JP5137880B2

JP5137880B2 - 結合性物質を固定化した乾燥粒子の製造方法

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Publication number: JP5137880B2
Application number: JP2009052403A
Authority: JP
Inventors: 大氏原
Original assignee: Fujifilm Corp
Current assignee: Fujifilm Corp
Priority date: 2009-03-05
Filing date: 2009-03-05
Publication date: 2013-02-06
Anticipated expiration: 2029-03-05
Also published as: JP2010204037A

Description

本発明は、結合性物質を固定化した乾燥粒子の製造方法及び結合性物質を固定化した粒子の乾燥方法に関する。さらに、本発明は、上記方法によって実施可能な、結合性物質を固定化した乾燥粒子、被験物質の測定方法、及び結合性物質を固定化した乾燥粒子を含むキットに関する。

これまでに、臨床診断における疾病の特定には、血液（全血、血漿、血清など）や尿などの体液成分を採取して被験試料とし、その被験試料中の対象となる成分の濃度を測定して、その測定対象成分濃度を指標とする方法が採用されてきた。このような臨床検査の態様において、被験試料中の測定対象成分の親和性を利用する場合、例えば、測定対象成分が抗原又は抗体である場合には、抗体が抗原を厳密に識別して結合する性質を利用する定量方法として、免疫学的測定方法が用いられている。

免疫学的測定方法のうち、主として用いられている方法がＥＬＩＳＡ（Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay）である。ＥＬＩＳＡを臨床診断に応用する際は、ＥＬＩＳＡに用いられる酵素標識抗体を乾燥する場合があった。酵素標識抗体を乾燥する方法としては、一般的に、凍結乾燥法が用いられており、酵素標識抗体の凍結乾燥前後において、ＥＬＩＳＡの性能（感度）が大きく変化することはなかった。

一方、酵素の代わりに不溶性担体粒子、例えば、ラテックスに抗体又は抗原を固定化し、被験物質として抗原又は抗体と反応させ、この反応の進行（ラテックス凝集）に伴う反応混合物の透過率の減少から、被験物質の濃度を測定する方法が知られている。また、この方法における、被験物質に対して結合性のある結合性物質を固定化したラテックス粒子は、凍結乾燥法により、該結合性を維持したまま保存できる（特許文献１を参照）。

特開平１１−２５８２４１号公報

一般的に、ラテックス粒子と異なり、結合性物質を固定化した蛍光粒子を乾燥させると、結合性物質が有する結合性が減少する場合がある。したがって、結合性物質を固定化した蛍光粒子を乾燥させる方法として、結合性物質が有する結合性の低下を抑制し得る、つまり保存安定性の高い方法を採用することが好ましい。しかし、これまでにこのような方法は知られていない。

そこで、本発明の目的は、結合性物質が有する結合性の低下を抑制し得る、結合性物質を固定化した乾燥粒子の製造方法及び結合性物質を固定化した粒子の乾燥方法を提供することにある。さらに、本発明の目的は、上記方法によって実施可能な、結合性物質を固定化した乾燥粒子、被験物質の測定方法、及び結合性物質を固定化した乾燥粒子を含むキットを提供することにある。

本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討した結果、驚くべきことに、結合性物質を固定化した粒子と該結合性物質の等電点付近のｐＨに調整した溶液とを混合した後に、該粒子を乾燥することにより、結合性物質が有する結合性を安定して保持できることを見出し、本発明を完成させた。

したがって、本発明によれば、結合性物質を固定化した粒子と該結合性物質の等電点付近のｐＨに調整した溶液とを混合した後に、該粒子を乾燥することを含む、結合性物質を固定化した乾燥粒子の製造方法が提供される。

本発明の別の側面によれば、結合性物質を固定化した粒子と該結合性物質の等電点付近のｐＨに調整した溶液とを混合した後に、該粒子を乾燥することを含む、結合性物質を固定化した粒子の乾燥方法が提供される。

好ましくは、粒子が、着色粒子である。
好ましくは、着色粒子が、蛍光粒子である。
好ましくは、粒子が、高分子粒子、磁気粒子、リポソーム、又はガラス粒子である。
好ましくは、結合性物質が、抗原、抗体又はこれらの複合体である。
好ましくは、結合性物質が、被験物質又は被験物質に対して結合性がある物質に対して結合性がある。

本発明の別の側面によれば、本発明の方法により得られる、結合性物質を固定化した乾燥粒子が提供される。

本発明の別の側面によれば、本発明の結合性物質を固定化した乾燥粒子を用いて被験物質を測定することを含む、被験物質の測定方法が提供される。
好ましくは、水溶液に分散した本発明の結合性物質を固定化した乾燥粒子及び該結合性物質に対して結合性がある被験物質を、該被験物質に対して結合性がある物質を固定化した固相上で接触させること、及び、固相上に形成された該結合性物質、該被験物質及び該被験物質に対して結合性がある物質からなる複合体を検出することを含む。

本発明の別の側面によれば、本発明の結合性物質を固定化した乾燥粒子を含む、本発明のの被験物質の測定方法を実施するためのキットが提供される。

本発明の方法によれば、結合性物質が有する結合性の低下を抑制し得る、保存安定性の高い結合性物質を固定化した乾燥粒子を得ることができる。本発明の方法によって得られる結合性物質を固定化した乾燥粒子を用いれば、乾燥前の結合性物質を固定化した粒子を用いる場合と比べて、８０％以上の感度で免疫学的測定方法を実施することができる。また、本発明の方法は、専用の機器が必要であり、さらに凍結−乾燥と少なくとも二段階の工程が必要である凍結乾燥法を用いることなく、真空乾燥法などの簡便な乾燥法を用いて、結合性物質を固定化した乾燥粒子を製造することができる。また、本発明の方法は、結合性物質の種類に関係なく、保存安定性の高い結合性物質を固定化した乾燥粒子を得ることができるものと推測される。

例１のビオチン化抗体を用いたＥＬＩＳＡの結果を示す。例２の蛍光粒子標識抗体を用いたＥＬＩＳＡの結果を示す。

以下、本発明について詳細に説明する。
本発明の結合性物質を固定化した乾燥粒子の製造方法は、結合性物質を固定化した粒子と該結合性物質の等電点付近のｐＨに調整した溶液とを混合した後に、該粒子を乾燥することを含む。また、本発明の結合性物質を固定化した粒子の乾燥方法は、結合性物質を固定化した粒子と該結合性物質の等電点付近のｐＨに調整した溶液とを混合した後に、該粒子を乾燥することを含む。以下、これらを「本発明の方法」として説明する。

１．粒子
本発明の方法に供される粒子（以下、単に「粒子」ともいう）は、粒状の不溶性担体であれば特に制限はないが、標識されていることが好ましい。粒子の標識は、粒子自体の有する標識や、標識物質を粒子に結合させるなどの処理を施して得られる標識であっても、いずれでもよい。例えば、標識の種類は特に制限されないが、例えば、標識が着色標識である場合は、その着色の波長を基に、目視や顕微鏡、デジタルマイクロスコープ、プレートリーダーなどの機器により、粒子を簡便に検出することができる。したがって、本発明の方法に供される粒子は、着色粒子であることが好ましく、発色強度を考慮すれば、蛍光粒子であることがより好ましい。また、粒子の材質としては、特に制限されないが、例えば、容易に入手可能なものとして、高分子粒子、磁気粒子、ガラス粒子、リポソームなどが好ましい。以下に、粒子が蛍光粒子である場合について説明する。

蛍光粒子は、免疫凝集反応に通常用いられ得る蛍光で着色された粒子を使用することができ、例えば、蛍光ポリスチレンビーズなどの蛍光高分子粒子、蛍光ガラスビーズ等の蛍光ガラス粒子を用いることができる。蛍光粒子の材質の具体例としては、スチレン、メタクリル酸、グリシジル（メタ）アクリレート、ブタジエン、塩化ビニル、酢酸ビニルアクリレート、メチルメタクリレート、エチルメタクリレート、フェニルメタクリレート、ブチルメタクリレートなどのモノマーを用いた高分子または、２つ以上のモノマーを用いた共重合体などの合成高分子粉末があり、これらを均一に懸濁させたラテックスが好ましい。また、その他の有機高分子粉末や無機物質粉末、微生物、血球や細胞膜片、リポソームなどが挙げられる。

粒子の平均粒径は、粒子の材質や被験物質を定量する濃度範囲、測定機器などによって異なるが、０．００１〜１０μｍ（より好ましくは０．００１〜１μｍ）の範囲が好ましい。蛍光色素を含有したリポゾ−ムやマイクロカプセル等も蛍光粒子として使用することができる。蛍光発色は、紫外光等を吸収して励起し、基底状態に戻る際に放出されるものであれば特に制限されるものではなく、例えば、黄緑（励起波長５０５ｎｍ／放出波長５１５ｎｍ、以下同じ）、青（３５０〜３５６ｎｍ／４１５〜４４０ｎｍ）、赤（５３５〜５８０ｎｍ／５７５〜６０５ｎｍ）、オレンジ（５４０ｎｍ／５６０ｎｍ）、レッド・オレンジ（５６５ｎｍ／５８０ｎｍ）、クリムゾン（６２５ｎｍ／６４５ｎｍ）、ダークレッド（６６０ｎｍ／６８０ｎｍ）などの蛍光発色が用いられ得る。これらの蛍光を発する蛍光粒子は、例えば、Invitrogen社から入手可能であり、同社においてFluoSpheres（登録商標）の商品名で市販されている。

２．結合性物質
本発明の方法に供される粒子は、結合性物質を固定化したものである。具体的には、粒子において、（ａ）被験物質に対する結合性物質、又は（ｂ）被験物質に対して結合性がある物質に対する結合性物質が固定化されている。上記（ａ）被験物質に対する結合性物質とは、例えば、被験物質（抗原）に対する抗体、被験物質（抗体）に対する抗原、被験物質（タンパク質、低分子化合物、アビジン、ビオチン等）に対するアプタマーなど、被験物質に対して親和性を持つ化合物であればよく、特に限定されない。上記（ｂ）被験物質に対して結合性がある物質に対する結合性物質とは、被験物質そのものでも良いし、上記（ａ）被験物質に対する結合性物質を認識する部位を持つ化合物でもよく、例えば、被験物質の誘導体とタンパク質（例えばＢＳＡなど）とを結合させたような化合物などが該当する。ただし、（ａ）被験物質に対する結合性物質及び（ｂ）被験物質に対して結合性がある物質に対する結合性物質は、両性電解質、つまり、アニオン性の官能基及びカチオン性の官能基を有する物質である。

本発明の方法に供される結合性物質の好ましい例は、抗原、抗体、又はこれらの複合体であるが、これらに限定されるものではない。例えば、結合性物質が抗体である場合は、被験物質に対して特異性を有する抗体として、例えば、その被験物質によって免疫された動物の血清から調製する抗血清、抗血清から精製された免疫グロブリン画分、その被験物質によって免疫された動物の脾臓細胞を用いる細胞融合によって得られるモノクローナル抗体、あるいは、それらの断片［例えば、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、又はＦｖ］などを用いることができる。これらの抗体の調製は、常法により行なうことができる。さらに、その抗体がキメラ抗体などの場合のように、修飾を加えられたものでもよいし、また市販の抗体でも、動物血清や培養上清から公知の方法により調製した抗体でも使用可能である。

抗体は、その動物種やサブクラス等によらず使用できる。例えば、本発明に用いることが可能な抗体は、マウス、ラット、ハムスター、ヤギ、ウサギ、ヒツジ、ウシ、ニワトリなど免疫反応が起こり得る生物に由来する抗体、具体的には、マウスIgG、マウスIgM、ラットIgG、ラットIgM、ハムスターIgG、IgMウサギIgG、ウサギIgM、ヤギIgG、ヤギIgM、ヒツジIgG、ヒツジIgM、ウシIgG、ウシIgM、トリIgY等であり、ポリクローナルもしくはモノクローナルの両方に適用可能である。断片化抗体は、少なくとも1つの抗原結合部位を持つ、完全型抗体から導かれた分子であり、具体的にはFab、F(ab')2等である。これらの断片化抗体は、酵素あるいは化学的処理によって、もしくは遺伝子工学的手法を用いて得られる分子である。本発明の方法に供される抗体の具体例としては、ヒト甲状腺刺激ホルモン(ｈＴＳＨ)を抗原として認識する抗ｈＴＳＨモノクローナル抗体やヒト絨毛性ゴナドトロピン（ｈＣＧ）を抗原として認識する抗ｈＣＧモノクローナル抗体を挙げることができるが、これらに限定されるものではない。

３．結合性物質を粒子に固定化する方法
抗原や抗体などの結合性物質を粒子に固定化する方法は、例えば、特開２０００−２０６１１５号公報やモレキュラープローブ社FluoSpheres（登録商標）ポリスチレンマイクロスフィアF8813に添付のプロトコールなどに記載されており、免疫凝集反応用試薬を調製する公知の方法がいずれも使用可能である。また、結合性物質として抗体を粒子に固定化する原理として、物理吸着及び共有結合による化学結合のいずれの原理も採用可能である。抗体を粒子に固定させた後に抗体が被覆されていない粒子表面を覆うブロッキング剤として、公知の物質、例えば、ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）やスキムミルク、カゼイン、大豆由来成分、魚由来成分、ポリエチレングリコールなどや、これらの物質やこれらと性質が同じである物質を含む市販の免疫反応用ブロッキング剤などが使用可能である。これらのブロッキング剤は、必要に応じて熱や酸・アルカリ等により部分変性などの前処理を施すことも可能である。

抗体を粒子に固定化する具体的な方法を、以下に例示する。粒子の固形分濃度が０．１〜１０％になるよう分散させた液に、０．０１〜２０ｍｇ／ｍＬの濃度に調整した抗体溶液を添加して、混合する。温度４〜５０℃の条件下で５分間から〜４８時間撹拌を継続する。次いで遠心分離その他の方法により粒子と溶液を分離して、溶液に含まれている、粒子に結合しなかった抗体を十分に除去する。その後、粒子を緩衝液にて洗浄する操作を０〜１０回繰り返す。粒子と抗体とを混合して、粒子に抗体を結合させる操作を実施した後に、抗原抗体反応に関与しない成分、好ましくはタンパク質、より好ましくはＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）、ブロックエース、スキムミルク及びカゼインなどのブロッキング剤を使用して粒子表面の抗体が結合していない部分を保護することが望ましい。

抗原や抗体等を粒子に固定化する際に、安定化剤を必要に応じて添加可能である。安定化剤とは、ショ糖や多糖類などの合成あるいは天然高分子など、抗原や抗体を安定化するものであれば特に制限されず、Immunoassay Stabilizer（ABI社）などの市販のものも使用可能である。

４．結合性物質の等電点付近のｐＨに調整した溶液
本発明の方法に供される結合性物質の等電点付近のｐＨに調整した溶液は、結合性物質の等電点付近のｐＨを有する溶液であれば特に制限されないが、好ましくは、結合性物質の等電点付近のｐＨに調整した緩衝液（Ｂｕｆｆｅｒ）である。緩衝液としては酢酸緩衝液、リン酸緩衝液、クエン酸緩衝液、コハク酸緩衝液、トリス塩酸緩衝液、ＥＤＴＡ緩衝液などのこれまでに知られているものを制限なく使用することができる。

等電点は、通常知られている意味のものとして広く解釈されるべきものであるが、例えば、結合性物質を電離させた後に、物質全体の電荷平均（又は電気泳動移動度）が０となるｐＨ値ということができる。結合性物質の等電点は、例えば、等電点電気泳動によって求めることができる。等電点電気泳動において、結合性物質をｐＨ勾配のある電気泳動ゲルに添加し、低イオン強度下で電場をかけると、結合性物質は、自身の等電点（ｐＩ）と同じｐＨに向かって移動し、やがて静止及び濃縮する。等電点電気泳動後の結合性物質が存在するｐＨを確認することにより、結合性物質の等電点を知ることができる。

結合性物質の等電点付近のｐＨに調整した溶液は、結合性物質の等電点を知ることができれば、通常知られている方法によってｐＨを調整することにより得られる。例えば、結合性物質としてMedix biochemica社の抗hTSH 5409 SPTNE-5を用いる場合は、抗hTSH 5409 SPTNE-5の等電点が5.8〜6.3であることから、pHを5.8〜6.3付近に調整したMES緩衝液、具体的にはpHを6.0に調整したMES緩衝液を、結合性物質の等電点付近のｐＨに調整した溶液として用いることができる。同様に、結合性物質としてMedix biochemica社の抗hCG 5008 SP-5を用いる場合は、抗hCG 5008 SP-5の等電点が6.8〜8.1であることから、pHを6.8〜8.1付近に調整したTris-HCl緩衝液、具体的にはpHを8.2に調整したTris-HCl緩衝液を、結合性物質の等電点付近のｐＨに調整した溶液として用いることができる。結合性物質の等電点付近のｐＨに調整した溶液は、ｐＨを調整するための溶質以外にも、例えば、ショ糖などの安定化剤を溶解したものであってもよい。

等電点付近のｐＨは、結合性物質が有する結合性に影響を与えない程度に、結合性物質の等電点よりも若干高い又は低いｐＨも含まれるが、好ましくは等電点±０．７、より好ましくは等電点±０．５、さらに好ましくは等電点±０．３、なおさらに好ましくは等電点±０．２、特に好ましくは等電点±０．１程度のｐＨである。

５．結合性物質を固定化した粒子及び該結合性物質の等電点付近のｐＨに調整した溶液の混合及び乾燥
結合性物質を固定化した粒子及び該結合性物質の等電点付近のｐＨに調整した溶液の混合は、特に制限はなく、例えば、結合性物質を固定化した粒子及び結合性物質の等電点付近のｐＨに調整した溶液を接触させた後に、数秒間〜数時間静置してもよいし、撹拌子やヴォルテックスなどの撹拌機器や手動によって撹拌してもよいし、これらを組み合わせてもよい。

結合性物質を固定化した粒子と結合性物質の等電点付近のｐＨに調整した溶液とを混合した後の、結合性物質を固定化した粒子を乾燥する方法も特に制限はない。例えば、ピペットやアスピレーターなどの液体を除去するための器具などを用いて該粒子と該溶液を分離した後に又は該溶液に該粒子を浸した状態で、該粒子又は該粒子を含む溶液を大気下で若しくは真空乾燥器や恒温器などの乾燥機を用いて、適当な温度及び時間で乾燥する方法を適用することができる。具体的には、結合性物質を固定化した粒子を含む、該結合性物質の等電点付近のｐＨに調整した溶液の一部を培養プレートにとり、次いで真空乾燥器や恒温器を用いて、数℃〜数十℃で、数分〜数時間乾燥することができる。

６．結合性物質を固定化した乾燥粒子
結合性物質を固定化した粒子と該結合性物質の等電点付近のｐＨに調整した溶液とを混合し、次いで該粒子を乾燥することにより、結合性物質を固定化した乾燥粒子が得られる。このようにして得られた結合性物質を固定化した乾燥粒子もまた、本発明の範囲内である。

結合性物質を固定化した乾燥粒子は、結合性物質を固定化した粒子を乾燥させたものであり、かつ結合性物質の結合性が維持されたものである限り特に制限はないが、例えば、実質的に水分を含まない粒子であることが、保存安定性の点から好ましい。結合性物質を固定化した乾燥粒子における、結合性物質の結合性の程度は、未乾燥の結合性物質を固定化した粒子における結合性物質の結合性に対して、８０％以上、好ましくは８５％以上である。

７．結合性物質を固定化した乾燥粒子を用いた被験物質の測定方法
本発明の方法によって得られた結合性物質を固定化した乾燥粒子を用いて、被験物質を測定することができる。このような被験物質の測定方法もまた、本発明の範囲内である。

本発明の被験物質の測定方法は、被験物質の存在の有無の検出や被験物質の量の測定（すなわち、定量）などを含む、最も広い概念として解釈されるものであり、通常知られている特異的親和性に基づく測定方法、例えば免疫学的測定方法を制限なく包含するものである。以下に、本発明の被験物質の測定方法の具体的な実施態様として、サンドイッチ法及び競合法について説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。

（サンドイッチ法）
サンドイッチ法では、特に限定されるものではないが、例えば、以下の手順により被験物質を測定することができる。まず、被験物質（例えば、抗原）に対して結合性がある結合性物質（例えば、抗体）を粒子、例えば、蛍光粒子に固定化する。並行して、結合性物質と異なる部位において被験物質に対して結合性がある物質（例えば、抗体）を固相（例えば、プレート）上に固定する。以下、固相に固定化した上記物質を固相固定化物質とよぶ。次いで被験物質を含む可能性のある被験試料（又はその抽出液）と結合性物質が固定化された蛍光粒子とを、固相上で接触させる。被験試料中に被験物質が存在する場合には、被験物質と結合性物質との間、及び被験物質と固相固定化物質との間で抗原抗体反応が起きる。この抗原抗体反応は、通常の抗原抗体反応と同様に行なうことができる。結果として、被験試料中に被験物質が存在する場合には、結合性物質、被験物質及び固相固定化物質からなる免疫複合体が形成される。免疫複合体の形成反応が終了した後、免疫複合体を形成しなかった蛍光粒子を除去し、洗浄する。次いで免疫複合体の形成の度合いを蛍光強度として検出することにより、被験物質の濃度などを測定することができる。なお、蛍光強度及び被験物質の濃度は、正の相関関係がある。

（競合法）
競合法では、特に限定されるものではないが、例えば、以下の手順により被験物質を測定することができる。競合法は、サンドイッチ法でアッセイすることができない低分子化合物の抗原を検出する手法として知られている。

まず、被験物質（抗原）に対して結合性がある結合性物質（例えば、抗体）を、粒子、例えば、蛍光粒子に固定化する。並行して、結合性物質に対して結合性がある、被験物質そのもの、又は被験物質と同様の結合性物質に対するエピトープを持つ物質を固相（例えば、基板）上に固定化する。以下、固相に固定化した上記物質を固相固定化物質とよぶ。次いで被験物質を含む可能性のある被験試料（又はその抽出液）と結合性物質を固定化した蛍光粒子とを固相に接触させると、その被験試料中に被験物質が存在しない場合には、結合性物質と固相固定化物質とにより、固相上で抗原抗体反応が起き、免疫複合体が形成される。一方、被験物質が存在する場合には、結合性物質に被験物質が結合するため、その後の結合性物質と固相固定化物質との、固相上の抗原抗体反応が阻害され、抗原抗体反応による結合が起こらない。結合性物質と被験物質又は固相固定化物質との反応が終了した後、免疫複合体を形成しなかった蛍光粒子を除去する。次いで免疫複合体の形成の度合いを蛍光強度として検出することにより、被験物質の濃度などを測定することができる。

本発明の被験物質の測定方法の具体例は、上記サンドイッチ法に基づく方法であり、水溶液に分散した結合性物質を固定化した乾燥粒子及び該結合性物質に対して結合性がある被験物質を、該被験物質に対して結合性がある物質を固定化した固相上で接触させること、及び、固相上に形成された該結合性物質、該被験物質及び該被験物質に対して結合性がある物質からなる複合体を検出することを含む。

被験試料としては、測定の対象となる物質である被験物質を含む可能性のある試料である限り、特に限定されるものではなく、例えば、生物学的試料、特には動物（特にヒト）の体液（例えば、血液、血清、血漿、髄液、涙液、汗、尿、膿、鼻水、又は喀痰）若しくは排泄物（例えば、糞便）、臓器、組織、粘膜や皮膚、それらを含むと考えられる搾過検体（スワブ）、うがい液、又は動植物それ自体若しくはそれらの乾燥体を挙げることができる。

本発明の被験物質の測定方法では、被験試料をそのままで、あるいは、被験試料を適当な抽出用溶媒を用いて抽出して得られる抽出液の形で、さらには、該抽出液を適当な希釈剤で希釈して得られる希釈液の形、若しくは該抽出液を適当な方法で濃縮した形で、用いることができる。抽出用溶媒としては、通常の免疫学的測定方法で用いられる溶媒（例えば、水、生理食塩液、又は緩衝液など）、あるいは、該溶媒で希釈することにより直接的に抗原抗体反応を実施することができる水混和性有機溶媒を用いることもできる。

本発明の被験物質の測定方法に供される被験試料は、好ましくは血液であり、より好ましくは血漿又は血清である。本発明の被験物質の測定方法に供される被験試料の具体例としては、血液成分を水で希釈した５０％血液成分含有水溶液を挙げることができるが、これに限定されるものではない。

本発明の被験物質の測定方法に供される固相は、特に制限されないが、粒子と同様の標識がないことが好ましい。例えば、スチレン、メタクリル酸、グリシジル（メタ）アクリレート、ブタジエン、塩化ビニル、酢酸ビニルアクリレート、メチルメタクリレート、エチルメタクリレート、フェニルメタクリレート、ブチルメタクリレートなどのモノマーを用いた高分子または、２つ以上のモノマーを用いた共重合体や、ガラスなどの材質の基板を挙げることができる。

本発明の被験物質の測定方法は、上記した以外にも種々の態様をとることができ、例えば、粒子に結合性物質として被験物質又は被験物質のエピトープを有する物質を固定化し、固相に被験物質に対して結合性がある物質を固定化する系とすることもできる。

本発明の被験物質の測定方法に使用することができる緩衝液は、通常の抗原抗体反応が行われるｐＨ条件下で緩衝能を有しているものであればよく、そのようなｐＨ条件として５〜１１、より好ましくは、６〜１０が用いられる。このｐＨ条件下で緩衝能を有す緩衝液の例として、例えば、リン酸緩衝液、トリス緩衝液、ＭＥＳ緩衝液、ＨＥＰＥＳ緩衝液、グリシン緩衝液、クエン酸緩衝液など、通常の生化学実験において使用され得る緩衝液であれば、いずれも使用可能である。

被験物質の測定としては、従来用いられている、蛍光測定法（ＦＩＡ）、酵素発色法（ＥＩＡ）、放射能測定法（ＲＩＡ）、発光法（ＣＬＥＩＡ）、電気化学発光法（ＥＣＬＩＡ）、磁気免疫測定法（ＭＩＡ）等の様々な手法に応用できる。また、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）測定技術、水晶発振子マイクロバランス（ＱＣＭ）測定技術、金のコロイド粒子から超微粒子までの機能化表面を使用した測定技術などの非電気化学的方法を好ましく用いることができる。

例えば、本発明の被験物質の測定方法が蛍光強度を検出して被験物質を測定する系を採用する場合、蛍光強度の検出は、特に制限されないが、例えば、蛍光強度を検出することができる機器、具体的には、マイクロプレートリーダー、ＳＰＦバイオセンサーなどを用いて蛍光強度を検出することができる。蛍光強度の検出は、通常、抗原抗体反応後一定時間、例えば、数分〜数時間後に終了する。前記免疫複合体の形成の度合いを蛍光強度として検出することにより、蛍光強度と被験物質の濃度の関係から、被験物質の濃度を定量することができる。

表面プラズモン蛍光（Surface Plasmon Fluoresence; SPF）バイオセンサーとは、例えば、特開２００８−２４９３６１号公報に記載されているような、所定波長の励起光を透過させる材料から形成された光導波路と、この光導波路の一表面に形成された金属膜と、光ビームを発生させる光源と、前記光ビームを光導波路に通し、該光導波路と金属膜との界面に対して表面プラズモンを発生させる入射角で入射させる光学系と、該表面プラズモンによって増強されたエバネッセント波によって励起されたことによって発生する蛍光を検出する蛍光検出手段とを備えたセンサーをいう。

８．キット
本発明の別の側面によれば、被験物質を測定するためのキットが提供される。本発明のキットは、結合性物質が固定化された乾燥粒子を含めば特に制限されない。

以下の実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、これによって本発明の範囲が限定されるものではない。

［例１］
１．試薬
Medix biochemica社 Anti-h TSH 5407 SPTN-1
Medix biochemica社 Anti-h TSH 5409 SPTNE-5（等電点：5.8〜6.3）
Medix biochemica社 Anti-h alpha subunit 6601 SPR-5
Medix biochemica社 Anti-h hCG 5008 SP-5（等電点：6.8〜8.1）
PIERCE社 Blocke BSA in PBS
PIERCE社 SuperSignal ELISA FemtoMaximum Sensitivity Substrate
PIERCE社 Streptavidin, Horseradish Peroxidase Conjugated
PIERCE社 Ez-link NHS-PEO4-Biotin
サーモサイエンティフィック社 nunc FLUORONUNC PLATE
スクリップスラボラトリーズ cTSH

２．機器
YAMATO社 Vacuum Drying Oven DP43
perkin elmar社 ARVO

３．抗体プレートの作製
Medix biochemica社 Anti-h TSH 5407 SPTN-1とMedix biochemica社Anti-h alpha subunit 6601 SPR-5抗体を炭酸バッファー(pH9.6)で10μg/mLとなるように希釈し、抗体溶液を作製した。これをサーモサイエンティフィック社nunc FLUORONUNC PLATEに100μL/wellで分注し、室温で一晩静置した。プレート中の抗体溶液を除去し、PBSTで2回洗浄した。PIERCE社Blocker BSA in PBSをPBSで10倍希釈した後、300μL/wellで分注し、室温で4時間静置した。10倍希釈したPIERCE社Blocker BSA in PBSを除去後、4℃に保管した。これにより、hTSH抗体5407固相化プレート、hCG抗体6601プレートを作製した。

４．抗原の調製
TSHについてはメルク社で販売されているCALBIOCHEM Cat 869006 Thyroid Stimulating Hormone,HumanPituitary,lodination Gradeを用いて、2.5×10^-10pMとなるように1%BSA-PBS溶液で調整した。

hCGについては、Acris社より販売されているCat.NO.PA1180XC Human Chorionic Gonadortopin(hCG)を用いて、2.5×10^-10pMとなるように1%BSA-PBS溶液で調整した。また、0pM濃度として、1%BSA-PBS溶液を使用した。

５．ビオチン化抗体の作製
Medix biochemica社 Anti-h TSH 5409 SPTNE-5とMedix biochemica社Anti-h hCG 5008 SP-5にPIERCE社 Ez-link NHS-PEO4-Biotinを用いてPIERCE社Ez-link NHS-PEO4-Biotinの添付されたプロトコール通りに実施し、ビオチン化hTSH抗体5409、ビオチン化hCG抗体5008を作製した。

６．ビオチン化抗体の乾燥および、ビオチン化抗体溶液の調製
上記１で作製したビオチン化hTSH抗体5409、ビオチン化hTSH抗体5008をそれぞれ、MES buffer(pH6.0)、Tris-HCl(pH8.2)に対しショ糖を5%となるように添加した溶液に溶解し、プレートにそれぞれ添加して、Vacuum Drying Oven DP43を用いて室温で1時間乾燥した。これを1%BSA-PBS溶液で溶解し、ビオチン化抗体溶液とした。

７．アッセイ
上記４で調整した2.5×10^-10pMの抗原と0pMの抗原をそれぞれhTSH抗体5407固相化プレート、hCG抗体6601プレートのウェルに50μLづつ分注し、続けビオチン化hTSH抗体5409溶液又はビオチン化hCG抗体5008溶液を50μLづつで分注した。700rpmで4時間振とう後、PBSTを用いて4回洗浄を実施した。PIERCE社Streptavidin, Horseradish Peroxidase Conjugatedを0.1μg/mLになるように純水で希釈し、ウェルに100μLで分注を実施した。700rpmで30分振とう後、PBSTを用いて6回洗浄を実施した。PIERCE社SuperSignal ELISA Femto Maximum Sensitivity Substrateのプロトコールに従って、プレート内で発光させ、perkin elmar社 ARVOを用いて測定を実施し、発光量を測定した。

［例２］
１．蛍光粒子標識抗体の作製
モレキュラープローブ社FluoSpheres（登録商標）ポリスチレンマイクロスフィアF8813を用いて、添付のプロトコールに沿ってMedix biochemica社Anti-h TSH 5409 SPTNE-5とMedix biochemica社Anti-h hCG 5008 SP-5を標識し、蛍光粒子標識hTSH5409溶液、蛍光粒子標識hCG5008溶液とした。

２．蛍光粒子標識抗体の乾燥
蛍光粒子標識hTSH抗体5409および、蛍光粒子標識hCG抗体5008それぞれ、MES buffer(pH6.0)、Tris-HCl(pH8.2)に対しショ糖を5%となるように添加した溶液に溶解し、プレートにそれぞれ添加して、Vacuum Drying Oven DP43を用いて室温で1時間乾燥して、乾燥した蛍光粒子標識抗体を得た。

３．蛍光粒子標識抗体の調製及びアッセイ
乾燥した蛍光粒子標識抗体を、1%BSA-PBS溶液で溶解し、蛍光粒子標識抗体溶液とした。希釈系列の抗原を50μLずつ、上記［例１］で作製した抗体プレートに分注し、蛍光粒子標識hTSH5409溶液と蛍光粒子標識hCG抗体5008溶液を50μLで分注した。700rpmで4時間振とう後、PBSTを用いて4回洗浄を実施した。Perkinelmer社ARVOを用いて測定を実施し、蛍光量を測定した。その結果、それぞれの抗体の等電点とほぼ同じpHである溶液を用いて乾燥した場合が、最も乾燥による影響を受け難いことが明らかとなった。

［結果］
例１の結果を図１に、例２の結果を図２にそれぞれ示した。標識がビオチンである場合（例１；図１）は、溶液のｐＨに関わらず抗体の抗原に対する結合性が８０％以上維持されている。しかし、標識が蛍光粒子である場合（例２；図２）は、抗体を固定化した蛍光粒子と抗体の等電点付近のｐＨに調整した溶液とを混合した後に乾燥した場合では、抗体の抗原に対する結合性は８０％以上であったが、抗体を固定化した蛍光粒子と抗体の等電点より大きい又は小さいｐＨに調整した溶液とを混合した後に乾燥した場合では、抗体の抗原に対する結合性は５０〜７５％程度であった。

Claims

結合性物質を固定化した蛍光粒子と該結合性物質の等電点±０．５の範囲のｐＨに調整した溶液とを混合した後に、該蛍光粒子を乾燥することを含む、結合性物質を固定化した乾燥蛍光粒子の製造方法。
結合性物質を固定化した蛍光粒子と該結合性物質の等電点±０．５の範囲のｐＨに調整した溶液とを混合した後に、該蛍光粒子を乾燥することを含む、結合性物質を固定化した蛍光粒子の乾燥方法。
蛍光粒子が、高分子粒子、磁気粒子、リポソーム、又はガラス粒子である、請求項１又は２に記載の方法。
結合性物質が、抗原、抗体又はこれらの複合体である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
結合性物質が、被験物質又は被験物質に対して結合性がある物質に対して結合性がある、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法により得られる、結合性物質を固定化した乾燥蛍光粒子。
請求項６に記載の結合性物質を固定化した乾燥蛍光粒子を用いて被験物質を測定することを含む、被験物質の測定方法。
水溶液に分散した請求項６に記載の結合性物質を固定化した乾燥蛍光粒子及び該結合性物質に対して結合性がある被験物質を、該被験物質に対して結合性がある物質を固定化した固相上で接触させること、及び、固相上に形成された該結合性物質、該被験物質及び該被験物質に対して結合性がある物質からなる複合体を検出することを含む、請求項７に記載の被験物質の測定方法。
請求項６に記載の結合性物質を固定化した乾燥蛍光粒子を含む、請求項７又は８に記載の被験物質の測定方法を実施するためのキット。