JP5167338B2 - 哺乳動物細胞へのｉｎｖｉｖｏ送達のための、プラスミド非含有機能性核酸を含有するインタクトな細菌由来ミニセル - Google Patents

Description

関連出願に関するクロス・リフェレンス
本出願は、2007年3月30日に出願された米国特許仮出願第60/909,074号の優先権を主張する。尚、上記文献は、参照としてその全体を本明細書に組み込むものとする。

近年、細胞の様々な機能を調節するために、核酸に基づく多数の手法が開発されている（Opalinska及びGewirtz、2002）。アプタマー、転写因子結合デコイオリゴヌクレオチド、リボザイム、三重らせん形成オリゴヌクレオチド、免疫刺激性CpGモチーフ、アンチセンスオリゴヌクレオチド（ペプチド核酸を含む）、短鎖干渉RNA、並びに、マイクロRNAなどのオリゴヌクレオチドのクラスは、その高度に特異的な作用様式のために、研究ツールとして注目を集めている。これらのオリゴマー核酸は、治療薬としてもかなり有望である。しかし、このような治療薬は、遊離核酸の不安定性、並びにこれら巨大分子の安全かつ効率的で、しかも標的化した細胞送達など、いくつかの課題を抱えている（Dykxhoorn及びLieberman, 2005）。

核酸に基づく多くの治療手法の焦点は、RNA干渉（RNAi）の現象であり、これにより、細胞内の長い二本鎖RNA（dsRNA）は、相同的（相補性又は部分的に相補性）遺伝子転写産物の配列特異的分解を引き起こす。さらに具体的には、「ダイサー（dicer）」と呼ばれる内在性リボヌクレアーゼによって、長いdsRNA分子がより小さいRNAにプロセシングされる（Grishokら、2000；Zamoreら、2000）。これらの小さいRNAは、外来の供給源に由来する場合は「短鎖干渉RNA」（siRNA）として知られ、また、細胞自体のゲノム内のRNAコード遺伝子から生成された場合には、「マイクロRNA」（miRNA）として知られる。これら2つのクラスの短鎖（典型的には21〜23ヌクレオチド）の調節性RNAはまた、miRNAがメッセンジャーRNA（mRNA）標的に対し部分的相補性のみを示す点でも相違する。

短鎖調節性RNAは、いわゆる「RNA誘導サイレンシング複合体」（RISC）に結合し、この複合体は、ヘリカーゼ活性及びエンドヌクレアーゼ活性を有する。ヘリカーゼ活性は、RNA分子の二本鎖を巻き戻し、アンチセンス鎖を標的化RNA分子に結合させる（Zamoreら、2000；Zamoreら、2002；Vickersら、2003）。エンドヌクレアーゼ活性は、アンチセンス鎖が結合する部位で標的RNAを加水分解する。

従って、RNAiにおいて、一本鎖RNA分子（ssRNA）は、ワトソン−クリックの塩基対合法則により標的RNA分子に結合し、標的RNAを分解するリボヌクレアーゼをリクルートする。これと対照的に、遺伝子発現のアンチセンス抑制により、ssRNAとmRNAの結合が起こり、mRNAの分解を触媒することなく、翻訳が遮断される。

1クラスとして、調節性RNAは、ヒト血漿中での半減期が1時間未満であり（Layzerら、2004）、腎臓により急速に排泄される。そのため、複数のグループが、ヌクレアーゼ耐性の調節性RNA（siRNAなど）を作製することを試みている。このような努力の例として、化学的に修飾されたヌクレオチド（例えば、2’-F、2’-Ome、ロックド核酸；LNA）又はホスホジエステル骨格、例えば、ホスホロチオエート結合（Chiu及びRana 2003；Choungら、2006；Czaudernaら、2003；Elmenら、2005；Layzerら、2004；Morrisseyら、2005）が挙げられる。また、siRNA又は他の調節性RNAが循環中に存在する時間を最小限にするために、研究者らは、RNA分子をタンパク質及び抗体にコンジュゲートさせることにより、所望の哺乳動物細胞を標的化させている。低い安定性及び急速な腎臓排泄の課題にさらに取り組むべく、研究者らは、調節性RNAを送達するためのビヒクルを開発している。ポリプレックス（ポリカチオンを含む核酸の自己集合により形成される）、リポポリプレックス（ポリカチオンを含む核酸の初期縮合の後、カチオン脂質の添加により形成される）、リポソーム、及び合成ナノ粒子も研究中である。

これらの手法もまた、以下のような多数の問題を抱えている：（a）腎臓排泄による血清からのキャリアタンパク質の急速なクリアランス、（b）各キャリアタンパク質にコンジュゲートすることができる調節性RNA分子の数が限られていること、（c）キャリアタンパク質からのインタクトな調節性RNAの細胞内解離が困難であること、（d）オプソニンとして作用することができる、ポリプレックス結合血清タンパク質による急速なクリアランス（Dashら、1999）、並びに（e）リポソームはin vivoで不安定であるため、血清への核酸の放出を引き起こしたり、非特異的形質転換の可能性があること。

調節性RNAを内在的に生成させるためのウイルスベクターも開発されている。例えば、Devroe及びSilver, 2004を参照されたい。しかし、これらのウイルスベクターは、安全性について深刻な問題を呈示する。このような問題の例として、野生型ウイルスによる組換え、挿入性及び発癌性、ウイルスが誘発する免疫抑制、ウイルスベクターの大型DNAセグメント保持能の制限、弱毒化ウイルスの病原性の逆転、製造及び流通の困難性、低い安定性、並びに有害反応などが挙げられる（Hacein-Bey-Abinaら、2003; Kootstra及びVerma, 2003；Raperら、2003；Verma及びWeitzman, 2005; Check, 2005）。

また、調節性RNA、例えば、siRNA又はそれより大きい（約70 nt）前駆体、短いヘアピンRNA（shRNA）の組換えin situ発現のために、プラスミドに基づく系も開発されている。shRNAは、ヘアピンループにより連結される標的遺伝子由来のセンス及びアンチセンス配列を含む。例えば、Paddisonら、2002を参照されたい。shRNAは、pol-III型プロモーターから、又はmiRNAの場合には、pol IIプロモーターにより発現させることができる。

国際出願WO 03/033519号に記載されているように、shRNA、siRNA、又はその他の調節性RNAをコードするプラスミドを親細菌株に形質転換することができ、この細菌株が、不等細胞分裂を引き起こす突然変異によって、インタクトなミニセルを生産する。このような形質転換により、組換え菌が得られ、ここで、プラスミドは、細胞内複製して、細菌細胞質に多数のプラスミドを導入する。不等分裂中に、一部のプラスミドはミニセル細胞質に分離するが、これによって、組換えミニセルが得られる。このとき、ミニセルは、プラスミドDNAを哺乳動物細胞に送達することができ、そこで、プラスミドDNAは細胞核に移動する。核内で、プラスミドDNAは、場合に応じて、shRNA又はその他の調節性RNAを発現し、これにより生じた核酸は、次に細胞質に移動し、そこで、関与する調節性RNAの種類に応じて、RNAi又は遺伝子抑制を実施することができる。

しかし、上記の手法は、宿主機構を必要とすることから、発現に基づく系を介した治療有効量の核酸の送達は、複雑かつ持続的プロセスを伴うため、その有効性が制限される。従って、調節性RNAのような機能性核酸を標的細胞に送達するためのさらに効果的な方法が求められる。

従って、本発明の一態様において、（a）複数の各々のミニセルがプラスミド非含有機能性核酸を含有する、複数のインタクトなミニセルと、（b）その製薬上許容される担体とを含む組成物が提供される。「機能性核酸」のカテゴリーの例として、一本鎖、二本鎖又は多重鎖のDNA又はRNAが挙げられる。一実施形態では、上記複数のミニセルは、調節性RNAであるプラスミド非含有機能性核酸を含有する。このような調節性RNAの例として、限定するものではないが、siRNA、miRNA、及びshRNAが挙げられる。

ミニセルに封入された機能性核酸は、とりわけ、薬物耐性、アポトーシス耐性、又は新生物形成に寄与するタンパク質をコード化するRNA転写産物を標的とするものとしうる。また、本発明の組成物は、例えば、ミニセル表面構造に特異的な第１アームと、非食細胞の哺乳動物細胞表面受容体に特異的な第２アームから構成される二重特異性リガンドをさらに含んでもよい。

本発明の別の態様においては、標的哺乳動物細胞に機能性核酸を送達する方法が提供される。本発明の方法は、以下のステップ：（a）製薬上許容される担体中に複数のインタクトなミニセルを用意するステップであって、上記複数の各々のミニセルがプラスミド非含有機能性核酸を含有する、上記ステップ、及び（b）上記複数のミニセルを哺乳動物細胞と接触させて、該哺乳動物細胞が複数のミニセルを取り込み、これにより、該機能性核酸が標的細胞の細胞質に放出されるようにするステップを含む。前述したように、機能性核酸（例えば、siRNA、miRNA、及びshRNAなどの調節性RNA）は、薬物耐性、アポトーシス耐性、又は新生物形成に寄与するタンパク質をコード化するRNA転写産物を標的とすることができる。別の実施形態では、本発明の方法はさらに、機能性核酸とは異なる薬物を標的哺乳動物細胞に送達するステップも含む。薬物は、ミニセル組成物の投与後、又は投与と同時に投与してもよいし、あるいは、投与前であっても投与することができる。

別の態様において、本発明は、プラスミド非含有機能性核酸を含有するミニセルを作製する方法に関する。この方法は、バッファー中で、機能性核酸、例えば、siRNA、miRNA、又はshRNAのような調節性RNAと一緒に、複数のミニセルを共インキュベートすることを含む。いくつかの実施形態では、共インキュベーションは穏やかな振盪を含んでもよく、別の実施形態では、共インキュベーションは静的である。いくつかの態様においては、共インキュベーションは約0.5時間実施するが、別の態様では約1時間実施する。一実施形態では、上記バッファーは、緩衝生理食塩水、例えば、1Xリン酸緩衝液を含む。別の実施形態では、共インキュベーションは、約4℃〜約37℃、約20℃〜約30℃、約25℃、又は約37℃の温度で実施する。共インキュベーションには、約10⁷、10⁸、10⁹、10¹⁰、10¹¹、10¹²、又は10¹³個のミニセルを含有させることができる。

その他の目的、特徴及び利点は、以下の詳細な説明から明らかになるであろう。詳細な説明及び具体的な実施例を例示目的のみで記載する。なぜなら、この詳細な説明から、本発明の精神及び範囲内の様々な変更及び改変が当業者には明らかであるからである。さらに、実施例は、本発明の原理を明らかにするのであり、当業者に本発明が有用であろうすべての実施例への本発明の適用を具体的に説明するものと考えることはできない。

Cy3蛍光団標識siRNAを封入したインタクトなミニセルを示す図である。図1Aは、光学顕微鏡から得た図であり、図1Bは、同じスライドであるが、515〜560励起フィルターを用いて蛍光灯下で見たスライドを示し、ミニセルと一致する強力な蛍光のsiRNA分子が明らかである。 蛍光共焦点顕微鏡検査により捕捉したイメージであり、siRNA-Plk1を封入したEGFR標的化ミニセルのヒト乳癌細胞へのin vitroでの接着及び内在化を示す。 KSP-siRNAを封入したEGFR標的化ミニセルで、ヌードマウスにおけるヒト乳癌（MDA-MB-468）異種移植片を処置することにより達成された有意な抗腫瘍効果をグラフで示す図である。第1群（対照群）（-◆-）には滅菌食塩水を投与したのに対し、第2群（実験群）（-○-）には、^EGFRミニセル_siRNA-KSP(10⁹)を毎週4回投与した。 カルボプラチンを封入したEGFR標的化ミニセルと一緒に、KSP-siRNAを封入したEGFR標的化ミニセルで、ヌードマウスにおけるヒト結腸癌（HCT116）異種移植片を処置することにより達成された有意な抗腫瘍効果をグラフで示す図である。第1群（-◆-）のマウスには滅菌食塩水を投与したのに対し、第2群（--△--）、第3群（-■-）、及び第4群（-□-）のマウスは、最初の10用量について（図4参照）、10⁹個の^EGFRミニセル_siRNA-Plk1、^EGFRミニセル_siRNA-KSP-1、及び^EGFRミニセル_siRNA-KSP-2でそれぞれ処置した。 実験ミニセル、^EGFRミニセル_siRNA-KSP、又は^EGFRミニセル_siRNA-Plk1で処理した結腸癌（HCT116）細胞のトランスフェクション後様々な時点でのFACS分析を示す図である。図5A〜5Dは、トランスフェクションから4時間後に採取したサンプルのFACS分析を示し、図5E〜5Hは、トランスフェクションから8時間後のサンプルの分析を示す。図5A及び5Eは、細胞のみからの結果を示し、図5B及び5Fは、細胞＋非封入^EGFRミニセルに関する。また、図5C及び5Gは、細胞＋^EGFRミニセル_siRNA-KSPからの結果を示し、図5D及び5Hは、細胞＋^EGFRミニセル_siRNA-Plk1に関する。 実験ミニセル、^EGFRミニセル_siRNA-KSP、又は^EGFRミニセル_siRNA-Plk1で処理した結腸癌（HCT116）細胞のトランスフェクション後様々な時点でのFACS分析を示す図である。図6A〜6Dは、トランスフェクションから16時間後に採取したサンプルのFACS分析を示し、図6E〜6Hは、トランスフェクションから24時間後のサンプルの分析を示す。図6A及び6Eは、細胞のみからの結果を示し、図6B及び6Fは、細胞＋非封入^EGFRミニセルに関する。また、図6C及び6Gは、細胞＋^EGFRミニセル_siRNA-KSPからの結果を示し、図6D及び6Hは、細胞＋^EGFRミニセル_siRNA-Plk1に関する。 実験ミニセル、^EGFRミニセル_siRNA-KSP、又は^EGFRミニセル_siRNA-Plk1で処理した結腸癌（HCT116）細胞のトランスフェクション後様々な時点でのFACS分析を示す図である。図7A〜7Dは、トランスフェクションから32時間後に採取したサンプルのFACS分析を示し、図7E〜7Hは、トランスフェクションから48時間後のサンプルの分析を示す。図7A及び7Eは、細胞のみからの結果を示し、図7B及び7Fは、細胞＋非封入^EGFRミニセルに関する。また、図7C及び7Gは、細胞＋^EGFRミニセル_siRNA-KSPからの結果を示し、図7D及び7Hは、細胞＋^EGFRミニセル_siRNA-Plk1に関する。

本発明に従い、激しい化学薬品又はエレクトロポレーションに頼らずに、治療上有効な量の機能性核酸をミニセルに封入することができる。これに関して、治療に有効な濃度の機能性核酸をインタクトなミニセルに直接封入するための単純な方法を開発し、これは、プラスミドに基づく発現構築物又は宿主細菌細胞の発現機構を必要としない。従って、機能性核酸をコードするポリヌクレオチドセグメントをプラスミドDNA又はウイルスベクターにクローニングするものではない。そうではなく、ミニセルのインタクトな膜を通過させることにより、プラスミド非含有機能性核酸をミニセルに直接封入する。さらに、本発明のミニセル組成物は、治療上有効な量の機能性核酸分子（例えば、siRNA、miRNA、及びshRNAなどの調節性RNA）を安全かつ有効に、標的とする哺乳動物細胞に送達することができる。

定義
特に明記しない限り、本明細書中で使用する全ての技術用語及び科学用語は、当業者によって一般に理解される意味と同じ意味を持つ。

便宜上、本明細書、実施例、及び添付の特許請求の範囲で使用する、一部の用語及び語句の意味を以下に示す。他の用語及び語句は、明細書全体にわたって定義する。

単数形は、前後関係から明瞭にそうではないと指示されない限り複数形を含む。

「アンチセンスオリゴヌクレオチド」は、転写産物とハイブリダイズし、その翻訳を阻止できる、特定の遺伝子転写産物の一部に相補的な核酸分子を指す。アンチセンスオリゴヌクレオチドはRNA又はDNAを含みうる。

「生体分子配列」又は「配列」は、ポリヌクレオチド又はポリペプチド配列の全体又は一部分を指す。

本明細書で互換的に使用される「癌」、「新生物」、「腫瘍」、「悪性腫瘍」、及び「癌腫」は、細胞増殖の著しい制御不能によって特徴付けられる、異常な増殖表現型を示す細胞又は組織を指す。本発明の方法及び組成物は、特に、悪性、前転移性、転移性、及び非転移性細胞に適用される。

「相補的」は、siRNA分子とその標的mRNAなど、２つの分子の相互作用する表面同士が、その形状において適合すること（topological compatibility）、又は互いに一致することを指す。それらの分子は、相補的であると表すことができ、さらには接触面特性は互いに相補的である。

「対応する（correspond to）」又は「表す（represent）」は、例えば、遺伝子に「対応する」か又は遺伝子を「表す」ポリヌクレオチド若しくは配列と関連して使用される場合、ポリヌクレオチド配列が、遺伝子又は核酸の遺伝子産物、例えばmRNA中に存在することを意味する。ポリヌクレオチドは、遺伝子のゲノム配列のエクソン内に全体として存在するか、又はポリヌクレオチド配列の異なる部分が異なるエクソン中に存在することもあり、例えば、連続するポリヌクレオチド配列が、スプライシング前又は後に、遺伝子の発現産物である一つのmRNA中に存在することとなる。

「デコイRNA」は、標的化しようとするRNAの重要な機能的領域と同じ構造を採用することができる分子である。そのRNAは、哺乳動物宿主に由来するもの（天然）であってもよいし、又は哺乳動物細胞に感染した病原因子、例えばHIVであってもよい。デコイRNAは、標的RNAと通常は相互作用するタンパク質を隔離して、哺乳動物又は病原因子宿主の正常なプロセシングを破壊する。

「薬物」は、動物、特に、哺乳動物及びヒトで、局所的又は全身的効果が得られる任意の生理学的又は薬理学的活性物質を指す。

「発現」は、一般的に、ポリヌクレオチド配列が、首尾よく転写・翻訳されて、その結果、検出可能なレベルのアミノ酸配列又はタンパク質が発現されるプロセスを指す。本明細書のある状況では、発現とはmRNAの産生を指す。他の状況では、発現とはタンパク質の産生を指す。

「機能性核酸」とは、宿主細胞への導入後、タンパク質の発現を特異的に干渉する核酸分子を指す。一般に、機能性核酸分子は、タンパク質をコードする転写産物と直接的に相互作用することによって、タンパク質の発現を減少させる能力を有する。調節性RNA（regulatory RNA）、例えばsiRNA、shRNA、短鎖RNA（典型的には400塩基長未満）、マイクロRNA（miRNA）、リボザイム及びデコイRNA、並びにアンチセンス核酸が、代表的な機能性核酸である。

「遺伝子」は、ポリペプチド又は前駆体の産生に必要な制御配列及びコード配列を含むポリヌクレオチド配列を指す。ポリペプチドは、完全長コード配列又はコード配列の任意の一部分によってコードされうる。遺伝子は、連続するコード配列を構成していてもよいし、又は適当なスプライシング連結部によって結合された１又は複数のイントロンを含んでもよい。さらに、遺伝子は、発現産物の生物学的活性若しくは化学構造、発現速度、又は発現制御方式に影響を及ぼす可能性がある、コード領域又は非翻訳領域中に１又は複数の改変を含みうる。そのような改変には、限定されるものではないが、１又は複数のヌクレオチドの突然変異、挿入、欠失、及び置換が含まれる。この点に関して、そのように改変された遺伝子は「ネイティブ」遺伝子の「変異体」と称される場合がある。

「宿主細胞」は、組換えプラスミド又は他のポリヌクレオチド移入のためのレシピエントとして使用しうる細胞、又は使用されている細胞を指し、トランスフェクトされた元の細胞の子孫も含まれる。単一細胞の子孫は、形態又はゲノムDNA若しくは全DNAの相補鎖において、自然の、偶然の、又は計画した突然変異のために、元の親と必ずしも完全に同一でなくてもよい。

「ハイブリダイゼーション」は、それによりポリヌクレオチド配列が塩基対合によって相補配列と結合するあらゆるプロセスを指す。

本明細書で互換的に使用される「個体」、「被験体」、「宿主」、及び「患者」は、診断、処置、又は治療が望まれるあらゆる哺乳動物被験体を指す。好ましい一実施形態では、個体、被験体、宿主、又は患者はヒトである。他の被験体には、限定されるものではないが、ウシ、ウマ、イヌ、ネコ、モルモット、ウサギ、ラット、霊長類、及びマウスが含まれる。

「標識」は、直接的に、あるいはシグナル生成系の１又は複数の追加要素との相互作用を介して、検出可能なシグナルを提供することができる作用物質を指す。直接的に検出可能な本発明で有用でありうる標識には蛍光標識がある。具体的な蛍光団には、フルオレセイン、ローダミン、BODIPY、シアニン色素などがある。本発明は、標識として³⁵S、³²P、³Hなどの放射性同位元素の使用も意図している。金コロイド又は着色ガラス又はプラスチック（例えばポリスチレン、ポリプロピレン、ラテックス）ビーズなどの比色標識も使用しうる。例えば、米国特許第4,366,241号、同第4,277,437号、同第4,275,149号、第3,996,345号、同第3,939,350号、同第3,850,752号、及び同第3,817,837号を参照のこと。

「オリゴヌクレオチド」は、例えば、約10ヌクレオチド（nt）〜約1000ntを含むポリヌクレオチドを指す。本発明で使用されるオリゴヌクレオチドは、約10nt〜約150ntであることが好ましい。オリゴヌクレオチドは、天然オリゴヌクレオチド又は合成オリゴヌクレオチドであってよい。オリゴヌクレオチドは修飾されていてもよい。

「ミニセル」は、DNA分離を伴う細胞分裂の二分裂中に、配位障害によって生じる細菌細胞の無核形を指す。ミニセルは、ある状態で自然に発生し放出され、特定の遺伝子の再構成又はエピソーム遺伝子の発現によらない他の小型小胞とは区別される。本発明において、ミニセルはインタクトである。なぜなら、他の「露出した（denuded）」形態、例えばスフェロプラスト、ポロプラスト（poroplast）、プロトプラストは、封入された機能性核酸を漏出し、治療上有用ではないと考えられるためである。インタクトなミニセルの膜によって、積載物がミニセル内に保持され、標的の宿主哺乳動物細胞内で細胞内に放出されることが可能となる。

本明細書において、「修飾」及び「化学修飾」は、塩基、糖部分及びヌクレオシド間リン酸結合の全て又はいずれかの天然分子構造に、１又は複数の化学的変化を有するオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドを指し、さらにこれらの部位で置換、又は修飾の組合せが加えられている分子を指す。ヌクレオシド間リン酸結合は、ホスホジエステル、ホスホトリエステル、ホスホルアミデート、シロキサン、カルボネート、カルボキシメチルエステル、アセトアミデート、カルバメート、チオエーテル、架橋ホスホルアミデート、架橋メチレンホスホネート、ホスホロチオエート、メチルホスホネート、ホスホロジチオエート、架橋ホスホロチオエート若しくはスルホンヌクレオチド間結合、又は3’-3’、5’-3’、若しくは5’-5’結合、及び同様のそのような結合の組合せでありうる。ホスホジエステル結合は、ホスホロチオエート、メチルアミノ、メチルホスホネート、ホスホルアミデート、及びグアニジンなど、代わりの結合と置換されていてよく、それらのポリヌクレオチドのリボースサブユニットもまた置換されていてよい（例えば、ヘキソースホスホジエステル；ペプチド核酸）。修飾は、オリゴヌクレオチド分子内部（１若しくは繰り返し）にあるか又はその末端であってもよく、デオキシリボースなどのヌクレオシド間リン酸結合及びリン酸修飾の分子への付加を含んでもよく、それらは向かい合う鎖又は関連する酵素や他のタンパク質を切断し又は架橋する。「修飾オリゴヌクレオチド」及び「修飾ポリヌクレオチド」という用語は、糖部分への修飾（例えば、3'置換リボヌクレオチド若しくはデオキシリボヌクレオチドモノマー）を有するオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドも含み、それらのいずれも5'→3'結合を介して互いに結合する。

語句「核酸分子」及び用語「ポリヌクレオチド」は、リボヌクレオチドであろうと、デオキシヌクレオチドであろうと、任意の長さのヌクレオチドのポリマー形態を指す。これらには、一本鎖、二本鎖又は多重鎖のDNA又はRNA、ゲノムDNA、cDNA、DNA−RNAハイブリッド、あるいはプリン塩基及びピリミジン塩基、又は他の天然、化学的若しくは生化学的に修飾された、非天然若しくは誘導体したヌクレオチド塩基を含むポリマーが含まれる。ポリヌクレオチド主鎖は、（通常RNA又はDNA中に見られる）糖及びリン酸基、あるいは修飾又は置換された糖又はリン酸基を含みうる。あるいは、ポリヌクレオチドの主鎖は、ホスホルアミダイトなどの合成サブユニットのポリマーを含むことができ、すなわちオリゴデオキシヌクレオシドホスホルアミデート又はホスホルアミデート-ホスホジエステル混合オリゴマーとすることができる。ポリヌクレオチドは、メチル化ヌクレオチド及びヌクレオチドアナログなどの修飾ヌクレオチド、ウラシル、他の糖類、並びにフルオロリボース及びチオエートなどの結合基、及びヌクレオチド分枝鎖を含みうる。ポリヌクレオチドは、標識成分とのコンジュゲート化などによってさらに修飾してよい。他の修飾の種類には、キャップ、アナログによる天然ヌクレオチドの１又は複数の置換、並びにポリヌクレオチドをタンパク質、金属イオン、標識成分、他のポリヌクレオチド、又は固体支持体に付着させる手段の導入が含まれる。

「製薬上許容される」とは、生理学的適合を指す。製薬上許容される担体又は賦形剤は、投与する組成物の生物学的活性を抑止せず、化学的に不活性であり、それを投与する生物体に害を及ぼさない。

「プラスミド非含有」という修飾語句は、機能的核酸のin situ発現のための構築物（プラスミド又はウイルスベクターなど）が存在しないことを示す。

本明細書で互換的に使用される「ポリペプチド」及び「タンパク質」は、任意の長さのアミノ酸のポリマー形態を指し、翻訳、非翻訳、化学的修飾、生化学的修飾、及び誘導体化されたアミノ酸を含みうる。ポリペプチド又はタンパク質は、天然、組換え、若しくは合成、又はこれらの任意の組合せでありうる。さらに、ポリペプチド又はタンパク質は、天然タンパク質又はペプチドの断片を含みうる。ポリペプチド又はタンパク質は、単一分子でも、又は多分子複合体であってもよい。さらに、そのようなポリペプチド又はタンパク質は、修飾ペプチド主鎖を含みうる。この用語には、異種アミノ酸配列との融合タンパク質、Ｎ末端メチオニン残基を有する又は有しない異種及び同種リーダー配列との融合体、免疫学的なタグ標識タンパク質などをはじめとする融合タンパク質が含まれる。

「精製」は、その自然環境から取り出され、それが自然に伴う他の成分を少なくとも約60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.9％、又は99.99％含まない化合物を指す。

「調節性RNA」は、RNA干渉、遺伝子発現の抑制又は他の作用機構により発現に影響を及ぼすRNAの包括的なカテゴリーを意味する。従って、shRNA、siRNA、miRNA及びアンチセンスssRNAの他に、調節性RNAのカテゴリーは特にリボザイム及びデコイRNAを含む。

「リボザイム」は、ヌクレオチド塩基配列に特異的な方式で、他のRNA分子を繰り返し切断することができる酵素活性を有するRNA分子を指す。

「RNA干渉」（RNAi）は、遺伝子発現（タンパク質合成）の配列特異的又は遺伝子特異的な調節のための、相補的な又は部分的に相補的な標的RNAの分解を含む、上述したRNA誘導機構を意味する。

「配列同一性」は、類似性又は相補性の程度を指す。部分的同一又は完全同一がありうる。部分的相補配列は、同一配列がその標的ポリヌクレオチドとハイブリダイズするのを、少なくとも部分的に阻害する配列であり、この配列は機能的用語「実質的に同一」を使用して称される。標的配列と完全相補配列とのハイブリダイゼーションの阻害は、低ストリンジェンシー条件下での、ハイブリダイゼーションアッセイ（サザン又はノーザンブロット、溶液ハイブリダイゼーションなど）を使用して調べることができる。実質的に同一な配列又はプローブは、低ストリンジェンシー条件下で、完全同一配列又はプローブと標的配列との結合（すなわちハイブリダイゼーション）と競合し、かつこれを阻害する。このことは、低ストリンジェンシー条件が非特異的結合を許すようなものである、と言っているのではなく、すなわち、低ストリンジェンシー条件は、２つの配列の結合が互いに特異的（すなわち選択的）な相互作用であることを必要とする。非特異的結合が存在しないことは、部分的な程度の相補性さえも持たない（例えば同一性約30％未満の）第２の標的配列を使用することによって試験することができ、非特異的結合の不在下では、プローブは、第２の非相補的標的配列とハイブリダイズしない。

配列同一性を調べる別の方法は、２つの核酸又はポリペプチド配列に関して、特定の領域にわたって最も一致するように整列した場合、２つの配列中で同一の残基を参照することを含む。本明細書で使用する場合、「配列同一性の割合（％）」は、最適に整列した２つの配列を比較ウインドウにわたって比較することにより決定した値を意味し、その比較ウインドウ中のポリヌクレオチド配列部分は、（付加又は欠失を含まない）参照配列と比較して、２つの配列を最適に整合させるために、付加又は欠失（すなわちギャップ）を含みうる。割合（％）は、同一の核酸塩基が両配列中に生じる位置数を決定して、マッチした位置数を求め、マッチした位置数をその比較ウインドウ中の位置総数で割り、その結果を100倍して配列同一性の割合（％）を得ることにより算出する。

「短鎖干渉RNA」（siRNA）は、一般的に、RNA干渉（RNAi）を媒介することができる、約10〜約30ヌクレオチド長の二本鎖RNA分子を指す。一般に、siRNA分子は、タンパク質をコードする転写産物と直接相互作用することによってそのタンパク質の発現を低減する能力を有する。

機能性核酸の「治療上有効な」量は、本発明に従って被験者に投与した場合に薬理学的応答を引き起こす、対象の分子、例えばsiRNA、miRNA又は遊離shRNAの投与量である。従って、本発明においては、治療上有効な量は、以下により詳細に説明するように、機能性核酸を封入したミニセルを投与した場合の、動物モデル又はヒト被験者における、疾患又は障害に付随する有害な症状又は症候の予防又は改善を参考にして判断される。特定の被験者について、所定の場合における「治療上有用な量」であると判明した量は、その投与量が当業者により「治療上有効な量」であるとみなされたとしても、考慮される疾患又は症状について同様に治療される被験者の100％に対して有効なものではない。これに関して適当な投与量は、例えば影響を及ぼそうとする疾患又は症状の種類、段階及び重篤度の関数として変動するだろう。いずれの場合でも、本発明に係るin vitro試験（実施例２）並びにin vivo試験（実施例４、５、及び６）の、そして機能性核酸分子のミニセル送達量の定量に関する方法（実施例３）の本明細書の例示によって、その記載全体に照らして考慮された場合に、通常の実験により、薬物候補の前臨床試験及び臨床試験において当業者が特定の適応症のための機能性核酸の治療上有効な量を決定することができる。

「治療」、「治療すること」、「治療する」などの用語は、所望の薬理学的及び／又は生理学的効果を得ることを指す。効果は、疾患又はその症状を完全に又は部分的に予防することに関して、予防的であってよく、並びに／あるいは、疾患及び／又は疾患に帰することができる有害作用を部分的に又は完全に安定化又は治癒する点で、治療的であってよい。「治療」は、哺乳動物、特にヒトでのあらゆる疾患治療を包含し、（a）疾患又は症状にかかりやすい傾向があるが、まだ罹患していると診断されていない被験体で、疾患又は症状が生じないように予防すること、（b）疾患症状の阻害、すなわち、その発生を抑止すること、あるいは（c）疾患症状の軽減、すなわち、疾患又は症状を退行させることが含まれる。

ミニセル
本発明のミニセルは、DNA分離を伴う細胞分裂の二分裂中に、配位障害によって生じる大腸菌又は他の細菌細胞の無核形である。原核生物の染色体の複製は、細胞中央（mid-cell）隔壁形成を含む正常な二分裂に関連付けられる。大腸菌では、例えば、minCDなどのmin遺伝子が突然変異することによって、細胞分裂中の細胞極での隔壁形成の阻害が取り除かれ、正常な娘細胞及び無核ミニセルを産生させることができる。de Boerら、1992；Raskin及びde Boer、1999；Hu及びLutkenhaus、1999；Harry、2001を参照のこと。ミニセルは、ある状態で自然に発生し放出され、ミニセルとは対照的に、特定の遺伝的再構成又はエピソーム遺伝子の発現によらない他の小型小胞とは区別される。好ましい実施形態において、ミニセルはインタクトな細胞壁を有する（「インタクトなミニセル」）。

minオペロンの突然変異に加えて、無核ミニセルはまた、隔壁形成に影響する一定範囲の他の遺伝的再構成又は突然変異に続いて発生し、それは例えば枯草菌のdivIVB1中で発生する。Reeve及びCornett、1975を参照のこと。ミニセルはまた、細胞分裂／染色体分離に関与するタンパク質の遺伝子発現レベルにおける不安定により形成されることもある。例えば、minEが過剰発現すると極分裂とミニセルの産生がもたらされる。同様に、無染色体ミニセルは、染色体分離での欠陥、例えば、枯草菌でのsmc変異（Brittonら、1998）、枯草菌でのspoOJ欠失（Iretonら、1994）、大腸菌でのmukB変異（Hiragaら、1989）、及び大腸菌でのparC変異（Stewart及びD'Ari、1992）から生じる。遺伝子産物は、in transに供給されうる。高コピー数プラスミドから過剰発現される場合、例えば、CafAは細胞分裂の速度を亢進し、かつ／又は複製後の染色体分配を阻害し（Okadaら、1994）、鎖状細胞及び無核ミニセルを形成しうる（Wachiら、1989）。ミニセルは、グラム陽性又はグラム陰性起源の任意の細菌細胞から調製することができる。

一態様において、ミニセルは、送達が望まれる１又は複数のプラスミド非含有機能性核酸を含むことができる。本発明の機能性核酸は、タンパク質をコードする転写産物と直接的に相互作用することにより、そのタンパク質の発現を減少させる能力を有する。

インタクトなミニセルへの機能性核酸の封入
機能性核酸は、インタクトなミニセルに直接封入することができる。この方法は、以前に必要とされていたステップ、例えば、機能性核酸をコードする核酸の発現プラスミドへのクローニングステップ、該プラスミドによるミニセル産生親細菌の形質転換ステップ、及び組換えミニセルの作製ステップ、を回避する。代わりに、プラスミド非含有機能性核酸は、複数のインタクトなミニセルを該機能性核酸と共にバッファー中で共インキュベーションすることにより、インタクトなミニセルに直接封入することができる。いくつかの実施形態において、共インキュベーションは、穏やかな振盪を含んでもよく、別の実施形態では、共インキュベーションは静的である。約１時間の共インキュベーション時間が十分であることが証明されているが、より短い時間、例えば約0.5時間なども有効でありうる。一実施形態では、上記バッファーは、緩衝生理食塩水、例えば、1Xリン酸緩衝溶液を含む。緩衝生理食塩水はゼラチン形態であってもよい。別の実施形態では、共インキュベーションは、約4℃〜約37℃、約20℃〜約30℃、約25℃、又は約37℃の温度で実施する。他の態様において、共インキュベーションには、約10⁷、10⁸、10⁹、10¹⁰、10¹¹、10¹²、又は10¹³個のミニセルを含有させることができる。温度、時間、バッファー、ミニセル濃度などの具体的なパラメータは、特定の条件の組み合わせについて最適化することができる。

この手法の成功は驚くべきである。なぜなら、40年以上にもわたって、核酸を細菌細胞に形質転換するための多様な化学的及び電気化学的プロセスが当業者により開発されてきたためである（Miller, 1994により概説されている）。当業者は、siRNA、miRNA又はプラスミド非含有shRNAなどの核酸がミニセル細胞質に受動的に侵入するには大きすぎるという従来の知識のために、このような過酷な手段を利用してきた。例えば、拡散孔として典型的に機能するβ-バレルタンパク質であるポリンは、分子量600ダルトン以下の分子の細菌外膜を通過する受動輸送を可能にする（Nikaido, 1994）。その一方で、shRNAをコードする二本鎖プラスミドDNAは100万ダルトンを超え、二本鎖siRNA又はmiRNAは15,000ダルトンを超える。

さらに、機能性核酸は封入された後、ミニセル内部にとどまり、分解から保護される。この点に関し、滅菌生理食塩水中でインキュベートしたsiRNA封入ミニセルを用いたインキュベーションの延長試験ではsiRNAの漏出が示されなかった。さらに、siRNA封入ミニセルをヌクレアーゼと共インキュベーションすることによって、siRNAがインタクトなミニセルの外膜を貫通し、分解から保護されたことが確認された。同様に、ミニセルが親細菌細胞質からの残存ヌクレアーゼを保持すると予想されている事実にもかかわらず、封入されたsiRNAはミニセル細胞質内で安定である。封入されたsiRNAはまたファゴリソソーム内に存在する分解機構（酸、酸素フリーラジカル及び酸性加水分解酵素など）を回避し（Conner and Schmid, 2003）、哺乳動物細胞内において標的mRNAノックダウンを実行する。

他の実施形態において、異なるmRNA標的に対する複数の機能性核酸を同じミニセルに封入することができる。このような手法は、薬物耐性及びアポトーシス耐性に対処するために用いることができる。例えば、癌患者は通常、化学療法剤に対して耐性を示す。このような耐性は、多剤耐性（MDR）ポンプなどの遺伝子、及び抗アポトーシス遺伝子などの過剰発現によって媒介されうる。この耐性に対処するため、MDR関連遺伝子に対する治療上有意な濃度の機能性核酸をミニセルに封入し、それを化学療法の前に患者に投与することができる。さらに、異なるmRNA標的に対する複数の機能性核酸を同じミニセルに封入することによって、治療の成功を高めることができる。なぜなら、大部分の分子標的が突然変異を受け、複数のアレルを有するためである。

従って、本明細書で上述したようなインタクトなミニセルへの直接的なプラスミド非含有機能性核酸の封入は多くの利点を提供する。例えば、本発明の方法は機能性核酸の発現に適合させるための親細菌の遺伝子改変が必要ないため、１つの親細菌を用いて、種々の適応に対する多くの種類の核酸を含むミニセルを産生することが可能である。同様に、ミニセルは、多様な異なるRNAを積載することができ、それにより耐性機構を回避又は克服することができる。

機能性核酸
上述したように、機能性核酸は、RNA干渉、遺伝子発現の抑制又は他の作用機構により発現に影響を及ぼす核酸分子の包括的なカテゴリーを意味する。このような分子は、例えば一本鎖、二本鎖又は多重鎖のDNA又はRNAである。機能性核酸の例としては、限定されるものではないが、調節性RNA、例えばshRNA、siRNA、miRNA及びアンチセンスssRNA、そしてまたリボザイム及びデコイRNA、並びにアンチセンス核酸などが挙げられる。

本発明の好ましい実施形態において、インタクトなミニセルはsiRNA分子を有する。短鎖干渉RNA分子は、転写後遺伝子サイレンシングメカニズムであるRNAiの実施に有用である。上述したように、「siRNA」は、一般的には、約10〜約30ヌクレオチド長の二本鎖RNA分子を指し、タンパク質の発現を特異的に干渉するその能力にちなんで名付けられた。好ましくは、siRNA分子は12〜28ヌクレオチド長であり、より好ましくは15〜25ヌクレオチド長であり、よりさらに好ましくは19〜23ヌクレオチド長であり、最も好ましくは21〜23ヌクレオチド長である。従って、siRNA分子は、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28又は29ヌクレオチド長であることが好ましい。

一方の鎖の長さが、siRNA分子の長さを表す。例えば、21リボヌクレオチド長（21mer）として記載されているsiRNAは、互いにアニールして19個の連続した塩基対を形成する、２本の対向するRNA鎖を含みうる。各鎖の２個の残存するリボヌクレオチドは、「オーバーハング」を形成する。siRNAが長さの異なる２本の鎖を含む場合、長い方の鎖がsiRNAの長さを表す。例えば、21ヌクレオチド長の一本の鎖と、20ヌクレオチド長の第２の鎖を含むdsRNAは21merを構成する。

オーバーハングを含むsiRNAが望ましい。オーバーハングは、鎖の5’末端又は3’末端にありうる。オーバーハングはRNA鎖の3’末端にあるのが好ましい。オーバーハングの長さは、様々であってよいが、約１〜約５塩基が好ましく、約２ヌクレオチド長がより好ましい。本発明のsiRNAは、約２〜４塩基の3’オーバーハングを含むのが好ましい。3’オーバーハングは２リボヌクレオチド長であるのがより好ましい。3’オーバーハングを含む２個のリボヌクレオチドは、ウリジン（U）であることがさらにいっそう好ましい。

shRNAは、ステムループ構造を形成する一本鎖RNAを含み、その際、ステムは、二本鎖siRNAを含む、相補センス鎖及びアンチセンス鎖からなり、ループは様々なサイズのリンカーである。一般的に、shRNAのステム構造は、約10〜約30ヌクレオチド長である。shRNA分子のステムは、12〜28ヌクレオチド長であることが好ましく、より好ましくは15〜25ヌクレオチド長、よりさらに好ましくは19〜23ヌクレオチド長、最も好ましくは21〜23ヌクレオチド長である。従って、shRNA分子は、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、又は29ヌクレオチド長のステムを含むのが好ましい。

本発明のsiRNAは、標的リボヌクレオチド配列と相互作用するように設計され、それは、siRNAが、標的配列とハイブリダイズするのに十分に標的配列に相補的であることを意味する。一実施形態では、本発明は、標的リボヌクレオチド配列又は標的リボヌクレオチド配列の相補鎖に対して少なくとも70％、75％、80％、85％又は90％の同一性を有するリボヌクレオチド配列を含むsiRNA分子を提供する。好ましくは、siRNA分子は、標的リボヌクレオチド配列又は標的リボヌクレオチド配列の相補鎖に対して少なくとも90％、95％、96％、97％、98％、99％又は100％の同一性を有する。最も好ましくは、siRNAは、標的ヌクレオチド配列又はリボヌクレオチド配列の相補鎖に100％同一である。しかし、標的と比較して挿入、欠失、又は単一点突然変異を有するsiRNA分子も有効でありうる。

従って、本発明の一態様において、インタクトなミニセルは、薬物耐性又はアポトーシス耐性遺伝子のサイレンシングを目的とした１又はそれ以上のsiRNA配列を有することができる。複数のsiRNAをコードするミニセルを用いることにより、多剤耐性機構を発現している細胞を処理することが可能である。

siRNA及び調節性RNA全般の設計を補助するツールは、公に容易に利用可能である。例えば、コンピュータに基づくsiRNA設計ツールは、www.dharmacon.comでインターネット上で利用可能である。

機能性核酸の標的
本発明の機能性核酸は、薬物耐性を促進する、アポトーシスを阻害する、新生物の表現型を促進する、病原体の増殖を阻害する、又はウイルスの複製若しくは増殖を阻害するタンパク質の遺伝子又は転写産物を標的とする。こうした状況における機能性核酸戦略の適用の成功は、当技術分野で既になされているが、ミニセルベクターの利点によるものではない。例えば、Sioud（2004）、Caplen（2003）、Wuら（2003）、Yagueら（2004）を参照のこと。

薬物耐性、又は新生物表現型の促進に関与するタンパク質は、機能性核酸の好ましい標的である。これらのタンパク質は、後天的薬物耐性又は内因性薬物耐性に関与している可能性がある。腫瘍細胞などの疾患細胞が、最初は薬物に応答するが、次の治療サイクルで不応性になる場合、耐性表現型は後天的である。後天的又は内因性の薬物耐性に関与する有用な標的には、限定されるものではないが、ATP結合カセットトランスポーター、例えばP-糖タンパク質（P-gp）、P-170、PGY1、MDR1、ABCB1、MDR関連タンパク質、多剤耐性タンパク質1、MDR-2、及びMDR-3、MRP2（多剤耐性関連タンパク質）、BCR-ABL（切断点クラスター領域−アベルソンプロトオンコジーン）、STI-571耐性関連タンパク質、肺耐性関連タンパク質、シクロオキシゲナーゼ-2、核内因子κ、XRCC1（X線交差補完群1）、ERCC1（切除交差補完遺伝子）、GSTP1（グルタチオンS-トランスフェラーゼ）、変異型β-チューブリン、Abcb1a（ABCB4）、Abcc1、Abcc2、Abcc3（MLP-2）、Abcc5、Abcc6、Abcd2、Abcg2、Bax、Bcl2、Bcl2l（bcl-x）、Mvp、Rb1、Top1、Top2a、Top2b、Trp53（p53）がある。薬物耐性に関与する他の遺伝子には、以下が挙げられる：（a）薬物代謝に関与する遺伝子、例えばArnt、Blmh、C130052I12Rik（CRR9p）、Comt、Crabp1、Cyp1a1、Cyp1a2、Cyp2b19、Cyp2b20、Cyp2c29、Cyp2c40、Cyp2c70、Cyp2d22、Cyp2e1、Dhfr、Ephx1、Ephx2、Gstm1（MGST1）、Gstp1、Nat2、Nqo1、Sod1、Ste、Tpmt、Tyms、Ugcg、（b）DNA修復に関与する遺伝子、例えばApc、Atm、Brca1、Brca2、Ercc3（XPB）、Mgmt、Mlh1、Xpa、Xpc、（c）細胞周期に関与する遺伝子、例えばCcnd1（サイクリンD1）、Ccne1（サイクリンE1）、Cdk1、Cdk2、Cdk4、Cdkn1a（p21Waf1）、Cdkn1b（p27Kip1）、Cdkn2a（p16Ink4a）、Cdkn2d（p19）、KSP、（d）成長因子（増殖因子）受容体に関与する遺伝子、例えばEgfr、Erbb2（Neu、HER2）、Erbb3、Erbb4、Fgf2（bFGF）、Met、（e）ホルモン受容体に関与する遺伝子、例えばAr、Esr1、Esr2、Igf2r、Ppara、Ppard、Pparg、Ppargc1、Rara、Rarb、Rxra、Rxrb、Rxrg、Srd5a2、並びに（f）転写因子に関与する遺伝子、例えばAhr、Ap1s1、Ap1s2、Elk1、Fos（c-fos）、Gabpa、Hif1a、Mafb、Myc（c-myc）、Nfkb1、Nfkb2、Nfkbib、Nfkbie、Relb（l-rel）、Tnfrsf11A。

有用な標的には、アポトーシス耐性に関与するタンパク質も含まれる。これらには、Bcl-2（B細胞白血病／リンパ腫）、Bcl-X_L、A1/Bfl1、焦点接着キナーゼ、及びp53突然変異タンパク質が含まれる。

有用な標的にはさらに、発癌性及び突然変異型腫瘍抑制タンパク質が含まれる。例えば、β-カテニン、PKC-α（プロテインキナーゼC）、C-RAF、K-Ras（V12）、h-Ras、DP97 DeadボックスRNAヘリカーゼ、DNMT1（DNAメチルトランスフェラーゼ1）、FLIP（Flice様阻害タンパク質）、C-Sfc、53BPI、ポリコーム群タンパク質EZH2（zesteホモログエンハンサー）、ErbB1、HPV-16 E5、及びE7（ヒト乳頭腫ウイルス初期5及び初期7）、フォルティリン（Fortilin）及びMCI1P（骨髄細胞白血病1タンパク質）、DIP13α（DDC相互作用タンパク質13a）、MBD2（メチルCpG結合ドメイン）、p21、KLF4（Kruppel様因子4）、tpt/TCTP（翻訳制御腫瘍タンパク質）、SPK1及びSPK2（スフィンゴシンキナーゼ）、P300、PLK1（Polo様キナーゼ-1）、Trp53、Ras、ErbB1、VEGF（血管内皮増殖因子）、及びBAG-1（BCL2関連の抗死遺伝子（athanogene）1）が含まれる。

癌治療のための多数の分子標的が同定されており、RNAiの発見が、ある範囲の種々の新規標的を迅速に同定する基礎となっている。本発明において有用な、そのような分子標的の例としては、チロシンキナーゼ（変異体）、Akt（プロテインキナーゼB、PKB）、Akt1、αLβ2インテグリン、アミノペプチダーゼ、アンドロゲン受容体、Aurora A、AuroraB、塩基性線維芽細胞増殖因子（bFGF）受容体（bFGFr）、BRaf、癌胎児性抗原（CEA）、CD142、CD37、CD44、CD5、CD74、CD77、Chk1、CHK2、CHras、CSF1r、CXCR4、サイクリンD1（CCND1）、サイクリン依存性キナーゼ1（CDK1）、サイクリン依存性キナーゼ2（CDK2）、サイクリン依存性キナーゼ阻害因子1B（CDKN1B、p27、KIP1）、CYP26、線維芽細胞増殖因子受容体3（FGFr3）、線維芽細胞増殖因子受容体4（FGFr4）、G250、Hedgehog（Hh）シグナル伝達経路、肝細胞増殖因子/散乱因子（HGF/SF若しくはSF/HGF）、HEr4（ErbB4）、HIF、ヒストンデアセチラーゼ9（HDAC9）、ホメオボックス遺伝子（HOXB7）、ヒアルロナン（HA）、インスリン様成長因子（IGF）、インスリン様成長因子1受容体（IGF1r、IGF1r、IGFIr、IGFIr）、インスリン様成長因子結合タンパク質2（IGFBP2）、インスリン様成長因子結合タンパク質5（IGFBP5）、インテグリン様キナーゼ（ILK）、インターロイキン（IL6）受容体、インターロイキン1（IL1）受容体II型、インターロイキン10（IL10）、インターロイキン4（IL4）受容体、インターロイキン6（IL6）、インターロイキン15（IL15）、インターロイキン3受容体α（IL3r α）鎖、JAK、JAK3、JNK1、JNK2、キネシン紡錘タンパク質（KSP）、ラミニン5、Lewis（b）、リンホトキシン（LT）β受容体（LTBr）、リゾホスファチジン酸（LPA）受容体（LPAr）、リゾホスファチジン酸アシルトランスフェラーゼ、マクロファージ遊走阻止因子（MIF）、MAGE3、微小管、MUC2、Notch 1（TAN1）、P38マイトジェン活性化プロテインキナーゼ（p38 MAPK）、アポト
ーシスのP53上方調節メディエーター（PUMA）、PDGFチロシンキナーゼ（TK）シグナル伝達経路、ホスファターゼ及びテンシンホモログ（PTEN）、ホスファチジルイノシトール3キナーゼ（PI3K）、プラスミノーゲン活性化因子、ウロキナーゼ（PLAU）受容体（PLAUr）、ポロ様キナーゼ1（Plk1）、Poly（ADPリボース）、ポリメラーゼ（PARP）、増殖性細胞核抗原（PCNA）、前立腺幹細胞抗原（PSCA）、前立腺特異抗原（PSA）773、タンパク質チロシンホスファターゼ（PTP）、Rad51タンパク質、RAF1、レチノイン酸受容体（RAr）α、レチノイン酸受容体（RAr）γ、レチノイドX受容体（RXr）β、セリン（若しくはシステイン）プロテイナーゼ阻害因子、テロメラーゼ逆転写酵素（TERT、hTERT）、テロメア、トムゼン・フリーデンライヒ（TF）抗原、トロンボスポンジン1（TSP1）、トランスフェリン、腫瘍壊死因子α（TNFa、TNFA）、腫瘍壊死因子受容体（TNFr、TNFr）、腫瘍関連炭酸脱水素酵素（CA）IX（CA9）、I型インターフェロン、ユビキチンリガーゼ、血管細胞接着分子1（VCAM1、CD106）、血管内皮増殖因子（VEGF、VEGFA）、血管内皮増殖因子D（VEGFD）、ビトロネクチン（VTN）、ウィルムス腫瘍1（WT1）などが挙げられる。

HIV感染に関しては、標的には、HIV-Tat、HIV-Rev、HIV-Vif、HIV-Nef、HIV-Gag、HIV-Env、LTR、CD4、CXCR4（ケモカイン受容体）、及びCCR5（ケモカイン受容体）が含まれる。

腫瘍細胞の異種性のために、いくつかの異なる薬物耐性又はアポトーシス耐性経路が、標的細胞中で作動する可能性がある。従って、本発明の方法で使用する機能性核酸は、経時変化が求められる可能性がある。例えば、後天的薬物耐性をもたらす新たな突然変異が生検試料により明らかになった場合、特異的な機能性核酸を設計し、インタクトなミニセルに封入し、それを後天的薬物耐性に対処するために哺乳動物宿主に投与することができる。

インタクトなミニセルを介した機能性核酸の送達
第２の態様において、本発明は、機能性核酸の送達方法であって、（a）製薬上許容される担体中の複数のインタクトなミニセルを用意するステップであって、上記複数の各々のミニセルがプラスミド非含有機能性核酸を含有する、上記ステップ、及び（b）上記複数のミニセルを哺乳動物細胞と接触させて、該哺乳動物細胞が該複数のミニセルを取り込み、これにより、該機能性核酸が標的細胞の細胞質に放出されるようにするステップを含む方法を提供する。ミニセルは、PCT出願公開WO 05/056749号に記載のように、二重特異性リガンドを介して標的哺乳動物細胞と接触させる。ミニセルと標的哺乳動物細胞との接触は、in vitro又はin vivoで行うことができる。

薬物耐性を克服し疾患を治療する方法
別の態様では、本発明は、被験体において、薬物耐性を克服し、癌やAIDSなどの疾患を治療する方法を提供する。本方法は、（a）薬物耐性を促進するタンパク質の遺伝子又は転写産物を標的化する１又はそれ以上の機能性核酸を、精製されたインタクトなミニセルに封入するステップ、（b）上記で引用した’749PCT出願（参照により本明細書に組み入れられる）に記載されているように前記機能性核酸を含有するミニセルを標的哺乳動物細胞と接触させて、該哺乳動物細胞が該ミニセルを取り込むようにするステップと、（c）PCT出願公開WO05/079854号に記載されているように該標的哺乳動物細胞に薬物を送達するステップとを含む。好ましくは、ステップ（a）及び（b）の後にステップ（c）を実施して、薬物を投与する前に機能性核酸が薬物に対する耐性を減少できるようにする。薬物の送達及び機能性核酸の導入は、任意の順序で連続的に、又は同時に行うことができる。

本発明によれば、任意の慣用手段によって薬物を送達することができる。例えば、経口、非経口（皮下、静脈内、筋肉内、腹腔内、及び注入など）、局所、経皮、又は吸入によって薬物を送達することができる。各薬物の適当な送達方式及び投与量は、医学分野の当業者が容易に確かめることができる。

ミニセルを介した薬物送達
薬物送達は、慣用の手段により行うことができるが、PCT出願公開WO05/079854号（参照により本明細書に組み入れられる）に記載されているように、ミニセルを介した送達が好ましい。この点で、本発明者らは、異なる内容物を封入し、標的化したインタクトなミニセルにより、同一の哺乳動物細胞を首尾よく再トランスフェクトできることを発見した。例えば、機能性核酸が封入されたミニセルを哺乳動物細胞にトランスフェクトし、その後、薬物を封入したミニセルが、薬物をその同じ哺乳動物細胞に送達することができ、補完的又は相乗的な抗腫瘍効果が得られる。

薬物は、機能性核酸とは別のミニセル中に封入することができる。あるいは、薬物は、機能性核酸分子と同じミニセル中に封入することができる。ある種の薬物は、核酸と相互作用し、同一ミニセル中への薬物及び核酸の同時封入を不可能にする。例えば、ドキソルビシンは、DNAと相互作用することが知られている。

好ましくは、本発明のミニセルは、標的細胞に対して薬物の生理学的又は薬理学的効果を発揮するのに十分な量の薬物を含む。また、ミニセルに含まれる薬物は、ミニセルの親細菌細胞が通常はその薬物を産生しないという意味で、ミニセルに対して異種、すなわち外来であるのが好ましい。

親水性及び疎水性薬物は、ミニセルを含む細胞外媒体とミニセル細胞質との間の薬物の濃度勾配を作成することによって、ミニセル中に封入することができる。細胞外媒体の薬物濃度がミニセル細胞質よりも高い場合、薬物は自然にこの濃度勾配を下ってミニセル細胞質中へ移動する。しかし、濃度勾配が逆転している場合、薬物はミニセルの外へ移動しない。薬物をミニセルに積載（loading）するための手順及び機構は、PCT出願公開WO05/079854号に記載されているとおりである。

ミニセルに通常、水溶性ではない薬物をロードするためには、最初に薬物を適当な溶媒に溶解することができる。例えば、パクリタキセルは、エタノールとクレモフォアEL（ポリエトキシル化ヒマシ油）の1：1混合物に溶解し、続いてPBSで希釈して、水性媒体に部分的に希釈され、そして必要最小限の量の有機溶媒を有して、薬物が確かに溶液中に残存する、パクリタキセル溶液を得ることができる。薬物のロードのために、ミニセルをこの最終媒体中でインキュベートすることができる。そのようにして、本発明者らは、疎水性薬物でさえも、ミニセルの細胞質中に拡散して、高いそして治療上有意な、細胞質への薬物のロードを実現することができることを発見した。ミニセル膜は、疎水性分子が細胞質中に拡散するのを防止すると推測される疎水性リン脂質二重層から構成されるので、これは予想外であった。

ミニセルに薬物をロードする別の方法は、組換え親細菌細胞が薬物をコードする核酸を転写翻訳し、その結果、薬物が親細菌細胞の細胞質に放出されるような条件下で、組換え親細菌細胞を培養するステップを含む。例えば、所望の薬物のため細胞の生合成経路をコードする遺伝子クラスターをクローニングし、ミニセルを産生することができる親細菌株中に移送することができる。遺伝子クラスターの遺伝子転写翻訳によって、親細菌細胞の細胞質中で薬物は生合成され、細菌の細胞質内は薬物で満たされる。親細菌細胞が分裂し子孫ミニセルを形成する場合、ミニセルもその細胞質に薬物を含む。予め封入したミニセルは、上記の方法論などの任意の好適なミニセル精製法によって精製することができる。

同様に、ミニセルに薬物をロードする別の方法は、薬物をコードする遺伝子がミニセル内で転写翻訳されるような条件下で、薬物をコードする発現プラスミドを含む組換えミニセルを培養するステップを含む。

薬物
本発明で有用な薬物は、動物、特に哺乳動物及びヒトで所望の局所的又は全身的効果をもたらす、任意の生理学的に又は薬理学的に活性な物質でありうる。薬物は、限定されるものではないが、ペプチド、タンパク質、核酸、及び小分子をはじめとする無機又は有機化合物であってよく、そのいずれも特性決定されていても又は特性決定されていなくてもよい。薬物は、様々な形態、例えば、未変化分子、分子複合体、薬理学的に許容される塩、例えば、塩酸塩、臭化水素酸塩、硫酸塩、ラウリン酸塩、パルミチン酸塩、リン酸塩、亜硝酸塩、硝酸塩、ホウ酸塩、酢酸塩、マレイン酸塩、酒石酸塩、オレイン酸塩、サリチル酸塩などであってよい。酸性薬物には、金属塩、アミン、又は有機カチオン、例えば、四級アンモニウムを使用することができる。塩基、エステル、及びアミドなどの薬物の誘導体を使用することもできる。非水溶性薬物は、その水溶性誘導体の形で、又はその塩基誘導体として使用することができ、その誘導体は、どちらの場合でも、又はその送達により、酵素により転換される、身体のpHにより、又は他の代謝過程により、元の治療活性形態へ加水分解される。

有用な薬物には、化学療法剤、免疫抑制剤、サイトカイン、細胞傷害性薬物、核溶解性（nucleolytic）化合物、放射性同位元素、受容体、及びプロドラッグ活性化酵素が含まれ、これらは天然に存在するか又は組換え法により生成しうる。

従来の多剤耐性により影響を受ける薬物、例えば、ビンカアルカロイド（例えばビンブラスチン及びビンクリスチンなど）、アントラサイクリン（例えばドキソルビシン及びダウノルビシンなど）、RNA転写インヒビター（例えばアクチノマイシン-Dなど）及び微小管安定化薬（例えばパクリタキセルなど）が、本発明では特に有用性を有する。

一般に、癌化学療法剤が好ましい薬物である。有用な癌化学療法剤には、ナイトロジェンマスタード、ニトロソウレア、エチレンイミン、アルカンスルホナート、テトラジン、白金化合物、ピリミジンアナログ、プリンアナログ、代謝拮抗物質、葉酸アナログ、アントラサイクリン、タキサン、ビンカアルカロイド、トポイソメラーゼインヒビター及びホルモン剤が含まれる。代表的な化学療法剤は、アクチノマイシン-D、アルケラン、Ara-C、アナストロゾール、アスパラギナーゼ、BiCNU、ビカルタミド、ブレオマイシン、ブスルファン、カペシタビン、カルボプラチン、カルボプラチナ（Carboplatinum）、カルムスチン、CCNU、クロランブシル、シスプラチン、クラドリビン、CPT-11、シクロホスファミド、シタラビン、シトシンアラビノシド、サイトキサン、ダカルバジン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デクスラゾキサン、ドセタキセル、ドキソルビシン、DTIC、エピルビシン、エチレンイミン、エトポシド、フロクスウリジン、フルダラビン、フルオロウラシル、フルタミド、ホテムスチン、ゲムシタビン、ハーセプチン、ヘキサメチルアミン、ヒドロキシ尿素、イダルビシン、イホスファミド、イリノテカン、ロムスチン、メクロレタミン、メルファラン、メルカプトプリン、メトトレキセート、マイトマイシン、ミトタン、ミトキサントロン、オキサリプラチン、パクリタキセル、パミドロネート、ペントスタチン、プリカマイシン、プロカルバジン、リツキシマブ、ステロイド、ストレプトゾシン、STI-571、ストレプトゾシン、タモキシフェン、テモゾロマイド、テニポシド、テトラジン、チオグアニン、チオテパ、トムデックス、トポテカン、トレオスルファン（Treosulphan）、トリメトレキセート、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン、ビノレルビン、VP-16、及びゼローダである。

有用な癌化学療法剤には、以下のものも含まれる：アルキル化剤、例えば、チオテパ及びシクロスホスファミド（cyclosphosphamide）；スルホン酸アルキル類、例えば、ブスルファン、インプロスルファン、及びピポスルファン；アジリジン、例えば、ベンゾドーパ（Benzodopa）、カルボコン、メツレドーパ（Meturedopa）、及びウレドーパ（Uredopa）；以下を含むエチレンイミン及びメチルアメラミン（methylamelamine）：アルトレタミン、トリエチレンメラミン、トリエチレンホスホルアミド、トリエチレンチオホスファオルアミド、及びトリメチルオロメラミン（trimethylolomelamine）；ナイトロジェンマスタード、例えば、クロランブシル、クロルナファジン、クロロホスファミド（Cholophosphamide）、エストラムスチン、イホスファミド、メクロレタミン、メクロレタミンオキシド塩酸塩、メルファラン、ノベムビエヒン（Novembiehin）、フェネステリン（Phenesterine）、プレドニムスチン、トロホスファミド、ウラシルマスタード；ニトロ尿素、例えば、カヌスチン（Cannustine）、クロロゾトシン、ホテムスチン、ロムスチン、ニムスチン、及びラニムスチン；抗生物質、例えば、アクラシノマイシン（Aclacinomysin）、アクチノマイシン、アウスラマイシン（Authramycin）、アザセリン、ブレオマイシン、カクチノマイシン、カリケアミシン、カラビシン（Carabicin）、カルミノマイシン（Carminomycin）、カルジノフィリン（Carzinophilin）、クロモイニシン（Chromoinycin）、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デトルビシン、6-ジアゾ-5-オキソ-L-ノルロイシン、ドキソルビシン、エピルビシン、エソルビシン（Esorubicin）、イダンビシン（Idambicin）、マルセロマイシン（Marcellomycin）、マイトマイシン、ミコフェノール酸、ノガラマイシン（Nogalamycin）、オリボマイシン（Olivomycins）、ペプロマイシン、ポトフィロマイシン（Potfiromycin）、ピューロマイシン、ケラマイシン（Quelamycin）、ロドルビシン（Rodorubicin）、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、ツベルシジン（Tubercidin）、ウベニメクス、ジノスタチン、及びゾルビシン；代謝拮抗剤、例えば、メトトレキセート及び5-フルオロウラシル（5-FU）；葉酸アナログ、例えば、デノプテリン（Denopterin）、メトトレキセート、プテロプテリン（Pteropterin）、及びトリメトレキセート；プリンアナログ、例えば、フルダラビン、6-メルカプトプリン、チアミプリン（Thiamiprine）、及びチオグアニン；ピリミジンアナログ、例えば、アンシタビン、アザシチジン、6-アザウリジン（azauridine）、カルモフール、シタラビン、ジデオキシウリジン、ドキシフルリジン、エノシタビン、フロックスウリジン、及び5-FU；アンドロゲン、例えば、カルステロン（Calusterone）、プロピオン酸ドロモスタノロン、エピチオスタノール、ルネピチオスタン（Rnepitiostane）、及びテストラクトン；抗アドレナリン薬、例えば、アミノグルテチミド、ミトタン、及びトリロスタン；葉酸補剤、例えば、フロリン酸（frolinic acid）；アセグラトン；アルドホスファミド（aldophosphamide）グリコシド；アミノレブリン酸；アムサクリン；ベストラブシル（Bestrabucil）；ビサントレン；エダトラキセート（Edatraxate）；デホファミン（Defofamine）；デメコルシン；ジアジコン；エルホルニチン（Elfornithine）；酢酸エリプチニウム（elliptinium）；エトグルシド；硝酸ガリウム；ヒドロキシ尿素；レンチナン；ロニダミン；ミトグアゾン；ミトキサントロン；モピダモール；ニトラクリン；ペントスタチン；フェナメト（Phenamet）；ピラルビシン；ポドフィリン酸（podophyllinic acid）；2-エチルヒドラジド；プロカルバジン；PSK（登録商標）；ラゾキサン；シゾフラン（Sizofrran）；スピロゲルマニウム；テヌアゾン酸；トリアジクオン；2,2',2''-トリクロロトリエチルアミン；ウレタン；ビンデシン；ダカルバジン；マンノムスチン；ミトブロニトール；ミトラクトール；ピポブロマン；ガシトシン（Gacytosine）；アラビノシド（「Ara-C」）；シクロホスファミド；チオテパ；タキソイド、例えば、パクリタキセル（TAXOL(登録商標)、Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, NJ）及びドキセタキセル（Doxetaxel）（TAXOTERE(登録商標)、Rhone-Poulenc Rorer, Antony, France）；クロランブシル；ゲムシタビン；6-チオグアニン；メルカプトプリン；メトトレキセート；白金アナログ、例えば、シスプラチン及びカルボプラチン；ビンブラスチン；白金；エトポシド（VP-16）；イホスファミド；マイトマイシンC；ミトキサントロン；ビンクリスチン；ビノレルビン；ナベルビン；ノバントロン；テニポシド；ダウノマイシン；アミノプテリン；ゼローダ；イバンドロネート；CPT-11；トポイソメラーゼインヒビターRFS2000；ジフルオロメチルオルニチン（DMFO）；レチノイン酸；エスペラマイシン（Esperamicins）；カペシタビン；並びに上記のいずれかの製薬上許容される塩、酸、又は誘導体。さらに、以下のものが含まれる：腫瘍に対するホルモン作用を調節するか又は阻害する働きをする抗ホルモン剤、例えば、以下をはじめとする抗エストロゲン薬：例えば、タモキシフェン、ラロキシフェン、アロマターゼ阻害4(5)-イミダゾール、4-ヒドロキシタモキシフェン、トリオキシフェン、ケオキシフェン（Keoxifene）、オナプリストン、及びトレミフェン（フェアストン）；並びに抗アンドロゲン薬、例えば、フルタミド、ニルタミド、ビカルタミド、ロイプロリド、及びゴセレリン；並びに上記のいずれかの製薬上許容される塩、酸又は誘導体。

有用な薬物には、サイトカインも含まれる。そのようなサイトカインの例は、リンホカイン、モノカイン、及び従来のポリペプチドホルモンである。サイトカインに含まれるものは、成長ホルモン、例えば、ヒト成長ホルモン、N-メチオニルヒト成長ホルモン、及びウシ成長ホルモン；副甲状腺ホルモン；チロキシン；インスリン；プロインスリン；リラキシン；プロレラキシン；糖タンパク質ホルモン、例えば、濾胞刺激ホルモン（FSH）、甲状腺刺激ホルモン（TSH）、及び黄体化ホルモン（LH）；肝臓増殖因子；線維芽細胞増殖因子；プロラクチン；胎盤ラクトゲン；腫瘍壊死因子α及びβ；ミュラー管抑制物質；マウスゴナドトロピン関連ペプチド；インヒビン；アクチビン；血管内皮増殖因子；インテグリン；トロンボポエチン（TPO）；神経成長因子、例えば、NGF-β；血小板増殖因子；トランスフォーミング増殖因子（TGF）、例えば、TGF-α及びTGF-β；インスリン様成長因子-I及び-II；エリスロポエチン（EPO）；骨誘導因子；インターフェロン、例えば、インターフェロン-α、-β、及び-γ；コロニー刺激因子（CSF）、例えば、マクロファージ-CSF（M-CSF）；顆粒球-マクロファージ-CSF（GM-CSF）；及び顆粒球-CSF（GCSF）；インターロイキン（IL）、例えば、IL-1、IL-1a、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-11、IL-12、IL-15；腫瘍壊死因子、例えば、TNF-α又はTNF-β；LIF及びkitリガンド（KL）をはじめとする他のポリペプチド因子である。本明細書で使用するように、サイトカインという用語には、天然供給源由来又は組換え細胞培養物由来のタンパク質、及びネイティブ配列サイトカインの生物活性等価物が含まれる。

薬物は、続いて、例えばペプチジル化学療法剤などのプロドラッグを活性な抗癌薬物に変換するプロドラッグ活性化酵素により、活性化される、プロドラッグであってよい。例えば、WO88/07378号、WO81/01145号、米国特許第4,975,278号を参照のこと。一般に、酵素成分には、プロドラッグをより活性な細胞傷害性の形態に変えるような方式で、プロドラッグに作用することができる任意の酵素が含まれる。

ミニセルを特異的哺乳動物細胞に標的化する
本発明の一態様では、PCT出願公開WO05/056749号及びWO05/079854号に記載されているように、ミニセルは、二重特異性リガンドを介して標的哺乳動物細胞に指向する。ミニセルと哺乳動物細胞成分の両方に対する特異性を有する二重特異性リガンドは、ミニセルが哺乳動物細胞によって取り込まれ、それにより機能性核酸が哺乳動物細胞の細胞質に放出されるように、ミニセルと哺乳動物細胞とを結合させる。この標的化した送達法は、in vivo若しくはin vitroで、又はin vivoとin vitroの両方で実施することができる。

二重特異性リガンド、ミニセル、及び哺乳動物細胞間の接触は、いくつかの異なる方式で生じうる。in vivo送達には、既に二重特異性リガンドが結合したミニセルを投与するのが好ましい。従って、ミニセル、二重特異性リガンド、及び標的細胞は全て、二重特異性リガンド標的化ミニセルが、in vivoで標的細胞に到達した時に接触する。あるいは、二重特異性リガンド及びミニセルは、in vivoで別々に投与することができる。

二重特異性リガンド、ミニセル、及び哺乳動物細胞間の接触は、in vitroでの一回又は複数のインキュベーション中に行うこともできる。一実施形態では、３種の要素を同時に全て一緒にインキュベートする。あるいは、段階的インキュベーションを行うこともできる。段階的手法の一例では、初めにミニセルと二重特異性リガンドを一緒にインキュベートして二重特異性リガンド標的化ミニセルを形成させ、続いてこれを標的細胞と共にインキュベートする。別の例では、二重特異性リガンドを初めに標的細胞と共にインキュベートし、続いてミニセルとインキュベートする。一回又は複数のin vitroインキュベーションとin vivo投与との組合せによっても、二重特異性リガンド、ミニセル、及び哺乳動物標的細胞を接触させることができる。

本発明者らは、標的化した送達手法は、特異的接着及びミニセルのエンドサイトーシスに通常不応である細胞を含め、一定範囲の哺乳動物細胞に広く適用可能であることを見出した。例えば、一方のアーム上に抗O-多糖体特異性を有し、他方のアーム上に抗HER2受容体、又は抗EGF受容体の特異性を有する二重特異性抗体リガンドは、ミニセルと一定範囲の標的非貪食性細胞上のそれぞれの受容体とを効率よく結合させる。これらの細胞には、肺、卵巣、脳、乳房、前立腺、及び皮膚癌細胞が含まれる。さらに、効率的な結合は、非貪食性細胞のそれぞれによる、ミニセルの迅速なエンドサイトーシスを進行させる。

本発明の標的細胞には、機能性核酸を導入しようとするあらゆる細胞が含まれる。望ましい標的細胞は、リガンドの結合と同時にエンドサイトーシスを促進する、細胞表面受容体の発現を特徴とする。好ましい標的細胞は、細胞が専門の貪食細胞（例えば、マクロファージ、樹状細胞、及びナチュラルキラー（NK）細胞）ではないという意味で非貪食性である。さらに、好ましい標的細胞は哺乳動物細胞である。

本発明の標的化した送達法において有用なリガンドには、標的細胞の表面成分とミニセルの表面成分とを結合する任意の作用物質が含まれる。標的細胞の表面成分は、受容体、特に、エンドサイトーシスを媒介できる受容体が好ましい。リガンドは、ポリペプチド成分及び／又は炭水化物成分を含みうる。抗体は、好ましいリガンドである。例えば、細菌由来のインタクトなミニセルの表面成分と標的哺乳動物細胞の表面成分とに対して二重特異性を保有する二重特異性抗体は、ミニセルをin vitro及びin vivoで標的哺乳動物細胞に標的化するために、効率よく使用することができる。有用なリガンドには、受容体、酵素、結合ペプチド、融合／キメラタンパク質、及び小分子が含まれる。

特定のリガンドの選択は、２つの主たる判定基準によりもたらされる：（i）インタクトなミニセル表面の１個又は複数のドメインへの特異的結合、及び（ii）標的細胞表面の１個又は複数のドメインへの特異的結合。すなわち、リガンドは、細菌由来のインタクトなミニセル表面構造に対して特異性を有する第１アーム、及び哺乳動物細胞の表面構造に対して特異性を有する第２アームを有することが好ましい。第１アーム及び第２アームのそれぞれは多価であってよい。各アームは、多価の場合でさえも単一特異性であることが好ましい。

細菌由来ミニセルへの結合のためには、リガンドの一方のアームは、親細菌細胞に見出されるリポ多糖のO-多糖成分に特異的であることが望ましい。リガンド結合に利用することができる他のミニセル表面構造には、外膜タンパク質、線毛（pilli）、線毛（fimbrae）、及び鞭毛細胞表面露出ペプチドセグメントなど、細胞表面に露出した、外膜上のポリペプチド及び炭水化物が含まれる。

標的細胞への結合のために、リガンドの一方のアームは、哺乳動物細胞の表面成分に特異的である。そのような成分には、特性決定されているか又は特性決定されていない細胞表面タンパク質、ペプチド、及び炭水化物が含まれる。細胞表面受容体、特に、受容体介在エンドサイトーシスを活性化することができる細胞表面受容体は、標的化に望ましい細胞表面成分である。そのような受容体が標的細胞表面で過剰に発現された場合、処理しようとする細胞を標的化する選択性を高め、それにより非標的細胞へ送達される可能性を減少させる。

例として、腫瘍細胞、転移性細胞、内皮細胞及び平滑筋細胞などの脈管構造細胞、肺細胞、腎細胞、血液細胞、骨髄細胞、脳細胞、肝細胞など、又は所望の細胞の細胞表面受容体モチーフに特異的に結合するリガンドを選択することによって、選択した細胞のいずれかの前駆体を標的とすることができる。細胞表面受容体の例には以下のものが含まれる：大部分の大腸癌、直腸癌、乳癌、肺癌、膵臓癌、及び消化管癌で過剰に発現する癌胎児性抗原（CEA）（Marshall、2003）；乳癌、卵巣癌、大腸癌、肺癌、前立腺癌、及び子宮頚癌で過剰に発現することが多いヘレグリン受容体（HER-2、neu又はc-erbB-2）（Hungら、2000）；乳房、頭頚部、非小細胞肺、及び前立腺の固形腫瘍を含め、一定範囲の固形腫瘍で高度に発現する上皮成長因子受容体（EGFR）（Salomonら、1995）；アシアロ糖タンパク質受容体（Stockert、1995）；トランスフェリン受容体（Singh、1999）；肝細胞で発現するセルピン酵素複合体受容体（Ziadyら、1997）；膵管腺癌細胞に過剰に発現する線維芽細胞増殖因子受容体（FGFR）（Kleeffら、2002）；抗血管新生遺伝子治療のための血管内皮増殖因子受容体（VEGFR）（Beckerら、2002；Hoshidaら、2002）；非粘液性卵巣癌の90％で選択的に過剰に発現する葉酸受容体（Gosselin及びLee、2002）；細胞表面糖衣（Batraら、1994）；炭水化物受容体（Thurnherら、1994）；及び呼吸上皮細胞への遺伝子送達に有用であり、肺疾患、例えば、嚢胞性線維症の治療について興味が持たれるポリマー免疫グロブリン受容体（Kaetzelら、1997）。

好ましいリガンドは、抗体及び／又は抗体誘導体を含む。本明細書で使用する「抗体」という用語は、免疫応答のin vitro又はin vivo発生によって得られた免疫グロブリン分子を包含する。「抗体」という用語には、ポリクローナル抗体、単一特異性抗体、及びモノクローナル抗体、並びに一本鎖抗体フラグメント（scFv）などの抗体誘導体が含まれる。本発明において有用な抗体及び抗体誘導体は組換えDNA技術によっても得ることができる。

野生型抗体は、２本の同一の重鎖と２本の同一の軽鎖である４本のポリペプチド鎖を有する。両方の種のポリペプチド鎖は、同一クラスの抗体間で異ならないか又は最小限に異なる定常領域と、可変領域とを含む。可変領域は、特定の抗体に特有であり、特異的エピトープを認識する抗原結合ドメインを含む。抗体結合に最も直接的に関与する抗原結合ドメイン領域は「相補性決定領域」（CDR）である。

「抗体」という用語は、抗原に特異的に結合する能力を保持している抗体誘導体（抗体フラグメントなど）も包含する。そのような抗体フラグメントには、Fabフラグメント（抗原結合ドメインを含み、ジスルフィド結合により架橋された軽鎖と重鎖の一部とを含むフラグメント）、Fab’（単一抗原結合ドメインを含み、ヒンジ領域を介して一個のFabと重鎖の追加部分とを含む抗体フラグメント）、F(ab’)2（重鎖のヒンジ領域内の鎖間ジスルフィド結合によって連結した２個のFab'分子）、二重特異性Fab（２個の抗原結合ドメインを含むFab分子であって、その各々が異なるエピトープに対するFab分子）、scFv（アミノ酸鎖により共に結合した抗体の単一の軽鎖と重鎖の可変抗原結合決定領域）が含まれる。

抗体フラグメントをはじめとする抗体が、リガンドの一部又は全てを構成する場合、抗体はヒト起源であるか、又はヒトでの使用に適切であるように修飾されているのが好ましい。いわゆる「ヒト化抗体」は、当技術分野で周知である。例えば、Osbournら、2003を参照のこと。ヒト化抗体は、ヒトでその抗原性を減少させるために、遺伝子操作により改変され、かつ／又はin vitro処理されている。抗体をヒト化する方法は、例えば、米国特許第6,639,055号、同第5,585,089号、及び同第5,530,101号に記載されている。その最も簡単な事例では、マウスmAbの相補性決定領域（CDR）として知られる抗原結合ループをヒトIgG中に移植することによって、ヒト化抗体を形成する。Jonesら、1986；Riechmannら、1988；及びVerhoeyenら、1988を参照のこと。しかし、一般的に、高親和性ヒト化抗体の作製は、マウス親mAbのいわゆるフレームワーク領域（FR）から、一個又は複数の追加の残基を移行させる必要がある。そのヒト化技術の数種の変形形態も開発されている。Vaughanら、1998を参照のこと。

「ヒト化抗体」ではなく、ヒト抗体も本発明では使用することができる。ヒト抗体は、そのそれぞれの抗原に対して親和性が高く、常法に従って、非常に大きい一本鎖可変フラグメント（scFv）又はFabファージディスプレイライブラリーから得る。Griffithsら、1994；Vaughanら、1996；Sheetsら、1998；de Haardら、1999；及びKnappikら、2000を参照のこと。

有用なリガンドは、二重特異性一本鎖抗体も含み、この抗体は、典型的には、リンカー分子により、対応する可変重鎖部分と共有結合した可変軽鎖部分からなる組換えポリペプチドである。米国特許第5,455,030号、同第5,260,203号、及び同第4,496,778号を参照のこと。二重特異性抗体は、他の方法によっても作製することができる。例えば、化学的ヘテロ複合体は、異なる特異性のインタクトな抗体又は抗体フラグメントを化学的に結合することによって作製することができる。Karpovskyら、1984を参照のこと。しかし、そのようなヘテロ複合体は、再現可能に作製するのは困難であり、正常なモノクローナル抗体の少なくとも２倍は大きい。二重特異性抗体は、抗体フラグメントの酵素切断と再会合を含むジスルフィド交換によっても作製することができる。Glennieら、1987を参照のこと。

Fab及びscFvフラグメントは一価であるので、これらは標的構造に対して親和性が低いことが多い。従って、これらの成分から作製した好ましいリガンドは、二量体、三量体、又は四量体複合体に操作して機能親和性を高める。Tomlinson及びHolliger、2000；Carter、2001；Hudson及びSouriau、2001；及びTodorovskaら、2001を参照のこと。そのような複合体構造は、化学的及び／又は遺伝的架橋によって作製しうる。

本発明の二重特異性リガンドは、各末端で単一特異的、すなわち、一端でミニセル上の単一成分に特異的であり、他端で標的細胞上の単一成分に特異的であるのが好ましい。リガンドは、一端で又は両端で多価、例えば、いわゆるダイアボディ、トリアボディ、及びテトラボディ形態でありうる。Hudson及びSouriau、2003を参照のこと。ダイアボディは、２個のscFvの非共有結合性会合により形成される二価二量体であり、これにより２個のFv結合部位がもたらされる。同様に、トリアボディは３個のscFvによる三価三量体の形成から生じ、３個の結合部位がもたらされ、テトラボディは４個のscFvによる四価四量体の形成から生じ、４個の結合部位がもたらされる。

哺乳動物細胞上の受容体に対する特異性を有する、数種のヒト化、ヒト、及びマウスのモノクローナル抗体並びにそれらのフラグメントが、ヒト治療用途に認可されており、そのリストは急速に増えている。Hudson及びSouriau、2003を参照のこと。二重特異性リガンドの一方のアームを形成するのに使用できるそのような抗体の一例は、HER2：Herceptin^TM；トラスツズマブに対して特異性を有する。

抗体可変領域も、広範なタンパク質ドメインに融合させることができる。IgG1 CH3など、ヒト免疫グロブリンドメインへ融合させると、質量が増大し、二量体化が促進される。Huら、1996を参照のこと。ヒトIgヒンジ-Fc領域へ融合させると、エフェクター機能を付加することができる。さらに、多量体タンパク質からの異種タンパク質ドメインに融合させると、多量体化が促進される。例えば、短鎖scFvと短鎖両親媒性へリックスとの融合は、ミニ抗体の産生に使用されている。Pack及びPluckthun、1992を参照のこと。fos/junなど、ヘテロ二量体を形成するタンパク質に由来するドメインは、二重特異性分子を産生するために使用することができ（Kostelnyら、1992）、あるいは「ノブ・イントゥー・ホール（knobs into holes）」などの戦略を設計することによって、ホモ二量体化ドメインを設計し、ヘテロ二量体を形成させることができる（Ridgwayら、1996）。最後に、多量体化及び追加機能を提供する融合タンパク質パートナー、例えば、ストレプトアビジンを選択することができる。Dubelら、1995を参照のこと。

貪食能又はエンドサイトーシス能を有する細胞への送達
さらに、本発明は、細菌由来ミニセルを貪食能又はエンドサイトーシス能を有する哺乳動物細胞と接触させることによる送達を提供する。細胞内細菌性病原体の方式で、親細菌細胞を取り込むことができる哺乳動物細胞は、同様にミニセルを取り込み、その内容物を哺乳動物細胞の細胞質中に放出する。この送達手法は、標的化リガンドの使用なしに達成することができる。

様々なメカニズムが、所与の型の細胞によってミニセルを取り込むステップに関与してよく、この点において本発明は特定の何らかのメカニズムに依存しない。例えば、貪食は、マクロファージ及び他の貪食細胞、例えば好中球が、粒子表面上にその粒子が完全に包まれるまで仮足を伸展することによって粒子を摂取するという、詳しく報告されているプロセスである。「非特異的」貪食として記載されているが、そのプロセスでの特異的受容体の関与は実証されている。Wrightら（1986）；Speertら（1988）を参照のこと。

従って、貪食の一形態には、表面リガンドと仮足の膜に位置するリガンド受容体との間の相互作用が関与する。特異的受容体が介在するこの結合ステップは、細菌表面のアドヘシンに依存すると考えられる。非腸内毒素原性大腸菌など、毒性の低い細菌に関して、貪食は、貪食細胞受容体に対する表面リガンドの不在下でも生じうる。例えば、Pikaarら（1995）を参照のこと。従って、本発明は、限定されるものではないが、その親細菌細胞の性質と一致して表面アドヘシンを保持するか又は保持せず、かつ貪食細胞（すなわち「貪食能を有する」宿主細胞）（好中球及びマクロファージが哺乳動物におけるその主要な型である）によって取り込まれる、ミニセルの使用を包含する。

別の取り込みプロセスは、エンドサイトーシスであり、それによって、サルモネラ、エシェリキア、シゲラ、ヘリコバクター、シュードモナス、及びラクトバチルス属の種によって代表される細胞内病原体は、哺乳動物上皮細胞へ侵入できるようになり、そこで複製する。この点における２つの基本的メカニズムは、「被覆ピットエンドサイトーシス」としても知られているクラスリン依存性受容体介在エンドサイトーシス、（Riezman、1993）、及びクラスリン非依存性エンドサイトーシス（Sandvig及びDeurs、1994）である。エンドサイトーシスによって作用する取り込み能を有する細胞（すなわち「エンドサイトーシス能を有する」宿主細胞）が本発明に従ってミニセルを取り込む場合、いずれか又は両方のメカニズムが関与しうる。代表的なエンドサイトーシス能を有する細胞は、乳房上皮細胞、消化管腸細胞、胃上皮細胞、肺上皮細胞、並びに尿路及び膀胱上皮細胞である。

標的化リガンドを使用せずに取り込み能を有する哺乳動物細胞へ送達する場合、企図したその適用の性質は、使用したミニセルの細菌源の選択に影響を与える。例えば、サルモネラ、エシェリキア及びシゲラ属の種は、消化管腸細胞上のエンドサイトーシス媒介受容体により認識されるアドヘシンを保有し、大腸癌細胞に有効な薬物を送達するのに適しているであろう。同様に、胃上皮細胞に特異的なアドヘシンを保有するピロリ菌（Helicobacter pylori）由来ミニセルは、胃癌細胞を目標とした送達に適切であると思われる。肺上皮細胞の受容体によって認識されるアドヘシンを保有するシュードモナス属の種由来のインタクトなミニセルの投与には、吸入又は吹入が理想的であろう。尿路及び膀胱上皮細胞に特異的なアドヘシンを保有するラクトバチルス属細菌由来ミニセルは、尿路又は膀胱癌への薬物の尿道内送達に適合すると思われる。

製剤
一態様において、（a）複数の各々のミニセルがプラスミド非含有機能性核酸を含有する、複数のインタクトなミニセルと、（b）その製薬上許容される担体とを含む組成物を提供する。

製剤は、場合により薬物を含有してもよい。一例では、製剤のミニセルは薬物を含み、別の例では、ミニセルは、薬物をコードする、プラスミドなどの核酸分子を含みうる。

製剤はまた、場合により、ミニセルを標的細胞に標的化するための二重特異性リガンドを含んでもよい。ミニセル及びリガンドは、本明細書に記載したもののいずれであってもよい。従って、ミニセルは、機能性核酸をコードする核酸を含み、二重特異性リガンドは、ミニセルの表面成分と標的哺乳動物細胞の表面成分とに結合可能であることが好ましい。

製剤は、追加の防腐剤を含むか又は含まないで、例えば、アンプル又はバイアルの単位投与剤形、又は複数回用量容器で提供しうる。製剤は、油性若しくは水性ビヒクルの溶液、懸濁液、又は乳濁液であり、かつ懸濁化剤、安定化剤、及び／又は分散化剤などの製剤用物質を含みうる。適当な溶液は、レシピエントの血液と等張であり、生理食塩水、リンゲル液、及びデキストロース溶液により例示される。あるいは、製剤は、適当なビヒクル、例えば、滅菌のパイロジェンを含まない水又は生理食塩水によって再構成するための凍結乾燥粉末形態であってもよい。製剤はまた、デポー製剤の剤形であってよい。そのような長時間作用製剤は、移植（例えば、皮下若しくは筋肉内）又は筋肉内注射によって投与しうる。

投与経路
本明細書に記載の製剤は、様々な経路により、哺乳動物の身体の様々な部位に、所望の治療効果を実現するために局所に又は全身に投与することができる。送達は、例えば、経口投与、体腔への製剤の塗布、吸入又は吹入、あるいは非経口、筋肉内、静脈内、門脈内、肝内、腹膜、皮下、腫瘍内、又は皮内投与により行いうる。投与方法及び投与部位は、標的細胞の位置に依存する。例えば、嚢胞性−線維性細胞は、標的化ミニセルの吸入送達によって有効に標的化しうる。同様に、腫瘍転移は、標的化ミニセルを静脈内送達することにより、より有効に治療しうる。原発性卵巣癌は、標的化ミニセルを腹腔内送達することにより治療しうる。

純度
一態様において、ミニセルは、混入親細菌細胞を実質的に含まない。すなわち、ミニセル含有製剤は、10⁷個ミニセル当たり約１個未満の混入親細菌細胞を含有するのが好ましく、10⁸個ミニセル当たり約１個未満の混入親細菌細胞を含有するのがより好ましく、10⁹個ミニセル当たり約１個未満の混入親細菌細胞を含有するのがさらにいっそう好ましく、10¹⁰個ミニセル当たり約１個未満の混入親細菌細胞を含有するのがよりさらに好ましく、10¹¹個ミニセル当たり約１個未満の混入親細菌細胞を含有するのが最も好ましい。

ミニセルを精製する方法は、当技術分野で公知であり、国際公開WO03/033519号に記載されている。そのような一つの方法は、クロスフローろ過（供給フローは膜表面に並行している；Forbes、1987）とデッドエンドろ過（供給フローは膜表面に対して直交している）を組み合わせる。任意により、これらのろ過の組合せに先行して低遠心力での分画遠心法を行い、細菌細胞のある程度の部分を除去し、それによりミニセルについて上清を濃縮することができる。

別の精製法は、生物学的に適合する媒体での密度勾配遠心分離を利用する。遠心分離後、勾配からミニセルのバンドを採取し、任意により、ミニセルをさらに数回の密度勾配遠心分離にかけて純度を最高にする。方法はさらに、ミニセル含有試料に対して分画遠心法を実施する予備ステップ含みうる。低遠心力で実施する場合、分画遠心法は、親細菌細胞のある程度の部分を除去し、それによりミニセルについて上清を濃縮する。

特に有効な精製法は、ミニセルの純度を上昇させるために細菌のフィラメント化を利用する。すなわち、ミニセル精製法は、（a）親細菌細胞がフィラメント形態を選択するのを誘発する条件にミニセル含有試料を供するステップ、続いて（b）試料をろ過して精製ミニセル調製物を得るステップを含むことができる。

既知のミニセル精製法も併用することができる。方法の極めて有効な一つの組合せは以下の通りである：
ステップA：ミニセル産生細菌細胞培養物の分画遠心法。2000gで約20分間実施しうるこのステップによって、ほとんどの親細菌細胞は除去されるが、ミニセルは上清中に残存する。
ステップB：等張無毒の密度勾配媒体を使用する密度勾配遠心分離。このステップでは、ミニセルの損失を最小にして、親細菌細胞を含む多くの混入物質からミニセルを分離する。このステップは精製法内で繰り返すのが好ましい。
ステップC：0.45μmフィルターにより、クロスフローろ過を行って親細菌細胞の混入をさらに低減する。
ステップD：ストレス誘発による残存する親細菌細胞の線維化。これは、ミニセル懸濁液を数種のストレスのいずれかを誘発する環境条件に供することによって実現しうる。
ステップE：親細菌細胞を死滅させるための抗生物質による処理。
ステップF：膜ブレブ、膜断片、細菌破片、核酸、媒体成分など、微小な混入物質を除去し、ミニセルを濃縮するためのクロスフローろ過。0.2μmフィルターを使用して微小な混入物質からミニセルを分離し、0.1μmフィルターを使用してミニセルを濃縮しうる。
ステップG：フィラメント化死滅細菌細胞を除去するためのデッドエンドろ過。このステップには0.45μmフィルターを使用しうる。
ステップH：ミニセル調製物からのエンドトキシンの除去。このステップには抗リピドA被覆磁気ビーズを使用しうる。

投与スケジュール
一般に、本明細書に開示した製剤は、いかなる潜在的毒性も最小限に抑えながら、最適の生理学的効果を得るために、慣用試験により求めた適当な投与量で使用しうる。投与レジメンは、患者の年齢、体重、性別、健康状態、治療しようとする病状の重症度、投与経路、並びに患者の腎機能及び肝機能をはじめとする様々な要因に従って選択しうる。

最小の副作用で最大効力を得る範囲内でミニセルと薬物の濃度を達成するための精度を最適にするには、標的部位及び標的細胞への機能性核酸と薬物の利用能の動力学に基づくレジメンが必要であろう。治療レジメンに向けて最適濃度を決定する場合、ミニセル又は薬物の分配、平衡、及び除去が考慮されうる。組み合わせて使用する場合、所望の効果を得るために、ミニセル及び薬物の投与量を調節しうる。

さらに、製剤の投与量は、薬物動態学的／薬物力学的モデリング系を使用して最適化しうる。例えば、一種又は複数の投与レジメンを選択し、薬物動態学的／薬物力学的モデルを使用して、一種又は複数の投与レジメンの薬物動態学的／薬物力学的プロフィールを判定することができる。次に、その特定の薬物動態学的／薬物力学的プロフィールに基づき、所望の薬物動態学的／薬物力学的応答を実現する投与のための投与量レジメンの１つを選択することができる。例えば、WO00/67776号を参照のこと。この点に関し、任意の適応症のための投与レジメンを、本明細書の実施例６に記載されている手法及びモデルを、目的の特定の細胞について改変して用いて、決定することができる。

具体的には、製剤は、数週間にわたって少なくとも週１回投与する。一実施形態では、製剤は、数週間から数ヵ月に渡って少なくとも週１回投与する。

より具体的には、製剤は、約2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、又は31日間にわたり、少なくとも１日に１回投与する。あるいは、製剤は、毎日、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、又は31日毎に、又はそれ以上の日数毎に約１回投与する。

あるいは、製剤は、毎週、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、l9、又は20週毎に、又はそれ以上の週数毎に約１回投与する。あるいは、製剤は、約2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19又は20週間、又はそれ以上の週数にわたって、少なくとも週１回投与する。

あるいは、製剤は、毎月、約2、3、4、5、6、7、8、9、10、11又は12ヵ月毎に、又はそれ以上の月数毎に、約１回投与する。

製剤は、単回の日用量で投与してもよいし、又は一日分の合計投与量を毎日２回、３回、又は４回の分割用量で投与してもよい。

薬物の前にミニセルを投与する方法では、薬物投与はミニセルの投与後、数分間から数時間の任意の時点で行うことができる。あるいは、薬物は、ミニセルの後、数時間から数日間、おそらく数週間から数ヵ月までのいずれの時点で投与してもよい。

より具体的には、機能性核酸を封入したミニセルは、薬物の少なくとも約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23又は24時間前に投与してもよい。さらに、ミニセルは、薬物投与の少なくとも約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、又は31日前に投与してもよい。さらに別の実施形態では、ミニセルは、薬物の少なくとも約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19又は20週間又はそれ以上前に投与してもよい。別の実施形態では、ミニセルは薬物の少なくとも約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、又は12ヵ月前に投与してもよい。

別の実施形態では、ミニセルは薬物の後に投与する。ミニセルの投与は、薬物の投与の数分間から数時間後の任意の時点で行うことができる。あるいは、ミニセルは、薬物の後、数時間から数日、おそらく数週間から数ヵ月までのいずれの時点で投与してもよい。

以下の実施例は、限定するものではなく例示的なものにすぎず、本発明の理解をより完全にする。

実施例

インタクトなミニセルへのin vitroでの調節性RNAの直接封入
米国特許公開US 2004/0265994号に記載のように、細菌由来のインタクトなミニセルを調製し、精製した。Cy3標識グリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼ（GAPDH）siRNA（最大励起（λ_max）547 nm、最大発光（λ_max）563 nm）（Ambion（Austin、米国テキサス）の製品）を取得し、これを終濃度50μMまでヌクレアーゼを含まない水中で再構成した。

約10⁷個のミニセルを1xリン酸緩衝溶液（PBS）（Gibco）中に再懸濁させ、1μMのCy3標識GAPDH siRNAと一緒に共インキュベートした。インキュベーションは、穏やかに混合しながら37℃で2時間実施した。対照ミニセルは、1 x PBSのみとのインキュベーションによりロードしたモック（mock）であった。ロード後、ミニセルをペレット化し、16,200×gで10分の遠心分離により1xPBSで2回洗浄した。D70カメラ（Olympus Microscopes（ドイツ）の製品）を取り付けた蛍光DMLB顕微鏡（Leica（ドイツ）の製品）で実験ミニセル及び対照ミニセルを観察した。100×油浸レンズを用いて、イメージを取得した。

また、前記共インキュベーション実験は、室温、37℃、及び4℃でのインキュベーションなど様々な実験条件下でも実施した。加えて、共インキュベーション時間は、それぞれ、1時間、2時間、4時間、及び12時間のように変えた。

図1Bに示すように、インタクトなsiRNA分子は、ミニセル中に急速に拡散した。37℃で2時間のインキュベーションは、ミニセルの極めて有意な封入を達成するのに十分であった。

siRNA分子がミニセル内部にあるか、又はミニセル表面に接着しているかを判定するために、Cy3-蛍光標識siRNA含有ミニセルをエキソヌクレアーゼと一緒に一晩インキュベートした後、蛍光顕微鏡検査を繰り返した。その結果は、図1Bに示したものと同じであり、これは、siRNAがミニセルに内在化しており、ミニセル表面に接着しているのではないことを示している。

調節性RNAを封入した二重特異性抗体標的化ミニセルによるヒト乳癌細胞のin vitroトランスフェクション
調節性RNAを保有するミニセルが、in vitroにおいて血清中で安定であること、並びに、これらが特異的標的化哺乳動物細胞に内在化することができることを実証するために、以下の実験を実施した。

ポロキナーゼ1（plk1）に対するsiRNAを標的配列5’-GGTGGATGTGTGGTCCATTTT-3’を用いて合成し、蛍光タグであるAlexaFluor 488で標識した。ポロキナーゼは、有糸分裂の開始、中心体成熟、双極紡錘体形成、染色体の分離、及び細胞質分裂、並びに、決定的には、チェックポイント制御の精度モニタリング時に、多様な機能を有する（Gloverら、1998；Barrら、2004；van de Weerdt及びMedema 2006）。ヒトにおいて、Plk1は、このファミリーのうち最もよく特性決定されたメンバーである。Plk1は、腫瘍発生に関連し、セリン／トレオニンキナーゼのファミリーに属するが、これらは、新規化学療法剤の魅力的な標的である。従って、Plk1は、抗癌薬開発の有望な標的とみなされている（Strebhardt及びUllrich, 2006）。

ミニセルを精製し、実施例1に記載のように、10⁹個のミニセルに抗^AF488Plk1 siRNAを封入した。抗ネズミチフス菌O抗原と抗ヒトEGFR特異性を保有する二重特異性抗体（BsAb）を調製し、PCT出願公開WO 05/056749号に記載のようにミニセル_{AF488-Plk1-siRNA}に結合させた。得られたミニセルは、^EGFRミニセル_{AF488-Plk1-siRNA}と名付けた。これらのミニセル（10⁹個）をミニセル10,000個：腫瘍細胞1個の密度で、ヒト乳癌細胞と一緒に、組織培養においてインキュベートした。インキュベーションは、1時間、2時間、4時間、及び24時間実施した。各時点で、細胞を収集し、DAPIで染色した（核染色、青色蛍光）。IX81共焦点顕微鏡（Olympus）及びCellRソフトウエアを用いて、細胞を観察した。

1時間後までに、siRNAを保有する蛍光ミニセルは、MDA-MB-468細胞に接着した（図2参照）。非標的化ミニセル_{AF488-Plk1-siRNA}と共に行なった対照インキュベーションは、洗い流され、MDA-MB-468細胞に結合した緑色蛍光を一切呈示しなかったため、上記の結合は、MDA-MB-468細胞上のEGF受容体を標的化したミニセル結合BsAbとの結合によるものと考えられる。インキュベーションから2時間後までに、^EGFRミニセル_{AF488-Plk1-siRNA}は、MDA-MB-468細胞内に内在化し、強力な緑色蛍光を呈示した。24時間後までには、大部分の緑色蛍光が消失したが、これは、内在化ミニセルが、恐らくファゴリソソーム内で分解されたことを示している。

インタクトなミニセルからのsiRNAの抽出及び定量
siRNAは、細菌細胞又は細菌由来のミニセルには天然に存在しないため、このような粒子からsiRNAを抽出するための確立された方法が存在しないことは、意外ではない。従って、本発明者らは、本発明に従って、インタクトなミニセルに封入されたsiRNAの定量的抽出方法を開発した。

キネシン紡錘体タンパク質（KSP）（また、「キネシン-5」及び「Eg5」としても知られる）は、微小管運動タンパク質である。これは、双極紡錘体の形成、及び有糸分裂中の姉妹染色分体の適切な分離に必須である（Enos及びMorris, 1990；Blangyら、1995；Sawin及びMitchison, 1995；Dagenbach及びEndow, 2004）。KSPの阻害は、単極有糸分裂紡錘体の形成を引き起こし、紡錘体集合チェックポイントを活性化し、細胞を有糸分裂で停止するため、結果として細胞死を招く（Blangyら、1995, Canerら、1999; Kapoorら、2000; Taoら、2005）。

本発明に従ってミニセルからのsiRNA抽出の最適化を達成するように、ミニセルに封入するためのKSPに対するsiRNAを選択した。さらに具体的には、実施例1（前掲）に記載した手順に従い、KSP-1-siRNA二本鎖オリゴヌクレオチド配列（センス鎖；5'-AAC TGG ATC GTA AGA AGG CAG-3'）を合成し、ミニセルに封入した。

多数の市販の核酸抽出キットを用いて、ミニセル_siRNA-KSP（10¹⁰個）及び同等数の対照非封入ミニセルを処理した。その結果から、mirVana miRNA単離キット（Ambion）が、インタクトなミニセルからのsiRNA-KSPの定量的抽出を達成したことがわかった。製造者の指示に従い、この手順を実施した。

まず、超感受性蛍光核酸色素であるRiboGreen^TM（Molecular Probes Inc.（米国オレゴン州ユージーン）の製品）で精製siRNAを染色した後、NanoDrop ND-3300 Fluorospectrometer（NanoDrop Technologies Inc.（米国デラウエア州、ウィルミントン）の製品）を使用し、また、製造業者の使用説明書に従って定量を実施した。RNA結合RiboGreen^TMは、最大励起約500 nm及び最大発光約525 nmを有する。

その結果から、ミニセルはsiRNAを保有することができることがわかった。10¹⁰個の非封入ミニセルは、約1.4μgのRNAを保有したが、これは、恐らく内在的に形成された細菌RNAのバックグラウンドレベルであろう。同じ数のミニセル_siRNA-KSPは、約2.7μgのRNAを保有したが、これは、内在性細菌RNAと、外来的に封入したsiRNA-KSPを含んでいる。従って、これらのデータは、10¹⁰個のミニセルが、少なくとも約1.3μgの外来封入siRNAを封入することができることを実証している。

調節性RNA封入ミニセルにより達成される抗腫瘍効果のin vivo実証
調節性RNA封入ミニセルが、治療に有効な濃度のインタクトな調節性RNAを腫瘍細胞にin vivoで送達できることを明らかにするために、以下の試験を実施した。

実施例3に記載したように、本発明に従って、KSPに対するsiRNAを選択して、ミニセルに封入した。実施例1に記載したように、ミニセルを精製し、10⁹個のミニセルに抗KSP siRNAを封入した。また、BsAbを用意し、実施例2に記載のように、ミニセル_siRNA-KSPに結合させることにより、^EGFRミニセル_siRNA-KSPを作製した。

この実施例で用いるマウスは、Animal Resources Centre（オーストラリア、ウェスタンオーストラリア州パース）から購入し、動物実験は全て、実験動物のケア及び使用の指針、並びに、動物倫理委員会の承認を遵守して行なった。実験は、EnGeneIC Pty Ltd（オーストラリア、ニューサウスウエールズ州シドニー）のNSW農業認可小動物施設で実施した。

GIBCO-BRL 5％仔ウシ血清（Invitrogen Corporation（米国、カリフォルニア州カールスバッド）の製品）、及びグルタミン（Invitrogen）を添加したRPMI 1640培地で、95％空気及び5％CO₂の加湿雰囲気にて、37℃で組織培養することにより、ヒト乳癌細胞（MDA-MB-468、ATCC）を増殖させた。1×10⁶個の細胞を含む50μlの無血清培地を50μlの増殖因子低減マトリゲル（BD Biosciences（米国、ニュージャージー州フランクリンレークス）の製品）と混合した。23ゲージ針を用いて、上記細胞を各マウスの肩甲骨間に皮下注射した。電子デジタルカリパス（精度0.001まで）（ミツトヨ（日本）の製品）を用いて、腫瘍を週2回測定し、式：長さ（mm）×幅²（mm）×0.5＝体積（mm³）を用いて、平均腫瘍体積を計算した。

腫瘍の体積が170 mm³〜200 mm³に達したら、様々な処置を開始し、マウスを一群当たり8匹の異なる2つの群に無作為に分けた。第1群（対照群）には、滅菌食塩水を投与し、第2群（実験群）には、^EGFRミニセル_siRNA-KSP（10⁹個）を週4回投与した。

図3に示すように、^EGFRミニセル_siRNA-KSPは、食塩水の対照群と比較して、高度に有意な抗腫瘍効果をもたらした。これらの結果から以下のことが実証された：（a）siRNAはin vivoにてミニセル内で安定している、（b）インタクトで、十分に機能性のsiRNAは、in vivoで腫瘍細胞に送達される、並びに（c）ミニセルは、治療に有意な濃度のsiRNAをin vivoで腫瘍細胞に送達する。

調節性RNA封入ミニセル後の薬物封入ミニセルを用いた処置によるテーラーメード癌治療法の実証
ほとんどの抗癌療法は薬物耐性を伴う。同じことが調節性RNA治療にも言える。というのは、標的遺伝子が、調節性RNAにより標的化された配列内で突然変異を起こすと、腫瘍細胞内の遺伝子突然変異は、調節性RNAを無効にすることができるからである。

癌患者における薬物耐性に対処する有効な戦略はなかった。その代わり、突然変異を回避するために、新たな薬物を投与しなければならない。しかし、この手法は深刻な問題を抱えている。というのは、ほとんどの抗癌剤は毒性が高く、併用療法は、毒性を高めるため、患者が毒性に耐えられなくなったとき、用量が制限されたり、往々にして治療が断念されたりするからである。このような耐性に対処する上での調節性RNA封入ミニセルの効力を評価するために、以下の試験を実施した。

前述したように、ミニセル（10⁹個）を精製した後、抗KSP又は抗Plk1 siRNAを封入した。やはり前述したように、抗ネズミチフス菌O抗原及び抗ヒトEGFR特異性を保有する二重特異性抗体を用意し、ミニセル_siRNA-KSPに結合させることにより、^EGFRミニセル_siRNA-KSPを作製した。

実施例3に記載のように、ヒト結腸癌（HCT116；ATCC）異種移植片をヌードマウスに樹立し、以下のように静脈内処置した。第1群のマウスには滅菌食塩水を投与し、第2、第3及び第4群のマウスは、最初の10用量について（図4参照）、10⁹個の^EGFRミニセル_siRNA-Plk1、^EGFRミニセル_siRNA-KSP-1、及び^EGFRミニセル_siRNA-KSP-2でそれぞれ処置した。Plk1及びKSP-1配列は前記実施例に示したのと同じである。siRNA-KPS-2（センス鎖：5’ CTGAAGACC TGAAGACAAT 3’）は、KSP mRNAの別のセグメントを標的とする。33日目から、第2、第3及び第4群のマウスを2用量の^EGFRミニセル_{カルボプラチン}で処置した。

結果（図4）から、26日目を過ぎると、腫瘍はsiRNA治療に耐性になり始めていることがわかる。従って、続く4回の用量については、全て3用量の^EGFRミニセル_siRNA-Plk1、＋^EGFRミニセル_siRNA-KSP-1、＋^EGFRミニセル_siRNA-KSP-2を等量（すなわち、各ミニセルタイプ約3×10⁸個）ずつ併用して、第2、第3及び第4群のマウスを処置した。さらに、33日目までには、腫瘍は全てのsiRNAに対して高い耐性を示した（図4）。^EGFRミニセル_{カルボプラチン}の投与後、第3及び第4群のマウスの腫瘍増殖は、有意に遅くなった。^EGFRミニセル_{カルボプラチン}の投与後、第3群のマウスは、腫瘍体積の有意な退縮を示した。

これらのデータは、本発明に従い、薬物耐性腫瘍細胞をin vivoで有効に治療することができることを示している。具体的には、（1）腫瘍負荷を有意に低減するように設計された調節性RNA配列を保有する標的化ミニセルの逐次投与後、腫瘍細胞が、siRNA媒介抗腫瘍効果に対して耐性となったとき、（2）調節性RNAにより標的化された同じタンパク質に作用しない薬物を保有する標的化ミニセルを投与する。

インタクトなミニセルに封入した治療有効量の調節性RNAの標的化送達後に起こる、腫瘍細胞における標的タンパク質ノックダウン及びそれによる細胞増殖の停止の実証
本発明の方法が、インタクトなミニセルに治療有効量の調節性RNAを封入することを実証するためには、二重特異性抗体で標的化した調節性RNA封入ミニセルが効率的かつ効果的に腫瘍細胞増殖停止を誘発して、アポトーシス細胞死を誘導することを実証する必要があった。

5％仔ウシ血清及びグルタミンを添加したRPMI 1640培地で、95％空気及び5％CO₂の加湿雰囲気にて、37℃で組織培養することにより、ヒト結腸上皮癌細胞（HCT116）を増殖させた。前述のように、ミニセルを精製した後、Plk1又はKSPに対するsiRNAを封入し、抗ネズミチフス菌O抗原及び抗ヒトEGFR特異性を保有するBsAbに結合させた。このようにして、ミニセル_siRNA-KSP、ミニセル_siRNA-Plk1、及びミニセル（対照）から、^EGFRミニセル_siRNA-KSP 、^EGFRミニセル_siRNA-Plk1、及び^EGFRミニセルを作製した。HCT116細胞を6ウェルプレートに播種し、実験群及び対照群をミニセル5,000個：HCT116細胞1個の比でトランスフェクトした。細胞だけの別の対照も含めた。

ミニセルと一緒に2時間のインキュベーション後、新鮮なPBSでウェルを3回洗浄した。トランスフェクションから4時間、8時間、16時間、24時間、32時間及び48時間後にウェルを回収し、細胞を低温70％エタノール中で固定し、4℃で30分インキュベートした。細胞をリン酸−クエン酸バッファー（pH 7.8）で2回洗浄し、100 mg/mlのRNAseで処理することにより、DNAのみが染色されることを確実にした。ヨウ化プロピジウム（核酸染色）で細胞を染色した後、マクワイヤー大学（オーストラリア、シドニー）にて、FACSCalibur^TMフローサイトメーター（Becton Dickinson（米国、ニュージャージー州フランクリンレークス）の製品）、及びCELL Quest取得及び分析ソフトウエア（同様にBecton Dickinsonの製品）を用いて分析した。

細胞のFACS分析により、トランスフェクションから4及び8時間後（図5A）までに、^EGFRミニセル_siRNA-KSP 又は^EGFRミニセル_siRNA-Plk1のいずれかで処理した細胞は、頑健なG2細胞周期停止を特徴とすることがわかった。細胞のみ、又は^EGFRミニセルで処理したいずれの対照細胞も有害な作用は示さなかった。これらの細胞は、細胞周期の正常なG1、S、及びG2期を示した。16及び24時間後までに、実験細胞は、頑健なG2停止だけではなく、多数のアポトーシス細胞も呈示した（図6）。32及び48時間後までには、実験群の細胞のほとんどがアポトーシス状態となり、細胞屑となった（図7の波括弧内を参照）。

これらの結果は、標的化したインタクトなミニセルが、治療に有効な量の調節性RNAを封入しており、本発明のミニセルが、腫瘍細胞内の標的タンパク質のノックダウンにおいて、極めて効率的かつ有意に効果的であり、その結果、アポトーシス細胞死を引き起こすことを実証するものである。

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Claims (27)

1. （a）複数の各々のミニセルが前記ミニセル内に封入された調節性RNAを含有する、複数のインタクトな細菌由来ミニセルと、（b）その製薬上許容される担体とを含む組成物であって、前記ミニセルでは前記調節性RNAのin situ発現のための構築物が不在であり、前記調節性RNAがsiRNA、miRNA及びshRNAからなる群より選択され、並びに前記複数のミニセルが治療上有効な量の前記調節性RNAを含有する組成物。
2. 前記調節性RNAが、薬物耐性、アポトーシス耐性又は腫瘍性に関与するタンパク質をコードするRNA転写産物を標的とする、請求項１に記載の組成物。
3. 前記調節性RNAが、P-糖タンパク質、MDR-2又はMDR-3の転写産物を標的とする、請求項１に記載の組成物。
4. 前記調節性RNAが、MRP2、BCR-ABL、STI-571耐性関連タンパク質、肺耐性関連タンパク質、シクロオキシゲナーゼ-2、核内因子κ、XRCC1、ERCC1、GSTP1、変異型β-チューブリン、又は成長因子（増殖因子）の転写産物を標的とする、請求項１に記載の組成物。
5. 前記調節性RNAが、Bcl-2、Bcl-X_L、A1/Bfl 1、焦点接着キナーゼ、又はp53タンパク質の転写産物を標的とする、請求項１に記載の組成物。
6. 前記調節性RNAが、β-カテニン、PKC-α、C-RAF、K-Ras、DP97 DeadボックスRNAヘリカーゼ、cdk1、DNMT1、FLIP、C-Sfc、53BPI、ポリコーム群タンパク質EZH2、ErbB1、HPV-16 E5及びE7、フォルティリン（Fortilin）及びMCI1P、KSP、DIP13α、MBD2、p21、KLF4、tpt/TCTP、SPK1及びSPK2、P300、PLK1、Trp53、Ras、ErbB1、VEGF、又はBAG-1の転写産物を標的とする、請求項１に記載の組成物。
7. 薬物をさらに含む、請求項１に記載の組成物。
8. 前記調節性RNAが、前記薬物に対する耐性に関与するタンパク質をコードする転写産物を標的とする、請求項７に記載の組成物。
9. 前記薬物がインタクトな細菌由来ミニセル中に封入されている、請求項８に記載の組成物。
10. 前記調節性RNA及び前記薬物が同一のミニセル中に封入されている、請求項９に記載の組成物。
11. 二重特異性リガンドをさらに含む、請求項１に記載の組成物。
12. 前記二重特異性リガンドが、ミニセル表面構造に対する特異性を有する第１アームと、非貪食性哺乳動物細胞表面受容体に対する特異性を有する第２アームとを含む、請求項１１に記載の組成物。
13. 前記哺乳動物細胞表面受容体が、前記ミニセルの受容体介在エンドサイトーシスを活性化することが可能なものである、請求項１２に記載の組成物。
14. 前記二重特異性リガンドが抗体又は抗体フラグメントを含む、請求項１１に記載の組成物。
15. 10⁹個ミニセル当たり１個未満の混入親細菌細胞を含有する、請求項１に記載の組成物。
16. 10¹⁰個ミニセル当たり１個未満の混入親細菌細胞を含有する、請求項１に記載の組成物。
17. 10¹¹個ミニセル当たり１個未満の混入親細菌細胞を含有する、請求項１に記載の組成物。
18. 医薬として使用するための請求項１に記載の組成物。
19. 前記調節性RNAがshRNAである、請求項１８に記載の組成物。
20. 前記調節性RNAがsiRNAである、請求項１８に記載の組成物。
21. 薬物耐性、アポトーシス耐性又は腫瘍の治療において使用するための請求項１８〜２０のいずれか１項に記載の組成物。
22. 癌の治療のための、請求項１８〜２０のいずれか１項に記載の組成物。
23. 癌が、結腸癌、胃癌、尿路癌、膀胱癌、卵巣癌、乳癌、大腸癌及び結腸上皮癌からなる群より選択される、請求項２２に記載の組成物。
24. 前記医薬が薬物と併用して使用され、前記調節性RNAが前記薬物に対する耐性に関与するタンパク質の転写産物を標的とする、請求項１８〜２０のいずれか１項に記載の組成物。
25. 前記薬物がインタクトな細菌由来ミニセル中に封入されている、請求項２４に記載の組成物。
26. 前記調節性RNA及び前記薬物が同一のミニセル中に封入されている、請求項２５に記載の組成物。
27. 複数のインタクトな細菌由来ミニセルを緩衝生理食塩水中でプラスミド非含有調節性RNAと共インキュベートするステップを含み、前記調節性RNAがsiRNA、miRNA及びshRNAからなる群より選択される、請求項１〜１７のいずれか１項に記載の組成物のミニセルを製剤化する方法。

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