JP5080787B2 - タンパク質改変方法、ニトリルヒドラターゼ成熟化方法、成熟化ニトリルヒドラターゼ生産方法、成熟化ニトリルヒドラターゼを用いたアミド化合物生産方法 - Google Patents
タンパク質改変方法、ニトリルヒドラターゼ成熟化方法、成熟化ニトリルヒドラターゼ生産方法、成熟化ニトリルヒドラターゼを用いたアミド化合物生産方法 Download PDFInfo
- Publication number
- JP5080787B2 JP5080787B2 JP2006309145A JP2006309145A JP5080787B2 JP 5080787 B2 JP5080787 B2 JP 5080787B2 JP 2006309145 A JP2006309145 A JP 2006309145A JP 2006309145 A JP2006309145 A JP 2006309145A JP 5080787 B2 JP5080787 B2 JP 5080787B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- protein
- nitrile hydratase
- subunit
- cobalt
- apoenzyme
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
- 108010024026 Nitrile hydratase Proteins 0.000 title claims description 142
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 48
- 230000035800 maturation Effects 0.000 title claims description 31
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title claims description 22
- -1 amide compound Chemical class 0.000 title claims description 9
- 238000003506 protein modification method Methods 0.000 title description 26
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 212
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 175
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 46
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 46
- 229910017052 cobalt Inorganic materials 0.000 claims description 10
- 239000010941 cobalt Substances 0.000 claims description 10
- GUTLYIVDDKVIGB-UHFFFAOYSA-N cobalt atom Chemical compound [Co] GUTLYIVDDKVIGB-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 10
- 241000187693 Rhodococcus rhodochrous Species 0.000 claims description 7
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 claims description 6
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 claims description 6
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims 6
- 101710204837 Envelope small membrane protein Proteins 0.000 claims 2
- 101710088839 Replication initiation protein Proteins 0.000 claims 2
- 230000005070 ripening Effects 0.000 claims 1
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 167
- 108010006591 Apoenzymes Proteins 0.000 description 58
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 47
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 46
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 40
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 33
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 23
- 108010025076 Holoenzymes Proteins 0.000 description 15
- 229910001429 cobalt ion Inorganic materials 0.000 description 15
- XLJKHNWPARRRJB-UHFFFAOYSA-N cobalt(2+) Chemical compound [Co+2] XLJKHNWPARRRJB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 15
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 15
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 15
- 239000000539 dimer Substances 0.000 description 13
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 11
- DFPAKSUCGFBDDF-UHFFFAOYSA-N Nicotinamide Chemical compound NC(=O)C1=CC=CN=C1 DFPAKSUCGFBDDF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 10
- 230000009145 protein modification Effects 0.000 description 10
- 238000001641 gel filtration chromatography Methods 0.000 description 8
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 8
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 7
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 7
- 230000026731 phosphorylation Effects 0.000 description 7
- 238000006366 phosphorylation reaction Methods 0.000 description 7
- 108010042653 IgA receptor Proteins 0.000 description 6
- 102100034014 Prolyl 3-hydroxylase 3 Human genes 0.000 description 6
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 6
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 6
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 6
- 102000007474 Multiprotein Complexes Human genes 0.000 description 5
- 108010085220 Multiprotein Complexes Proteins 0.000 description 5
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 5
- 238000009739 binding Methods 0.000 description 5
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 5
- 229960003966 nicotinamide Drugs 0.000 description 5
- 235000005152 nicotinamide Nutrition 0.000 description 5
- 239000011570 nicotinamide Substances 0.000 description 5
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 5
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 5
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 5
- HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N Acrylamide Chemical compound NC(=O)C=C HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 241000187694 Rhodococcus fascians Species 0.000 description 4
- 230000004075 alteration Effects 0.000 description 4
- 238000001142 circular dichroism spectrum Methods 0.000 description 4
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 4
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 4
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 4
- 238000009776 industrial production Methods 0.000 description 4
- 230000004853 protein function Effects 0.000 description 4
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 4
- GZPHSAQLYPIAIN-UHFFFAOYSA-N 3-pyridinecarbonitrile Chemical compound N#CC1=CC=CN=C1 GZPHSAQLYPIAIN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Natural products NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 101001057508 Homo sapiens Ubiquitin-like protein ISG15 Proteins 0.000 description 3
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 3
- 108010006519 Molecular Chaperones Proteins 0.000 description 3
- 102100027266 Ubiquitin-like protein ISG15 Human genes 0.000 description 3
- 230000021736 acetylation Effects 0.000 description 3
- 238000006640 acetylation reaction Methods 0.000 description 3
- 230000010933 acylation Effects 0.000 description 3
- 238000005917 acylation reaction Methods 0.000 description 3
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 3
- 230000029936 alkylation Effects 0.000 description 3
- 238000005804 alkylation reaction Methods 0.000 description 3
- 230000006287 biotinylation Effects 0.000 description 3
- 238000007413 biotinylation Methods 0.000 description 3
- 230000008859 change Effects 0.000 description 3
- 239000000470 constituent Substances 0.000 description 3
- 230000008030 elimination Effects 0.000 description 3
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 3
- 230000006237 glutamylation Effects 0.000 description 3
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 description 3
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 description 3
- 230000006238 glycylation Effects 0.000 description 3
- 230000006122 isoprenylation Effects 0.000 description 3
- 230000006144 lipoylation Effects 0.000 description 3
- 230000004807 localization Effects 0.000 description 3
- 239000011259 mixed solution Substances 0.000 description 3
- 230000007026 protein scission Effects 0.000 description 3
- 230000034512 ubiquitination Effects 0.000 description 3
- 238000010798 ubiquitination Methods 0.000 description 3
- 241000590020 Achromobacter Species 0.000 description 2
- 241000589291 Acinetobacter Species 0.000 description 2
- NLHHRLWOUZZQLW-UHFFFAOYSA-N Acrylonitrile Chemical compound C=CC#N NLHHRLWOUZZQLW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000607534 Aeromonas Species 0.000 description 2
- 241000589158 Agrobacterium Species 0.000 description 2
- 241000193830 Bacillus <bacterium> Species 0.000 description 2
- 241000588923 Citrobacter Species 0.000 description 2
- 241000186216 Corynebacterium Species 0.000 description 2
- 241000588914 Enterobacter Species 0.000 description 2
- 241000588698 Erwinia Species 0.000 description 2
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 2
- XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N Iron Chemical compound [Fe] XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000588748 Klebsiella Species 0.000 description 2
- 241000192041 Micrococcus Species 0.000 description 2
- 125000001429 N-terminal alpha-amino-acid group Chemical group 0.000 description 2
- 241000187654 Nocardia Species 0.000 description 2
- 241000187603 Pseudonocardia Species 0.000 description 2
- 241000589180 Rhizobium Species 0.000 description 2
- 241000589506 Xanthobacter Species 0.000 description 2
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 2
- WPYMKLBDIGXBTP-UHFFFAOYSA-N benzoic acid Chemical compound OC(=O)C1=CC=CC=C1 WPYMKLBDIGXBTP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000003054 catalyst Substances 0.000 description 2
- 230000006329 citrullination Effects 0.000 description 2
- 230000009615 deamination Effects 0.000 description 2
- 238000006481 deamination reaction Methods 0.000 description 2
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 2
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 2
- 108091005573 modified proteins Proteins 0.000 description 2
- 102000035118 modified proteins Human genes 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 241000894007 species Species 0.000 description 2
- 230000019635 sulfation Effects 0.000 description 2
- 238000005670 sulfation reaction Methods 0.000 description 2
- 230000010741 sumoylation Effects 0.000 description 2
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 2
- 241000589155 Agrobacterium tumefaciens Species 0.000 description 1
- 208000024827 Alzheimer disease Diseases 0.000 description 1
- 239000005711 Benzoic acid Substances 0.000 description 1
- 101710117545 C protein Proteins 0.000 description 1
- 108091006040 C-modified proteins Proteins 0.000 description 1
- 241000579497 Falsibacillus pallidus Species 0.000 description 1
- RHGKLRLOHDJJDR-BYPYZUCNSA-N L-citrulline Chemical compound NC(=O)NCCC[C@H]([NH3+])C([O-])=O RHGKLRLOHDJJDR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- RHGKLRLOHDJJDR-UHFFFAOYSA-N Ndelta-carbamoyl-DL-ornithine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=O RHGKLRLOHDJJDR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 1
- 241000589516 Pseudomonas Species 0.000 description 1
- 241000316848 Rhodococcus <scale insect> Species 0.000 description 1
- 241000187747 Streptomyces Species 0.000 description 1
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L Sulfate Chemical compound [O-]S([O-])(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 238000005576 amination reaction Methods 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 235000010233 benzoic acid Nutrition 0.000 description 1
- 102000023732 binding proteins Human genes 0.000 description 1
- 108091008324 binding proteins Proteins 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 239000003990 capacitor Substances 0.000 description 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 1
- 235000013477 citrulline Nutrition 0.000 description 1
- 229960002173 citrulline Drugs 0.000 description 1
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 238000006356 dehydrogenation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000003795 desorption Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 1
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 description 1
- 108091008053 gene clusters Proteins 0.000 description 1
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 description 1
- 125000003630 glycyl group Chemical group [H]N([H])C([H])([H])C(*)=O 0.000 description 1
- 229910052742 iron Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000004811 liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 238000002715 modification method Methods 0.000 description 1
- 230000000865 phosphorylative effect Effects 0.000 description 1
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 1
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 1
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 description 1
- 230000004481 post-translational protein modification Effects 0.000 description 1
- 239000008057 potassium phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 1
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 1
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 230000019491 signal transduction Effects 0.000 description 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 1
- 230000003595 spectral effect Effects 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 238000005486 sulfidation Methods 0.000 description 1
- 102000013498 tau Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010026424 tau Proteins Proteins 0.000 description 1
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 1
- 239000013638 trimer Substances 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Classifications
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
- Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
- Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
- Y02P20/52—Improvements relating to the production of bulk chemicals using catalysts, e.g. selective catalysts
Landscapes
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Description
本発明は、タンパク質改変方法などに関する。より詳しくは、新規メカニズムに基づくタンパク質改変方法、ニトリルヒドラターゼ成熟化方法、成熟化ニトリルヒドラターゼ生産方法、成熟化ニトリルヒドラターゼ、該成熟化ニトリルヒドラターゼを用いたアミド化合物生産方法に関する。
タンパク質の改変は、タンパク質の機能、性質、活性、安定性、局在性などに深く関わっている。例えば、リン酸化のようなタンパク質の修飾による改変は、生体内でのタンパク質機能制御やシグナル伝達などに関わっている。また、活性中心に金属を含有する酵素などに、金属元素を結合又は付加、若しくは脱離することによる改変は、該酵素の活性に関わっている。その他、特定のリガンドの結合若しくは脱離、アミノ酸配列の１若しくは数個のアミノ酸の欠失、置換若しくは付加などにより、構造や機能が改変されるタンパク質も多く存在する。
特許文献１には、アルツハイマー病等に関与するタウタンパク質のリン酸化方法が、特許文献２には、生理活性タンパク質をポリエチレングリコール、多糖等で修飾する方法が、特許文献３には、生理活性ペプチド又は生理活性タンパク質にアミノ供与体を有する物質を修飾する方法が開示されている。
また、非特許文献１では、一般的な金属部位の生合成メカニズムが、特許文献４では、結合タンパク質からリガンドを脱離する方法が開示されている。
なお、ニトリルヒドラターゼを成熟化（活性化）させる方法として、特許文献５では、ニトリルヒドラターゼの活性化に関与する遺伝子を用いて活性化したニトリルヒドラターゼを発現させる方法が、非特許文献２には、鉄型ニトリルヒドラターゼを成熟化させる遺伝子を用いて成熟化した鉄型ニトリルヒドラターゼを発現させる方法が開示されている。
特開２００２−３３５９８３号公報。
ＷＯ９６／０６１８１。
ＷＯ９６／１００８９。
特表平９−５０９２４９号公報。
特開平１１−２５３１６８号公報。
Chem.Rev.2004,104,509-525。
FEBS Letters 553(2003)391-396。
上記のように、タンパク質の改変は、タンパク質の機能、性質、活性、安定性、局在性などにおいて、非常に重要な役割を担っている。そのため、タンパク質の新規な改変方法の開発が期待されている。
そこで、本発明では、新規メカニズムに基づくタンパク質改変方法を提供するとともに、該方法の産業的利用を可能とすることを主目的とする。
本願発明者らは、複数のサブユニットから構成されるタンパク質の改変方法を研究した結果、一部のサブユニットを交換することにより、タンパク質を改変する新規なメカニズムを見出した。
本発明では、まず、タンパク質中の特定のサブユニット（Ａ）を、下記のいずれか一つ以上の特徴を有するタンパク質（Ｂ）に交換する段階を含むタンパク質改変方法を提供する。
（１）前記サブユニット（Ａ）と同一又は近似の構造を有し、前記構造の一部が修飾されたタンパク質（Ｂ）。
（２）前記サブユニット（Ａ）と同一又は近似の構造を有し、金属元素の結合又は付加、若しくは脱離がされたタンパク質（Ｂ）。
（３）前記サブユニット（Ａ）と同一又は近似の構造を有し、リガンドの結合若しくは脱離がされたタンパク質（Ｂ）。
（４）前記サブユニット（Ａ）と同一又は近似の構造を有し、アミノ酸配列の１若しくは数個のアミノ酸の欠失、置換若しくは付加がされたタンパク質（Ｂ）。
（１）前記サブユニット（Ａ）と同一又は近似の構造を有し、前記構造の一部が修飾されたタンパク質（Ｂ）。
（２）前記サブユニット（Ａ）と同一又は近似の構造を有し、金属元素の結合又は付加、若しくは脱離がされたタンパク質（Ｂ）。
（３）前記サブユニット（Ａ）と同一又は近似の構造を有し、リガンドの結合若しくは脱離がされたタンパク質（Ｂ）。
（４）前記サブユニット（Ａ）と同一又は近似の構造を有し、アミノ酸配列の１若しくは数個のアミノ酸の欠失、置換若しくは付加がされたタンパク質（Ｂ）。
従来、複数のサブユニットから構成されるタンパク質の改変方法は、該タンパク質を構成するサブユニット自体を直接修飾等することにより改変する方法であった。即ち、改変前の構成サブユニットは、何らかの改変が行われているものの、改変後にも該タンパク質を構成するサブユニットとして残存していた。
しかし、本発明に係るタンパク質改変方法は、タンパク質中の一部のサブユニット（Ａ）が、該タンパク質外に存在する任意のタンパク質（Ｂ）と入れ替わる方法である。即ち、改変前のサブユニット（Ａ）は、前記タンパク質中には残存しない新規な方法である。
本発明に係るタンパク質改変方法は、あらゆるタンパク質改変に用いることができる。例えば、アセチル化、アルキル化、ビオチン化、アシル化、グルタミル化、グリシル化、グリコシル化、イソプレニル化、リポイル化、ホスホパンテテイン化、リン酸化、硫酸化、ISG15化、SUMO化、ユビキチン化、シトルリン化、脱アミノ化、前記構造の一部のジスルフィド化、前記構造の一部のタンパク質切断などの修飾機構のいずれか又は複数による修飾に基づくタンパク質改変、金属元素の結合又は付加、若しくは脱離に基づくタンパク質改変、リガンド結合若しくは脱離に基づくタンパク質改変、アミノ酸配列の１若しくは数個のアミノ酸の欠失、置換若しくは付加に基づくタンパク質改変などに用いることができる。
また、本発明に係るタンパク質改変方法は、酵素として機能するタンパク質の改変にも用いることができる。該酵素は特に限定されないが、一例としては、ニトリルヒドラターゼを挙げることができる。
本発明に係るタンパク質改変方法を用いてニトリルヒドラターゼを改変する方法の一例として、ニトリルヒドラターゼ成熟化方法を説明する。ニトリルヒドラターゼは、αサブユニット、及びβサブユニットから形成され、その活性中心に金属元素を有する酵素であるが、金属元素の含有量が低いと、その活性も低い。そこで、ニトリルヒドラターゼの金属元素低含有型αサブユニットを、金属元素高含有型αサブユニットに交換することで、金属元素含有量を高め、酵素活性の高いニトリルヒドラターゼへと成熟化することができる。
本発明に係る成熟化方法は、微生物由来のニトリルヒドラターゼに用いることができ、その微生物の種は限定されない。一例としては、Rhodococcus rhodochrous J1菌由来のニトリルヒドラターゼを挙げることができる。
また、ニトリルヒドラターゼの活性中心金属も限定されない。工業的に多く用いられるものとしては、例えば、コバルト元素を活性中心に持つコバルト型ニトリルヒドラターゼが挙げられる。
本発明に係るニトリルヒドラターゼ成熟化において、交換に用いる金属元素高含有型αサブユニットは、そのαサブユニット同士の交換に支障がなければ、その形態は限定されない。例えば、他のタンパク質と複合体を形成した状態で用いることも可能である。
この場合、それぞれのαサブユニット同士が交換されるので、成熟化後、成熟化ニトリルヒドラターゼは金属元素高含有型αサブユニットを含有し、一方の前記タンパク質複合体は金属元素低含有量αサブユニット含有することとなる。
本発明に係るニトリルヒドラターゼ成熟化に用いることが可能であり、かつ、コバルト元素高含有型αサブユニットを含むタンパク質複合体として、配列番号１に示すアミノ酸配列を有するタンパク質と、配列番号２に示すアミノ酸配列を有するタンパク質と、を有するタンパク質複合体を例示する。
本発明に係るニトリルヒドラターゼ成熟化方法を用いれば、酵素活性の高い成熟化ニトリルヒドラターゼを大量に生産することができる。成熟化ニトリルヒドラターゼは、様々なニトリル化合物からアミド化合物への変換酵素として、アミド化合物の工業的生産に用いることができる。例えば、アクリルニトリルからアクリルアミドへの変換酵素として用いることができる。また、３−シアノピリジンからニコチンアミドへの変換酵素としても用いることができる。
以下、本発明で使用する技術用語等を説明する。
「タンパク質の改変」とは、タンパク質の構造の一部の修飾、金属元素等の結合又は付加若しくは脱離、リガンドの結合若しくは脱離、アミノ酸配列の１若しくは数個のアミノ酸の欠失、置換若しくは付加、などに基づいて、該タンパク質の機能、活性、安定性、局在性などの性質を変化させることを意味する。
「修飾」とは、広く翻訳後修飾を意味し、アセチル化、アルキル化、ビオチン化、アシル化、グルタミル化、グリシル化、グリコシル化、イソプレニル化、リポイル化、ホスホパンテテイン化、リン酸化、硫酸化、ISG15化、SUMO化、ユビキチン化、シトルリン化、脱アミノ化、前記構造の一部のジスルフィド化、前記構造の一部のタンパク質切断などの修飾機構のいずれか又は複数によるもの、及び、これらを工業的に行うことを含む。
「成熟化ニトリルヒドラターゼ」とは、構造変換により、活性中心金属含有量が高く活性化した状態の酵素を意味する。
本発明に係るタンパク質改変方法は、従来のタンパク質改変方法とは全く異なるメカニズムに基づく方法であるため、あらゆる分野において、様々な状況に応じて、タンパク質改変方法の選択の幅を増やすことができる。
以下、本発明を実施するための好適な形態について図面を参照しながら説明する。なお、以下に説明する実施形態は、本発明の代表的な実施形態の一例を示したものであり、これにより本発明の範囲が狭く解釈されることはない。
＜タンパク質改変方法について＞
本発明に係るタンパク質改変方法について、図１を用いて説明する。
本発明に係るタンパク質改変方法について、図１を用いて説明する。
図１は、本発明に係るタンパク質改変方法を模式的に示す図である。
図１中符号１は、サブユニットＡとサブユニットＣから構成されるタンパク質を示している。該タンパク質１は、便宜上、２つのサブユニットから構成されるタンパク質を例示しているが、３つ以上のサブユニットから構成されるタンパク質であってもよい。該タンパク質１の特定のサブユニットＡが、別のタンパク質Ｂと交換されることにより、改変されたタンパク質２１となる（図１中（Ｉ）参照）。
タンパク質Ｂは、下記のいずれか一つ以上の特徴を有するタンパク質である。
（１）サブユニットＡと同一又は近似の構造を有し、前記構造の一部が修飾されたタンパク質。
（２）サブユニットＡと同一又は近似の構造を有し、金属元素の結合又は付加、若しくは脱離がされたタンパク質。
（３）サブユニットＡと同一又は近似の構造を有し、リガンドの結合若しくは脱離がされたタンパク質。
（４）サブユニットＡと同一又は近似の構造を有し、アミノ酸配列の１若しくは数個のアミノ酸の欠失、置換若しくは付加がされたタンパク質。図１では、タンパク質Ｂの一例として、サブユニットＡと同一の構造を有し、かつ、リン酸化により修飾されたタンパク質（「タンパク質Ａｐ」と称する。）を例示して説明する（図１中かっこ参照）。
（１）サブユニットＡと同一又は近似の構造を有し、前記構造の一部が修飾されたタンパク質。
（２）サブユニットＡと同一又は近似の構造を有し、金属元素の結合又は付加、若しくは脱離がされたタンパク質。
（３）サブユニットＡと同一又は近似の構造を有し、リガンドの結合若しくは脱離がされたタンパク質。
（４）サブユニットＡと同一又は近似の構造を有し、アミノ酸配列の１若しくは数個のアミノ酸の欠失、置換若しくは付加がされたタンパク質。図１では、タンパク質Ｂの一例として、サブユニットＡと同一の構造を有し、かつ、リン酸化により修飾されたタンパク質（「タンパク質Ａｐ」と称する。）を例示して説明する（図１中かっこ参照）。
タンパク質１は、その構成サブユニットＡを、リン酸化により修飾されたタンパク質Ａｐに交換することにより、リン酸化により改変されたタンパク質２２となる（図１中（II）参照）。
タンパク質Ｂは、リン酸化による修飾をうけたタンパク質Ａｐに限定されない。例えば、アセチル化、アルキル化、ビオチン化、アシル化、グルタミル化、グリシル化、グリコシル化、イソプレニル化、リポイル化、ホスホパンテテイン化、硫酸化、ISG15化、SUMO化、ユビキチン化、シトルリン化、脱アミノ化、前記構造の一部のジスルフィド化、前記構造の一部のタンパク質切断などの修飾機構のいずれか又は複数によるもの、及び、これらを工業的に行うことにより修飾されたタンパク質であってもよい。
また、タンパク質Ｂは、サブユニットＡと同一又は近似の構造を有するタンパク質であって、任意の金属元素を結合又は付加若しくは脱離、特定のリガンドの結合若しくは脱離、アミノ酸配列の１若しくは数個のアミノ酸の欠失、置換若しくは付加、などの特徴を有するタンパク質であってもよい。
更に、タンパク質Ｂは、サブユニットＡとの交換に支障がなければ、その形態は限定されない。例えば、他のタンパク質と複合体を形成した状態で用いることも可能である。
このように、本発明に係るタンパク質改変方法は、タンパク質１の構成サブユニットＡ、Ｃ自体を直接、修飾等するのではなく、タンパク質１中の特定のサブユニットＡを、タンパク質１外に存在し、修飾等された別のタンパク質Ｂに交換することにより、タンパク質１全体としての改変を行う新規メカニズムに基づく改変方法である。
本発明に係るタンパク質改変方法は、酵素として機能するタンパク質の改変などにも用いることができる。本発明に係るタンパク質改変方法を用いれば、例えば、酵素活性の強弱の調節、酵素基質特異性の変更、至適温度・至適ｐＨの変更、アポ酵素からホロ酵素への変換、局在部位の変更などの酵素タンパク質の改変が可能である。
本発明に係る酵素タンパク質の改変について、ニトリルヒドラターゼを例示して説明する。
＜ニトリルヒドラターゼ成熟化方法＞
図２は、ニトリルヒドラターゼ成熟化方法を模式的に示す図である。
図２は、ニトリルヒドラターゼ成熟化方法を模式的に示す図である。
図２（I）は、４量体及び２量体の未成熟ニトリルヒドラターゼを示す。未成熟ニトリルヒドラターゼとは、構造変換が不完全で、活性中心金属含有量が低く、酵素活性の低いニトリルヒドラターゼを意味する。図２中符号α１は、ニトリルヒドラターゼの金属元素低含有型αサブユニットを示す。図２中符号βは、ニトリルヒドラターゼのβサブユニットを示す。
図２中符号α２は、金属元素高含有型αサブユニットを示す。図２に示すように、４量体及び２量体の未成熟ニトリルヒドラターゼの金属元素低含有型αサブユニットα１を、金属元素高含有型αサブユニットα２に交換する。そして、ニトリルヒドラターゼ自体の金属元素含有量が増加する。その結果、ニトリルヒドラターゼが酵素活性の高い状態へと成熟化する（図２（II）参照）。
本発明に係る成熟化方法は、微生物由来のニトリルヒドラターゼの成熟化に用いることができ、その微生物の種は限定されない。例えば、Achromobacter属、Acinetobacter属、Aeromonas属、Agrobacterium属、Bacillus属、Citrobacter属、Corynebacterium属、Enterobacter属、Erwinia属、Klebsiella属、Micrococcus属、Nocardia属、Pseudomonas属、Pseudonocardia属、Rhodococcus属 Streptomyces属、Thermophila属、Rhizobium属、Xanthobacter属などに属する微生物由来のニトリルヒドラターゼに用いることができる。好適な一例としては、Rhodococcus rhodochrous J1菌由来のニトリルヒドラターゼが挙げられる。
本発明に係るニトリルヒドラターゼ成熟化方法では、その活性中心である金属元素含有量を増加させるが、該金属元素も、特に限定されない。例えば、コバルト、鉄等が挙げられる。
交換に用いる金属元素高含有型αサブユニットα２は、αサブユニット同士の交換に支障がなければ、その形態は限定されない。例えば、他のタンパク質と複合体を形成した状態で用いることも可能である。金属元素高含有型αサブユニットα２を含むタンパク質複合体を用いて、ニトリルヒドラターゼを成熟化する方法について、図３を用いて説明する。
図３は、金属元素高含有型αサブユニットα２を含むタンパク質複合体を用いたニトリルヒドラターゼ成熟化方法を模式的に示す図である。
前記タンパク質複合体の一例を図３中（Ｘ）で示す。該タンパク質複合体は、金属元素高含有型αサブユニットα２とタンパク質ｅとからなるタンパク質複合体である（以下「タンパク質複合体αｅ２」と称する）。
図３に示すように、４量体及び２量体の未成熟ニトリルヒドラターゼの金属元素低含有型αサブユニットα１が、タンパク質複合体αｅ２を構成する金属元素高含有型αサブユニットα２と交換する。そして、ニトリルヒドラターゼ自体の金属元素含有量が増加する。その結果、ニトリルヒドラターゼが酵素活性の高い状態へと成熟化する（図３（II）参照）。
このとき、タンパク質複合体αｅ２を構成するαサブユニットは、金属元素低含有型αサブユニットα１に交換されている（図３（Ｙ）参照）。
前記タンパク質複合体αｅ２は、金属元素高含有型αサブユニットα２を少なくとも含むタンパク質複合体であれば特に限定されない。一例としては、配列番号１に示すアミノ酸配列を有するタンパク質（金属元素高含有型αサブユニットα２。以下「ＮｈｌＡタンパク質」とする。）と、配列番号２に示すアミノ酸配列を有するタンパク質（以下、「ＮｈｌＥタンパク質」とする。）とから形成されたタンパク質複合体を挙げることができる。
なお、前記ＮｈｌＡタンパク質は、未成熟ニトリルヒドラターゼの金属元素低含有型αサブユニットα１と交換可能であれば、配列番号１に示すアミノ酸配列を有するものの実に狭く限定されない。即ち、配列番号１に示すアミノ酸配列の一部が置換、欠損、挿入等されたアミノ酸配列を有するタンパク質も、ＮｈｌＡタンパク質に包含される。
また、前記ＮｈｌＥタンパク質も、前記交換を妨げない性質であれば、配列番号２に示すアミノ酸配列を有するものの実に狭く限定されない。即ち、配列番号２に示すアミノ酸配列の一部が置換、欠損、挿入等されたアミノ酸配列を有するタンパク質も、ＮｈｌＥタンパク質に包含される。更に、ＮｈｌＥタンパク質が、前記交換において、シャペロンとして機能するタンパク質であると、より好適である。「シャペロン」とは、ニトリルヒドラターゼの立体構造の形成やＮｈｌＡタンパク質の運搬を助けるタンパク質を意味する。
ＮｈｌＥタンパク質をコードする遺伝子（以下、「ｎｈｌＥ遺伝子」とする。）は、ニトリルヒドラターゼをコードする遺伝子（即ち、この酵素のαサブユニット及びβサブユニットをコードする遺伝子。以下、それぞれ、「ｎｈｌＡ遺伝子」、及び「ｎｈｌＢ遺伝子」とする。）の近傍に位置する。
これらの遺伝子を有するものとして、例えば、Achromobacter属、Acinetobacter属、Aeromonas属、Agrobacterium属、Bacillus属、Citrobacter属、Corynebacterium属、Enterobacter属、Erwinia属、Klebsiella属、Micrococcus属、Nocardia属、Pseudomonas属、Pseudonocardia属、Rhodococcus属 Streptomyces属、Thermophila属、Rhizobium属、Xanthobacter属などの微生物を挙げることができる。代表例として、Rhodococcus rhodochrous J1菌における塩基配列を配列表（配列番号３）に示す。
前記タンパク質複合体は、ｎｈｌＡ遺伝子をコードする配列（配列番号３に示す塩基配列のうち第７４５番目から第１３６８番目の配列、図中「ｎｈｌＡ」参照。）とｎｈｌＥ遺伝子をコードする配列（配列番号３に示す塩基配列のうち第１３７０番目から第１８１６番目の配列、図中「ｎｈｌＥ」参照。）を少なくとも含むプラスミドを用いて、取得することができる。該プラスミドの構成例を図４に模式的に示す。
例えば、このプラスミドで、所定の培養細胞などを形質転換し、細胞内で大量発現させた後、精製することにより、本発明に係るタンパク質複合体を簡易かつ大量に取得できる。なお、本発明に係るタンパク質複合体の調製手段としては、公知の方法が広く適用可能であり、同調製手段は、前記手段のみに狭く限定されない。
図４に示すプラスミドは、公知の方法により、作製できる。例えば、ｎｈｌＡ遺伝子及びｎｈｌＥ遺伝子と同じ配列を有するＤＮＡを調製し、それらのＤＮＡ（予め連結したものを含む）とプラスミドＤＮＡとを制限酵素（例えば、図中「Ｘｂａ Ｉ」及び「Ｓａｃ Ｉ」参照。）で処理した後、連結酵素で処理することにより、即ち、プラスミドＤＮＡにそれらのＤＮＡを組み込むことにより、前記プラスミドを作製できる。
＜成熟化ニトリルヒドラターゼ生産方法について＞
本発明に係るニトリルヒドラターゼ成熟化方法を、ニトリルヒドラターゼ生産方法の一工程で使用すれば、成熟化したニトリルヒドラターゼを生産することができる。成熟化ニトリルヒドラターゼ生産方法を、図５、及び図６を用いて説明する。
本発明に係るニトリルヒドラターゼ成熟化方法を、ニトリルヒドラターゼ生産方法の一工程で使用すれば、成熟化したニトリルヒドラターゼを生産することができる。成熟化ニトリルヒドラターゼ生産方法を、図５、及び図６を用いて説明する。
図５は、本発明に係る成熟化ニトリルヒドラターゼ生産方法の一実施形態を模式的に示す図である。図５中ＳＴＥＰ１は、in vivo（宿主内）、ＳＴＥＰ２は、in vitroでの様子を示す。
まず、ｎｈｌＥ遺伝子とｎｈｌＡ遺伝子の２つのＯＲＦを持つプラスミドpREIT‐nhlAEを宿主に導入し、タンパク質複合体４（αｅ２）を精製する。発明者らの研究の結果、該タンパク質複合体を構成するＮｈｌＡタンパク質（ニトリルヒドラターゼのαサブユニット）は、金属元素高含有型であることが分かっている（実施例６参照）。
また、ｎｈｌＡ遺伝子とｎｈｌＢ遺伝子の２つのＯＲＦを持つプラスミドpREIT‐nhlBAを宿主に導入し、４量体３１（α２β２）、及び２量体３２（αβ）のニトリルヒドラターゼを精製する。発明者らの研究の結果、これらのニトリルヒドラターゼは、金属元素含有量が低く、酵素活性も低いことが分かっている(実施例２参照)。また、これらのニトリルヒドラターゼを構成するαサブユニットは、金属元素低含有型であることも分かっている（実施例４参照）。
次に、前記タンパク質複合体４（αｅ２）を用いて、本発明に係るニトリルヒドラターゼ成熟化を行う。具体的には、精製したタンパク質複合体４（αｅ２）と、未成熟ニトリルヒドラターゼ（４量体３１（α２β２）、２量体３２（αβ））とを、in vitroにおいて混合等する。このとき、図５に示すように、４量体３１（α２β２）及び２量体３２（αβ）の未成熟ニトリルヒドラターゼの金属元素低含有型αサブユニットα１が、タンパク質複合体αｅ２を構成する金属元素高含有型αサブユニットα２と交換される。そして、ニトリルヒドラターゼ自体の金属元素含有量が増加する。その結果、ニトリルヒドラターゼが酵素活性の高い状態へと成熟化し、成熟化ニトリルヒドラターゼ５を生産することができる。
従来、成熟化ニトリルヒドラターゼを生産するには、ニトリルヒドラターゼ構造遺伝子と共に、ニトリルヒドラターゼの成熟化に関わる遺伝子を同一の宿主内に導入し、成熟化ニトリルヒドラターゼとして発現させる必要があった。
しかし、本発明に係るニトリルヒドラターゼ成熟化方法を用いれば、一旦、未成熟なまま発現したニトリルヒドラターゼであっても、発現後に成熟化させることが可能となった。従って、未成熟ニトリルヒドラターゼから、別に発現させたタンパク質複合体４（αｅ２）を用いたニトリルヒドラターゼ成熟化を行うことによって、成熟化ニトリルヒドラターゼを工業的に生産することができる。
本発明に係る成熟化ニトリルヒドラターゼ生産方法は、未成熟ニトリルヒドラターゼとタンパク質複合体４（αｅ２）を混合する方法を用いることに限定されず、前記混合以外にも、添加、滴下など、未成熟ニトリルヒドラターゼとタンパク質複合体４（αｅ２）が接触等する方法全てを包含する。
図６は、本発明に係る成熟化ニトリルヒドラターゼ生産方法の図５とは異なる一実施形態を模式的に示す図である。ｎｈｌＥ遺伝子、ｎｈｌＡ遺伝子、及びｎｈｌＢ遺伝子の３つのＯＲＦを持つプラスミドpREIT-nhlBAEを宿主に導入した様子を示す。本実施形態は、本発明に係る成熟化ニトリルヒドラターゼ生産方法を、同一の宿主内で行う実施形態である。
ｎｈｌＡ遺伝子、及びｎｈｌＢ遺伝子からは、４量体α２β２と２量体αβのニトリルヒドラターゼが発現する（図６中符号３１、３２で示す）。前記と同様、このときの４量体３１（α２β２）、及び２量体３２（αβ）のニトリルヒドラターゼは、活性中心金属の含有量、及び酵素活性が低い。また、これらのニトリルヒドラターゼを構成するαサブユニットは、金属元素低含有型である。
一方、ｎｈｌＥ遺伝子、及びｎｈｌＡ遺伝子からは、本発明に係るニトリルヒドラターゼ成熟化に用いることが可能なタンパク質複合体αｅ２が発現する（図６中符号４で示す）。前記と同様、該タンパク質複合体を構成するＮｈｌＡタンパク質（ニトリルヒドラターゼのαサブユニット）は、金属元素高含有型であることが分かっている（実施例６参照）。
次に、前記タンパク質複合体４（αｅ２）を用いて、本発明に係るニトリルヒドラターゼ成熟化が行われる。図５に示すように、４量体３１（α２β２）及び２量体３２（αβ）の未成熟ニトリルヒドラターゼの金属元素低含有型αサブユニットα１が、タンパク質複合体４（αｅ２）を構成する金属元素高含有型αサブユニットα２と交換される。そして、ニトリルヒドラターゼ自体の金属元素含有量が増加する。その結果、ニトリルヒドラターゼが酵素活性の高い状態へと成熟化し、成熟化ニトリルヒドラターゼ５を生産することができる。
このように、本発明に係るニトリルヒドラターゼ成熟化方法をニトリルヒドラターゼ生産の一工程に使用すれば、成熟化ニトリルヒドラターゼを大量に産することができる。
本発明に係る成熟化ニトリルヒドラターゼ生産方法は、図５、及び図６で示した方法に限定されず、本発明に係るニトリルヒドラターゼ成熟化方法を使用する工程を少なくとも含む方法を全て包含する。
＜成熟化ニトリルヒドラターゼの工業的利用について＞
前記生産方法で得られた成熟化ニトリルヒドラターゼは、反応性が高いため、あらゆるアミド化合物の工業的生産に用いることができる。
前記生産方法で得られた成熟化ニトリルヒドラターゼは、反応性が高いため、あらゆるアミド化合物の工業的生産に用いることができる。
例えば、本発明に係る成熟化ニトリルヒドラターゼは、アクリルアミドの工業的生産において、アクリルニトリルからアクリルアミドへの変換酵素として、用いることができる。本発明に係るアクリルアミド生産方法は、成熟化ニトリルヒドラターゼを前記変換酵素として用いる工程を含む方法を全て包含する。
また、本発明に係る成熟化ニトリルヒドラターゼは、ニコチンアミドの工業的生産において、３−シアノピリジンからニコチンアミドへの変換酵素として、用いることができる。本発明に係るニコチンアミド生産方法は、成熟化ニトリルヒドラターゼを前記変換酵素として用いる工程を含む方法を全て包含する。
実施例１では、以下実施例２から実施例５において使用するプラスミドを構築した。
なお、以下の実施例では、本発明に係るタンパク質改変方法の新規メカニズムを解明するために、タンパク質の一例として、ニトリルヒドラターゼを用いている。しかし、本発明に係るタンパク質改変方法は、該ニトリルヒドラターゼの改変に限定されず、該ニトリルヒドラターゼのように、複数のサブユニットから構成されるタンパク質全てに適用できる。
Rhodococcus rhodochrous J1菌（特開平０５−２１９９７２号参照）由来のニトリルヒドラターゼ遺伝子を含むプラスミドpLJK60（J.Biol.Chem.,271,15796-15802 1996）を鋳型としてＰＣＲを行い、得られたＰＣＲ産物を本願発明者が先に発明したプラスミドpREIT19（特願2004-380940）に連結した。図７（ｍ）にプラスミドpLJK60に存在する遺伝子部位を模式的に示す。
そして、以下（I）から（III）のプラスミドを構築した。これらのプラスミドの遺伝子部位を、図７（I）から（III）に、模式的に示す。
（I）ｎｈｌＡ遺伝子（配列番号３に示す塩基配列のうち第７４５番目から第１３６８番目、図７中「ｎｈｌＡ」参照、以下同じ）、ｎｈｌＢ遺伝子（配列番号３に示す塩基配列のうち第１番目から第６８１番目、図７中「ｎｈｌＢ」参照、以下同じ）、及びｎｈｌＥ遺伝子（配列番号３に示す塩基配列のうち第１３７０番目から第１８１６番目、図７中「ｎｈｌＥ」参照、以下同じ）の３つのＯＲＦを持つプラスミドpREIT-nhlBAE。
（II）ｎｈｌＡ遺伝子、及びｎｈｌＢ遺伝子の２つのＯＲＦを持つプラスミドpREIT-nhlBA。
（III）ｎｈｌＡ遺伝子、及びｎｈｌＥ遺伝子の２つのＯＲＦを持つプラスミドpREIT-nhlAE。
（I）ｎｈｌＡ遺伝子（配列番号３に示す塩基配列のうち第７４５番目から第１３６８番目、図７中「ｎｈｌＡ」参照、以下同じ）、ｎｈｌＢ遺伝子（配列番号３に示す塩基配列のうち第１番目から第６８１番目、図７中「ｎｈｌＢ」参照、以下同じ）、及びｎｈｌＥ遺伝子（配列番号３に示す塩基配列のうち第１３７０番目から第１８１６番目、図７中「ｎｈｌＥ」参照、以下同じ）の３つのＯＲＦを持つプラスミドpREIT-nhlBAE。
（II）ｎｈｌＡ遺伝子、及びｎｈｌＢ遺伝子の２つのＯＲＦを持つプラスミドpREIT-nhlBA。
（III）ｎｈｌＡ遺伝子、及びｎｈｌＥ遺伝子の２つのＯＲＦを持つプラスミドpREIT-nhlAE。
実施例２では、実施例１で構築した（Ｉ）〜（III）のプラスミドを宿主に導入し、発現したタンパク質のニトリルヒドラターゼ活性を調べた。
まず、Rhodococcus fascians DSM43985を宿主として、（Ｉ）〜（III）のプラスミドを導入し、それぞれタンパク質を発現させ、精製した。発現・精製したそれぞれのタンパク質のゲル濾過クロマトグラフィーにおける保持容量を図８に、SDS-PAGE（Sodium dodecyl sulfate-polyacrylamidegel electrophoresis）の結果を図９に示す。
プラスミドpREIT-nhlBAE（Ｉ）からは、４量体（α２β２）のタンパク質（図８（１）、図９lane１参照）が、プラスミドpREIT-nhlBA（II）からは、４量体（α２β２）及び２量体（αβ）のタンパク質（図８（２）（３）、図９lane２、３参照）が、プラスミドpREIT-nhlAE（III）からは、３量体（αｅ２）のタンパク質（図８（４）、図９lane４）が、それぞれ発現し、精製できた。
発現・精製したそれぞれのタンパク質のニトリルヒドラターゼ活性を調べた。なお、ニトリルヒドラターゼ活性測定は、以下のように行った（以下同様）。
水で希釈した精製酵素溶液、50mMリン酸カリウム緩衝液（pH7.5）、20mM 3-シアノピリジンを含む0.5mL中で、20℃にて20分間反応後、アセトニトリルを0.5mL加えることにより反応を停止させた。酵素反応により生成したニコチンアミドをHPLCにより分析した。HPLCの解析条件は表１の通りである。１分間に１mmolの安息香酸を生成する酵素量を１unitとした。
発現・精製したそれぞれのタンパク質のニトリルヒドラターゼ活性を表２に示す。プラスミドpREIT-nhlBAE（Ｉ）から発現した４量体（α２β２）のタンパク質のニトリルヒドラターゼ活性は、320U/mgと高い数値を示した。プラスミドpREIT-nhlBA（II）から発現した４量体（α２β２）及び２量体（αβ）のタンパク質のニトリルヒドラターゼ活性は、それぞれ83U/mg、4U/mgと低い数値を示した。プラスミドpREIT-nhlAE（III）から発現した３量体（αｅ２）のタンパク質は、ニトリルヒドラターゼ活性を示さなかった。
実施例２では、プラスミドpREIT-nhlBAE（Ｉ）からは、成熟化した４量体（α２β２）のニトリルヒドラターゼ（以下「ホロ酵素α２β２」と称する。）が発現し、pREIT-nhlBA（II）からは、未成熟の４量体（α２β２）及び２量体（αβ）のニトリルヒドラターゼ（以下それぞれ「アポ酵素α２β２」「アポ酵素αβ」と称する。）が発現することが分かった。
実施例３では、in vitroにおいて、アポ酵素α２β２、及びアポ酵素αβから、ホロ酵素α２β２への改変を試みた。
実施例２で発現させたアポ酵素α２β２（比活性83U/mg）、及びアポ酵素αβ（比活性4U/mg）を、それぞれ、２倍量の（実施例２で発現させた）タンパク質複合体αｅ２と混合し、ゲル濾過カラムを用いて混合溶液を分画・精製した。
まず、アポ酵素α２β２とタンパク質複合体αｅ２との混合溶液を分画・精製した。その結果、４量体（α２β２）酵素の大きさはそのままであったが、この酵素の比活性は、328.4U/mgまで上昇した。生成した酵素を「Ｒ−アポ酵素α２β２」と称する。
混合時（０時間）のアポ酵素α２β２とタンパク質複合体αｅ２のゲル濾過クロマトグラフィーにおける保持容量を図１０中Ａに、混合後１２時間後のＲ−アポ酵素α２β２とタンパク質複合体αｅ２のゲル濾過クロマトグラフィーにおける保持容量を図１０中Ｂに示す。新たに生成したＲ−アポ酵素α２β２の比活性は、328.4U/mgであった。比活性を表３に示す。Ｒ−アポ酵素α２β２の比活性は、プラスミドpREIT-BAE（I）を導入したRhodococcus fascians DSM43985から発現・精製したホロ酵素α２β２の比活性と同じレベルであった。
次に、アポ酵素αβとタンパク質複合体αｅ２との混合溶液を分画した。その結果、新たに４量体（α２β２）酵素が生成した。生成した酵素を「Ｒ−アポ酵素αβ（α２β２）」と称する。
混合時（０時間）のアポ酵素αβとタンパク質複合体αｅ２のゲル濾過クロマトグラフィーにおける保持容量を図１０中Ｃに、混合後１２時間後のＲ−アポ酵素αβ（α２β２）とタンパク質複合体αｅ２のゲル濾過クロマトグラフィーにおける保持容量を図１０中Ｄに示す。新たに生成したＲ−アポ酵素αβ（α２β２）の比活性は、326.2U/mgであった。比活性を表３に示す。これも、プラスミドpREIT-BAE（I）を導入したRhodococcus fascians DSM43985から発現・精製したホロ酵素α２β２の比活性と同じレベルであった。
実施例３では、in vitroにおいて、酵素活性の低い未成熟な状態で発現したアポ酵素α２β２、及びアポ酵素αβを、タンパク質複合体αｅ２を用いることにより、酵素活性の高い成熟化したホロ酵素α２β２へと改変させることができた。
実施例４では、以下に示す、実施例２で発現させたタンパク質、及び実施例３で改変させたタンパク質について、コバルトイオン含有量の測定を行った。
（ａ）pREIT-nhlBAE（I）を導入して発現したホロ酵素α２β２。
（ｂ）pREIT-nhlBA（II）を導入して発現したアポ酵素α２β２。
（ｃ）pREIT-nhlBA（II）を導入して発現したアポ酵素αβ。
（ｄ）pREIT-nhlAE（III）を導入して発現したタンパク質αｅ２。
（ｅ）（ｂ）のアポ酵素α２β２を改変させたＲ−アポ酵素α２β２。
（ｆ）（ｃ）のアポ酵素αβを改変させたＲ−アポ酵素αβ（α２β２）。
（ａ）pREIT-nhlBAE（I）を導入して発現したホロ酵素α２β２。
（ｂ）pREIT-nhlBA（II）を導入して発現したアポ酵素α２β２。
（ｃ）pREIT-nhlBA（II）を導入して発現したアポ酵素αβ。
（ｄ）pREIT-nhlAE（III）を導入して発現したタンパク質αｅ２。
（ｅ）（ｂ）のアポ酵素α２β２を改変させたＲ−アポ酵素α２β２。
（ｆ）（ｃ）のアポ酵素αβを改変させたＲ−アポ酵素αβ（α２β２）。
（ａ）から（ｆ）のそれぞれの酵素について、コバルトイオン含有量の測定結果を表４に示す。
（ａ）pREIT-BAE（I）を導入して発現したホロ酵素α２β２はαβサブユニットあたり1.06モル（2.12モル/α２β２）のコバルトイオンを含有しているのに対し、（ｂ）pREIT-BA（II）を導入して発現したアポ酵素α２β２、及び（ｃ）pREIT-BA（II）を導入して発現したアポ酵素α２β２は、それぞれαβサブユニットあたり0.036モル（0.072モル/α２β２）、0.030モルのコバルトイオンしか含有していなかった。また、（ｂ）のアポ酵素α２β２と混合するタンパク質複合体αｅ２、及び（ｃ）のアポ酵素αβと混合する（ｄ）タンパク質複合体αｅ２のコバルトイオン含有量は、どちらもαｅ２サブユニットあたり0.92モルであった。
しかし、（ｂ）のアポ酵素α２β２、及び（ｃ）のアポ酵素αβをそれぞれタンパク質複合体αｅ２と混合した後に改変した（ｅ）Ｒ−アポ酵素α２β２、及び（ｆ）Ｒ−アポ酵素αβ（α２β２）のコバルトイオン含有量は、それぞれ、αβサブユニットあたり1.16モル（2.32モル/α２β２）、1.18モル（2.36モル/α２β２）と増加した。
一方で、混合後の（ｄ）タンパク質複合体αｅ２のコバルトイオン含有量は、それぞれ、αｅ２サブユニットあたり0.40モル、0.42モルと減少していた。
実施例４の結果より、タンパク質複合体αｅ２は、コバルトイオン含量が少なく比活性の低いアポ酵素α２β２、及びアポ酵素αβに対し、自身のコバルトイオンを受け渡すことにより、酵素活性を上昇させることが分かった。
実施例５では、実施例４で用いた（ａ）〜（ｃ）、（ｅ）、（ｆ）のそれぞれの酵素について、内部構造の違いを調べるためにＣＤスペクトルを測定した。
ＣＤスペクトルパターンを図１１に示す。
（ａ）pREIT-nhlBAE（I）を導入して精製したホロ酵素α２β２：黒
（ｂ）pREIT-nhlBA（II）を導入して精製したアポ酵素α２β２：赤
（ｃ）pREIT-nhlBA（II）を導入して精製したアポ酵素αβ：青
（ｅ）（ｂ）のアポ酵素α２β２を改変させたＲ−アポ酵素α２β２：緑
（ｆ）（ｃ）のアポ酵素αβを改変させたＲ−アポ酵素αβ（α２β２）：紫
（ａ）pREIT-nhlBAE（I）を導入して精製したホロ酵素α２β２：黒
（ｂ）pREIT-nhlBA（II）を導入して精製したアポ酵素α２β２：赤
（ｃ）pREIT-nhlBA（II）を導入して精製したアポ酵素αβ：青
（ｅ）（ｂ）のアポ酵素α２β２を改変させたＲ−アポ酵素α２β２：緑
（ｆ）（ｃ）のアポ酵素αβを改変させたＲ−アポ酵素αβ（α２β２）：紫
図１１に示す通り、（ａ）ホロ酵素α２β２（黒）と比較して、（ｂ）アポ酵素α２β２（赤）、及び（ｃ）アポ酵素αβ（青）は、異なるＣＤスペクトルパターンを示した。
しかし、タンパク質複合体αｅ２と混合後に改変した（ｅ）Ｒ−アポ酵素α２β２（緑）、及び（ｆ）Ｒ−アポ酵素αβ（α２β２）（紫）は、（ａ）ホロ酵素α２β２（黒）と同じＣＤスペクトルパターンを示すようになった。
実施例５の結果より、（ｂ）アポ酵素α２β２（赤）、及び（ｃ）アポ酵素αβ（青）は、（ａ）ホロ酵素α２β２と内部構造が異なるが、タンパク質複合体αｅ２と混合することにより、（ａ）ホロ酵素α２β２と同じ構造へと改変することが明らかとなった。
実施例６では、タンパク質複合体αｅ２に含有されるコバルトイオンが、ＮｈｌＡタンパク質（αサブユニット）、又はＮｈｌＥタンパク質のどちらに含有されているかを調べた。
まず、液体クロマトグラフィーにおける保持容量（図１２）、及びSDS-PAGE（図１３）上のバンドを指標に、ＮｈｌＡタンパク質（αサブユニット）とＮｈｌＥタンパク質の分離を行った。得られたＮｈｌＡタンパク質（αサブユニット）、及びＮｈｌＥタンパク質のそれぞれのコバルトイオン含有量を測定した。測定結果を表５に示す。
表５に示すように、ＮｈｌＡタンパク質（αサブユニット）は、ＮｈｌＡタンパク質（αサブユニット）あたり0.79±0.08モルのコバルトイオンを含有していたが、ＮｈｌＥタンパク質は、コバルトイオンを全く含有していなかった。
なお、ＮｈｌＡタンパク質（αサブユニット）、及びＮｈｌＥタンパク質を、それぞれ単独でアポ酵素α２β２、及びアポ酵素αβを混合したところ、Ｒ−アポ酵素α２β２、及びＲ−アポ酵素αβ（α２β２）へと改変されなかった。
実施例６では、コバルトイオンは、タンパク質複合体αｅ２を構成するＮｈｌＡタンパク質（αサブユニット）が含有していることが分かった。
実施例７では、タンパク質複合体αｅ２からアポ酵素α２β２、及びアポ酵素αβへのコバルトイオン受け渡しメカニズムを調べた。
まず、ニトリルヒドラターゼのαサブユニットの３番目のアラニンをグリシンに置換したＯＲＦと、ｎｈｌＢ遺伝子の２つのＯＲＦを持つプラスミドpREIT-nhlBA-α-A3Gを構築した。
そして、Rhodococcus fascians DSM43985を宿主として、アポ酵素α２β２、及びアポ酵素αβに対応する変異体酵素を発現・精製した。精製した酵素を「アポ酵素(α−A3G)２β２」、「アポ酵素(α−A3G)β」と称する。アポ酵素(α−A3G)２β２、及びアポ酵素(α−A3G)βの比活性を調べたところ、アポ酵素(α−A3G)２β２の比活性は78.2±3.2U/mg、アポ酵素(α−A3G)βの比活性は3.2±1.6U/mgであった。これは、アポ酵素α２β２、及びアポ酵素αβと同レベルの数値である。
次に、アポ酵素(α−A3G)２β２、及びアポ酵素(α−A3G)βそれぞれと、（αサブユニットの３番目がアラニンである）タンパク質複合体αｅ２とを混合した。それぞれ生成した酵素を精製し、その比活性を調べたところ、それぞれ330.5±15.5U/mg、318.6±10.6U/mgと上昇していた。比活性を表６に示す。これは、ホロ酵素α２β２と同レベルの数値である。
更に、生成したそれぞれの酵素を精製し、そのN末端アミノ酸配列を調べた。それぞれの酵素のN末端アミノ酸配列を表７に示す。表７に示す通り、３番目のグリシンは、アラニンへ変化していた。
実施例７の結果から、タンパク質複合体αｅ２は、自身のＮｈｌＡタンパク質（αサブユニット）とアポ酵素α２β２、及びアポ酵素αβを構成するαサブユニットとを交換することで、アポ酵素α２β２、及びアポ酵素αβを、Ｒ−アポ酵素α２β２、及びＲ−アポ酵素αβ（α２β２）へと改変することが分かった。
また、以上の結果より、ＮｈｌＥタンパク質は、アポ酵素α２β２、αβをホロ酵素α２β２へと改変する際のシャペロンとして機能することが示唆された。
実施例８では、ＢＬＡＳＴ法を用いて、ＮｈｌＥタンパク質と以下のタンパク質とのアミノ酸配列の相同性を調べた。
（１）ＮｈｈＧタンパク質： Rhodococcus rhodochrous J1菌由来のコバルト型高分子量ニトリルヒドラターゼ遺伝子クラスター中に存在し、ＮｈｌＥに相同性を示すタンパク質
（２）Ｐ１４Ｋタンパク質：Bacillus pallidus RAPc8菌由来のコバルト型ニトリルヒドラターゼ活性化タンパク質
（３）Ａ．ｔｕｍタンパク質：Agrobacterium tumefaciens菌由来のコバルト型ニトリルヒドラターゼのβサブユニット
（４）Ｊ１ｎｈｌＢタンパク質：Rhodococcus rhodochrous J1菌由来のコバルト型低分子量ニトリルヒドラターゼのβサブユニット
（５）Ｐ．ｐｕｔタンパク質：Psudomonas putida菌由来のコバルト型ニトリルヒドラターゼのβサブユニット
（２）Ｐ１４Ｋタンパク質：Bacillus pallidus RAPc8菌由来のコバルト型ニトリルヒドラターゼ活性化タンパク質
（３）Ａ．ｔｕｍタンパク質：Agrobacterium tumefaciens菌由来のコバルト型ニトリルヒドラターゼのβサブユニット
（４）Ｊ１ｎｈｌＢタンパク質：Rhodococcus rhodochrous J1菌由来のコバルト型低分子量ニトリルヒドラターゼのβサブユニット
（５）Ｐ．ｐｕｔタンパク質：Psudomonas putida菌由来のコバルト型ニトリルヒドラターゼのβサブユニット
結果を表８、及び図１４に示す。表８に示すように、ＮｈｌＥタンパク質とそれぞれのタンパク質の相同性は、ＮｈｈＧタンパク質３８％、Ｐ１４Ｋタンパク質３５％、Ａ．ｔｕｍタンパク質３３％、Ｊ１ｎｈｌＢタンパク質３０％、Ｐ．ｐｕｔタンパク質３２％であった。
また、図１４に示すように、ＮｈｌＥタンパク質とそれぞれのタンパク質は、全体にわたり相同性を示していることが分かった。
実施例８より、これらのタンパク質も、ＮｈｌＥタンパク質と同様の機能を有することが示唆された。即ち、これらのタンパク質も本発明に係るタンパク質改変に深く関わることが示唆された。
本発明に係るタンパク質改変方法は、タンパク質同士を交換することにより行う方法であるため、従来、in vivoにおいてのみ可能であったタンパク質改変方法であっても、場合によってはin vivo、及びin vitroにかかわらず行えることが期待できる。そのため、あらゆる分野において、様々な状況に応じて、タンパク質改変方法の選択の幅を増やすことができる。
また、タンパク質を改変させる際に触媒等が必要な場合であっても、本発明に係るタンパク質改変方法は全く新規なメカニズムに基づく改変方法であるため、場合によっては触媒が必要なくなったり、別の触媒に変更できたりするなど、手間やコスト面での軽減を図ることも期待できる。
１ サブユニットＡとサブユニットＣから構成されるタンパク質
２１、２２ 改変されたタンパク質
Ａ、Ｂ、Ｃ タンパク質
α ニトリルヒドラターゼのαサブユニット
β ニトリルヒドラターゼのβサブユニット
α１ 金属元素低含有型αサブユニット
α２ 金属元素高含有型αサブユニット
ｅ ＮｈｌＥタンパク質
３１ ４量体の未成熟ニトリルヒドラターゼ
３２ ２量体の未成熟ニトリルヒドラターゼ
４ タンパク質複合体αｅ２
５ 成熟化ニトリルヒドラターゼ
２１、２２ 改変されたタンパク質
Ａ、Ｂ、Ｃ タンパク質
α ニトリルヒドラターゼのαサブユニット
β ニトリルヒドラターゼのβサブユニット
α１ 金属元素低含有型αサブユニット
α２ 金属元素高含有型αサブユニット
ｅ ＮｈｌＥタンパク質
３１ ４量体の未成熟ニトリルヒドラターゼ
３２ ２量体の未成熟ニトリルヒドラターゼ
４ タンパク質複合体αｅ２
５ 成熟化ニトリルヒドラターゼ
Claims (4)
- インビトロにおいて、
下記のαサブユニットおよび配列番号３に示す塩基配列のうち第１番目から第６８１番目の配列でコードされるβサブユニットから構成されるコバルト型ニトリルヒドラターゼのコバルト元素低含有型αサブユニットを、
下記のαサブユニットと、下記のタンパク質Ｅと、を有するタンパク質複合体中のコバルト元素高含有型の前記αサブユニットに、交換することを特徴とするコバルト型ニトリルヒドラターゼの成熟化方法。
αサブユニット：配列番号１に示すアミノ酸配列を有するタンパク質または配列番号１に示すアミノ酸配列の一部が置換、欠損、挿入されたアミノ酸配列を有するタンパク質であって、前記コバルト元素低含有型αサブユニットと交換可能なタンパク質。
タンパク質Ｅ：配列番号２に示すアミノ酸配列を有するタンパク質または配列番号２に示すアミノ酸配列の一部が置換、欠損、挿入されたアミノ酸配列を有するタンパク質であって、前記αサブユニットと複合体を形成可能なタンパク質。 - 前記コバルト型ニトリルヒドラターゼは、Rhodococcus rhodochrous J1菌由来のコバルト型ニトリルヒドラターゼであることを特徴とする請求項１記載のコバルト型ニトリルヒドラターゼ成熟化方法。
- 請求項１または２に記載のコバルト型ニトリルヒドラターゼ成熟化方法を使用する工程を含む成熟化コバルト型ニトリルヒドラターゼ生産方法。
- 請求項１または２に記載のコバルト型ニトリルヒドラターゼ成熟化方法を使用する工程を含む成熟化コバルト型ニトリルヒドラターゼの生産工程、および、
該生産工程によって生産された成熟化コバルト型ニトリルヒドラターゼを、ニトリル化合物からアミド化合物への変換酵素として用いる工程を含むアミド化合物生産方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2006309145A JP5080787B2 (ja) | 2006-11-15 | 2006-11-15 | タンパク質改変方法、ニトリルヒドラターゼ成熟化方法、成熟化ニトリルヒドラターゼ生産方法、成熟化ニトリルヒドラターゼを用いたアミド化合物生産方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2006309145A JP5080787B2 (ja) | 2006-11-15 | 2006-11-15 | タンパク質改変方法、ニトリルヒドラターゼ成熟化方法、成熟化ニトリルヒドラターゼ生産方法、成熟化ニトリルヒドラターゼを用いたアミド化合物生産方法 |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2008118959A JP2008118959A (ja) | 2008-05-29 |
| JP2008118959A5 JP2008118959A5 (ja) | 2010-01-07 |
| JP5080787B2 true JP5080787B2 (ja) | 2012-11-21 |
Family
ID=39504404
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2006309145A Expired - Fee Related JP5080787B2 (ja) | 2006-11-15 | 2006-11-15 | タンパク質改変方法、ニトリルヒドラターゼ成熟化方法、成熟化ニトリルヒドラターゼ生産方法、成熟化ニトリルヒドラターゼを用いたアミド化合物生産方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP5080787B2 (ja) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP5654739B2 (ja) * | 2009-01-21 | 2015-01-14 | 小林 達彦 | ニトリルヒドラターゼ成熟化方法 |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1806047A (zh) * | 2003-06-10 | 2006-07-19 | 旭化成株式会社 | 新型腈水合酶 |
| TW200634151A (en) * | 2004-12-09 | 2006-10-01 | Asahi Chemical Ind | Transformant expressing nitrile hydratase |
-
2006
- 2006-11-15 JP JP2006309145A patent/JP5080787B2/ja not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP2008118959A (ja) | 2008-05-29 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN110139930B (zh) | 突变型腈水合酶及其应用 | |
| CA2630341A1 (en) | Process for producing isoprenoid compounds by microorganisms | |
| CN104017791B (zh) | 一种热稳定性提高的角蛋白酶突变体及其制备方法 | |
| CA2744286C (en) | Fusion collagenase in which affinity tag is linked and method for producing the same | |
| CN102089437B (zh) | 生产氨基羟基苯甲酸盐类化合物的方法 | |
| JP2004504001A (ja) | スプライソソーム媒介ｒｎａトランスースプライシングにおける使用のための方法及び組成物 | |
| EE200100232A (et) | Meetod kiraalsete karboksüülhapete saamiseks nitriilidest nitrilaasi või mikroorganismide abil, missisaldavad ühte geeni nitrilaasi jaoks | |
| US20220041645A1 (en) | Method for producing modified oligonucleotide comprising complementary portion | |
| DE10345772A1 (de) | Verfahren zur Herstellung von 3-Methylamino-1-(thien-2-yl)-propan-1-ol | |
| Musier-Forsyth et al. | Acceptor helix interactions in a class II tRNA synthetase: photoaffinity crosslinking of an RNA miniduplex substrate | |
| CN106906190B (zh) | 一组亮氨酸脱氢酶及其编码基因和应用 | |
| JP5080787B2 (ja) | タンパク質改変方法、ニトリルヒドラターゼ成熟化方法、成熟化ニトリルヒドラターゼ生産方法、成熟化ニトリルヒドラターゼを用いたアミド化合物生産方法 | |
| CN107164349A (zh) | 一种嗜热中性蛋白酶基因、工程菌、酶及其应用 | |
| Yin et al. | A green-by-design bioprocess for l-carnosine production integrating enzymatic synthesis with membrane separation | |
| CN117070514A (zh) | 非天然rna的制备方法及产品 | |
| JP5120852B2 (ja) | 新規タンパク質複合体、該タンパク質複合体を用いたコバルト型低分子量ニトリルヒドラターゼ成熟化方法、成熟化コバルト型低分子量ニトリルヒドラターゼ、及び該ニトリルヒドラターゼを用いた方法 | |
| JP5654739B2 (ja) | ニトリルヒドラターゼ成熟化方法 | |
| CN118460651B (zh) | 制备Cemdisiran的方法 | |
| CN118460655B (zh) | 抑制FXI基因表达的siRNA的制备方法 | |
| CN118460650B (zh) | 一种Nedosiran的制备方法 | |
| CN118460649B (zh) | 一种Vutrisiran的制备方法 | |
| CN118460647B (zh) | 一种Patisiran的制备方法 | |
| Mizobata et al. | Aspartases: molecular structure, biochemical function and biotechnological applications | |
| CN118460652B (zh) | 一种治疗非动脉性缺血性视神经病变的siRNA的制备方法 | |
| CN118460653B (zh) | 一种治疗α1-抗胰蛋白酶缺乏症的siRNA的制备方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| RD01 | Notification of change of attorney |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A7426 Effective date: 20091102 |
|
| A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20091104 |
|
| A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20091104 |
|
| A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A821 Effective date: 20091102 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20120131 |
|
| A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20120308 |
|
| A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20120410 |
|
| RD01 | Notification of change of attorney |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A7426 Effective date: 20120531 |
|
| A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A821 Effective date: 20120531 |
|
| A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20120709 |
|
| A911 | Transfer of reconsideration by examiner before appeal (zenchi) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A911 Effective date: 20120717 |
|
| TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20120807 |
|
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 |
|
| A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20120831 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20150907 Year of fee payment: 3 |
|
| R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |