JP5138271B2 - 高活性アミダーゼ酵素液およびその調製方法 - Google Patents

Description

本発明は、高純度、高活性なアミダーゼ、特にα−アミノ酸アミドおよびα−ヒドロキシ酸アミドを立体選択的に加水分解する活性を有するアミダーゼ、およびその調製方法に関する。

光学活性なα−アミノ酸やα−ヒドロキシ酸は各種工業製品等の中間体、食品添加物および医薬品等として重要である。微生物あるいは微生物由来の酵素をα−アミノ酸アミドおよびα−ヒドロキシ酸アミドの加水分解触媒として用いることにより、光学活性なα−アミノ酸やα−ヒドロキシ酸を製造できることが知られている。例えば、光学活性なα−アミノ酸の製造については、特開昭６１−２９３３９４号公報、特開昭６２−５５０９７号公報、光学活性なα−ヒドロキシ酸の製造については、特開平２−８４１９８号公報等が挙げられる。近年、アミダーゼ遺伝子が導入された組換え体を用いた反応も報告されてきている（ＷＯ００／６３３５４、特表２００４−５３６６０８、Appl. Environ. Microbiol (2005) 71, 7961-7973）。

このような加水分解反応において、アミダーゼ活性を効率的に発現させるため、培養液中や反応液中に亜鉛塩などの金属塩を添加することが行われている。例えば、ＷＯ００／６３３５４においては、Enterobacter Cloacae N-7901株由来のアミダーゼについて、培養液中に亜鉛塩、マンガン塩、カルシウム塩およびマグネシウム塩を添加している。また、Ochrobactrum anthropi NCIMB40321由来のアミダーゼについて、特表２００４−５３６６０８においては反応液中への亜鉛塩の添加効果および培養液中への亜鉛塩の添加効果が示されている。さらに、同菌株ついて、Appl. Environ. Microbiol (2005) 71, 7961-7973においては反応液中への亜鉛、マグネシウム、マンガンの金属塩の添加効果についての記載がある。
また、金属塩とアミダーゼとの関係に関する情報としては、タンパク質立体構造情報データベース（Protein Data Bank(http://www.rcsb.org/pdb/home/home.do)）において、好熱菌 Thermotoga maritima由来でアセトアミダーゼのホモログであるタンパク質（2F4L）に亜鉛が含有されていることが開示されている。さらに同データベースにより、好アルカリ性菌Bacillus halodurans由来のアセトアミダーゼのホモログであるタンパク質（2II1）にはカルシウムが含有されていることも知られている。なお、Enterobacter Cloacae N-7901株由来のアミダーゼとThermotoga maritima由来でアセトアミダーゼのホモログであるタンパク質（2F4L）とはアミノ酸配列において３１％の相同性を有する。

上述の加水分解反応の触媒としては、アミダーゼ活性菌体を用いてもよく、菌体処理物（菌体抽出液や精製酵素）を用いてもよい。反応時の問題点として目的の酵素以外の活性により、例えば副生物の生成、光学純度の低下が懸念されることから、単離した酵素を用いて反応を行う方法がしばしば採用されている。しかしながら、通常のクロマトグラフィーを用いた酵素の単離方法は、工程が複雑になり、また、酵素の収量も低下することから、経済的な方法であるとは限らない。

一方、好熱菌由来の酵素等、酵素の耐熱性が高い場合には、菌体抽出液等の加熱処理という比較的簡単な処理により、粗精製酵素を得ることができることが知られている（極限環境微生物学会誌 第２巻 第１号 p9（２００３）、極限環境微生物学会誌 第４巻 第２号 p125（２００５）等）。アミダーゼの耐熱性については、Ochrobactrum anthropi NCIMB40321由来のものが60℃まで安定であり、より高温では失活することが報告されている（Appl. Environ. Microbiol (2005) 71, 7961-7973）。
特開昭６１−２９３３９４号公報 特開昭６２−５５０９７号公報 特開平２−８４１９８号公報 国際公開第００／６３３５４号パンフレット 特表２００４−５３６６０８ Appl. Environ. Microbiol (2005) 71, 7961-7973 極限環境微生物学会誌 第２巻 第１号 p9（２００３） 極限環境微生物学会誌 第４巻 第２号 p125（２００５）

このように、光学活性なα−アミノ酸またはα−ヒドロキシ酸などの製造方法において加水分解触媒として使用されるアミダーゼは、従来の方法では十分高い活性または高純度に取得することは困難であった。

本発明者らは、Enterobacter Cloacae N-7901株由来のアミダーゼの特性等について鋭意検討した結果、驚くべきことに、該酵素が常温菌由来のものであるにもかかわらず、70℃、６時間の処理においても少なくとも90%以上の活性を維持しているという極めて高い耐熱性を有することを見出した。この知見をもとに、このアミダーゼの耐熱性についてさらに検討したところ、該酵素遺伝子が導入された培養形質転換体を破砕し、殆どのタンパク質が変性不溶化するような条件で加熱処理した後も、該酵素は変性せず活性を維持したまま可溶性画分に存在することを明らかにした。さらに、加熱処理時に亜鉛塩を存在させることにより、亜鉛を添加しないで加熱処理した場合に比べて活性が数倍向上することを見出し、本発明を完成するに至った。

すなわち、本発明は、以下に関する。
（１）常温菌由来のアミダーゼ遺伝子が導入された形質転換体を破砕および加熱して得られるアミダーゼ。
（２）アミダーゼがα−アミノ酸アミドまたはα−ヒドロキシ酸アミドを立体選択的に加水分解する活性を有する酵素である、（１）に記載のアミダーゼ。
（３）アミダーゼ遺伝子がEnterobacter cloacae由来の遺伝子である、（１）または（２）に記載のアミダーゼ。
（４）アミダーゼ遺伝子が以下の(a)または(b)のタンパク質をコードする遺伝子である、（１）〜（３）のいずれか１項に記載のアミダーゼ。
(a) 配列番号１で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質
(b) 配列番号１で示されるアミノ酸配列と少なくとも70%以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつアミダーゼ活性を有するタンパク質
（５）加熱が亜鉛塩の存在下で実施される、（１）〜（４）のいずれか１項に記載のアミダーゼ。
（６）亜鉛塩の濃度が、0.1 mM〜40 mMである（５）に記載のアミダーゼ。
（７）亜鉛塩が、硫酸亜鉛または塩化亜鉛である、（５）または（６）に記載のアミダーゼ。
（８）下記１）から４）の少なくとも１つの理化学的性質を有するアミダーゼ。
１）SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動分析から算出される分子量が33,000〜35,000Daである。
２）ゲル濾過クロマトグラフィー分析においてそのピーク面積の80%以上が130,000Daを越える。
３）10 mM亜鉛塩存在、７０℃保温下のアミダーゼ活性の失活が１０％以下である。
４）40℃における比活性が、20〜40ユニット／ｍｇタンパク質である。
好ましくは１）から４）うち、２つ、３つまたは全ての理化学的性質を有するアミダーゼである。
（９）常温菌由来のアミダーゼ遺伝子が導入された形質転換体を破砕して得られる破砕物を加熱し、可溶性画分を採取することを含む、アミダーゼの調製方法。
（１０）アミダーゼがα−アミノ酸アミドまたはα−ヒドロキシ酸アミドを立体選択的に加水分解する活性を有する酵素である、（９）に記載の方法。
（１１）アミダーゼ遺伝子がEnterobacter cloacae由来の遺伝子である、（９）または（１０）に記載の方法。
（１２）アミダーゼ遺伝子が以下の(a)または(b)のタンパク質をコードする遺伝子である、（９）〜（１１）のいずれか１項に記載の方法。
(a) 配列番号１で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質
(b) 配列番号１で示されるアミノ酸配列と少なくとも70%以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつアミダーゼ活性を有するタンパク質
（１３）加熱が亜鉛塩の存在下で実施される、（９）〜（１２）のいずれか１項に記載の方法。
（１４）カルボン酸の製造方法であって、
(i) 常温菌由来のアミダーゼ遺伝子が導入された形質転換体を破砕し、
(ii) 得られる破砕物を加熱し、
(iii) 加熱処理物から可溶性画分を採取してアミダーゼを調製し、および
(iv) 得られたアミダーゼをアミド化合物と接触させる
ことを含む、前記方法。
（１５）アミド化合物がα−アミノ酸アミドまたはα−ヒドロキシ酸アミドである、（１４）に記載の方法。
（１６）カルボン酸が光学活性カルボン酸である（１４）又は（１５）に記載の方法。

本発明によれば、加熱処理という極めて簡単な操作により、高純度なアミダーゼを得ることができる。また、加熱処理時に亜鉛塩を共存させることで、高活性なアミダーゼを得ることができる。さらにまた、本発明により得られるアミダーゼを用いて、カルボン酸を製造することができる。

本発明において、常温菌由来のアミダーゼ遺伝子を導入した形質転換体を破砕し、加熱処理しても、当該アミダーゼは変性せず、活性を維持したまま可溶性画分に存在することが示された。したがって、本発明では、アミダーゼ遺伝子が導入された形質転換体を破砕して得られる破砕物を加熱することで得られるアミダーゼおよびアミダーゼの製造方法が提供される。
さらに、破砕物に亜鉛塩を添加して、亜鉛塩の存在下で加熱処理することにより、亜鉛塩を添加しないで加熱処理した場合に比べて活性が数倍向上することが示された。一方、加熱処理後に亜鉛塩を添加した場合も活性向上は認められたが、亜鉛存在下での加熱処理に比べるとその効果は極めて小さかった。また、形質転換体の培養時により高い亜鉛塩濃度で培養した場合、形質転換体における活性はわずかに向上したものの、菌体破砕液においてはその効果は認められなかった。つまり、加熱処理時における亜鉛塩による活性向上効果は、培養液に由来する亜鉛塩のみでは不充分であることを明らかにした。したがって、本発明では、亜鉛塩を添加し、所定の濃度の亜鉛塩の存在下に上記破砕物を加熱することで得られるアミダーゼおよびアミダーゼの製造方法が提供される。
以下、本発明を詳しく説明する。

本発明において、アミダーゼは、常温菌由来のアミダーゼである。
極限環境微生物ハンドブック（大島泰郎監修、株式会社サイエンスフォーラム）によれば、好熱菌とは一般に５５℃以上で生育可能な細菌を言う。一方、好冷菌、低温菌については諸定義があるが、最適生育温度が１５℃以下のもので、好冷菌は生育限界温度が２０℃前後のもの、低温菌は生育限界温度が２０℃以上のもの、という定義が提唱されている。
「常温菌」とはこれら好熱菌、好冷菌、低温菌の定義に当てはまらないものを言い、従って、最適生育温度が１５〜４５℃のものであり、５５℃以上で生育不可能な細菌を指す。現在単離されている微生物の多くは常温菌であるが、常温菌の例としては、限定されるわけではないが、Enterobacter属細菌、Escherichia属細菌、Krebsiella属細菌、Ochrobactrum属細菌、Rhodococcus属細菌、Mycobacterium属細菌等を挙げることができる。Enterobacter属細菌には、例えば、Enterobacter cloacaeが挙げられる。

本発明において、アミダーゼは、例えば、配列番号１で示されるアミノ酸配列を含むタンパク質であって、かつアミダーゼ活性を有するタンパク質を含む。

配列番号１で示されるアミノ酸配列からなるアミダーゼは、Enterobacter cloacae由来のアミダーゼであり、配列番号２で示されるアミダーゼ遺伝子によりコードされる。

また、本発明で用いられるアミダーゼには、配列番号１で示されるアミノ酸配列と６５％以上、好ましくは７０％以上、より好ましくは７５％以上、さらに好ましくは８５％以上、最も好ましくは９０％、９５％、９７％、９８％または９９％の相同性（同一性）を有するアミノ酸配列を含み、かつアミダーゼ活性を有するタンパク質も含まれる。

さらに、本発明におけるアミダーゼには、配列番号１で示されるアミノ酸配列において、１または数個のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列を含み、かつ、アミダーゼ活性を有するタンパク質も含まれる。
配列番号１で示されるアミノ酸配列において、１個または数個のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列としては、例えば、(i) 配列番号１で示されるアミノ酸配列において、１〜１０個（例えば、１〜５個、好ましくは１〜３個、さらに好ましくは１〜２個）のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列、（ii）配列番号１で示されるアミノ酸配列の１〜１０個（例えば、１〜５個、好ましくは１〜３個、さらに好ましくは１〜２個）のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されたアミノ酸配列、（iii）配列番号１で示されるアミノ酸配列に１〜１０個（例えば、１〜５個、好ましくは１〜３個、さらに好ましくは１〜２個）のアミノ酸が付加したアミノ酸配列、（iv）上記（i）〜（iii）を組み合わせたアミノ酸配列が挙げられる。

本発明で用いられるアミダーゼは、酸アミド基を加水分解してカルボン酸とアミンまたはアンモニアを生ずる反応（ＲＣＯＮＨＲ’＋Ｈ₂Ｏ→ＲＣＯＯＨ＋ＮＨ₂Ｒ’）を触媒する加水分解酵素であり、好ましくはα−アミノ酸アミドまたはα−ヒドロキシ酸アミドを立体選択的に加水分解する活性を有する酵素である。したがって、本発明において、「アミダーゼ活性」は、酸アミド基を加水分解してカルボン酸とアミンあるいはアンモニアとを生ずる反応を触媒する活性、好ましくはα−アミノ酸アミドまたはα−ヒドロキシ酸アミドを立体選択的に加水分解して、Ｌ−α−アミノ酸またはＬ−α−ヒドロキシ酸と、アンモニアとを生ずる反応を触媒する活性を意味する。

アミド加水分解反応は、α−アミノ酸アミドまたはα−ヒドロキシ酸アミドを0.5〜50％の濃度になるように本発明のアミダーゼと混合して行う。α−アミノ酸アミドとして、例えば、反応用緩衝液（50 mM Tris-HCl緩衝液）で希釈した2%ラセミ体tert-ロイシンアミドを使用することができる。また、本発明のアミダーゼは、50 mMリン酸ナトリウム緩衝液や反応用緩衝液などで適当な濃度に希釈してもよい。これらの溶液は、混合前に予め反応温度に加温しておくことが好ましい。
反応は、通常、0〜80℃、好ましくは20〜75℃、より好ましくは40℃において、pH4〜11、好ましくはpH6〜10の範囲で行われる。アミダーゼ活性の測定では、反応時間は0.1〜48時間、好ましくは20分である。反応は、1Mリン酸溶液を添加することにより停止することができる。
反応後の溶液を遠心して上清を取得し、さらにフィルターにより菌体を除去する。こうして得られた反応終了液を逆相カラムを用いた高速液体クロマトグラフィーにて分析し、生成したtert-ロイシン量からアミダーゼ活性を算出することができる。光学純度は、光学分割カラムを用いた高速液体クロマトグラフィー分析にて得られたL体及びD体の比率から算出する。

また、本発明で用いられるアミダーゼは、形質転換体、形質転換体懸濁液、形質転換体破砕物（菌体抽出液を含む）、粗精製アミダーゼ酵素液またはアミダーゼ酵素液などの本発明のアミダーゼを７０℃で１時間処理した後も、処理前の活性と比較して、例えば、７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、さらに好ましくは少なくとも９５％の活性を保持していることを特徴とする。

本発明のアミダーゼ遺伝子は、本発明で用いられるアミダーゼをコードする遺伝子である。本発明のアミダーゼ遺伝子は、好ましくはEnterobacter cloacae由来のアミダーゼ遺伝子であり、例えば、配列番号２で示される塩基配列からなる遺伝子が挙げられるが、これに限定されるものではない。

本発明のアミダーゼ遺伝子には、配列番号２で示される塩基配列に相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAであって、かつアミダーゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子も含まれる。
このような遺伝子の例として、配列番号２で示される塩基配列と６５％以上、好ましくは７０％以上、より好ましくは７５％以上、さらに好ましくは８５％以上、最も好ましくは９０％、９５％、９７％、９８％または９９％の相同性（同一性）を有する塩基配列を含み、かつアミダーゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子が挙げられる。

上記遺伝子は、配列番号２で示される塩基配列からなるDNAの一部をプライマーとして、公知の核酸増幅方法またはプライマーウォーキング法により取得することができる。また、本発明のアミダーゼ遺伝子は、配列番号２で示される塩基配列からなるDNAの一部をプローブとして、コロニーハイブリダーゼーション、プラークハイブリダイゼーション、サザンブロットなどの公知のハイブリダイゼーション法により取得することもできる。
上記方法には、アミダーゼ遺伝子を含むベクター、mRNA、total RNA、cDNA、ゲノムDNA、またはそれらのライブラリーを用いることができる。また、市販のライブラリーを使用しても良い。
本明細書において、ストリンジェントな条件は、ハイブリダイゼーション後の洗浄条件として、例えば、「2×SSC、0.1％SDS、42℃」、「1×SSC、0.1％SDS、37℃」、よりストリンジェントな条件としては、例えば、「1×SSC、0.1％SDS、65℃」、「0.5×SSC、0.1％SDS、50℃」等の条件を挙げることができる。
ハイブリダイゼーションは、公知の方法によって行うことができる。ハイブリダイゼーションの方法は、例えば、「Molecular Cloning, A Laboratory Manual 2nd ed.」（Cold Spring Harbor Laboratory Press（1989））、「Current Protocols in Molecular Biology」（John Wiley & Sons（1987-1997））等を参照することができる。

さらに、本発明のアミダーゼ遺伝子には、配列番号２で示される塩基配列において、１または数個の塩基配列が欠失、置換または付加された塩基配列を含み、かつ、アミダーゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子も含まれる。
配列番号２で示される塩基配列において、１個または数個の塩基が欠失、置換または付加された塩基配列としては、例えば、(i) 配列番号２で示される塩基配列において、１〜１０個（例えば、１〜５個、好ましくは１〜３個、さらに好ましくは１〜２個）の塩基が欠失した塩基配列、（ii）配列番号２で示される塩基配列の１〜１０個（例えば、１〜５個、好ましくは１〜３個、さらに好ましくは１〜２個）の塩基が他の塩基で置換された塩基配列、（iii）配列番号２で示される塩基配列に１〜１０個（例えば、１〜５個、好ましくは１〜３個、さらに好ましくは１〜２個）の塩基が付加した塩基配列、（iv）上記（i）〜（iii）を組み合わせた塩基配列が挙げられる。

配列番号２で示される塩基配列において１または数個の核酸に欠失、置換または付加などの変異の生じた塩基配列を含むDNAは、「Molecular Cloning, A Laboratory Manual 2nd ed.」(Cold Spring Harbor Press (1989))、「Current Protocols in Molecular Biology」(John Wiley & Sons (1987-1997))、Kunkel (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 488-92、Kunkel (1988) Method. Enzymol. 85: 2763-6等に記載の部位特異的変異誘発法等の方法に従って調製することができる。

また、DNAに変異を導入するには、Kunkel法や Gapped duplex法等の公知手法により、部位特異的突然変異誘発法を利用した変異導入用キット、例えばQuikChange^TM Site-Directed Mutagenesis Kit（ストラタジーン社製）、GeneTailor^TM Site-Directed Mutagenesis System（インビトロジェン社製）、TaKaRa Site-Directed Mutagenesis System（Mutan-K、Mutan-Super Express Km等：タカラバイオ社）等を用いて行うことができる。

本発明のアミダーゼ遺伝子の塩基配列の確認は、慣用の方法により配列決定することにより行うことができる。例えば、ジデオキシヌクレオチドチェーンターミネーション法（Sanger et al. (1977) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74: 5463）等により行うことができる。また、適当なDNAシークエンサーを利用して配列を解析することもできる。

上述のアミダーゼを発現させるための宿主−ベクター系の選択は下記のようにして行われる。

宿主に導入するベクターとしては、上記の酵素遺伝子を保持し、且つ複製可能であれば、特段の制約を受けるものではなく、それぞれの宿主に適したベクターを使用することができる。例えば、プラスミドDNA、バクテリオファージ等が挙げられる。
プラスミドDNAとしては、例えば、大腸菌由来のプラスミド（pBR322、pUC18、pUC19、pUC118、pUC119、pBluescriptなどのColE系プラスミド等）、放線菌由来のプラスミド（pIJ486等）、酵母由来のプラスミド（YEp13、YEp 24、Ycp50等）が挙げられる。ファージDNAとしては、λファージ（Charon4A、Charon21A、EMBL3、EMBL4、λgt10、λgt11等）、レトロトランスポゾンDNA、人工染色体DNA等が挙げられる。

宿主としては、上記の酵素遺伝子が発現するものであれば良い。例えば、哺乳動物細胞、昆虫細胞、大腸菌、枯草菌、酵母、カビ、ロドコッカス属細菌、植物等を挙げることができる。好ましくは、大腸菌およびロドコッカス属細菌である。
大腸菌宿主としては、例えば大腸菌Ｋ１２株やＢ株、あるいはそれら野生株由来の派生株であるJM109株、XL1-Blue株、C600株、W3110株等を挙げることができる。その他、これら菌株の変異体、組換え体および遺伝子工学的手法による誘導体等も用いられ得る。
酵母宿主としては、例えばサッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）、シゾサッカロミセス・ポンベ（Schizosaccharomyces pombe）、ピヒア・パストリス（Pichia pastoris）等を挙げることができる。
ロドコッカス属細菌としては、例えばロドコッカス ロドクロウス（Rhodococcus rhodochrous）ATCC 12674株やロドコッカス ロドクロウス（Rhodococcus rhodochrous）J-1株（FERM BP-1478）等を挙げることができる。

以下、より詳細にアミダーゼ遺伝子が導入された形質転換（導入）体（以下、単に「形質転換体」と称す）の作製方法について説明する。

プラスミドDNAは、宿主細胞中にてプラスミドが増殖するために必要なDNA配列、プロモーター、リボソーム結合配列、転写ターミネーター（転写終結配列）、更に好ましくは形質転換体の選択マーカーとなる遺伝子を含む。
プロモーター配列としては、大腸菌由来のトリプトファンオペロンのｔｒｐプロモーター、ラクトースオペロンのｌａｃプロモーター、ラムダファージ由来のＰＬプロモーターおよびＰＲプロモーター、枯草菌由来のグルコン酸合成酵素プロモーター（ｇｎｔ）、アルカリプロテアーゼプロモーター（ａｐｒ）、中性プロテアーゼプロモーター（ｎｐｒ）、α−アミラーゼプロモーター（ａｍｙ）等を挙げることができる。また、ｔａｃプロモーター、ｔｒｃプロモーターのように独自に改変、設計された配列も利用できる。
リボソーム結合配列としては、SD配列やKozak配列が知られており、これらの配列を変異遺伝子の上流に挿入することができる。原核生物を宿主に用いるときにはSD配列を、真核細胞を宿主に用いるときにはKozak配列をPCR法等により付加してもよい。SD配列としては、大腸菌由来、ロドコッカス属細菌または枯草菌由来の配列等を挙げることができるが、所望の宿主内で機能する配列であれば特に限定されるものではない。例えば、16SリボゾームRNAの３’末端領域に相補的な配列が４塩基以上連続したコンセンサス配列をDNA合成により作製してこれを利用してもよい。
転写終結配列は必ずしも必要ではないが、ρ因子非依存性のもの、例えばリポプロテインターミネーター、ｔｒｐオペロンターミネーター等が利用できる。
選択マーカーとしては、例えばジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子、ブラストサイジン耐性遺伝子等を挙げることができる。

大腸菌を宿主に用いた場合には、特に有用なベクターとしては、pUCT118、pTrc99A、pKK233-2、pFY529、pET-12、pET-26b等が例示される。

これらのベクターにアミダーゼをコードする遺伝子断片を組み込むには、アミダーゼ遺伝子を含むDNAを適当な制限酵素で切断し、必要であれば適当なリンカーを付加した後、適当な制限酵素で切断したベクターと結合させることにより行うことができる。あるいは、アミダーゼ遺伝子を含むDNAを適当な制限酵素認識配列を含むプライマーを用いてPCR増幅し、増幅産物を制限酵素処理した後、適当な制限酵素で切断したベクターと結合させることによっても行うことができる。

このように作製した発現ベクターを宿主細胞に導入すれば、アミダーゼを高度に発現する形質転換体が得られる。当該形質転換体を培養することにより、これらの酵素を発現させることができる。

発現ベクターの宿主への導入方法としては、DNAを導入する方法であれば特に限定されるものではない。例えばカルシウムイオンを用いる方法、エレクトロポレーション法等を挙げることができる。
大腸菌への発現プラスミドの導入方法としては、例えば、ヒートショックによる方法を挙げることができ、その際、予め作製したコンピテントセルを用いてもよい。酵母への発現プラスミドの導入方法としては、酵母にDNAを導入する方法であれば特に限定されず、例えばエレクトロポレーション法、スフェロプラスト法、酢酸リチウム法等を挙げることができる。

次に、上記のように作製した形質転換体を培養する方法を説明する。培養に際し使用する培地には特に制限は無く、宿主菌が資化し得る炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、形質転換体の培養を効率的に行うことができる培地であれば、天然培地、合成培地のいずれを用いてもよい。また培養条件に関しても、形質転換体が生育、増殖可能で且つ酵素産生が良好に行える条件を選択し、培養すればよい。
培養培地に用いる炭素源としては、グルコース、ガラクトース、フラクトース、スクロース、ラフィノース、デンプン等の炭水化物、酢酸、プロピオン酸等の有機酸、エタノール、プロパノール、グリセリン等のアルコール類を挙げることができる。窒素源としては、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等の無機酸若しくは有機酸のアンモニウム塩またはその他の含窒素化合物を挙げることができる。その他、ペプトン、肉エキス、コーンスティープリカー、酵母エキス、各種アミノ酸等を用いてもよい。無機物としては、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸銅、炭酸カルシウム、硫酸亜鉛等を挙げることができる。その他、ビタミン等を必要に応じて適宜添加してもよい。培養中は必要に応じてアンピシリンやテトラサイクリン等の抗生物質を培地に添加してもよい。

プロモーターとして誘導性のプロモーターを用いた発現プラスミドを導入した形質転換体を培養する場合は、必要に応じてインデューサーを培地に添加してもよい。例えば、イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトシド（ＩＰＴＧ）で誘導可能なプロモーターを有する発現プラスミドを導入した形質転換体を培養するときは、ＩＰＴＧ等を培地に添加することができる。また、インドール酢酸（ＩＡＡ）で誘導可能なｔｒｐプロモーターを用いた発現プラスミドを導入した形質転換体を培養するときは、ＩＡＡ等を培地に添加することができる。

大腸菌の培養に際し、通常の固体培養法で培養してもよいが、培養効率を考慮すると、可能な限り液体培養法を採用して培養することが好ましい。なお、培地の初発ｐＨは７〜９に調整することが適当である。また、培養は、５℃〜４０℃、好ましくは１０℃〜３７℃で５〜１００時間行う。通気攪拌深部培養、振盪培養、静置培養、流加培養等により実施することが好ましい。
ロドコッカス属細菌の培養は、４〜３６℃、好ましくは２０〜３０℃で１８〜９６時間行う。

（破砕処理方法）
こうして得られた培養物から菌体や細胞を回収するには、遠心分離法や膜ろ過法を用いることができる。遠心分離は、限定されるわけではないが、例えば、3,000〜4,500×g、５〜２０分間、４℃の条件で行うことができる。回収した形質転換体を、必要に応じて、リン酸−ナトリウム緩衝液、リン酸緩衝液等で洗浄し、懸濁することができる。このようにして得られる懸濁液を「形質転換体懸濁液」、「菌体懸濁液」と称する場合がある。
菌体または細胞の破砕方法としては、超音波処理、フレンチプレスやホモジナイザーによる高圧処理、ガラスビーズなどによる磨砕処理、リゾチーム、セルラーゼ、ペクチナーゼ等を用いる酵素処理、凍結融解処理、低張液処理、ファージによる溶菌誘導処理等を利用することができる。破砕処理は、必要に応じて氷冷下で行う。破砕処理を行ったサンプルを「形質転換体破砕物」、「破砕物」、「菌体破砕液」または「細胞抽出液全画分」とも称する。菌体破砕液等は、限定されるわけではないが、例えば、菌体懸濁液を超音波破砕機VP−15S（タイテック、日本）を用いて、出力コントロール4、DUTY CYCLE 40%、PULS、TIMER＝Bモード10sの条件で氷冷下に１〜５分、好ましくは３分間破砕することにより得られる。また、菌体破砕液等は、例えば、菌体懸濁液を100 MPa加圧条件でＮｉｒｏ Ｓｏａｖｉ社製ホモジナイザーPANDA2K型を用いて破砕することによっても得られる。

破砕後、形質転換体破砕物から、必要に応じて菌体または細胞の破砕残渣（細胞抽出液不溶性画分を含む）を除くことができる。残渣を除去する方法としては、例えば、遠心分離やろ過などが上げられ、必要に応じて、凝集剤やろ過助剤等を使用して残渣除去効率を上げることもできる。遠心分離は、限定されるわけではないが、例えば、4,000〜25,000×g、3〜45分間、４℃の条件で行うことができる。破砕物から残渣を除去した後に得られる上清は、「細胞抽出液可溶性画分」であり、特に「菌体抽出液」、「粗精製したアミダーゼ溶液」と称する場合がある。

（加熱処理方法）
上述の形質転換体破砕物や細胞抽出液可溶性画分を加熱処理することにより、目的のアミダーゼ以外の多くのタンパク質を変性させることができる。したがって、形質転換体破砕物または細胞抽出液可溶性画分を加熱処理することにより、アミダーゼ酵素液を可溶性画分として取得することができる。本発明のアミダーゼには、上記のように取得されるアミダーゼ酵素液が含まれる。
本発明でいう加熱処理とは、形質転換体に由来する本発明のアミダーゼ以外のタンパク質を変性させるために行う熱失活操作をいい、該加熱処理の温度は好ましくは50℃以上75℃以下、さらに好ましくは60℃以上70℃以下である。加熱処理の時間は特に限定されないが、形質転換体破砕物や細胞抽出液可溶性画分が設定温度となってから10分以上が好ましい。さらに好ましくは1時間以上5時間以下である。
例えば、加熱処理は、形質転換体破砕物などを試験管に入れ、所定の温度に設定したウォーターバスにおいて所定の時間インキュベートすることにより行うことができる。また、温度計を付した三ツ口フラスコに形質転換体破砕物などを入れ、所定の温度まで加熱し、所定の時間加熱処理を行うこともできる。
また、本発明において、形質転換体破砕物を加熱処理（前加熱）した後、破砕残渣を除き、その後再び加熱処理を行ってもよい。再加熱の際、亜鉛塩を存在させてもよい。

（加熱処理時の亜鉛濃度）
本発明において、加熱処理時に硫酸亜鉛や塩化亜鉛等の亜鉛塩を存在させることにより、高活性なアミダーゼを得ることができる。亜鉛塩の濃度は、好ましくは0.01 mM〜40 mM、好ましくは0.1 mM〜40 mM、より好ましくは0.1 mM〜20 mM、さらに好ましくは2 mM〜15 mMであり、よりさらに好ましくは5 mM〜12 mMであり、最も好ましくは10 mMである。

（加熱処理後の不溶物の除去）
加熱処理により生じた不溶性物を除去する方法としては、例えば、遠心分離やろ過などが挙げられ、必要に応じて、凝集剤やろ過助剤等を使用して除去効率を上げることもできる。不溶性物を除去した後に得られた上清または可溶性画分は、「粗精製アミダーゼ酵素液」または「アミダーゼ酵素液」とすることができる。必要があれば、各種クロマトグラフィー等（ゲルろ過、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィー等）を用いて更に精製してもよい。本発明のアミダーゼには、「粗精製アミダーゼ酵素液」、「アミダーゼ酵素液」、およびこれらをさらに精製したものも含まれる。

また、本発明のアミダーゼは、以下（１）〜（４）のうち、少なくとも１つ、好ましくは１つ、２つ、３つまたは全ての理化学的性質を有するものも含まれる。
（１）SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動分析から算出される分子量が、33,000〜35,000 Daである（図８）。
SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動分析は、以下のように実施することができる。
サンプルを、それぞれ培養液時点での菌濃度換算で5 mg／mlとなるよう、50 mM リン酸−ナトリウム緩衝液（pH8）で希釈する。サンプルは、本発明の菌体破砕液をウォーターバス中で７０℃１時間加熱処理し、遠心分離（23,000×g、10分間）による不溶性物質を除いたものが好ましい。希釈したサンプルを等量のポリアクリルアミドゲル電気泳動用サンプル溶液（0.1M Tris−HCl(pH6.8)、4%w/v SDS、12%v/vβメルカプトエタノール、20%v/vグリセロール、微量ブロモフェノールブルー）と混合し、5分間煮沸し変性処理を行う。10%ポリアクリルアミドゲルを作製し、変性処理済みサンプルを1レーンあたり5μlずつ用い、電気泳動分析を行う。分子量マーカーも電気泳動し、アミダーゼの分子量を測定する。

（２）ゲル濾過クロマトグラフィー分析においてそのピーク面積の80%以上が130,000Daを越える（図１０）。
ゲル濾過クロマトグラフィー分析は、以下のように実施することができる。
本発明の菌体懸濁液を超音波破砕して得られる本発明の形質転換体破砕物を、７０℃に設定したウォーターバスにおいて10 mM硫酸亜鉛の存在下で加熱処理し、さらに遠心分離（23,000×g、10分間）して上清を得る。この上清4 mlに36 mlの50 mM Tris−HCl緩衝液（pH8）を加え、DEAE Sepharose Fast Flow（5 ml、GEヘルスケア バイオサイエンス社）によるクロマトグラフィー（同緩衝液、流速1 ml／分）を行う。サンプルをロードした後、同緩衝液により２０分間洗浄し、0−1 Mの塩化ナトリウム勾配により５０分間かけて溶出させる。２０〜２３分の画分に流出する活性画分を回収する。そして、回収した画分をSuperdex 200 10/300 GL（GEヘルスケア バイオサイエンス社、50 mM Tris-HCl (pH 7.5)-150 mM NaCl、溶出速度0.5 ml／分）によるゲル濾過クロマトグラフィーを行う。

（３）10 mM亜鉛塩存在、７０℃保温下のアミダーゼ活性の失活が、１０％以下である（図９）。
10 mM亜鉛塩存在、７０℃で保温した場合、アミダーゼ活性は、保温開始６時間後まで最大値（例えば、保温開始時の活性）の９０％以上維持される。保温条件及び活性の測定は以下のように実施することができる。
攪拌機および温度計を付した200 ml三ツ口フラスコに、50 mM リン酸ナトリウム緩衝液（pH8）に懸濁された本発明の菌体懸濁液を超音波破砕して得られる本発明の形質転換体破砕液100 mlと2mlの0.5M硫酸亜鉛を加え、約３０分かけて７０℃まで加熱する。７０℃に到達した時点、および到達後６時間においてモニタリングを行う。なお、７０℃到達後、６時間まで適宜モニタリングを行ってもよい。モニタリングは、具体的には、内容物約0.5 mlを抜き出し、不溶物を除去（12500×g、5分遠心分離）した後、活性測定を行う。
アミダーゼの活性測定は、下記のように行うことができる。不溶物を除去したサンプル20μｌに50 mMリン酸ナトリウム緩衝液（pH8）180μｌを加えることにより10倍希釈液を作製し、本希釈液20μｌに反応用緩衝液（50 mM Tris-HCl緩衝液(pH8)）780μｌを添加して400倍希釈液を作製する。これを0.5 mlとり、40℃で10分間プレインキュベートする。ここに、予め40℃で加温した0.5 mlの2%ラセミ体tert-ロイシンアミド（50 mM Tris-HCl緩衝液(pH8)）を加え、40℃にて20分間反応させた後、1 Mリン酸溶液を0.2 ml添加して反応を停止させる。遠心（15000rpm / 5min）により菌体を除去し上清を取得し、更に0.45μｍのフィルターにより菌体を完全に除去する。こうして得られた反応終了液5μlを高速液体クロマトグラフィー（分析カラム Inertsil ODS-3V（4.6ｘ250 mm GLサイエンス社製）40℃、キャリヤー 0.1％リン酸水溶液、ＵＶ検出波長＝220 nm）にて分析し、生成したtert-ロイシン量から活性を算出する。
光学純度は、上記反応終了液を高速液体クロマトグラフィー（分析カラム スミキラルOA-5000 住友化学社製、キャリアー 2 mM硫酸銅水溶液／メタノール（85:15） 40℃ UV検出波長=254 nm）にて分析して得られたL体及びD体の比率などから算出できる。

（４）40℃における比活性が、20〜40ユニット／ｍｇタンパク質である（表２）。
比活性は、以下の方法で測定する。理化学的性質（３）に記載した方法と同様の方法で作製した400倍希釈液を40℃で10分間プレインキュベートし、その0.5 mlに、予め40℃で加温した0.5 mlの2%ラセミ体tert-ロイシンアミド（50 mM Tris-HCl緩衝液(pH8)）を加え、40℃にて20分間反応させた後、1 Mリン酸溶液を0.2 ml添加して反応を停止させる。遠心（15000rpm / 5min）により菌体を除去し上清を取得し、更に0.45μｍのフィルターにより菌体を完全に除去する。こうして得られた反応終了液5μlを高速液体クロマトグラフィー（分析カラム Inertsil ODS-3V（4.6ｘ250 mm GLサイエンス社製）40℃、キャリヤー 0.1％リン酸水溶液、ＵＶ検出波長＝220 nm）にて分析する。光学純度の測定は、上記反応終了液を高速液体クロマトグラフィー（分析カラム スミキラルOA-5000 住友化学社製、キャリアー 2 mM硫酸銅水溶液／メタノール（85:15） 40℃ UV検出波長=254 nm）にて分析することにより行うことができる。タンパク質濃度はタンパク質定量キット（バイオラッド社：プロテインアッセイ）により測定し、BSAを標準タンパク質として算出する。１分間に１μmolのtert-ロイシンが生成する活性を１ユニット（U）とする。

次に、上記のように調製した本発明のアミダーゼをアミド化合物に接触させることによる、カルボン酸（例えば、光学活性α−アミノ酸または光学活性α−ヒドロキシ酸などの光学活性カルボン酸）の製造方法を説明する。

本発明においては、上記のようにして得られた本発明のアミダーゼを反応に供する場合には、そのまま用いてもよく、またはさらに精製してもよく、あるいは常法により担体に固定化して用いてもよい。なお、これらの態様のアミダーゼも、本発明のアミダーゼに含まれる。

アミド加水分解反応は、通常、α−アミノ酸アミドまたはα−ヒドロキシ酸アミドなどのアミド化合物を０．５〜５０％（反応基質溶液はスラリー状であってもよい）の濃度になるように本発明のアミダーゼと混合することにより接触させて行う。反応は通常、０〜８０℃、好ましくは２０〜７５℃において、ｐＨ４〜１１、好ましくはｐＨ６〜１０の範囲で行われる。反応時間は、０．１〜４８時間、好ましくは１〜１２時間である。反応は、１Mリン酸溶液を添加することにより停止することができる。

このようにして反応液中に生成、蓄積したＬ−α−アミノ酸またはＬ−α−ヒドロキシ酸などのカルボン酸は、イオン交換法、晶析法等、公知の方法を組み合わせて分離、精製し取得することができる。

本発明において、「α−アミノ酸アミド」（以下、「アミノ酸アミド」とも称する）とは、α−アミノ酸分子中のカルボキシル基が酸アミドを形成するものを意味し、式（Ｉ）：

で表される。式（Ｉ）中、Ｒは、炭素数１〜４の直鎖状もしくは分岐状のアルキル基、フェニル基またはハロゲン原子を意味する。

本明細書において、「ハロゲン原子」は、例えば、フッ素原子、塩素原子、臭素原子またはヨウ素原子である。
本明細書において、「炭素数１〜４の直鎖状もしくは分岐状のアルキル基」の例としては、制限するわけではないが、メチル、エチル、プロピル、イソピロピル、ｎ−ブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル等を挙げることができる。

式（Ｉ）において、アルキル基またはフェニル基は、メルカプト基、ヒロドキシル基、アミノ基、カルボキシル基、フェニル基、インドリル基、メチルチオ基、カルバモイル基およびイミダゾリル基から選ばれる１個以上の基で置換されていてもよい。あるいは、ＲはＮＨ₂基と結合して環を形成していてもよい。

α−アミノ酸アミドの具体例としては、フェニルアラニンアミド、トリプトファンアミド、ロイシンアミド、ｔｅｒｔ−ロイシンアミド、バリンアミド、メチオニンアミド、セリンアミド、ヒスチジンアミド、プロリンアミド等を挙げることができる。

本明細書において、「α−ヒドロキシ酸アミド」（以下、「ヒドロキシ酸アミド」とも称する）とは、α−ヒドロキシ酸分子中のカルボキシル基が酸アミドを形成するものを意味し、式（ＩＩ）:

で表される。式（ＩＩ）中、Ｒ¹およびＲ²は、それぞれ独立して、炭素数１〜４の直鎖状もしくは分岐状のアルキル基、フェニル基またはハロゲン原子を意味する。

式（ＩＩ）において、アルキル基またはフェニル基は、メルカプト基、ヒロドキシル基、アミノ基、カルボキシル基、フェニル基、インドリル基、メチルチオ基、カルバモイル基およびイミダゾリル基から選ばれる１個以上の基で置換されていてもよい。あるいは、Ｒ¹はＲ²と結合して環を形成していてもよい。

α−ヒドロキシ酸アミドの具体例としては、マンデル酸アミド、α−乳酸アミド、α−ヒドロキシ酪酸アミド、α−ヒドロキシイソ酪酸アミド、α−ヒドロキシ吉草酸アミド、α−ヒドロキシイソ吉草酸アミドおよびこれらの置換体などを挙げることができる。

本発明において用いられるアミダーゼは、立体選択的に加水分解を触媒するため、加水分解の結果、Ｌ−α−アミノ酸またはＳ−α−ヒドロキシ酸が選択的に生じ得る。

本発明において、産生されるＬ−α−アミノ酸の具体例としては、例えば、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−ｔｅｒｔ−ロイシン、Ｌ−バリン、Ｌ−メチオニン、Ｌ−セリン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−プロリン等を挙げることができる。また、本発明において、産生されるＳ−α−ヒドロキシ酸の具体例としては、例えば、Ｓ−マンデル酸、Ｌ−乳酸、Ｓ−２−ヒドロキシプロピオン酸、Ｓ−２−ヒドロキシ酪酸、Ｓ−２−ヒドロキシイソ酪酸、Ｓ−２−ヒドロキシ吉草酸、Ｓ−２−ヒドロキシイソ吉草酸およびこれらの置換体等を挙げることができる。
また、反応に用いるアミノ酸アミドまたはヒドロキシ酸アミドの光学純度に関しては特に制限はない。

本発明において、アミダーゼ活性は、ラセミ体のα−アミノ酸アミドやα−ヒドロキシ酸アミドを基質として一定時間反応させた後、生成するα−アミノ酸やα−ヒドロキシ酸を高速液体クロマトグラフィー等により定量することにより、測定することができる。

以下、実施例により本発明を具体的に説明するが、以下の実施例は本発明を限定するものではない。
なお、実施例で使用するpLA205は、pLA205で形質転換されたJM109株FERM BP-7132（E.coli JM109/pLA205）として特許微生物寄託センターに寄託されている。

プラスミドpLA301の作製 （含む図１：プラスミドの作製）
（１）アミダーゼ遺伝子断片の調製
Enterobacter cloacae由来のアミダーゼ遺伝子を含むプラスミドpLA205（再公表WO00/63354参照）を鋳型として、配列番号３の合成DNA（LTL-03）および配列番号４の合成DNA（RV）をプライマーとして用い、ポリメラーゼ伸長鎖反応（PCR）により、アミダーゼ遺伝子を含むDNA断片を増幅した。PCR用の反応混合物は、5μlの10×Pfu Turboバッファー、4μlのdNTP mix（2.5 mM each）、1μlのPfu Turbo DNAポリメラーゼ、37μlの蒸留水、1μlの各プライマー、および鋳型としてpLA205を1μl添加したものを用いた。PCRは、95℃で1分の変性を行った後、94℃で1分、60℃で1分、72℃で5分の反応を30サイクル行った。反応終了後、1μlの反応終了液を1.5 %アガロースゲル電気泳動により分析し、増幅産物を確認した。増幅産物をGFX PCR DNA and Gel Band Purification Kit（GEヘルスケア バイオサイエンス社）を用いて精製し、約50μlのDNA溶液を得た。
次に、43μlのDNA溶液に、10×Kバッファー（タカラバイオ社）を5μl、制限酵素BamHIおよびHindIIIを各1μl加え、37℃で2時間反応後、エタノール沈殿によりDNA断片を回収した。反応終了後1.5 %アガロースゲル電気泳動を行い、約1.3 kbの目的バンド（アミダーゼ遺伝子断片）を切り出し、GFX PCR DNA and Gel Band Purification Kitを用いて精製した。

（２）ベクター断片の調製とライゲーション
一方、5μlのベクターpUC118（タカラバイオ社）に10×Kバッファー（タカラバイオ社）を3μl、滅菌水を23μl、制限酵素BamHIおよびHindIIIを各1μl加え、37℃で2時間反応後、アルカリフォスファターゼ処理（Shrimp Alkaline Phosphatase、プロメガ株式会社）を行い、エタノール沈殿によりDNA断片を回収した。
BamHIとHindIIIにより切断されたこれらのDNA断片、すなわち、（１）で得られたアミダーゼ遺伝子断片および（２）で得られたベクター断片を各2μlと、solution I（DNA Ligation Kit ver.2（タカラバイオ社））（10μl）を混合してライゲーション混合物を作った。該混合物を、16℃で2時間インキュベートすることでアミダーゼ遺伝子断片とベクターpUC118を結合させた。

（３）大腸菌JM109株のコンピテントセルの作製
大腸菌JM109株をLB培地（1% バクトトリプトン、0.5%バクトイーストエキス、0.5% NaCl）1 mlに接種し37℃、5時間好気的に前培養した。得られた前培養液0.4 mlをSOB培地（2%バクトトリプトン、0.5%バクトイーストエキス、10 mM NaCl、2.5 mM KCl、1 mM MgSO₄、1 mM MgCl₂）40 mlに加え、18℃で20時間培養した。当該培養物を遠心分離（3,700×g、10分間、4℃）により集菌した後、冷TF溶液（20 mM PIPES−KOH (pH 6.0)、200 mM KCl、10 mM CaCl₂、40 mM MnCl₂）を13 ml加え、0℃で10分間放置した。その後、再度遠心分離（3,700×g、10分間、4℃）し、上清を除いた。沈殿した大腸菌を冷TF溶液3.2 mlに懸濁し、0.22 mlのジメチルスルホキシドを加え0℃で10分間放置した。その後、液体窒素下で冷凍した後、-80℃で保存した。

（４）組換えプラスミドの調製
上記（３）で作製したコンピテントセル200μlを氷上で解凍し、上記（２）で作製したライゲーション産物10μlに加え、0℃で30分放置した。続いて、当該コンピテントセルに42℃で30秒間ヒートショックを与え、0℃で2分間冷却した。その後、SOC培地（20 mM グルコース、2%バクトトリプトン、0.5%バクトイーストエキス、10 mM NaCl、2.5 mM KCl、1 mM MgSO₄、1 mM MgCl₂）1 mlを添加し、37℃にて1時間振盪培養した。培養後の培養液を各200μlずつ、LB Amp寒天培地（アンピシリン 100 mg/L、1.5％寒天を含有するLB培地）にまき、37℃で一晩培養した。寒天培地上に生育した形質転換体コロニー複数個を1.5 mlのLB Amp培地（アンピシリン 100 mg/Lを含有するLB培地）にて37℃で一晩培養した。得られた培養液を各々集菌後、Flexi Prep（GEヘルスケア バイオサイエンス社）を用いて組換えプラスミドを回収した。得られたプラスミドの塩基配列をCEQ DTCS Quick Start Kitおよび蛍光シーケンサCEQ 2000XL DNA Analysis system（いずれもBECKMAN COULTER、米国）を用いて解析した。目的とするプラスミドをpLA301と命名した（図１）。

配列番号３
LTL-03（GAAAGCTTACATAACGCTCCTAATTAAACACGCTGTTGGG）
配列番号４
M13 primer RV (CAGGAAACAGCTATGAC)

大腸菌K-12／pLA301の菌体破砕液および菌体抽出液の調製
（１）培養および菌体懸濁液の調製
実施例１と同様にして、大腸菌K-12株（NBRC3308）のコンピテントセルを作製し、プラスミドpLA301による形質転換を行った。得られた形質転換体K-12／pLA301のコロニーを、以下に示す培地（500 ml容三角フラスコ中の100 ml）で37℃で12時間前振盪培養（回転数：210rpm）を行った。
前培養培地組成（pH7.2）：ポリペプトンN（20 g/L）、酵母エキス（5 g/L）、KH₂PO₄（1.5 g/L）、アンピシリン（0.1 g/L）。
得られた前培養液20 mlを以下に示す本培養培地（3Lジャーファーメンター中の2L）に植菌し、37℃または25℃で20〜52時間本培養を行った。

本培養培地組成
ポリペプトンN 20 g/L
酵母エキス 5 g/L
KH₂PO₄ 1.5 g/L
MgSO₄・7H₂O 0.5 g/L
MnSO₄・5H₂O 0.2 g/L
ZnSO₄・7H₂O 0.02 g/L
CaCl₂・2H₂O 0.02 g/L
プルロニック L-61 0.5 g/L
フルクトース 40 g/L
アンピシリン 0.1 g/L

回転数は750rpm、空気流量は2 L/min、内圧は常圧、pHは6.8−7.2制御（3N NaOHと5N H₂SO₄使用）で行った。培養の途中、適時サンプリングを行い、菌濃度（OD₆₃₀）の測定、および調製した菌体懸濁液を用いてアミダーゼ活性測定を行った。菌体懸濁液の調製は、サンプリングして得られた培養液から遠心分離（3,700×ｇ、10分間、4℃）により菌体を回収し、50 mM リン酸ナトリウム緩衝液（pH8）で洗浄した後、同緩衝液に懸濁することにより行った。

（２）菌体破砕液および菌体抽出液の調製
得られた菌体懸濁液の1 mlを、超音波破砕機VP−15S（タイテック、日本）を用いて、出力コントロール4、DUTY CYCLE 40%、PULS、TIMER＝Bモード10sの条件で氷冷しながら3分間破砕した。得られた菌体破砕液を細胞抽出液全画分として採取した。破砕液を遠心分離（10,000×g、5分間、4℃）し、得られた上清を菌体抽出液（細胞抽出液可溶性画分）として採取した。沈殿物を、上清と等量のリン酸緩衝液（pH8）に懸濁し、細胞抽出液不溶性画分とした。
また、大量に調製する際は、Ｎｉｒｏ Ｓｏａｖｉ社製ホモジナイザーPANDA2K型を用いて菌体を破砕した。破砕は100 MPa加圧条件で行い、この操作を３回繰り返した。

（３）菌体懸濁液および菌体破砕液の活性測定
活性測定は下記のようにして行った。40℃で10分間プレインキュベートした0.5 mlの菌体懸濁液または菌体破砕液（上記（１）および（２）で作製した菌体懸濁液および菌体破砕液を50 mMリン酸ナトリウム緩衝液（pH8）および反応用緩衝液（50 mM Tris-HCl緩衝液(pH8)）により適当な濃度に希釈したもの）に、予め40℃で加温していた0.5 mlの2%ラセミ体tert-ロイシンアミド（50 mM Tris-HCl緩衝液(pH8)）を加え、40℃にて20分間反応させた後、1 Mリン酸溶液を0.2 ml添加して反応を停止させた。遠心（15000rpm / 5minにより菌体を除去し上清を取得し、更に0.45μｍのフィルターにより菌体を完全に除去した。こうして得られた反応終了液5μlを高速液体クロマトグラフィー（分析カラム Inertsil ODS-3V（4.6ｘ250 mm GLサイエンス社製）40℃、キャリヤー 0.1％リン酸水溶液、ＵＶ検出波長＝220 nm）にて分析した。光学純度の測定は、上記反応終了液を高速液体クロマトグラフィー（分析カラム スミキラルOA-5000 住友化学社製、キャリアー 2 mM硫酸銅水溶液／メタノール（85:15） 40℃ UV検出波長=254 nm）にて分析することにより行った。菌濃度は分光光度計を用いて波長630nmの吸収強度を測定し、1OD＝0.4g Dry cell／lとして算出した。

菌体懸濁液（菌濃度158 g Dry cell／l）の活性は、306U／ml（1.94U/mgDry cell）であるのに対して、菌体破砕液の活性は180U／mlであり、破砕によって活性が約６０％にまで低下していた。

（菌体抽出液を用いた耐熱性試験）
実施例２（２）と同様の方法で得られた菌体抽出液1 mlを微量試験管に入れ、４０、５０、６０、７０、７５および８０℃の各温度に設定したウォーターバス上で１時間加熱処理を行った後、50 mMリン酸ナトリウム緩衝液（pH8）にて１０倍に希釈後、更に反応用緩衝液（Tris−HCl（pH8））にて４１倍に希釈後、実施例２（３）と同様にして４０℃にて活性測定を行った。
その結果、本発明の菌体抽出液は７５℃１時間の加熱処理後もアミダーゼ活性を有していたため、本発明のアミダーゼは少なくとも７５℃までは安定であることが見出された（図２、●）。

（菌体抽出液を用いた亜鉛塩添加及び加熱効果（その１））
本実施例は、10 mM硫酸亜鉛存在下で加熱処理を行う以外は、実施例３と同様の実験を行った。
結果を図２（■）に示す。亜鉛存在下で４０℃ １時間処理したものでも活性向上が認められたが、５０℃以上において更に活性向上が認められ、７５℃において最も顕著な活性向上効果が認められた。すなわち、硫酸亜鉛存在下においても、７５℃までの耐熱性が見られるとともに、５０℃以上の処理においては、４０℃での処理における活性向上効果以上の効果が認められた。
したがって、本発明の菌体抽出液は亜鉛塩存在下で７５℃までの耐熱性を示し、さらに、亜鉛塩存在下で加熱処理することによりアミダーゼ活性が向上することが示された。

（菌体抽出液を用いた亜鉛塩添加および加熱効果（その２））
実施例２（２）と同様の方法で得られた菌体抽出液1 mlを用いて、0〜37 mM硫酸亜鉛存在下で７０℃１時間の加熱処理を行った後、実施例３と同様にして、４１０倍に希釈後４０℃にて活性測定を行った。対照実験としては、0〜37 mM硫酸亜鉛存在下で室温にて１時間放置した菌体抽出液を用いておこなった。
７０℃１時間の加熱処理した場合、10 mM硫酸亜鉛までは濃度依存的なアミダーゼ活性向上効果が認められた。一方、室温で放置した場合も濃度依存的な活性向上効果が認められたが、その効果は７０℃で加熱処理した場合には及ばなかった（図３）。

（菌体抽出液を用いた亜鉛塩添加および加熱効果（その３））
実施例５と同様の実験を、更に高濃度の硫酸亜鉛を添加した条件で行った。その結果、40 mM硫酸亜鉛までは７０℃での加熱処理による活性向上効果は認められた。しかしながら、更に高濃度の亜鉛存在下では、その効果は認められなかった（図４、■）。
一方、室温で放置した場合、150 mMまでは濃度依存的なアミダーゼ活性向上が見られたが、その程度は低濃度（40 mMまで）硫酸亜鉛存在下における７０℃での加熱処理した場合と同程度の活性であった（図４、●）。

また、高濃度の硫酸亜鉛を菌体抽出液に添加した場合は、菌体抽出液から持ち込まれる硫酸亜鉛により、活性測定時の反応液中の硫酸亜鉛濃度も高くなる。そこで、菌体抽出液の希釈率から計算される反応液の硫酸亜鉛濃度（0〜0.183 mM）になるように硫酸亜鉛を反応液に直接添加し、アミダーゼ活性測定を行った。その結果、反応液中の硫酸亜鉛の影響はほとんど認められなかった（図５、▲）。

実施例５の結果とも合わせると、加熱処理をしなくても室温での高濃度の硫酸亜鉛の添加により酵素の活性化効果が得られるが、加熱処理により低濃度の硫酸亜鉛の添加でも充分な活性化効果が得られた。このことは、本発明の菌体抽出液を亜鉛塩存在下で加熱処理をすることにより、反応液中の、更には製品中への亜鉛塩の持ち込みが少なくて済むことを示している。

（菌体抽出液を用いた至適反応温度の測定）
実施例２（２）と同様の方法で得られた菌体抽出液を４０、５０、６０、７０、７５および８０℃の各温度で、反応温度以外は実施例２（３）と同様にして活性を測定した。また、10 mM硫酸亜鉛存在下での各反応温度における活性も測定した（図６）。但し、反応温度が高いほど反応が速く進むため反応液へ添加する菌体抽出液の希釈率を、硫酸亜鉛非存在下では、４１０倍（４０、５０℃）、２０５０倍（６０℃以上）、硫酸亜鉛存在下では、４１０倍（４０℃）、２０５０倍（５０、６０℃）、１０２５０倍（７０℃以上）の希釈率で希釈を行った。

図６に示すように、至適反応温度は硫酸亜鉛非存在下では７０℃であり、一方、10 mM硫酸亜鉛存在下では７５℃であった。活性測定温度が４０℃の場合には反応液中への10 mM硫酸亜鉛の添加効果は全く認められなかったが、反応温度がより高い場合、特に６０℃以上の場合には硫酸亜鉛の添加効果が認められた。

加熱処理後に得られた菌体抽出液の亜鉛塩存在下での再加熱処理効果
実施例２（２）と同様の方法で得られた菌体破砕液40 mlを遠心管に入れ、７０℃に設定したウォーターバス上にて亜鉛塩を添加せずに１時間処理し、4,400×ｇ、40分間の遠心分離により不溶物を除き、上清を「前加熱処理後に得られた菌体抽出液」とした。
上記加熱処理後に得られた菌体抽出液1 mlを用いて、硫酸亜鉛添加（10 mM）および加熱処理の効果を実施例５と同様にして調べた。その結果、前加熱処理しないで得られた菌体抽出液の場合と同様に（実施例３〜５）、前加熱処理後に得られた菌体抽出液の場合も亜鉛存在下での加熱処理により高い活性向上効果が認められた（図７）。

菌体破砕液の亜鉛塩存在下での加熱処理による高活性酵素液（菌体抽出液）の調製
実施例２（２）と同様の方法で得られた菌体破砕液1 mlを用い、硫酸亜鉛添加（10 mM）または非添加、および室温放置または７０℃加熱処理１時間後に遠心分離（23,000×g、10分間）により不溶性物質を除き、上清を得た。これらの活性の測定、およびSDSポリアクリルアミドゲル電気泳動による分析を行った。活性測定は実施例２（３）と同様にして行った。

SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動による分析は次のように行った。上清を、それぞれ培養液時点での菌濃度換算で5 mg／mlとなるよう、50 mM リン酸−ナトリウム緩衝液（pH8）で希釈した。希釈した上清を等量のポリアクリルアミドゲル電気泳動用サンプル溶液（0.1M Tris−HCl(pH6.8)、4%w/v SDS、12%v/vβメルカプトエタノール、20%v/vグリセロール、微量ブロモフェノールブルー）と混合し、5分間煮沸し変性処理を行った。10%ポリアクリルアミドゲルを作製し、変性処理済みサンプルを1レーンあたり5μlずつ用い、電気泳動分析を行った（図８）。

その結果、加熱処理したサンプルでは、アミダーゼ（33000〜35000 Da）以外のタンパク質の含有量が減ったことから、加熱処理により高純度のアミダーゼが得られることが示された（図８レーンBおよびD）。また、10 mM硫酸亜鉛の添加の有無によってはアミダーゼの量に変化はみられなかった（図８レーンBおよびD）。

活性測定結果を表１に示す。本発明の菌体破砕液を10 mM硫酸亜鉛などの亜鉛塩存在下で加熱処理することにより高活性な菌体抽出液（酵素液）が得られることがわかった。

菌体破砕液の亜鉛塩存在下での加熱処理による高活性酵素液（菌体抽出液）の調製
攪拌機、および温度計を付した200 ml三ツ口フラスコに、実施例２（２）と同様にして得られた100 mlの菌体破砕液および2 mlの0.5 M硫酸亜鉛を加え、約３０分かけて７０℃まで加熱した。７０℃到達後、１０、２０，３０、６０分、それ以降は１時間ごとに６時間までモニタリングを行った。具体的には、内容物約0.5 mlを抜き出し、不溶物を除去（12,500×g、5分遠心分離）した後、活性測定およびSDSポリアクリルアミドゲル電気泳動による分析を行った。その結果、本発明の菌体破砕液は７０℃到達時に既に最大の活性値を示し、その活性は６時間後まで９０％以上維持されていた（図９）。
また、これらのサンプルのタンパク質当たりの比活性を表２に示した。

菌体抽出液からの酵素の精製と酵素の分子量測定
実施例８と同様の処理により得られた「前加熱処理後に得られた菌体抽出液」および10 mM硫酸亜鉛存在下で加熱処理した以外は同様の処理により得られた「亜鉛塩存在下での前加熱処理後に得られた菌体抽出液」を更に遠心分離（23,000×g、10分間）にかけ、上清を得た。これらの上清4 mlに36 mlの50 mM Tris−HCl緩衝液（pH8）加え、DEAE Sepharose Fast Flow（5 ml、GEヘルスケア バイオサイエンス社）によるクロマトグラフィー（同緩衝液、流速1 ml／分）を行った。サンプルをロードした後、同緩衝液により２０分間洗浄し、0−1 Mの塩化ナトリウム勾配により５０分間かけて溶出させた。

硫酸亜鉛非存在下で加熱調製されたサンプル（前加熱処理後に得られた菌体抽出液）では溶出後１６−１９分に最大活性が現れ、硫酸亜鉛存在下で加熱調製されたサンプル（亜鉛塩存在下での前加熱処理後に得られた菌体抽出液）では溶出後２０−２３分に最大活性が現れた（表３）。

これらの活性画分を回収し、Superdex 200 10/300 GL（GEヘルスケア バイオサイエンス社、50 mM Tris-HCl (pH 7.5)-150 mM NaCl、溶出速度0.5 ml／分）によるゲル濾過クロマトグラフィーを行った（図１０）。その結果、硫酸亜鉛非存在下で加熱調製されたサンプルでは、主として二量体（分子量67 kDa）および四量体（分子量135 kDa）から構成されているのに対して、硫酸亜鉛存在下で加熱調製されたサンプルではこれらの比率は少なく、ボイドボリュームに溶出される巨大タンパク質（分子量1,000 kDa以上）の存在から四量体（分子量135 kDa）を越える分子量のタンパク質が主たる構成成分であることがわかった。
したがって、本発明の菌体破砕液を亜鉛塩存在下で加熱処理して得られた菌体抽出液をゲル濾過クロマトグラフィー分析すると、菌体抽出液の主成分はそのピーク面積の80%以上が130,000 Daを超える高分子量会合体の混合物であることが示された。

プラスミドpLA301の作製スキームを示す図である。 菌体抽出液を加熱処理したときのアミダーゼ活性に対する影響を示す図である（●：亜鉛非添加、■：10mM亜鉛添加）。 菌体抽出液を加熱処理したときの硫酸亜鉛の濃度の影響（その１）を示す図である（■：非加熱、◆：70℃１時間処理）。 菌体抽出液を加熱処理したときの硫酸亜鉛の濃度の影響（その２）を示す図である（■：非加熱、◆：70℃１時間処理）。 アミダーゼ活性に対する反応時における硫酸亜鉛濃度の影響を示す図である（◆：菌体抽出液に亜鉛塩を添加、▲：反応液に亜鉛塩を添加）。 菌体抽出液を用いて至適反応温度を検討した結果を示す図である（●：亜鉛非存在下、■：10mM亜鉛存在下）。 前加熱処理後に得られた菌体抽出液の亜鉛塩存在下での再加熱処理効果を示す図である。 SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動（加熱処理による高活性酵素液の調製）の結果を示す図である。図は左から、Ａ：無処理 Ｂ：加熱処理 Ｃ：10mM硫酸亜鉛処理 Ｄ：10mM硫酸亜鉛存在下で加熱処理したサンプルを示す。 菌体破砕液の加熱処理時間と、各時間での活性を示す図である。 実施例１１のゲル濾過クロマトグラフィーの結果を示す図である。A)は、亜鉛非存在下で加熱処理して得られたサンプルのクロマトグラムを示し、B)は、亜鉛存在下で加熱処理して得られたサンプルのクロマトグラムを示す。

配列番号１：Enterobacter cloacae由来のアミダーゼアミノ酸配列
配列番号２：Enterobacter cloacae由来のアミダーゼ遺伝子配列
配列番号３：合成DNA
配列番号４：合成DNA

Claims (7)

1. 常温菌由来のアミダーゼ遺伝子が導入された形質転換体を破砕および、５０℃以上７５℃以下で１０分以上、亜鉛塩の存在下で加熱後、不要物を除去して得られるアミダーゼであって、
   前記アミダーゼ遺伝子が以下の(a)または(b)のタンパク質をコードする遺伝子である、アミダーゼ。
   (a) 配列番号１で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質
   (b) 配列番号１で示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつアミダーゼ活性を有するタンパク質
2. 亜鉛塩の濃度が、0.1 mM〜40 mMである請求項１に記載のアミダーゼ。
3. 亜鉛塩が、硫酸亜鉛または塩化亜鉛である、請求項１または２に記載のアミダーゼ。
4. 請求項１〜３のいずれか１項に記載のアミダーゼをアミド化合物と接触させることを特徴とするカルボン酸の製造方法。
5. アミド化合物がαーアミノ酸アミドまたはαーヒドロキシ酸アミドである、請求項４に記載の方法。
6. カルボン酸が光学活性カルボン酸である、請求項４または５に記載の方法。
7. ６０℃以上７０℃以下で1時間以上６時間以下、亜鉛塩の存在下で加熱することを特徴とする、請求項４〜６のいずれか１項に記載の方法。

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