培養装置
２１２ 培養ユニット
２２１ 画像処理用ユニット
２３０ 低温室
２３１ 培地バッグトレイ
２３２ 廃液バッグトレイ
２３３ 培地バッグ（培地貯溜手段、培地貯溜容器）
２３４ 廃液バッグ（廃液貯溜手段、使用済み培地貯溜容器）
２４０ 培養室
２４１ 培養バッグトレイ
２４２ 培養バッグ（抗体刺激用培養容器、増殖用培養容器）
２５２ 載置台
２５２ｂ 面積変化パーツ
２５２ｃ 面積変化パーツ
２６１ 供給ポンプ
２７１ 排出ポンプ
２９０ 振盪装置
２９１ 振盪機構
２９１ａ 作動板（押圧手段）
２９１ｂ 突出部
３０２ ＣＣＤカメラ（画像取得手段）

Claims (9)

1. 細胞が接種された培養液を収容する可撓性の培養容器内で細胞を培養する細胞培養用振盪装置において、
   前記培養容器に対して上下移動により突出部が該培養容器を押圧又は該押圧を解除可能な押圧手段を備え、
   前記押圧手段を移動させて前記突出部が前記培養容器を押圧し、該押圧を離間して解除する動作を繰り返すことにより前記培養容器内の培養液を撹拌する構成としたこと
   を特徴とする細胞培養用振盪装置。
2. 前記突出部は、所定の距離離間して配設された複数の突出部でなることを特徴とする請求項１に記載の細胞培養用振盪装置。
3. 前記細胞は、浮遊系細胞であることを特徴とする請求項１又は請求項２に記載の細胞培養用振盪装置。
4. 前記細胞は、免疫細胞療法に使用されることを特徴とする請求項１乃至請求項３のうち、いずれか１に記載の細胞培養用振盪装置。
5. 前記押圧手段は、押圧幅１乃至１５ｍｍで押圧することを特徴とする請求項１乃至請求項４のうち、いずれか１に記載の細胞培養用振盪装置。
6. 細胞が接種された培養液を収容する可撓性の培養容器内で細胞を培養する細胞培養方法であって、
   前記培養容器に対して上下移動により突出部が該培養容器を押圧又は該押圧を解除する押圧手段を移動させて前記培養容器を押圧し、該押圧を離間して解除する動作を繰り返すことにより当該培養容器内で培養液を撹拌して細胞を培養すること
   を特徴とする細胞培養方法の振盪培養方法。
7. 前記突出部は、所定の距離離間して配設された複数の突出部でなることを特徴とする請求項６に記載の細胞培養方法の振盪培養方法。
8. 前記細胞は、浮遊系細胞であることを特徴とする請求項６又は請求項７に記載の細胞培養方法の振盪培養方法。
9. 前記細胞は、免疫細胞療法に使用されることを特徴とする請求項６乃至請求項８のうち、いずれか１に記載の細胞培養方法の振盪培養方法。

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