JP5068175B2 - プライマー生成ローリングサークル型増幅 - Google Patents

Description

本発明のプライマー生成−ローリングサークル型増幅（primer generation-rolling circle amplification）（ＰＧ−ＲＣＡ）は、高感度で迅速なＤＮＡ及びＲＮＡ等の核酸配列の一段階検出を可能にする。さらに、この技術は、ＤＮＡメチル化、一塩基多型（ＳＮＰ）、タンパク質修飾、及び翻訳後修飾等の他の生体分子の検出に容易に適用することができる。本発明はまた、ＰＧ−ＲＣＡに有用なリボンプローブ（ribbon probe）に関する。

［関連技術の説明］
近年、インビトロでの診断のために、多様な核酸配列の検出技術が確立されている。このような技術には、ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）、ＬＣＲ（リガーゼ連鎖反応）、ＲＣＡ（ローリングサークル型増幅）、ＮＡＳＢＡ（核酸配列に基づいた増幅）、及びＴＭＡ（転写媒介性増幅）などがある。これらの技術のなかには、指数関数的増幅の機構によって、１０分子未満の検出さえ可能にするものもある。

病原体検出において、これらの増幅技術が広く利用され、病原体のゲノムＤＮＡで見出された病原体に特異的な配列又は遺伝子を標的とすることで、サンプルにおける病原体による汚染を検出する。しかし、ひとつの細胞はゲノムＤＮＡを１組しか含まないので、これらの核酸増幅による病原体検定は、酵素免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）等の他の従来の試験と同程度の感度しか有していない。１つの解決策は、より多量な病原体特異的ｒＲＮＡ又はｍＲＮＡを標的とすることであるが、核酸増幅反応の多くが、鋳型ＲＮＡ上では効率良く重合を進められないＤＮＡポリメラーゼを利用するので、これらの増幅法の多くでは、標的ＲＮＡを直接検出することができない。

逆転写−ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）が、標的ＲＮＡ配列を検出するために最も広範に使用されている。この反応では、逆転写酵素でＲＮＡ配列を一本鎖ＤＮＡ又は二本鎖ＤＮＡに変換し、次いでＰＣＲによって増幅する。しかし、ＲＴとＰＣＲの反応条件が異なることから、それらの反応を別々に行う必要があるため、検出可能な量の産物を得るためにはＲＴ−ＰＣＲ全体で数時間を要するし、また、ＲＴ産物をＰＣＲに移動させることが必要な場合もあり、これは多くのサンプルがある場合には、非常に面倒である。

ライゲーション−ローリングサークル型増幅は、標的ＲＮＡ配列を検出するための別法である。この方法では、標的ＲＮＡ上でパドロック(padlock)プローブ又は直鎖核酸プローブの５’末端及び３’末端をライゲーションし、次いで超分岐ローリングサークル型増幅（ＨＲＣＡ）を行い、環状化したパドロックプローブを定量する。しかし、この方法は少なくとも２つの反応、ライゲーション及びＨＲＣＡを必要とし、また、効果的なＨＲＣＡ反応のためには、環状化の後に、環状化していないパドロックプローブを除去するエキソヌクレアーゼ処理が必要になることもあり得る。さらに、鋳型ＲＮＡ上でのＤＮＡリガーゼによるライゲーションは、鋳型ＤＮＡ上よりも効率が低いことが知られているので、少量の標的ＲＮＡを検出することはできないかもしれない。

［発明の概要］
本発明の一態様においては、第１の核酸プライマーを第１の核酸配列から生成するステップ、第１の核酸プライマーを第１のポリメラーゼ及び第１の環状核酸プローブと混合するステップであって、第１の環状核酸プローブは第２の核酸配列に対する少なくとも１つ
のアンチセンス配列及び第１の核酸プライマーに対する少なくとも１つのアンチセンス配列を含むステップ、第１のポリメラーゼを使用して、ローリングサークル型増幅により、第１の環状核酸プローブの少なくとも１反復の配列コピーを産出するステップであって、該配列コピーは少なくとも第２の核酸配列を含むステップ、第２の核酸プライマーを第２の核酸配列から生成するステップ、第２の核酸プライマーを第２のポリメラーゼ及び第２の環状核酸プローブと混合するステップであって、第２の環状核酸プローブは第２の核酸プライマーに対する少なくとも１つのアンチセンス配列を含むステップ、及び第２のポリメラーゼを使用して、ローリングサークル型増幅により、第２の環状核酸プローブの少なくとも１反復の配列コピーを産出するステップ、を含む、核酸を増幅する方法が提供される。

本方法のさらなる態様においては、第１の核酸配列及び第２の核酸配列が同じ配列である。

本発明の別の態様においては、分子を検出する方法であって、当該分子を使用して第１のプライマー生成反応を開始するステップであって、第１のプライマー生成反応が第１の核酸プライマーを生成するステップ、第１の核酸プライマーを第１のポリメラーゼ及び第１の環状核酸プローブと混合するステップであって、第１の環状核酸プローブは第２の核酸配列に対する少なくとも１つのアンチセンス配列及び第１の核酸プライマーに対する少なくとも１つのアンチセンス配列を含むステップ、第１のポリメラーゼを使用して、ローリングサークル型増幅により、第１の環状核酸プローブの少なくとも１反復の第１の配列コピーを産出するステップであって、第１の配列コピーは少なくとも第２の核酸配列を含むステップ、第２の核酸配列を使用して、少なくとも第２の核酸プライマーを生成するステップ、第２の核酸プライマーを第２のポリメラーゼ及び第２の環状核酸プローブと混合するステップであって、第２の環状核酸プローブは第２の核酸配列に対する少なくとも１つのアンチセンス配列及び第２の核酸プライマーに対する少なくとも１つのアンチセンス配列を含むステップ、第２のポリメラーゼを使用して、ローリングサークル型増幅により、第２の環状核酸プローブの少なくとも１反復の第２の配列コピーを産出するステップであって、第２の配列コピーは少なくとも第２の核酸配列を含むステップ、第２の配列コピーに含まれる第２の核酸配列を使用して、生成、混合、及び産出ステップを少なくとも１回反復するステップ、及び、当該分子の存在を示す、第２のポリメラーゼ又は第２の核酸プライマーの生成物を検出するステップ、を含む方法が提供される。

本方法のさらなる態様においては、第１の核酸配列及び第２の核酸配列が同じ配列である。

さらなる態様においては、少なくとも２つの第１又は第２の核酸プライマーが、生成ステップにおいて、第１又は第２の核酸配列から生成される。

さらなる態様においては、第１の核酸プライマー及び第２の核酸プライマーが、重合、開裂、転写、及び高次核酸構造形成の少なくとも１つにより生成される。

さらなる態様においては、第１の核酸プライマー及び第２の核酸プライマーが、ヌクレアーゼによる開裂反応、鎖置換増幅、開裂により開始される等温増幅（cleavage-initiated isothermal amplification）、３方向連結（three-way junction）等温増幅、及び３方向連結ローリングサークル型反応の１つによって生成される。

さらなる態様においては、第１及び第２の核酸プライマーが、ヌクレアーゼによる開裂反応、鎖置換増幅、開裂により開始される等温増幅、３方向連結等温増幅、３方向連結ローリングサークル型反応、核酸で標識化した認識剤を使用する結合アッセイ、及び近接ア
ッセイの１つによって生成される。

さらなる態様においては、検出される分子がメチル化ＤＮＡ及び一塩基多型から成る群より選択される。

本発明の別の態様においては、環状核酸プローブ及び核酸ロックプローブを含むリボンプローブであって、核酸ロックプローブは少なくとも開裂可能なリンカーを含み、かつ環状核酸プローブ及び核酸ロックプローブは開裂可能なリンカーを開裂しなければ解離できないことを特徴とする、リボンプローブが提供される。

さらなる態様においては、環状プローブは少なくともプライマー生成配列又はそれに対するアンチセンス配列を含む。

さらなる態様においては、開裂可能なリンカーが、核酸、核酸誘導体、又は非核酸を含み、かつ開裂可能なリンカーは開裂剤により開裂することができる。

さらなる態様においては、開裂剤がヌクレアーゼ酵素及び人工ヌクレアーゼから成る群より選択される。

本発明の別の態様においては、第１の核酸配列を使用して、上述の第１のリボンプローブの第１の核酸ロックプローブの開裂を誘導し、それにより第１のプライマーを第１の核酸ロックプローブから産出するステップ、第１の核酸ロックプローブを第１のポリメラーゼ及び第１のリボンプローブの第１の環状核酸プローブと混合するステップであって、第１の環状核酸プローブは第１の核酸配列に対する少なくとも１つのアンチセンス配列及び第１のプライマーに対する少なくとも１つのアンチセンス配列を含むステップ、第１のポリメラーゼを使用して、ローリングサークル型増幅により、第１の環状プローブの少なくとも１反復の配列コピーを産出するステップであって、該配列コピーは少なくとも第１の核酸配列を含むステップ、及び、配列コピーに含まれる第１の核酸配列を使用して、誘導、混合、及び産出ステップを少なくとも１回反復するステップを含む、核酸を増幅する方法が提供される。

［好ましい実施形態の詳細な説明］
プライマー生成−ローリングサークル型増幅（ＰＧ−ＲＣＡ）
本発明は、プライマー生成−ローリングサークル型増幅（ＰＧ−ＲＣＡ）を使用して、対象の核酸配列を検出及び定量する方法を開示する。この反応により、ＤＮＡ及びＲＮＡ（例えばｍＲＮＡ及びｒＲＮＡ）等の核酸配列が検出できる。さらに、この反応は、一塩基多型（ＳＮＰ）、タンパク質、抗原、ペプチド、多糖類、及び小分子等の生体内分子、並びに例えばＤＮＡメチル化及び翻訳後修飾によって生じる修飾残基の検出に容易に適用することができる。

プライマー生成−ローリングサークル型増幅（ＰＧ−ＲＣＡ）は、標的核酸配列からのＰＧ−ＲＣＡ開始反応、その後の複数サイクルのプライマー生成反応（ＰＧＲ）及びローリングサークル反応（ＲＣＲ）を含む。これらの反応は、等温条件下で行うことが好ましい。

標的核酸配列からのＰＧ−ＲＣＡ開始反応は、以下のように行うことができる。標的配列がサンプル中に存在する場合にのみ標的核酸配列と連結点（junction）を形成するように、３方向連結（three-way junction）（３ＷＪ）プライマー及び環状プローブを設計する（図１）。図では、オリゴヌクレオチド、核酸、又はポリヌクレオチドは、５’末端か
ら３’末端方向に矢印で示されている（矢の方向が３’末端である）。このような連結点は、３方向連結でもよく、さらに分岐した核酸構造（例えば４方向連結又は５方向連結）であってもよい。このように、好ましくは鎖置換活性を有するＤＮＡポリメラーゼは、環状プローブ上で３ＷＪプライマーからのプライマー伸長反応を開始させて、等温条件下でのローリングサークル反応（ＲＣＲ）により、環状プローブのコピーが連鎖した配列を産出することができる。

このような開始反応を実現するために、反応温度と同程度の高Ｔｍ値で標的とハイブリダイズするように３ＷＪプライマーの５’部分を設計し、低Ｔｍ値で環状プローブとハイブリダイズするように３ＷＪプライマーの３’部分を設計する。この低Ｔｍ値は、標的配列が存在しない場合に３ＷＪプライマーと環状プローブとの間でのハイブリダイゼーションを回避できる程度に低くすべきである。環状プローブについても、反応温度と同程度の高Ｔｍ値で標的とハイブリダイズするように設計する。さらに、３ＷＪ複合体の張力及び立体障害を軽減させるために、３ＷＪプライマー、環状プローブ、又は標的の２つのハイブリダイゼーション配列の間に少なくとも１つの不対ヌクレオチドを挿入してもよい。

さらに、次工程である指数関数的な増幅工程を開始させるプライマー生成反応（ＰＧＲ）開始配列に対する少なくとも１つのアンチセンス配列を含むように、環状プローブを設計する。ここで、ＰＧＲは、ＲＣＲ産物のＰＧＲ開始配列から少なくとも１つの核酸プライマーを産出するように設計される反応であり、その結果得られるプライマーは、環状核酸プローブにプライミングしてＲＣＲを開始するように設計される。ＰＧＲの幾つかの例としては、開裂反応、鎖置換増幅、及びＲＮＡ転写が挙げられ、これらは以下により詳細に記載される。一方、ＲＣＲは、連鎖した環状プローブの配列コピーを産出するように設計され、得られた産物は、最初の反応シグナルのように、各反復配列に少なくとも１つのＰＧＲ開始配列を含んでいる。

したがって、ＰＧＲ及びＲＣＲの最初の反応サイクルが開始すると、互いの反応を開始させるようにＰＧＲ及びＲＣＲが設計されているので、これらの反応の反応サイクルは自動的に数回継続する（図２）。ＰＧＲはＰＧＲ開始配列から複数のプライマー（プライマー数は「ｘ」で示される）を産出することができ、ＲＣＲは複数回反復（反復数は「ｙ」で示される）したＰＧＲ開始配列を含むＲＣＲ産物を産出することができるので、ＰＧＲとＲＣＲの単一の反応サイクルの増幅係数は、それぞれの増幅係数の積、すなわちｘｙとなる。複数サイクル（サイクル数は「ｚ」で示される）のＰＧＲ及びＲＣＲを反復することで、ＰＧ−ＲＣＡの全増幅係数は指数関数的に高くなる：（ｘｙ）^z。したがって、増幅した核酸プライマー又はＲＣＲ産物の存在により、高い感度で且つ迅速に標的核酸配列を検出して、リアルタイムでこれらの産物量の増加をモニタリングすることによって定量化することができる。

プライマー生成反応（ＰＧＲ）
プライマー生成反応（ＰＧＲ）は、ＰＧ−ＲＣＡの感度に大きな影響を及ぼすので、ＰＧ−ＲＣＡの重要な要素である。ＰＧＲが単一のＰＧＲ開始配列からより多くのプライマーを産出する、すなわち増幅係数ｘがより大きくなれば、一サイクルのＰＧＲ及びＲＣＲは、より多くのＲＣＲプライマー、ＲＣＲ産物、及びＰＧＲ開始配列を産出することができ、増幅係数ｘｙはより大きくなる。また、ＰＧＲがより迅速にプライマーを産出すれば、増幅係数「ｚ」がより大きくなるように、より多くのサイクルのＰＧＲ及びＲＣＲを行うことができる。したがって、ＰＧ−ＲＣＡの感度を最大限にするためには、迅速に多くのプライマーを産出することができるＰＧＲを使用することが重要である。プライマー生成反応（ＰＧＲ）の幾つかの実施例は、以下に開示されている。

ヌクレアーゼによる開裂反応
ヌクレアーゼによる開裂反応では、ＲＣＲプライマーを生成するためにヌクレアーゼを用いる。ここで、ＰＧＲプローブは、ＰＧＲ開始配列とのハイブリダイゼーション、及びその後のヌクレアーゼによる認識及び開裂によって、ＲＣＲプライマーを産出するように設計される（図３Ａ）。より詳細には、ＰＧＲプローブは、開裂後にＲＣＲプライマーとなる５’末端領域、ＰＧＲ開始配列とハイブリダイズし得る配列及びヌクレアーゼにより開裂可能な配列を含む内部領域、並びに３’末端領域を含む。好ましくは、ＰＧＲ開始配列は変化させず、かつ、開裂後に、開裂したＰＧＲプローブをＰＧＲ開始配列から分離させるように、ヌクレアーゼによる開裂を設計するが、それによって開裂反応が反復して起こり、単一のＰＧＲ開始配列から複数のＲＣＲプライマーが産出される。ヌクレアーゼによる開裂の一例では、Ｎｂ．Ｂｓｍ Ｉ及びＮｔ．ＢｂｖＣ Ｉ（New England Biolabs(Ipswich, MA)製）等のニッキングエンドヌクレアーゼ（nicking endonuclease）を利用することができる。これは、この酵素が二本鎖ＤＮＡ中の一本の鎖のみを開裂するからである。したがって、この酵素はＰＧＲプローブがＰＧＲ開始配列とハイブリダイズする場合にのみＰＧＲプローブを開裂し、ＰＧＲ開始配列は変化させずに残す。環状プローブがＰＧＲプローブと同じ開裂可能な配列を有している可能性がある場合、前述のニッキング酵素が環状プローブではなくＰＧＲプローブを開裂するように、メチル化修飾及びホスホロチオエート結合修飾等の化学修飾した核酸により環状プローブの配列を保護してもよい。別の例では、開裂可能な配列がＲＮＡを含み、ＰＧＲ開始配列がＤＮＡを含む場合、ＲＮＡ／ＤＮＡ二本鎖構造中のＲＮＡ鎖を特異的に認識及び開裂するリボヌクレアーゼＨ（ＲＮａｓｅＨ）を使用することができる。ＲＮａｓｅＨは４塩基対未満のＲＮＡ／ＤＮＡ二本鎖を効率的に認識及び開裂することができないので、開裂可能な配列は少なくとも４塩基のＲＮＡを含むことが好ましい。別の例では、ＰＧＲプローブの内部領域は、反応温度においてＰＧＲ開始配列とハイブリダイズするに十分な高いＴｍ値すなわち融解温度を有するように設計され、開裂可能な配列は内部領域の中央部(in the middle of)であるべきであり、これによってそれぞれの開裂した領域が、開裂後にＰＧＲ開始配列から自然に解離するに十分な低いＴｍ値を有する。さらに、制限エンドヌクレアーゼ、ホーミングエンドヌクレアーゼ、３’→５’エキソヌクレアーゼ、及びミスマッチ特異的エンドヌクレアーゼ等の幾つかのエンドヌクレアーゼ又はエキソヌクレアーゼが、開裂反応によりＰＧＲ開始配列からＲＣＲプライマーを生成することができる。

デオキシリボザイム及びリボザイム等の幾つかのヌクレオザイムは、特異的なＤＮＡ又はＲＮＡを認識及び開裂することで知られている。また、Ｃｅ（ＩＶ）、Ｅｕ（ＩＩＩ）、Ｔｍ（ＩＩＩ）、及びＬｕ（ＩＩＩ）等の幾つかの金属イオンはＤＮＡ及びＲＮＡを開裂することで知られており、関連技術分野の当業者には、核酸プローブを用いて開裂部位を制御する方法は既知であろう(J. Am. Chem. Soc. 126, 1430(2004)を参照のこと)。したがって、ヌクレアーゼ酵素を用いる場合と同様に、これらの人工ヌクレアーゼ又は開裂剤を使用して、ＲＣＲプライマーを生成することが可能である。一例では、デオキシリボザイムにより開裂可能なＲＮＡ配列を少なくとも含むＰＧＲプローブを認識して開裂するデオキシリボザイムとなるように、ＰＧＲ開始配列を設計する(Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94, 4262(1997))。

あるいは、ＰＧＲ開始配列とハイブリダイズさせ、ＰＧＲ開始配列のヌクレアーゼによる認識及び開裂の助けとなるように、環状プローブを設計する。一例では、ニッキング酵素により開裂可能な配列を少なくとも１つ含むように、ＰＧＲ開始配列を設計する。この酵素は、環状プローブがＰＧＲ開始配列とハイブリダイズし、生成した３’末端又はプライマーからポリメラーゼが自然に重合を開始することができる場合にのみ、ＰＧＲ開始配列を開裂することができる（図３Ｂ）。ヌクレオザイムには、開裂した３’末端に効果的なプライマーにならない可能性のある２’，３’−シクロホスフェート又は他の修飾を残すものもあるので(Nucleic Acids Research, 30, 12, e56(2002))、効果的なプライマーである３’ヒドロキシ末端を生成するために幾つかの技法を使用してもよい。一例は、Ｔ
４ポリヌクレオチドキナーゼの３’−ホスファターゼ活性の利用である。別の例は、このような修飾した３’末端を消化し、３’ヒドロキシル末端を生成することができる、３’→５’エキソヌクレアーゼ活性の利用である。

鎖置換増幅
図４に示されるように、プライマー生成反応として、鎖置換増幅（ＳＤＡ）を利用することができる。

ＳＤＡによるＰＧＲの一例では、ＰＧＲプローブを用いて、重合とヌクレアーゼによる開裂反応との組み合わせによって、単一のＰＧＲ開始配列から複数のＲＣＲプライマーを生成することができる（図４Ａ）。より詳細には、ＰＧＲプローブは、ＲＣＲプライマーに対するアンチセンス配列である５’末端領域、ＰＧＲ開始配列とハイブリダイズ可能な配列及び開裂可能な配列に対するアンチセンス配列を含む内部領域、並びに３’末端領域を含む。合成したＲＣＲプライマーが別の環状プローブとハイブリダイズすることができさえすれば、５’領域はＲＣＲ産物と相補的であっても相補的でなくてもよい。また、いったん第２鎖のＲＣＲ産物が合成されると、もはやＰＧＲプローブは第１鎖のＲＣＲ産物ともＰＧＲ開始配列ともハイブリダイズすることができないため、３’領域はＲＣＲ産物と相補的ではないこと、あるいは３’ホスフェート修飾等の化学修飾した核酸を使用してポリメラーゼにより伸長可能ではないことが好ましい。

いったんＰＧＲプローブがＲＣＲ産物のＰＧＲ開始配列とハイブリダイズすると、切断酵素等の開裂剤がＲＣＲ産物を開裂するが、ＰＧＲプローブは変化させない。その後、鎖置換活性を有するポリメラーゼは、ＰＧＲプローブ上の開裂したＲＣＲ産物を伸長させてＰＧＲの開始点である二本鎖核酸とすることができる。

このＰＧＲは、重合及び開裂の反応サイクルであり、これは好ましくは等温条件下で、自然に反復的に継続する。二本鎖核酸がＲＣＲ産物と同じ開裂配列を含むので、開裂反応が新たに合成した鎖を開裂するが、ＰＧＲプローブは変化させない。その後、鎖置換活性を有するポリメラーゼがＰＧＲプローブ上の開裂した鎖を伸長させ新たな二本鎖核酸とし、もう一方の開裂した鎖を転置してＲＣＲプライマーとなる一本鎖とする。反応サイクルにおいて二本鎖核酸が再生成されるので、このＰＧＲは反復的に継続し、複数のＲＣＲプライマーを生成する。

ＳＤＡによるＰＧＲの別の例では、重合とヌクレアーゼによる開裂反応との組み合わせによって、二本鎖ＲＣＲ産物から複数のＲＣＲプライマーを生成することができる（図４Ｂ）。第１鎖のＲＣＲ産物とプライミングすることができる外因性のＲＣＲプライマーを用いて、ポリメラーゼが二本鎖ＲＣＲ産物を合成する。その後、切断酵素等の開裂剤により、第２のＲＣＲ産物を変化させずに第１鎖のＲＣＲ産物を開裂することができる。次いで、鎖置換活性を有するポリメラーゼが、開裂した第１鎖のＲＣＲ産物を伸長させＰＧＲの開始点である二本鎖核酸とする。

このＰＧＲは、重合及び開裂の反応サイクルであり、これは好ましくは等温条件下で、自然に反復的に継続する。二本鎖核酸が少なくとも１つの開裂配列を含むので、開裂剤が新たに合成した鎖を開裂するがＰＧＲプローブは変化させない。それから、鎖置換活性を有するポリメラーゼがＰＧＲプローブ上の開裂した鎖を伸長させて新たな二本鎖核酸とし、もう一方の開裂した鎖を転置してＲＣＲプライマーとなる一本鎖とする。この反応において二本鎖核酸が再生成されるので、このＰＧＲは反復的に継続し、複数のＲＣＲプライマーを生成する。さらに、外因性のＲＣＲプライマーは新たに生成したＲＣＲプライマーとハイブリダイズすることができるので、ポリメラーゼによって、ＰＧＲの別の開始点になる別の二本鎖核酸が合成される。さらに、より高い感度を目的として、生成したＲＣＲ
プライマーの３’末端が外因性ＲＣＲプライマーと相補的にならないようにするため、ポリメラーゼが鋳型として認識することができない核酸又は非核酸による修飾によって、外因性ＲＣＲプライマーを修飾してもよい。このような修飾の一例として、Ｔａｑ及びＢｓｔＤＮＡポリメラーゼ等の多様なポリメラーゼによって認識できない２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、あるいはポリメラーゼによって認識できないＣ３、Ｃ９、及びＣ１２等の化学的な内部リンカー(chemical internal linkers)が挙げられる。

開裂により開始される等温増幅
開裂反応及びその後の等温増幅が単一のＰＧＲ開始配列から複数のプライマーを生成することができる（図５）。ＰＧＲ開始配列により誘導されたヌクレアーゼによる開裂の際に、直鎖ＰＧＲプローブ又は環状ＰＧＲプローブから直鎖核酸プローブを生成することができる（図５）。得られた直鎖プローブは、自己プライミングするように設計され、ポリメラーゼは３’末端を伸長させ、ＰＧＲの開始点になるヘアピン核酸を形成する。一例では、ヌクレアーゼ又は非ヌクレアーゼ因子により開裂可能な領域を有するように、ヘアピン核酸を設計する（図５の経路Ａで示される）。鎖置換活性を有するポリメラーゼ及び開裂剤は、鎖置換増幅（ＳＤＡ）によって、ＲＣＲプライマーとして機能する一本鎖核酸を連続して生成する。別の例では、ＲＮＡ転写を開始できるプロモーター配列を含むように、ヘアピン核酸を設計する（図５の経路Ｂで示される）。ＲＮＡポリメラーゼは、ＲＣＲプライマーとして機能するＲＮＡ転写産物を連続して合成する。別の例では、ＲＮＡポリメラーゼによりＲＮＡ転写を開始することができるバブル構造として、ヘアピン核酸のヘアピン構造を設計する。ＲＮＡポリメラーゼは、ＲＣＲプライマーとして機能するＲＮＡ転写産物を連続して合成する。

３方向連結等温増幅
３方向連結又はさらに分岐した核酸構造（例えば４方向連結若しくは５方向連結）を形成させ、その後、等温増幅することによって、単一のＰＧＲ開始配列から複数のプライマーを生成することが可能である（図６）。ＰＧＲ開始配列と安定した３ＷＪ又はさらに分岐した構造を形成するように、核酸プライマー及びプローブを設計する。プライマーの３’末端部分は環状プローブと相補的ではあるが、環状プローブとの自動的なハイブリダイゼーションを抑制できる程度に短い。したがって、ＰＧＲ開始配列を用いるだけで、ポリメラーゼは、プローブ上のプライマーを伸長させＰＧＲの開始点である二本鎖核酸とすることができる。

一例では、ヌクレアーゼ又は非ヌクレアーゼ因子により開裂可能な領域を有するように、二本鎖核酸を設計する（図６の経路Ａで示される）。好ましくは、鎖置換活性を有するポリメラーゼ及び開裂剤は、鎖置換増幅（ＳＤＡ）によって、ＲＣＲプライマーとなる一本鎖核酸を連続して生成する。別の例では、ＲＮＡ転写を開始することができるプロモーター配列を含むように、二本鎖核酸を設計する（図６の経路Ｂで示される）。ＲＮＡポリメラーゼは、ＲＣＲプライマーとなるＲＮＡ転写産物を連続して合成する。

３方向連結ＲＣＲ
ＰＧＲは、必ずしも核酸の新たな３’末端を合成する反応ではない。３方向連結（３ＷＪ）又はさらに分岐した核酸構造（例えば４方向連結又は５方向連結）を利用することによって、ＰＧＲ開始配列から複数のプライマーを生成することが可能である。ＰＧＲ開始配列と安定した３ＷＪ又はさらに分岐した構造を形成するように、核酸プライマー及び環状核酸プローブを設計する（図７）。プライマーの３’末端部分は環状プローブと相補的であるが、環状プローブとの自動的なハイブリダイゼーションを抑制できる程度に短い。したがって、プライマーは、その化学構造が変化しないにもかかわらず、ＰＧＲ開始配列を用いるだけでＲＣＲプライマーとなる。

その他の分子の検出のためのＰＧ−ＲＣＡ開始反応
標的分子を検出するため、その分子がＰＧＲ又はＲＣＲを誘導及び開始させることができる限りにおいて、ＰＧＲとＲＣＲの反応サイクルは、非常に高い感度で且つ迅速に、分子を検出することを可能にする。したがって、ＰＧ−ＲＣＡは、インビトロでの診断に対して非常に汎用的な技術である。

核酸配列の検出
対象の核酸配列を検出するために、ＰＧＲ開始配列の代わりに対象の核酸配列から開始するようＰＧＲを設計することにより、ヌクレアーゼによる開裂反応、開裂により開始される等温増幅、及び３ＷＪ等温増幅等の上記のＰＧＲ反応を利用することができる。一例では、ヌクレアーゼによる開裂反応により、ＰＧ−ＲＣＡを開始することができる。標的ＤＮＡ配列がニッキング酵素により切断可能な配列を有し、且つ、環状プローブがこの配列とハイブリダイズするように設計される場合、この環状プローブがこの配列とハイブリダイズし、生成した３’末端又は環状プローブ上のプライマーをポリメラーゼが伸長させることができる場合にのみ、この酵素はこの標的配列を切断し、ＰＧ−ＲＣＡが始まる。さらに、ＨｈａＩ、ＡｌｕＩ、ＴａｑＩ、及びＨａｅＩＩＩ等の多様な制限酵素がＤＮＡ／ＲＮＡ二本鎖構造中のＤＮＡ鎖及びＲＮＡ鎖を開裂することが知られており(Nucleic Acid Res., 1980, 13, 2939)、逆転写なしでヌクレアーゼによる開裂反応を利用することができる。さらに、逆転写はＲＮＡを一本鎖ｃＤＮＡ又は二本鎖ｃＤＮＡへ変換するので、変換したｃＤＮＡから開始されるようにＰＧ−ＲＣＡ開始反応を設計することができる。さらに、ヌクレアーゼからの保護プローブの代わりに、環状プローブ又はＰＧＲプローブを使用して、ＰＧ−ＲＣＡ開始反応として、ＲＮＡ保護アッセイ等の幾つかの従来の技法を利用することができる。

ＳＮＰの検出
一塩基多型（ＳＮＰ）を検出する幾つかの技法が確立されており、これらの幾つかを、ＳＮＰを検出するためのＰＧ−ＲＣＡ開始反応として利用することができる。一例では、Ｓｕｒｖｅｙｏｒヌクレアーゼ（Transgenomic, Inc. (ネブラスカ州オマハ)から入手可能）、Ｃｌｅａｖａｓｅ(Third Wave Molecular Diagnostics(ウィスコンシン州マディソン)から入手可能)、又はＲＮａｓｅＨ(Analytical Biochem., 333, 246(2004))等のミスマッチ感受性ヌクレアーゼを使用してＳＮＰを検出するように、上述のヌクレアーゼによる開裂反応又は開裂により開始される増幅を設計することができる。

ＤＮＡメチル化の検出
ＨａｅＩＩ、ＮｏｔＩ、及びＳｍａＩ等の種々のヌクレアーゼは、ＤＮＡのメチル化修飾に対し感受性であり、このような修飾された配列を開裂しない。したがって、上述のヌクレアーゼによる開裂反応を使用するＰＧ−ＲＣＡ又はメチル化感受性ヌクレアーゼを使用する開裂により開始される増幅によって、メチル化ＤＮＡと非メチル化ＤＮＡとを区別することが可能である。したがって、ＰＧ−ＲＣＡにより、非常に高い感度でＤＮＡメチル化修飾を検出することができる。

生体内分子の検出
ＰＧ−ＲＣＡを使用して、タンパク質、抗原、ペプチド、多糖類、又は小分子等の対象の生体内分子、並びに、核酸で標識化した認識剤を使用して、ＤＮＡ上のメチル化及びタンパク質上のリン酸化等の生体内分子上の修飾残基を検出することができる。

一例では、ＰＧ−ＲＣＡは、対象の分子と特異的に結合する抗体、抗原、タンパク質、ペプチド、アプタマー、又はポリマー等の認識剤と結合した核酸標識を検出することができる。対象の分子を標識化した認識剤でインキュベートし、未結合の認識剤を洗浄することにより、対象の分子と結合した核酸標識を検出することで対象の分子を検出することが
可能である。核酸標識は、ＰＧＲ又はＲＣＲを開始することができる核酸配列又は分子であり得る。したがって、ＰＧ−ＲＣＡ産物の量によって、対象の分子を検出して定量化することができる。このような核酸の例としては、環状プローブと相補的な核酸プライマー、及びＳＤＡ増幅又はＲＮＡ増幅によりＲＣＲプライマーを生成することができる二本鎖核酸又はヘアピン状二本鎖核酸が挙げられる。

別の例では、対象の分子が存在する場合にのみ、１組の認識剤が複合体を形成することができる近接アッセイにより、ＰＧ−ＲＣＡが開始され、対象の分子を検出することができる。関連技術分野の当業者には、Nat. Biotech., 14, 1714(1996)、Nat. Biotech. 20,
473(2002)、及びNucleic Acids Research, 33, 6, e64, (2005)で示されるような近接アッセイを行う方法が理解されるであろう。認識剤の幾つかの例は、ＰＧ−ＲＣＡを開始することができる核酸配列又は分子で標識化した、抗体、抗原、タンパク質、ペプチド、アプタマー、及びポリマーである。一例では、２つの認識剤が非常に近接している場合にのみＲＣＲが開始するように、一方の認識剤をプライマーで標識化し、他方の認識剤を環状プローブで標識化する。別の例では、一方の認識剤を、環状プローブと相補的ではあるが短すぎて環状プローブとハイブリダイズできない、短い核酸プライマーによって標識化し、かつ、他方の認識剤を、環状プローブと相補的で、かつ環状プローブと安定にハイブリダイズするに十分な程度長い核酸プローブによって標識化する。したがって、両方の認識剤が対象の分子の助けによって非常に近接し、ＰＧ−ＲＣＡを開始する場合にのみ、環状プローブはこの短いプライマーとハイブリダイズすることができる。したがって、対象の分子を検出し、ＰＧ−ＲＣＡ産物の量によって定量化することができる。

ＰＧ−ＲＣＡのためのリボンプローブ
リボンプローブ（ribbon probe）は、少なくとも１つの開裂可能なリンカーを含む少なくとも１つの核酸ロックプローブにハイブリダイズされた環状核酸プローブである。環状プローブ及びロックプローブは、開裂可能なリンカーを開裂しなければ、互いから解離することはできない。ロックプローブは環状核酸（図８Ａ、図８Ｂ）又は環状プローブから自動的に解離しない程度に十分長い直鎖核酸（図８Ｃ）である。開裂可能なリンカーは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、修飾した核酸、又は開裂可能な分子を含む。環状テンプレート又は長鎖テンプレートによりパドロックされた環状プローブは、ローリングサークル型増幅に対して効率的なテンプレートではないので(Nucleic Acid Research, 26, 22, 5073(1998))、リボンプローブは、サンプル中の核酸が環状プローブと非特異的にプライミングすることによる偽陽性のＰＧ−ＲＣＡ増幅を最小限にすることができる。さらに、環状プローブは、ＰＧ−ＲＣＡのためのＰＧＲ開始配列に対する少なくとも１つのアンチセンス配列を含む。

ヌクレアーゼによる開裂反応により、リボンプローブを使用するＰＧ−ＲＣＡを行うことができる。ひとたび開裂剤によりロックプローブを開裂すれば、ロックプローブから生成されるＲＣＲプライマーが環状プローブとハイブリダイズしてＲＣＲを開始する（図９）。環状プローブは、別のリボンプローブの開裂可能なリンカーの開裂を誘導する、複数のＰＧＲ開始配列を含むＲＣＲ産物を産出するように設計される。

さらに効率的な開裂のために、核酸の物理的特性により、環状プローブと相補的であるが一本鎖は維持するように、開裂後に３’末端となる領域を設計する。核酸は、一本鎖形態よりも二本鎖形態でより強固であり、二本鎖ＤＮＡは、完全な環を形成するには少なくとも１２６塩基対を必要とする(Gene, 211, 277(1998), J. Am. Chem. Soc, 118, 1587(1996)、及びProc. Natl. Acad. Sci. USA, 78, 4833(1981))。したがって、１２６塩基より小さい一本鎖環状プローブが別の核酸と共に形成することができる二本鎖の長さには限界がある。あるいは、開裂後にＲＣＲプライマーになる領域と環状プローブに結合する領域との間に、環状プローブとハイブリダイズしない核酸配列又は非核酸リンカーであるス
ペーサー領域を組み込むことができる。あるいは、開裂及び開裂した３’末端の消化により、ロックプローブからＲＣＲプライマーを生成することができる。一例では、３’→５’エキソヌクレアーゼ、又はポリメラーゼのエキソヌクレアーゼ活性を利用して、開裂可能なリンカーを開裂した後の３’末端を消化することができる。あるいは、開裂可能なリンカーと共に標的分子を開裂してもよい。

以下の実施例においては、核酸配列を５’末端（左側）から３’末端（右側）方向に記載する。ＤＮＡは小文字で示し、ＲＮＡは大文字で示し、２’−Ｏ−メチル−ＲＮＡはイタリック体の大文字で示している。５’末端リン酸修飾及び３’末端リン酸修飾は、それぞれ／５ｐｈｏｓ／及び／３ｐｈｏｓ／で示している。Ｎｔ．ＢｂｖＣ Ｉ認識配列及びＮｂ．Ｂｓｍ Ｉ認識配列は、それぞれ一重下線及び二重下線で示している。内部Ｃ３リンカーは、／ｉｓｐ３／で示している。

＜実施例１＞
環状プローブの合成
直鎖核酸プローブ（配列番号１）は、Intergrated DNA Technologies(アイオワ州コーラルヴィル)から購入した。製造業者のプロトコルに従って、Epicentre(ウィスコンシン州マディソン)製のＣｉｒｃｌｉｇａｓｅを使用して、環状プローブをこの直鎖プローブから合成した。環状化させた後、Ｇ２５スピンカラム処理(Amersham Biosciences、ニュージャージー州ピスカタウェイ)の後に、３７℃で一晩、エキソヌクレアーゼＩ(Epicentre、ウィスコンシン州マディソン))処理及びエキソヌクレアーゼＩＩＩ(New England Biolabs、マサチューセッツ州イプスウィッチ)処理を行い、環状化していないプローブを取り除いた。あるいは、エキソヌクレアーゼＩ処理及びエキソヌクレアーゼＩＩＩ処理の後に、７Ｍの尿素−５％のポリアクリルアミドゲル電気泳動を行い、環状プローブを精製した。

＜実施例２＞
３方向連結構造からのＲＣＲ反応
環状化可能なプローブ（配列番号２）、３ＷＪプライマー（配列番号３）、及び標的ＤＮＡ（配列番号４）をIntegrated DNA Technologiesから入手した。Ｂｓｔ ＤＮＡポリメラーゼの大フラグメントをNew England Biolabsから購入した。実施例１で示されるように環状プローブを合成したが、ただし、異なる配列を有する環状化可能なプローブを使用した。

４ｎＭの環状プローブ、及び３ＷＪプライマーとして５００ｎＭの３ＷＪプライマーを使用し、５００ｎＭの標的ＤＮＡを加えて、あるいは加えずに、３ＷＪ−ＲＣＡを行った。Ｃプローブ、３ＷＪプライマー、及び標的を含む３ＷＪ構造中に２つの不対チミジンを形成するように３ＷＪプライマーを設計した。４００μＭのｄＮＴＰ(Promega)、１×Ｔｈｅｒｍｏｐｏｌ反応緩衝液(New England Biolabs)、及び０．０８Ｕ／μｌのＶｅｎｔ（エキソ−）ＤＮＡポリメラーゼ(New England Biolabs)を含む緩衝液１０μｌ中で、９４℃で３分間変性の後、６９℃で６５時間この反応を行った。

ＰＣＲ及びその後の１．５％のアガロースゲル分析により、この反応産物を分析した。５００ｎＭの標的分子を用いた場合にのみ、連鎖した産物が認められた。ＰＣＲ条件は、
４００μＭのｄＮＴＰ(Promega)、１×Ｔｈｅｒｍｏｐｏｌ反応緩衝液(New England Biolabs)、０．０４Ｕ／μｌのＶｅｎｔ（エキソ−）ＤＮＡポリメラーゼ(New England Biolabs)、１／１２５０００に希釈したＳｙｂｒＧｒｅｅｎ１(Molecular Probes)、１０ｎＭの６−カルボキシフルオレセイン(Molecular Probes)、０．５μＭのセンスＰＣＲプライマー及びアンチセンスＰＣＲプライマー（配列番号５、配列番号６）、及び上記の反応産物１μｌを含む反応物１０μｌであった。温度サイクルは、９５℃で３分間の最初の変性、並びに９５℃で１５秒間及び６９℃で５分間を３４サイクルとした。

＜実施例３＞
ヌクレアーゼによる開裂反応を使用するＰＧ−ＲＣＡ
ＰＧＲプローブ（配列番号７）、環状化可能なプローブ（配列番号８）、及び対象の核酸配列（配列番号９）をIntegrated DNA Technologiesから入手した。Ｂｓｔ ＤＮＡポリメラーゼの大フラグメントをNew England Biolabsから購入し、熱安定性のＲＮａｓｅＨをEpicentreから購入した。実施例１で示されるように環状プローブを合成したが、ただし、異なる配列を有する環状化可能なプローブを使用した。

４００μＭのｄＮＴＰ、５００ｎＭのＰＧＲプローブ、１０ｎＭの環状プローブ、１×Ｔｈｅｒｍｏｐｏｌｙ緩衝液(New England Biolabs)、１／１２５０００に希釈したＳｙｂｒＧｒｅｅｎ Ｉ(Invitrogen、カルフォルニア州カールスバッド)、０．３Ｕの熱安定性のＲＮａｓｅＨ、及び０．８ＵのＢｓｔ ＤＮＡポリメラーゼの大きいフラグメントを構成成分とする１０μｌの反応系において、６５℃で１時間、ＰＧ−ＲＣＡを行った。ｉＣｙｃｌｅｒ(Biorad Laboratories、カルフォルニア州ハーキュリーズ)上での蛍光強度の増大により、リアルタイムでこの反応をモニタリングし、ＳｙｂｒＧｏｌｄ(Invitrogen)染色によりアガロースゲル上で分析した。対象の核酸配列の量（１０μｌ中に３×１０¹⁰、３×１０⁹、３×１０⁸、３×１０⁷、３×１０⁶、３×１０⁵、３×１０⁴、又は０個の分子）に応じて、蛍光シグナル強度の増大が観察された。

＜実施例４＞
鎖置換増幅を使用する３方向連結ＲＣＲにより開始されるＰＧ−ＲＣＡ
環状化可能なプローブ（配列番号１０）、３ＷＪプライマー（配列番号１１）、アンチセンスプライマー（配列番号１２）、及び対象の核酸配列（配列番号１３）をIntegrated
DNA Technologiesから購入した。実施例１で示されるように環状プローブを合成したが、ただし、異なる配列を有する環状化可能なプローブを使用した。

４００μＭのｄＮＴＰ、５００ｎＭの３ＷＪプライマー、５００ｎＭのアンチセンスプライマー、１μＭの環状プローブ、４ｍＭのＭｇＳＯ₄、５０ｍＭのＫＣｌ、１×Ｔｈｅｒｍｏｐｏｌ反応緩衝液(New England Biolabs)、１／１２５０００に希釈したＳｙｂｒＧｒｅｅｎ Ｉ(Invitrogen)、０．８ＵのＢｓｔ ＤＮＡポリメラーゼの大フラグメント(New England Biolabs)、及び１ＵのＮｂ．Ｂｓｍ Ｉ(New England Biolabs)を含む１０μｌの反応系において、６４℃で１時間、ＰＧ−ＲＣＡを行った。ｉＣｙｃｌｅｒ(Biorad Laboratories)上での蛍光強度の増大により、リアルタイムでこの反応をモニタリングし、ＳｙｂｒＧｏｌｄ(Invitrogen)染色によりアガロースゲル上で分析した。対象の核酸配列の量（１０μｌ中に３×１０⁸、３×１０⁶、３×１０⁴、３×１０²、３×１０⁰、３×１０^-2、又は０個の分子）に応じて、蛍光シグナル強度の増大が観察された。

＜実施例５＞
リボンプローブの合成
環状化可能なプローブ（配列番号１４）及び環状化可能なロックプローブ（配列番号１５）をIntegrated DNA Technologiesから購入した。製造業者のプロトコルに従って、Ｃｉｒｃｌｉｇａｓｅ(Epicentre)により環状化可能なロックプローブから環状ロックプローブを合成し、エキソヌクレアーゼＴ(New England Biolabs)及びエキソヌクレアーゼＩ(Epicentre)、並びにその後のＧ２５スピンカラム(Amersham Biosciences)精製により、環状化していないロックプローブを取り除いた。環状ロックプローブを鋳型として使用して、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ(Epicentre)により環状化可能なプローブを環状化して、エキソヌクレアーゼＴ及びエキソヌクレアーゼＩ、並びに後続のＧ２５スピンカラム精製によって、環状化していないプローブを取り除いた。得られたプローブは、互いにパドロックした環状プローブ及び環状ロックプローブから成るリボン状のプローブである。

＜実施例６＞
リボンプローブを使用するＰＧ−ＲＣＡ
対象の核酸（配列番号１６）をIntegrated DNA Technologiesから購入した。実施例５で示されるようにリボンプローブを合成した。

４００μＭのｄＮＴＰ、８０ｎＭのリボンプローブ、１×Ｔｈｅｒｍｏｐｏｌｙ緩衝液(New England Biolabs)、１／１２５０００に希釈したＳｙｂｒＧｒｅｅｎ Ｉ(Invitrogen)、０．３Ｕの熱安定性のＲＮａｓｅＨ、及び０．８ＵのＢｓｔ ＤＮＡポリメラーゼの大フラグメントを構成成分とする１０μｌの反応系において、６５℃で１時間、ＰＧ−ＲＣＡを行った。ｉＣｙｃｌｅｒ(Biorad Laboratories)上での蛍光強度の増大により、リアルタイムでこの反応をモニタリングし、ＳｙｂｒＧｏｌｄ(Invitrogen)染色によりア
ガロースゲル上で分析した。

標的分子の量（１０μｌ中に３×１０¹⁰、３×１０⁹、３×１０⁸、３×１０⁷、３×１０⁶、３×１０⁵、３×１０⁴、又は０個の分子）に応じて、蛍光シグナル強度の増大が観察された。

プライマー生成ローリングサークル増幅（ＰＧ−ＲＣＡ）開始反応を示す概略図である。 プライマー生成反応（ＰＧＲ）及びローリングサークル反応（ＲＣＲ）の反応サイクルを示す概略図である。 ヌクレアーゼによる開裂反応を利用したプライマー生成反応を示す概略図である。 ヌクレアーゼによる開裂反応を利用したプライマー生成反応を示す概略図である。 鎖置換増幅を利用したプライマー生成反応を示す概略図である。 鎖置換増幅を利用したプライマー生成反応を示す概略図である。 開裂により開始される等温増幅を利用したプライマー生成反応を示す概略図である。 ３方向連結等温増幅を利用したプライマー生成反応を示す概略図である。 ３方向連結ローリングサークル反応を利用したプライマー生成反応を示す概略図である。 リボンプローブを示す概略図である。 リボンプローブを示す概略図である。 リボンプローブを示す概略図である。 リボンプローブを使用するＰＧ−ＲＣＡを示す概略図である。

Claims (15)

1. 核酸配列を検出する方法であって、
   （ａ）第１の核酸プライマー及び環状核酸プローブを準備し、検出すべき核酸配列上に３方向連結構造を形成させるステップであって、前記第１の核酸プライマーは、下記ステップ（ｃ）における増幅反応温度と同程度に高いＴｍ値で前記検出すべき核酸配列とハイブリダイズするよう設計された５’部分と、前記検出すべき核酸配列が存在しない場合に前記第１の核酸プライマーと前記環状核酸プローブとの間でのハイブリダイゼーションを回避できる程度に低いＴｍ値で前記環状核酸プローブとハイブリダイズするよう設計された３’部分とを有し、前記環状核酸プローブは、下記ステップ（ｃ）における増幅反応温度と同程度に高いＴｍ値で前記検出すべき核酸配列とハイブリダイズするように設計されており、前記環状核酸プローブはプライマー生成反応（ＰＧＲ）開始配列に対する少なくとも１つのアンチセンス配列を含む、ステップ、
   （ｂ）前記３方向連結構造をポリメラーゼと混合するステップ、
   （ｃ）前記ポリメラーゼを使用して、ローリングサークル型増幅により、少なくとも１反復の前記環状核酸プローブのアンチセンスのコピーであって、少なくとも前記ＰＧＲ開始配列を含むコピーを産出するステップ、
   （ｄ）複数の第２の直鎖状核酸プライマーを、前記ＰＧＲ開始配列の各々のコピーから生成するステップ、
   （ｅ）前記第２の直鎖状核酸プライマーを、複数の前記環状核酸プローブとハイブリダイズさせるステップ、
   （ｆ）ステップ（ｃ）、（ｄ）及び（ｅ）を少なくとも１回反復するステップ、及び
   （ｇ）検出すべき核酸配列の存在を示すものとして、前記ポリメラーゼによる増幅反応の産物、又は前記第２の直鎖状核酸プライマーを検出するステップ
   を含む、方法。
2. 核酸配列を検出する方法であって、
   （ａ）以下のステップ（ａ１）、（ａ２）、及び（ａ３）を含む第１の核酸プライマーを生成するステップ、
   （ａ１）核酸プライマー及び核酸プローブを準備し、検出すべき核酸配列上に３方向連結構造を形成させるステップであって、前記核酸プライマーは、下記ステップ（ａ３）における増幅反応温度と同程度に高いＴｍ値で前記検出すべき核酸配列とハイブリダイズするよう設計された５’部分と、前記検出すべき核酸配列が存在しない場合に前記核酸プライマーと前記核酸プローブとの間でのハイブリダイゼーションを回避できる程度に低いＴｍ値で前記核酸プローブとハイブリダイズするよう設計された３’部分とを有し、前記核酸プローブは、下記ステップ（ａ３）における増幅反応温度と同程度に高いＴｍ値で前記検出すべき核酸配列とハイブリダイズするように設計されており、前記核酸プローブが少なくとも１つの第１のプライマー生成反応（ＰＧＲ）開始配列を含むステップ、
   （ａ２）前記３方向連結構造をポリメラーゼと混合するステップ、
   （ａ３）複数の第１の直鎖状核酸プライマーを、前記第１のＰＧＲ開始配列から生成するステップ、
   （ｂ）前記第１の直鎖状核酸プライマーをポリメラーゼ及び環状核酸プローブと混合するステップであって、前記第１の直鎖状核酸プライマーは前記環状核酸プローブとハイブリダイズするように設計されており、前記環状核酸プローブは第２のＰＧＲ開始配列に対する少なくとも１つのアンチセンス配列及び前記第１の直鎖状核酸プライマーに対する少なくとも１つのアンチセンス配列を含むステップ、
   （ｃ）前記ポリメラーゼを使用して、ローリングサークル型増幅により、少なくとも１反復の前記環状核酸プローブのアンチセンスのコピーであって、少なくとも前記第２のＰＧＲ開始配列を含むコピーを産出するステップ、
   （ｄ）複数の第２の直鎖状核酸プライマーを、前記第２のＰＧＲ開始配列の各々のコピーから生成するステップ、
   （ｅ）前記第２の直鎖状核酸プライマーを、複数の前記環状核酸プローブとハイブリダイズさせるステップ、
   （ｆ）ステップ（ｃ）、（ｄ）及び（ｅ）を少なくとも１回反復するステップ、及び
   （ｇ）検出すべき核酸配列の存在を示すものとして、前記ポリメラーゼによる増幅反応の産物、又は前記第２の核酸プライマーを検出するステップ
   を含む方法。
3. 前記生成ステップ（ｄ）が、第２の直鎖状核酸プライマーの生成反応を進行させる核酸分子を前記環状核酸プローブのアンチセンスのコピーにハイブリダイズさせることを含む、請求項１または２に記載の方法。
4. 前記第２の直鎖状核酸プライマーの生成反応を進行させる核酸分子が、前記環状核酸プローブのアンチセンスのコピーに含まれるＰＧＲ開始配列の少なくとも一部にハイブリダイズすることを特徴とする、請求項３に記載の方法。
5. 前記第２の直鎖状核酸プライマーの生成反応を進行させる核酸分子の少なくとも一部は、前記環状核酸プローブのアンチセンスのコピーに含まれるＰＧＲ開始配列とハイブリダイズしないことを特徴とする、請求項４に記載の方法。
6. 前記第２の直鎖状核酸プライマーの生成反応を進行させる核酸分子が直鎖状の核酸分子である、請求項３〜５のいずれか１項に記載の方法。
7. 前記第２の直鎖状核酸プライマーの生成反応を進行させる核酸分子が環状の核酸分子である、請求項３〜５のいずれか１項に記載の方法。
8. 前記第２の直鎖状核酸プライマーが、前記第２の直鎖状核酸プライマーの生成反応を進行させる核酸分子のヌクレアーゼによる開裂によって生成される、請求項３〜７のいずれ
   か１項に記載の方法。
9. 前記第２の直鎖状核酸プライマーが、前記環状核酸プローブのアンチセンスのコピー又は前記第２の直鎖状核酸プライマーの生成反応を進行させる核酸分子の伸長に由来する核酸のヌクレアーゼによる開裂によって生成される、請求項３〜７のいずれか１項に記載の方法。
10. 前記環状核酸プローブのアンチセンスのコピーのヌクレアーゼによる開裂の後で、アンチセンスのコピーの伸長と開裂が繰り返されることによって前記第２の直鎖状核酸プライマーが生成されることを特徴とする、請求項９に記載の方法。
11. ステップ（ｄ）が、前記第２の直鎖状核酸プライマーを自己プライミングさせること及び付加的な第２の直鎖状核酸プライマーを生成することを含む、請求項９に記載の方法。
12. 前記付加的な第２の直鎖状核酸プライマーが、前記第２の直鎖状核酸プライマーの伸長及びヌクレアーゼによる開裂によって生産される、請求項１１に記載の方法。
13. 前記付加的な第２の直鎖状核酸プライマーがＲＮＡの重合反応によって生成される、請求項１１に記載の方法。
14. ステップ（ｄ）が、ポリメラーゼによる重合、ヌクレアーゼによる開裂、及び転写のうち少なくとも１つを含む、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
15. ステップ（ｄ）が、ヌクレアーゼによる開裂反応、鎖置換増幅、ヌクレアーゼによる開裂により開始される等温増幅、３方向分岐等温増幅、及び３方向分岐ローリングサークル反応の１つを含む、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法。

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