JP5033798B2 - タンパク質を含む安定水系 - Google Patents

Description

本発明は、タンパク質を含む安定水系に関する。

タンパク質の天然の三次元構造の消失は、一般的に、その生物活性の消失と関連する。したがって、活性タンパク質（例えば、ワクチン、治療タンパク質、診断タンパク質ほか）を天然の三次元構造が維持される条件下で保存することを確保することは重要である。

いずれか長時間にわたるタンパク質の保存は、安定性の問題を課する。三次元構造の不安定は温度に比例する。したがって、タンパク質は一般的により低温においてより安定である。典型的には、タンパク質は、フリーズドライ（凍結乾燥）または凍結（−２０℃付近）で保存して、その生物活性を維持しなければならない。凍結乾燥または凍結して保存する場合、タンパク質はそれを使用する前に復元しなければならない。タンパク質の短期間の保存であれば、４℃の冷蔵で十分となり得る。

タンパク質は、２０種類の異なる天然に発生するアミノ酸の配列からなる巨大分子である。これらのアミノ酸の７種（アスパラギン酸、グルタミン酸、ヒスチジン、システイン、チロシン、リシンおよびアルギニン）は、酸−塩基平衡で結合することができる側鎖を含んでいる。このことは、それらが、ｐＨおよび溶液中に存在する他の種に依存してプロトンの受容または供与のいずれかを行い得ることを意味している。セリンおよびスレオニンも、周りの分子とプロトンを交換することができる。しかしながら、これらのアミノ酸のｐＫａ値はきわめて高く（＞１３.９）、よってそれらの側鎖は実際には常にほぼ全体としてプロトン化した形態である。

欧州特許０５１３９１４は、７５０ｍＭの濃度のアスパラギン酸でのウリカーゼの安定化を開示している。米国特許第３０５１６２７号は、ｐＨ４のアミノ酸を含む水中のキモトリプシンを開示している。

本発明の第１の態様によれば、水系はタンパク質および１以上の安定化剤を含み、ここに該水系は以下のことを特徴とする：
（ｉ）１以上の安定化剤は、タンパク質とおよび水解離のイオン化生成物とプロトンを交換できるイオン化可能な基を有する；
（ｉｉ）イオン化可能な基は、プロトン化された場合に正に荷電し、脱プロトン化された場合に荷電しない第１の基、およびプロトン化した場合に荷電せず、脱プロトン化した場合に負に荷電する第２の基を含み；および
（ｉｉｉ）組成物のｐＨは、ｐＨに関するタンパク質の最大安定性の少なくとも５０％であるタンパク質安定性の範囲内にある。

本発明の第２の態様によれば、水系はタンパク質および１以上の安定化剤を含み、ここに該水系は以下のことを特徴とする：
（ｉ）１以上の安定化剤はタンパク質とおよび水解離のイオン化生成物とプロトンを交換できるイオン化可能な基を有する；
（ｉｉ）イオン化可能な基は、プロトン化された場合に正に荷電し、脱プロトン化された場合に荷電しない第１の基、およびプロトン化した場合に荷電せず、脱プロトン化した場合に負に荷電する第２の基を含み；および
（ｉｉｉ）組成物のｐＨは、組成物がｐＨに関して最大安定性を有するｐＨの±０.５ｐＨ単位の範囲内にある。

本発明の第３の態様によれば、組成物は、固形物に吸着した、タンパク質および前記に定義した１以上の安定化剤を含む。

本発明は、タンパク質が保存安定性について最適化した周囲に対してプロトン交換平衡状態にある値の、すなわち最適プロトン交換平衡の条件下の４ないし９の範囲内またはその付近の値のｐＨを決定することを含む、水性環境中のタンパク質の保存安定性を最適化する適当なｐＨを同定する方法も提供する。

最適プロトン交換平衡状態は、以下の２の条件が合致するｐＨに存在する：
ａ）（各々の個々のアミノ酸のｐＫａによって決まる）タンパク質配列中の個々のアミノ酸の各々のプロトン化（Ｐ）の確率が、５０％（すなわち、５０％がプロトン化した形態で、５０％が脱プロトン化された形態）から可能な限り遠く離れている；および
ｂ）タンパク質配列中のすべてのアミノ酸の全体プロトン化（配列中の全アミノ酸のｐＫａ値によって決まる）が可能な限り高い。

最適プロトン交換平衡状態、すなわち、保存安定性が最適化される状態は、条件ａ）およびｂ）が両方とも可能な限り遠くで合致するものであるが、妥協は全体の最適化のために２の条件の間に達する。

条件ａ）およびｂ）の基準の値は、両方ともｐＨに依存し、いずれかのｐＨのいずれかのタンパク質について計算することができる。条件ａ）の計算には、タンパク質のアミノ酸配列（これはすべてのアミノ酸に基づき得るが、好ましくは折り畳まれた活性状態のタンパク質の表面に近づき得るアミノ酸のみに基づく）およびタンパク質のアミノ酸側鎖のｐＫａ値の知識が必要である。７のプロトン化可能なアミノ酸のみが適当である。条件ｂ）の計算には、タンパク質の等電点の知識も必要である。このようにして、条件ａ）およびｂ）が両方可能な限り遠くで合致するｐＨを決定することができる。

特に、いずれかのｐＨでのプロトン化の確率（Ｐ）（本明細書中では「プロトン交換頻度」ともいう）は、前記のようにして計算することができ、ｐＨに対してプロットしてＰが最小であるｐＨ（４ないし９の間隔）（Ｐ最小値）を決定することができる。

プロトン化の確率（Ｐ）は、以下の数学関数によって計算することができる：

式中：

Ｍはタンパク質単位の相対分子量であり；
Ｎはタンパク質単位の所与のアミノ酸側鎖の数であり；
ｐＫａは所与のアミノ酸側鎖の酸解離定数Ｋａの負の常用対数である。
その場合、条件ｂ）を考慮する調節は、以下の等式によるＰの至適化値（至適Ｐ）を計算することによってなし得る：

式中：
ｐｌはタンパク質の等電点であり；および
ＡおよびＢは、全アミノ酸組成を用いる場合は値Ａ＝−１.１９２およびＢ＝１０.５８７、タンパク質表面に近づき得るアミノ酸のみを用いる場合は値Ａ＝−０.９３１およびＢ＝８.４３０を有する定数である。

ついで、Ｐ最小値の値に対応するｐＨ値よりも低い至適Ｐに対応するｐＨ値を決定することができ、これはタンパク質についての計算至適ｐＨを与える。

この論理式の使用は、特定のタンパク質の保存安定性利益の至適ｐＨの合理的に正確な予想を可能にする。ついで、正確な至適ｐＨを、前記に論じた１以上の添加物を含む可能性があるいずれの所与の系について実験的に決定することができる。

値「のまたは付近の」ｐＨという場合、通常、±０.５ｐＨ単位、好ましくは±０.４ｐＨ単位、より好ましくは±０.２ｐＨ単位を意味する。

多くのタンパク質についての折り畳まれた、活性状態の、タンパク質のアミノ酸の表面での近づき易さを含む、等張点値およびアミノ酸配列のデータは、種々のソースから容易に利用可能であり、配列データの１の都合のよいソースは、www.rcsb.org/pdbのオンラインで利用可能であるProtein Data Bank情報データバンクである。その他、情報の紙に基づくソースも利用可能である。

本発明は、非最適保存安定性の初期条件の環境における水性中のタンパク質を処理する方法も提供して、保存安定性を最適に近づ、かかる方法は、ｐＨを、タンパク質が保存安定性について最適化されたその周囲に対してプロトン−交換平衡状態にある値である４ないし９またはその付近の値にｐＨを調節することが含まれる。

本発明は、さらに、タンパク質が保存安定性について最適化されたその周囲に対してプロトン交換平衡状態にある値の付近のｐＨを提供することを含む、保存安定性について最適化された条件を有する水性環境中にタンパク質を提供する方法を提供する。

本発明は、さらに、その範囲内において、タンパク質が保存安定性について最適化された周囲に対してプロトン交換平衡状態にあるタンパク質を提供する方法も提供する。

安定化したタンパク質は、微生物学的に無菌形態で存在することができ、簡便に含ませることができ、バイアル、シリンジまたはカプセルのような密封した無菌容器に簡便に含有させることができる。

本発明は、タンパク質が保存安定性について最適化されたその周りに対してプロトン交換平衡状態にある値のまたはその付近の４ないし９の範囲のｐＨを環境に提供することを含む、常温およびそれを超える温度を含む、水性環境中のタンパク質の保存方法も提供する。

本発明のさらなる態様は、熱分解（常温およびそれを超える温度を含む）に対して水性環境中のタンパク質を保護することができる条件を選択する方法であり、タンパク質が保存安定性について最適化されたその周りに対してプロトン交換平衡状態にある値のまたはその付近の４ないし９の範囲のｐＨを選択することを含む。

タンパク質を、その周りに対してプロトン交換平衡状態が保存安定性について最適化される値のまたはその付近の好適なｐＨ（通常０.５ｐＨ単位以内、好ましくは０.４ｐＨ単位以内、およびより好ましくは０.２ｐＨ単位以内）にすることによって、タンパク質の保存安定性（常温（約２０℃））または高温のいずれにおいても）を向上することができ、おそらくは実質的に、非−最適化条件（通常、ｐＨ７）のタンパク質の保存安定性と比較して向上することができる。

「タンパク質の保存安定性を最適化する」とは、必ずしも最適を達成するものではないが、最適に向けてタンパク質の保存安定性が移動することを意味する。最適に近い保存安定性にすることにより、非−最適条件、例えばｐＨ７、と比較して保存安定性が改善する。

保存安定性は、一般的に、Ｈ_３Ｏ^＋（１３.９９のｐＫａを有する）およびＯＨ⁻（−１.７４のｐＫａを有する）のものよりも極めて低いｐＫａ値を有するタンパク質でプロトンを交換することができる１またはそれを超える種を含む１またはそれを超える添加剤の使用によってさらに向上することができる。前記に論じた第１および第２の官能基を有する１またはそれを超える添加剤を使用することが好ましい。

添加剤は、添加剤の全濃度が１ｍＭないし１Ｍ、好ましくは１ｍＭないし２００ｍＭ、最も好ましくは５ｍＭないし１００ｍＭの範囲にあるような量で好適には存在する。ある種のタンパク質では低レベルの添加剤（５ｍＭ付近）で良好な結果が得られており、より高レベルを用いることによってほとんど利益が得られないが、例外も見出される。例えば、カタラーゼの場合、より高レベルの添加剤（１００ｍＭ）は、低レベル（１０ｍＭ）よりも顕著に良好な安定性を付与する。ある種の実際の適用においては、特に医療適用においては、可能な限り低濃度の添加剤を使用することが望ましい場合があろう。

本発明の根底にある発見は、本明細書中で論じるように、理論的基礎を有し、それは実践において支持されている。実際、本明細書は、利用可能な情報に基づいて、いずれかのタンパク質についての安定化系をどのように決定することができるかを記載している。それにもかかわらず、本発明の利点は、溶液中のいずれのタンパク質についても、他の添加剤の存在に依存して安定性とｐＨの間に関係が存在すること、およびタンパク質が最適安定性を有するｐＨが存在することの理解の上の、経験的基礎でも達成し得る。本明細書に示す情報に基づいて、当業者は、有用となりそうな添加剤を容易に決定することができ、ついで、それが実際にそれによって本発明が定義される基準に合致するかを容易に決定することができる。

本発明の前には、プロトン交換およびしたがってタンパク質の保存安定性に関連するｐＨの重要性は正しく認識されていなかったようである。本発明は、適当なｐＨを、好ましくは１またはそれを超える添加剤と組合せて、選択することによってタンパク質の保存安定性に改善をなすことができる。

したがって、本発明は、活性の顕著な損失なしに常温で長期間タンパク質を保存し得るように水性環境中におけるタンパク質の保存安定性に改善をなすことができ、したがって凍結または冷蔵の必要を回避することができる。本明細書中の実験例の大部分は高温（典型的には５５℃および６５℃）を用いて活性の損失を加速しているが、結果は、常温の温度を含む、より低温でのタンパク質安定性の非常に良好な兆候を提供している。

本発明は、前記に論じたように、ポリペプチドほかを含む、タンパク質ワクチンおよび治療タンパク質を含む、ならびにグルカゴン（相対分子量３５５０）およびインスリン（相対分子量６０００）のような比較的小さなタンパク質／ポリペプチドを含む広範囲のタンパク質に適用可能である。

本発明がタンパク質を安定化する課題に対する一般的解決法を提供していることは理解されるであろう。もちろん、本発明の普遍性を理解することなく本明細書に記載した基準に合致する組成物を先行技術が開示している可能性はある。前記に言及した先行技術のようないずれのかかる開示も、本願の特許請求の範囲から除外される。

本発明のさらなる態様は、タンパク質および調節剤上に吸着した１またはそれを超える添加剤を含む組成物である。そのまたは各添加剤は、前記に定義したように、まるで水溶液中に存在するかのように選択する（しかし、必ずしも水溶性でなくてもよい）。かかる組成物は、水性組成物または本発明からの成分の調節剤上への吸着によって得ることができる。

図面の説明
図１は、７のプロトン化可能なアミノ酸についての、％プロトン化／脱プロトン化形態−対−ｐＨのグラフであり、実線はプロトン化形態を表し、点線は脱プロトン化形態を表し；
図２は、７のプロトン化可能なアミノ酸についての、通常単位のプロトン化形態［ＨＡ］および脱プロトン化形態［Ａ］の正規化濃度の生成物−対−ｐＨのグラフである。
図３は、酵素パパインについての、通常単位のプロトン交換頻度（タンパク質のサイズに対する）−対−ｐＨのグラフであり、パパイン分子の表面に対するプロトン交換の相対速度を示している。
図４は、グルコースオキシダーゼおよびパパインのアミノ酸側鎖の％プロトン化−対−ｐＨのグラフである。
図５は、グルコースオキシダーゼおよび西洋ワサビペルオキシダーゼについての、通常単位のプロトン交換頻度（タンパク質のサイズに対する）−対−ｐＨの一対のグラフであり、最低全体プロトン交換頻度および実際のｐＨ最適値に基づいて計算したタンパク質安定性の理論ｐＨ最適値間の差を示している。
図６は、２５℃の水性溶液中のＨ_３Ｏ^＋およびＯＨ⁻についての（μＭの）濃度−対−ｐＨのグラフである。
図７は、通常単位Ｐのプロトン交換頻度（タンパク質のサイズに対して）−対−ｐＨのグラフであり、タンパク質の公知のアミノ酸配列および等電点に基づくタンパク質安定性のｐＨ最適値の推定を示している。
図８は、図３と同様のグラフであり、タンパク質の公知のアミノ酸配列および等電点に基づくグルコースオキシダーゼの安定性のｐＨ最適値の推定を示している。
図９は、カタラーゼについての図８と同様のグラフである。
図１０は、パパインについての図８と同様のグラフである。
図１１は、グルタミン酸脱水素酵素についての図８と同様のグラフである。
図１２は、（Ａ）リン酸緩衝液（２０ｍＭ、ｐＨ７.０）、（Ｂ）ＴＲＩＳ／ＨＣｌ緩衝液（２０ｍＭ、ｐＨ７.２）、（Ｃ）ホウ酸緩衝液（２０ｍＭ、ｐＨ９.０）、（Ｄ）プリン（２０ｍＭ）＋コハク酸（２０ｍＭ）ｐＨ９.０、（Ｅ）ＴＲＩＳ（２０ｍＭ）＋セリン（２０ｍＭ）ｐＨ８.８を含有する処方中の６０℃でのインキュベーションでのウリカーゼ活性の活性回復のグラフである。［ウリカーゼ］＝２５０μｇ ｍＬ^−１。

好ましい形態の説明
本発明のある種の好ましい特徴を下位請求項に規定する。
本発明がタンパク質の安定性に関し、詳細には水性環境中、例えば自由水または結合水が存在する水溶液中、水性ゲル形態中および固体状態中（または他の非液体状態）のタンパク質の安定性に関し、タンパク質の保存安定性、すなわち常温（約２０℃）以上の安定性を含む経時安定性に関することは理解されるであろう。本明細書中で用いる「タンパク質」なる語は、単一のポリペプチドからなる分子または分子複合体、２またはそれを超えるポリペプチドを含む分子または分子複合体、ならびに置換基、補助因子ほかのような１またはそれを超える非−ポリペプチド基と一緒に１またはそれを超えるポリペプチドを含む分子または分子複合体を包含する。「ポリペプチド」なる語は、グリコシル化ポリペプチド、リポタンパク質ほかのような共有結合した非−アミノ酸基を含むポリペプチドを包含することを意図する。詳細には、本発明は、その活性が分子または分子複合体の少なくとも重要な部分の特定または天然の三次元構造の保持にきわめて依存する、関心のある１またはそれを超える生物活性を有する分子に関する。一般的に、本発明は、タンパク質機能におそらく重要である二次元構造または三次元構造の少なくとも基本モチーフを形成し得る場合の少なくとも２０００の分子量を有するポリペプチド（すなわち、少なくとも約１５のアミノ酸からなる）に適用し得し得る。

本発明は、タンパク質の構造特徴、詳細には二次元構造、三次元構造および四次元構造の保持、およびタンパク質の機能特徴、詳細には酵素活性、抗原結合、受容体結合、リガンド結合または他の特定の結合事象の保持が重要であるいずれの系にも適用可能である。

本発明の適用は、不可逆的なコンフォメーション変化およびタンパク質の不可逆的な凝集およびその後のタンパク質活性の喪失の確率を顕著に減少する。

本発明は、単離または発現、精製、輸送および貯蔵を含むその産物の寿命の全体を通してのタンパク質の安定化に適用可能である。

分子サイズの観点から、本発明は、少なくとも二次元または三次元構造の少なくとも基本モチーフが形成されそうな少なくとも２０００の相対分子量を有するポリペプチドに適用可能である。本発明の適用を制限する相対分子量の上限は存在しない。

二次元構造の観点から、本発明はいずれの比率のアルファヘリックス、ベータシートおよびランダムコイルを含むタンパク質に適用可能である。

三次元構造の観点から、本発明は、球形タンパク質および繊維状タンパク質の両方に適用可能である。本発明は、三次元構造が非−共有相互作用によって唯一維持されるタンパク質、ならびに、三次元構造が非−共有相互作用および１またはそれを超えるジスルフィド結合の組合せによって維持されるタンパク質に適用可能である。

四次元構造の観点から、本発明は、モノマータンパク質ならびに２、３、４またはそれを超えるサブユニットからなるタンパク質に適用可能である。本は詰めいは、タンパク質コンジュゲートにも適用可能である。

非−タンパク質構造成分の観点から、本発明は、いずれの非−ペプチド成分も含まないタンパク質ならびに糖タンパク質、リポタンパク質、核タンパク質、金属タンパク質およびタンパク質が全質量の少なくとも１０％を表す複合体を含む他のタンパク質に適用可能である。それは、その機能のために補助因子を必要としないタンパク質ならびにその機能のために補酵素、置換基またはアクチベーターを必要とするタンパク質に適用可能である。

本発明は、水溶液に自由に溶解したタンパク質、または分散液または懸濁液として水系に存在するタンパク質、ならびに疎水性、イオン性またはリガンド交換相互作用によってワクチンアジュバントまたは細胞性の膜のような固形基体に結合したタンパク質に適用可能である。また、本発明は、水性ゲル形態で溶解したタンパク質、および乾燥または凍結乾燥によって水溶液から水が部分的または完全に除去された（しかし、自由水または結合水はいまだ存在する）固体状態のタンパク質に適用可能である。

タンパク質は天然または組換え、グリコシル化または非−グリコシル化、自己溶解性または非−自己溶解性のものとし得る。本発明は、特に以下の群のタンパク質に適用可能である。

タンパク質またはペプチドホルモンおよび成長因子
タンパク質またはペプチド御ホルモンおよび成長因子の機能は、特定の受容体に結合するそれらの能力に依存する。かかる結合事象は、タンパク質コンフォメーションに密接に関連している。したがって、タンパク質の三次元構造の保持、または少なくとも鍵ドメインの３−Ｄ構造の保持はその機能のために極めて重要である。構造および機能特徴の保持は、タンパク質治療薬の規則認可にも最高に重要である。治療タンパク質またはペプチドホルモンの例には以下のものが含まれる：
インスリン（糖尿病の治療）
グルカゴン（糖尿病の治療）
ヒト成長因子
ゴナドトロピン
ヒト甲状腺刺激ホルモン（甲状腺ガンの治療）
顆粒球コロニー刺激因子（化学療法の一部として使用する）

治療酵素
治療酵素の機能は、その分子構造およびコンフォメーションに直接的に依存する。不可逆的なコンフォメーション変化および不可逆的な凝集は、治療酵素の不活性化につながる。タンパク質の構造特徴の保持も、規則認可の必須の次に必要なものである。治療タンパク質またはペプチドホルモンの例には以下のものが含まれる：
ストレプトキナーゼ（虚血性発作の治療における血栓溶解剤）
アスパラギナーゼ
尿酸オキシダーゼ
パパイン（組織創傷清拭）

ワクチン
タンパク質ワクチンの免疫原活性は、特に立体構造エピトープに関連する（大きな程度で）鍵タンパク質抗原の構造一体性に依存する（抗体がポリペプチド鎖の離れた領域に結合することが必要な場合、天然のフォールディングによって一緒になる）。不可逆的なコンフォメーション変化および不可逆的な凝集は、ワクチンの不活性化につながる。同一の考察は、アルミナ粒子のような粒子、または各タンパク質分子の実質的な領域がいまだ溶媒水と完全に相互作用する他の（非−粒子）表面に吸着したタンパク質に適用される。これは、一部は実際的または論理的な制限によりまたは一部は費用面によりコールドチェーンの維持が非常に困難または不可能な第三世界におけるワクチン配布において特に重要である。本発明は、ポリペプチド鎖からなる鍵抗原を提供する、組換えタンパク質ワクチンならびに弱毒ウイルスまたは全細胞ワクチンに適用可能である。かかるワクチンの例には以下のものが含まれる：
Ｂ型肝炎ワクチン
マラリアワクチン
ヒトパピローマワクチン
髄膜炎Ａワクチン
髄膜炎Ｃワクチン
百日咳ワクチン
ポリオワクチン

治療抗体
治療抗体の機能は、標的抗原とのその特異的な相互作用に基づいている。よって、その機能を維持するためには、三次元構造の保持がその半減期の期間に必須である。固有の剛直性、免疫グロブリンのフォールドまたはドメインの安定構造に起因して一般的に常温では非常に安定であるが、貯蔵におけるその安定性をさらに増大することによって本発明からの恩恵を抗体は受け得る。例えば、ガン療法において使用し得る治療抗体の例には以下のものが含まれる：
抗−上皮細胞増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）モノクローナル抗体
抗−ＨＥＲ２モノクローナル抗体（乳癌療法）
抗体−ＣＤ５２モノクローナル抗体（慢性リンパ性白血病療法）
抗−ＣＤ２０モノクローナル抗体（攻撃的白血病療法）

インターフェロン
インターフェロンは、例えば多発性硬化症治療に使用される治療上重要なむしろ不安定なポリペプチドである。本発明の適用は、インターフェロンの貯蔵寿命および費用効果を増大し得る。インターフェロンβは主要な最新の例である。

他の治療タンパク質
以下のものは、特に水溶液中の、費用効果および改善された貯蔵寿命の観点から、本発明の適用から恩恵を受け得る他の治療タンパク質の例である。
エリスロポイエチン（赤血球産生を刺激する）
ダーベポイエチン（赤血球産生を刺激する）
血液凝固因子、主として第VIII因子および第IX因子（血友病の治療および制御）
免疫抑制剤（喘息、アレルギー性鼻炎または多発性硬化症のような種々の症状の治療）
ヒト・アルブミン
タンパク質Ｃ（抗血栓症剤）

診断および産業タンパク質
構造特徴の保持は、診断タンパク質、特に酵素および抗体の機能に非常に重要である。特に、それを通してアッセイを較正し、ＱＣに付す分析物のキット内参照標準は厳格に安定化されていなければならない。それらの一体性におけるいずれのずれも全体キットの精度における結果として生じたずれを生じるからである。したがって、その製品寿命を通した診断タンパク質の機能活性の安定性は、最高の重要性のものである。診断製品の製造は、実質的なプロセス律速を生じる費用のかかる凍結乾燥を排除するアプローチおよび処方を見出すことを熱望している。診断タンパク質の例には：
モノクローナル抗体
ポリクローナル抗体
抗体−酵素コンジュゲート
グルコースオキシダーゼ、ガラクトース・オキシダーゼ、コレステロールオキシダーゼのようなオキシダーゼ
ペルオキシダーゼ
アルカリホスファターゼ
グルタミン酸デヒドロゲナーゼ、グルコースデヒドロゲナーゼのようなデヒドロゲナーゼ
インベルターゼのようなイソメラーゼ
トリプシンまたはキモトリプシンのようなヒドロラーゼ
ホルモン、成長因子、微生物タンパク質、代謝タンパク質、可溶性形態の構造タンパク質ほかのような、キット形態で供給される統合アッセイ参照標準が含まれる。

産業タンパク質の例には：
アミラーゼ
プロテアーゼ
リパーゼが含まれる。

治療タンパク質、ワクチンおよび診断の国際参照標準
治療または診断タンパク質の参照標準は、治療および診断方法の標準化について極めて重要である。参照標準の安定性は、基本的な重要のものである。したがって、広範囲のタンパク質ベースの参照標準が、本発明の理想的標的である。

本発明に用いるタンパク質は、実質的にそのネイティブの状態で維持し得る。本明細書の目的のため、「ネイティブタンパク質」という用語を用いて、保持された三次元構造を有するタンパク質および一定程度のほつれまたは変性を受けたタンパク質との相異を説明する。ネイティブタンパク質は、物理的修飾よりも、幾つかの化学的修飾、例えばデアミデーションを取り込むことができる。

本発明の安定化技術は、アルミナのような固体表面に吸着したタンパク質を安定化することに適用し得る。ある場合においては、表面にタンパク質を吸着させる前に、固体表面（アルミナ粒子のような）を安定化処方でインキュベートすることが有利な場合もある。これは、タンパク質のより大きな安定性を生じ得る。

ワクチンとしての使用が意図され、よってアルミナのようなアドソルベント／アジュバントと結合して用いることができる、Ｂ型肝炎のような、例えばリンタンパク質のような免疫原性タンパク質の特定の場合については、特にリガンド交換が生じ得る場合においては、リン酸が好ましい安定化剤である。リン酸は、例えば処方がリン酸アニオン（＞２０ｍＭ）を含む場合、さらなる望ましい特性を提供し得るようである。リン酸の重要性の背後にある理由は、全体的に明らかにされていないが、リン酸アニオンはアルミナに対するワクチンの適当な結合に役割を果たしていると考えられている（例えば、Iyer Sら：Vaccine 22 (2004) 1475-1479を参照されたい）。実施例８で報告するように、抗原活性の＞９５％の回収は、リン酸アニオン存在下の新規な安定化技術に基づく処方中での５５℃にて７週間の保存に対するＢ型肝炎ワクチンで観察された。さらなる実験を行って、残ったワクチンがアルミナアジュバントに強く吸着し、ワクチン／アルミナ粒子の沈降速度に全く変化を生じないことを確かめた。リン酸の使用は医薬処方中のｐＨ緩衝液として非常に一般的であるが、処方のｐＨは５.２、すなわちリン酸の緩衝能力が否定的である条件であるため、本発明におけるその適用は普通でない。

理論に束縛されることを望むものではないが、本発明は、少なくとも部分的に、エネルギー的に好ましい酸−塩基方向でのプロトンの各々の交換は、アミノ酸側鎖とプロトンが交換する分子との間のｐＫａの差に比例するエネルギーの放出を伴う。かかる移動のエネルギーは、エンタルピーの形態の周囲環境に散らされ（熱放出）、エントロピーで変化する。これは、関与するアミノ酸の付近の構造的およびエネルギー的特徴の一時的変化に通じ得る。かかる事象が化学結合の破損を生じ得ることは排除し得ないが、かかる効果の可能性は疑いなく非常に小さい。しかしながら、かかる事象が問題のアミノ酸付近のタンパク質コンフォメーションに重大な（一時的および局所的であるが）変化を生じ得ることはかなり起こりそうである。タンパク質分子の種々の部分において同時に起こる多くのかかる事象の場合においては、これは、ネイティブの三次元構造の損失（「アンホールディング」）およびタンパク質生物機能（例えば、酵素活性）のつづく不可逆的損失に通じ得るであろう。

タンパク質分子を安定化するためには、タンパク質表面のプロトン交換の頻度およびエネルギーを最小限化することが必要である。プロトン交換の以下の３つのエネルギーが関係する態様が本態様において考えられる：
（１）タンパク質安定性は、その表面のプロトン交換の頻度を最小限化することによって高めることができる。
（２）すべてのプロトン付加可能なアミノ酸側鎖の自由エネルギーは脱プロトン化形態におけるよりもプロトン化形態でより低いため、タンパク質安定性は、プロトン付加した形態で可能な限り側鎖の比率を高く維持することによって高めることができる。
（３）タンパク質の表面のアミノ酸側鎖の酸−塩基動的平衡は周囲の分子とのプロトンとの連続的な交換によって維持されるため、および、かかるプロトン交換の間に放出されるエネルギーの量は関与する種の間のｐＫａの差に依存するため、「エネルギー」プロトン交換（特にＨ_３Ｏ^＋およびＯＨ⁻を含むもの）の代わりに温和なもの（より極めて小さいｐＫａ値を有する化学種を含む）を用いることがタンパク質安定性に有利である。これは、Ｈ_３Ｏ^＋およびＯＨ⁻の濃度を最小限化し、より極めて小さいｐＫａ値を有するプロトンを交換することができる種を取り入れることによって達成し得る。

プロトン交換の頻度
化合物のｐＫａはその酸−塩基挙動の指標である。値は温度で変化し、アミノ酸側鎖のｐＫａ値は必ずしも遊離アミノ酸のものと同じであるとは限らない（差が大き過ぎてはならないが）ことに注意しなければならない。タンパク質アミノ酸の側鎖のｐＫａ値は、所定のｐＨでのプロトン化および脱プロトン化形態の相対比を決定する。これを図１に示す。

アミノ酸側鎖および周囲の分子との間のプロトン交換の頻度（または比）は、ｐＨ＝アミノ酸のｐＫａの場合に最大になる。このｐＨでは、等量の側鎖のプロトン化および脱プロトン化形態が存在するように、平衡が維持されている。これは、プロトン付加／脱プロトン付加循環の最大比を生じる。ｐＨがアミノ酸のｐＫａから離れる場合、プロトン化／脱プロトン化循環の比はプロトン形態（高ｐＨでの）または脱プロトン形態（低ｐＨでの）のいずれかの低い比によって減少する。例えば、グルタミン酸の場合は最大プロトン交換頻度が４.１５付近のｐＨで起こり、ヒスチジンの場合はｐＨ６付近で起こる、ほかというようにである。７アミノ酸のプロトン交換の相対比をｐＨの関数として図２に示す。相対比は、アミノ酸側鎖のプロトン化（ＨＡ）および脱プロトン化（Ａ）形態の濃度の積として表され、アミノ酸側鎖の合計の非−寸法濃度を任意に１と選択する。プロトン交換の最大比に対応するｙ−軸上の値は、したがって０.５×０.５＝０.２５である。

タンパク質安定性はプロトン交換の全体頻度、すなわちタンパク質表面の全てのプロトン交換の合計を最小限化することによって高めることができる。プロトン交換頻度の全体頻度の例を、プロテアーゼ酵素パパインについて図３に示す。これは、各アミノ酸の相対寄与をパパイン配列中の相対存在量によって決定しつつ個々のアミノ酸のプロトン交換頻度を合算することによって計算した。パパイン安定性のｐＨ至適値は、実験的に５.８ないし６.２であることが判明した。これは、プロトン交換比の最小値にほぼ相当する（図３）。

しかしながら、プロトン交換の相対頻度は、タンパク質安定性／不安定性に対する寄与因子のうちのわずか１であり、他の寄与因子の関係で考えなければならない（以下を参照されたい）。これは、プロトン交換の頻度はｐＨ至適値の良好な指標であるが、最も高い安定性は必ずしもプロトン交換頻度特性の最小値で正確に達成されるものではないことを意味している。このことを、以下の幾つかの実施例において立証する。

側鎖の自由（ギブズ）エネルギーを最小限化すること
全てのプロトン付加可能なアミノ酸側鎖のギブズ自由エネルギーは、脱プロトン化形態でよりもプロトン化形態においてより低い。これは、自由電子対（その上にプロトンが結合する）がプロトン存在下においてそれが不存在の場合よりもエネルギーにおいてより低いためである。したがって、アミノ酸側鎖へのプロトンの結合は、全体タンパク質の全体自由エネルギーを減少する。したがって、タンパク質安定性は、アミノ酸表面上のアミノ酸のプロトン付加を最大化することによって高めることができる。

ｐＨの関数としての２のモデルタンパク質（グルコースオキシダーゼおよびパパイン）の表面における全体プロトン付加のパーセンテージを図４に示す。これは、２のタンパク質の配列中のすべてのプロトン付加可能なアミノ酸のプロトン化形態の比率を合算することによって計算した。グルコースオキシダーゼは低い等電点（ｐｌ＝ほぼ４.４）のタンパク質の例であるが、パパインは非常に高い等電点（ｐｌ＝ほぼ８.７）を有する酵素である。これは、図４に示すプロトン付加特性に反映されている。中性ｐＨ（〜７）の側鎖プロトン付加のパーセンテージは、グルコースオキシダーゼの場合よりもパパインの場合においてかなり高い。したがって、パパインの場合におけるよりもグルコースオキシダーゼの場合におけるより低いｐＨに向けて至適ｐＨを向けるより大きな傾向が存在する。

酵素安定性についての実際のｐＨ至適値は、常に、プロトン交換頻度に基づいて計算した理論ｐＨ至適値から低ｐＨに向けて少なくともわずかに（またはよりかなり）離れることが実験的に見出された。プロトン付加の程度は、明らかに、プロトン交換頻度に基づいて計算した理論ｐＨ至適値から至適値がどのくらい低ｐＨに向かってシフトするかを決定する重要なパラメータである。プロトン付加の程度はタンパク質のｐｌに密接に関係するため、この効果は以下のように要約することができる：高ｐｌを有するタンパク質はその実際のｐＨ至適値を低ｐＨにシフトする小さな傾向のみ有するが、低ｐｌを有するタンパク質はこの方向でｐＨ至適値をシフトするより大きな傾向を有する。比較は、非常に異なるｐｌ値を有する２のタンパク質の実際の例、すなわちグルコースオキシダーゼおよび西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）で最良に示される。図５に示すように、全体プロトン交換頻度に基づいて計算した理論ｐＨ至適値は、グルコースオキシダーゼの場合ではほぼ７.５であり、ＨＲＰの場合では７.９である。これらの両方のタンパク質の実際のｐＨ至適値は、理論値よりもより小さい。このことは、タンパク質が、タンパク質表面のより大きなプロトン付加を達成するために、最小限化されたプロトン交換頻度によって達成される安定性の小さい部分を「犠牲にしている」ことを意味する。（図５で示されたごとく）酵素が犠牲にする部分は、タンパク質のｐｌに反比例することが繰り返して示されている。したがって、そのｐＨ至適値をより低く向けるグルコースオキシダーゼの傾向は、ＨＲＰのものよりもはるかに大きい（図５）。

プロトン交換の間に放出されるエネルギーを最小限化すること
プロトン交換の間に放出されるエネルギーの量は、関与する種の間のｐＫａの差に依存する。したがって、極端なｐＫａの化合物（特に、Ｈ_３Ｏ^＋およびＯＨ⁻を含むもの）との連続した相互作用の衝撃を最小限化すること、および、これらが極端に小さいｐＫａ値を有する化合物との相互作用によって置き換わることを確認することは、タンパク質の安定性に有利である。

水溶液中の「極端なｐＫａ値」を有する優性な種はＨ_３Ｏ^＋およびＯＨ⁻である。より極端なものは種のｐＫａ値であり、この種が「高エネルギー」形態（すなわち、強酸の場合のプロトン化した形態または強塩基の場合の脱プロトン化した形態）で生じることはあまりなさそうである。タンパク質に対して種がより有害であればあるほど、それが水溶液中で生じることはあまりなさそうであり、これは、タンパク質を保護する有用なフィードバック機構である。かかるフィードバック機構はＨ_３Ｏ^＋およびＯＨ⁻にもあてはまる。しかしながら、これらの２の種は水に由来し（プロトン化または脱プロトン化によって）、水溶液中のその濃度は極めて高く（〜５５.５Ｍ）、代わってこれらの「高エネルギー」種の相対的な豊富さを増加する。したがって、Ｈ_３Ｏ^＋およびＯＨ⁻の極端なｐＫａが与えられれば、これらの種の濃度は常に非常に高いであろう（例えば、５５.５ｍＭ濃度で存在する添加物由来の匹敵するｐＫａの他の種の濃度よりも３桁高い）。

酵素処方と結合して比較的一般的に使用し得る極端なｐＫａ値を有する他の種が存在することは注意すべきである。かかる例のうちの１つは、ナトリウムカチオン（Ｎａ^＋）である。２５℃のＮａ^＋のｐＫａは１４.８（Handbook of Chemistry and Physics, 1998）である。これは、Ｎａ^＋とタンパク質分子との間のプロトン交換を極めて「活力のある」とすることができることを意味する。前記したフィードバック保護機構により、Ｎａ^＋の「高エネルギー形態」の濃度は、等しく「活力のある」ＯＨ⁻の（すなわち、ナトリウムカチオンと非常に類似するｐＫａを有する種）ものよりも所定のｐＨでかなり低いであろう。それにもかかわらず、モデルタンパク質に対するＮａ^＋の脱安定化効果が、多くの実験においていまだ観察された（特に、より高濃度のＮａ^＋塩を用いた場合）。それに対して、アンモニウムカチオン（ＮＨ_４ ^＋）、かなり低い極端なｐＫａ（ほぼ９）を有する種、については脱保護化効果は全く観察されなかった。

アミノ酸側鎖とＨ_３Ｏ^＋またはＯＨ⁻のいずれかとの間の破壊的な「活力のある」プロトン交換を完全に回避することはできないが、その熱力学的確率をかなり低下させることは可能であり、したがって酵素をより安定にすることが可能である。これは、タンパク質のアミノ酸側鎖のプロトン化の状態およびＨ_３Ｏ^＋およびＯＨ⁻の濃度に起因して「活力のある」プロトン交換の破壊的な能力が最小限となるかかる値にｐＨを調節し；ついで、タンパク質分子の表面上のアミノ酸側鎖とのプロトンの「温和な」交換を行うことができる化合物または理想的には化合物の組合せを入れることによって達成することができる。これらの「温和な」交換は、Ｈ_３Ｏ^＋またはＯＨ⁻によって引き起こされる破壊的な「活力のある」交換と競合し、それらのインパクトを減少するであろう。

所定のｐＨの２５℃の水溶液中のＨ_３Ｏ^＋およびＯＨ⁻の濃度を図６に示す。タンパク質安定性の至適ｐＨは７でなければならないとする幾つかの論理が存在するようである。これはＨ_３Ｏ^＋およびＯＨ⁻の合計濃度がその最小（２００ｎＭ）であるｐＨだからである。比較するために、ｐＨ６または８のＨ_３Ｏ^＋およびＯＨ⁻の合計濃度は１.１μＭであり、ｐＨ５または９のそれは１０.０１μＭであるなど。それにもかかわらず、これは、Ｈ_３Ｏ^＋およびＯＨ⁻の濃度が破壊的なプロトン交換の確率を決定する唯一のパラメータである場合のみであろう。確率は、前記に論じたように、所定のｐＨにおけるタンパク質のプロトン化状態にも依存する。さらに、それは、タンパク質の全体アミノ酸組成に依存し、それはタンパク質がＨ_３Ｏ^＋攻撃またはＯＨ⁻攻撃に全体としてより感受性であるかを決定する。したがって、ｐＨ最適値は７から全く離れたものとし得る。

アミノ酸側鎖およびＨ_３Ｏ^＋またはＯＨ⁻の間のプロトン交換のエネルギーインパクトを表１に示す。インパクトは、衝撃種の間のｐＫａの差として表される（ｐＫａの差は衝撃の間に放出されるエネルギーに比例する）

より酸性のアミノ酸（アスパラギン酸、グルタミン酸およびヒスチジン）の場合にはそれはより多くのエネルギー放出を生じるＯＨ⁻との相互作用であるが、よりアルカリ性のアミノ酸の場合には、それはより脱安定化するＨ_３Ｏ^＋との相互作用である。

低いプロトン化形態ではより多くのアミノ酸側鎖をタンパク質が維持する傾向があるため、３つの最もアルカリ性の側鎖（チロシン、リシンおよびアルギン−すべてｐＫａ＞１０を有する）は最適条件下では遊離に完全にプロトン化し得、したがってプロトン交換におけるそれらの結合は最小であると予想することができる。この予想は実験結果と一致する：試験したモデルタンパク質の至適ｐＨは４.８−８.０の範囲であった。ｐＨ８.０でさえ、チロシン、リシンおよびアルギニンはほぼ完全にプロトン化している。したがって、タンパク質のＨ_３Ｏ^＋またはＯＨ⁻に対する感受性を決定し、したがって、タンパク質安定性の最適条件を決定するのは、システイン、ヒスチジン、グルタミン酸およびアスパラギン酸の相対的な豊富さである。

低いｐＨを有するタンパク質がその至適ｐＨをより低い値に向けて押しやる傾向があるであろう。これは、低いｐｌのタンパク質が、ＯＨ−攻撃に特に感受性であるより高い比率の最も酸性のアミノ酸（アスパラギン酸およびグルタミン酸）を含むからである（表１を参照されたい）。

ｐＨ調節はタンパク質安定性を改善するために採り得る唯一の尺度ではない。安定性は、さらに、タンパク質のアミノ酸側鎖と「温和な」プロトン交換で結合し得、したがって、Ｈ３Ｏ＋またはＯＨ−との破壊的な「活力のある」プロトン交換の確率をさらに低下する化合物を添加することによっても改善し得る。

２のアミノ酸塩基官能基を取り込んだ場合に最良の結果が達成し得ることが実験的に見出された。好ましくは、第１の官能基は至適ｐＨよりも少なくとも１単位高いｐＫａを有し、至適ｐＨではプラスに荷電している。このことは、プロトンを受容する間に基の荷電が中性から陽性にスイッチすることを意味している（例えば、アミノ基、プリン、ＴＲＩＳほか）。第２の官能基は好ましくは至適ｐＨよりも少なくとも１単位低いｐＫａを有し、至適ｐＨでは陰性に荷電している。このことは、プロトンを受容する間に基の荷電が陰性から中性にスイッチすることを意味している（例えば、カルボン酸基）。

至適ｐＨを維持するために添加剤と一緒に少量の緩衝液を使用し得る。添加剤の配合は、タンパク質安定性のための至適ｐＨにわずかに影響し得る（添加剤の性質および量に依存してほぼ０.５ｐＨ単位以内）。

また、第１の基（すなわち、至適ｐＨにおいて陽性に荷電している）の相対的な過剰がタンパク質安定性に有利なことも見出された。このことは、アスパラギン酸およびグルタミン酸の陰性に荷電した側鎖とイオン結合を形成することによって推論的に説明することができる（これらの側鎖は、実際にはすべての酵素の場合に至適ｐＨでおおいに脱プロトン化しているであろう−これらの側鎖がおおいにプロトン化するようになるためには至適ｐＨははるかに４未満とならなければならないであろう）。かかるイオン結合は、これらの側鎖の自由電子対のギブスエネルギーを低下し得るであろう−プロトンの結合がそうであるように。

公知のタンパク質のアミノ酸配列およびその等電点に基づく至適ｐＨの良好な予想を許容する論理式が導かれた。予想は全アミノ酸配列を用いて達成し得るが、タンパク質の表面の近づき得るアミノ酸側鎖のみを考慮することを推薦する。全アミノ酸配列およびタンパク質構造中の個々のアミノ酸の近づき易さの両方を、Protein Data Bank情報データベース（http:www.rcsb.org/pdb）を用いて見出し得る。アミノ酸の近づき易さの概算には、DEEP VIEW protein softoware（http://www.expasy.org/spdby）をダウンロードすることが必要である。

論理式は以下の３つの工程からなる
工程１：（これは、ＭＳ−Ｅｘｃｅｌで簡単に行うことができる）
プロトン交換頻度係数（Ｐ）を計算し、ｐＨに対してプロットし：

式中、

Ｍはタンパク質単位の相対分子量であり
Ｎはタンパク質単位中の所定のアミノ酸側鎖の数であり（１＝アスパラギン酸、２＋グルタミン酸、３＝ヒスチジンほか）
［ＨＡ］は所定のｐＨにおけるアミノ酸のプロトン化形態の比率であって、
０＜［ＨＡ］＜１であり、
［Ａ］は所定のｐＨにおけるアミノ酸の脱プロトン化形態の比率であって、
０＜［Ａ］＜１である。

ｐＨに対してプロットした場合、プロトン交換頻度特性を得ることができる（パパインについて図３にしめしたもののような）。

工程２：つぎのようにしてｐＨシフトの大きさ（本明細書中では「Ｘ」と示す）を計算する：
Ｘ＝Ａ×ｐＩ＋Ｂ
式中、全アミノ酸組成を用いる場合は、Ａ＝−１.１９２であって、Ｂ＝１０.５８７であり、タンパク質表面で近づき易いアミノ酸のみを用いる場合は、Ａ＝―０.９３１であって、Ｂ＝８.４３０である。

ｐＨ間隔４−９中に工程１で得た係数の最小値を見出す。計算したｐＨシフト値を最小値に加えて値Ｙを得る：
Ｙ＝Ｐ最小値＋Ｘ

Ｐ−対−ｐＨのグラフにおける値Ｙに対応するｐＨを読む。Ｐ−対−ｐＨのグラフには値Ｙに対応する２つのｐＨ値が常に存在するであろう（１つはＰ最小値より下方に存在し、１つはＰ最小値の上方に存在する）。値はＰ最小値の下方のものを読むことが重要である（すなわち、より低いｐＨ値に向けて）。これは、酵素の安定性についての概算至適ｐＨである。パラメータＸ、ＹおよびＰ最小値の間の関係を図７に示す。

ＡおよびＢの値は、４のモデル酵素（グルコースオキシダーゼ、カタラーゼ、ラクトペルオキシダーゼおよびパパイン）を用いた一連の実験の結果に基づいて計算した。つづいてこれらの値を用いて、２のさらなる酵素の至適ｐＨを予想し（西洋ワサビペルオキシダーゼおよびグルタミン酸デヒドロゲナーゼ）、実験は予想が非常に良好な正確さを有することを示した。

工程３：
至適ｐＨを選択したら、１またはそれを超える以下の官能基を含む１またはそれを超える添加剤を選択し得る。

官能基１：
第１の官能基はタンパク質安定性のための至適ｐＨ（工程１および２で概算した）よりも高いｐＫａを有し、至適ｐＨでは陽性に荷電している。このことは、プロトンを受容する間に基の荷電が中性から陽性にスイッチすることを意味している。

官能基のｐＫａはタンパク質安定性のための至適ｐＨよりも高くなければならない。好ましくは、それは至適ｐＨより上方の５ｐＨ単位内とすべきである。より好ましくは、それは至適ｐＨより上方の０.５−４ｐＨ単位内とすべきである。最も好ましくは、それは酵素の至適ｐＨの上方の１−３ｐＨ単位内とすべきである。

官能基２：
第２の官能基は、タンパク質安定性のための至適ｐＨ（工程１および２で概算した）よりも少なくとも１単位低いｐＫａを有し、至適ｐＨでは陰性に荷電している。このことは、プロトンを受容する間に基の荷電が陰性から中性にスイッチすることを意味している（例えば、カルボン酸基）。

官能基のｐＫａは、タンパク質安定性のための至適ｐＨよりも低くなければならない。好ましくは、それは、至適ｐＨより下方の５ｐＨ単位内とすべきである。より好ましくは、それは、至適ｐＨより上方の０.５−４ｐＨ単位とすべきである。最も好ましくは、それは、酵素の至適ｐＨより下方の１−３ｐＨ単位内とすべきである。

処方は、第１の官能基（すなわち、陽性に荷電したもの）のみを含むことができる。好ましくは、処方は、第１および第２の官能基の両方を含む。

２の官能基は１の化合物内に含めることができる（例えば、アミノ酸）。好ましくは、２の官能基は１を超える添加剤に位置する（例えば、１の添加剤が第１の陰性に荷電した基を含み、他の添加剤が第２の陽性に荷電した基を含む）。処方に添加する２の型の官能基の各々の数に制限はない。

ある場合においては、陰性に荷電した基の量に対して過剰な陽性に荷電した基を入れることが有利となり得る。

添加剤の緩衝能は、そのｐＫａが至適ｐＨから約１単位のみである場合に十分なものとすることができる。ｐＫａがさらに離れる場合は、その緩衝能は低下し得る。この場合に、至適ｐＨに近いｐＫａを有する低濃度の緩衝液を、求めるｐＨを維持するために使用することができる。

安定化添加剤として有利に入れることができる２の官能基の各々の基のクラスの幾つかの例を表２に示す。

ｐＫａ値と共に、可能な添加成分の具体的な例のリストを表３に掲載する。

上記に掲載した材料は、説明目的のみで提供するものである。勿論、当業者であれば、特定のタンパク質に特異的な態様を考慮しなければならないことを理解するであろう。例えば、選択した添加剤がタンパク質活性を阻害しないことを確認することは重要である。また、タンパク質の熱安定性を改善するために用いる化合物がそれ自体用いる条件下で安定であることを確認することも重要である。

本発明は、タンパク質安定性の他のよく確立された
アプローチと結合することができる。例えば、プロテアーゼ・インヒビターを処方に入れて、試料中に存在するプロテアーゼ活性によってタンパク質が徐々に消化されないことを確認することができる。

用いることができるもう１の添加剤は、少なくとも０.５％、典型的には５％（ｗ／ｗ）までの濃度の多価アルコールである。かかる化合物の例は、イノシトール、ラクチトール、マンニトール、キシリトールおよびトレハロースのような糖類である。

本発明の適用により安定化されるタンパク質処方のイオン強度は、処方の意図する使用の要件に合致するように調節し得る（例えば、治療用途の等張処方）。重要なことには、原則として、室温におけるタンパク質の安定性が高温でのものを反映し、活性低下の速度が高温（例えば６０℃）でのものと比較して室温で数桁遅くなることを実験は繰り返して示した。

実施例
以下の実施例は本発明を説明する。
材料
硫酸アンモニウム（Fisher、コードA/6480／60）
ＢＡＮＡ−Ｎα−ベンゾイル−ＤＬ−アルギニン−β−ナフチルアミド塩酸（Sigma、コードB4750）
カタラーゼ（ウシ肝臓由来、Sigma C9322、2380U／mg固体）
Ｌ−システイン（Fluka、コード449808／1）
クエン酸（Fisher、コードC／6200／53）
脱イオン水（伝導率＜10μScm⁻¹；分析試薬等級、FisherまたはSanyo Fostreem MultiPureのいずれか）
リン酸水素二ナトリウム（Fisher、コードS／4520／53）
ＤＭＡＣ−４−（ジメチルアミノ）シンナムアルデヒド（Sigma、コードD4506）
ＤＭＳＯ−ジメチルスルフォキシド（Sigma-Aldrich、コード154938-500）
ＥＤＴＡ二ナトリウム塩（Fisher、コード BPE120-500）
グルコース（Fisher、コードG050061）
グルコースオキシダーゼ（Biocatalysts G575P〜150U／mg固体）
ウシ肝臓由来のグルタミン酸デヒドロゲナーゼ（BioChemika、コード49392）
西洋ワサビペルオキシダーゼ（Fisher、コードJ／4310／17）
過酸化水素（Sigma H1009）
D,L−乳酸（Fluka、コード1077141）
ラクトペルオキシダーゼ（ウシ乳由来、DMV International：ＡＢＴＳ法、ｐＨ５.０により1,050単位mg^-1）
リシン（Sigma、コードL5501）
メタノール（Fisher、コードM／3950／17）
ＮＡＤＨ−β−ニコチンアミドアデニン二ヌクレオチド（還元型）二ナトリウム塩（Sigma、N−8129）
２−オキソグルタル酸二ナトリウム塩二水和物（Fluka、コード75892）
パパイン（700TU ex Biocatalysts）
ＰＢＳ−リン酸緩衝化塩類溶液（Sigma D1408）
ヨウ化カリウム（Fisher、コード5880／53）
水酸化ナトリウム（Fisher、コードJ／7800／15）
デンプン（Acros Organics、コード177132500）
ＴＭＢ−テトラメチルベンジジン（Sigma T-2885）
ＴＲＩＳベース−トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（Fisher Bioreagents、コードBPE152-1）

別段指摘しない限り、本実験で用いる所定の濃度およびｐＨ（Ｘ ｍＭ、ｐＨ Ｙ）のリン酸緩衝液は、リン酸水素二ナトリウム（ＸｍＭ）とリン酸二水素ナトリウム（ＸｍＭ）とを混合して必要なｐＨ Ｙを達成することによって調製した。

別段指摘しない限り、本実験で用いる所定の濃度およびｐＨ（Ｘ ｍＭ、ｐＨ Ｙ）のクエン酸／リン酸緩衝液は、リン酸水素二ナトリウム（ＸｍＭ）とクエン酸（ＸｍＭ）とを混合して必要なｐＨ Ｙを達成することによって調製した。

全体実験計画
各実施例において、所定の酵素の水溶液は、選択した添加剤を用いてエッペンドルフチューブ中で調製した。別段指摘しない限り、用いた酵素の濃度は以下のとおりであった：
グルコースオキシダーゼ： ３５０μｇ／ｍＬ
カタラーゼ： １００μｇ／ｍＬ
ラクトペルオキシダーゼ： １００μｇ／ｍＬ
西洋ワサビペルオキシダーゼ １０μｇ／ｍＬ
グルタミン酸デヒドロゲナーゼ １５０μｇ／ｍＬ
パパイン １００μｇ／ｍＬ

各溶液を酵素活性についてアッセイした。その場合、エッペンドルフチューブを水浴（各実施例に指定するように５５−６５℃の高温に設定した）中に所定の時間浸漬した。ついで、溶液を残存している酵素活性についてアッセイした。常温の作業よりもより多くを要求し、タンパク質安定性の指標をより迅速に提供するために常温を超える温度を用いた。

実施例は特定の酵素に対する情報、（前記した論理式を用いて）表面アミノ酸に基づく安定性の最適条件を選択する手続、および高温での酵素の安定性を示す実施例を含み得る。すべてのアミノ酸配列は、公共に入手可能なProtein Data Bank（http://www.rcsb.org/pdb）から得た。

実施例１−グルコースオキシダーゼ（ペニシリウム種由来）
（ペニシリウム種由来の）グルコースオキシダーゼは２の同じサブユニット（各々のＭｒはほぼ８０,０００）からなる。グルコースオキシダーゼの等電点はほぼ４.３である。各サブユニット中の酸−塩基アミノ酸の豊富さを表４に示す。

*最初の数字はジスルフィド結合で結合していないシステインの数を示している。括弧内の数字はサブユニット中のシステインの合計数を示している。

グルコースオキシダーゼのプロトン交換頻度特性を図８に示す。ｐＨ最適化論理式は、グルコースオキシダーゼについて以下の結果を与えている：
Ｐ最小値＝０.１７（ｐＨ７.７において）
Ｘ＝４.３３
Ｙ＝４.５０
概算至適ｐＨ＝５.０

新鮮および高温でのインキュベート後の両方のグルコースオキシダーゼ溶液を、グルコースオキシダーゼ活性についてアッセイした。これは、以下の手順に従って行った：
５０μＬの溶液を５０ｍＬの脱イオン水に加えた。ついで、以下の試薬を加えた：
・試薬混合物１０ｍＬ（５.５部の０.１Ｍリン酸二水素ナトリウム、ｐＨ６＋４部の２％ ｗ／ｗデンプン＋０.５部の１ｍｇ／ｍＬラクトペルオキシダーゼ酵素）；
・１００ｍＭヨウ化カリウム５ｍＬおよび
・２０％ｗ／ｗグルコース溶液５ｍＬ

これらは一緒に迅速に混合した。時間＝０はグルコースの添加からカウントした。５分後、５Ｍ希塩酸１ｍＬを添加して反応を終結した。ついで、Unicam UV−可視光分光光度計（Helios gamma型）を用いて６３０ｎｍで吸光度を読んだ。色強度が大きすぎて正確に読めない場合は、試料を規定体積の脱イオン水で希釈して色をスケール上に戻した。結果は、新鮮な試料（すなわち、高温でインキュベートする前）で測定した吸光度に参照してパーセント回復として表した。

実施例１．１：有利な添加剤の不存在下での計算至適ｐＨの外側のグルコースオキシダーゼのインキュベーションに対する少ない活性回復
６０℃のグルコースオキシダーゼの安定性に対する５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＫａ＝７.２）の効果を６.０から８.０のｐＨ範囲で調べた。リン酸緩衝液は、リン酸水素二ナトリウム（５０ｍＭ）およびリン酸二水素ナトリウム（５０ｍＭ）を混合して求めるｐＨを達成することによって調製した。ｐＨ７.０、７.５または８.０のリン酸の存在下、６０℃にて１５分間のグルコースオキシダーゼのインキュベーション後に測定可能な活性は存在しなかった。ｐＨ６.５および６.０での１５分では幾分かの活性が測定可能であったが、これは６０分でゼロに落ちた。グルコースオキシダーゼの良好な回復は、脱イオン水で観察された。それにもかかわらず、この場合でさえ、活性は１８０分後にゼロまで落ちた。ＤＩ水中のグルコースオキシダーゼ溶液のｐＨはほぼ６であった。これは、酵素自体の緩衝能の結果であり、酵素調製物中の不純物の結果である。ｐＨが計算至適ｐＨの外側であり、処方が有利な添加剤を含んでいなかったため、活性の回復は少なかった。

実施例１．２：有利な添加剤の存在下での計算至適ｐＨの外側のグルコースオキシダーゼのインキュベーションに対する少ない活性回復
乳酸存在下の５０ｍＭ ＴＲＩＳ緩衝液（ｐＫａ＝８.３）の６０℃のグルコースオキシダーゼの安定性に対する効果を、７.５ないし９.０の範囲のｐＨで調べた。Ｔｒｉｓ緩衝液は、Ｔｒｉｓ塩基（５０ｍＭ）および乳酸（５０ｍＭ）を混合して求めるｐＨを達成することによって調製した。ｐＨ７.０、７.５、８.０、８.５または９.０のＴＲＩＳ／乳酸の存在下、６０℃にて１５分間のグルコースオキシダーゼのインキュベーション後には測定可能な活性は存在しなかった。有利な添加剤が存在するにもかかわらず、活性の回復は少なかった。これは、ｐＨが計算至適ｐＨから遠く離れていたためである。

実施例１．３：計算至適ｐＨ付近であるが、有利な添加剤の不存在下でのグルコースオキシダーゼのインキュベーションに対する良好な活性回復
６０℃のグルコースオキシダーゼの安定性に対する５０ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＫａ１＝３.２、ｐＫａ２＝４.８、ｐＫａ３＝６.４）の効果を４.４ないし５.４の範囲のｐＨで調べた。クエン酸緩衝液は、クエン酸（５０ｍＭ）と水酸化ナトリウム（５Ｍ）とを混合して求めるｐＨを達成することによって調製した。酵素活性の低下は、ｐＨ４.８で最も遅かった。元の活性の１５％を超える活性が６０℃での２２時間インキュベーション後にもまだ測定可能であった。酵素活性の低下は、ｐＨ４.６および５.０の同一処方を用いてわずかだけ低かった。それにもかかわらず、至適から＞０.４単位離れて調節したｐＨの同一処方を用いると、酵素活性のかなり迅速な低下を生じた。

実施例１.４：有利な添加剤の存在下での計算至適ｐＨ付近でのグルコースオキシダーゼのインキュベーションの非常に良好な活性回復
至適ｐＨ付近に調節したグルコースオキシダーゼ処方にグルタミン酸およびヒスチジンを入れると、６０℃におけるインキュベーションに対するグルコースオキシダーゼ活性の最良の維持を生じた。バックグラウンド溶液は、グルタミン酸（５０ｍＭ）とヒスチジン（５０ｍＭ）とを混合し、塩酸（５Ｍ）または水酸化ナトリウムのいずれかを用いてｐＨを求める値に調節することによって調製した。元の活性の５０％を超える活性が６０℃での２２時間インキュベーション後にも測定可能であった。処方は、至適ｐＨより情報のｐＫａを有する陽性荷電プロトン化可能な基（すなわち、２のアミノ酸のアミノ基−ｐＫａ９付近）および至適ｐＨより下方のｐＫａを有する陰性荷電プロトン化可能な基（すなわち、２のアミノ酸のカルボキシル基−３−４.２のｐＫａ）を含んでいた。

実施例２ （ウシ肝臓由来の）カタラーゼ
（ウシ由来の）カタラーゼは４つの同じサブユニットからなる（各々のＭｒはほぼ６５,０００）。カタラーゼの等電点はほぼ５.７である。各サブユニットの酸−塩基アミノ酸の豊富さを表５に示す。

カタラーゼのプロトン交換頻度特性を図９に示す。ｐＨ最適化論理式は、カタラーゼについて以下の結果を与えた：
Ｐ最小値＝０.３７（ｐＨ８.０にて）
Ｘ＝３.１２
Ｙ＝３.４９
概算至適ｐＨ＝６.６

新鮮および高温でのインキュベーション後の両方のカタラーゼ溶液を、カタラーゼ活性についてアッセイした。これは、以下の手順に従って行った：
２ｍＬの過酸化水素（水中の３０ｍＭ）を１２５ｍＬのポリプロピレン・ポット中の１８ｍＬのＰＢＳに添加した。１００μＬのカタラーゼ試料を添加し、混合した。得られた混合物を３０分間正確に室温でインキュベートした。その間に、以下の試薬を、吸光度測定のためにプラスチックキュベット中で混合した。
・２.７３ｍＬのクエン酸／リン酸緩衝液（０.１Ｍ、ｐＨ５.０）
・１００μＬのＴＭＢ（３ｍｇ／ｍＬ、ＤＭＳＯ中に溶解）
・１００μＬのラクトペルオキシダーゼ

３０分のインキュベーション後に、７０μＬのカタラーゼ含有混合物をキュベットに添加し、吸光度をほぼ３０秒で読んだ。結果は、新鮮な試料で測定した吸光度に参照して、パーセント回復として表した（すなわち、高温でのインキュベーション前）。

実施例２．１：有利な添加剤の存在下および不存在下の両方での計算至適ｐＨの外側のカタラーゼのインキュベーションに対する少ない活性回復
５５℃のカタラーゼの安定性に対する５０ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＫａ１＝４.８、ｐＫａ２＝６.４）およびＴＲＩＳ緩衝液の効果を、カタラーゼについての概算至適ｐＨの外側で調べた。区rn酸緩衝液はクエン酸（５０ｍＭ）と水酸化ナトリウム（５Ｍ）とを混合して求めるｐＨを達成することによって調製した。ＴＲＩＳ緩衝液は、ＴＲＩＳ塩基（５０ｍＭ）と塩酸（５Ｍ）とを混合して求めるｐＨを達成することによって調製した。ｐＨ４.５のクエン酸緩衝液存在下またはｐＨ８.２のＴＲＩＳ緩衝液存在下の５５℃にて６０分のインキュベーション後に、実質的に測定可能な活性は存在しなかった。ｐＨが計算至適ｐＨの外側であったため（ＴＲＩＳの場合の「有利な添加剤」が存在するにもかかわらず）、活性の回復は少なかった。

６０℃のグルコースオキシダーゼの安定性に対する５０ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＫａ１＝４.８、ｐＫａ２＝６.４）の効果を５.２ないし７.２の範囲のｐＨで調べた。クエン酸緩衝液は、クエン酸（５０ｍＭ）と水酸化ナトリウム（５Ｍ）とを混合して求めるｐＨを達成することによって調製した。酵素活性の低下はｐＨ６.４で最も遅かった。元の活性の２０％を超える活性が５５℃の２２時間インキュベーション後に測定可能であった。酵素活性の低下は、ｐＨ６.８および６.０の同一処方を用いるとわずかだけより迅速であった。それにもかかわらず、至適ｐＨから離れて＞０.４単位で調節したｐＨを有する同一処方を用いると、酵素活性のかなり迅速な低下を生じた。

実施例２．３：有利な添加剤存在下の計算至適ｐＨ付近のカタラーゼのインキュベーションの非常に良好な活性回復
至適ｐＨ付近に調節したカタラーゼ処方にヒスチジン（５０ｍＭ）を入れると、５５℃のインキュベーションに対するグルコースオキシダーゼの最良の保存を生した。元の活性の４０％を超える活性が、５５℃での２２時間のインキュベーション後にもいまだ測定可能であった。処方は、至適ｐＨより上方のｐＫａを有する陽性に荷電したプロトン化可能な基（すなわち、ヒスチジンのアミノ基−９付近のｐＫａ）および至適ｐＨより下方のｐＫａを有する陰性に荷電したプロトン化可能な基（すなわち、ヒスチジンのカルボキシル基−３付近のｐＫａ）を含んでいた。ヒスチジンの側鎖（６付近のｐＫａ）は、簡便な緩衝能を提供して、必要な値にｐＨを維持した。

実施例３−パパイン
パパインは１のユニットからなる（各々ほぼ２１,０００のＭｒ）。パパインの等電点はほぼ８.７である。パパインはプロテアーゼであり、活性化した場合には自己消化することができる。自己消化を回避するためには、それを不活性化（酸化された）形態で維持しなければならない。本明細書に示すパパインを含むすべての実験は、パパインの不活性化（酸化された）形態を用いて行った。

各サブユニット中の酸−塩基アミノ酸の豊富さを表６に示す。

パパインのプロトン交換頻度特性を図１０に示す。ｐＨ最適化論理式は、パパインについて以下の結果を与えた：
Ｐ最小値＝０.５４（ｐＨ６.３にて）
Ｘ＝０.３３
Ｙ＝０.８７
概算至適ｐＨ＝５.８

新鮮および高温でのインキュベーション後の両方のパパイン溶液を、パパイン活性についてアッセイした。これは、以下の手順に従って行った：
１００μｌのパパイン試料を１００μＬのシステイン（２５ｍＭリン酸緩衝液、ｐＨ６.９中で調製した２４ｍｇ／ｍＬ）と混合した。１６０μＬのＥＤＴＡ（２５０ｍＭリン酸緩衝液、ｐＨ６.０中で調製した２.５ｍＭ）を添加し、得られた混合物を６０℃にて１０分間インキュベートした。１６０μＬのＢＡＮＡ（２０％ＤＭＳＯ／８０％水中で調製した５ｍｇ／ｍＬ）を添加し、６０℃にてさらに１０分間インキュベートした。２８０μｌのＨＣｌ／メタノール混合物（１ｍＬの５Ｍ ＨＣｌおよび９ｍＬのメタノールを混合することによって調製した）を添加することによって反応を終結した。４００μＬのＤＭＡＣを添加し、最終混合物を室温にて２５分間放置した。ついで、混合物の吸光度を５４０ｎｍで測定した。色強度が大きすぎて正確な読みが不可能である場合は、試料を規定量の８０％（ｖ／ｖ）メタノール（４体積部のメタノールと１体積部の脱イオン水とを混合することによって調製した）で希釈して色をスケール上に戻した。結果は、新鮮な試料（すなわち、高温でインキュベートする前）で測定した吸光度に参照してパーセント回復として表した。

実施例３．１：有利な添加剤の不存在下の計算至適ｐＨの外側のパパインのインキュベーションに対する少ない活性回復
６５℃のパパインの安定性に対する５０ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＫａ＝４.８、ｐＫａ２＝６.４）の効果およびＴＲＩＳ緩衝液の効果を、パパインについて概算した至適ｐＨの外側のｐＨで調べた。クエン酸緩衝液は、クエン酸（５０ｍＭ）と水酸化ナトリウム（５Ｍ）とを混合して求めるｐＨを達成することによって調製した。ＴＲＩＳ緩衝液は、Ｔｒｉｓ塩基（５０ｍＭ）と塩酸（５Ｍ）とを混同して求めるｐＨを達成することによって調製した。パパイン活性は４時間で約３０％に落ち、６５℃での２２時間のインキュベーションではほぼゼロまで落ちた。ｐＨが計算至適ｐＨの外側であったため、（ＴＲＩＳの場合に「有利な添加剤」が存在するにもかかわらず）活性の回復は少なかった。

実施例３.２：有利な添加剤の存在下での計算至適ｐＨ付近のパパインのインキュベーションに対する満足のゆく活性回復
グルタミン酸およびヒスチジンを至適ｐＨ付近に調節したパパイン処方に入れると、６５℃でのインキュベーションに対してパパイン活性の満足の行く維持を生じた。バックグラウンド溶液は、グルタミン酸（５０ｍＭ）およびヒスチジン（５０ｍＭ）を混合して求めるｐＨを達成することによって調製した。元の活性の６５％を超える活性が、ｐＨを５.７に調節した場合に６５℃での２２時間のインキュベーション後にいまだ測定可能であった。酵素活性の低下はｐＨ５.４および６.１の同一処方を用いてわずかにより迅速なだけであった。それにもかかわらず、至適から離れて＞０.３単位に調節したｐＨを有する同一処方を用いると、酵素活性のかなり迅速な低下を生じた。処方は、至適ｐＨより上方のｐＫａを有する陽性に荷電したプロトン化可能な基（すなわち、２のアミノ酸のアミノ基−９付近のｐＫａ）および至適ｐＨより下方のｐＫａを有する陰性に荷電したプロトン化可能な基（すなわち、２のアミノ酸のカルボキシル基−３付近のｐＫａ）を含んでいた。ヒスチジンの側鎖（６付近のｐＫａ）は簡便な緩衝能を付与して、ｐＨを求める値に維持した。

実施例４−（ウシ肝臓由来の）グルタミン酸デヒドロゲナーゼ
（ウシ肝臓由来の）グルタミン酸デヒドロゲナーゼは６つのサブユニットからなる（各々ほぼ５６,０００のＭｒ）。グルタミン酸デヒドロゲナーゼの等電点はほぼ５.５である。各サブユニット中の酸−塩基アミノ酸の豊富さを表７に示す。

グルタミン酸デヒドロゲナーゼのプロトン交換頻度特性を図１１に示す。ｐＨ最適化論理式は、グルタミン酸デヒドロゲナーゼに対して以下の結果を与えた：
Ｐ最小値＝０.３２（ｐＨ７.９にて）
Ｘ＝３.２１
Ｙ＝３.５３
概算至適ｐＨ＝６.２

新鮮および高温でのインキュベーション後の両方のグルタミン酸デヒドロゲナーゼ溶液を、グルタミン酸デヒドロゲナーゼ活性についてアッセイした。これは、以下の手順に従って行った：
１００μＬのグルタミン酸デヒドロゲナーゼ試料を、以下の試薬の混合物を含むキュベットに添加した。
・ＥＤＴＡ（３５０μＭ）を含有する２.５ｍＬのリン酸緩衝液（０.２Ｍ、ｐＨ７.４）
・２００μＬの２−オキシグルタル酸（２００ｍＭ）
・１００μＬの硫酸アンモニウム（１Ｍ）
・１００μＬのＮＡＤＨ（７ｍＭ）

これらを迅速に一緒にして混合した。時間＝０はグルタミン酸デヒドロゲナーゼ試料の添加からカウントした。ついで、正確に５分後に、３４０ｎｍで吸光度を読んだ。結果は、高温でのインキュベーションの前の試料で測定した吸光度に参照して、パーセント回復として表した。

実施例４.１：有利な添加剤不存在下の計算至適ｐＨの外側でのグルタミン酸デヒドロゲナーゼのインキュベーションに対する少ない活性回復
５５℃のグルタミン酸デヒドロゲナーゼの安定性に対する５０ｍＭのクエン酸緩衝液（ｐＫａ１＝４.８、ｐＫａ２＝６.４）の効果およびＴＲＩＳ緩衝液の効果を、グルタミン酸デヒドロゲナーゼについての概算した至適ｐＨの外側のｐＨで調べた。クエン酸緩衝液は、クエン酸（５０ｍＭ）と水酸化ナトリウム（５Ｍ）とを混合して求めるｐＨを達成することによって調製した。ＴＲＩＳ緩衝液は、Ｔｒｉｓ塩基（５０ｍＭ）と塩酸（５Ｍ）とを混合して求めるｐＨを達成することによって調製した。５５℃にて４時間のインキュベーション後に、酵素活性は（ＴＲＩＳ緩衝液、ｐＨ８.０の場合）約１５％まで落ち、（クエン酸緩衝液（ｐＨ４.０）の場合）ほとんどゼロまで落ちた。ｐＨが計算至適ｐＨの外側であったため（ＴＲＩＳの場合は「有利な添加剤」の存在下にもかかわらず）活性の回復は少なかった。

実施例４.２：有利な添加剤の存在下での計算至適ｐＨ付近のグルタミン酸デヒドロゲナーゼのインキュベーションに対する満足のゆく活性回復
至適ｐＨ付近に調節したグルタミン酸デヒドロゲナーゼ処方にリシン（５０ｍＭ）を入れると、５５℃でのインキュベーションに対して酵素活性の満足のゆく保存を生じた。バックグラウンド溶液は、９部のリシン（５５ｍＭ）と１部のリン酸水素二ナトリウム（５０ｍＭ）とを混合物ことによって調製した。ｐＨは、クエン酸（１Ｍ）を用いて求める値に調節した。ｐＨを６.１に調節した場合、元の活性の７５％を超える活性が５５℃にて２２時間のインキュベーション後にも測定可能であった。酵素活性の低下は、ｐＨ５.８および６.４の同一処方を用いてわずかにより迅速なだけであった。それにもかかわらず、至適から離れた＞０.３単位に調節したｐＨを有する同一処方を用いると、酵素活性のかなり迅速な低下を生じた。該処方は、至適ｐＨより上方のｐＫａを有する陽性に荷電したプロトン化可能な基（すなわち、リシンのアミノ基−９付近のｐＫａ）および至適ｐＨより下方のｐＫａを有する陰性に荷電したプロトン化可能な基（すなわち、リシンのカルボキシル基−３付近のｐＫａ）を含んでいた。１０ｍＭクエン酸リン酸緩衝液を用いて、ｐＨを維持した。

実施例５−西洋ワサビペルオキシダーゼ
西洋ワサビペルオキシダーゼは、１つのユニット（ほぼ４２,０００のＭｒ）からなる。西洋ワサビの根部中の最も豊富な西洋ワサビペルオキシダーゼのペルオキシダーゼのイソ型のペルオキシダーゼについて一般的にいわれている値はほぼ８.６である。西洋ワサビペルオキシダーゼ・ユニット中の酸−塩基アミノ酸の豊富さを表８に示す。

*最初の数はジスルフィド結合で結合していないシステインの数を示す。括弧内の数はサブユニット中のシステインの合計数を示す。

図１２ 至適ｐＨ論理式は、西洋ワサビペルオキシダーゼについて以下の結果を与えた：
Ｐ最小値＝０.０８（ｐＨ８.１にて）
Ｘ＝０.４２
Ｙ＝０.４９
概算至適ｐＨ＝７.１

新鮮および高温でのインキュベーション後の両方の西洋ワサビペルオキシダーゼ溶液を、西洋ワサビペルオキシダーゼ活性についてアッセイした。これは、以下の手順に従って行った：
１０μＬの西洋ワサビペルオキシダーゼ試料を、以下の試薬の混合物を含むキュベットに添加した。
・２.５ｍＬのクエン酸／リン酸緩衝液（０.０５Ｍ、ｐＨ５.０）
・１００μＬの過酸化水素（２ｍＭ）
・１００μＬのＴＭＢ（３ｍｇ／ｍＬ、ＤＭＳＯに溶解）
これらを一緒に迅速に混合した。時間＝０は西洋ワサビペルオキシダーゼ試料の添加からカウントした。ついで、正確に３分後に、吸光度を６３０ｎｍで読んだ。結果は、高温でのインキュベーション前に試料で測定した吸光度に参照して、パーセント回復として表した。

実施例５.１：有利な添加剤の不存在下の計算至適ｐＨの外側での西洋ワサビペルオキシダーゼのインキュベーションに対する少ない活性回復
６５℃の西洋ワサビペルオキシダーゼの安定性に対する５０ｍＭクエン酸／リン酸緩衝液（ｐＨ５.０）の効果およびリン酸緩衝液（ｐＨ６.０）の効果を、西洋ワサビペルオキシダーゼの概算至適ｐＨの外側のｐＨで調べた。クエン酸／リン酸緩衝液は、クエン酸（５０ｍＭ）とリン酸水素二ナトリウム（５０ｍＭ）とを混合して求める濃度を達成することによって調製した。リン酸緩衝液はリン酸水素二ナトリウム（５０ｍＭ）とリン酸二水素ナトリウム（５０ｍＭ）とを混合して求めるｐＨを達成することによって達成した。６５℃の２２時間のインキュベーション後に、クエン酸／リン酸緩衝液（ｐＨ５.０）の場合は＜１０％まで酵素活性が落ち、リン酸緩衝液（ｐＨ６.０）の場合は約３０％まで落ちた。ｐＨが計算した至適ｐＨの外側であったため、活性の回復は低かった。また、陽性に荷電したプロトン化可能な官能基も存在しなかった。

実施例５.２：有利な添加剤存在下での計算至適ｐＨ付近の西洋ワサビペルオキシダーゼのインキュベーションに対する満足のゆく活性回復
至適ｐＨ付近に調節した西洋ワサビペルオキシダーゼ処方にリシンおよび乳酸を入れると、６５℃でのインキュベーションに対して酵素活性の満足のゆく保存を生じた。バックグラウンド溶液は、リシン（５０ｍＭ）と乳酸（５０ｍＭ）とを混合して必要なｐＨを達成することによって調製した。元の活性のほぼ７５％が、ｐＨを７.２または７.５に調節した場合に、６５℃での２２時間インキュベーション後にも測定可能であった。酵素活性の低下は、ｐＨ６.９ないし８.１の同処方を用いるとわずかに迅速でしかなかった。これは、西洋ワサビペルオキシダーゼ（実施例６に示すラクトペルオキシダーゼと共に）を、他の実験した酵素と比較して最も広範な至適ｐＨを有する酵素とする。このことは、酵素の至適ｐＨがプロトン交換頻度グラフ（図１１を参照されたい）において比較的広い最小値に一することによって説明し得るであろう。

実施例６−ラクトペルオキシダーゼ
文献に引用されたラクトペルオキシダーゼの等電点は８.０−９.２である。西洋ワサビペルオキシダーゼとラクトペルオキシダーゼとの間に構造類似性が存在すると予想し得る場合（等電点の同様の値を示し得るであろうため）は、ラクトペルオキシダーゼの概算至適ｐＨは西洋ワサビペルオキシダーゼのものに類似するとすべきである。

新鮮および高温でのインキュベート後の両方のラクトペルオキシダーゼ溶液を、ラクトペルオキシダーゼ活性についてアッセイした。これは、以下の手順に従って行った：
１００μＬのラクトペルオキシダーゼ試料を１０ｍＬの脱イオン水と混合した。１.２５ｍＬの得られた混合物を、以下の試薬の混合物を含むキュベットに加えた：
・１.２５ｍＬのクエン酸／リン酸緩衝液（０.１Ｍ、ｐＨ５.０）
・１００μＬの過酸化水素（２ｍＭ）
・１００μＬのＴＭＢ（３ｍｇ／ｍＬ、ＤＭＳＯに溶解）
これらは一緒に迅速に混合した。時間＝０は、ラクトペルオキシダーゼ試料の添加からカウントした。ついで、正確に５分後に吸光度を６３０ｎｍで読んだ。結果は、高温でのインキュベーションの前に試料で測定した吸光度に参照してパーセント回復として表した。

実施例６.１：有利な添加剤の不存在下における計算至適ｐＨの外側のラクトペルオキシダーゼのインキュベーションに対する少ない活性回復
６５℃のラクトペルオキシダーゼの安定性に対する５０ｍＭクエン酸／リン酸緩衝液（ｐＨ５.０）の効果およびリン酸緩衝液（ｐＨ６.０）の効果を、（西洋ワサビペルオキシダーゼ配列から算出した）ラクトペルオキシダーゼの概算至適ｐＨの外側のｐＨで調べた。クエン酸／リン酸緩衝液は、クエン酸（５０ｍＭ）とリン酸水素二ナトリウム（５０ｍＭ）とを混合して必要な濃度を達成することによって調製した。リン酸緩衝液はリン酸水素二ナトリウム（５０ｍＭ）とリン酸二水素ナトリウム（５０ｍＭ）とを混合して求めるｐＨを達成することによって調製した。６５℃にて４時間インキュベーション後に、酵素活性は、クエン酸／リン酸緩衝液（ｐＨ５.０）の場合にほぼゼロまで落ち、リン酸緩衝液（ｐＨ６.０）の場合に約１０％まで落ちた。ｐＨが計算至適ｐＨの外側だったため、活性の回復は少なかった。

実施例６.２：有利な添加剤の存在下における計算至適ｐＨ付近のラクトペルオキシダーゼのインキュベーションに対する満足のゆく活性回復
（西洋ワサビペルオキシダーゼから算出した）至適ｐＨ付近に調節したラクトペルオキシダーゼ処方にＴＲＩＳを入れると、６５℃でのインキュベーションに対して酵素活性の満足のゆく保存を生じた。バックグラウンド溶液は、ＴＲＩＳ塩基（５０ｍＭ）と塩酸（５Ｍ）とを混合して求めるｐＨを達成することによって調製した。７.８または８.２にｐＨを調節した場合、６５℃にて４時間インキュベーションした後に、元の活性の１００％がいまだ測定可能であった。ｐＨ７.４および８.６の同一処方を用いると、酵素活性の小さい低下しか存在しなかった。

実施例７−ウリカーゼ
申請および高温でのインキュベーション後の両方のウリカーゼ溶液（典型的に２５０μｇｍＬ^−１）をウリカーゼ活性についてアッセイした。これは、以下の手順に従って行った：
以下の溶液を１ｃｍキュベット中で混合した：
・水酸化ナトリウムを用いて２５ｍＭホウ酸のｐＨを調節することによって調製した。
・０.８ｍＬの尿酸ナトリウム（２ｍＭ）。

４０μＬのウリカーゼ試料（５.３Ｕｍｇ^−１調製物の最大２０５０μｇｍＬ^−１）を添加し、迅速に混合した。時間＝０は、ウリカーゼの添加からカウントした。５分後に、以下の試薬をこの特定の順番で添加した（最初の試薬は正確に５分に添加し、他の試薬の添加のタイミングはさほど重要でない）：
・０.５Ｍクエン酸と０.５Ｍリン酸水素二ナトリウムとを混合して求めるｐＨを達成することによって調製した０.８ｍＬのクエン酸／リン酸緩衝液（０.５Ｍ、ｐＨ４.０）
・１００μＬのＴＭＢ（３ｍｇ ｍＬ^−１、ＤＭＳＯに溶解）
・１００μＬのラクトペルオキシダーゼ（１ｍｇ ｍＬ^−１、水に溶解）

得られた溶液をよく混合し、吸光度をUnicam UV−可視光分光光度計（Helios gamma型）を用いて６３０ｎｍで読んだ。結果は、新鮮な試料（すなわち、高温でのインキュベーションの前の）で測定した吸光度に参照して、パーセント回復で表した。

対照溶液（リン酸緩衝液、ｐＨ７.０；ＴＲＩＳ／ＨＣｌ緩衝液、ｐＨ７.２）中６０℃でのインキュベーションに対して、ウリカーゼの活性は非常に迅速に落ちた。かなり良好な回復がホウ酸緩衝液（ｐＨ９.０）で達成された。しかしながら、タンパク質安定化理論のすべての条件を満たす場合（すなわち、陽性および陰性に荷電したイオン化可能な基の両方が至適ｐＨで存在する場合）に最良の安定性が観察された。これを、プリンおよびコハク酸ならびにＴＲＩＳおよびセリンの混合物について図１２に示す（図１２を参照されたい）。

実施例８−Ｂ型肝炎組換えワクチン
Ｂ型肝炎ワクチンのイン・ビトロ(in vitro)抗原活性を、AUSZYMEモノクローナル診断キット（Abbott Laboratories;カタログ番号1980-64）を用いて測定した。抗原活性は、全ワクチンおよび遠心（１３,０００RPM、５分）後の上清の両方で測定した。各試料は３回測定した。抗原活性は、以下のように、非処理の冷蔵ワクチンの測定した値に対するパーセントとして表した：

式中、
Ｒは抗原活性の回復（％）であり、
Ｎは陰性対照AUSZYME測定の値であり、
Ｃ１、Ｃ２およびＣ３は対照試料（非処理の冷蔵したワクチン）の３回繰り返しAUSZYME測定の値であり、
Ｓ１、Ｓ２およびＳ３は、試験した試料の３回繰り返しAUSZYME測定の値である。

Ｂ型肝炎ワクチンの残存抗原活性を、５５℃での２、４および７週間のインキュベーション後に試験した。ヒスチジンおよびリン酸アニオンからなり、至適ｐＨに調節した安定化処方は、７週間後に元の抗原活性の＞９５％を保持していた。それに対して、元のワクチン処方（１８ｍＭのリン酸緩衝液、ｐＨ６.９−７.１、１３２ｍＭの塩化ナトリウムを含有する）の残存抗原活性はこの時点で＜１０％であった。安定化処方は、アルミナ−抗原会合に影響しないようであった。遠心後の安定化処方の上清で測定した抗原活性は元の試料の上清で測定したものと匹敵したからである。リン酸アニオンの存在はアルミナに対するワクチンの最適の結合を保証すると考えられる。

実施例９−多価アルコールの効果
多価アルコールの選択の有利な効果は、至適ｐＨでの最適化プロトン−交換受容体の存在下の６０℃でのグルコースオキシダーゼの安定性に対して示した。バックグラウンドとしてのｐＨ５.３のヒスチジン（２５ｍＭ）および乳酸（２５ｍＭ）の最適化混合物を用いると、６０℃での２０時間インキュベーション後のグルコースオキシダーゼ活性の回復は、イノシトール、ラクチトール、マンニトール、キシリトールおよびトレハロース（すべて１０％）の存在下においてこれらの多価アルコールの不存在下でよりも良好であった。

グルコースオキシダーゼ安定性の同様な効果は、他の多価アルコール、グリセロールでも観察された。グリセロールの効果を種々の濃度で実験し、効果が１０％ないし２０％（ｗ／ｗ）の濃度で最も顕著であることが見出された。それにもかかわらず、１.３３％濃度のグリセロールの存在でさえ、最適化ヒスチジン／酪酸混合物（ｐＨ５.３）において達成されたものを超えるグルコースオキシダーゼ安定性の測定可能な改善を生じた。

重要なことには、多価アルコールの存在は、バックグラウンド溶液がプロトン交換受容体およびｐＨの存在に関する最適条件から離れている場合には有意な有利な効果を有することが見出されなかった。したがって、例えば、バックグラウンド溶液としてリン酸緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ７.０）を用いた場合には、６０℃にて２０時間のグルコースオキシダーゼのインキュベーションは、選択した糖アルコールの存在下および不存在下の両方でグルコースオキシダーゼ活性の完全な喪失を生じた。

実施例１０−アルミナ粒子に吸着したグルコースオキシダーゼ
グルコースオキシダーゼを、グルコースオキシダーゼの溶液（２５μｇ／ｍＬ）中、４℃にて一晩のアルミナのインキュベーションによってアルミナ粒子上に吸着させた。新鮮および４０℃にてインキュベーションした後の両方の吸着したグルコースオキシダーゼの活性を、以下の手順に従ってアッセイした。

以下の溶液を１ｃｍキュベット中で混合した：
・２.０ｍＬのクエン酸／リン酸緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ５.０）；クエン酸（５０ｍＭ）とリン酸水素二ナトリウム（５０ｍＭ）とを混合して求めるｐＨを達成することによって調製した
・ＤＩ水中の４０％（ｗ／ｗ）グルコース
・ＤＩ水中の１００μＬラクトペルオキシダーゼ（１ｍｇ／ｍＬ）
・１００μＬのＴＭＢ（３ｍｇ／ｍＬ、ＤＳＭＯ中に溶解）

１０μＬのグルコースオキシダーゼ試料を迅速に添加し、混合した。時間＝０は、試料の添加からカウントした。吸光度は、Unicam UV-可視光分光光度計（Helios gamma型）を用いて試料の添加の正確に５分後に６３０ｎｍで読んだ。結果は、新鮮な試料（すなわち、高温でのインキュベーションの前）で測定した吸光度に参照して、パーセント回復として表した。

溶液（ヒスチジン＋グルタミン酸、合計５０ｍＭ、ｐＨ５.０）中のグルコースオキシダーゼを安定化するために以前に見出した最適化処方が、アルミナ粒子上に吸着させた場合に、グルコースオキシダーゼ活性を保存することに有効であることも見出された。したがって、合計５０ｍＭの供与体を含有する処方は、合計１０ｍＭの供与体蛍光団を含有するものよりも良好な活性回復を生じた。回復は、ＤＩ水またはリン酸緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ７.０）において観察されたものよりもかなり良好であった。

実施例１１−多価アルコールの効果
多価アルコールの選択の有利な効果を、至適化したｐＨの最適化プロトン交換受容体の存在下、５５℃のカタラーゼの安定性に対して示した。バックグラウンドとしてのｐＨ６.６のヒスチジン（５０ｍＭ）および乳酸（５０ｍＭ）の最適化混合物を用いると、５５℃での２４時間インキュベーション後のグルコースオキシダーゼ活性の回復は、イノシトール、ラクチトール、マンニトール、キシリトールおよびトレハロース（すべて１０％）存在下においてこれらの多価アルコールの不存在下よりも良好であった。

実施例１２
ＨＰＬＣアッセイを以下のように行った：移動相Ａは水中の０.１％のＴＦＡからなり、移動相Ｂはアセトニトリル中の０.１％のＴＦＡからなる。移動相はそれらを使用する前に濾過した。線形グラジエントを用いた：２０分のＡ／Ｂ（７０：３０）からＡ／Ｂ（６８：３２）。液体クロマトグラフィー（Agilent 1100シリーズ）には、２１４ｎｍディテクターおよび５μｍの粒度分布を有するオクタデシルシリル・シリカゲルを充填し、３０℃に維持した４.６×２５０ｍｍカラム（Zorbax Eclipse XDB-C18）00G-4167-E0）を備えた。流速は１ｍＬ分^−１に維持した。１５μＬのヒトインスリンの水性試料（典型的に１−２.５ｍｇ ｍＬ^−１）を注射した。

ヒトインスリンの構造一体性の回復を、６５℃にて５時間のインキュベーションに対する加速保存で調べた。主要なクロマトグラフィー・ピークの面積は対照溶液（リン酸緩衝液、５０ｍＭ、ｐＨ７.０）で約５０％に落ちたが、ｐＨ５.３のグルタミン酸（２５ｍＭ）およびリシン（２５ｍＭ）を含む安定化処方の溶液中ではインスリンの９０％を超える活性が回復した。

実施例１３−ヒト成長ホルモン
ＨＰＬＣアッセイは以下のとおりに行った：移動相は７１部（体積部）のＴＲＩＳの溶液（０.０５Ｍ、塩酸で７.５のｐＨに調節した水中）と２９部（体積部）のｎ−プロピルアルコールとを混合することによって調製した。移動相はそれを使用する前に濾過した。液体クロマトグラフィー（Agilent 1100シリーズ）には、２１４ｎｍディテクターおよび５μｍの粒度分布および３０ｎｍの孔を有するブチルシリル・シリカゲルを充填し、４５℃に維持した４.６×２５０ｍｍカラム（Phenomenex 00G-4167-E0）を備えた。流速は０.５ｍＬ分^−１に維持した。１５μＬのヒト成長ホルモンの水性試料（典型的に１−２.５ｍｇ ｍＬ^−１）を注射した。

ヒト成長ホルモンの構造一体性の回復を、４０℃にて４週間のインキュベーションに対する加速保存試験で調べた。主要なクロマトグラフィーピークの面積は対照溶液中（すなわち、リン酸緩衝液、水中の５０ｍＭ、ｐＨ７.０中）で＜３５％まで落ちたが、グルタミン酸（１０ｍＭ、ｐＨ６.０）またはリシン（１０ｍＭ、ｐＨ６.０）を含む安定化処方中の溶液中では７０％のヒト成長ホルモンが回復した。

図１は、７のプロトン化可能なアミノ酸についての、％プロトン化／脱プロトン化形態−対−ｐＨのグラフであり、実線はプロトン化形態を表し、点線は脱プロトン化形態を表す。 図２は、７のプロトン化可能なアミノ酸についての、通常単位のプロトン化形態［ＨＡ］および脱プロトン化形態［Ａ］の正規化濃度の生成物−対−ｐＨのグラフである。 図３は、酵素パパインについての、通常単位のプロトン交換頻度（タンパク質のサイズに対する）−対−ｐＨのグラフであり、パパイン分子の表面に対するプロトン交換の相対速度を示している。 図４は、グルコースオキシダーゼおよびパパインのアミノ酸側鎖の％プロトン化−対−ｐＨのグラフである。 図５は、グルコースオキシダーゼおよび西洋ワサビペルオキシダーゼについての、通常単位のプロトン交換頻度（タンパク質のサイズに対する）−対−ｐＨの一対のグラフであり、最低全体プロトン交換頻度および実際のｐＨ最適値に基づいて計算したタンパク質安定性の理論ｐＨ最適値間の差を示している。 図６は、２５℃の水性溶液中のＨ_３Ｏ^＋およびＯＨ⁻についての（μＭの）濃度−対−ｐＨのグラフである。 図７は、通常単位Ｐのプロトン交換頻度（タンパク質のサイズに対して）−対−ｐＨのグラフであり、タンパク質の公知のアミノ酸配列および等電点に基づくタンパク質安定性のｐＨ最適値の推定を示している。 図８は、図３と同様のグラフであり、タンパク質の公知のアミノ酸配列および等電点に基づくグルコースオキシダーゼの安定性のｐＨ最適値の推定を示している。 図９は、カタラーゼについての図８と同様のグラフである。 図１０は、パパインについての図８と同様のグラフである。 図１１は、グルタミン酸脱水素酵素についての図８と同様のグラフである。 図１２は、（Ａ）リン酸緩衝液（２０ｍＭ、ｐＨ７.０）、（Ｂ）ＴＲＩＳ／ＨＣｌ緩衝液（２０ｍＭ、ｐＨ７.２）、（Ｃ）ホウ酸緩衝液（２０ｍＭ、ｐＨ９.０）、（Ｄ）プリン（２０ｍＭ）＋コハク酸（２０ｍＭ）ｐＨ９.０、（Ｅ）ＴＲＩＳ（２０ｍＭ）＋セリン（２０ｍＭ）ｐＨ８.８を含有する処方中の６０℃でのインキュベーションでのウリカーゼ活性の活性回復のグラフである。［ウリカーゼ］＝２５０μｇ ｍＬ^−１。

Claims (27)

1. タンパク質および２の安定化剤を含む水性組成物であって、
   （ｉ）第１の安定化剤は、ギ酸、グリオキシル酸、シュウ酸、酢酸、グリコール酸、ピルビン酸、マロン酸、乳酸、グリセリン酸、フマル酸、コハク酸、リンゴ酸、α−酒石酸、グルタル酸、アスコルビン酸、アジピン酸および没食子酸よりなる群から選択されるが、但し、第１の安定化剤は組成物のｐＨよりも１ないし５ｐＨ単位低いｐＫａ値を有し；
   （ｉｉ）第２の安定化剤は、トリメチルアミン、1,2−プロパンジアミン、1,3−プロパンジアミン、1,2,3−トリアミノプロパン、ペンチルアミン、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン、ベンジルアミン、フェニルエチルアミン、チラミン、トリプタミン、ヒドロキシトリプタミン、エチレンイミン、プリン、8−ヒドロキシプリン、アンモニウムイオン、キノリン、1−イソキノリンアミン、1−メチルイミダゾール、アラントイン、ベロナール、2−エチルベンズイミダゾール、ブルシン、ウラシルおよび2,4,6−トリメチルピリジンよりなる群から選択されるが、但し、第２の安定化剤は組成物のｐＨよりも１ないし５ｐＨ単位高いｐＫａ値を有し；および
   （ｉｉｉ）組成物のｐＨは、ｐＨに対するタンパク質の最大安定性の少なくとも５０％であるタンパク質安定性の範囲内である；
   ことを特徴とする該水性組成物。
2. タンパク質および２の安定化剤を含む水性組成物であって、
   （ｉ）第１の安定化剤は、ギ酸、グリオキシル酸、シュウ酸、酢酸、グリコール酸、ピルビン酸、マロン酸、乳酸、グリセリン酸、フマル酸、コハク酸、リンゴ酸、α−酒石酸、グルタル酸、アスコルビン酸、アジピン酸および没食子酸よりなる群から選択されるが、但し、第１の安定化剤は組成物のｐＨよりも１ないし５ｐＨ単位低いｐＫａ値を有し；
   （ｉｉ）第２の安定化剤は、トリメチルアミン、1,2−プロパンジアミン、1,3−プロパンジアミン、1,2,3−トリアミノプロパン、ペンチルアミン、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン、ベンジルアミン、フェニルエチルアミン、チラミン、トリプタミン、ヒドロキシトリプタミン、エチレンイミン、プリン、8−ヒドロキシプリン、アンモニウムイオン、キノリン、1−イソキノリンアミン、1−メチルイミダゾール、アラントイン、ベロナール、2−エチルベンズイミダゾール、ブルシン、ウラシルおよび2,4,6−トリメチルピリジンよりなる群から選択されるが、但し、第２の安定化剤は組成物のｐＨよりも１ないし５ｐＨ単位高いｐＫａ値を有し；および
   組成物のｐＨは、組成物がｐＨに対して最大安定性を有するｐＨの±０.５ｐＨ単位の範囲内である；
   ことを特徴とする該水性組成物。
3. 該範囲が最大安定性の少なくとも６０％である請求項１記載の組成物。
4. 該範囲が最大安定性の少なくとも７０％である請求項１記載の組成物。
5. 該範囲が最大安定性の少なくとも８０％である請求項１記載の組成物。
6. 少なくとも５０％のイオン化可能な基がイオン化している請求項１ないし５のいずれか１項に記載の組成物。
7. 少なくとも８０％のイオン化可能な基がイオン化している請求項６記載の組成物。
8. 該イオン化可能な基が実質的に完全にイオン化している請求項６記載の組成物。
9. 各々のｐＫａ値が組成物のｐＨの１ないし４ｐＨ単位内である請求項６ないし８のいずれか１項に記載の組成物。
10. 各々のｐＫａ値が組成物のｐＨの１ないし３ｐＨ単位内である請求項９記載の組成物。
11. ｐＨが４ないし９である請求項１ないし１０のいずれか１項に記載の組成物。
12. さらに、多価アルコールを含む請求項１ないし１１のいずれか１項に記載の組成物。
13. 少なくとも０.５％（ｗ／ｗ）の多価アルコールを含む請求項１２記載の組成物。
14. 少なくとも０.１％（ｗ／ｗ）の第１および第２の安定化剤を含む請求項１ないし１３のいずれか１項に記載の組成物。
15. 少なくとも０.５％（ｗ／ｗ）の第１および第２の安定化剤を含む請求項１４記載の組成物。
16. ２００ｍＭまでの各安定化剤を含む請求項１ないし１５のいずれか１項に記載の組成物。
17. １００ｍＭまでの各安定化剤を含む請求項１ないし１６のいずれか１項に記載の組成物。
18. タンパク質がネイティブな状態で存在する請求項１ないし１７のいずれか１項に記載の組成物。
19. タンパク質安定性を、その機能および／または構造特徴の保持により測定する請求項１ないし１８のいずれか１項に記載の組成物。
20. タンパク質がホルモンまたは成長因子もしくは増殖因子である請求項１ないし１９のいずれか１項に記載の組成物。
21. タンパク質が治療酵素である請求項１ないし２０のいずれか１項に記載の組成物。
22. タンパク質が治療抗体である請求項１ないし２１のいずれか１項に記載の組成物。
23. タンパク質がインターフェロンである請求項１ないし２２のいずれか１項に記載の組成物。
24. タンパク質が免疫原性である請求項１ないし２３のいずれか１項に記載の組成物。
25. 水溶液、懸濁液または分散液である請求項１ないし２４のいずれか１項に記載の組成物。
26. ヒトまたは動物の身体に行う治療または診断において使用するための、請求項１ないし２５のいずれか１項に記載の組成物。
27. 請求項１ないし２６のいずれか１項に記載の組成物を含む密閉容器。

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