JP5148497B2 - スクロースバイオセンサーおよびそれを用いる方法 - Google Patents
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Description
発明者: Wolf B. Frommerおよび Ida Lager
発明の分野
本発明は一般に、スクロースバイオセンサーの構築および蛍光共鳴エネルギー転移 (FRET)を用いるスクロースレベルの変化の測定および検出方法に関する。
本発明は一般に、スクロースバイオセンサーの構築および蛍光共鳴エネルギー転移 (FRET)を用いるスクロースレベルの変化の測定および検出方法に関する。
関連出願との相互参照
本出願は、仮出願第60/643,576号、仮出願第60/658,141号、仮出願第60/658,142号および仮出願第60/657,702号、PCT出願 [代理人整理番号056100-5053、“Phosphate Biosensers and Methods of Using the Same”]、およびPCT出願 [代理人整理番号056100-5054、“Methods of Reducing Repeat-Induced Silencing of Transgene Expression and Improved Fluorescent Biosensors”]に関連し、これらはその内容全体を引用により本明細書に含める。
本出願は、仮出願第60/643,576号、仮出願第60/658,141号、仮出願第60/658,142号および仮出願第60/657,702号、PCT出願 [代理人整理番号056100-5053、“Phosphate Biosensers and Methods of Using the Same”]、およびPCT出願 [代理人整理番号056100-5054、“Methods of Reducing Repeat-Induced Silencing of Transgene Expression and Improved Fluorescent Biosensors”]に関連し、これらはその内容全体を引用により本明細書に含める。
政府支援の記載
本研究はDOE助成金番号DE-FG02-04ER15542により支援された。政府は本発明についての一定の権利を有しうる。
本研究はDOE助成金番号DE-FG02-04ER15542により支援された。政府は本発明についての一定の権利を有しうる。
発明の背景
本明細書中のすべての出版物および特許は、あたかも各々の出版物および特許出願が引用により含まれることを意図して具体的かつ個別に示されるのと同程度に、引用により含まれる。
本明細書中のすべての出版物および特許は、あたかも各々の出版物および特許出願が引用により含まれることを意図して具体的かつ個別に示されるのと同程度に、引用により含まれる。
本出願の出願日に先立ち、本明細書中で考察される出版物は、あくまでそれらの開示を目的として提供される。本明細書においては、先行発明に照らして本発明にかかる出版物に先行する権利が与えられないことの承認として解釈されるべき点は全くない。
スクロースは植物における炭水化物の主要な輸送形態である。炭水化物を輸出する組織はしばしばソース組織と称され、輸入する組織はシンク組織と称される。マメ科植物根粒へと輸送されるもっとも豊富な炭素源は光合成により作られたスクロースである。植物におけるスクロースの輸送機構はよく研究されてきており、様々な植物種からのスクローストランスポーターがクローニングされ、特徴決定されている。例えば、最初のスクローストランスポーターであるSUT1は、酵母における機能発現によりクローニングされた(Riesmeier et al. 1992、EMBO J. 11: 4705-4713)。植物由来の関連遺伝子がSUT1の配列を用いて得られており、トマト(Lycopersicon esculentum)からの３つの遺伝子が挙げられる。LeSUT1およびその他の植物からのそのオルソログは、12の膜貫通ドメインからなる疎水性タンパク質であり、プロトン共役機構を用いてスクロースの高度に特異的な流入を媒介する細胞の細胞膜に位置している。
植物においてどのようにスクロースが輸送されているかに関しては多くの知見が得られているが、細胞の様々な区画におけるスクロース分布に関してはあまり知られていない。既存の技術はいずれも満足いく程度にかかる問題に取り組むものではない。例えば、非水性分画(non-aqueous fractionation)は、静的、侵襲的であり、細胞解像度を有さずアーティファクトによる影響を受けやすい。分光学的方法、例えば、NMRi (各磁気共鳴イメージング)およびPET (陽電子放出断層撮影)は動的データを提供するが、空間的分解能は低い。
標的分子と認識要素との相互作用を、１以上のシグナル伝達要素のアロステリック制御を介して可視可能なシグナルへと伝達する遺伝的にコードされた分子センサーの開発は、これら問題のいくつかに解答を与えうる。認識要素は標的に単に結合するものでもよいし、標的に結合してそれを酵素的に変換するものでもよいし、あるいは、プロテアーゼセンサーの構築における特異的標的配列の使用におけるように、標的に対する基質として働くものであってもよい(Nagai and Miyawaki、2004)。もっとも一般的なレポーター要素は、立体的に離れた蛍光タンパク質のドナー-アクセプター FRET 対であるが(GFP スペクトル変異体等) (Fehr et al.、2002)、単一の蛍光タンパク質 (Doi and Yanagawa、1999)または酵素(Guntas and Ostermeier、2004)も同様に利用できる。分子センサーのなかにはさらに立体構造アクチュエータ(もっとも一般的には認識要素の１つの立体構造状態に結合するペプチド)を用いて、レポーター要素についてのアロステリック効果およびその結果の出力を増幅するものもある(Miyawaki et al.、1997; Romoser et al.、1997; Kunkel et al.、2004)。
立体構造アクチュエータの非存在下での方法の適用可能性、およびその様々な分析物への一般化の可能性が最近示されている。細菌ペリプラズム結合タンパク質スーパーファミリー(PBP)のメンバーは数百もの基質を高い親和性(アトモルから低マイクロモル)および特異性(Tam and Saier、1993)にて認識する。PBPは様々な実験技術によりリガンド結合の際に有意な立体構造変化を経ることが示されている;個々の糖結合 PBPとGFP 変異体の対との融合により、マルトース、リボースおよびグルコースに対するセンサーが得られた(Fehr et al.、2002; Fehr et al.、2003; Lager et al.、2003)。 かかるセンサーは動物生細胞における糖の取り込みおよび恒常性を測定するのに用いられ、細胞より小さい分析物のレベルが核標的化バージョンにより測定された(Fehr et al.、2004)。マルトース、リボース、およびグルコースに対する細菌 PBPを用いたバイオセンサーの開発の成功により、本発明者らは好適なペリプラズムスクロース結合タンパク質(BP)が同定することができればスクロースに特異的なバイオセンサーの作成に類似の戦略を用いることが出来るのではないかと考えるに至った。いくつかの微生物において見いだされた様々なペリプラズム糖結合タンパク質がスクロースセンサーとしての能力を有するようである。
リゾビウム・メリロティ(Rhizobium meliloti)は、土壌においては自由生活雑菌として、アルファルファおよび関連マメ科植物の根粒においては窒素固定細胞内共生生物として、少なくとも２種類の環境適所を占めうる。AgpAは、ペリプラズムオリゴペプチド結合タンパク質ファミリーからのタンパク質と非常に類似したペリプラズム結合タンパク質をコードする。アルファ-ガラクトシドはagpAの発現を誘導し、agpA 突然変異体はかかる糖を利用または輸送することができないため、agpAはアルファ-ガラクトシドに結合するようである。agpA遺伝子は、syrA遺伝子産物およびグルコースおよびコハク酸により下方制御されうる。agpA:TnphoA 融合タンパク質の活性もSyrAにより下方制御される。syrAは細胞内共生リゾビウム・メリロティにおいて高レベルに発現し、自由生活細菌においては低レベルに発現することが知られているので、agpAは、リゾビウム・メリロティが細胞内共生生物になった場合にその発現が低下する遺伝子産物のクラスに属するという仮定がなされた(Gage and Long 1998)。
シノリゾビウム・メリロティ(Sinorhizobium meliloti)のagl オペロンは、アルファ-グルコシダーゼおよびアルファ-グルコシドに対するペリプラズム結合タンパク質依存的輸送系をコードする (Willis and Walker 1999)。 6遺伝子のクラスターが、シノリゾビウム・メリロティにおけるトレハロースの輸送および利用 (thu)に関与している。ThuEは、トレハロース/マルトース-結合タンパク質 (thuE)として分類される結合タンパク質依存的トレハロース/マルトース/スクロース ABCトランスポーターの結合成分をコードする。thuE 座位が遺伝子置換により不活性化されると、突然変異体シノリゾビウム・メリロティ株はトレハロースの上で成育するその能力が損なわれることが見いだされ、成育の顕著な遅延がマルトースの上でもみられたのに対し、野生型およびthuE 突然変異体はグルコースおよびスクロース上での成育について識別不可能であった。これは、thuEFGK オペロンの機能とaglEFGAK オペロンの機能においてオーバーラップがある可能性を示唆しており、後者はスクロース、マルトース、およびトレハロースについての結合タンパク質依存的 ATP-結合輸送系として同定された。ThuE 発現はトレハロースによってのみ誘導され、セロビオース、グルコース、マルトペンタオース、マルトース、マンニトール、またはスクロースによっては誘導されず、これはthuEFGK 系が主にトレハロースを標的とすることを示唆している。aglEFGAK オペロンは、一方、主にスクロースによって、そして程度は低いがトレハロースによって誘導される(Jensen et al. 2002)。
アグロバクテリウム・ツメファシエンス(Agrobacterium tumefaciens)の病原性決定基 chvEは、植物傷害環境において起こる単糖類に応答する走化性および病原性遺伝子誘導に関与するペリプラズム結合タンパク質である。遺伝子はグルコースガラクトース取り込みを略して gguA、-B、および -Cと称された。gguA、gguB、または gguCにおける突然変異は、Kalanchoe diagremontianaに対するアグロバクテリウム・ツメファシエンスの病原性; 1 mM ガラクトース、グルコース、キシロース、リボース、アラビノース、フコース、またはスクロース上での成育; またはグルコース、ガラクトース、キシロース、またはアラビノースに対する走化性に影響を与えない(Kemner et al. 1997)。
好熱好酸性グラム陽性細菌 Alicyclobacillus acidocaldarius は57℃pH 3.5で有効に成育する。放射標識マルトースの取り込みは、マルトテトラオース、アカルボース、およびシクロデキストリンによって阻害されたが、ラクトース、スクロース、またはトレハロースによっては阻害されなかった。対応する結合タンパク質 (AaMalE) はマルトースと高親和性 (Kd 1.5μM)にて相互作用する。精製された野生型および組換えタンパク質は広いpH 範囲にわたって (2.5 〜 7) 80℃までで高親和性にてマルトースと結合する(Hulsmann et al. 2000)。
超好熱性古細菌 Thermococcus litoralisからの細胞外膜固着トレハロース/マルトース-結合タンパク質 (TMBP)が結晶化され、その構造がその基質であるトレハロースとの複合体において1.85 オングストロームにて決定された。TMBPは、高親和性トレハロース/マルトース ABCトランスポーターの基質認識部位である。インビボでは、このタンパク質はおそらくはN-末端システイン脂質修飾を介して膜に固着している。 しかし、MBPにおけるマルトース結合と比較して、基質とタンパク質との間の直接の水素結合が支配的であり、無極性接触は低下している(Diez、2001)。
これらタンパク質のいずれについてもスクロース結合は直接は示されていない。 さらに、SmThuEのアグロバクテリウムホモログはいまだに突然変異またはタンパク質分析によって分析されていない。したがって、スクロースに対するセンサーを開発するために、ThuE を単離し試験した。
発明の概要
本発明者らは驚くべきことに、細菌種、アグロバクテリウム・ツメファシエンス由来のペリプラズム糖結合タンパク質がスクロースのためのバイオセンサーの構築に用いることが出来ることを見いだした。本発明はしたがって、生細胞一般、特に植物細胞におけるスクロース濃度の変化を検出および測定するのに利用可能なスクロースバイオセンサーを提供する。具体的には、本発明は、スクロース蛍光指標をコードする単離核酸(配列番号3)を提供し、該指標は、スクロース結合タンパク質部分、スクロース結合タンパク質部分に共有結合したドナー蛍光タンパク質部分、およびスクロース結合タンパク質部分に共有結合したアクセプター蛍光タンパク質部分(配列番号 4)を含み、ここでドナー部分とアクセプター部分との間の蛍光共鳴エネルギー転移 (FRET) が、ドナー部分が励起され、スクロースがスクロース結合タンパク質部分に結合すると変化する。本発明の核酸を含む、発現ベクターを含むベクター、および宿主細胞も提供され、核酸によってコードされるバイオセンサータンパク質も提供される。かかる核酸、ベクター、宿主細胞およびタンパク質は、スクロース結合およびスクロースレベルの変化の検出方法ならびにスクロース結合またはスクロース媒介活性を調節する化合物の同定方法において利用できる。
本発明者らは驚くべきことに、細菌種、アグロバクテリウム・ツメファシエンス由来のペリプラズム糖結合タンパク質がスクロースのためのバイオセンサーの構築に用いることが出来ることを見いだした。本発明はしたがって、生細胞一般、特に植物細胞におけるスクロース濃度の変化を検出および測定するのに利用可能なスクロースバイオセンサーを提供する。具体的には、本発明は、スクロース蛍光指標をコードする単離核酸(配列番号3)を提供し、該指標は、スクロース結合タンパク質部分、スクロース結合タンパク質部分に共有結合したドナー蛍光タンパク質部分、およびスクロース結合タンパク質部分に共有結合したアクセプター蛍光タンパク質部分(配列番号 4)を含み、ここでドナー部分とアクセプター部分との間の蛍光共鳴エネルギー転移 (FRET) が、ドナー部分が励起され、スクロースがスクロース結合タンパク質部分に結合すると変化する。本発明の核酸を含む、発現ベクターを含むベクター、および宿主細胞も提供され、核酸によってコードされるバイオセンサータンパク質も提供される。かかる核酸、ベクター、宿主細胞およびタンパク質は、スクロース結合およびスクロースレベルの変化の検出方法ならびにスクロース結合またはスクロース媒介活性を調節する化合物の同定方法において利用できる。
図面の簡単な説明
図 1は、BL21(DE3)goldから精製されたナノセンサーの基質-誘導FRET 変化を含むスクロースセンサーのインビトロ特徴決定のグラフを示す。(A) FLIPsuc センサーの構築。(B)２種類の濃度のスクロース: 0 μMおよび 200 μMにおけるFLIPsuc センサー (蛍光スクロースナノセンサー、スクロースに対するKd 3.7 μM)のスペクトル。(C) FLIPsucについてのスクロース、マルトース、およびグルコース滴定曲線。適合曲線は非線形回帰により得られる。
図 1は、BL21(DE3)goldから精製されたナノセンサーの基質-誘導FRET 変化を含むスクロースセンサーのインビトロ特徴決定のグラフを示す。(A) FLIPsuc センサーの構築。(B)２種類の濃度のスクロース: 0 μMおよび 200 μMにおけるFLIPsuc センサー (蛍光スクロースナノセンサー、スクロースに対するKd 3.7 μM)のスペクトル。(C) FLIPsucについてのスクロース、マルトース、およびグルコース滴定曲線。適合曲線は非線形回帰により得られる。
図 2は、親和性突然変異体についての結合特異性アッセイの結果を示すグラフを含む。すべてのセンサーは、スクロース、マルトースおよびグルコースの溶液により滴定した。突然変異体は、FLIPsuc F113A、FLIPsuc W283A、FLIPsuc D115A、FLIPsuc D115E、FLIPsuc Y246A、および FLIPsuc W224Aである。
図 3は、FLIPThuEW283Aよりもリンカー配列において18 アミノ酸短いスクロースセンサーであるFLIPThuEW283A-18AAの改善されたデルタ比を示すグラフである。
図 4は、FLIPsuc センサーの基質特異性を示す。
発明の詳細な説明
以下の説明は、本発明の理解において有用でありうる情報を含む。本明細書中に提供される情報のいずれかが先行技術であるかまたは今回特許請求される発明に関連していること、あるいは具体的もしくは暗黙的に参照される任意の出版物が先行技術であることは承認されたことではない。
以下の説明は、本発明の理解において有用でありうる情報を含む。本明細書中に提供される情報のいずれかが先行技術であるかまたは今回特許請求される発明に関連していること、あるいは具体的もしくは暗黙的に参照される任意の出版物が先行技術であることは承認されたことではない。
本発明の他の目的、利点および特徴は、当業者にとっては本明細書中に提供される明細書および図面をレビューする際に明白なものになる。したがって、本発明のさらなる目的および利点は、以下の記載から明白なものになる。
バイオセンサー
本発明は蛍光共鳴エネルギー転移 (FRET)を用いてスクロース濃度の変化を検出および測定するためのスクロースバイオセンサーを提供する。
本発明は蛍光共鳴エネルギー転移 (FRET)を用いてスクロース濃度の変化を検出および測定するためのスクロースバイオセンサーを提供する。
具体的には、本発明はスクロース結合蛍光指標をコードする単離核酸およびそれによってコードされるスクロース蛍光指標を提供する。一つの態様は、とりわけ、スクロース結合蛍光指標をコードする単離核酸であって、指標が、スクロース結合タンパク質部分、スクロース結合タンパク質部分に共有結合したドナー蛍光タンパク質部分およびスクロース結合タンパク質部分に共有結合したアクセプター蛍光タンパク質部分を含み、ここで、ドナー部分とアクセプター部分との間のFRETがドナー部分が励起され、スクロースがスクロース結合タンパク質部分に結合すると変化する、単離核酸である。
本明細書において用いる場合、「共有結合している」とは、ドナーおよびアクセプター蛍光部分がリガンド結合タンパク質部分に化学結合を介して、例えば、該リガンド結合タンパク質部分における選択されたアミノ酸に結合していることを意味する。共有結合しているとは、また、ドナーおよびアクセプター部分がリガンド結合タンパク質部分に、リガンド結合タンパク質部分がドナーおよびアクセプター部分を含む融合タンパク質として発現するように遺伝子上で融合していることも意味する。本明細書に記載するように、ドナーおよびアクセプター部分は、ドナー部分とアクセプター部分との間のFRETが、ドナー部分が励起され、スクロースがスクロース結合タンパク質部分に結合すると変化する限り、スクロース結合部分の末端に融合していてもよいし、スクロース結合部分の内部部位に融合していてもよい。例えば、引用により本明細書に含める仮出願 60/658,141号を参照されたい。
好ましいスクロース結合タンパク質部分は、とりわけ、配列番号2の配列を有するアグロバクテリウム・ツメファシエンス ペリプラズムスクロース結合タンパク質 (BP)からのスクロース結合タンパク質部分である。スクロース結合領域をコードするスクロース BP 配列のいずれの部分も本発明の核酸において用いることが出来る。スクロース BP またはその他の生物、例えば、好熱性および超好熱性生物を含むグラム陰性細菌からのそのあらゆるホモログのスクロース結合部分が、本明細書に記載するベクターにクローニングでき、開示されるアッセイにしたがって活性をスクリーニングすることが出来る。
スクロース BPの天然の種変異体も、測定可能なスクロース結合機能を維持する、部位特異的突然変異、欠失または挿入を含む人工操作された変異体に加えて用いることが出来る。本発明の核酸コンストラクトにおける使用に好適な変異体核酸配列は、スクロース BPの遺伝子配列(配列番号 1)に対して好ましくは少なくとも 30、40、50、60、70、75、80、85、90、95、または99%の類似性または同一性を有する。適切な変異核酸配列はまた、高度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でスクロース BP遺伝子にハイブリダイズしうる。高度にストリンジェントな条件は当該技術分野で既知であり、例えばManiatis et al.、Molecular Cloning: A Laboratory Manual、2d Edition、1989、およびShort Protocols in Molecular Biology、ed. Ausubel、et al.（双方とも本明細書において引用により含まれる）を参照のこと。ストリンジェントな条件は、配列に依存し、かつ異なる環境下で異なることになる。より長い配列は、より高温で特異的にハイブリダイズする。核酸のハイブリダイゼーションに対する広範な手引きは、Tijssen, Techniques in Biochemistry and Molecular Biology--Hybridization with Nucleic Acid Probes, "Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid assays" (1993)（引用により本明細書中に含まれる）において見出される。一般にストリンジェントな条件は、所定のイオン強度、ｐＨで特定の配列の熱融点（Ｔｍ）よりも約５〜１０℃低いように選択される。Ｔｍは、（標的配列がＴｍで過剰に存在し、プローブの５０％が平衡時に占有される際に）標的に対して相補的なプローブの５０％が平衡時に標的配列にハイブリダイズする（所定のイオン強度、ｐＨおよび核酸濃度の下での）温度である。ストリンジェントな条件は、塩濃度が約１．０Ｍ未満のナトリウムイオン、典型的にはｐＨ７．０〜８．３で約０．０１〜１．０Ｍのナトリウムイオン濃度（または他の塩）、ならびに温度が短いプローブ（例えば１０〜５０ヌクレオチド）について少なくとも約３０℃および長いプローブ（例えば５０ヌクレオチドより長い）について少なくとも約６０℃という条件となる。ストリンジェントな条件はまた、ホルムアミドなどの不安定化剤の添加によって得られる場合がある。
開示されたナノセンサーにより測定可能なリガンド濃度の範囲を拡大するために、本発明の好ましい人工変異体が、リガンドに対する低い親和性を示すように設計される場合がある。リガンドに対する結合親和性の低下または増大を示すさらなる人工変異体は、ランダムまたは部位特異的変異誘発および他の既知の変異誘発技術によって構築され、本明細書に記載のベクターにクローニングされ、活性について開示されたアッセイに従いスクリーニングされうる。開示されたバイオセンサーの結合特異性はまた、バイオセンサーによって認識されるリガンドを改変するように変異誘発によって改変されうる。例えば、Looger et al.、Nature、423 (6936): 185-190を参照のこと。
本発明のセンサーを、ドナーおよびアクセプター蛍光部分に共有結合または融合したスクロース結合部分および１以上のさらなるタンパク質結合部分を有するように設計して、活性が２以上のリガンドによって制御されるアロステリック酵素を作ることが出来る。２以上のリガンドに対する二重特異性を含むアロステリック酵素は当該技術分野において記載されており、本明細書に記載するFRET バイオセンサーの構築に用いることが出来る(Guntas and Ostermeier、2004、J. Mol. Biol. 336(1): 263-73)。
本発明の単離された核酸は、FRETにおけるドナーおよびアクセプター部分として協働可能なあらゆる適切なドナーおよびアクセプター蛍光タンパク質部分を組み込んでいてもよい。好ましいドナーおよびアクセプター部分は、GFP（緑色蛍光タンパク質）、CFP（シアン蛍光タンパク質）、BFP（青色蛍光タンパク質）、YFP（黄色蛍光タンパク質）、およびこれらの増強された変異体よりなる群から選択され、ここでは特に好ましい実施形態が、ドナー/アクセプター対CFP/YFP Venus（これは改善されたｐＨ耐性および成熟期間を有するYFPの変異体である）（Nagai, T., Ibata, K., Park, E.S., Kubota, M., Mikoshiba, K., and Miyawaki, A. (2002) A variant of yellow fluorescent protein with fast and efficient maturation for cell-biological applications. Nat. Biotechnol. 20, 87-90）によって提供される。それ以外として、より高いｐＨ安定性およびより大きいスペクトル分離を有するMiCy/mKO対が挙げられる（Karasawa S, Araki T, Nagai T, Mizuno H, Miyawaki A. Cyan-emitting and orange-emitting fluorescent proteins as a donor/acceptor pair for fluorescence resonance energy transfer. Biochem J. 2004 381:307-12）。さらに、ドナーまたはアクセプターとして適するものに、ディスコソマ（Discosoma）種に由来する天然DsRed、別属に由来するDsRedのオルソログ、または最適化された特性を有する天然DsRedの変異体（例えば、K83M変異体またはDsRed2（Clontechから入手可能））が挙げられる。ドナーおよびアクセプター蛍光部分を選択する場合に考慮すべき基準は、例えば米国特許第6,197,928号（その全体が引用により本明細書中に含まれる）に開示のように当該技術分野で既知である。
本明細書において用いる場合、「変異体」という用語は、少なくとも 約 30%、40%、50%、60%、70%、より好ましくは少なくとも 75%の同一性、例えば少なくとも 80%、90%、95%またはそれを超える同一性をネイティブな蛍光分子に対して有しているポリペプチドをいう。多くのかかる変異体が当該技術分野において知られており、あるいはネイティブな蛍光分子のランダムまたは指向性突然変異誘発によって容易に作ることが出来る(例えば、Fradkov et al.、FEBS Lett. 479:127-130 (2000)参照)。FRETのために発光量子ドット (QD) (Clapp et al.、2005、J. Am. Chem. Soc. 127(4): 1242-50)、色素、例えばこれらに限定されないが数例を挙げると、TOTO色素(Laib and Seeger、2004、J Fluoresc. 14(2):187-91)、Cy3およびCy5 (Churchman et al.、2005、Proc Natl Acad Sci U S A. 102(5): 1419-23)、Texas Red、フルオレセイン、およびテトラメチルローダミン (TAMRA) (Unruh et al.、Photochem Photobiol. 2004 Oct 1)、AlexaFluor 488、ならびに蛍光タグを使用することも可能である (例えば、Hoffman et al.、2005、Nat. Methods 2(3): 171-76参照)。
本発明者らは、最近、バイオセンサーのフルオロフォアが類似または関連配列のストレッチを含む場合、遺伝子サイレンシングが特定の細胞内および特に生物全体内でのバイオセンサーの発現に不利に作用しうることを発見している。かかる場合には、フルオロフォアの核酸配列が修飾されてもコードされたアミノ酸配列は変化しないように、フルオロフォアのコード配列を各フルオロフォアのコドンの１つもしくは複数の縮重またはゆらぎ位置で修飾することが可能である。あるいはフルオロフォアの機能に不利に作用しない、１つもしくは複数の保存的置換もまた取り込まれる場合がある。PCT出願［代理人整理番号第056100-5054号、Methods of Reducing Repeat-Induced Silencing of Transgene Expression and Improved Fluorescent Biosensors］（その全体が引用により本明細書中に含まれる）を参照のこと。
本発明は、本明細書に記載のバイオセンサーポリペプチドをコードする単離核酸分子を含むベクターをさらに提供する。例示的なベクターは、バクテリオファージ、バキュロウイルスまたはレトロウイルスなどのウイルス由来のベクター、ならびにコスミドまたはプラスミドなど、細菌あるいは細菌の配列と他の生物由来の配列の組み合わせに由来するベクターを含む。かかるベクターは、バイオセンサーをコードする核酸配列に作動可能に連結される発現制御配列を含む発現ベクターを含む。ベクターは、大腸菌(E.coli)もしくは他の細菌などの原核細胞内、または動物細胞または植物細胞を含む真核細胞内での機能に適合されうる。例えば、本発明のベクターは、一般に、対象とする宿主細胞に適合する複製起点、対象とする宿主細胞に適合する１つもしくは複数の選択可能なマーカーおよび１つもしくは複数のマルチクローニングサイトなどの要素を含むことになる。ベクター内に含めることを意図した特定の要素の選択は、例えば誘導または調節可能なプロモーター、ベクターの所望のコピー数、所望の選択系などの使用を通じ、対象とする宿主細胞、インサートのサイズ、挿入配列の調節された発現が望ましいか否かなどの因子に依存することになる。異なる用途における宿主細胞とベクターの間の適合性を保証することに関連する因子は、当該技術分野で周知である。
本発明での使用を目的とする好ましいベクターは、ドナーおよびアクセプター蛍光分子をコードする核酸間のスクロース結合ドメインまたは受容体のクローニングを可能にし、ドナーおよびアクセプター蛍光分子に共有結合されたスクロース結合ドメインを含むキメラまたは融合タンパク質の発現をもたらすことになる。例示的なベクターは、Fehr et al. (2002) (Visualization of maltose uptake in living yeast cells by fluorescent nanosensors, Proc. Natl. Acad. Sci. U S A 99, 9846-9851)、（その全体が引用により本明細書中に含まれる）に開示された細菌のpRSET-FLIP誘導体を含む。融合タンパク質を発現するような正しいフレームで核酸をベクターにクローニングする方法は、当該技術分野で周知である。
本発明のスクロースバイオセンサーは、細胞のいずれの位置で発現させてもよく、例えば、細胞質、細胞表面または細胞内オルガネラ、例えば、核、小胞、ER、液胞等が挙げられる。タンパク質の発現を様々な細胞内区画へと標的化する方法およびベクター成分は当該技術分野において周知であり、バイオセンサーが発現する特定の細胞または生物に応じて選択される。例えば、Okumoto、S.、Looger、L. L.、Micheva、K. D.、Reimer、R. J.、Smith、S. J.、and Frommer、W. B. (2005) P Natl Acad Sci USA 102(24)、8740-8745; Fehr、M.、Lalonde、S.、Ehrhardt、D. W.、and Frommer、W. B. (2004) J Fluoresc 14(5)、603-609、参照。これらはその内容全体を引用により本明細書に含める。
本発明のキメラ核酸は、好ましくは、ドナーとアクセプターの間のFRETにおける変化がリガンド結合時に検出されうるような方法で、ドナーおよびアクセプター蛍光部分のコード配列がリガンド結合ドメインの別の末端に融合されるように構築され得る。蛍光ドメインは、所望により、１つもしくは複数の柔軟なリンカー配列によりリガンド結合ドメインから分離されうる。かかるリンカー部分は、好ましくは約１〜５０アミノ酸残基長、およびより好ましくは約１〜３０アミノ酸残基長である。リンカー部分およびそれらの用途は当該技術分野で周知であり、例えば、米国特許第5,998,204号および米国特許第5,981,200号ならびにNewton et al.、Biochemistry 35:545-553 (1996)において記載されている。あるいは、リンカーまたは本明細書に記載するいずれかのフルオロフォアの短くしたバージョンも利用できる。例えば、その内容全体を引用により本明細書に含める出願番号60/658,141に記載のように、本発明者らは３つのモジュールのいずれかのN-またはC-末端部分を欠失させることによりFRET 比変化が上昇しうることを見いだしている。
蛍光部分が末端ではなくバイオセンサー内部の位置から発現および提示されるように、蛍光分子のコード配列の一方もしくは双方をスクロース結合タンパク質のオープンリーディングフレーム内に挿入することも、スクロース結合ドメインの性質および大きさに応じて可能となる。かかるセンサーは、米国特許出願番号60/658,141号（その全体が引用により本明細書中に含まれる）に概ね記載されている。スクロース結合配列を、タンデム分子間ではなく、単一のフルオロフォアのコード配列、すなわちGFP、YFP、CFP、BFPなどをコードする配列内に挿入することも可能となる。米国特許第6,469,154号および米国特許第6,783,958号（これら各々はその全体が引用により本明細書中に含まれる）の開示によると、かかるセンサーは、フルオロフォアの活性に影響するタンパク質内部での検出可能な変化をもたらすことにより応答する。
本発明はまた、大腸菌もしくは他の細菌などの原核細胞、または酵母細胞、動物細胞または植物細胞などの真核細胞を含む、本発明のベクターまたは発現ベクターが形質移入された宿主細胞を含む。本明細書において用いる場合、「植物」という用語には、それから植物が再生しうる植物細胞、植物プロトプラスト、植物細胞組織培養、植物カルス、植物凝集塊、および植物中のインタクトな植物細胞または植物の部分、例えば、胚、花粉、胚珠、種子、葉、花、枝、果実、穀粒、穂、穂軸、殻、茎、根、根端、葯等が含まれる。別の態様では、本発明は、環境的に安定なバイオセンサーの発現をコードする核酸配列の発現に特徴づけられる表現型を有するトランスジェニック非ヒト動物を特徴とする。表現型は、動物の体細胞内および胚細胞内に含有される導入遺伝子によって授けられ、（ａ）スクロースバイオセンサーをコードするDNAコンストラクトを含む導入遺伝子を動物の接合体に導入するステップと、（ｂ）接合体を偽妊娠した動物に移植するステップと、（ｃ）接合体の出産までの発達を可能にするステップと、（ｄ）導入遺伝子を含む少なくとも１つのトランスジェニック子孫を同定するステップと、により生成されうる。導入遺伝子を胚に導入するステップは、導入遺伝子を含む胚性幹細胞を胚に導入するか、または胚を導入遺伝子を含むレトロウイルスに感染させることにより達成可能である。本発明のトランスジェニック動物は、トランスジェニック線虫（C.elegans)、トランスジェニックマウスおよび他の動物を含む。
トランスジェニック植物も含まれる。トランスジェニック植物はセンサーを標準的技術、例えば、アグロバクテリウム媒介形質転換によって発現させることによって作成され、センサーは、それぞれの区画、例えばプラスチド、液胞、細胞表面等にシグナルおよびアンカー配列を用いて標的化される。植物または組織は、区画におけるスクロースの定常状態レベルについて、および、例えば、光、糖の供給、阻害物質等の条件変化に応答した定常状態レベルの変化について分析され得、または様々な突然変異体が試験されうる。これには、ハイスループットスクリーニングによる突然変異体集団の分析または細胞株またはプロトプラストの分析が含まれる。
本発明は、本明細書に記載の特性を有する単離されたスクロースバイオセンサー分子、特に超好熱性および中等度好熱性タンパク質を用いて構築されたスクロース結合蛍光指標も包含する。例えば、その内容全体を引用により本明細書に含める仮出願 60/658,142号を参照されたい。かかるポリペプチドは、本明細書に記載の核酸コンストラクトを用いて組み換え発現されうるか、または成分ドメインの一部もしくは全部の化学的結合により生成されうる。発現されたポリペプチドを、所望により、当該技術分野で既知の生化学的および／または免疫学的精製方法により、転写−翻訳系において生成しおよび／またはそれから単離するか、あるいは組み換え細胞から産生してもよい。本発明のポリペプチドを、細胞膜抽出物などの脂質二重層、あるいは人工脂質二重層（例えばリポソーム小胞）またはナノ粒子に導入してもよい。
スクロースを検出する方法
本発明の核酸およびタンパク質は、スクロース結合を検出し、かつインビトロと植物または動物内の双方でのスクロースのレベルにおける変化を測定するのに有用である。一実施形態では、本発明は、細胞のサンプル内でのスクロースレベルにおける変化を検出する方法であって、（ａ）本明細書に記載のスクロースバイオセンサーをコードする核酸を発現する細胞および細胞のサンプルを提供するステップと、（ｂ）ドナー蛍光タンパク質部分とアクセプター蛍光タンパク質部分の間のFRETにおける変化を検出するステップと、を含む方法を含み、ここで、ドナー蛍光タンパク質部分とアクセプター蛍光タンパク質部分の各々がスクロース結合ドメインに共有結合されており、ドナー部分とアクセプター部分との間のFRETの変化が、細胞のサンプル中のスクロースレベルの変化を示す。
本発明の核酸およびタンパク質は、スクロース結合を検出し、かつインビトロと植物または動物内の双方でのスクロースのレベルにおける変化を測定するのに有用である。一実施形態では、本発明は、細胞のサンプル内でのスクロースレベルにおける変化を検出する方法であって、（ａ）本明細書に記載のスクロースバイオセンサーをコードする核酸を発現する細胞および細胞のサンプルを提供するステップと、（ｂ）ドナー蛍光タンパク質部分とアクセプター蛍光タンパク質部分の間のFRETにおける変化を検出するステップと、を含む方法を含み、ここで、ドナー蛍光タンパク質部分とアクセプター蛍光タンパク質部分の各々がスクロース結合ドメインに共有結合されており、ドナー部分とアクセプター部分との間のFRETの変化が、細胞のサンプル中のスクロースレベルの変化を示す。
FRETは、当該技術分野で既知の種々の技術を用いて測定されうる。例えば、FRETを測定するステップは、アクセプター蛍光タンパク質部分から放射される光を測定するステップを含みうる。あるいは、FRETを測定するステップは、ドナー蛍光タンパク質部分から放射される光を測定するステップと、アクセプター蛍光タンパク質部分から放射される光を測定するステップと、ドナー蛍光タンパク質部分から放射される光とアクセプター蛍光タンパク質部分から放射される光の比を計算するステップと、を含みうる。FRETを測定するステップは、ドナー部分の励起状態寿命または異方性変化を測定するステップも含みうる（Squire A, Verveer PJ, Rocks O, Bastiaens PI. J Struct Biol. 2004 Jul;147(1):62-9. Red-edge anisotropy microscopy enables dynamic imaging of homo-FRET between green fluorescent proteins in cells.）。かかる方法は、当該技術分野で既知であり、米国特許第6,197,928号に概ね記載されており、これはその全体が引用により本明細書中に含まれる。
細胞のサンプル中のスクロースの量については、FRETの度合いを測定することにより判定可能である。まずセンサーをサンプル中に導入しなければならない。スクロース濃度における変化については、サンプルと蛍光指標の間の接触後における第１の時間および第２の時間にFRETをモニターし、かつFRETの度合いにおける差異を測定することによって判定可能である。サンプル中のスクロースの量を、例えば滴定により確定された較正曲線を用いて定量可能である。
本発明の方法によって分析されるべき細胞サンプルは、例えば細胞表面上でのスクロース輸送またはシグナル伝達の測定においてはインビボに、またはスクロースの流出が細胞培養において測定されうるインビトロに含有される場合がある。あるいは、細胞または組織由来の流体抽出物はサンプルとして使用される場合があり、それからスクロースが検出または測定される。
本明細書に開示されるようにスクロースレベルを検出するための方法を用い、スクロース濃度およびスクロース変化に関連する活性の調節に使用可能な化合物をスクリーニングおよび同定することが可能である。一実施形態では、特に、本発明は、スクロース結合またはレベルを調節する化合物を同定する方法であって、（ａ）本明細書に開示されるようにスクロースバイオセンサーを発現する細胞および細胞のサンプルを含む混合物を、１つもしくは複数の試験化合物に接触させるステップと、（ｂ）該接触させるステップ後に、ドナー蛍光ドメインとアクセプター蛍光ドメインの間のFRETを測定するステップと、を含む、方法を含み、ここで該接触させるステップ後のFRETの増大または低下は、該試験化合物がスクロース結合活性またはスクロースレベルを調節する化合物であることを示す。
「調節する」という用語は、この態様において、かかる化合物がスクロース結合活性を上昇または低下させうる、または活性、即ち、スクロースレベルに影響する細胞機能またはシグナル伝達カスケードに影響を与えうるということを意味する。スクロース結合活性を上昇または低下させる化合物は、上記のように異常なスクロース活性または異常な細胞代謝またはシグナル伝達に関連する障害の治療的介入および処置の標的であり得る。細胞機能に関連するスクロース結合活性またはスクロースレベルを上昇または低下させるその他の化合物は、リガンド結合活性に関連する障害の処置のための治療製品へと開発され得る。
有用性
本発明のスクロースセンサーは広い範囲の用途に有用であり、例えば、植物におけるスクロースレベルのより正確な研究に有用である。スクロースは多くの微生物にとってと同様に、植物細胞にとっても必須の多量養素である。本発明のセンサーは植物におけるスクロース合成機構の解明およびスクロース分布がよりよい改良作物の開発の助けとなるであろう。かかるセンサーは生細胞におけるスクロースの流れを測定する、例えば、植物と微生物との間のスクロースの交換、植物間の交換、植物細胞間のスクロースの交換、スクロースの細胞内分布および流れ、および動物の腸におけるスクロースの取り込みを追跡する、独特の機会を提供する。かかるセンサーは、維管束組織へと既知のスクローストランスポーターによって輸入される前に、スクロースをアポプラズム空間(apoplasmic space)に提供する師部の積み込みに必要な未知の機能、例えば、スクロース流出体（effluxer）の同定、細胞内区画、例えばプラスチドおよび液胞への/からのスクロースの取り込みおよび放出に必要なトランスポーターの同定および糖の恒常性を制御する未知の調節物質およびシグナル伝達カスケードの同定のための手段として有用であり得る。したがって本発明のセンサーは、スクロースの細胞による取り込みおよび放出、そしてより重要なことに細胞内区画化を特徴決定するために利用できる。
本発明のスクロースセンサーは広い範囲の用途に有用であり、例えば、植物におけるスクロースレベルのより正確な研究に有用である。スクロースは多くの微生物にとってと同様に、植物細胞にとっても必須の多量養素である。本発明のセンサーは植物におけるスクロース合成機構の解明およびスクロース分布がよりよい改良作物の開発の助けとなるであろう。かかるセンサーは生細胞におけるスクロースの流れを測定する、例えば、植物と微生物との間のスクロースの交換、植物間の交換、植物細胞間のスクロースの交換、スクロースの細胞内分布および流れ、および動物の腸におけるスクロースの取り込みを追跡する、独特の機会を提供する。かかるセンサーは、維管束組織へと既知のスクローストランスポーターによって輸入される前に、スクロースをアポプラズム空間(apoplasmic space)に提供する師部の積み込みに必要な未知の機能、例えば、スクロース流出体（effluxer）の同定、細胞内区画、例えばプラスチドおよび液胞への/からのスクロースの取り込みおよび放出に必要なトランスポーターの同定および糖の恒常性を制御する未知の調節物質およびシグナル伝達カスケードの同定のための手段として有用であり得る。したがって本発明のセンサーは、スクロースの細胞による取り込みおよび放出、そしてより重要なことに細胞内区画化を特徴決定するために利用できる。
本発明のセンサーは、スクロース合成と植物成育と特定の植物細胞、植物組織、植物部分および植物の収量の間の関係を特徴決定するのにも利用できる。というのは様々な異なる環境条件下での植物の成育応答は、二酸化炭素利用、酸素感受性、温度依存的成育反応性および糖含量に応答する内在遺伝子の発現によって一般に影響されうるからである。
本発明のスクロースセンサーはさらに、生鮮食品および食品産業においても有用性を有する。今日、生鮮食品の品質は通常その外観、例えば、色、大きさ、形、病気の存在および不在によって判断されている。生鮮食品における全可溶性固体の濃度は携帯型屈折計によって通常測定されている。かかる評価は通常、生鮮食品の全体の品質の測定において不正確である。例えば、全可溶性固体と、味の重要な決定成分の１つである総糖濃度の間にはあまり相関がないことが示されている。別の味の重要な成分はフルーツ酸である。フルーツ糖/酸比は消費者に受け入れられるかの重要な指標として用いることが出来、フルーツの全体の品質の１つの決定因子として作用する。したがって本発明のセンサーは生鮮食品および食品の糖濃度と甘さの常套分析において適用できる。
本発明のセンサーは生化学的経路のインビボでの研究、即ち、微生物、土壌および真核生物におけるスクロースの流れの測定にも有用である。本発明のセンサーはハイスループットスクリーニングにおいてスクロース合成に正または負に影響を与える新規化学物質の開発のための手段としても利用できる。本発明のスクロースセンサーは創薬およびスクリーニングのための優れたツールである。スクロースレベルは、化学物質、代謝事象、輸送工程およびシグナル伝達工程に応答して、リアルタイムで測定することが出来る。
本発明のセンサーは糖代謝に関連する疾患、例えば、糖尿病の診断にも利用することが出来る。それは特定の疾患、例えば、胃上皮傷害の診断に利用することも出来る。胃上皮傷害の検出方法、特に胃の潰瘍および病巣の非浸潤的、比放射能および非-x線技術または手順を用いた検出方法は米国特許第5,620,899号に開示されており、引用により本明細書に含める。この方法は患者に経口投与出来る二糖を用いる。二糖は細胞膜を横切って輸送されず、小腸内でその単糖類成分に代謝され、体内では分解されない。胃上皮に対する傷害は二糖が代謝されずに血中に入ることを可能にする。したがって、二糖は胃上皮傷害の程度と相関しうる程度で血中または尿中に現れる。典型的には、二糖は患者に投与され、次いで血液または尿が採取され、それを二糖についてアッセイする。胃上皮傷害の検出における特に診断マーカーとしてのスクロースの使用は米国特許第5,605,840号に記載されており、引用により本明細書に含める。したがって、スクロースセンサーは基礎となる疾患の研究および治癒の発展のための手段を提供しうる。
以下の実施例は、本発明を説明および例示するために提供される。そのようなものとして、それらが本発明の範囲を限定するものとして解釈されるべきではない。当業者であれば、多数の他の実施形態も上文や特許請求の範囲に記載のような本発明の範囲内に含まれることを十分に理解するであろう。
実施例
実施例 1. スクロース BPのクローニングおよび構造モデリング
本発明者らはまず、マルトース/トレハロース/スクロース結合タンパク質・シノリゾビウム・メリロティ (SmThuE)が、スクロースの輸送の役割も果たしていると仮定した。さらに、データベース検索により、推定シノリゾビウム・メリロティ・マルトース/トレハロース/スクロース結合タンパク質 (SmThuE)に関連するアグロバクテリウム・ツメファシエンス タンパク質を同定した。スクロースセンサーを作成するために、SmThuEをシアン (CFP)および黄色蛍光タンパク質 (YFP)を結合タンパク質のN-およびC-末端に結合させることにより２つのGFP 変異体と融合させた。しかし、 SmThuEの融合タンパク質はECFPとEYFPとの間に挟まれている場合、不安定であることが判明した。
実施例 1. スクロース BPのクローニングおよび構造モデリング
本発明者らはまず、マルトース/トレハロース/スクロース結合タンパク質・シノリゾビウム・メリロティ (SmThuE)が、スクロースの輸送の役割も果たしていると仮定した。さらに、データベース検索により、推定シノリゾビウム・メリロティ・マルトース/トレハロース/スクロース結合タンパク質 (SmThuE)に関連するアグロバクテリウム・ツメファシエンス タンパク質を同定した。スクロースセンサーを作成するために、SmThuEをシアン (CFP)および黄色蛍光タンパク質 (YFP)を結合タンパク質のN-およびC-末端に結合させることにより２つのGFP 変異体と融合させた。しかし、 SmThuEの融合タンパク質はECFPとEYFPとの間に挟まれている場合、不安定であることが判明した。
アグロバクテリウム・ツメファシエンス (AtThuE)由来のマルトース/トレハロース/スクロース結合タンパク質は、SmThuE タンパク質 (配列番号2)の予測成熟領域に対して78.9 %同一であり、大腸菌由来のマルトース結合タンパク質(malE)に21.4 %相同的であるので、本発明者らはAtThuE 結合タンパク質のクローニングを試みた。遺伝子を単離するために、シグナル配列と終止コドンを含まない成熟 AtThuEをコードするゲノム アグロバクテリウム・ツメファシエンス (株 C58C1) DNAからのPCR産物をECFP と EYFP遺伝子の間のKpnI 部位にクローニングした(図1A)。キメラ遺伝子をpRSET (Invitrogen)に挿入し、大腸菌 BL21(DE3)Gold (Stratagene)に移した。AtThuE 配列 (配列番号1)をDNA配列決定により確認し、公表された配列と比較してN192D置換を有することを見いだした。この相違が突然変異または天然の変動に対応するのかは知られていない。N192Dは結合ポケットの外側にあり、突然変異を担持するAtThuEは糖センサーとして機能的であったので (表1参照)、さらなるすべての実験は突然変異 N192Dを担持するFLIPsuc4μと称するナノセンサーを用いて行った。FLIPsuc タンパク質をBL21(DE3)goldから抽出し記載されているようにして精製した(Fehr et al. 2002)。
実施例 2.ナノセンサーのインビトロ 特徴決定
成熟アグロバクテリウム・ツメファシエンス マルトース/トレハロース/スクロース BP タンパク質をコードするDNA 断片を上記のようにECFPとEYFP 配列との間に融合させた。キメラ遺伝子を大腸菌で発現させ、タンパク質産物を精製し、基質特異性についてアッセイした。
成熟アグロバクテリウム・ツメファシエンス マルトース/トレハロース/スクロース BP タンパク質をコードするDNA 断片を上記のようにECFPとEYFP 配列との間に融合させた。キメラ遺伝子を大腸菌で発現させ、タンパク質産物を精製し、基質特異性についてアッセイした。
基質滴定曲線および基質特異性分析はSafire (Tecan) 蛍光光度計で行った。ECFPは433 nmで励起し、発光はECFPおよびEYFPについてそれぞれ485 nmおよび528 nmに設定した (バンド幅 12 nm)。すべてのインビトロ分析は20 mM MOPS バッファー、pH 7中で行った。FRETをEYFP-ECFP 発光強度比として測定した。リガンド結合の際の比変化を用いて、結合定数(Kd)を基質滴定曲線を下記式 1に当てはめることにより決定した。
（式１）: S=1-(r-rmin)/(rmax-rmin)=[S]b/[P]t=n[S]/(Kd+[S])
ここで、 [S] は基質濃度; [S]b、結合基質濃度; n、結合部位の数; [P]t、結合タンパク質の総濃度; r、比; rmin、リガンドの非存在下での最小比; rmax、飽和状態での最大比。ヒル係数をヒル式 2を用いて決定した。
（式２）: S= (n[S]n)/( Kd+[S]n)
（式１）: S=1-(r-rmin)/(rmax-rmin)=[S]b/[P]t=n[S]/(Kd+[S])
ここで、 [S] は基質濃度; [S]b、結合基質濃度; n、結合部位の数; [P]t、結合タンパク質の総濃度; r、比; rmin、リガンドの非存在下での最小比; rmax、飽和状態での最大比。ヒル係数をヒル式 2を用いて決定した。
（式２）: S= (n[S]n)/( Kd+[S]n)
このセンサーとmalE センサーのヒンジ領域に対する末端の相対的位置の類似性により、本発明者らは糖-誘導ヒンジねじれ運動がGFP-変異体を互いに近くに動かし、FRETの上昇をもたらすと予測した。驚くべきことに、糖の精製タンパク質への添加の結果、FRETが低下した。同じ現象が 非関連リボース (FLIPrib) およびグルコースセンサー (FLIPglu)において観察された。したがって、精製融合タンパク質 FLIPsuc4μの滴定は、FRET のスクロース濃度依存的低下を示した(図1B)。このセンサーのスクロースに対する結合定数 (Kd) は 3.7 μMでありヒル係数は1.04であった。表1に示すように、FLIPsucについて観察された最大比変化は0.2である。FLIPsuc4μは0.4 μM〜33 μMの高親和性範囲におけるスクロース定量を可能とする。
Thermus由来のトレハロース結合タンパク質はその他の糖にも結合するため、本発明者らはFLIPsuc センサーの特異性を試験した(Silva et al. 2005)。センサーの比特異性を測定するために、本発明者らは、マルトース、グルコースおよびスクロースに対するセンサーの親和性を比較した(図1C)。本発明者らは、マルトースに対するセンサーの親和性がより高く、グルコースに対する親和性はスクロースに対するものと同じ範囲にあることを見いだした。これらのデータは、FLIPsucをスクロースレベルの測定に使用可能であること、FLIPsuc センサーはマルトース (FLIPmal)およびグルコース (FLIPglu)センサーと機能においてオーバーラップすることを示唆する。それゆえ、スクロースに対する選択性および特異性が改良されたFLIPsuc センサーを開発するのが望ましい。
実施例 3.特異性の変化した突然変異体 FLIPsucの作成
スクロースセンサーのダイナミックレンジを広げるために、部位特異的突然変異誘発を上記のように用いてスクロース結合ドメインの結合親和性を低下させた。FLIPsuc4μの親和性突然変異体を作成した。AtThuEと結晶化されたマルトース結合タンパク質とのアラインメントおよびモデリングはリガンド結合に重要な残基の予測の助けとなった。FLIPsuc4μのスクロース結合部位に存在すると予測されるアミノ酸の突然変異により、広い範囲のスクロース濃度にわたって感受性であり、スクロース結合に際する最大比変化が有意に大きいセンサーが作成された(表1参照)。置換 F113A、D115A、D115E、D115N、W244A、Y246Aおよび W283Aを有する突然変異体形態をFLIPsuc4μの突然変異体バックグラウンドにおけるKunkel 突然変異誘発を用いて (Kunkel et al. 1991)作成した。親和性突然変異体をFLIPsucF113A、FLIPsucW283A、FLIPsucD115A、FLIPsucD115E、FLIPsucY246A、および FLIPsucW244Aと命名した。６つのすべての突然変異体はFLIPsuc4μと比べてスクロースに対する親和性が低く、Kd 値は10μMからより高いmM 範囲であった(表1)。 EYFPとECFPとの間の出発比は1.4から2.0に近い範囲であり、その他の糖センサー (FLIPmal、FLIPgluおよびFLIPrib)についてみられたものと類似である。置換 F113AをFLIPsuc4μのThuE 部分に導入すると FLIPsuc10μが生じ、これはスクロースに対する結合定数 (Kd)が10 μMであり、したがって、少なくとも 1μM〜90 μ Mのスクロース定量範囲を提供する(表1)。
スクロースセンサーのダイナミックレンジを広げるために、部位特異的突然変異誘発を上記のように用いてスクロース結合ドメインの結合親和性を低下させた。FLIPsuc4μの親和性突然変異体を作成した。AtThuEと結晶化されたマルトース結合タンパク質とのアラインメントおよびモデリングはリガンド結合に重要な残基の予測の助けとなった。FLIPsuc4μのスクロース結合部位に存在すると予測されるアミノ酸の突然変異により、広い範囲のスクロース濃度にわたって感受性であり、スクロース結合に際する最大比変化が有意に大きいセンサーが作成された(表1参照)。置換 F113A、D115A、D115E、D115N、W244A、Y246Aおよび W283Aを有する突然変異体形態をFLIPsuc4μの突然変異体バックグラウンドにおけるKunkel 突然変異誘発を用いて (Kunkel et al. 1991)作成した。親和性突然変異体をFLIPsucF113A、FLIPsucW283A、FLIPsucD115A、FLIPsucD115E、FLIPsucY246A、および FLIPsucW244Aと命名した。６つのすべての突然変異体はFLIPsuc4μと比べてスクロースに対する親和性が低く、Kd 値は10μMからより高いmM 範囲であった(表1)。 EYFPとECFPとの間の出発比は1.4から2.0に近い範囲であり、その他の糖センサー (FLIPmal、FLIPgluおよびFLIPrib)についてみられたものと類似である。置換 F113AをFLIPsuc4μのThuE 部分に導入すると FLIPsuc10μが生じ、これはスクロースに対する結合定数 (Kd)が10 μMであり、したがって、少なくとも 1μM〜90 μ Mのスクロース定量範囲を提供する(表1)。
良好なセンサーのための１つの重要な因子はそのデルタ比であり、非結合から飽和結合への比変化の尺度である。比変化が高いほど、糖レベルのより小さい変化がより容易に正確に測定できる。FLIPsuc4μのデルタ比はおよそ 0.2である。FLIPsuc-10μの変化はより小さいが(0.1-0.15)、D115A 突然変異を有するセンサーはデルタ比が少なくとも 0.6とより改良されている。D115A 突然変異はスクロースに対するKdが1.4 mMのセンサーを与える。AtThuEの結晶構造モデルによると、位置 D115 は結合タンパク質ポケットのヒンジ領域に位置する。D115 残基は、アラニンに変化するだけでなく、グルタミン酸およびアスパラギンにも変化した。D115N置換によるとスクロース添加の際の比変化をみることができないセンサーが生じたが、アスパラギン酸からグルタミン酸への変化は、Kdが2.9 mMでありデルタ比がほぼ0.4のセンサーを与えた (図2、表1)。
スクロースセンサーのデルタ比を改良する試みにおいて、W283A 突然変異を含むセンサーをGFP 変異体と結合タンパク質との間により短いリンカー配列を有するコンストラクトにクローニングした。Deuschle et al. (2005)は、リンカー配列の長さが比の最大変化に主要な役割を果たすことを示している。 FLIPglu600μΔ5に対応するコンストラクトを構築したところ、リンカーが18 アミノ酸短くなったスクロースセンサーが得られた(FLIPsucW283A-18AA)。このコンストラクトは、元のコンストラクトと比べて3-倍高い比変化を有するセンサーを提供した (図3)。
表1. FLIP スクロース親和性突然変異体。インビトロで測定した結合定数。
実施例 4.基質結合特異性
複雑な混合物 (例えば、生細胞の細胞質)における基質濃度の測定にはその基質に対する高い特異性を有するセンサーが必要である。それゆえ、インビボ用途のためには、各センサーの結合特異性を試験することが必要である。
複雑な混合物 (例えば、生細胞の細胞質)における基質濃度の測定にはその基質に対する高い特異性を有するセンサーが必要である。それゆえ、インビボ用途のためには、各センサーの結合特異性を試験することが必要である。
SmThuE は主にトレハロースおよびマルトース結合タンパク質として機能する。スクロースは程度は低いが輸送されると考えられている。FLIPsuc4μをそれゆえ、トレハロース、マルトースおよびその他の関連糖とインキュベートしてその結合能力を試験した。基質-誘導立体構造変化をマイクロプレートアッセイにおいてFRET を用いて測定した。FLIPsuc4μはマルトース、トレハロースおよびツラノース に5x Kd (20μM)にてスクロースおよびグルコースよりも高い程度または同程度で結合し、パラチノースにはより低い程度で結合した(図4)。フルクトース、ガラクトースおよびセロビオースはより高い糖濃度(50 x Kd)の添加後であっても認識されなかった。マルトースおよびグルコースをFLIPsuc4μおよびその突然変異体のさらなる分析のために選択した。というのは、それらは植物において重要な糖であり、それゆえスクロース測定にインビボで干渉するかもしれないからである。FLIPsuc4μはスクロースよりもマルトース (Kd 230nM)に対してより高い親和性を示し、これはSmThuEの主にマルトースおよびトレハロース取り込みへの関与ならびに程度は低いがスクロース取り込みへの関与に一致する(Jensen et al.)。グルコースはセンサーに対する親和性がより低く、Kd 27μMであった。ほとんどの突然変異体はスクロースよりもマルトースに対して高い親和性を有し、類似のパターンを示す。FLIPsuc-10μはもっとも顕著な例でありスクロースと比べてマルトースに対する親和性が83 倍高い (表1)。D115 突然変異体はともにスクロースおよびマルトースと比較してマルトースに対して最高の親和性を示すが、その程度は異なる。FLIPsucD115Aはマルトース に対してKd が 51μMでありグルコースに対して16mMであり、FLIPsucD115EについてのKd 値はそれほどばらついておらず、マルトース に対して1.5 mMでありグルコースに対して9.1 mMである。しかし、FLIPsucW283Aはスクロースに対する親和性について異なるパターンを示し、マルトース(Kd 265 μM)についてより3倍高く、グルコースに対するKdは 7.2 mMである。
したがってFLIPsucW283Aは驚くべきことにスクロースに対してよりよい選択性を示し、したがってインビボ用途に最適である。というのはデータは主にスクロース変化を示し、その他の糖、例えばグルコースまたはマルトースの変化によりあまり影響を受けないからである。特異性を保持するが親和性がより低いさらなる突然変異体をインビボ分析のために作成することができる。
本明細書中て考察されるすべての出版物、特許および特許出願は、引用により本明細書中に含まれる。本発明がその特定の実施形態に関連して記載されている一方、そのさらなる改良を可能とし、さらに本出願が、一般に本発明の原理に従い、本発明が関係する当該技術分野内での既知のまたは習慣的な実施の枠内に収まり、上記の本質的な特徴に適用可能で、かつ添付の特許請求の範囲の範囲内に従うように、本開示からのかかる逸脱を含む、本発明の任意の変数、使用、または適応を網羅するように意図されることが理解されるであろう。
参考文献
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Claims (35)
- 以下を含むスクロース蛍光指標をコードする単離核酸:
スクロース結合タンパク質部分;
スクロース結合タンパク質部分の末端に遺伝子上で融合しているドナー蛍光タンパク質部分; および、
スクロース結合タンパク質部分の末端に遺伝子上で融合しているアクセプター蛍光タンパク質部分;
ここでドナー部分とアクセプター部分の間の蛍光共鳴エネルギー転移(FRET)がドナー部分が励起され、スクロースがスクロース結合タンパク質部分に結合すると変化し、
そして、該スクロース結合タンパク質部分は、配列番号１と少なくとも８５％の同一性を有する核酸配列によりコードされ、測定可能なスクロース結合機能を維持する。 - 該スクロース結合タンパク質部分が細菌ペリプラズム結合タンパク質 (PBP) 部分である請求項 1の単離核酸。
- 該スクロース結合タンパク質部分が 細菌病原性決定基遺伝子産物である請求項 1の単離核酸。
- 該スクロース結合タンパク質部分が好熱性微生物由来である請求項 1の単離核酸。
- 該好熱性微生物が高度好熱菌または中度好熱菌である請求項 4の単離核酸。
- 該細菌がアグロバクテリウムの種である請求項 2の単離核酸。
- 該スクロース結合タンパク質部分がアグロバクテリウムのスクロース BP由来のものである請求項 6の単離核酸。
- 該スクロース結合タンパク質部分が配列番号2の配列からのものである請求項 7の単離核酸。
- 該ドナー蛍光タンパク質部分がGFP、CFP、BFP、YFP、dsRED、CoralHue（登録商標） ミドリイシ-シアン (MiCy)および単量体 CoralHue（登録商標） クサビラ-オレンジ (mKO) からなる群から選択される請求項 1の単離核酸。
- 該アクセプター蛍光タンパク質部分がGFP、CFP、BFP、YFP、dsRED、CoralHue（登録商標） ミドリイシ-シアン (MiCy)および単量体 CoralHue（登録商標） クサビラ-オレンジ (mKO) からなる群から選択される請求項 1の単離核酸。
- 該ドナー蛍光タンパク質部分がCFPであり、該アクセプター蛍光タンパク質部分が YFP Venusである請求項 1の単離核酸。
- さらに少なくとも１つのリンカー部分を含む請求項 1の単離核酸。
- 該スクロース蛍光指標が、配列番号４の配列を有するスクロース蛍光指標と比較して、スクロースに対する親和性の上昇または低下を示す請求項 1の単離核酸。
- 該スクロース蛍光指標が、配列番号４の配列を有するスクロース蛍光指標と比較して、最大 FRET 比変化の上昇を示す請求項 1の単離核酸。
- 請求項 1の核酸を発現する細胞。
- スクロース蛍光指標が該細胞の細胞質ゾルに発現する請求項 15の細胞。
- スクロース蛍光指標が該細胞の表面に発現する請求項 15の細胞。
- スクロース蛍光指標が該細胞の核に発現する請求項 15の細胞。
- 原核生物である請求項 15の細胞。
- 真核細胞である請求項 15の細胞。
- 酵母細胞である請求項 20の細胞。
- 動物細胞である請求項 20の細胞。
- 植物細胞である請求項 15の細胞。
- 請求項 1の核酸を含む発現ベクター。
- 請求項 24のベクターを含む細胞。
- 原核細胞における機能に適している請求項 24の発現ベクター。
- 真核細胞における機能に適している請求項 24の発現ベクター。
- 請求項 1の核酸を発現するトランスジェニック非ヒト動物。
- 請求項 1の核酸を発現するトランスジェニック植物。
- 請求項 1の核酸にコードされるスクロース結合蛍光指標。
- 以下の工程を含む、インビトロにて含まれる細胞のサンプルにおけるスクロースのレベルの変化を検出する方法：
(a)請求項 1の核酸を発現しインビトロにて含まれる細胞を提供する工程;および、
(b)該ドナー蛍光タンパク質部分と該アクセプター蛍光タンパク質部分との間のFRETの変化を検出する工程、
ここで該ドナー部分と該アクセプター部分との間のFRETの変化はインビトロにて含まれる細胞のサンプルにおけるスクロースのレベルの変化を示す。 - FRETを測定する工程が、アクセプター蛍光タンパク質部分から放射される光を測定することを含む請求項 31の方法。
- FRETを測定する工程が、ドナー蛍光タンパク質部分から放射される光を測定すること、アクセプター蛍光タンパク質部分から放射される光を測定すること、およびドナー蛍光タンパク質部分から放射される光とアクセプター蛍光タンパク質部分から放射される光との比を算出することを含む請求項 31の方法。
- FRETを測定する工程がドナー部分の励起状態寿命を測定することを含む請求項 31の方法。
- 以下の工程を含む、スクロースのその受容体への結合を調節する化合物を同定する方法:
(a)請求項 1の核酸を発現しインビトロにて含まれる細胞を１以上の被験化合物とスクロースの存在下で接触させる工程;および、
(b)該接触の後、該ドナー蛍光ドメインと該アクセプター蛍光ドメインとの間のFRETを測定する工程、
ここで該接触の後のFRETの上昇または低下は、該被験化合物がスクロース結合を調節する化合物であることを示す。
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