JP5083807B2 - 嫌気性細菌培養キット用容器および嫌気性細菌培養キット、並びに嫌気性細菌培養方法および嫌気性細菌の生育判別方法 - Google Patents

Description

本発明は、嫌気性細菌培養キット用容器および嫌気性細菌培養キット、並びに嫌気性細菌培養方法および嫌気性細菌の生育判別方法に関する。

歯科治療において、感染した歯質、いわゆる虫歯の治療では、器械的に切削し感染源を除去する治療が実施されている。感染が歯髄にまで及んだ場合には、根管内の感染源や根管象牙質を切削・拡大後、根管消毒、根管充填する根管治療が行われる。治療を必要とする根管は、組織片、壊死片、細菌およびその産生毒素、腐敗産物で満たされており、これらの感染源を排除する必要がある。この根管治療の目的の1つは根管の無菌化であり、殺菌処理後の根管が十分に無菌化されているかは、その後の治療成績に大きな影響を及ぼす。従って、根管が十分に無菌化されているかを確認できることが望ましい。

感染根管内から検出される菌種のうち70〜80%は嫌気性菌であると言う報告がある。しかし、これらの嫌気性菌、特に高い嫌気度を要求する偏性嫌気性菌を培養するためには研究室で使用する嫌気グローブボックス等の大掛かりな設備が必要である。この嫌気グローブボックスは、(1)装置が複雑でチェアサイドで使用するには大きすぎる、(2)操作が煩雑、(3)高価、などの欠点が挙げられ、歯科臨床のチェアサイドにおいての使用は現実的ではない。

そのため、現状では感染根管治療における根管充填時に、臨床チェアサイドにおいて、根管内における嫌気性菌の存在の有無を客観的に示すことは非常に困難であり、根管充填の可否は術者の判断にゆだねられている。また、偏性嫌気性菌の中には、根管治療における予後不良および難治性の根尖性歯周炎への関与が強く示唆されるものも多く存在する。

ところで、特開２００５−４００２９号公報(特許文献1)には、嫌気性細菌を採取する方法、器具及びキット、ならびに嫌気性細菌を採取及び培養する方法及びキットが開示されている。
特開２００５−４００２９号公報

しかし、特許文献1に記載の方法は、主に、嫌気性細菌を採取する方法であり、この方法で採取した細菌は、ゴム栓を有する試験管に移されて培養される。試験管内は嫌気性ガスで置換されると記載されているが、具体的な方法の記載はなく、試験管内が嫌気性ガスで完全に置換されるには相当の時間を要し、ゴム栓の開け閉めも必要であり、簡便さに欠けると同時に嫌気的条件の保持が難しいという欠点がある。

前述した理由から、本発明者らは、根管充填を行う際に根管内に病原性の高い偏性嫌気性菌が存在するか否かを判断することが重要であると考えた。しかし、これまでに、チェアサイドにおいて簡便に偏性嫌気性菌を培養できる簡易型嫌気培養キットは知られていない。

そこで本発明の目的は、一般歯科医院のチェアサイドでも、簡便且つ安価に、無菌化確認の培養試験ができるような手段を提供することにある。

さらに本発明の目的は、上記手段を用いた嫌気性細菌の培養方法および嫌気性細菌の生育判別方法を提供することにある。

そこで、本発明者らは、上記発明の目的を達成すべく検討し、本発明を完成した。

本発明は、以下の通りである。
[1]開閉自在の外部口および弾力性材料で密閉されたガス注入口を有する密閉容器であって、
前記開閉自在の外部口から密閉容器内に延在する、採取したサンプルを空気中の酸素の混入を抑制して密閉容器に移送するための中間室を有し、
前記中間室は密閉容器内部に通じる開閉自在の内部口を有し、
前記密閉容器の内部には、培地を保持するための空間を有する、
ことを特徴とする嫌気性細菌培養キット用容器。
[2]前記密閉容器は、柔軟性のある透明材料からなる[1]に記載の嫌気性細菌培養キット用容器。
[3]前記ガス注入口は密封用キャップを有する[1]または[2]に記載の嫌気性細菌培養キット用容器。
[4]前記開閉自在の外部口および開閉自在の内部口は、いずれもファスナーで開閉自在とする[1]〜[3]のいずれかに記載の嫌気性細菌培養キット用容器。
[5][1]〜[4]のいずれかに記載の嫌気性細菌培養キット用容器、
前記容器の培地を保持するための空間に収容された培地、および
前記中間室に収容された脱酸素剤
を含む嫌気性細菌培養キット。
[6]前記培地は液体培地である[5]に記載の嫌気性細菌培養キット。
[7]前記培地は、嫌気性細菌が産生する物質により色調が変化する指示薬を含む[5]または[6]に記載の嫌気性細菌培養キット。
[8]前記開閉自在の外部口および開閉自在の内部口は、いずれもファスナーで開閉自在とし、かつ前記中間室には、前記ファスナーの開放を助けるための塊状物がさらに収容されている[5]〜[7]のいずれかに記載の嫌気性細菌培養キット。
[9]前記塊状物は球状体である[8]に記載の嫌気性細菌培養キット。
[10]前記中間室には、酸素検知剤がさらに収容されている[5]〜[9]のいずれかに記載の嫌気性細菌培養キット。
[11]嫌気性細菌を担持した部材を、内部口を密閉した状態の[5]〜[10]のいずれかに記載の嫌気性細菌培養キットの前記中間室に収容し、
前記中間室の外部口を密閉し、
前記中間室内の酸素を脱酸素剤によって除去し、
前記密閉容器の内部に前記ガス注入口を介して、嫌気性ガスを注入し、
内部口を開放して嫌気性細菌を担持した部材を培地に供給し、
所定時間培養することを含む
嫌気性細菌培養方法。
[12]被検査物を担持した部材を、内部口を密閉した状態の[5]〜[10]のいずれかに記載の嫌気性細菌培養キットの前記中間室に収容し、
前記中間室の外部口を密閉し、
前記中間室内の酸素を脱酸素剤によって除去し、
前記密閉容器の内部に前記ガス注入口を介して、嫌気性ガスを注入し、
内部口を開放して嫌気性細菌を担持した部材を培地に供給し、
所定時間培養し、
培地の色調の変化により、被検査物が嫌気性細菌を含むか否かを判別することを含む、
嫌気性細菌の生育判別方法。

本発明によれば、一般歯科医院のチェアサイドで、簡便且つ安価に、無菌化確認の培養試験ができるようなキットが提供される。キットを用いた嫌気性細菌の生育判別方法により、その結果、根管内が無菌化したことを確認した上で、次の治療に移ることができ、根管治療成績を向上することができる。また、上記キットを用いることで、根管内の無菌化確認以外の嫌気性細菌の培養も、簡便且つ安価に行うことができる。

[嫌気性細菌培養キット用容器]
本発明の嫌気性細菌培養キット用容器は、
開閉自在の外部口および弾力性材料で密閉されたガス注入口を有する密閉容器であって、
前記開閉自在の外部口から密閉容器内に延在する中間室を有し、
前記中間室は密閉容器内部に通じる開閉自在の内部口を有し、
前記密閉容器の内部には、培地を保持するための空間を有する、
ことを特徴とする。

本発明の容器を図1に基づいて説明する。
図1の左図は本発明の容器の正面図であり、右図は本発明の容器の側面図である。
本発明の容器の本体は、開閉の自在の外部口20および弾力性材料で密閉されたガス注入口30を有する密閉容器10である。

密閉容器10は、柔軟性のある透明材料からなることができ、具体的には、ポリエチレン、ポリプロピレン等の高分子材料のシートから形成したものであることができる。密閉容器10が柔軟性のある材料からなることで、取り扱いや折り畳んでの収納が行え、透明材料からなることで、内部の状態を確認しながら操作でき、かつ培養状態の視覚による確認も容易にできる、という利点がある。

ガス注入口30は、密閉容器10の内部と容器の外部との間に連通する孔に弾力性材料を充填したものであることができる。弾力性材料は、例えば、シリコーン材料(例えば、シリコーンゴム、シリコーン樹脂)であることができ、弾力性材料に、ガス注入用の針を差し込んで、密閉容器10の内部に、ガスを空気の混入を防ぎながら注入することができる。さらに、ガス注入口30は、ガス注入口の保護と無菌を目的として、口密封用キャップ31を有することができる。

密閉容器10は、外部口20から密閉容器内に延在する中間室40を有し、さらに、中間室40は密閉容器10内部に通じる開閉自在の内部口50を有する。外部口20および内部口50は、開閉自在であれば、特に制限はないが、操作の容易さ、構造の単純さ、作成の容易さ等を考慮すると、いずれもファスナーで開閉自在とすることが好ましい。特に、外部との密閉性を高める目的で、外部口20は、ファスナーを2重に設けることが好ましい。さらに、ファスナーは、樹脂製のレールファスナーであることが、開閉自在であり、厳重な密閉状態の作出が可能であり、かつ高分子材料のシートからなる密閉容器10への設置も容易であるため、好ましい。

中間室40は、採取したサンプル、例えば、根管内を拭き取ったペーパーポイントを、密閉容器内に、極力、空気中の酸素の混入を抑制して移送する目的で設けられている。従って、中間室40の形状および寸法は、採集したサンプルの移送が可能な程度とすることが適当である。

密閉容器10の内部には、採取したサンプルに含まれる可能性がある偏性嫌気性細菌の培養に適した培地を保持するための空間11を有する。培地の量は、例えば、1〜50ml程度であればよく、空間11の容量は、培地を収容できるように適宜決定できる。但し、密閉容器10及び空間11の容量や形状は、容器利用の利便性等を考慮して、適宜決定できる。また、密閉容器10の内部は、中間室40内部を含めて、使用時までは減圧または真空状態にしておくことが、容器内を滅菌状態にする際には好都合である(容器内に余計な雑菌の存在を低減できる)。

本発明の嫌気性細菌培養キット用容器は、包装に収納された状態で、供給されることができ、包装は、この包装に本発明の嫌気性細菌培養キット用容器が収納されたままでの状態でオートクレーブでの滅菌処理やエチレンオキサイド(EOガス)による滅菌処理ができる構造や材質のものであることが好ましい。そのような構造や材質のものは、公知のものから適宜選択できる。

前述のように、ガス注入口30にはキャップ31を設けることができるが、ガス注入口30にキャップ31を着けた状態で全体をガス滅菌することで、ガス注入口30の外部表面を無菌的保つことができる。それによって、ガス注入時にガス注入口30にノズルを差し込んだ時に、本体内部に雑菌が侵入することを防ぐことが出来る。

また、上記包装に収納された本発明の嫌気性細菌培養キット用容器には、付属品(例えば、滅菌した液体培地を導入するためのストローや、ファスナー51を開口するための塊状物(例えば、球状体)、脱酸素剤、酸素検知剤(好ましくは酸素検知剤一体型脱酸素剤)等)を一緒に収納し、嫌気性細菌培養キット用容器と一緒に滅菌処理できるようにしておくこともできる。尚、ファスナー51を開口するための塊状物(例えば、球状体)は、本体とは別に滅菌しておき、試料を着けたペーパーポイントと一緒に中間室40入れることも可能である。

[嫌気性細菌培養キット]
本発明は、嫌気性細菌培養キットにも関する。
本発明の培養キットは、前記本発明の嫌気性細菌培養キット用容器、
前記容器の培地を保持するための空間に収容された培地、および
前記中間室に収容された脱酸素剤
を含む。

培地は、嫌気性細菌を培養できるものであればよく、例えば、BHI（Brain HeartInfusionブレーンハートインフュージョン）などは、口腔内の多種類の細菌が最も生育しやすい培地であることから好ましい。また、Yeast extractやメナジオンを添加したTryptic soy broth等を使用することもできる。また、前記培地は、pH指示薬による色の変化によって、細菌の生育の有無を見る場合には、液体培地であることが適当である。培地には、必要により酸素吸収材を共存させることもでき、本発明のキットは酸素吸収材をさらに含むことができる。酸素吸収材を共存させることで、培地の嫌気度を高め(酸化還元電位を低め)に維持することが容易になる。酸素吸収材としては、例えば、水分依存型のエージレス（ラベルタイプおよびカードタイプ）(いずれも三菱ガス化学株式会社製)等を挙げることができる。また本キットの容器材料として鉄系酸素吸収剤を層構造にしたシート袋状のエージレス・オーマック(三菱ガス化学株式会社製)を使うことによっても、嫌気度を高めることができる。

しかし、本発明の嫌気性細菌培養キット用容器を、単純に嫌気性菌を培養するに用いる場合には、固体培地を使うこともできる。例えば、直径３ｃｍ程度のシャーレの寒天を含む固体培地を作り、その表面に、ペーパーポイントに付着させた臨床試料を擦り付けた後、その個体培地をこのキットに入れて培養することもできる。その場合は、容器10の外部口20は、固体培地の容器内への搬入がしやすい大きさに調整する。また、寒天を含む固体培地の原料となる溶液を、容器10内の空間11で導入し、そこで固化して固体培地とすることもできる。その場合には、容器10の外部口20は、固体培地の原料となる溶液が導入できる大きさであればよく、図1に示す形状であってもよい。

培地には、グルコースを添加することが好ましい。グルコース添加によって細菌が酸（乳酸、酢酸等）を作りやすくし、作られた酸によるpHの変化で培地中のBCGが緑色から黄色へ変化して、嫌気性細菌の存在を検知することができる。

前記培地は、嫌気性細菌の繁殖の有無をその場で判定するために、嫌気性細菌が産生する物質により色調が変化する指示薬を含むことが好ましい。培地としては、例えば、最も多くの口腔細菌が培養可能なBHI培地等をベースに、へミン・ビタミンK、細菌の代謝を促進するためのグルコース、そしてpH指示薬であるBCGを加えたものを使用することができる。この培地は細菌が産生した有機酸によるpHの低下にBCGが反応し、培地の色調が緑から黄色へと変化する。この色調変化により、嫌気性菌の生育の有無を確認することが可能となる。BCG以外の指示薬としては、例えば、BTB（ブロムチモルブルー）、MR（メチールレッド）、BPB（ブロムフェノールブルー）などがあるが、指示薬によっては、pHによる色調の変化が、培地自体の色調と類似しているものもある。その場合は、色調の変化を明確に判定することが困難である。従って、本キットの培地に加えるpHの指示薬は、使う培地によって適宜考慮する。

外部口20および内部口50が、いずれもファスナー21、51で開閉自在となっている場合には、中間室40には、前記ファスナーの開放を助けるための塊状物60がさらに収容されていることが好ましい。この塊状物は、例えば、球状体であることができる。この塊状物を指で、ファスナーに押し当てることで、ファスナーの開放を容易に行うことができる。球状体は、例えば、直径1cm程度であることができる。

中間室40には、脱酸素剤41が収容される。脱酸素剤としては、例えば、「酸素検知剤一体型エージーレス：商品コードSAPE-A」(三菱ガス化学株式会社製)を挙げることができる。この酸素検知剤一体型脱酸素剤は、滅菌された状態で真空パックとして販売されており、これをそのまま利用できる。

中間室40に脱酸素剤41を収容しておくことで、中間室40には、採取したサンプルを一時的に収容した後、所定時間をおいて、中間室40内を脱酸素し、その上で、中間室40内から密閉容器10内の培地に採取したサンプルを移送することで、密閉容器10内の嫌気性環境を維持することができる。

中間室40には、脱酸素剤41に加えて、酸素検知剤42が収容されていることが好ましい。中間室40に酸素検知剤42を収容しておくことで、中間室40に採取したサンプルを一時的に収容した後、中間室40内の脱酸素の状態を検知することができ、中間室40内が確実に嫌気性環境になった後に、中間室40内から密閉容器10内の培地に採集したサンプルを移送することができる。酸素検知剤の例としては、酸素検知剤一体型脱酸素剤を用いることができ、例としては、前述の酸素検知剤一体型エージーレス等を挙げることができる。

前記培地は、中間室40を経由して、密閉容器10の内部の培地を保持するための空間11に供給される。培地供給の際には、中間室40には、脱酸素剤41および酸素検知剤42が収容されていてもよいが、脱酸素剤41および酸素検知剤42を収容する前に培地を供給することが好ましい。培地供給が完了し、内部口50を閉じ、次いで、脱酸素剤41および酸素検知剤42を中間室40に収容した後に外部口20を閉鎖することが好ましい。脱酸素剤41および酸素検知剤42は、採集したサンプルを、中間室40に収容した後に、中間室40に収容してもよく、脱酸素剤41および酸素検知剤42を収容した中間室40に採集したサンプルを収容してもよい。

上記本発明の嫌気性細菌培養キット用容器および嫌気性細菌培養キットは、嫌気性細菌の培養に利用でき、さらには、嫌気性細菌を含む可能性がある検体の試験のために利用することができる。

[嫌気性細菌培養方法]
本発明の嫌気性細菌培養方法は、
嫌気性細菌を担持した部材を、内部口を密閉した状態の本発明の嫌気性細菌培養キットの前記中間室に収容し、
前記中間室の外部口を密閉し、
前記中間室内の酸素を脱酸素剤によって除去し、
前記密閉容器の内部に前記ガス注入口を介して、嫌気性ガスを注入し、
内部口を開放して嫌気性細菌を担持した部材を培地に供給し、
所定時間培養することを含む。

本発明の嫌気性細菌培養方法で培養できる嫌気性細菌は、特に制限はなく、ヒトの口腔内に存在する偏性嫌気性細菌以外の嫌気性細菌であることもできる。嫌気性細菌を担持するための部材は特に制限はなく、ペーパーポイントやその他、嫌気性細菌の担持に適した物であればよい。

本発明の嫌気性細菌培養方法は、前記本発明の嫌気性細菌培養キットの中間室に、内部口を密閉した状態で、外部口を開放して、嫌気性細菌を担持した部材を収容する。次いで、中間室の外部口を密閉し、中間室内の酸素を脱酸素剤によって除去する。中間室内の酸素の除去の完了は、中間室内に酸素検知剤が収容されている場合には、酸素検知剤の色から判断することができる。中間室内に酸素検知剤が収容されていない場合には、予め、例えば、酸素検知剤を用いて酸素が除去できる時間を計測しておき、計測された時間に基づいて、所定時間を予め設定しておくことができる。

次いで、密閉容器の内部にガス注入口を介して、嫌気性ガスを注入する。嫌気性ガスの注入は、中間室内の酸素除去の完了を待たずに行うことができ、好ましくは、中間室内の酸素除去を行っている間に嫌気性ガスの注入を行う。嫌気性ガスには、特に制限はなく、例えば、偏性嫌気性菌培養用として多くの研究室で使用されている3種混合ガス（窒素80% 水素10% 二酸化炭素10%）が一般的である。しかし、培養する細菌の種類によっては、窒素と水素の２種混合ガスや、水素、窒素または二酸化炭素単独でも使用できる。

嫌気性ガスを注入する前の密閉容器には、予め培地が収容されているが、培地以外の密閉容器内の空間には、予め、嫌気性ガスを充填しておくこともできる。また、培地には、予め酸素吸収材を添加しておくこともできる。培地に予め酸素吸収材を添加しておくことで、嫌気度が高い培地に嫌気性細菌の培養を容易にすることができる。

嫌気性ガスを注入した後に、内部口を開放して嫌気性細菌を担持した部材を培地に供給し、次いで、所定時間培養する。培養条件(温度および時間)は、目的とする嫌気性細菌の種類等に応じて適宜決定できる。例えば、３７℃の保温機器に入れ、３〜５日間培養することができる。培養した嫌気性細菌は、例えば、さらに次の試験等に利用することができる。

本発明の嫌気性細菌培養方法では、嫌気性細菌を培養するための液体培地は、嫌気性細菌が好適に生育できる嫌気度に調節することができる。上記手順で嫌気性細菌を液体培地に供給する場合、3種混合ガス（窒素80% 水素10% 二酸化炭素10%）を用いれば、液体培地の嫌気度は酸化還元電位で表示して、例えば、-100〜-150mV程度に調節することができる。特に、-110〜-130mV程度の嫌気性細菌培養に通常よく使用する嫌気度は容易に達成できる。また、3種混合ガスの代わりに、水素、窒素または二酸化炭素を単独で使用すると、液体培地の嫌気度は酸化還元電位で表示して、例えば、-30〜-100mV程度に調節することができる。通常の嫌気グローブボックスを使用する嫌気性細菌培養では、酸素と水素の反応を促進する触媒(例えば、白金アルミナペレット)を用いて残存する酸素を共存する水素を反応させて水にすることで除去する。しかし、本発明のキットを用いた培養方法では、上記触媒を用いることなく、上記範囲の嫌気度の実現が可能である。

加えて、前記水分依存型のエージレス（ラベルタイプおよびカードタイプ）(いずれも三菱ガス化学株式会社製)等の酸素吸収剤を用いることによって、更に酸化還元電位を50〜80mV程度低下させることもできる。同様に、本キットの容器材料として鉄系酸素吸収剤を層構造にしたシート袋状のエージレス・オーマック(三菱ガス化学株式会社製)を使うことによっても、酸化還元電位を低下させることができる。

但し、より高い嫌気度を必要とする嫌気性細菌を培養する場合、液体培地の嫌気度もより高める必要が生じる。そのような場合には、前記中間室内に酸素と水素の反応を促進する触媒(例えば、白金アルミナペレット)を収納し、嫌気性ガスとして水素を含有するガスを用いることで、より高い嫌気度を実現することもできる。したがって、本発明の前記キットは、必要により、上記酸素と水素の反応を促進する触媒を含むこともできる。

[嫌気性細菌の生育判別方法]
本発明の嫌気性細菌の生育判別方法は、被検査物を担持した部材を、内部口を密閉した状態の本発明の嫌気性細菌培養キットの前記中間室に収容し、
前記中間室の外部口を密閉し、
前記中間室内の酸素を脱酸素剤によって除去し、
前記密閉容器の内部に前記ガス注入口を介して、嫌気性ガスを注入し、
内部口を開放して嫌気性細菌を担持した部材を培地に供給し、
所定時間培養し、
培地の色調の変化により、被検査物が嫌気性細菌を含むか否かを判別することを含む。

本発明の嫌気性細菌の生育判別方法は、嫌気性細菌を担持した部材の代りに被検査物を担持した部材を用いることで、本発明の嫌気性細菌培養方法と同様に実施できる。被検査物を担持した部材は、具体的には、ヒト口腔内の所定部位、例えば、根管内を拭き取ったペーパーポイントであることができる。

本発明の嫌気性細菌の判別方法では、培地として嫌気性細菌が産生する物質により色調が変化する指示薬を含む培地を用い、培養の結果、培地の色調に変化があるか否か、あるいは培地の色調の変化の程度により、被検査物が嫌気性細菌を含むか否かを判別する。培地がpH指示薬であるBCGを含む場合、嫌気性細菌が存在すると、嫌気性細菌が酸（乳酸、酢酸等）を生成し、生成した酸によるpHの変化で培地中のBCGが緑色から黄色へ変化する。

次に、より具体的に本発明の嫌気性細菌の判別方法について説明する。
ポリエチレン製の袋を加工し、図1に示すような、約15×10cmの本発明の嫌気培養キットを作成した。このキットは、本体となるポリエチレン製の袋10、そして、本体上部に試料の取り入れ口(外部口)20と偏性嫌気性菌培養用の3種混合ガス（窒素80% 水素10% 二酸化炭素10%）注入口30を設けた構造とした。更に、本体内部には作成した液体培地70が入っている。また、試料取入れ口20はポリエチレン製でファスナー21が上下に2本付いた袋状の構造になっている。そして、その内部には、脱酸素剤40(酸素に反応して色が変化する酸素検知剤との一体型)および樹脂製の直径１cmの球60が入っており、この球によって、袋の外側からでも下部のファスナーを開くことが可能である。

3種混合ガス注入口30には樹脂製のキャップ31が設けられており、キャップを開くと、内部にはシリコーン(図示せず)が充填されている。この構造により、ハンディースプレー缶90から容器10の本体内に3種混合ガス充填を行う際に混合ガスが漏れず、容器10内部にも酸素が侵入することなく、スプレー缶90先端の針状のノズルから容易に容器10内へガス充填が可能である。また、使用前の容器10内部は滅菌され、減圧状態である。更に、このポリエチレン製の容器10は底部が、袋でありながら孵卵器中において立てた状態で培養が可能であるような形状に加工されている。尚、培地はオートクレーブ滅菌した後に、EOG滅菌した容器10に分注する方法を採用した。

この本発明の嫌気培養キットを用いた偏性嫌気性菌の培養法を図2に示す。
(工程1)滅菌ペーパーポイント80を用いて細菌を採取する。
(工程2)採取したペーパーポイント80を脱酸素剤41が入っている中間室40に入れ、ファスナー21を閉じて中間室を嫌気的にする。
(工程3)ガス注入口30からハンディースプレー缶90に充填してある3種混合ガスをキット容器10内に充填する。
(工程4)ファスナー51を開きペーパーポイントを培地の中に落とす。
(工程5)キットごと孵卵器に入れ培養を行う。
(工程6)72時間後に培地の色調変化によって嫌気性菌の存在の有無の確認を行う。
実際に臨床チェアサイドにおいて、偏性嫌気性菌の存在を確認する場合には、根管内に滅菌ペーパーポイントを挿入することにより試料を採取する。

本発明の嫌気培養キットを用いた実験
まず、感染根管から分離される頻度が高く、生体に対して比較的病原性が高いとされている偏性嫌気性菌を含む5菌種（S.ミュータンス(S. mutans)、E.リモスム(E. limosum)、E.フェカーリス(E. faecalis)、P.ジンジバーリス(P. gingivalis)、F.ヌクレイタム(F. nucleatum)）を選択した。そして、同5菌種を本発明の簡易型嫌気培養キットを用いて、37℃、72時間培養を行った。培養後、培地のpHの変化および指示薬の色調の変化を測定し、各細菌の生育の有無を検討した。培養後の培地の酸化還元電位も測定した。さらに、厳密な嫌気的環境で偏性嫌気性菌を培養することができる研究室レベルでの大型嫌気グローブボックスを用い、同じ培地（指示薬を含む）で同5菌種を培養し、簡易型嫌気培養キットによる結果と比較した。また、臨床試料を採取し、本発明の嫌気培養キットを用いて嫌気性菌の培養を試みた。

（結果）
本発明の嫌気培養キットを用いて偏性嫌気性菌を含む5菌種の培養を行った結果、培地のpHは低下し、培地の色調も緑から黄色へと変化した。また、この結果は研究室レベルの大型嫌気グローブボックスで培養を行った結果と同様のものとなった。また、比較的嫌気度要求性の高いとされるE.リモスム(E. limosum)、F.ヌクレイタム(F. nucleatum)も本発明の嫌気培養キット内でも培養可能であった。これらの結果により、本発明の嫌気性菌培養キットを用いて、根管内の偏性嫌気性菌の存在の有無を簡便に確認することが可能であることが判明した。本発明の嫌気培養キットを用いた培養後に測定した培地の酸化還元電位は、-110〜-130mVの範囲であった。更に、酸素吸収剤エージレス・オーマック(三菱ガス化学株式会社製)を併用した場合の酸化還元電位は、-170〜-180mVの範囲であった。また、純培養を行った5菌種以外にも多くの菌種が含まれると推測される臨床試料を用いた培養実験でも、同様に培地の色調変化が認められた。以上より、本発明の嫌気培養キット(嫌気性細菌培養キット)の有用性が確認された。

本発明の容器及びキット、さらには方法を利用することで、一般歯科医院のチェアサイドでも、簡便且つ安価に、無菌化確認の培養試験ができるようになる。そのため、治療の精度が増し、再発の防止につながる。

本発明の培養キットの説明図。 本発明の嫌気培養キットを用いた偏性嫌気性菌の培養法の説明図。

Claims (12)

1. 開閉自在の外部口および弾力性材料で密閉されたガス注入口を有する密閉容器であって、
   前記開閉自在の外部口から密閉容器内に延在する、採取したサンプルを空気中の酸素の混入を抑制して密閉容器に移送するための中間室を有し、
   前記中間室は密閉容器内部に通じる開閉自在の内部口を有し、
   前記密閉容器の内部には、培地を保持するための空間を有する、
   ことを特徴とする嫌気性細菌培養キット用容器。
2. 前記密閉容器は、柔軟性のある透明材料からなる請求項1に記載の嫌気性細菌培養キット用容器。
3. 前記ガス注入口は密封用キャップを有する請求項1または2に記載の嫌気性細菌培養キット用容器。
4. 前記開閉自在の外部口および開閉自在の内部口は、いずれもファスナーで開閉自在とする請求項1〜3のいずれか１項に記載の嫌気性細菌培養キット用容器。
5. 請求項1〜4のいずれか１項に記載の嫌気性細菌培養キット用容器、
   前記容器の培地を保持するための空間に収容された培地、および
   前記中間室に収容された脱酸素剤
   を含む嫌気性細菌培養キット。
6. 前記培地は液体培地である請求項5に記載の嫌気性細菌培養キット。
7. 前記培地は、嫌気性細菌が産生する物質により色調が変化する指示薬を含む請求項5または6に記載の嫌気性細菌培養キット。
8. 前記開閉自在の外部口および開閉自在の内部口は、いずれもファスナーで開閉自在とし、かつ前記中間室には、前記ファスナーの開放を助けるための塊状物がさらに収容されている請求項5〜7のいずれか１項に記載の嫌気性細菌培養キット。
9. 前記塊状物は球状体である請求項8に記載の嫌気性細菌培養キット。
10. 前記中間室には、酸素検知剤がさらに収容されている請求項5〜9のいずれか１項に記載の嫌気性細菌培養キット。
11. 嫌気性細菌を担持した部材を、内部口を密閉した状態の請求項5〜10のいずれか１項に記載の嫌気性細菌培養キットの前記中間室に収容し、
    前記中間室の外部口を密閉し、
    前記中間室内の酸素を脱酸素剤によって除去し、
    前記密閉容器の内部に前記ガス注入口を介して、嫌気性ガスを注入し、
    内部口を開放して嫌気性細菌を担持した部材を培地に供給し、
    所定時間培養することを含む
    嫌気性細菌培養方法。
12. 被検査物を担持した部材を、内部口を密閉した状態の請求項5〜10のいずれか１項に記載の嫌気性細菌培養キットの前記中間室に収容し、
    前記中間室の外部口を密閉し、
    前記中間室内の酸素を脱酸素剤によって除去し、
    前記密閉容器の内部に前記ガス注入口を介して、嫌気性ガスを注入し、
    内部口を開放して嫌気性細菌を担持した部材を培地に供給し、
    所定時間培養し、
    培地の色調の変化により、被検査物が嫌気性細菌を含むか否かを判別することを含む、
    嫌気性細菌の生育判別方法。