JP5067917B2 - Ａｄａｍｔｓ１３の分離精製方法 - Google Patents

Description

本発明はフォンヴィルブランド因子切断酵素（ＡＤＡＭＴＳ１３）の分離精製方法、ＡＤＡＭＴＳ１３含有組成物の製造方法ならびにそれらの用途に関するものである。

血栓性血小板減少性紫斑病(thrombotic thrombocytopenic purpura; ＴＴＰ)は、血小板減少、溶血性貧血、動揺性精神神経障害などを特徴とする症候群である。かつては約８０%の患者が3ヶ月以内に死亡する予後不良の疾患であった。最近、ＴＴＰの病因としてＶＷＦ切断酵素（ＡＤＡＭＴＳ１３）の活性低下が報告された。すなわち、後天性のＴＴＰは、ＶＷＦ切断酵素に対するＩｇＧ型インヒビターが産生されることによって酵素活性が低下することが原因であることが明らかにされた(非特許文献1及び２)。また先天的なＴＴＰであるUpshaw-Schulman症候群(ＵＳＳ)では、遺伝的にＶＷＦ切断酵素が欠損していることが判明した(非特許文献３)。このＶＷＦ切断酵素をコードする遺伝子は、ＡＤＡＭＴＳ１３であることが判明した(非特許文献４及び５)。

先天性或いは後天性のＡＤＡＭＴＳ１３欠損症の治療は、主に新鮮凍結血漿の輸注或いは血漿交換等によって、予後が大幅に改善されるようになっている。しかしながら、先天性ＡＤＡＭＴＳ１３欠損症患者は約２週間毎に新鮮凍結血漿の輸注を欠かせないことから、輸血副作用が危惧されている。ＡＤＡＭＴＳ１３の濃縮製剤が供給されれば、そのような危惧も大幅に改善されると考えられる。

ＡＤＡＭＴＳ１３は亜鉛型メタロプロテアーゼで、ＶＷＦサブユニットのＴｙｒ１６０５−Ｍｅｔ１６０６結合を特異的に切断する。この酵素は血漿中に約０．５−１μｇ／ｍＬの濃度で存在するといわれている。この酵素を精製する試みはいくつか報告されている（非特許文献６，７）しかしながら、何れの報告も複雑な工程が必要であり、収率も悪いものであった。そこで簡便な精製方法の開発が望まれていた。

免疫吸着体を用いた抗原又は抗体の精製方法は一般的に行われている方法である。その手段は目的物質から不要物の除去、目的物質の精製及び濃縮等に有用である。抗原を担体に固定化した抗原固定化担体を用いて特異抗体を吸着させた後、抗原抗体結合体を酸、アルカリ或いはロダン塩等を用いて解離させ、特異抗体を回収する方法等はよく知られた技術である。また、抗体固定化担体を用いて抗原を吸着させたのち、抗原抗体結合体を解離させて抗原を回収する方法も公知である。この場合には、抗原の性質によって解離剤を選択する必要があることも知られている（非特許文献８）。本発明の目的であるＡＤＡＭＴＳ１３の分離精製方法において、抗ＡＤＡＭＴＳ１３抗体を用いて効率よくＡＤＭＴＳ１３を含む画分を回収した報告はない。
New Engl. J. Med.339,1578-1584,1998。 New Engl. J. Med.339,1585-1594,1988。 J. Hematol.74,101-108,2001 J Biochem.130,475-480,2001。 J. Biol. Chem.276,41059-41063,2001 Ｂｌｏｏｄ、８７、４２２３−４２３４，１９９６ Ｂｌｏｏｄ、９８、１６６２−１６６６，２００１ Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６５、７０６９−７０７７、１９９０

本発明の目的は、ＡＤＡＭＴＳ１３の効率的な分離精製方法の提供ならびに当該方法により調製されたＡＤＡＭＴＳ１３含有組成物の産業的利用方法を提供することである。

本発明者らは、ＡＤＡＭＴＳ１３の分離精製方法を鋭意研究し、抗ＡＤＡＭＴＳ１３抗体を用いてＡＤＡＭＴＳ１３分子を抗体に結合させた後、結合体より水溶性有機溶媒を用いてＡＤＡＭＴＳ１３を解離させる、或いは高濃度の塩化マグネシウムを用いて解離させることにより、効率よくＡＤＡＭＴＳ１３を含む画分を回収することができることを見出し、本発明を完成させた。

本発明は以下の構成からなる。
１、フォンヴィルブランド因子切断酵素（ＡＤＡＭＴＳ１３）を含む試料よりＡＤＡＭＴＳ１３分子を含む画分を分離精製する方法であって、ＡＤＡＭＴＳ１３分子に特異的結合性を有する抗体とＡＤＡＭＴＳ１３を含む溶液中のＡＤＡＭＴＳ１３とを結合させた後、該結合を解離させる工程において、水溶性有機溶媒を含む解離剤を用いることを特徴とする分離精製方法。
２、水溶性有機溶媒を含む解離剤が、ジメチルスルオキシド、エチレングリコール、プロピレングリコール、エタノール、メタノール、アセトン、ジメチルホルムアミド及びグリセロールの中から選択された少なくとも１種の水溶性有機溶媒を含む解離剤を用いる上記１に記載のＡＤＡＭＴＳ１３の分離精製方法。
３、水溶性有機溶媒を少なくとも３（ｖ／ｖ）％含む解離剤を用いる上記１および２のいずれかに記載のＡＤＡＭＴＳ１３の分離精製方法。
４、ＡＤＡＭＴＳ１３分子に特異的結合性を有する抗体と試料中のＡＤＡＭＴＳ１３を結合させた後、０．１〜３Ｍの無機塩を含む緩衝液で結合物を含む画分を洗浄した後、
水溶性有機溶媒を含む解離剤を用いる上記１〜３のいずれか１に記載のＡＤＡＭＴＳ１３の分離精製方法。
５、ＡＤＡＭＴＳ１３を含む試料よりＡＤＡＭＴＳ１３分子を含む画分を分離精製する方法であって、ＡＤＡＭＴＳ１３分子に特異的結合性を有する抗体とＡＤＡＭＴＳ１３を含む溶液中のＡＤＡＭＴＳ１３とを結合させた後、該結合を解離させる工程において、塩化マグネシウムを含む解離剤を用いることを特徴とする分離精製方法。
６、塩化マグネシウムの濃度が少なくとも１mol/Lを含む解離剤を用いる上記５に記載のＡＤＡＭＴＳ１３の分離精製方法。
７、固相担体に担持させたＡＤＡＭＴＳ１３分子に特異的結合性を有する抗体を用いる上記１〜６のいずれか１に記載のＡＤＡＭＴＳ１３の分離精製方法。
８、上記１〜７のいずれか１に記載の分離精製方法と、ＡＤＡＭＴＳ１３分子の電気的性質、分子の大きさ、親水性又は疎水性、水素結合力、塩析又は塩溶、及び特異的リガンドとの結合性を利用した精製方法のうちから選択された少なくとも１つの精製工程を組み合わせるＡＤＡＭＴＳ１３の分離精製方法。
９、上記１〜８のいずれか１に記載の方法により分離精製されたＡＤＡＭＴＳ１３含有組成物。
１０、上記９に記載のＡＤＡＭＴＳ１３含有組成物を用いる、先天性或いは後天性ＡＤＡＭＴＳ１３減少症の治療薬。
１１、上記９に記載のＡＤＡＭＴＳ１３含有組成物を用いる、抗ＡＤＡＭＴＳ１３抗体の検査方法。
１２、上記１１に記載の検査方法に用いる検査試薬又はキット。
１３、上記９に記載のＡＤＡＭＴＳ１３含有組成物を免疫原として動物に免疫することにより抗ＡＤＡＭＴＳ１３抗体を調製する方法。
１４、上記１３に記載の方法により調製された抗体。
１５、上記１４に記載の抗体を含むＡＤＡＭＴＳ１３抗原検査用検査試薬又はキット。

本発明のＡＤＡＭＴＳ１３の分離精製方法は、簡単に血漿などの体液及び細胞等の抽出液から効率よくＡＤＡＭＴＳ１３を含む画分を回収する方法を提供するものであり、血漿のごとく大多数の分子種、大量の夾雑物質を含む試料からＡＤＡＭＴＳ１３を高度に精製、濃縮する方法を提供するものである。当該ＡＤＡＭＴＳ１３の分離精製
方法により調製されたＡＤＡＭＴＳ１３組成物は治療薬、検査薬に応用できることから、
本発明は、ＡＤＡＴＳ１３含有組成物の利用方法にも及び産業上の利用価値も高い。

本発明においてＡＤＡＭＴＳ１３を含む試料はヒト又は動物の血液、体液、組織或いは細胞の抽出液等特に限定されるものではない。また抗ＡＤＡＭＴＳ１３抗体はＡＤＡＭＴＳ１３分子と結合しうるものであればよく、その由来の動物種またモノクローナル抗体或いはポリクローナル抗体のいかなるものも含まれる。抗体は抗体分子全体でも、或いは抗体活性を有する分子の一部でもよい。抗体は液状のまま用いることも不可能ではないが、好適には固相担体に担持固定化された状態で用いられる。固相に担持固定化する方法は特に限定されることなく公知の方法が適用される。固相担体の体積当りの担持固定化される抗体の量はとりわけ限定されないが、０．１−１０ｍｇ／ｍＬ固相、より好適には０．５−５ｍｇ／ｍＬ固相である。

本発明の本質である抗原抗体結合体の解離剤は水溶性有機溶媒または塩化マグネシウムから選択される。水溶性有機溶媒として、ジメチルスルオキシド、エチレングリコール、プロピレングリコール、エタノール、メタノール、アセトン、ジメチルホルムアミド及びグリセロール等が好適に用いることができる。その濃度は用いる抗体の性質と溶媒の種類によって変動するが、少なくとも３（ｖ／ｖ）％の濃度で用いられる。より好適には、１０−５０（ｖ／ｖ）％の濃度で用いられる。水溶性有機溶媒を溶かす緩衝液は、ＡＤＡＭＴＳ１３の安定性を考慮し、中性付近のｐＨを有する緩衝液が用いられる。緩衝液の種類はＡＤＡＭＴＳ１３の安定性や活性を損なわないものであればよく、特に限定されないが、ＴｒｉｓやＨＥＰＥＳ等の公知の緩衝液が好適に用いられる。また、解離剤には、塩化ナトリウム、塩化カリウム、硫酸アンモニウム等の無機塩を０．１−３Ｍの濃度、より好適には０．５−２Ｍで適宜含ませることもある。塩化マグネシウムを解離剤として用いる場合には、前記の適当な緩衝液に少なくとも１Ｍを、より好適には２−５Ｍ含ませて用いる。

本発明のＡＤＡＭＴＳ１３の分離精製方法により調製されたＡＤＡＭＴＳ１３組成物は、さらに、ＡＤＡＭＴＳ１３の電気的性質、分子の大きさ、親水性又は疎水性、水素結合力、塩析又は塩溶、及び特異的リガンドとの結合性を利用した精製方法のうちから選択された方法により更に精製することも本発明に含まれる。電気的性質を利用した精製方法の例として、イオン交換クロマトグラフィ、等電点電気泳動などの手段、分子の大きさを利用した精製方法の例として、分子篩クロマトグラフィ、ゲル電気泳動、
限外ろ過膜による分離等の手段、親水性又は疎水性を利用した精製方法の例として、疎水性相互作用クロマトグラフィ等、水素結合を利用した精製方法の例として、水素結合クロマトグラフィ等、塩析又は塩溶を利用した精製方法の例として、硫酸アンモニウムや硫酸ナトリウムによる塩析操作や、塩析クロマトグラフィ等、特異的リガンドとの結合性を利用した精製方法の例として、ヘパリン固定化カラム等による群特異的親和性クロマトグラフィ等が例示される。

本発明のＡＤＡＭＴＳ１３の分離精製方法により調製されたＡＤＡＭＴＳ１３組成物の利用方法として、先天性又は後天性にＡＤＡＭＴＳ１３が減少する疾患において、ＡＤＡＭＴＳ１３を補充するための治療薬が挙げられる。該組成物を免疫原として動物に投与し、公知の方法で抗ＡＤＡＭＴＳ１３抗体を調製するための抗原として利用することもできる。また、該組成物を用いて血液中の抗ＡＤＡＭＴＳ１３自己抗体の検査用原料としても利用できる。本発明には、上記の治療薬、抗体を作成する方法および作製した抗体、該抗体または該抗原を利用した検査方法、さらには該検査方法を実施するための検査試薬、キットも含まれる。

抗ＡＤＡＭＴＳ１３モノクローナル抗体（クローンＡ１０，受託番号 ＦＥＲＭ Ｐ−２０１８９のマウスハイブリドーマより産生されるモノクローナル抗体）を用いた本発明の方法を具体的に説明する。
１、抗ＡＤＡＭＴＳ１３モノクローナル抗体（Ａ１０抗体）を市販のアガロースゲルに公知の方法で固定化する。固定化する抗体の量は、ゲル体積１ｍＬ当たり約１ｍｇを目処に固定化する。この量は既に述べたように特に限定されるものではない。固定化したゲルを適当な大きさのカラムに充填し、０．１５Ｍ ＮａＣｌ含有２０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液、ｐＨ７．４、（ＴＢＳ緩衝液）のような適当な緩衝液で平衡化し、ヒトクエン酸加血漿をカラムに通過させる。所定量の血漿を通過させた後、カラムをＴＢＳ緩衝液により洗浄する。次いで４０（ｖ／ｖ）％ジメチルスルオキシドを含むＴＢＳ緩衝液をカラムに通し、吸着画分を溶出する。この操作により、ＡＤＡＭＴＳ１３を含む画分が回収される。
２、回収したＡＤＡＭＴＳ１３を含む画分を更に精製するために、回収した画分を２０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．４）に対して透析し、同緩衝液で平衡化したＤＥＡＥ−陰イオン交換体に吸着させた。吸着させたカラムを、食塩濃度を０−０．５Ｍの間で変化させることにより溶出し、ＡＤＡＭＴＳ１３を含む画分を回収する。
３、回収したＡＤＡＭＴＳ１３を含む画分を更に精製するために、上記２の工程で回収した画分を濃縮後、分子篩クロマトグラフィにより分画、精製する。

（解離剤の検索）
Ａ１０抗体を５μｇ／ｍＬの濃度に調製し、各々、１ウエル当たり１００μＬずつマイクロタイタープレートに添加し、一晩吸着させた後、Ｔｗｅｅｎ−２０を０．０５％含むリン酸緩衝液（以下洗浄液と略す）で５回洗浄し、さらに１０％ブロックエース（商品名）を含むリン酸緩衝液でブロッキングしＡ１０抗体固相化プレートを調製した。正常ヒト血漿５０μＬを固相プレートに添加し、３７℃で６０分間反応させた後、洗浄液で３回洗浄し、種々の解離剤を含む緩衝液１００μＬを加え、室温で１０分間放置した後、洗浄液で３回洗浄し、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（以下ＨＲＰと略す）標識した抗ＡＤＡＭＴＳ１３モノクローナル抗体(クローンＣ７、受託番号 ＦＥＲＭ Ｐ−２０１９０)を３７℃で６０分反応させた。この反応の後、洗浄液で４回洗浄し、基質液（ｏ−フェニレンジアミン0.4ｍｇ／ｍｌ及び０．０２％Ｈ₂
Ｏ₂ を含む）を３７℃で１５分間反応させた後、この反応を２Ｎ硫酸で停止させ、主波長４９２ｎｍでエライザ用プレートリーダーにて吸光度を測定した。各解離剤の固相抗体に対する影響を相殺するため、正常ヒト血漿を添加する前に、種々の解離剤で処理した後、洗浄後正常ヒト血漿を反応させたものを対照とした。解離剤により解離作用の判定は対照のウエルで得られた吸光度から試験ウエルの吸光度の差を求め、それを対照の吸光度で除した値を比較検討した。その結果を表１に示した。最下段の２０ｍM Tris＋１M NaClは解離剤を含まない対照である。解離剤を含まない２０ｍM Tris＋１M NaClでは試験ウエルと対照ウエルでの吸光度の差がなく、ウエルにＡ１０抗体を介して捕獲されたＡＤＡＭＴＳ１３がそのまま残存しているのに対して、エチレングリコール或いはジメチルスルオキシドを含む解離剤では対照ウエルの吸光度に比して試験ウエルの吸光度が何れも有意に減じていることから、ウエルに捕獲されているＡＤＡＭＴＳ１３が解離剤によって解離していることが判った。従って、この結果よりエチレングリコール或いはジメチルスルオキシドを含む解離剤を用いてＡ１０抗体−ＡＤＡＭＴＳ１３結合体よりＡＤＡＭＴＳ１３を解離できることが判った。

約５ｍｇのＡ１０抗体を約５ｍＬの市販のブルムシアン活性化セファロース４Ｂ（商品名）に公知の方法により固定化し、Ａ１０抗体固定化セファロースを調製した。調製したＡ１０抗体固定化セファロース、１ｍＬずつをカラムに充填し、ＴＢＳで洗浄、平衡化した後、各カラムに５ｍＬのクエン酸加ヒト血漿をカラムに通した。その後、カラムをＴＢＳで洗浄し、４．５Ｍ 塩化マグネシウムを含む２０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．４）緩衝液及び５０（ｖ／ｖ）％エチレングリコールと１ＭＮａＣｌを含む２０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．４）緩衝液でそれぞれカラムを溶出した。溶出画分を過剰のＴＢＳに透析した後、波長２８０ｎｍに於ける吸光度及びＡＤＡＭＴＳ１３活性を加藤らの方法（特願２００５−１５７５３０）により測定した。その結果を図１に示した。何れの解離剤でもＡＤＡＭＴＳ１３がカラムより溶出してくることがわかった。

約５ｍｇのＡ１０抗体を約５ｍＬの市販のブルムシアン活性化セファロース４Ｂ（商品名）に公知の方法により固定化し、Ａ１０抗体固定化セファロースを調製した。調製したＡ１０抗体固定化セファロースをカラムに充填し、ＴＢＳで洗浄、平衡化した後、
９２０ｍＬのクエン酸加ヒト血漿をカラムに通した。その後、カラムをＴＢＳで洗浄し、
１Ｍ ＮａＣｌと１０（ｖ／ｖ）％ＤＭＳＯを含む２０ｍＭＴｒｉｓ（ｐＨ７．４）及び１Ｍ ＮａＣｌと３０（ｖ／ｖ）％ＤＭＳＯを含む２０ｍＭＴｒｉｓ（ｐＨ７．４）で溶出した。溶出画分を過剰のＴＢＳに透析した後、波長２８０ｎｍに於ける吸光度及びＡＤＡＭＴＳ１３活性を加藤らの方法（特願２００５−１５７５３０）により測定した。その結果、１０％ＤＭＳＯ溶出画分に約３％の収率で、一方３０％ＤＭＳＯ溶出画分に約２５％の収率でＡＤＡＭＴＳ１３活性が回収され、回収された画分の精製度は原料血漿に比して、それぞれ約８７倍及び約８７７倍であった。さらにこれらの画分をＤＥＡＥ−セファロースカラムによるイオン交換クロマトグラフィにより、更に精製度を
原料血漿に比して、それぞれ約１１９倍及び約３４６３倍まで高めることができた。この画分をセファロース６Ｂカラムによる分子篩クロマトグラフィにかけることにより、原料血漿に比して、それぞれ約１８５倍及び約７３００倍まで精製度を高めた画分を得た。

本発明の方法によるイムノアフィニティクロマトグラフィの結果の一例を示した図である。

Claims (6)

1. フォンヴィルブランド因子切断酵素（ＡＤＡＭＴＳ１３）を含む試料よりＡＤＡＭＴＳ１３分子を含む画分を分離精製する方法であって、ＡＤＡＭＴＳ１３分子に特異的結合性を有する抗体とＡＤＡＭＴＳ１３を含む溶液中のＡＤＡＭＴＳ１３とを結合させた後、該結合を解離させる工程において、中性のｐＨを有する緩衝液中にジメチルスルオキシドを含む解離剤を用いることを特徴とする分離精製方法。
2. ジメチルスルオキシドを３０〜５０（ｖ／ｖ）％含む解離剤を用いる請求項１に記載のＡＤＡＭＴＳ１３の分離精製方法。
3. 前記解離剤がさらに、０．１〜３Ｍの無機塩を含む、請求項１または２に記載のＡＤＡＭＴＳ１３の分離精製方法。
4. ＡＤＡＭＴＳ１３分子に特異的結合性を有する抗体が受託番号ＦＥＲＭ−Ｐ２０１８９のハイブリドーマにより産生されるモノクローナル抗体である、請求項１〜３のいずれか１に記載のＡＤＡＭＴＳ１３の分離精製方法。
5. 請求項１〜４のいずれか１に記載の分離精製方法と、ＡＤＡＭＴＳ１３分子の電気的性質、分子の大きさ、親水性又は疎水性、水素結合力、塩析又は塩溶、及び特異的リガンドとの結合性を利用した精製方法のうちから選択された少なくとも１つの精製工程を組み合わせるＡＤＡＭＴＳ１３の分離精製方法。
6. ＡＤＡＭＴＳ１３を含む試料がヒト又は動物の血液、体液、又は組織由来のものであり、当該試料から請求項１〜５のいずれか１に記載の方法により分離精製されたＡＤＡＭＴＳ１３含有組成物。

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