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JP5091484B2 - トリコデルマにおける顆粒デンプン加水分解酵素の発現及び顆粒デンプン基質からグルコースシロップを製造する方法 - Google Patents

トリコデルマにおける顆粒デンプン加水分解酵素の発現及び顆粒デンプン基質からグルコースシロップを製造する方法 Download PDF

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Description

本出願は、2003年12月21日に提出された、米国仮出願Ser. No.60/524,276、発明の名称「トリコデルマにおける顆粒デンプン加水分解酵素の発現」、2003年12月22日に提出された、米国仮出願Ser.No.60/531,953発明の名称「顆粒デンプン基質からグルコース原料を得るための酵素組成物」及び2004年4月28日に提出された、米国仮出願Ser.No.60/566,358発明の名称「トリコデルマにおける顆粒デンプン加水分解酵素の発現」に対して優先権を主張する。
本発明は、グルコアミラーゼ活性を有する異種顆粒デンプン加水分解酵素(GSHE)の発現に有用な糸状菌宿主細胞に関係する。本発明は更に、顆粒デンプンのゼラチン化温度以下において、デンプン液化アミラーゼ及びGSHEを同時に顆粒デンプン基質に接触させる工程を含む顆粒デンプン基質からグルコースシロップ及び他の所望の最終生産物を生産するための方法におけるGSHEの使用に関係する。本発明は更にGSHE及びデンプン液化酵素を含む酵素に関係する。
工業的発酵は、多数のタンパク質、酵素、アミノ酸、アルコール、有機酸、医薬品及び化学物質の生成のための供給原料としてグルコースを主に利用する。グルコースはバイオマス又はデンプン等の炭素基質の酵素的転換により生産される。植物中に豊富に見られるデンプンは直径0.5乃至175ミクロンの微細な顆粒として蓄積されている。これらのデンプン顆粒は結晶性粒子であることから、冷水中ではデンプン顆粒が不溶性となる。その結果として水中におけるデンプン顆粒の可溶化は、部分的にデンプンを加水分解して可溶化するので、顆粒の結晶構造を破壊するための多量の熱エネルギーを必要とする。多くの可溶化工程が採用されているが、これらは、直接的(蒸気注入による直接加熱)又は非直接的な加熱システムを含んでいる(STARCH CHEMISTRY AND TECHNOLOGY, eds R.L. Whistler et al., 2nd Ed., 1984 Academic Press Inc., Orlando, FL、STARCH CONVAR.SION TECHNOLOGY, Eds. G.M.A. Van Beynum et al., Food Science and Technology Series, Marcel Dekker Inc., NY、及びTHE ALCOHOL TEXTBOOK, 3 rdEd., Eds. K. Jacques, T.P. Lyons and D. R. Kelsall, 1999, Nottingham Univar.sity Press, UK参照のこと)。
通常、2段階の酵素工程が、デンプンからグルコースへの加水分解に用いられる。第一工程は液化工程であり、第二工程は糖化工程である。液化工程において不溶性デンプン顆粒を、水中でスラリーにした後、デキストリンのマッシュを生産するためにカルシウムを添加した熱安定性アルファアミラーゼ(E.C.3.2.11アルファ(1-4)-グルカン グルカノヒドロラーゼ)により加水分解する。得られたマッシュを約60乃至50℃で冷却する。糖化工程では、グルコアミラーゼ(E.C.3.2.1.3 アルファ(1,4-)-グルカン グルコヒドロラーゼ)活性を有する酵素を用いて可溶性デキストリン(糖)をデキストロース(グルコース)へ更に加水分解する。グルコースは、その後、最終生成物として使用されるか、又は、フルクトース、ソルビトール、エタノール、酪酸、アスコルビン酸(ASA)中間体及び1,3-プロパンジオール等の他の化学的に重要な所望の最終生成物に転換するための前駆体として使用される。
1950年代後半、アスペルギウスニガー(Aspergillus niger)由来のグルコアミラーゼが商品化された。デンプンからグルコースへの転換においてこれらの酵素は大幅に改良されていた。他の大幅な改良は1970年代に行われた。改良された熱安定性、pH耐性、低カルシウム濃度耐性を有する熱安定性アルファアミラーゼがバチルスリケニフォルミス(Bacillus licheniformis)から提供され、商品化された(米国特許No.3,912,590)。
酵素液化工程のための更なる工業プロセスがデンプン甘味料の製造分野において採用された(米国特許No.5,322,778)。これらのプロセスの幾つかはわずかな蒸気を必要とする低温工程(105乃至110℃で、5乃至8分)及びデンプン顆粒のゼラチン化を改善することによりろ過及び液化デンプン基質を改善する高温プロセス(148℃+/-5℃、8乃至10秒)を含む(Shetty et al., (1988) Cereal Foods World 33: 929-934)。
酵素によるデンプン液化工程は改良され続けているが、生産ロス、操業コスト、エネルギー消費、pH調整、温度域、カルシウム要求、及び劣化デンプンのレベルに対する改善が必要とされている。特に液化工程において残ったアルファアミラーゼは、糖化工程における処理上、悪い影響を及ぼすことが知られており、この残余アルファアミラーゼはグルコアミラーゼによる糖化工程に先立ち、失活させる必要があった。通常、95℃においてpHを4.0乃至4.5へと液化デンプンのpHを低くすることにより失活を行う。液化工程における他の不利益は、還元基のアルカリ異性化である。アルカリ異性化は、ジサッカライド、マルツロース(4-アルファ-D-グルコピラノシル-D-フルクトース)を形成する。マルツロースは、グルコアミラーゼ及びアルファアミラーゼによる加水分解に耐性を有するため、グルコース生産を低くする。更に高グルコース濃度において、活性グルコアミラーゼにより触媒される逆反応性生物の形成を制御することは難しい。アスペルギウスニガー(Aspergillus niger)由来のグルコアミラーゼは、通常、典型的な糖化条件に用いる熱に対して安定である。それゆえ、グルコアミラーゼの実質的な量は、糖化工程の後でもそのままである。ここで述べた問題のいくつかに対する解決法は各種研究において示唆されている。
例えば、Laech et al.(米国特許No.4,113,509及び米国特許No.3,922,196)は、デンプンのゼラチン化温度以下の温度で、バクテリアアルファアミラーゼで顆粒デンプンをインキュベートすることにより、（微細な）顆粒デンプンを可溶性加水分解物に転換する方法を開示した。この工程の後に、マルトース高含有シロップを生産するために、ベータアミラーゼを加水分解に用いる。
欧州特許出願No.0356737A2は、バチルスステアロセレモフィリス(Bacillus stearothermophilus)由来のアルファアミラーゼを用いた簡便な液化工程(ゼラチン化温度及び高温の液化が続く)を省略して、コーン、小麦、ジャガイモ、及びサツマイモ由来の（精製）顆粒デンプンを60℃で加水分解することによりマルトースシロップを生産する方法を開示した。
生のデンプンを加水分解する能力を有するグルコアミラーゼを用いた、顆粒(生)デンプンをグルコアミへ転換する複数工程法が開示されている(米国特許No,4,618,579)。しかしながら、この方法においては、60%のデンプンが加水分解されることから、更なる再利用工程が必要であった。
顆粒デンプンの転換のためにの従来法を改善するだけでなく、それらの(方法)に用いる酵素の発現及び生産を高くする方法を提示することが望まれいてる。例えば、高い特異活性、異なるpHレンジ、及び/又は異なるレベル等の特性が改善された顆粒デンプン加水分解活性を有するグルコアミラーゼは、特に工業的デンプン転換工程に用いるのに有利であろう。本発明はこれらの必要性に見合うばかりでなく、デンプンの加水分解から得られる各種最終生成物を効率的に生産することができる。
発明の概要
本発明の一の態様は、ゼラチン化されてないデンプン基質を、エンド作用アルファアミラーゼと接触させる工程とグルコアミラーゼ活性、特に、顆粒デンプン加水分解活性を有する酵素による糖化工程とを同時に行うことにより、顆粒デンプン基質のゼラチン化温度以下の温度で顆粒デンプンを加水分解して、グルコースに転換する、一段階プロセスに関係する。
本発明は、以下の項目の少なくとも1に対して、利用可能であり、従来技術に対して改善されている；a)アルファアミラーゼ及び顆粒デンプン加水分解活性を有するグルコアミラーゼが糖化工程の間活性である。；b)顆粒形態のデンプン基質を用いることができ、かつ該デンプン基質を加水分解することができる。；c)単一pHを顆粒デンプンの可溶化及び糖化に用いる。；d)液化デンプン基質を用いた従来の糖化工程と比較して、顆粒デンプンを用いた糖化時間のほうが短い。；e)液化デンプン基質から得られたグルコースシロップと比較して高い糖含量を還元して生産される高濃度のグルコース含有シロップが得られる。；ｆ)マルトース形成のためのグルコースのロスが低くなる。；g) メイラード反応が排除されるか最小化される。；h)ジェットクッキングによる劣化デンプンに起因する糖化後のヨウ素反応陽性デンプンポリマー形成(ブルーサック)のリスクか低くなる。；i)デンプンスラリーへのカルシウム添加が必要なくなる。及びj)加水分解されたデンプンはフィルターシステムを塞がなくなるので、ろ過工程が改善される。本発明に包含される方法及び組成物は、工業及び化学分野でのグルコース原材料を提供する、より経済的で効果的な手段を提供する。
本発明の一の側面において、グルコアミラーゼ活性を有する顆粒デンプン加水分解酵素(GSHE)をコードする異種ポリヌクレオチドを用いて形質転換された糸状菌株を提供する。好ましい糸状菌株は、トリコデルマ(Trichoderma)株及び、より具体的には培養培地中にGSHEを発現し分泌するトリコデルマレーシ(T. reesei)株である。
この側面の幾つかの態様において、本発明は、GSHEをコードする異種ポリヌクレオチドに作動可能に結合し、糸状菌宿主細胞転写活性を有する、プロモーターを含むDNA構築体で糸状菌宿主細胞を形質転換させる工程と、GSHEを発現させるために適切な培地において、形質転換された宿主細胞を培養する工程と、及びGSHEを生産する工程とを含む、糸状菌宿主細胞においてGSHEを生産する方法に関係する。他の態様において、GSHEを発現する異種ポリヌクレオチドはフミコーラグリセア(Humicola grisea)又はアスペルギウスアワモリ(Aspergillus awamori)から提供される。他の態様において、GSHEは配列番号3と少なくとも90%の配列同一性を有し、配列番号6と少なくとも90%の同一性を有する。更なる態様において、組換え宿主細胞により生産されたGSHEは回収される。
第二の側面において、本発明は組換えトリコデルマレーシ(Trichoderma reesei)の培地から生産された発酵ブロスを含む。この態様において、トリコデルマレーシは、配列番号3と少なくとも90%の配列同一性を有するか、又は、配列番号6と少なくとも90%の配列同一性を有するGSHEをコードする異種ポリヌクレオチドを含む。
第三の側面において、本発明は、顆粒デンプン基質からグルコースシロップを製造する一段階プロセスに関係する。この方法は、(a)デンプン基質のゼラチン化温度以下の温度で10乃至55%の乾燥固形含量(ds)を有する顆粒デンプン基質のスラリーにアルファアミラーゼとグルコアミラーゼ活性を有する顆粒デンプン加水分解酵素(GSHE)に同時に接触させる工程と、(b)グルコースシロップを得るために、顆粒デンプンを加水分解するのに十分な時間アルファアミラーゼとGSHEを作用させる工程を含む。一の態様において顆粒デンプンの95%が加水分解される。第二の態様において、グルコースシロップの賛成は少なくとも91重量%である。第三の態様において、顆粒デンプン基質の乾燥固形含量は約15乃至40%である。第四の側面において、顆粒デンプンを加水分解させる時間は約5乃至100時間である。第五の態様において、アルファアミラーゼはEC 3.2.1.1を有する酵素である。第六の態様において、このアルファアミラーゼは、バチルス(Bacillus)及び特にバチルスステアロセレモフィリス（Bacilus stearothermophilus）由来のアミラーゼである。更なる態様において、このアルファアミラーゼは、組換えバチルス株由来である。第七の態様において、このGHSEはフミコーラグリセアvar.セルモイデア(Humicola grisea var. thermoidea)株由来又はアスペルギウスアワモリvar.カワチ（Aspergillus awamori var. kawachi）株由来である。第八の態様において、このGHSEは組み替えトリコデルマ(Trichoderma)株、特に、フミコーラグリセア(Humicola grisea)GSHE又はアスペルギウスアワモリvar.カワチ(Aspergillus awamori var. kawachi)GSHEをコードする異種遺伝子を発現するトリコデルマレーシである。第九の態様において、この方法は更にグルコースシロップを分離する工程特に、ろ過工程を含む。第十の態様において、グルコースシロップから得られたグルコースは更にフルクトースに転換される。第十一の態様において、本発明の一段工程の温度は、約50℃乃至約70℃である。第十二の態様において、この工程はpH4.5乃至6.5のpH域で行われる。
第四の側面において、本発明は、顆粒トウモロコシデンプンからグルコースシロップを製造する一段工程に関係する。この工程は、(a) 約55℃乃至65℃の温度、及び約5.0乃至6.0のpHいおいて、25乃至45%の乾燥固形含量(ds)を有する顆粒デンプン基質のスラリーをバチルス(Bacillus)由来のアルファアミラーゼと糸状菌源由来のグルコアミラーゼ活性を有する顆粒デンプン加水分解酵素(GSHE)に同時に接触させる工程及び、(b)グルコースシロップを得るために、顆粒デンプンを加水分解するのに十分な時間アルファアミラーゼと顆粒デンプン加水分解活性を有するグルコアミラーゼを同時に作用させる工程を含む。一の態様において、顆粒デンプンの少なくとも80%が加水分解され、グルコースシロップの産生は少なくとも90重量%である。第二の態様において、このグルコアミラーゼはフミコーラグリセア(Humicola grisea) GSHE又はアスペルギウスアワモリvar.カワチ(Aspergillus
awamori var. kawachi)GSHEをコードする異種遺伝子を発現する組み替えトリコデルマレーシ由来のGHSEである。
第五の側面において、本発明は20乃至55%の乾燥固形含量を有する顆粒デンプンのスラリーをアルファアミラーゼ及びフミコーラグリセア(Humicola grisea)由来のGSHEをコードする異種ポリヌクレオチドを含むトリコデルマ(Trichoderma)株から得られた顆粒デンプン加水分解活性を有するグルコアミラーゼに同時に接触させる工程及び、顆粒デンプンを加水分解するのに十分な時間アルファアミラーゼとグルコアミラーゼを作用させる工程を含む、顆粒デンプンを加水分解する方法に関係する。一の態様において、顆粒デンプンの少なくとも90%が加水分解される。第二の態様において、顆粒デンプンはトウモロコシデンプン及びコムギデンプンである。第三の態様において、GSHEは約0.5乃至1.0フミコーラ(Humicola grisea)GA GSHE単位/ｇデンプンの濃度でスラリーに提供され、アルファアミラーゼは約0.1乃至0.5kgMTデンプンの間の濃度でスラリーに提供され、スラリーのpHは約4.5乃至6.0で、温度は55℃乃至65℃である。
第六の側面において、本発明は、グルコースシロップを得るために、顆粒デンプン基質を、アルファアミラーゼ及び顆粒デンプン加水分解酵素(GSHE)に同時に接触させる工程を含む、グルコースシロップの製造方法に関係する。このGSEHは、糸状菌株から分泌され、前記糸状菌株はフミコーラ株由来のGSHEをコードする異種ポリヌクレオチドを含んでおり及び配列番号3と少なくとも90%の配列同一性を有しグルコースシロップを得る。一の態様において、このグルコースは更に所望の生成物に転換される。
第七の側面において、本発明はアルファアミラーゼ及び顆粒デンプン加水分解活性を有するグルコアミラーゼを含む酵素組成物に関係する。第一の態様において、このアルファアミラーゼはバチルス(Bacillus)種由来であり、GSHEはフミコーラグリセア(Humicola grisea)GSHE由来である。第二の態様において、GSHEは、特に、フミコーラグリセア(Humicola grisea)GSHEをコードするポリヌクレオチドを含むように設計されたトリコデルマ(Trichoderma)株である。第三の側面において、この組成物のpHは4.5乃至6.0の間である。第四の側面において、このアルファアミラーゼはバチルスステアロセレモフィリス(B. stearothermophilus)株由来である。更なる態様において、この酵素組成物におけるGSHEに対するアルファアミラーゼの比は15：1乃至1：15である。
第八の側面において、本発明は、本発明に包含される方法を用いて得られたグルコースシロップをフルクースに転換することによりフルクトース高含有シロップを製造する方法に関係する。
第九の側面において、本発明は、本発明により包含される方法を用いて得られたグルコースシロップを発酵させることを特徴とする最終生成物を生産する方法に関係する。この側面の幾つかの態様において、最終生成物はアルコール及び好ましくはエタノールである。この側面の更なる態様において、発酵は接触工程と同時に行われる。及び他の態様において、発酵は接触工程と連続して又は分離して行われる。更なる態様において、発酵生成物は発酵ブロスから分離される。
第十の側面において、本発明は本発明の方法に従って製造されたグルコースシロップを分離する工程、及び、残余デンプンを含む組成物を保持する工程により、残余デンプンを得生産する工程に関係する。第一の態様において、残余デンプンは最終生成物として用いられる。第二の側面において、残余デンプンは再利用され、顆粒デンプンのゼラチン化温度以下の温度でGSHE及びアルファアミラーゼに接触させられる。
発明の詳細な説明
幾つかの側面において、本発明は遺伝子工学及び分子生物学の分野において日常的に用いられている技術に関係する。Sambrook et al,. “Molecular Cloning: A Laboratory Manual”, Second Edition (Cold Spring Harbor), [1989]及びAusbel et al., “Current Protocols in Molecular Biology” [1987]には本発明に用いられるそのような技術が記載されている。
他の違った方法で定義しない限り、本明細書で用いられる全ての技術的及び化学的言語は、本出願に関係する技術分野において当業者に通常理解されているものと同じ意味を有する。例えば、Singleton and Sainsbury, Dictionary of Microbiology and Molecular Biology, 2d Ed., JohnWiley and Sons, NY (1994)及び Hale and Marham, The Harper Collins Dictionary of Biology, Harper Perennial, NY (1991)は、本発明の技術分野の当業者が利用する、そして本発明において多く用いられている用語の一般的な辞書である。本明細書で述べられているのと同じかあるいは類似の多くの方法及び物質は本発明の実施に用いることができるけれども、本明細書中では特定の好ましい方法及び物質にのみ言及する。
本発明は、以下の定義及び実施例を参照することにいり詳細に説明される。本明細書で参照する開示されている全ての配列を含む、全ての特許及び刊行物は参照により本発明の明細書に援用される。
数値範囲は幅を定義している数値を含むものする。
違った形で定義しない限り、核酸は配列は左から右に向かって5’から3’を示し、アミノ酸配列は左から右に向かってアミノ末端からカルボキシ末端を示す。
更に、本明細書で付す標題は本発明の各種側面を限定するものではない。発明は明細書全体を参照して理解されるべきである。
A.定義
「デンプン」という語は、植物の多糖複合体を含むあらゆる物質であって、アミロース及び/又はアミロペクチンを含む化学式(C6H10O5)X(Xは任意の整数)で表されるあらゆる物質を言う。特に、「デンプン」の語は、穀粒、草、塊茎、及び塊根、より具体的には、コムギ、オオムギ、トウモロコシ、ライムギ、ソルガム、豆科植物、キャッサバ、キビ、ジャガイモ、サツマイモ、及びタピオカを含むがこれらに限定されない。
「粒デンプン」という語は、ゼラチン化されていない、非加熱(生の)デンプンを言う。
「ゼラチン化」という語は、粘性のある懸濁液を形成するためのデンプンの可溶化を言う。
「ゼラチン化温度」の語は、基質デンプンがゼラチン化する最も低い温度を意味する。正確な温度は、特定のデンプン基質に依存し、更には、デンプンを供給源と成っている植物種及び育成条件にも関係する。
「DE」又は、「デキストロース当量」の語は、総還元糖の濃度を測定する工業的基準であり、乾燥重量に対する、D-グルコースの割合として計算される。非加水分解粒デンプンのDEは0であり、D-グルコースは100のDEを有する。
「グルコースシロップ」の語は、グルコース固形物を含む水性組成物を意味する。一の態様において、グルコースシロップは、少なくとも90%のD-グルコースを含み、他の態様において、グルコースシロップは少なくとも95%のD-グルコースを含む。幾つかの態様において、「グルコース」、「グルコースシロップ」及び「デキストロース」の語は互換的に使用される。
「総糖含量」の語は、デンプン組成物中に存在する総糖含量を言う。
「乾燥固形成分」及び「ds」の語は、懸濁液中の化合物(例えば小麦)の乾燥重量成分の総量(in %)を言う。
「ブリックス」の語は、所定の温度における、溶液中の糖含量を測定するための比重単位を言う。従って、「ブリックス」は、溶液中に存在する可溶性糖の量を意味する。このブリックス計測器は、水溶性糖溶液の100グラム当たりに存在するスクロースのグラム数を測定する(可溶性固形含量の総量)。ブリックス測定値は、比重計あるいは、屈折計によって測定される。
「デンプン液化酵素」の語は、デンプン粒を液化させる酵素を言う。典型的なデンプン液化酵素は、アルファアミラーゼ(E.C.3.2.1.1)である。
「アミラーゼ」の語は、デンプンの加水分解を触媒する酵素を言う。
「アルファアミラーゼ」という語は、アルファ1,4グルコシド結合の加水分解を触媒する酵素を言う(E.C.3.2.1.1)。これらの酵素もまた、1,4-アルファ結合を有するDグルコース単位を含む多糖中の1,4-アルファDグルコシド結合のエキソ及びエンド型加水分解作用を有することが知られている。グリコゲナーゼもこれらの酵素と同義である。通常これらの酵素は、アルファ1,4グルカン4-グルカノヒドラーゼ、グルカノハイドラーゼを含む。
本明細書において互換的に使用される「糖化酵素」及び「グルコアミラーゼ」の語は、アミログルコシダーゼクラスの酵素を意味する(E.C.3.2.1.3、グルコアミラーゼ、アルファ1,4-グルカングルコシダーゼ)。これらはエキソ作用型酵素であり、アミロース及びアミロペクチンの非還元末端からグルコシル残渣を切り離す。この酵素は、アルファ-1,4結合よりは低い割合ではあるけれども、アルファ1,6-及びアルファ1,3-結合を加水分解する。
「顆粒デンプン加水分解酵素(GSHE)」又は「顆粒デンプン加水分解活性を有する酵素」の語は、グルコアミラーゼ活性及び顆粒形態のデンプンを分解する能力を有する酵素を意味する。好ましいGSHEは糸状菌由来のGSHEである。糸状菌由来のGSHEは、糸状菌細胞の内性又は外因性のGSHEである。一の好ましいGSHEはフミコーラグリセアvar.セルモイデア(Humicola grisea var. thermoidea)由来の天然GSHEである。他の好ましいGSHEはアスペルギウスアワモリvar.カワチ(Aspergillus awamori var. kawachi)由来のGSHEである。特に好ましいGSHEは、GSHEをコードしている異種ポリヌクレオチドを含む遺伝的に修飾された宿主株において発現するGSHEである。幾つかの好ましい態様において、このGSHEは細胞外酵素として発現される。
「デンプンの加水分解」の語は、水分子の付加を伴うグリコシル結合の切断を意味する。
「重合度(DP)」の語は、与えられた糖中の無水グルコピラノース単位の数を言う。DP1の例は、グルコース及びフルクトール等の、単糖である。DP2の例は、マルトース及びスクロース等の二糖である。「DP4+」(>DP3)は、重合の程度が3以上であるポリマーを意味する。
「接触」の語は、基質を所望の最終産物に転換するために、個々の酵素を所定の基質に対して、十分に近い位置に置くことを意味する。基質と1以上の酵素溶液とを混合することが「接触」であることは、当業者に理解されている。
「酵素的転換」の語は、通常、酵素の作用により基質を変えることを意味する。この語は、酵素の作用による顆粒デンプン基質の修飾を意味する場合にも使用される。好ましい態様において、顆粒デンプン基質の酵素的転換は、グルコースシロップを生産する。
「スラリー」の語は、不溶性粒デンプンを含んでいる水溶性混合物を言う。
「グリコシル化」の語は、糖質部分の付加によるタンパク質の翻訳後調節を意味する。この糖質は、N結合又はO結合のいずれかに結合し、グルコプロテインになる。グルコプロテインのN結合した糖質部分は、アスパラギン残渣のβアミノニトロゲンへグリコシル結合により付加される。O結合した糖質はセリン又はスレオニン残渣のヒドロキシ基を通じてグリコシル結合する。
本明細書において、「組換え体」という語は、非相同核酸又はタンパク質の導入又は天然核酸又はタンパク質の変性により修飾された、細胞、核酸、タンパク質またはベクター又はそのように修飾された細胞由来の細胞についても用いられる。従って、例えば、組換え細胞は、天然(非組換え)型の細胞内に同一の形態では見られない遺伝子を発現する。或いは組換え細胞は、他の方法で豊富に過剰発現する、あるいは、未発現の状態にある、あるいは、全く発現しない、天然遺伝子を有する。
「組み換えGSHE」、「組み換えにより発現されたGSHE」及び「組み換えにより生産されたGSHE」の語は、異種ポリヌクレオチドから宿主細胞において、生産された成熟GSHEタンパク質配列を意味する。「r」は組換え体を意味する。rGSHEのタンパク質配列はシグナル配列を含む。一の態様において、GSHEはトリコデルマレーシ(T. reesei)の株内で発現するフミコーラグリセアvar.セルモイデア(Humicola grisea var. thermoidea)を「rH-GSHE」と記載する。
「天然のGSHE」及び「nGSHE」の語は組換えGSHEを発現する糸状菌宿主細胞以下の微生物宿主細胞有機体から提供されるGSHEを意味する。好ましい天然GSHEはフミコーラグリセア(Humicola grisea)株又はアスペルギウスアワモリ(Aspergillus awamori)株である。
「シグナル配列」という語は、細胞の外に成熟タンパク質の分泌を促進するタンパク質のN-末端部分に結合するアミノ酸配列部分を言う。この細胞外タンパク質の成熟形成は、分泌過程の間に切除されるシグナル配列を欠いている。
ここで用いる、「遺伝子」の語はポリぺプチド鎖の生成に関するDNAセグメントを意味し、個々のコード断片(エクソン)間の介在配列(イントロン)だけでなく、コード領域に先行または後に続く領域を含む。
ここで用いる、「核酸」の語はDNA、RNA、これらの一本鎖又は二本鎖形態、及びそれらの化学修飾体を包含する。「核酸」及び「ポリヌクレオチド」の語は、ここにおいて互換的に用いる。遺伝子コードの縮退により1以上のコドンが特定のアミノ酸をコードするために使用されることになるので、本発明は特定のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドを包含する。
「ベクター」の語は、1以上の細胞タイプの核酸に所望の配列を導入するためのポリヌクレオチドを意味する。ベクターは、クローニングベクター、発現ベクター、シャトルベクター、プラスミド、ファージ粒子、カセット等を含む。
「発現ベクター」の語は、適切な宿主におけるDNAの発現に影響を与える適切な制御配列に作動可能に結合しているDNA配列を含むDNA構築体を意味する。そのような制御配列は、転写に影響するプロモーター、翻訳を制御する追加的なオペレーター配列、mRNA上の適切なリボゾーム結合部位をコードする配列、エンハンサー並びに、転写及び翻訳の終了を制御する配列を含む。
「プロモーター」の語は遺伝子の転写を開始するために結合しているRNAポリメラーゼに含まれる調節配列である。このプロモーターは誘発プロモーター又は構築プロモーターである。本発明に用いる好ましいプロモーターはトリコデルマレーシ(T. reesei)cbh1である。
「転写制御下で」の語は、ポリヌクレオチドの配列、通常はDNA配列の転写が、転写の抑制又は促進に寄与するエレメントに作動可能に結合することに依存するということを示唆する文言であると当業者に理解されている。
「翻訳制御下で」の語はmRNAが形成された後に起こる調節プロセスであることは当業者に理解されている。
本明細書で用いる様に、それらをコードするタンパク質及び遺伝子を説明する場合には、遺伝子についての語は大文字を用いず、イタリック(下線)で示す。例えば、フミコーラグリセアGSHEをコードする遺伝子はgla1と示す。タンパク質について用いる語はイタリックを用いず最初の文字を大文字で示す。例えば、gla1遺伝子によりコードされるタンパク質はGla1と示す。
「作動可能に結合」の語は、あるエレメントが機能を発揮するような位置に配置されていることを言う。例えば、プロモーターはそれが配列の転写を制御するならばコード配列に作動可能に結合している。
「選択マーカー」の語は導入された核酸又はベクターを含む宿主細胞の選択を容易にするために宿主細胞内で発現することができる遺伝子を意味する。選択マーカーの例は、抗菌薬(ハイグロマイシン、ブレオマイシン、又はクロラムフェニコール)又は宿主に栄養上の利益を与える等の代謝的利益を付与する遺伝子であるがこれらに限定されない。
「由来」の語は「~を起源とする」、「〜から得られた」又は「〜から単離された」の語と同義とする。
「宿主株」又は「宿主細胞」は、発現ベクター又は本発明のGSHEをコードするポリヌクレオチドを含むDNA構築体に適した宿主を意味する。特に、宿主株は糸状菌である。本発明の好ましい態様において、「宿主細胞」は細胞と糸状菌株、特にトリコデルマレーシ(T. reesei)種又はアスペルギウス（Aspergillus）種の細胞から精製されたプロトプラストの両方を含む。
本発明の「糸状菌」は、真核微生物及び真菌門亜門に属する全ての糸状菌を含む(Alexopoulos, C. J. (1962), Introductory Mycology, New York: Wiley参照)。これらの菌類はキチン、セルロース、および他の複合多糖類から構成されている細胞壁からなる栄養菌糸を有することが特徴である。本発明の糸状菌は形態的に、生理機能的に、および遺伝的に、酵母とは別個である。本発明において用いる糸状菌親細胞は、トリコデルマ(Trichoderma)、例えば、トリコデルマレーシ(Trichoderma reesei)(トリコデルマロンギブランギアタム(T.longibrachiatum)として分類されているもの、及び現時点で、ハイポクレアジェコリーナ(Hypocrea jecorina)に分類されるものを含む)、トリコデルマビリデ(Trichoderma viride)、トリコデルマコニンギ(Trichoderma koningii)、トリコデルマハルジアナム(Trichoderma harzianum)；ペニシリウム種(Penicillium sp.)；フミコーラインソランス(Humicola insolens)及びフミコーラグリセア(Humicola grisea)を含むフミコーラ種(Humicola sp.)；クリソスポリウムルクノエンス(C.lucknowense)を含むクリソスポリウム種(Chrysosporium sp.)；グリオクラディウム種(Gliocladium sp.)；アスペルギウスオリザエ(A. oryzae)、アスペルギウスニヅランス(A. nidulans)、アスペルギウスニガー(A. niger)、及びアスペルギウスアワモリ(A. awamori)を含むアスペルギウス種(Aspergillus sp.)；フサリウム種(Fusarium sp.)、ニューロスポラ種(Neurospora sp.)、ハイポクレア種(Hypocrea sp.)；及びエメリセラ種(Emericella sp.)であるが、これらに限定されない。参考文献は、Innis et al.,(1985)Sci. 228 : 21-26である。
「トリコデルマ(Trichoderma)」又は「トリコデルマ種(Trichoderma sp.)」の語は、アスペルギウスとして分類されているもの、あるいは、現時点でアスペルギウスと分類されているものを言う。
「培養」という語は、液体または固形培地中の適切な条件下で、微生物細胞の塊を成長させることを言う。ある態様においては、培養は、通常、発酵管あるいは、発酵槽内で行われ、発酵により粒デンプン基質をグルコースシロップあるいは他の所望の最終生産物へ転換することを言う。
ここで用いる、「異種」のという語は、宿主細胞中に自然発生していない、ポリヌクレオチド、又は、タンパク質を言う。幾つかの態様において、このタンパク質は商業的に重要な工業タンパク質である。この語は、自然発生遺伝子、変異遺伝子及び/又は合成遺伝子によりコードされるタンパク質も包含する。本明細書で用いる、「内因性の」という語は、宿主細胞中に自然発生するポリヌクレオチドまたは、タンパク質を言う。
「回収」、「単離」及び「分離」の語は、少なくとも１の本来関係のある成分を除去した、分子、タンパク質、細胞、核酸、アミノ酸、又は糖類を言う。
本明細書において、細胞に関する「形質転換」、「安定な形質転換」、又は「トランスジェニック」という語は、ゲノムに組み込まれた、又は複数世代を通して保存されるエピソームプラスミドとして非天然(異種)核酸配列を有する細胞を意味する。
本明細書において、「発現」という語は、ポリペプチドが遺伝子の核酸配列に基づいて生成される工程をいう。当該工程には、転写及び翻訳の両方が含まれる。
本明細書において、核酸配列を細胞に挿入することに関して用いられる「導入」という語は、「遺伝子導入」、「形質転換」、又は「形質導入」を意味し、及び、核酸配列を真核または原核細胞に組み込むことを含み、ここで、前記核酸配列は、前記細胞のゲノム(例えば、染色体、プラスミド、色素体、又はミトコンドリアDNA)に組み込まれ、自律レプリコン(automous replicon)に変換され、又は一時的に発現される(例えば、トランスフェクトmRNA)。
本明細書で用いる「特異活性」の語は、特定条件下において、所定の時間内に酵素調製物により基質を生成物に転換するモル数であると定義される。特異活性は、単位(U)/mgタンパク質で表す。
「酵素活性」の語は基質上での酵素の作用を意味する。
「酵素単位」の語は、最適アッセイ条件において、1分間に1mgの基質を所定の生成物に転換するために必要な酵素の量を意味する。例えば、一の態様において、顆粒デンプン加水分解酵素単位(GSHE U)の語は、例えば、50℃、pH4.5のアッセイ条件下で顆粒デンプンから1分間に1mgのグルコースを精製するために必要なGSHEの量であると定義される。例えば、一の態様において、アルファアミラーゼ酵素単位は、pH5.2及び40℃のアッセイ条件下において、1分間に1μモルのデンプン基質を加水分解するアルファアミラーゼの量であると定義される。
「最終生成物」又は「所望の最終生成物」の語は、顆粒デンプン基質から酵素的より転換された任意の炭素基質由来の分子生成物を意味する。好ましくは、この最終生成物は、グルコース又はグルコースシロップである。グルコースは他の所望の最終生成物の前駆体としても使用される。
「残余デンプン」の語は、本発明の顆粒デンプン加水分解工程の後に残る副生成物又は残余組成物を意味する。「残余デンプン」はグルコースシロップ又は他の生成物を分離した後に残るものを含む。残余デンプンは、分離工程の後に残った不溶性デンプンの残存物を含む。
「残余デンプン再利用工程」の語は、GSHE又はアルファアミラーゼを含む発酵管又は発酵槽の中で残余デンプンを再利用する工程を意味する。
「産出（量）」の語は、本発明の方法を用いて生産された最終生成物又は所望の最終生成物の量を意味する。幾つかの好ましい態様において、この産性は、当該技術分野で知られている従来法を用いた場合より高い。幾つかの態様において、この語は、最終生成物の容量を意味する。幾つかの態様において、この語は、最終生成物の濃度を示す。
「エタノール生成微生物」の語は、糖又はオリゴサッカライドをエタノールに転換する能力を有する微生物を意味する。エタノール生成微生物は1以上の酵素を別々に又は一緒に発現して糖をエタノールに転換することができる。
本明細書において「実質的に精製されたポリペプチド」の語は、本来関係のある他のポリペプチド物質を約10重量%まで含むポリペプチド調製物を意味する(他のポリペプチド物質は低いパーセンテージであることが望ましく、例えば、約8重量%、約6重量%、約5重量%、約4重量%、約3重量%、約2重量%、約1重量%、約0.5重量%である)。従って、実質的に精製されたポリペプチドは少なくとも92%純粋である。すなわち、このポリペプチドは、調製物中に存在する総ポリペプチド物質の少なくとも92重量%を占めている。このパーセンテージは高いことが好ましく、例えば、少なくとも94%純粋、少なくとも95%純粋、少なくとも96%純粋、少なくとも97%純粋、少なくとも98%純粋、少なくとも99%純粋、少なくとも、99.5%純粋であることが好ましい。本明細書で開示するポリペプチドは、実質的に精製された状態である。特に、本明細書で開示するポリペプチドは、「実質的に精製された形態」、すなわちポリペプチド調製物が本来関連のある他のポリペプチド物質を実質的に含まないことが好ましい。このことは、例えば、良く知られた組換え法を用いてポリペプチドを調製することにより達成することができる。
「ATCC」の語は、バージニア州(VA)マナッサス(Manassas)20108にある、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション(American Type Clture. Collection)(ATCC www/atcc.org)を言う。
「NRPL」の語は、イリノイ州(ILL)ピオリア(Peoria)にある、アグリカルチャラル・リサーチ・サービス・カルチャー・コレクション(Agricultural Research Service. Culture. Collection)、あるいは、農務省(USDA)の北部研究所(Northern Regional Research Laboratory)としても知られている、国立農業飼養研究センター(National Center for Agricultural Utilization Research)を意味する。
本明細書で用いる記号、「一つの」及び「この」という語は、他に違った形で定義されていない限り、複数を示す場合にも用いる。
本明細書で用いる「から成る(comprising)」の語は、「含める」の意味に用い、「含む(including)」と等しく用いる。
B.好ましい態様
デンプン基質
本発明の方法に用いるデンプン基質は、茎、穀粒、塊根、及び塊茎を含む任意の植物から得られる。特に、好ましい植物は、トウモロコシ、コムギ、ライムギ、コメ、キビ、オオムギ、キャッサバ、豆及びピーナツ等の豆科植物、ジャガイモ、サツマイモ、バナナ、並びにタピオカを含む。このデンプンは細かく粉砕された生デンプンであるか、あるいは、デンプンの粉砕工程から得られた原料である。特に意図するデンプン基質はトウモロコシデンプン及びコムギデンプンである。本発明に包含される方法に用いる顆粒デンプン基質を調製するために用いる方法は、当業者に良く知られている。これらの利用可能な方法は、ハンマーミル、ローラーミルを用いた全粒穀物の乾燥粉砕及び湿式粉砕を含む。
各種デンプンが市販されている。例えば、トウモロコシデンプンは、セルスター(Cerestar)、シグマ(Sigma)及びカタヤマケミカル工業社(Katayama Chemical Industry Co. (Japan))より市販されている。コムギデンプンはシグマ(Sigma)、サツマイモデンプンは和光純薬工業(Wako Pure Chemical Industry Co. (Japan))及びジャガイモデンプンはナカアリケミカル製薬社(Nakaari Chemical Pharmaceutical Co. (Japan))より市販されている。
本発明を特定の方法に限定することは意図しないけれども、表1は、幾つかの良く使用される穀物のデンプン含量を示したものである。このデンプン含量のレベルは、遺伝形質及び環境により変動することは当業者の知識の範囲内である。
Figure 0005091484
 本発明に包含される方法の幾つかの態様において、顆粒デンプン基質は、スラリーである(通常、水を用いる)。このスラリーは、i)約10乃至55%の乾燥固形含量、ii)約20乃至50%の乾燥固形含量、iii)約25乃至45%の乾燥固形含量、iv)約30乃至45%の乾燥固形含量、約30乃至40%の乾燥固形含量、及びvi)約30乃至35%の乾燥固形含量を有する。
アルファアミラーゼ
本発明に包含されるいくつかの態様において、アルファアミラーゼは、E.C.3.2.1.1-3、特に、E.C.3.2.1.1の酵素番号を有する。幾つかの態様において、このアルファアミラーゼは、熱安定性微生物アルファアミラーゼである。好適なアルファアミラーゼは、組換え体及び突然変異体アルファアミラーゼの他に、天然アルファアミラーゼを含む。特に好ましい態様において、このアルファアミラーゼは、バチルス(Bacillus)種由来のものである。好ましいバチルス(Bacillus)種は、バチルススブチルス(B. subtilis)、バチルスステアロセレモフィリス(B. stearothermophilus)、バチルスレンタス(B. lentus)、バチルスリケニフォルミス(B. licheniformis)、バチルスコアギュランス(B. coagulans)、及びバチルスアミロリケファシエンス(B. amyloliquefaciens)を含む(米国特許Nos.5,763,385、5,824,532、5,958,739、6,008,026 及び 6,361,809)。特に好ましいアルファアミラーゼは、バチルス(Bacillus)株由来のものであり、バチルスステアロセレモフィリス(B. stearothermophilus)、バチルスアミロリケファシエンス(B. amyloliquefaciens)及びバチルスリケニフォルミス(B. licheniformis)である。ATCC 39709、ATCC 11945、ATCC 6598、ATCC 6634、ATCC 8480、ATCC 9945A 及び NCIB8059を有するものも好ましい。
ジェネンカーインターナショナルインク(Genencor International Inc.)より販売されている、SPEZYME AA、SPEZYME FRED、GZYME G997及び、ノボザイムバイオテック(Novozyme Biotech)より販売されているTERMAMYL 120-L、LC、SC 及び SUPRAのような、市販のアルファアミラーゼも本発明の方法に用いることができる。
当該技術分野において、本発明の方法に用いるアルファアミラーゼの量が、アルファアミラーゼ活性に依存することは、当業者に理解されている。通常、デンプン含有基質1メートルトン(MT)当たり約0.01から5kgのアルファアミラーゼを添加する。この量は、GZYME997の0.06AU/g ds乃至30AU/g dsに相当する。幾つかの態様において、このアルファアミラーゼはメートルトン当たり、約0.05乃至5.0kg、約0.05乃至2.5kg、約0.1乃至2.5kg、約0.1乃至2.0kg、約1.0乃至1.5kg、約0.1乃至1.0kg、約0.5乃至5.0kg、約0.5乃至2.0kg添加される。これらの値はGZYME997の、0.3乃至30AU/g ds、0.3乃至15AU/g ds、0.6乃至15AU/g ds、0.6乃至12AU/g ds、0.6乃至9AU/g ds、0.6乃至6AU/g ds、3乃至30AU/g ds及び3乃至12AU/g dsに相当する。更なる態様において、他の量も用いることができる。例えば、GZYM E997又はSPEZYME FRED(ジエンコアインターナショナルインク)をデンプンメートルトン当たり、0.01乃至0.1kg添加することもできる。他の態様において、デンプンメートルトン当たり、約0.05乃至1.0kgの間、約0.1乃至0.6kgの間、約0.2乃至0.6kgの間及び約0.4乃至0.6kgの間のGZYME 997又はSPEZYME FREDを添加することもできる。
グルコアミラーゼ活性を有する顆粒デンプン加水分解酵素
グルコアミラーゼ(EC.3.2.1.3)はデンプンの非還元末端から連続的にグルコース単位を切り離す酵素である。この酵素は、デンプン、アミロース又はアミロペクチンの直鎖又は分岐鎖のグルコシル結合を加水分解することができる。グルコアミラーゼはバクテリア、植物、糸状菌から得ることができるが、本発明に包含される方法に用いるのに好ましいグルコアミラーゼは糸状菌株由来のものである。
アスペルギウス属(Aspergillus)、リゾプス属(Rhizopus)、フミコーラ属(Humicola)及びムコール属(Mucor)から分泌されるグルコアミラーゼは、アスペルギウスアワモリ(Aspergillus awamori)、リゾプスニベウス(Rhizopus niveus)、リゾプスオリザエ(Rhizopus oryzae)ムコールミエヘ(Mucor miehe)、フモコーラグリセア(Humicola grisea)、アスペルギウスシロウサミ(Aspergillus shirousami)及び フミコーラ(セルモマイセス)ラニギノーサ(Humicola (Thermomyces) laniginosa)を含む糸状菌株から提供されてきた(Boel et al. (1984) EMBO J. 3: 1097-1102; WO 92/00381 ; WO00/04136; Chen et al., (1996) Prot. Eng. 9: 499-505; Taylor et al., (1978) Carbohydrate Res. 61: 301-308及び Jensenet al., (1988) Can. J. Microbiol. 34: 218-223参照のこと)
。
グルコアミラーゼ活性を有する酵素は、商業的に使用されおり、例えば、アスペルギウスニガー(Aspergillus niger)(取引名、OPTIDEX L-400及びGZYME G900 4X、ジェネンコー・インターナショナル・インク)又はリゾプス(Rhizopus)(取引名CU.CONC. 新日本ケミカル、日本及び取引名GLUCZYME 天野製薬、日本)から提供されている。
グルコアミラーゼを有する酵素の特定のグループは、顆粒デンプン加水分解酵素、GSHE(Tosi et al., (1993) Can. J. Microbiol. 39: 846-855参照のこと)である。GSHEはグルコアミラーゼ活性だけでなく、顆粒(生の)デンプンを加水分解することもできる。GSHEは、フミコーラ種(Humicola sp.),アスペルギウス種(Aspergillus sp.)及びルゾプス種(Rhizopus sp.)から発見されている。リゾプスオリザエ(Rhizopus oryzae)GSHEはAshikari et al., (1986) Agric. Biol. Chem. 50: 957-964及び米国特No.4,863,864に記載されている。フミコーラグリセア(Humicola grisea)GSHEはAllison et al., (1992) Curr. Genet. 21: 225-229及びEuropean Patent No. 171218に記載されている。この酵素をコードしている遺伝子は、gla1として当業者に知られている。アスペルギウスアワモ var. カワチ(Aspergillus awamori var. kawachi)GSHEは、Hayashida et al., (1989) Agric.Biol.Chem 53 : 923-929 に記載されている。アスペルギウスシロウサミ(Aspergillus shirousami)GSHEはShibuya et al.,(1990)Agric. Biol. Chem. 54: 1905-1914に記載されている。
一の態様において、GSHE はフミコーラグリセア(Humicola grisea)特に、フミコーラグリセアvar.セルモイデア(Humicola grisea var. thermoidea)より提供される(米国特許No.4,618,579参照のこと)。
幾つかの好ましい態様において、GSHEは、ATCC 16453、NRRL 15219、NRRL 15220、NRRL 15221、NRRL 15222、NRRL 15223、NRRL 15224及びNRRL 1522だけでなく、これらを遺伝的に修飾した遺伝子からも発見されている(EP 0171218)。
一の態様において、GSHEは、アスペルギウスアワモリ(Aspergillus awamori)、特に、アスペルギウスアワモリvar.カワチ(A. awamori var. kawachi)(Hayashida et al.,(1989) Agric.Biol.Chem. 53: 923-929参照のこと)。
他の態様において、pH4乃至7.5の幅及びpH5.0乃至7.5の間で最大pH活性を示し、50乃至60℃の温度幅で最大活性を示す。
一の態様において、GSHEは配列番号3で定義されるアミノ酸配列と、少なくとも50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、93%、95%、97%、98%及び99%の配列同一性を有する。他の態様において、GSHEは、配列番号3と少なくとも80%配列同一性を有するアミノ酸を含む。他の態様において、配列番号3のアミノ酸配列を含むGSHE、又は配列番号3と少なくとも80%の配列同一性を有するGSHEは配列番号1と少なくとも70%、80%、85%、90%、93%、95%、97%、98%及び99%の配列同一性を有するポリヌクレオチドによりコードされる。
他の態様において、GSHEは配列番号6で定義されるアミノ酸配列と、少なくとも50%、55%、60%、65%、70%、75、80%、85%、90%、93%、95%、97%、98%及び99%の配列同一性を有する。他の態様において、GSHEは、配列番号6と少なくとも80%配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。他の態様において、配列番号6のアミノ酸配列を含むGSHE、又は配列番号6と少なくとも80%の配列同一性を有するGSHEは配列番号4と少なくとも70%、80%、85%、90%、93%、95%、97%、98%及び99%の配列同一性を有するポリヌクレオチドによりコードされる。
他の配列に対して、所定のパーセンテージ(例えば、 80%、85%、90%、93%、95%、97%、または99%)の配列同一性を有するポリヌクレオチド、または、ポリペプチドは、２の配列をアラインメントさせて比較したときに、そのパーセンテージの同じ塩基または、同じアミノ酸を有するものを意味する。このアラインメントおよびパーセント相同性(homology)または、同一性(identity)は、例えば、CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY ( Ausubel et al., eds., 1987 Supplement 30, section 7.7.18. )に記載されている。好ましいプログラムは、GCG Pileup プログラム、FASTA、及びBLASTを含む。他の好ましいアラインメントプログラムは、ALINGN Plus及びTFASTである。
本発明に包含される配列は、ストリンジェントハイブリダイゼーション条件で、典型的なGSHE配列(例えば、配列番号1及び配列番号4)にハイブリダイスする能力を有することは当業者に理解されている。適切な温度及びイオン強度条件において、一本鎖の核酸を他の核酸にアニーリングさせることができるときに、核酸は他の核酸配列にハイブリダイズする。ハイブリダイゼーション及び洗浄条件は当業者に知られている(例えば、Sambrook
(1989) 上記、 特に9章及び11章参照のこと)。幾つかの態様において、ストリンジェント条件は、65℃の温度及び0.1x SSC 0.1% SDSに対応する。更なる態様において、GSHE酵素は、リゾプス(Rhizopus)の株から提供される。そのような酵素は、リゾプスニベウス(R. niveus)(CU CONCの取引名で販売されている)のコウジ(Koji)株から提供される。リソプスソルド(Rizopus sold)から提供される酵素は、GLUCZYMEの取引名で販売されている。
好ましい態様において、本発明に包含される方法又は組成物に用いるGSHEは、糸状菌株から得られた、宿主株以外の糸状菌のGSHEをコードしている異種ポリヌクレオチドを発現するために、遺伝子組み換えにより発現されたGSHEである。
幾つかの態様において糸状菌株は、アスペルギウス種(Aspergillus sp.)トリコデルマ種(Trichoderma sp.)フサリウム種(Fusarium sp.)又はペニシリウム種(Penicillium sp.)である。特に好ましい糸状菌宿主は、アスペルギウスニデュランス(A. nidulans)、アスペルギウスアワモリ(A. awamori)、アスペルギウスオリザエ(A. oryzae)、アスペルギウスアキュランタス(A. aculeatus)、アスペルギウスニガー(A. niger)、アスペルギウスジャポニクス(A. japonicus)、トリコデルマレーシ(T. reesei)、トリコデルマビリデ(T. viride)、フサリウムオキシスポラウム(F. oxysporum)、及びフサリウムソラニ(F. solani)である。アスペルギウス株(Aspergillus strains)はWard et al., (1993) AppL Microbiol. Biotechnol. 39: 738-743及びGoedegebuur et al., (2002) Curr. Gene 41: 89-98に開示されている。好ましい態様において、宿主はトリコデルマ(Trichoderma)株及び特に、トリコデルマレーシ(T. reesei)株である。トリコデルマレーシ(T. reesei)株は知られており、非限定的な例は、ATCC No.13631、ATCC
No.26921、ATCC No.56764、ATCC No.56765、ATCC No.56767及びNRRL 15709を含む。幾つかの好ましい態様において、宿主株は、RL-P37から提供される。RL-P37は、Sheir-Neiss et al., (1984)Appl. Microbiol. Biotechnol. 20: 46-53に開示されている。
rGSHEを発現する宿主株は、遺伝子工学の手法により操作されたものである。幾つかの態様において、この糸状菌宿主の各種遺伝子は、前記技術により失活されている。これらの遺伝子は、例えば、エンドグルカナーゼ(EG)及びエキソセロビオハイドラーゼ(CBH)等のセルロース分解酵素をコードする遺伝子を含む(例えば、cbh1、cbh2、egl1、egl2及びegl3)。米国特許No.5,650,322は、cbh1遺伝子及びcbh2遺伝子における欠失を有するRL-P37誘導株を開示する。
幾つかの態様において、この糸状菌宿主はフミコーラグリセア(Humicola grisea)由来のGSHEをコードするポリヌクレオチドを含んでいる。一の態様において、組換えrGSHEは、配列番号3で定義するアミノ酸配列と少なくとも50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、93%、95%、97%、98%及び99%の配列同一性 を有する。他の態様において、配列番号3のGSHEをコードするポリヌクレオチドは、配列番号1で定義される配列と少なくとも70%、80%、85%、90%、95%、97%及び98%の配列同一性を有する。特に好ましい態様において、このGSHEはトリコデルマレーシ株(Trichoderma reesei)において発現され、配列番号3の配列と80%、85%、90%、95%、97%及び98%の配列同一性を有する。
他の態様において、糸状菌宿主は、アスペルギウスアワモリ(Aspergillus awamori)由来のGSHEをコードするポリヌクレオチドを発現するために遺伝的に修飾されている。一の態様において、rGHSEは、配列番号6で定義されるアミノ酸配列と少なくとも50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、93%、95%、97%、98%及び99%の配列同一性を有する。他の態様において、配列番号6のGSHEをコードしているポリヌクレオチドは、配列番号4で定義される配列と少なくとも70%、80%、85%、90%、95%、97%及び98%の配列同一性を有する。特に好ましい態様において、このGSHEは、トリコデルマレーシ(Trichoderma reesei)株において発現され、配列番号6の配列と80%、85%、90%、95%、97%及び98%の配列同一性を有する。
幾つかの態様において、組換え的に発現されたGSHEのグリコシル化レベルは、天然GSHEのグリコシル化レベルと異なる(例えば、フミコーラグリセア（H. grisea）又はアスペルギウスアワモリ(A. awamor)由来のGSHEはトリコデルマ(Trichoderma)において発現されたGSHEのグリコシル化レベルと異なるグリコシル化レベルを有する)。一の態様において、このグリコシル化レベルは、rGSHEにおいて天然のGSHEに対応するアミノ酸と少なくとも80%、85%、90%、95%の同一性を有している場合でも異なる。幾つかの態様において、トリコデルマ、特にトリコデルマレーシ(T. reesei)において発現されたrGSHEは対応するnGSHEのレベルと異なるグリコシル化レベルを有する。他の態様において、このグリコシレーションレベルは高いが、他の態様においては低い場合もある。
例えば、rGSHEのグリコシル化のレベルは、少なくとも1%、5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、又は65%、対応するGSHEのグリコシレーションレベルよりも低い。他の態様において、発現されたrGSHEのグリコシレーションレベルは対応するnGSHEのレベルよりも少なくとも、1%、5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、50%、60%、70%、80%、100%、125%、150%、175%、200%、225%又は250%高い。
他の態様において、本発明に従って製造された組換え技術を用いて生産されたGSHEは、適切な温度レベルにおいて、対応する天然GSHEよりも低pHにおける安定性が高い。より具体的には、トリコデルマ(Trichoderma)で発現された、フミコーラグリセアvar.セルモイデア(Humicola grisea var. thermoidea)由来のrGSHEは、45乃至55℃の温度において、対応するnGSHEと比較するとpH3.5乃至4.0における安定性が高い。 安定性における幾つかの条件下で、rGSHE、特にトリコデルマレーシ(Trichoderma reesei)の中で発現されたフミコーラグリセアvar.セルモイデア(H. grisea var. thermoidea)配列番号1の
安定性は、nGSHEの安定性の水準よりも2倍以上高い。
ベクター及び糸状菌形質転換
本発明に従い、本発明に包含されるGHSEをコードするポリヌクレオチドを含むDNA構築体を宿主細胞の中へGSHEを輸送するために構築する。従って、酵素の形で発現されるGHSEポリヌクレオチドを、ベクター、特に、GSHEコード配列に作動可能に結合している調節配列を含む発現ベクターを用いて宿主細胞内へ導入する。
ベクターは、糸状菌宿主細胞に導入されたときに宿主細胞の染色体に取り込まれ、置換される任意のベクターである。ベクターについてのFungal Genetics Stock Center
Catalogue of Strains (www. FGSC. net)は参考文献である。適した発現ベクターの例は、Sambrook et al., (1989)上記及び Ausubel (1987)上記、にも開示されており、特に好ましい例はvan den Hondel et al. (1991) in Bennett and Lasure Eds. MORE GENE MANIPULATIONS IN FUNGI, Academic Press pp. 396-428である。特に有用なベクターは、pFB6、pBR322、PUC18、pUC100及びpENTR/Dである。
いくつかの態様において、GSHEをコードする核酸は、糸状菌宿主細胞内で転写活性を示す、適切なプロモータに作動可能に結合している。このプモーターは、宿主細胞に相同又は非相同のいずれかのタンパク質をコードする遺伝子から提供される。好ましくは、このプロモーターは、トリコデルマ宿主の中で有用であり、適した非限定的な例はcbh1、cbh2、egl1、及びegl2を含むプロモーターである。一の態様において、このプロモーターは、宿主細胞由来である。例えば、トリコデルマレーシ(T. reesei)が宿主細胞の場合、このプロモーターは天然のトリコデルマレーシ(T. reesei)プロモーターである。好ましい態様において、このプロモーターは、プロモーターを含み、GenBank登録番号No.D86235を有するトリコデルマレーシ(T. reesei)cbh1である。誘発プロモーターは、環境下で活性があるか又は、促進的な調節をするものである。他の態様において、このプロモーターは、糸状菌宿主細胞とは異なる細胞由来である。有用なプロモーターの他の例は、アスペルギウスアワモリ(A. awamori)及びアスペルギウスニガー(A. niger)のグルコアミラーゼ遺伝子を含む(Nunberg et al., (1984) Mol.Cell Biol. 4: 2306-2315 and Boel et al., (1984) EMBO J. 3: 1581-158参照のこと)。トリコデルマーレーシ(T. reesei)xln1の遺伝子及びセロビオハイドラーゼ1遺伝子のプロモーターも有用である(EPA
137280A1)。
幾つかの態様において、GSHEコード配列は、シグナル配列に作動可能に結合している。このシグナル配列をコードするDNAは、発現されるべきGSHE遺伝子に関連していることが好ましい。好ましくは、このシグナル配列はGSHEをコードしているフミコーラグリセア(Humicola grisea)又はアスペルギウスアワモリ(Aspergillus awamori)遺伝子によりコードされている。より好ましくは、このシグナル配列は、図2A及び図6Aに示す配列と、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも97%、あるいは、少なくとも99%の配列同一性を有する。追加的な態様において、糸状菌宿主細胞の中に導入されるDNA構築体又はベクターを含む。このシグナル配列及びプロモーター配列は同じ源から提供される。例えば、幾つかの態様において、シグナル配列は、cbh1プロモーターに作動可能に結合しているcbh1シグナル配列である。
幾つかの態様において、発現ベクターは、転写終了配列を含む。一の態様において、この終了配列及びプロモーター配列は同じ源から提供される。一の態様において、終了配列は、宿主細胞と相同である。特に適した終了配列はトリコデルマ(Trichoderma)株、特にトリコデルマレーシ(T. reesei)由来のcbh1である。他の有用な糸状菌ターミネーターは、アスペルギウスアワモリ(A. awamori)及びアスペルギウスニガー(A. niger)グルコアミラーゼ遺伝子からのターミネーターである(Nunberg et al. (1984)上記、及びBoel et al., (1984) 上記)。
幾つかの態様において、発現ベクターは、選択マーカーを含む。好ましい選択マーカーの例は、抗菌質耐性を付与するものである(例えば、ハイグロマイシン及びフェロマイシン)。栄養選択マーカーもまた本発明に用いることができる。これらの選択マーカーは、amdS、argB及びpyr4として知られている。トリコデルマ(Trichoderma)の形質転換のためのベクターシステムに有用なマーカーは、Finkelstein、chapter 6 in BIOTECHNOLOGY OF FILAMENTOUS FUNGI、Finkelstein et al. Eds. Butterworth-Heinemann, Boston, MA (1992), Chap. 6. 及びKinghorn et al. (1992) APPLIED MOLECULAR GENETICS OFFILAMENTOUS FUNGI, Blackie Academic and Professional, Chapman and Hall, Londonに開示されている。好ましい態様において、選択マーカーは、形質転換された細胞がアセトアミドを窒素源として成長できるようになる、アセトアミダーゼ酵素をコードするamdS遺伝子である(Kelley et al., (1985) EM80J. 4: 475-479及びPenttila et al., (1987) Gene 61: 155-164)。
GSHEをコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターは、所与の糸状菌宿主微生物又は宿主のDNAに組み込まれる、自己複製可能なあらゆるベクターである。幾つかの態様においてこの発現ベクターはプラスミドである。好ましい態様において、2タイプの遺伝子発現を得るための発現ベクターを意図する。
第一の発現ベクターは、全て発現される遺伝子由来の、プロモーター、SGHEコード領域、及びターミネーターを有するDNA配列を含む。幾つかの態様において、ジーントランケーション(genge-truncation)が自己の転写及び翻訳調節配列の制御下で発現されるドメインを除去するために不要なDNA配列(例えば、不必要なドメインに対するコード)の欠失により得られる。
第二のタイプの発現ベクターは、予め組み立てられ、ハイレベルの転写のために必要な配列及び選択マーカーを含む。幾つかの態様において、GSHE遺伝子又はそれらの部分のコード領域は、発現構築物プロモーター及びターミネーター配列の転写制御下であるような、一般的な目的の発現ベクター内へ挿入される。幾つかの態様において、遺伝子又はそれらの一部はストロング(strong)cbh1プロモーターの下流に挿入される。
GSHEをコードするポリヌクレオチド、プロモーター、ターミネーター及び他の配列を含むベクターに結合させ、適切なベクター内へ挿入するために用いる方法は、当業者に知られている。通常簡便な制限部位において結合を行う。もし、そのような部位が存在しない場合には、合成オリゴヌクレオチドリンカーが簡便な方法に従って用いられる(Sambrook (1989) 上記及びBennett and Lasure, MORE GENE MANIPULATIONS IN FUNGI,
Academic Press, San Diego (1991) pp70-76)。すなわち、ベクターは既知の組換え技術を用いて構築することができる(例えば、Invitrogen Life Technologies, Gateway Technology)。1以上の失活した遺伝子を有する糸状菌宿主細胞を得たいときには、既知の方法が用いられる(米国特許Nos.5,246,853、5,475,101 及びWO92/06209参照のこと)。遺伝子失活は全体又は部分的な欠失、失活させるための部位の挿入、又は遺伝子の意図する機能を付与しない他の手段(遺伝子が機能的なタンパク質として発現させない)を用いて行うことができる。クローンされたトリコデルマ(Trichoderma)種又は他の糸状菌宿主細胞由来の任意の遺伝子(例えば、cbh1、cbh2、egl1)は欠失させることができる。幾つかの態様において、既知の方法によりプラスミド内へ、失活させるための所望の遺伝子形態を挿入することにより遺伝子欠失を行う。この欠失プラスミドは、選択マーカーに必要とされる所望の遺伝子コード領域、及び遺伝子コード配列又はそれらの部分内の適切な制限酵素部位で切断される。欠失されるべき遺伝子の一からのフランキングDNA配列はマーカーのどちからの端に残る(好ましくは約0.5乃至2.0kb)。適切な欠失プラスミドは、欠失遺伝子を含み、DNAフランキング配列を含み、及び一本鎖の直鎖部分として除去される選択マーカーを含むフラグメントの形で存在する。
宿主細胞へのDNA構築体又はベクターの導入は、形質転換、エレクトロポレーション、核酸注入、形質導入、リポフェクチョン仲介及びDEAE-デキストリン仲介形質感染を含む形質感染、カルシウムリン酸DNA沈殿によるインキュベーション、DNAコートのマイクロプロジェクタイルを用いた高速遺伝子銃及びプロトプラスト融合を含む。一般的な形質転換技術はAusubel et al., (1987)上記、9章及びSambrook (1989) 上記、に記載されている。糸状菌の形質転換のより詳しい方法はCampbell et al., (1989) Curr. Genet. 16: 53-56に開示されている。特に、トリコデルマ(Trichoderma)での異種タンパク質の発現に効果的な方法は、米国特許Nos.6,022,725、6,268,328；Harkki et al. (1991) Enzyme Microb. Technol. 13: 227-233; Harkki et al., (1989) Bio Technol. 7: 596-603; EP 244,234;及び EP 215,594である。Nevalainen et al., "The Molecular Biology of Trichoderma and its Application to the Expression of Both Homologous and Heterologous Genes", in MOLECULAR INDUSTRIAL MYCOLOGY, Eds. Leong and Berka, Marcel Dekker Inc., NY (1992) pp. 129-148及びCao et al., (2000) Sci. 9: 991-1001はアスペルギウス株の形質転換についての参考文献である。
GSHEのコードする核酸が宿主株の染色体に安定に取り込まれることにより、遺伝的に形質転換体がベクター内で構築されることが好ましい。形質転換体はその後既知の技術で精製される。
幾つかの非限定的な例において、アミドを含む固形培養培地上での成長の速さ及びアセトギザギザの外様よりはむしろスムースな円形のコロニーの形成を指標として、amdSを含む安定な形質転換体を不安定な形質転換体と区別する。すなわち、幾つかのケースにおいて、固形の非選択培地(すなわち、アセトアミド欠失培地)上で形質転換体を育成し、培養培地から胞子を収穫し、アセトアミド含有選択培地上での発芽及び成長する胞子のパーセンテージを決定することにより安定性の更なるテストを行う。代替的に、当該技術分野で知られている他の方法も形質転換体を選択するために用いることができる。
幾つかの特定の態様において、形質転換のためのトリコデルマ(Trichoderma)種の調製は糸状菌の菌糸からプロトプラストを調製することを含む(Campbell et al., (1989) Curr. Genet. 16: 53-56参照のこと)。幾つかの態様において、この菌糸は発芽させた発育胞子から得られ、細胞壁を消化しプロトプラストとするための酵素で処理する。このプロトプラストはその後、懸濁培地中に浸透安定剤を存在させることにより保護される。これらの安定剤はソルビトール、マンニトール、塩化カリウム、硫酸マグネシウム等を含む。通常これらの安定剤の濃度は、0.8Mから1.2Mの間で変動する。懸濁培地中に1.2Mのソルビトール溶液を用いることが好ましい。
トリコデルマ(Trichoderma)種株内へのDNAの取り込みはカルシウム濃度に依存している。通常10mM CaCl2乃至50mMのCaCl2を取り込み溶液に用る。取り込み溶液中のカルシウムの必要性の他に、通常含まれる他のアイテムは、TE緩衝液(10Mm Tris、pH7.4 ;1mM EDTA)又は10mM MOPS(モルフォリンプロパンスルホン酸(morpholinepropanesulfonic acid))、pH6.0及びポリエチレングリコール(PEG)である。ポリエチレングリコールは細胞膜を融解し、従って、(Trichoderma)トリコデルマ種の細胞質の中に培地の成分を輸送することができると考えられている。この融解が存在することにより、プラスミドDNAの多数のコピーを宿主細染色体の中に穏やかに組み込むことができる。
通常、105乃至107/mLの濃度で、好ましくは2×106/mLの浸透処理を受けた、トリコデルマ(Trichoderma)種又は細胞を含む懸濁液を形質転換に用いる。適切な溶液中(例えば、1.2Mソルビトール、50mM CaCl2)にプロトプラスト又は細胞を含む溶液の100μLを所望のDNAと混合する。通常、高濃度のPEGをこの取り込み溶液に添加する。0.1乃至1容量の25%PEG4000をプロトプラスト溶液に添加する。ジメチルスルホキシド、ヘパリン、スペルミジン、塩化カリウム、等も取り込み溶液の中に添加し、形質転換を助ける。同様の手順を他の宿主細胞にも用いることができる。例えば、参照により本明細書に援用することができる米国特許Nos.6,022,725 及び6,268,328参照のこと。
通常、混合物を約0℃において10乃至30分間インキュベートする。所望の遺伝子又はDNAの取り込みを更に高めるために、PEGを混合物に追加する。25% PEG4000を、5乃至15倍容量の形質転換混合物に添加するが、これより少ない又は大きい容量も採用することができる。PEGを添加した後、ソルビトール及びCaCl2溶液を添加する前に、形質転換混合物を室温又は氷上でインキュベートする。その後、成長培地の融解されたアリコートに更にプロトプラスト懸濁液を添加する。この成長培地においては形質転換体のみが成長することができる。
細胞培養
Pourquie J. et al., BIOCHEMISTRY AND GENETICS OF CELLULOSE DEGRADATION, eds. Aubert, J. P. et al., Academic Press, pp. 71-86, 1988 及 llmen, M. et al., (1997)Appl. Environ. Microbiol. 63: 1298-1306に開示されているように、適切な宿主細胞は生体に必要な塩及び栄養を含んだ標準培地で培養される。市販のイーストモルト抽出物(Yeast Malt Extract (YM))ブロス、ルイアバータリン(Luria Bertani (LB))ブロス及びシャボウラウドデキストロース(Sabouraud Dextrose (SD))ブロスについての参考文献もある。
培養条件は、標準的な条件であり、例えば、所望のレベルのGSHE発現が得られるまで、振とうシェイカー又は発酵槽の中において適切な培地を用いて約28℃で培地をインキュベートする。所与の糸状菌に対して好ましい培養条件は、American Type Culture Collection 及び Fungal Genetics Stock Center (www. FGSC. Net)のような、サイエンスライブラリー又は糸状菌の提供先から入手することができる。
糸状菌の成長が確立した後、細胞はGSHE、特に本明細書で定義するGSHEの発現を引き起こすために効果的な条件に曝される。GSHEコード配列が誘発プロモーターの制御下にあるときは、誘発剤、例えば、糖、金属塩又は抗生物質がGSHE発現を誘発するのに効果的な濃度で培地に添加される。
rGSHEの工業的使用-発酵
幾つかの態様において、異種GSHEを発現している糸状菌細胞は、バッチ、又は連続発酵条件で育成される。バッチ発酵は、閉鎖システムであり、培地の組成物は発酵の開始時に調整されており、発酵の間変更されることはない。従って、発酵の開始時に培地に所望の微生物を接種する。この方法において、発酵の間はいかなる成分もこのシステムに添加されることはない。古典的なバッチ培養は、閉鎖系であり、発酵の開始時点に培養液の組成が決定され、当該発酵の間は人為的な変更は受けない。従って、発酵の開始時点において、所望の微生物が培養液に接種されると、当該発酵の系には何も添加できない。しかしながら、典型的には、「バッチ」発酵は炭素源の添加に関するバッチであり、pHや酸素濃度等の因子を制御することは頻繁になされる。バッチ方式では、当該方式の代謝物及びバイオマス組成物は、発酵が停止されるまで定常的に変化する。バッチ培養においては、細胞は、静的誘導期を経て高成長対数期に緩和され、最終的には、成長速度が減少又は停止する静止期に至る。培養液が未処理の場合には、当該静止期の細胞は、最終的には死滅する。一般に、対数期の細胞が、最終生成物又は中間体の生産の大部分を担う。
標準的なバッチ方式におけるバリエーションの１つは、フェドバッチ方式である。フェドバッチ発酵工程も本発明に適しており、基質が発酵の進行と共に増加して添加されること以外は典型的なバッチ方式からなる。フェドバッチ方式は、異化の抑制が細胞の代謝を阻害する傾向にあり、培養液における基質の量を制限するのが望ましい場合に有用である。フェドバッチ方式における実測基質濃度の測定は困難であり、それゆえ、例えば、pH、溶存酸素量、及び廃ガス(例えば、CO2)の分圧等の測定可能な因子の変化に基づいて推測される。バッチ及びフェドバッチ発酵は、当該技術分野において広く周知である。
連続発酵は開放系であり、所定の発酵培養液が連続的にバイオリアクターへ添加され、それと同時に、同量のならし培養液(conditioned media)が工程から除去される。一般に、連続発酵では、培地は一定の高密度に維持され、細胞は主として対数期成長にある。
連続発酵により、細胞の成長又は最終生成物の濃度に影響を与える１又はそれ以上の因子の調節が可能となる。例えば、１の方法は、栄養分(例えば、炭素源)又は固定速度の窒素量の制限を維持し、その他全ての因子の緩和を可能にする。別の方式では、培養液の濁度により測定される細胞濃度を一定に保ちつつも、成長に影響する多くの因子を連続的に変化させることができる。連続方式は定常状態の成長条件を維持することに努め、従って、排出される培養液に依存する細胞の損失は、発酵における細胞成長速度に対して均衡になる必要がある。連続発酵工程における栄養分及び成長因子を調節する方法は、生成物の生成速度を最大化する技術と同様に、工業的微生物学の分野において周知である。
GSHE活性の同定
本発明に包含されるGSHEをコードする異種ポリヌクレオチドで形質転換された細胞株によるGSHEの発現を評価するために、タンパク質レベル、RNAレベル又は特に、グルコアミラーゼ活性及び/又はグルコアミラーゼ生産等のバイオアッセイにる、アッセイを行うことができる。
通常、GSHEの発現を解析するためのアッセイは、ノザンブロッティング、ドットボロッティング(DNA又はRNA解析)、RT-PCR(逆転写ポリメラーゼ連鎖反応)、又は適切なラベルプローブを用いたin situハイブリダイゼーション、及び簡便なサザンブロット及びオートラジオグラフィーである。加えて、GSHEの生産及び/又は発現はサンプルを直接測定、例えば、培養培地中のグルコースを直接測定することにより、又はグルコアミラーゼ活性を直接測定することにより、発現及び/又は生産を測定することができる。GSHE活性を測定するのに適した基質は、顆粒デンプン基質である。例えば、グルコース濃度は、グルコース試薬キットNo.15-UV(シグマケミカル社)又はテクニコンオートアナライザー(Technicon Autoanalyzer)等の機器等の方法により決定される。Instrumentation Lab.(Lexington、 MA)より市販されているグルコースオキシダーゼキット及びグルコースヘキソースキットも利用可能である。グルコアミラーゼ活性は3,5-ジニトロサリチル酸(DNS)法によりアッセイすることができる(Goto et al., (1994) Biosci. Biotechnol. Biochem. 58:49-54参照のこと)。一の非限定的な例において、rGSHEは水中に15%のデンプン固形含量の顆粒デンプンを、乾燥固形ベースで、少なくとも90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%及び99%重量グルコースに加水分解する能力を有する。
本発明の一に態様において、組換え宿主によるrGSHEの発現は、培養培地1リットル中1グラムタンパク質以上である。好ましくは、幾つかの態様において、組み換え宿主は、トリコデルマ(Trichoderma)又はアスペルギウス(Aspergillus)宿主である。幾つかの態様において、組換えトリコデルマ(Trichoderma)宿主により発現されるGSHEの量は2g/L培養培地である。他の態様において、組換えトリコデルマ(Trichoderma)宿主によるGSHE発現の量は、5g/L以上である。更なる態様において、組換えトリコデルマ(Trichoderma)宿主によるGSHE発現の量は、10g/L以上である。発現されたGSHEの量は、場合によっては、20
g/L以上、25 g/L以上、30g/L以上及び50g/L培養培地以上である。
加えて、タンパク質発現は、細胞、組織切片の免疫組織染色、又は組織培養培地の免疫アッセイ例えば、ウエスタンブロット又はELASA等の免疫学的法により評価することができる。そのような免疫アッセイはGSHEの発現を量的及び質的に評価することに用いることができる。そのような方法の詳細は、当業者に知られており、そのような方法に用いる多くの試薬が市販されいてる。
典型的なアッセイ方法は、ELISA、競合免疫アッセイ、ラジオイムノアッセイ、ウエスタンブロット、間接免疫蛍光法及び同種のものを含む。通常、市販の抗体及び/又はキットがGSHEの発現レベルの定量的イムノアッセイに用いられる。
GSHEの精製方法
通常、細胞培養の中で生産されるGSHE(nGSHE又はrGSHE)は、培地の中に分泌され、例えば、この培養培地から、不要な成分を除去することにより精製又は単離される。幾つかのケースにおいて、GSHEは細胞内で生産されるため、細胞溶解物からの回収工程が必要となる。そのようなケースにおいて、当業者が通常用いる技術を用いて、細胞から酵素が精製される。このような技術の例は、親和クロマトグラフィー(Tilbeurgh et al., (1984)
FEBS Lett. 16: 215)、イオン交換クロマトグラフィー法((Goyal et al., (1991) Biores. Technol. 36: 37、Fliess et al., (1983) Eur. J. Appl. Microbiol. Biotechnol. 17: 314、Bhikhabhai et al., (1984) J.Appl.Biochem. 6: 336及びEllouz et al., (1987) Chromatography 396: 307)、高分解力を有する物質を用いたイオン交換法(Medve et al., (1998) J.ChromatographyA 808: 153)、疎水相互クロマトグラフィー(Tomaz and Queiroz, (1999) J.ChromatographyA 865: 123、二相分離(Brumbauer et al., (1999) Bioseparation 7: 287)、エタノール分離、逆相HPLC、シリカ又はDEAE等のカチオン交換によるクロマトグラフィー、クロマトフォーシング、DSD-PAGE、硫酸アンモニウム沈殿法及び例えば、Sephadex G-75を用いたゲルろ過である。精製の程度は、GSHEの用途により変動する。精製の必要のない場合もある。
幾つかの態様において、組換え的に発現されたGSHEはトリコデルマ(Trichoderma)宿主由来である。他の態様において、トリコデルマ(Trichoderma)宿主はフミコーラグリセア(Humicola grisea)株、特にフミコーラグリセアvar.セルモイデア(Humicola grisea var. thermoidea)の株由来のGSHEをコードしている異種のポリヌクレオチドを発現する。他の態様おいて、トリコデルマ(Trichoderma)は、組換えGSHEを発現し、その異種のポリヌクレオチドは配列番号3と少なくとも50%の配列同一性を有するGSHEをコードしている。
幾つかの態様において、トリコデルマ宿主は、アスペルギウスアワモリ(Aspergillus awamori)株、特に、アスペルギウスアワモリvar.カワチ(A. awamori var. kawachi)由来のGSHEをコードする異種ポリヌクレオチドを発現する。他の態様において、当該トリコデルマは、組換えGSHEを発現し、その異種ポリヌクレオチドは配列番号6と少なくとも50%の配列同一性を有するGSHEをコードしている。
組成物及びプロセス条件
GSHEが無細胞抽出物から提供されるか、又は培養培地(発酵ブロス)からから提供されるかにかかわらず、顆粒デンプンを加水分解し、グルコースシロップを生産するために、GSHEを発現及び分泌する糸状菌細胞、顆粒デンプン基質を含むこの、好ましくはスラリー形態のものを、GSHEとアルファアミラーゼ(referred to herein as simultaneously)に、同時に接触させることが必要である。顆粒デンプンの加水分解は一段階プロセスである。
GSHEは、10乃至55%の乾燥固形含量になるように、約0.01乃至10.0 GSHE U/gデンプンの間の量を、アルファアミラーゼ及び顆粒デンプン基質を含む組成物の中に添加する。幾つかの態様において、このGSHEは約0.01乃至5.0 GSHE U/g、約0.01乃至2.0 GSHE U/g、約0.01乃至1.5 GSHE U/g、約0.05乃至1.5 GSHE U/g、約0.1乃至5.0 GSHE U/g、約0.1乃至1.0 GSHE U/g、約0.25乃至2.5 GSHE U/g、約0.5乃至5.0 GSHE U/g、及び約0.5乃至1.0 GSHE U/g、の間の量になるように組成物に添加する。幾つかの好ましい態様において、GSHEは0.05乃至1.5 GSHE U/g、0.1乃至2.0 GSHE U/g、及び、0.1乃至1.0 GSHE U/g、の間の量になるようにそのような溶液に添加される。
更なる態様において、GSHEは必ずアルファアミラーゼと同時に顆粒デンプンスラリー組成物に添加される。このスラリーは、10乃至55%ds、好ましくは20乃至45%dsに調製される。特定の態様において、このアルファアミラーゼはデンプン1メートルトン当たり約0.01乃至1.0
kgのGZYME997の幅で添加される。
一の態様において、顆粒デンプンは、無細胞ろ過物(GSHEが培養培地から単離されている)として利用可能であるGSHEに接触させる。他の態様において、この顆粒デンプン基質は、
分泌されたGSHE及び糸状菌細胞を含む培養培地中にあるGSHEと接触させる。好ましくは、このGSHEは、顆粒デンプン加水分解活性を有し、 配列番号3又は配列番号6と少なくとも、90%、少なくとも95%、及び少なくとも98%の配列同一性を有するポリペプチドをコードする異種のポリヌクレオチドを含むトリコデルマレーシ(Trichoderma reesei)から分泌される。
本発明の方法は、基質の顆粒デンプンのゼラチン化温度以下の温度で行われる。幾つかの態様において、この方法は少なくとも約25℃、30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃、及び75℃の温度で行われる。他の態様において、この方法は65℃以下、及び60℃以下の温度で行われる、他の態様において、この方法は約30℃及び65℃の間の温度、約35℃及び65℃の間の温度、約40℃及び65℃の間の温度、約45℃及び65℃の間の温度、及び約50℃及び65℃の間の温度の間の温度で行われる。この方法に用いる温度は、デンプン基質により、より詳しくは、植物種により異なる。幾つかの態様において、トウモロコシが顆粒デンプン基質であるときには、この温度は、55℃乃至65℃の間の温度、より具体的には60℃乃至65℃の温度で行われる。
表2は、幾つかの顆粒デンプンのゼラチン化温度の幅を示している。この表は、各種植物供給源からのものを示しており、本発明をこれらの植物に限定することを意図するものではなく、参考として提供するものである。
Figure 0005091484
 本発明の方法におけるpHの幅は、約pH3.0乃至pH6.5の幅、約pH3.5乃至pH6.5の幅、約pH4.0乃至pH6.5の幅、約pH4.5乃至pH6.5の幅、が用いられる。このpH幅は、酵素の種類に依存しており、当業者は、実験を行うことなしに、pHの幅を決定することができる。幾つかの態様において、トウモロコシが基質である場合には、約pH4.5乃至6.0の幅及びpH5.0乃至5.5の幅が用いられる。
幾つかの態様において、少なくとも50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、94%、95%、96%、97%、98%及び99%の顆粒デンプンの乾燥固形分がグルコースシロップの成分に転換される。幾つかの態様において、この顆粒デンプン基質は完全に加水分解される。特定の態様において、少なくとも90%の顆粒デンプン基質が24時間以内に加水分解される。他の態様において、本発明に従って生成されたデキストロースシロップは少なくとも90%グルコースを含む32乃至46%dsシロップに転換される。
幾つかの態様において、グルコースシロップを生産するために顆粒デンプンを加水分解するのに必要な時間は、約2乃至100時間である。幾つかの態様において、この時間は約5乃至100時間である。他の態様において、この時間は、約10乃至100時間である。更なる態様において、この時間は5乃至50時間である。他の態様においてこの時間は少なくとも約10時間であるが、約50時間未満である。5乃至50時間で一段階プロセスを行うことが好ましい。
好ましくは、可溶化された組成物中のグルコース産生(総可溶化固形乾燥物に対するグルコースのパーセント)は、約85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、95.5%、96%、96.5%、97%、97.5%、98%、98.5%、99%及び99.5%である。より好ましくは、この産生は少なくとも約95%、及び最も好ましくはこの産生は少なくとも96%である。
本発明の組成物及び方法に含まれる成分の正確な量は、処理される顆粒デンプンのタイプだけでなく酵素組成物にも依存している。幾つかの態様において、GSHE単位に対するアルファアミラーゼの比(アルファアミラーゼ：GSHE)は15：1乃至1：15、幾つかの態様においては、10：1乃至1：10である。他の態様において、この比は5：1乃至1：5であり、更なる態様においては、アルファアミラーゼ：GSHEの比は4：1乃至1：4である。好ましい態様において、この比は2：1乃至1：4であり、最も好ましい態様においてこの比は、2：1乃至1：2である。
本発明に包含される一段階プロセスはデンプンの加水分解の効果を減少させることなく、更なる成分を含むこともできる。これらの更なる成分はセルラーゼ、プロテアーゼ、プルラナーゼ、ヘミセルラーゼ、キシラナーゼ等の酵素を含むがこれらに限定されない。
本発明に従って製造されるグルコースは当該技術分野の既知の方法で分離される。これらの方法は、遠心分離、簡便なろ過法、及び好ましくは、膜分離を含む。精密ろ過膜システムの使用も意図する。グルコースシロップは分子量カットオフ(MWCO)精密ろ過膜を用いたろ過により分離される。これらの膜は当業者に知られている。幾つかの態様において、この膜は、1,000乃至1,000,000 MWCOである。他の態様において、分離膜は、0.1乃至1.0ミクロフィルタータイプの膜である。
グルコースから最終生成物への更なる転換
本発明に包含されている方法において、グルコースシロップは好ましい最終生成物である。しかしながら、グルコースは既知の方法を用いて結晶性デキストロースを生産するために更に精製することもできる。
グルコースは他の最終生成物に転換することもできる。グルコースから他の所望の最終生成物への転換は、酵素又は化学的方法の任意の方法を用いて行うことができる。一の態様において、転換は本発明により得られたグルコースをグルコースを最終生成物に転換する能力を有する微生物に接触させることにより行われる。接触工程は、本発明で生産されたグルコースシロップが所望の最終生成物を生産ために微生物と接触させることを特徴とする、連続工程であるか、あるいは、顆粒デンプン基質を、GSHE及びアルファアミラーゼを酵素により生産されるグルコースシロップを最終生成物に転換する能力を有する微生物と、組み合わせて、接触させる同時工程である。この微生物は、野生型、変異又は組換え微生物である。幾つかの態様において、所望の最終生成物は、フルクトース、グルコネート、2-ケト-D-グルコネート、2,5-ジケト-D-グルコネート、2-ケト-L-グルコン酸、イドン酸、エリソルビン酸、アスコルビン酸等のアスコルビン酸(ASA)中間体、エタノール、1,3-プロパンジオール、グルタミン酸1ナトリウム、アミノ酸、糖アルコール、有機酸及びインディゴである。
フルクトースが所望の最終生成物であるとき、本発明により得られたグルコースシロップはグルコースイソメラーゼによりフルクトースシロップに酵素転換される。幾つかの態様において、このグルコースイソメラーゼは、固定化されている。意図するグルコースイソメラーゼは、GZYMET G993液体及びGENSWEET (ジェネンコーインターナショナルインク) 並びに SWEETZYME T (ノボザイム)等の市販の酵素を含む(例えば、米国特許Nos.3,939,041及び4,687,742参照のこと)。
ASA中間体及びASAが所望の最終生成物であるとき、本発明により得られたグルコースシロップ、例えば、グルコースデヒドロゲナーゼ(又はグルコースオキシダーゼ-カタラーゼ酵素)を用いて、グルコネートに生物学的に転換される。グルコネートは、2,5-ジケト-D-グルコネート(DKG)にDKGリダクターゼにより酸化される。DKGは、KLGリダクターゼにより2-ケト-L-グルコン酸(KLG)に還元される。KLGはその後ASAに転換される。グルコースからASA及びASA中間体に転換するための方法は、当業者に知られている(例えば、米国特許Nos.4,945,052、5,008,193、5,817,490及び6,358,715参照のこと)。
1,3-プロパンジオールが所望の最終生成物であるとき、本発明に従って得られたグルコースは、大腸菌又は他の組換え微生物に接触される(例えば、米国特許Nos.6,013,494及び5,356,812参照のこと)。
エタノールが所望の最終生成物であるときには、グルコースはエタノールを得るために、酵母及びサッカソマイセスセレビシエラ(Saccharomyces cerevisiae)に、順番に又は同時に接触させる(例えば、米国特許No.4,316,956参照のこと)。本発明に用いることができるエタノール生産微生物の更なる例は、ジモモナスモビリス(Zymomonas mobilis)等のアルコールデヒドロゲナーゼ及びピルビン酸デヒドロゲナーゼを発現しているものである。酵母を用いた発酵が終了すると、エタノールが例えば蒸留により回収され、携帯燃料及び工業的エタノール生産に使用される。発酵の生成物である液体及び固体の両物質は、分離され更に利用することができる。例えば、回収された固形物質は、可溶性分を含む蒸留固形穀物(DDGS)を形成する液体副生成物を含む蒸留固形穀物とDDSの混合物は動物の飼料として使用される。発酵の間のエタノール生成に用いられる酵母及びエタノール生産物の使用は更にTHE ALCOHOL TEXTBOOK, A REFERENCE FOR THE BEVAR.AGE, FUEL ANDINDUSTRIAL ALCOHOL INDUSTRIES, 3rd Edition, Eds K. A. Jacques et al.,
1999, Nottingham Univar. Sity Press, UKに記載されている。
本発明の幾つかの態様において、グルコースシロップが、例えば、上で説明した遠心分離又はろ過により反応混合物から分離される場合、残った組成物は残余デンプンを含む。この残余デンプン副生成物は様々な用途に用いられる。例えば、残余デンプンは本発明の発明の方法における成分として再利用される。残余デンプンは更なる発酵の原料として利用される。残余デンプンは簡便なデンプン加水分解工程に用いられる。及び残余デンプンは、食品の成分として用いられる。本発明の一の好ましい態様は、グルコースシロップを得るために、顆粒デンプンを加水分解するために、顆粒デンプンのゼラチン化温度よりも低い温度で、GSHEとアルファアミラーゼとを顆粒デンプン基質に同時に接触される工程、グルコースシロップ成分を得るために、反応混合物からグルコースシロップを分離する工程及び残余デンプンを含む副生成物を利用する工程を含む。
本発明の幾つかの態様において、残余デンプンが再利用工程に用いられ、本発明の方法に用いられ、残余デンプンが、顆粒デンプン基質のゼラチン化温度以下の温度でGSHE及びアルファアミラーゼを含む組成物に接触させる。この残余デンプン成分は、分離膜により保持された及び/又は反応器に新しく添加されたGSHE及びアルファアミラーゼ酵素を含む。幾つかの態様において、接触工程も同時に兼ねている再利用工程は、多くの回数繰り返され、及び更にこの再利用工程においてグルコースシロップが既知の手段より分離される。反応器又は反応管における各種組成物の接触時間は、上で説明した2乃至100時間と同じ時間である。好ましい態様において、停滞時間は5乃至50時間の９間の時間である。
再利用工程の態様において、残余デンプンがグルコースシロップを製造するために用いられる。一の非限定的な例は、顆粒デンプンスラリー(すなわち、38乃至42%ds)を有するトウモロコシデンプン)が、約58乃至62℃、及びpH5.0ないし6.0で20乃至24時間、フミコーラ(Humicola GSHE)(すなわち、1.0GSHE U/g)及びSPEZYME
エチル(すなわち、0.6 AU/g)で加水分解され、少なくとも55%のトウモロコシデンプンが少なくとも90%のグルコースを含グルコースシロップを生産する。その後、残余デンプンが回収され、懸濁され、GSHE及びアルファアミラーゼを用いた第二ラウンドに利用される。第二ラウンドにおいて、少なくとも90%のデンプンが、少なくとも90%のグルコースを生産するため加水分解される。このグルコースシロップは、バキューム等の当業者に既知の方法により濃縮され、グルコース原材料として利用される。
再利用工程において、残余デンプンはグルコース以外の最終生成物を得るために再利用される。例えば、最終生成物がエタノールである場合、顆粒デンプンを加水分解しエタノールを生産するために、顆粒デンプン基質は、別々に、連続的に、又は同時のいずれかで、GSHE、アルファアミラーゼ及びエタノール生産微生物と、接触させ、エタノールを蒸留より分離する。残余デンプンを含む固形及び液体成分を含む残った物質が再利用され、再利用条件下で行われる再利用工程等の更なる工程に、GSHE及びアルファアミラーゼと同時に用いられる。
実施例
以下の開示及び実施例の章において、以下の略語が使用される。
rH-GSHE (トリコデルマレーシ(Trichoderma reesel)内で発現されたフミコーラグリセアvar.セルモイデア(Humicola grisea var. thermoidea GSHE)；wt% (重量パーセント)；℃ (摂氏温度)；rpm (一分間当たりの回転数)；H20 (水)；dH20 (脱イオン水)；bp (ベースペア)；kb (キロベースペア)；kD (キロダルトン)；gm (グラム)；μg (マイクログラム)；mg (ミリグラム)；ng (ナノグラム)；μl (マイクロリットル)；ml及びmL (ミリリットル)；mm (ミリメーター)；nm (ネノメーター)；μm (マイクロメータ)；M (モル)；mM (ミリモル)；μM (マイクロモル)；U (単位)；V (ボルト)；MW (分子重量)；sec (秒)；min (s) (分)；hr (s) (時間)；PAGE (ポリアクリルアミド電気泳動)；Di (脱イオンされた)；フタル酸緩衝液(水中20 mM のフタル酸ナトリウム、pH 5.0)；セレスター(Cerestar) (セレスター社(Cerestar,Inc、カルギル社(Cargill Inc.)ミネアポリス、ニュージャージ)；アビセル(AVICELL)(登録商標)(FMC コーポレーション)；SDS (ドデシル硫酸ナトリウム)；トリス (トリス (ヒドロキシメチル) アミノメタン)；w/v (容量対重量)；v/v (容量対容量)；ジエンコー(Genencor) (ジェネンコーインターナショナル、パロアルト、カリフォルニア)；新日本 (新日本,日本)。
一般法
デンプン基質-精製された及び/又は細かく粉砕された、トウモロコシデンプン、コムギデンプン及びタピオカデンプンが以下の実施例に用いた。
オリゴサッカライドアッセイ-オリゴヌクレオチドの反応生成物の組成は、屈折率(RI)検出器(アンスペック社(The Anspec Company, Inc.)のERC-7515A検出器)及び50℃に維持されたHPLCカラム(Rezex8 u8% H, Monosaccharides)、を装備した高圧液体クロマトグラフ法(Beckman System Gold 32 Karat Fullerton, California, USA)を用いて測定した。希硫酸(0.01N)を、0.6ml/分の流速で、移動相として使用した。20mlの0.4%溶液を、カラムに付加した。このカラムは、糖の分子重量に基づいて、分子を分離する。例えば、DP1の表記は、グルコース等の単糖類である。DP2の表記は、マルトース等の、二糖類である。DP3の表記は、マルトトリオース等の三糖類である。そして、DP4の表記は、重合度が4以上のオリゴ糖類である。
固形物の相対的可溶化(度)-簡便な低温で行われるジェットクッキング工程は可溶化したデンプンを用いる(米国特No.3,912,590)。このとき測定されたブリックスは、デンプンの100%可溶化として用いられる。典型的なジェットクッキング工程において、150グラムのデンプンを350グラムの水に溶解した30%デンプンスラリーを調製する。NaOHを用いてpHを5.8に調整した。熱安定性アルファアミラーゼ、SPEZYME FRED(ジェネンカーインターナショナル)を、0.4kg/MT ds添加し、105℃に維持したジェットクッカー(圧力鍋)を用いて、8分間加熱した。ゼラチン化したデンプンを更に95℃で90分間加水分解した。加水分解物のアリコートを回収し、遠心分離を行った。透明な上清をブリックス(ABBE リフレクトメーター,アメリカンオプティカルコーポレーション(American Optical Corporation)化学機器部門(
Scientific Instrument Division)バファロー、ニューヨーク)の測定に用いた。異なる30%dsデンプン基質に対する100%可溶化デンプンのブリックスを表3に示し、異なる処理条件下におけるデンプンの相対的可溶化度の計算に用いた。代替的に、5mlのアリコートを10μLのSPEZYME FRED(ジェネンカーインターナショナルインク)を用いて、95℃で5分間インキュベートすることにより異なる条件下における100%可溶化のブリックスを、決定した。高温で処理したサンプルを、85℃で2時間維持した。不溶性固形物を遠心分離により分離し、透明な上清のサンプルを測定した。
Figure 0005091484
 以下の実施例は、特定の好ましい態様及び本発明の側面を説明し、更に詳細に示すために提供され、本発明の範囲を限定するのもではない。すなわち、これらの示唆は本明細書で開示されている工程を更に最適化するために用いられる。
トリコデルマレーシ(Trichoderma reesei)におけるフミコーラグリセアvar.セルモイデア(Humicola grisea var. thermoidea)GSHE遺伝子の発現

A.フミコーラグリセアvar.セルモイデア(Humicola grisea var. thermoidea)GSHE遺伝子のクローニング
凍結スキタリジウムセルモフィリラム(Scytalidium thermophilum)(ATCC 16453、アナモルフ(anamorph)、フミコーラグリセアvar.セルモイデア(H. grisea var. thermoidea)
の菌糸からゲノムDNA (配列番号1)を抽出した。この凍結菌糸をコーヒーミルの中でドライアイスと一緒に粉砕し、Easy DNAプロトコル(インビトロジェン)によりDNAを抽出した。クロロホルム/フェノール/イソアミルアルコール抽出工程をこの標準的な手順に追加した。NCBI データベース登録番号＃M89475 配列にもとづいてPCRプライマーを設計した。以下のプライマーはpENTR/Dベクター(インビトロジェン)内でクローニングするためのモチーフを含んでいる。
このRSH003fプライマーは、CAACATGCATACCTTCTCCAAGCTCCTC (配列番号7) 及びRSH004r プライマーの配列はTTAACGCCACGAATCATTCACCGTC(配列番号8)である。
インビトロジェンゲートウェイシステムプロトコルに従ってPCR生成物をpENTR/D内へクローンした。このベクターは、その後化学的にコンピテント(competent)なTop10大腸菌 を形質転換し、カナマイシン選択された。幾つかのクローンからのプラスミドDNAが正確なサイズの挿入を確認するために制限酵素で消化された。いくつかのクローンからのgla1挿入が配列決定(Sequetech, Mountain View, CA)された。一のクローンからのプラスミドDNA、pENTR/D_N13pをTrex3glamdSデスティネーション(destination)ベクターDNAと共にLRクロナーゼ反応(インビトロジェン ゲートウェイシステム)に添加した。LPクロナーゼ反応における組換えは、デスティネーションベクターのCmR及びccdB遺伝子と、pENTR/Dベクターからのフミコーラグリセア(H. grisea)gal1とを置換した。組換えは、gal1を、デスティネーションベクターのcbh1プロモーターとターミネータとの間に挿入した。48及び50bpの組換え部位配列はそれぞれgal1の上流及び下流に残っていた。LRクロナーゼ反応のアリコートは化学的にコンピテントなTop10大腸菌 を形質転換し、一晩、カルベニシリンで選択条件で育成した。いくつかのクローンからのプラスミドDNAが正しい挿入サイズを確認するために適切な制限酵素で消化された。cbh1プロモーター：gla1：cbh1ターミネーター：amdSを含む発現カセットを切り離すためにクローンからのプラスミドDNA、pTrex3g_N13(図3及び図4参照)をXbal1で消化した。6.6kbのカセットを標準技術を用いたアガロースゲル抽出法により精製し、以下でさらに述べるようにして、公知の入手可能なQM6aのトリコデルマレーシ(T. reesei)株を形質転換した。

このカセットをSequetech, Mountain View, CAを用いて配列決定し、GSHEに対するDNAを図1(配列番号1)に、アミノ酸配列を図2(配列番号2及び3)に示した。
B.トリコデルマレーシの形質転換
菌糸の胞子を有する約2 cm2のプレート(5日間30℃でPADプレート上で育成したもの)を250mlの4バッフルの振とうフラスコ内の50mlのYEGブロス(5g/Lイースト抽出物及び20g/Ｌグルコース)に接種し37℃で16乃至20時間200rpmでインキュベーションした。インキュベーションしたものを50mlのコニカルチューブ内に移し2500rpmで10分間遠心して菌糸を回収した。上清を別容器に移した。菌糸のペレットは40mlのフィルターろ過したβ-Dグルカナーゼ溶液を含む250mlの0.22ミクロンCAコーニングフィルターボトルへ移し、形質転換のためのプロトプラストを育成するために30℃で200rpmで2時間インキュベーションした。
プロトプラストを滅菌ミラクロスから50mlのコニカルチューブにろ過することにより回収した。それらは、2000rpmで5分間遠心分離することによりペレット形成し、アスピレータで乾燥させた。このプロトプラストペレットを、1.2Mソルビトール50mLで一度洗浄し、遠沈し、アスピレータで乾燥した。25mlのソルビトール/CaCl2で洗浄した。このプロトプラストをカウントし、その後、2000rpm、5分間でペレット形成した。上清を別容器に移し、プロトプラストペレットを1mlあたり1.25×108のプロトプラスト濃度を調製するのに十分量のソルビトール/CaCl2の量の中に懸濁して、プロトプラスト溶液を調製した。
20μLまでの発現ベクターDAN(20μL以下の容量)のアリコートを15mlのコニカルチューブに入れ、氷上に置いた。その後に200μLのプロトプラスト懸濁液を50μLのPEG溶液とともに各形質転換アリコートに添加した。チューブをおだやかに撹拌し、氷上で20分間インキュベートした。2mlのPEG溶液をアリコートチューブに添加し、それらを室温で5分間インキュベートした。ソルビトール/CaCl2溶液、4mlをこのチューブに添加した(総容量が6.2mlになる)。形質転換混合物を3のアリコートに約2mlずつ添加した。各3のアリコートに3の溶解したトップアガーを添加することによりオーバーレイ混合物を作成し(温度を50℃に維持し融解状態を保った)、このオーバーレイ混合物を形質転換プレート上に注いだ。形質転換プレートは30℃で7日間インキュベートした。
形質転換体のamdS選択を行った。アセトアミド/ソルビトールプレート及びトップアガーを形質転換に用いた。トップアガー(Top ager)は、ノーブルアガー(Noble ager)の代わりに低融点アガロースを用いた以外は、プレートであるスルビトール/アセトアミドアガー レシピと同様に調製した。形質転換体は、アセトアミドを含む新しい選択培地(すなわち、スルニトールを含まないソルビトール/アセトアミドアガー)に移すために単離されコロニーを移すことにより精製された。
本実施例に用いた溶液を以下のように調製した。
1) 40mlのβ-D-グルカナーゼは、600mgのβ-D-グルカナーゼ(InterSpex Products Inc., San Mateo, CA)及び400mgのMgSO4・7H2Oを含む1.2Mのソルビトールから調製した。
2) 50gのPEG4000(BDH Laboratory Supplies Poole, England)及び1.47gのCaCl2・2H2Oを含む200ml PEGはdH2Oを用いて調製した。
3) ソルビトール/CaCl2は、1.2Mのソルビトールと50mMのCaCl2を含む。
4) アセトアミド/ソルビトールアガー；
パート1-0.6gのアセトアミド(Aldrich,99% 昇華)、1.68gのCsCl、20gのグルコース、20gのKH2PO4の0.6gのMgSO・7H2O、0.6gのCaCl2・2H20,1mlの1000 x 塩(以下参照)をpH5.5に調製し,dH2Oで300mlにメスアップし、滅菌フィルター処理をした。
パートII-20gのノブルアガー(Noble ager及び218gのソルビトールをdH2Oで700mlにメスアップし、オートクレーブ滅菌をした。
パートIII-パートIの調製物を最終容量を1Lにした。
5)1000 x 塩-5gのFeS04・7H2O,1.6gのMnS04・H20、1.4gのZnS04・7H2O,1gのCaCl2・6H2Oを混合し、dH2Oを用いて容量を1Lに調整し、フィルター滅菌をした。
C.フミコーラグリセアvar.セルモイデア(H. grisea var. thermoidea) GSHE遺伝子により形質転換されたトリコデルマレーシ(T. reesei)の発酵
一般的に、Foreman et al., (Foreman et al. (2003) J.Biol.Chem 278: 31988-31997)に説明されている発酵手順は以下のようである。より具体的には、図5に示した各株に対して2回の発酵を行った。1.5ml凍結スポア懸濁液を5%のグルコースを含む0.8Lのボゲルズ最小培地(Vogels minimal medium)(Davis et al., (1970) Methods in Enzymology 17A, pg 79-143 and Davis, Rowland, NEUROSPORA, CONTRIBUTIONS OF A MODEL ORGANISM, Oxford Univar. Sity Press,(2000))に接種した。48時間後、各培地を、14Lのバイオラフィット(Biolafitte)発酵槽中にある6.2Lの同じ培地に移した。発酵は25℃、750RPM及び1分間あたり8リットルの空気速度で行った。1時間後、最初に添加されたグルコースが全て消費された。25%(W/W)ラクトースの供給をラクトースの蓄積による炭素制限が生じないように供給した。グルコース及びラクトースの濃度は、グルコースオキシダーゼキット又はラクトースを切断するβガラクトシダーゼを用いたグルコースヘキソキナーゼアッセイキットにより、それぞれモニターされた(Instrumentation Laboratory Co., Lexington, MA)。発酵の進行具合をモニターするため定期的にサンプルを採取した。収集されたサンプルを、50mlの遠心管に移し、International Equipment Company (Needham Heights, MA) clinical centrifugeにおいて3/4スピードで遠心分離した。
サンプルの上清を、MOPS(モルフォリンプロパンスルホン酸)SDS緩衝液及びLDSサンプル緩衝液を用いた条件下で4乃至12%のBIS-TRIS SDS PAGEゲルを用いて電気泳動を行った。結果を図5に示す。レーン3、4及び5は、異なる時間におけるrGSHEの68 kDのバンドが見られた。
D.形質転換されたトリコデルマレーシ(Trichoderma reesei)クローンのGSHE活性のアッセイ
酵素活性-GSHE活性は、酵素調製液のアリコートを用いて、50℃、pH4.5、5mlの10%顆粒コーンスターチを含む0.1M酢酸バッファー中で、インキュベーションしたときに、1分間あたりに放出される還元糖のミリグラムを用いて決定される。GSHEの1の単位は、この条件下で1.0mgの還元糖を1分間放出する。
フミコーラグリセアvar.セルモイデア(Humicola grisea var. thermoidea)由来の天然のGSHE(nGSHE)及びトリコデルマレーシ(T. reesei)由来の組換えGSHEを、フェニルセファロースを用いた疎水相互クロマトグラフィー(Amersham Biosciences, Piscataway,NJ)で処理し、その後にSP-セファロースを用いたイオン交換クロマトグラフィー(Amersham Biosciences, Piscataway, NJ)を用いた標準技術により精製した。最初にトリコデルマレーシ(T. reesei)クローンにより発現された組換えGSHEは、ほぼ同じ濃度のタンパク質分画を含んでいた。これらのピークをrGSHE1及びrGSHE2とした。これらのピークは、1500Dによる、及び、輸送マススペクトロメーター(voyageur mass spectrometer)(Applied Biosystems, Foster City, CA)におけるマトリックス支援レーザーイオン化(MALDI-TOF)により測定される0.3pH単位によるマスにおいて、及び製造会社の説明書に従った等電点フォーカシングゲルにおいて違いが見られた。rGSHE1及びrGSHE2の、生デンプン加水分解アッセイにより測定された比重、及びMicroBCA タンパク質アッセイキット(Pierce, Rockford,IL)を用いて測定したタンパク質及び溶液中の消散係数のパーセンテージは同じであった(A280 0.1%
= 1.963)。初期のrGSHE発現の後約72時間、1のみのrGSHEが存在していた(rGSHE3)(表4参照のこと)。
Figure 0005091484
 GSHEの総炭水化物量%は、4Nのトリフルオロ酢酸を用いて、100℃で5時間、酸加水分解をすることにより決定された。測定値は、パラヒドロキシ安息香酸複合体を用いて、放出された還元糖を測定することにより決定された。
初期の発現のときに、rGSHE1及びrGSHE2は総炭水化物含量の2.70%を占めていた。しかしながら、72時間後、培地中のrGSHE3の糖化レベルは総炭水化物のうちの0.57%であった。天然GSHEの糖化レベルは1.12%であった。
E.フミコーラグリセアvar.セルモイデア(H. grisea var. thermoidea)由来の天然GSHE及びトリコデルマレーシ(Trichoderma reesei)中で発現した組換えフミコーラグリセアvar.セルモイデア(H. grisea var. thermoidea)
GSHEの比較
（1） pH3乃至7のpH安定性
上で説明したように組換え的に生産されたGSHEの収集サンプル及び天然GSHEの収集サンプルをpH4.5の20 mM酢酸緩衝液を用いて、タンパク質濃度が同じになるように希釈した。その後、pH3乃至7の各pHレベルにおいて、100mMクエン酸/NaOH緩衝液で50℃、30分間反応を行った。
サンプルチューブ中にある1.0 mlの反応物に、100 mM酢酸 pH4.5中に10%のトウモロコシデンプンを含む溶液、5 mlを添加した。このチューブを50℃で20分間振とうした。0.5
mlの2.0%のNaOHを添加した。チューブを、遠心し、0.5 mlの上清を、ジニトロサリチル酸(DNS)アッセイ(Goto et al., (1994)上記)を用いて還元糖の放出についてアッセイした。
アッセイの結果を図8Aに示す。組換え的に生産されたGSHEはpH3.5において約80%の活性を有していた。対照的に対応する天然GSHEは約20%の残存活性を有していた。pH4.0におい組換えGSHE及び天然GSHEは約82%の残存活性を有しており、pH5.5において両酵素は約90乃至100%の残存活性を有していた。
上で説明した方法を用いてpH7.5乃至10.5における安定性も測定された。しかしながら、この試験においては、緩衝液は100 mMホウ酸/NaOH緩衝液であって。図8に示すように、pH7.5において、両酵素は約100%の活性を保持していた。pH8.5において、組換えGSHEは約82%の残存活性を示したのに対し、天然のGSHEは約90%の残存活性を有していた。pH9.5において、組換えGSHEの残存活性は天然GSHEよりも低かった(それぞれ、10%乃至72%であった)。
（2） 所定の温度における活性プロファイル
温度安定性はpH5.5で測定した。pH安定性試験と同じ手順を用いた。酵素サンプルを100 mM酢酸緩衝液に同じ濃度になるように希釈し、1.0 mlの希釈酵素を、40℃、50℃、60℃、及び70℃の温度のウォーターバス内で、10分間インキュベートし、活性をpH安定性の試験で述べたのと同様に測定した。結果を表5に示す。
Figure 0005091484
 組換えGSHEの各温度における活性プロファイルは、天然GSHEと同様であった。
（3） nGSHE及びrGSHEによる顆粒トウモロコシデンプンの加水分解
フミコーラグリセアvar.セルモイデア(H. grisea var. thermoidea)由来の天然GSHE(nGSHE)及びトリコデルマレーシ(T. reesei)において組換え的に発現されたフミコーラグリセアvar.セルモイデア(H. grisea var. thermoidea)(rGSHE)をpH4.5の酢酸緩衝液を用いて同じ濃度になるように希釈した。1mlの希釈物を20mMのpH4.5の酢酸緩衝液中に10%のトウモロコシデンプン(Cargill Foods, Minneapolis, MN)を含むスラリーの中に添加し、50℃において350rpmで振とうした。所定の時間間隔で、100μLのスラリーを採取し、10μLの2%NaOHを添加した。このサンプルを遠沈し、上清をMonarch clinical analyzer (Instrumentation Laboratory, Lexington, MA)において、グルコースオキシダーゼ反応を用いてグルコース(mg グルコース/mgタンパク質)をアッセイした。図9に示すように、トウモロコシデンプンの加水分解はnGSHEと比較してrGSHEがわずかに低かった。
トリコデルマレーシ(Trichoderma reesei)におけるアスペルギウスアワモリvar.カワチ(Aspergillus awamori var. kawachi)GSHEの発現

A. アスペルギウスアワモリvar.カワチ(Aspergillus awamori var. kawachi)遺伝子のクローニング
実施例1で説明した方法に従って、アスペルギウスアワモリvar.カワチ(Aspergillus awamori var. kawachi)株の凍結菌糸からゲノムDNAを抽出した。PCRプライマー配列はアスペルギウスアワモリvar.カワチ(A. awamori var. kawachi)グルコアミラーゼ GAI(Hayashida et al. (1989) Agric.Biol.Chem. 53: 923-929)に基づいて設計された。このGAIはGSHEである。Gateway(インビトロジェン)ディレクショナルモチーフCACCを含、CAC CAT GTC GTT CCG ATC TCT TCT C (配列番号9)を有するRSH10fプライマー、及び、CTA CCG CCA GGT GTC GGT CAC (配列番号10)を有するRSH10rプライマーを用いた。
DNA配列を図6(配列番号4)に示す。シグナルペプチドを含むコードされるGSHEポリペプチド配列を図7A(配列番号5)に示す。成熟タンパク質配列は図7Bに示す(配列番号6)。2.16
kbのPCR産物をゲル精製(ゲル精製キット、キアゲン)し、ゲートウェイシステムプロトコルに従いpENTR/D(インビトロジェン)内へクローンした。このベクターを化学的に適したTop10大腸菌(インビトロジェン)内へ形質転換しカナマイシン選択をした。幾つかのクローンからのプラスミドDNAを正しいサイズの挿入を確認するために制限消化した。幾つかのクローンからのGAI遺伝子挿入を配列決定した(Sequetech, Mountain View, CA)(配列番号4)。一のクローンからのプラスミドDNA、pENTR/D_Aｋ33xx#1、をpTrex3g/andS消化ベクターDNAと共にLRクロナーゼ反応(インビトロジェン、ゲートウェイシステム)に添加した。LRクロナーゼ反応における組換えは、消化ベクターのCmR及びccdB遺伝子とpENTR/Dベクターからのアスペルギウスカワチ(A. kawachi)GAIとを置き換えた。この組換えは、GAIを消化ベクターのcbh1プロモーター及びターミネータの間に方向付けて挿入する。48及び50bpのAttB組換え部位配列は、それぞれグルコアミラーゼの上流及び下流にそれぞれ残っていた。図3を参照していただきたい。この実施例において、フミコーラグリセア(H. griseag)gla1は、アスペルギウスカワチ(A. kawachi)GAIに置き換えられる。2μLのLRクロナーゼ反応物を化学的に適合なTop10大腸菌内へ形質転換し、一晩カルベニシリン選択条件下でインキュベートした。クローンからのプラスミドDNA、pTrex3g_Akxx#3をcbh1プロモーター：GAI：cbh1ターミネーター：amdSを含む発現カセットを切り離すためにXbalで消化した。この6.7kbカセットは標準技術を用いたアガロース抽出により精製され、公知の入手可能なQM6a株由来のトリコデルマレーシ(T. reesei)の株内へ形質転換された。
B. アスペルギウスアワモリvar.カワチ(Aspergillus awamori var. kawachi)遺伝子を有するトリコデルマレーシ(T. reesei)の形質転換
トリコデルマレーシ(T. reesei)の胞子懸濁液を、MABA形質転換プレートの中心から6 cmのところに広げた(5×107-5×108胞子/mlの懸濁液を150μL)。このプレートをその後、チャンバー内で風乾した。ストッピングスクリーン(Stopping screens)(BioRad 165-2336)及びマクロキャリアホルダー(macrocarrier holders)(BioRad 1652322)を70%のエタノールに浸し、風乾した。ドリライトデシキャント(DriRite desiccant)を小さなペトリ皿の上に置き、ワットマン(Whatman)フィルターペーパーを用いて積み重ねた。マクロキャリアーを含むマクロキャリアホルダーをフィルターペーパーの上に水平に置き、ぺトリ皿の蓋を置き換えた。
タングステン粒子の懸濁液を60 mgのタングステンM-10粒子(ミクロキャリアー、0.7ミクロン、バイオラド＃1652266)をエッペンドルフチューブ内で調製した。1mlのエタノール(100%)を添加した。このタングステンをエタノール溶液中で攪拌し、15分間浸した。このエッペンドルフチューブをタングステンペレットを作るために最大速度で短時間、遠心分離した。このエタノールを移し、脱イオン水で3回洗浄した。3回目の洗浄水を移した後、タングステンを1mlの滅菌グリセロールに懸濁した。このタングステンを、2週間おきに新しく調製した。
形質転換反応は25μLの懸濁されたタングステンを各形質転換のための1.5 mlのタングステン懸濁液に添加することによって調製した。添加に続いて、0.5乃至5μLのDNA(0.2乃至1μg/μL)、25μlの2.5 M CaCl2、10μLの0.1 Mのスペルミジンを順番に添加した。反応物はタングステンを懸濁状態に維持するために、5乃至10分間ボルテックスで激しく攪拌した。このエッペンドルフチューブを短時間遠心し、上清を別容器に移した。このタングステンペレットを200μLの70%エタノールで洗浄し、短時間遠心し、上清を別容器に移した。次いで、このタングステンペレットを、24μLの100%エタノールの中でピペットを用いて懸濁した。このエッペンドルフチューブを超音波水槽に15秒間静置し、8μLのアリコートを乾燥したマクロキャリアーの真ん中に移した。マクロキャリアーを乾燥したペトリ皿の中で乾燥させた。
Heタンクを1500 psiに調製した。1100 psiの大気放出板(バイオラド、165-2329)をModelPDS-1000/He Biolistic Particle Delivary System (BioRad)に用いた。タングステン溶液が乾燥したときに、停止スクリーン及びマクロファージホルダーをPDS-1000に挿入した。標的トリコデルマレーシ(T. reesei)胞子を含むMABAプレートを停止スクリーンの下6cmに置いた。29インチのHgのバキュームをチャンバー上に設置し固定した。He
Biolistic Particle Delivary Systemを照射した。チャンバー内を通気し、MABAプレートを28℃、5乃至7日間のインキュベートのために取り出した。
実施例2で用いた溶液は以下の様に調製した。
変更amdSBiolistic アガー(MABA)/L
パートI dH2O 500ml中
1000×塩 1 ml
ノベルアガー 20 g
pHを6.0に調製してオートクレーブ

パートII ｄH2O500ml中
アセトアミド 0.6 g
CaCl 1.68 g
グルコース 20 g
KH2PO 15 g
MgSO4・7H2O 0.6 g
CaCl2・2H2O 0.6 g

pHを4.5に調製し、0.2ミクロンのフィルター滅菌をし、50℃のオーブン内で加熱し、パートI混合物と混合し、プレートに注いだ。
1000×塩 /L
FeSO4・7H2O 5 g
MnSO4・H2O 1.6 g
ZnSO4・7H2O 1.4 g
CaCl2・6H2O 1 g
0.2ミクロンのフィルター滅菌

rGSHEの発現(トリコデルマレーシ(T. reesei)において発現したアスペルギウスアワモリvar.カワチ(Aspergillus awamori var. kawachi)GSHE)は実施例1のフミコーラグリセアvar.セルモイデア(H. grisea var. thermoides)の発現について説明したのと同様に決定された。発現のレベルは1g/L以上であった(データは示していない)。図10は、トリコデルマレーシ(T. reesei)宿主内におけるアスペルギウスアワモリvar.カワチ(Aspergillus awamori var. kawachi)GSHEの発現を示すSDS-PAGEの結果である。
アルファアミラーゼによる異なる顆粒デンプン基質の可溶化及び加水分解
典型的な試験において、150グラムの顆粒デンプンを350グラムの脱イオン水に懸濁した。混合の後、6 NのNaOHを用いてpHを5.5に調整した。アルファアミラーゼ(GZYME G997を1.0
kg/MT ds)をデンプンスラリーに添加し、60℃に維持されているウォーターバス内で攪拌しながらインキュベートした。このサンプルを異なる時間間隔で回収し、ブリックスを測定した。インキュベートから24時間の時点で回収されたサンプルをHPLCを用いた糖組成の決定に用いた(表6)。
Figure 0005091484
 表6に示す結果は、顆粒デンプン基質の可溶化に有意な違いを示す。コムギが最も可溶化固形分率%が多く、トウモロコシが最も低いパーセンテージであった。有意な違いは24時間における糖組成についても見られた。
アルファアミラーゼ(GZYME G997)及びrGSHEによる顆粒デンプン基質の可溶化及び加水分解
通常の実験において、350 gの水を150 gの顆粒トウモロコシデンプン、顆粒コムギデンプン及び顆粒タピオカデンプンに添加し、6NのNaOHを用いてpHを5.5に調整した。このスラリーを、混合物を均一に保つために攪拌しながら、60℃維持した水槽内に静置した。温度が安定した後、アルファアミラーゼ(GZYME G997を1.0 kg/MT ds)及びrH-GSHE(1.0 GSHE単位/グラムデンプン da)を各デンプンスラリーに添加し、インキュベーションを続けた。サンプルを異なる時間間隔において回収し、遠心し、ブリックスを測定した。24時間のサンプルは糖組成を解析した。顆粒デンプンの相対的な可溶化はジェットクッキングプロセス処理されたブリックスの比較により計算した。
Figure 0005091484
 G Zyme G997及びrH-GSHEを組み合わせると、穏やかな条件で近年用いられている高温に置けるジェットクッキングと比較に匹敵する、完全な顆粒デンプンの加水分解が実現した。24時間のサンプルの解析は、96.5%以上のグルコース生産を示した。
顆粒デンプン加水分解活性を有するグルコアミラーゼによる顆粒デンプンの可溶化及び加水分解
アスペルギウスニガー(Aspergillus niger)(OPTIDEX L-400及びG Zyme G 990 4X ジェネンコーインターナショナルインク)及びリゾプスニベウス(Rhizopus niveus)(CU.
CONC.新日本製薬 日本)由来の顆粒デンプン加水分解活性を有する市販グルコアミラーゼを、実施例1のrH-GSHEと比較した。これらの酵素の顆粒デンプン基質加水分解活活性は上で説明した方法で測定した。
Figure 0005091484
 30%の顆粒トウモロコシデンプンスラリー(150 gのデンプンを350 gの蒸留水に溶解)を調製し、pHを6 NのNaOHで5.5に調整した。G Zyme G 997を0.1
Kg/MTデンプンdsに添加し、デンプンスラリーを60℃に維持したウォーターバス内に静置した。G Zyme G 997を含む各デンプンスラリーにグルコアミラーゼを同じ投与量、すなわち、1.5 GSHE単位/gデンプンds添加し、60℃でインキュベートした。アリコートを異なる時間で回収し、遠心分離した。透明な上清をブリックス測定に用いた。2、6、22.5、及び49時間インキュベーションしたサンプルをHPLCによる糖組成の解析に用いた。結果を表9に示す。
Figure 0005091484
アルファアミラーゼ(G Zyme G 997)及びrH-GSHEと共にインキュベーションした間の顆粒トウモロコシデンプン(35%スラリー)の可溶化おけるpHの影響

372 gの水を178gのトウモロコシデンプンに添加した。このスラリーの混合を均一にするためにスターラーでよく攪拌し、6 NのNaOHを用いてpHを4.0、5.0、5.5、6.0、及び7.0に調整した。このサンプルを60℃に維持したウォーターバスの中に静置した。温度が平衡になったあと、G Zyme G 997(0.1 kg/MT デンプン)及びrH-GSHEをスラリーに添加した。このスラリーをインキュベーションの間攪拌し、1時間インキュベーションした後のサンプルをブリックスの測定に用いた(表10)。
Figure 0005091484
 最大可溶化は、pH5.0乃至5.6の間で起こった。顆粒トウモロコシデンプンの可溶化における有意な減少は、pH5.0乃至5.5以下のpHで起こった。このことは、活性が低くなったか、酵素が失活したかのいずれかを示唆する結果である。
アルファアミラーゼ及びrH-GSHEでインキュベーションした間の顆粒トウモロコシデンプン(30%スラリー)の可溶化における温度の影響

372gの水を178gのトウモロコシデンプンに添加した。このスラリーを均一にするためによく混合し、pHを6NのNaOHを用いて5.5に調整した。このサンプルを55℃、60℃、及び65℃に維持したウォーターバス内に静置した。温度を平衡化した後、G Zyme G 997、0.1 kg/MTデンプン及び実施例1のrH-GSHE(1.0 GSHE単位/ｇデンプン)を添加した。このスラリーをインキュベーションの間、連続的に攪拌し1時間後にブリックスを測定した(表11)。
Figure 0005091484
 顆粒コーンスターチの可溶化温度はG Zyme G 997及びrH-GSHEの存在下で、温度が上昇すると高くなった。しかしながら、65℃以上の温度での炭水化物の可溶化のHPLC測定によると、rH-GSHE単独ではグルコース濃度低くなることからrH-GSHEの失活が示唆される。上の表のように、65℃以上の温度において、高い可溶化が起こるのは、主に、G Zyme G 997の高温における顆粒デンプンの液化に対する影響である。
顆粒トウモロコシデンプンの可溶化及び加水分解におけるG Zyme G 997及びrH-GSHEの濃度の影響

別々のフラスコ内で372 gの水に178 gの顆粒トウモロコシデンプンを含むスラリーを均一にするためによく混合した。このスラリーのpHを5.5に調整した。異なるレベルのG Zyme G 997 0.1 kg/MTデンプン及び0.5 kg/MTデンプンを、0.25、0.5、及び0.1 GSHE単位/g dsデンプンと共にインキュベートした。サンプルを異なる時間間隔で回収し、ブリックス及び総糖組成の測定に用いた(表12A及び表12B)。
Figure 0005091484
 表12Aにおける結果は、G Zyme G 997 0.1 kg/MTのデンプン乃至0.5 kg/MTデンプンの投与は顆粒デンプンのより早い可溶化になった。しかし、両レベルにおいて、可溶化がrH-GSHEの1.0 GSHE単位の存在下で24時間において95%以上の顆粒デンプンが可溶化されていた。G Zyme G 997の存在下における顆粒デンプンの可溶化におけるrH-GSHEの影響は酵素の濃度が高くなるに従って高くなった。上の結果は明らかにG Zyme G 997又はrH-GSHEのいずれか一方が顆粒デンプンを完全に可溶化したのではなく、これらの酵素を共に添加したときに完全な可溶化が起こることを示している。
60℃、pH 5.5において、12、24、30時間、顆粒トウモロコシデンプンをG Zyme G 997及びrH-GSHEと共にインキュベーションする間に精製する可溶化された顆粒トウモロコシデンプン(32%スラリー)の炭水化物(糖)組成をHPLCで解析し、結果を表12Bに示した。
Figure 0005091484
 表12Bの結果は、バシルスステアロセレモフィリスアルファアミラーゼ及びrH-GSHEの適切なブレンドは、従来の高温調理プロセスを適用することなく、顆粒デンプンから直接、糖甘味料及び他の生化学的生産物の工業的生産における様々な必要性を満たすことを示している。高いレベルのアルファアミラーゼは、顆粒デンプンの可溶化の比を促進するが、rH-GSHEの高いレベルは、高度に重合した糖のレベルを有意に低くする逆反応生成物のレベルが高くなる。
グルコアミラーゼ調製物による酵素液化トウモロコシデンプン(可溶デンプン基質)及び顆粒デンプン基質の加水分解の比較

32% dsのトウモロコシデンプンをpH5.6において、低温ジェットクッキング工程(105℃、8分の後に、95℃、90分間加水分解することにより液化した。SPEZYME FERD(ジェネンコーインターナショナル)を0.4 kgs/MTデンプンdsで添加した。液化工程において、SPEZYME FERD液化デンプン基質のpHを4.2に調整し、グルコアミラーゼ(OPTIDEX L-400)を0.22 GSHE/g ds添加した。加水分解を60℃で行った。サンプルを異なる時間間隔で回収し、最大グルコース生産にいたるまでの時間を決定するためにHPLCで解析した。
蒸留水中22% dsの顆粒トウモロコシデンプンが調整され、スラリーのpHを1 NのNaOHを用いて5.5に調整した。振とうフラスコを60℃に維持したウォーターバス内に置き、G Zyme G997を0.1 Kgs/Mt dsの濃度で添加し及びrH-GSHEを1.0 GSHE単位/gdsの濃度で添加し、サンプルを60℃で攪拌しながらインキュベートした。ブリックス及びグルコース生産を測定するために、サンプルを異なる時間間隔で回収した(表13)。
Figure 0005091484
 グルコアミラーゼによる液化固形デンプンの加水分解は最大グルコース産性にいたる時間が不溶性顆粒デンプンの加水分解と比較してより長かった。最大グルコース生産のピーク時間において、液化された可溶性デンプンと比較したときの顆粒デンプンによるグルコースレベルは、高く(顆粒デンプン96.8、DP4+の糖含量は有意に低かった(96.8及び02を比較する、65.2及び1.3)。
本発明のアルファアミラーゼ及びGSHEブレンドの混合物は、短い時間に高いグルコース産性をする能力及び高温ジェットクッキング工程が排除できるという点において、従来技術に対して差別化されている。
G Zyme G997(0.1 kgs/MT)及びrH-GSHE(1.0 GSHE単位/g)を用いたインキュベーションの間のデンプンの可溶化及び加水分解における顆粒トウモロコシデンプン濃度の影響
蒸留水中に異なる顆粒トウモロコシデンプンの濃度のスラリー(すなわち、32%、35%、38%、40%、及び42%)を調整した。このスラリーのpHをpH5.5に調整した。このサンプルを60℃に維持したウォーターバス内に置き、スラリーを均一にするために攪拌を続けた。G Zyme G997(0.1 kgs/MT ds)及び実施例1のrH-GSHE(1.0 GSHE単位/ds)をスラリーに添加した。ブリックス及び糖組成のために、サンプルの一部をインキュベーションの間の異なる時間間隔で回収した(表14)。
Figure 0005091484
 この結果は、30%と同じ高さの溶解された固形物における糖化の24時間以内に96%以上のグルコースを生産することができることを示した。35%以上の固形レベルにおけるこの96%以上のグルコース生産は、糖化工程に不溶性の顆粒デンプンを用いたときに達成された。
当該技術分野で知られているように、グルコース高含有シロップを得るための酵素-酵素-デンプン添加工程は、熱安定性アルファアミラーゼを用いて不溶性デンプン基質を高温液化工程に適用することにより可溶性液化デンプンを生産する工程を含む。
活性を有するアルファアミラーゼの存在により、糖化工程においてグルコアミラーゼによるグルコース生産が減少することを防ぐために、糖化工程に先立ち、液化工程で残ったアルファアミラーゼを不活性化することは商業的生産における常套手段である。残余アルファアミラーゼ活性の不活性化は通常95℃においてpH4.2で液化物を処理することにより行われる。高温及びpH4.5において、アルファアミラーゼは完全に失活する。従って、我々は、pH5.5において液化デンプンの糖化における活性又は不活性アルファアミラーゼの影響を検討した。
典型的な実験において、トウモロコシデンプンから調整された可溶性液化(デンプン)は、ジェットクッキング条件(32% ds デンプンを105℃で、8分クッキングした後に、95℃で90分液化工程が続く)において、液化酵素としてZyme
G 997(0.4 kgs/MTデンプン)を用いて製造される。更に残余アルファアミラーゼを失活させるために液化デンプンの一部を加熱する。残余アルファアミラーゼ活性を有する又は有さない、液化デンプンの糖化物を、実施例1のrH-GSHE、0.5 GSHE単位/gを用いて60℃、pH5.5の条件で、更に糖化(32%
ds)させる。サンプルを異なる時間間隔で回収し、グルコース生産をHPLCを用いて解析した(表15)。
Figure 0005091484
 表15の結果は、グルコアミラーゼによる可溶化デンプン基質(液化デンプン)の糖化の間のG Zyme G 997のアルファアミラーゼ活性の存在はグルコース生産を低めることを示している。一方、グルコアミラーゼが実質的に高いグルコースレベルにすることにより、不溶性(顆粒)デンプン基質の加水分解をアルファアミラーゼが高める。
トウモロコシデンプンの加水分解物からのグルコースシロップ及び残余デンプンの生産
反応管中に、水1200 gに顆粒トウモロコシデンプン(800 g)を懸濁したスラリーを得るため均一に混合した。4NのNaOHを用いてこのスラリーのpHを5.5に調整した。60℃において、G Zyme G 997(0.1 kgs/MTデンプン)及びトリコデルマレーシ(Trichoderma reesei)の中で発現したフミコーラグリセアvar.セルモイデア(Humicola grisea var. theromidea)(rH-GSHE)1.0 GSHE U/gデンプンを添加した。サンプルを異なる時間間隔で回収し、ブリックス及び総糖含量の測定に用いた(表16)。
Figure 0005091484
 10時間の反応時間において、顆粒デンプンの90%以上が可溶化した後、HPLCにより測定される可溶化顆粒デンプンの糖組成は表17に示すようになった。
Figure 0005091484
 10時間反応させた後、4 NのH2SO4を用いてpHを3.5に調整することにより加水分解を停止させた。シロップ混合物は、30%以上の固形含量において、96%のデキストロースを含んでいた。この混合物を500,000分子量カットオフ(MWCO)精密ろ過膜カートリッジ(AGテクノロジー)を用いて60℃でフィルターろ過した。
残余デンプンのサンプルを乾燥させ、電子顕微鏡(日立S-500コールドフィールドエミッションEMS(東京、日本))のスキャニングによりその構造を解析し、本発明の方法に従って酵素に曝す前の典型的なデンプン顆粒と比較した(図12)。乾燥サンプルは、両面接着性のカーボンテープを用いてSEMサンプルスタッズの上に乗せた。あらゆる余分なサンプルを圧縮空気を用いて取り除いた。このサンプルはその後、Bal-Tec Med020 Modular High Vacuum Coating System (Liechtenstein)の中に約30°の角度でおかれ、60rpmの回転数で10nmのプラチナ(Pt)でスパッタコートした。これらのセッティングによりデンプン顆粒の前面に均一にコートされた。コーティングの厚さは、デンプン顆粒の酵素作用からの結果となる特徴的なサイズと比較すると無視できる程度である。加速電圧は2乃至5Kvの間で変化し、倍率は500ないし1500Xであった。
図12aの電子顕微鏡写真は、本発明の酵素組成物及び方法に曝す前の典型的な顆粒デンプンを示す。表面は滑らかで均質であり、プラチナ金属コーティングのために生じた小さな亀裂のみが特徴である。一旦、本発明の酵素ブレンド及び方法に曝されると顆粒表面の形態が変化した。図12の電子顕微鏡写真b-dに示すように、デンプン顆粒基質の酵素消化により大きな丸い穴が顆粒の穴に開いていた。この穴の直径の幅は、穴の深さにより変動する。酵素反応の異なる動態段階におけるデンプン顆粒の集団を反映した。幾つかの顆粒は数個の穴しか有しなかったけれども、幾つかの顆粒は穴が密集していた(顕微鏡写真ｂ)。幾つかの顆粒は、消化された内部の切断面が示すように半分に切れていた(顕微鏡写真ｃ及びd)。顕微鏡写真d)は酵素消化の完了を示す。酵素により刳り抜かれた断片が観察された。
図1はグルコアミラーゼ活性(GSHE)を有する加水分解酵素をコードするゲノムDNA配列を示す(配列番号1)。推定されるイントロンを太字及び下線で示す。 図2Aはフミコーラグリセアvar.セルモイデア顆粒デンプン加水分解酵素をコードするゲノムDNA配列を示す(配列番号1)。推定されるシグナル配列を太字及び下線で示す。 図2Bはフミコーラグリセアvar.セルモイデアGSHE(配列番号3)の成熟アミノ酸配列を示す。 図3はpTrex3g_N13プラスミドの概略図を示す。このプラスミドは、フミコーラグリセアGSHEをコードする核酸の発現に用いられ、糸状菌発現ベクターに隣接するxba2部位を含み、a) cbh1プロモーターはトリコデルマセロビオハイドラーゼプロモーターであり、b) フミコーラgla1は配列番号3のフミコーラグリセアGSHEをコードするポリヌクレオチドであり、c) cbh1ターミネーターはトリコデルマレーシセロビオハイドラーゼターミネーターであり、オd) andsはアスペルギウスニデュランスの汗とアミラーゼダーゼマーカー遺伝子である。 図4は図3のpTrex3g_N13プラスミドの核酸配列(配列番号11)(10738bp)を示す。 図4は図3のpTrex3g_N13プラスミドの核酸配列(配列番号11)(10738bp)を示す。 図4は図3のpTrex3g_N13プラスミドの核酸配列(配列番号11)(10738bp)を示す。 図4は図3のpTrex3g_N13プラスミドの核酸配列(配列番号11)(10738bp)を示す。 図4は図3のpTrex3g_N13プラスミドの核酸配列(配列番号11)(10738bp)を示す。 図5は実施例1で述べるように、トリコデルマレーシクローンのための別個の発酵において、フミコーラグリセアvar.セルモイデア発現を示すSDS-PAGEゲルを示す。レーン1は市販されている分子量マーカーSeeBlue(インビトロジェン)、レーン2はブランク、レーン3は48時間におけるGSHE発現を示す、レーン4は56時間におけるrGSHEの発現を示す；及びレーン5は64時間におけるrGSHE発現を示す。 図6はアスペルギウスアワモリvar.カワチGSHEをコードするゲノムDNA配列(配列番号4)を示す。シグナル配列を太字及び下線で示す。 図7Aは、アスペルギウスアワモリvar.カワチGSHEのシグナル配列及び成熟アミノ酸は配列を示す(配列番号5)。シグナル配列を太字及び下線で示す。 図7Bはアスペルギウスアワモリvar.カワチGSHEの成熟アミノ酸配列を示す(配列番号6)。 図8A及び図8bは実施例1で示すように、天然フミコーラグリセアvar.セルモイデアGSHE(nGSHE)及びトリコデルマレーシ宿主細胞において発現されたフミコーラグリセアvar.セルモイデア(rGSHE)のpH耐性を残存活性(%)で示したグラフである。 図8A及び図8bは実施例1で示すように、天然フミコーラグリセアvar.セルモイデアGSHE(nGSHE)及びトリコデルマレーシ宿主細胞において発現されたフミコーラグリセアvar.セルモイデア(rGSHE)のpH耐性を残存活性(%)で示したグラフである。 図9は実施例1で示すように、天然のフミコーラグリセアvar.セルモイデア及び組み換えトリコデルマレーシやにおいて発現されたフミコーラグリセアvar.セルモイデアのトウモロコシデンプンの加水分解を経時的にmgグルコース／mgタンパク質をして示すグラフである。 図10は実施例2で野江bル様にトリコデルマレーシに対して行った別個の発酵におけるアスペルギウスアワモリvar.カワチGSHEの発現を示すSDS-PAGEゲルを示す。
レーン1は市販の分子量マーカーSeeBlue(Invitrogen)；レーン2は162時間後のrGSHE発現を示す；レーン3は162時間後の非組み換えトリコデルマレーシ宿主細胞の対照を示す。
図11は顆粒デンプン基質から低いエネルギーでグルコースを生産する本発明の方法の位置態様を示す図である。 図12は、本発明の工程を経る前のトウモロコシデンプン顆粒の電子顕微鏡写真(a)及び本発明の方法を経た後の残余デンプン(b-d)の電子顕微鏡写真を示す。

Claims (10)

  1. トリコデルマレーシ(Trichoderma reesei) 細胞においてグルコアミラーゼ活性を有する顆粒デンプン加水分解酵素(GSHE)を生産する方法であって、pHが3.0から4.0での前記酵素の活性は、天然の糸状菌宿主細胞（フミコーラグリセアvar セルモイデア細胞）から産生された対応するGSHEよりも高く、
    a) フミコーラグリセアvar セルモイデア（Humicola grisea var. thermoidea）株由来の、前記GSHEをコードしている異種ポリヌクレオチドに作動可能に結合した、前記トリコデルマレーシ(Trichoderma reesei) 細胞における転写活性を有するプロモーターを含むDNA構築体を用いてトリコデルマレーシ細胞を形質転換する工程と、
    b) 前記GSHEを発現させるのに許容する培地において前記形質転換されたトリコデルマレーシ細胞を培養する工程と、
    c) 前記GSHEを生産する工程、とを含むことを特徴とする方法。
  2. 前記生産されたGSHEを回収する工程を更に含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。
  3. 前記GSHEが配列番号３の配列と少なくとも90%の配列同一性を有することを特徴とする請求項１に記載の方法。
  4. 前記形質転換されたトリコデルマレーシ宿主細胞を連続発酵条件下で培養することを特徴とする請求項1に記載の方法。
  5. 前記形質転換されたトリコデルマレーシ宿主細胞をバッチ発酵条件下で培養することを特徴とする請求項1に記載の方法。
  6. フミコーラグリセアvar セルモイデア由来の、グルコアミラーゼ活性を有する顆粒デンプン加水分解酵素(GSHE)をコードする異種ポリヌクレオチドを含む、組み換えトリコデルマレーシ細胞。
  7. トリコデルマレーシ(Trichoderma reesei)の培養により生産されるグルコアミラーゼ活性を有する、請求項１に記載の顆粒デンプン加水分解酵素(GSHE)を含む発酵培地であって、該トリコデルマレーシが配列番号3と少なくとも90%の配列同一性を有するGSHEをコードしている異種ポリヌクレオチドを含むことを特徴とする発酵培地。
  8. 顆粒デンプンスラリーからグルコースシロップを生産する方法であって、前記顆粒デンプンのゼラチン化温度以下の温度において、請求項７に記載の発酵培地とバチルス(Bacillus) 株由来のアルファアミラーゼとを顆粒デンプン基質に同時に接触させる工程と、グルコースシロップを得るために2乃至100時間の間アルファアミラーゼとGSHEとを作用させて顆粒デンプンを加水分解する工程とを含むことを特徴とする方法。
  9. アルファアミラーゼ及び、請求項１の方法により生産される顆粒デンプン加水分解活性を有するグルコアミラーゼ(GSHE)を含む顆粒デンプン加水分解活性を有する酵素組成物であって、前記GSHEに対する前記アルファアミラーゼの比が15：1乃至1：15であることを特徴とする酵素組成物。
  10. 前記GSHEに対する前記アルファアミラーゼの比が、10：1乃至1：10であることを特徴とする請求項９に記載の酵素組成物。
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