JP5032778B2

JP5032778B2 - Biological tissue regeneration material

Info

Publication number: JP5032778B2
Application number: JP2006057335A
Authority: JP
Inventors: 孝介桑原; 昭浩宮内; 政嗣下村; 賢田中; 浩藪
Original assignee: Hitachi Ltd
Current assignee: Hitachi Ltd
Priority date: 2006-03-03
Filing date: 2006-03-03
Publication date: 2012-09-26
Anticipated expiration: 2026-03-03
Also published as: JP2007229348A

Description

本発明は、生体組織の再生に用いられる生体組織再生用材料に係り、特に、神経細胞を主とする細胞と、細胞を培養する細胞培養基材とを含んで構成される生体組織再生用材料に関する。 TECHNICAL FIELD The present invention relates to a biological tissue regeneration material used for regeneration of biological tissue, and in particular, a biological tissue regeneration material comprising cells mainly composed of nerve cells and a cell culture substrate for culturing the cells. About.

近年、再生医療や移植医療等、医療分野において、細胞培養の技術が適用される機会が増加している。例えば、現在、細胞培養の技術は皮膚の移植の際に適用されている。さらに、技術の進歩にともなって、その適用範囲は、角膜、歯、骨、さらには臓器等複雑な器官へと広がりつつある。 In recent years, opportunities for applying cell culture techniques in the medical field such as regenerative medicine and transplantation medicine are increasing. For example, cell culture techniques are currently applied during skin transplantation. Furthermore, with the advance of technology, the application range is expanding to corneas, teeth, bones, and even complex organs such as organs.

特に、神経細胞に対しては、欠損した神経の治療や神経の自己組織性を利用した神経回路の形成等を目的として広く研究が進められている。このような神経回路の再生はパーキンソン病、アルツハイマー病の治療に有効とされている。 In particular, for nerve cells, extensive research has been conducted for the purpose of treating deficient nerves and forming neural circuits utilizing the self-organization of nerves. Such regeneration of the neural circuit is considered effective for the treatment of Parkinson's disease and Alzheimer's disease.

そこで、神経回路の再生に用いられる材料として、ポリグリコール酸（ＰＧＡ）のメッシュ状チューブにコラーゲンを塗布した材料が非特許文献１に開示されている。非特許文献１に開示される材料によれば、チューブを神経突起伸長のガイドとして特に末梢神経の再生を促進することができる。 Thus, Non-Patent Document 1 discloses a material in which collagen is applied to a mesh tube of polyglycolic acid (PGA) as a material used for regeneration of a neural circuit. According to the material disclosed in Non-Patent Document 1, regeneration of peripheral nerves can be particularly promoted by using a tube as a guide for neurite outgrowth.

また、生体吸収性ポリマーおよび神経幹細胞よりなる神経再生用材料、それを生体吸収性材料からなるチューブに充填した神経再生材が特許文献１に開示されている。特許文献１に開示される神経再生材によればチューブによって神経の欠損部を繋ぎ、神経の機能を回復することができる。
特開２００２−７８７９２号公報（実施例１，２）Ｊ．Ａrtif．Ｏrgans，２７，４９０−４９４（１９９８） Further, Patent Document 1 discloses a nerve regeneration material composed of a bioabsorbable polymer and neural stem cells, and a nerve regeneration material filled with a tube composed of the bioabsorbable material. According to the nerve regeneration material disclosed in Patent Document 1, nerve deficient portions can be connected by a tube, and the function of the nerve can be recovered.
JP 2002-78792 A (Examples 1 and 2) J. et al. Artif. Organs, 27, 490-494 (1998)

しかしながら、非特許文献１に記載の神経再生材は、治療に充分な神経再生効果を示さない。
また、特許文献１に記載のチューブによれば、一次元的に神経を繋ぐことはできるものの、中枢神経および末梢神経の末端部における複雑な神経回路を再生するにはチューブを用いて複雑な回路を再現する必要があり、そのチューブを繋ぎ合わせるには、困難な操作が要求される。 However, the nerve regeneration material described in Non-Patent Document 1 does not exhibit a nerve regeneration effect sufficient for treatment.
In addition, according to the tube described in Patent Document 1, although nerves can be connected one-dimensionally, a complex circuit using a tube is required to regenerate complex neural circuits at the end of the central nerve and peripheral nerve. Must be reproduced, and difficult operations are required to connect the tubes together.

そこで、本発明の目的は、生体組織の再生に好適な治療材料を提供することである。特に、神経細胞に適用することによって良好な神経細胞増殖促進作用および神経突起の伸長作用を有し、損傷、欠損などの生じた部位の神経回路を再生することのできる生体組織再生用材料を提供することを課題とする。 Accordingly, an object of the present invention is to provide a therapeutic material suitable for regeneration of living tissue. In particular, it provides a material for regeneration of biological tissue that has a favorable nerve cell growth promoting action and neurite extension action when applied to nerve cells, and can regenerate the nerve circuit of the site where damage or loss has occurred. The task is to do.

前記課題を解決するために、本発明の生体組織再生用材料は、神経細胞と、前記神経細胞を培養する細胞培養基材とを備えた生体内に移植する生体組織再生用材料であって、前記細胞培養基材の培養表面は、前記神経細胞よりも直径の小さい複数の凸部を有すると共に、前記細胞培養基材が、前記神経細胞の培養表面に複数の凸部が形成されてなる前記神経細胞の成長形態を制御する培養制御領域を有しており、前記培養制御領域は、
（ａ）前記凸部の相当直径および前記凸部間の間隔が、培養する前記神経細胞の直径、および前記神経細胞から伸長する神経突起の直径よりも小さい複数の凸部により形成された少なくとも１つの領域、
（ｂ）前記凸部の相当直径および前記凸部間の間隔が培養する前記神経細胞の直径よりも小さく、かつ、前記凸部間の間隔が前記神経細胞から伸長する神経突起の直径よりも大きい複数の凸部により形成された少なくとも１つの領域、
（ｃ）前記培養制御領域における前記凸部の相当直径が前記神経細胞の直径よりも小さく、前記凸部間の間隔が前記神経細胞の直径の０．４倍から２倍までの範囲である複数の凸部により形成された少なくとも１つの領域
より成る群から選択された少なくとも２つの領域を含むことを特徴とする生体組織再生用材料である。 In order to solve the above-mentioned problems, the biological tissue regeneration material of the present invention is a biological tissue regeneration material that is transplanted into a living body comprising a nerve cell and a cell culture substrate for culturing the nerve cell, The culture surface of the cell culture substrate has a plurality of convex portions having a diameter smaller than that of the nerve cells , and the cell culture substrate is formed by forming a plurality of convex portions on the culture surface of the nerve cells. It has a culture control region that controls the growth form of nerve cells, the culture control region,
(A) At least 1 formed by a plurality of convex portions having an equivalent diameter of the convex portions and an interval between the convex portions smaller than a diameter of the nerve cell to be cultured and a neurite extending from the nerve cell. One area,
(B) The equivalent diameter of the convex portions and the interval between the convex portions are smaller than the diameter of the nerve cell to be cultured, and the interval between the convex portions is larger than the diameter of the neurite extending from the neural cell. At least one region formed by a plurality of convex portions,
(C) A plurality of protrusions having an equivalent diameter in the culture control region smaller than the diameter of the nerve cell, and a distance between the protrusions in a range from 0.4 to 2 times the diameter of the nerve cell. At least one region formed by the convex portion of
A biological tissue regeneration material comprising at least two regions selected from the group consisting of:

本発明によれば、生体組織の再生に好適な治療材料を提供することができる。特に、神経細胞に適用することによって良好な神経細胞増殖促進作用および神経突起の伸長作用を有し、損傷、欠損などの生じた部位の神経回路を再生することのできる生体組織再生用材料を提供することができる。 ADVANTAGE OF THE INVENTION According to this invention, the therapeutic material suitable for reproduction | regeneration of a biological tissue can be provided. In particular, it provides a material for regeneration of biological tissue that has a favorable nerve cell growth promoting action and neurite extension action when applied to nerve cells, and can regenerate the nerve circuit of the site where damage or loss has occurred. can do.

以下、本発明を実施するための最良の形態（以下「実施形態」という）について、適宜図面を参照しながら詳細に説明する。なお、参照する図面において、同一の機能を有する構成要素に対しては同一の符号を付すことによって説明をしているが、形状、大きさ等においては必ずしも同一であるとは限らない。 Hereinafter, the best mode for carrying out the present invention (hereinafter referred to as “embodiment”) will be described in detail with reference to the drawings as appropriate. In the drawings to be referred to, components having the same functions are described by being given the same reference numerals, but the shapes, sizes, etc. are not necessarily the same.

本発明は、生体組織再生用材料の構成要素である細胞培養基材に、培養用培地と神経細胞とを配して、前記神経細胞を対応する培養条件下で培養するに当たって、前記細胞培養基材の培養表面に、所定の形状と間隔を有する複数の凸部が設けられた細胞培養基材を用いると、神経細胞の成長形態を制御して培養を行うことができるという知見に基づいて創作されたものである。 The present invention provides a cell culture substrate, which is a component of a material for living tissue regeneration, in which a culture medium and nerve cells are arranged and the cells are cultured under the corresponding culture conditions. Creation based on the knowledge that a cell culture substrate provided with a plurality of convex portions having a predetermined shape and interval on the culture surface of the material can control the growth form of nerve cells. It has been done.

ここで、「神経細胞の成長形態」とは、細胞培養基材を用いて神経細胞を培養するに当たって、前記神経細胞が成長する種々の形態を意味するものである。例えば、神経細胞の成長形態としては、神経細胞と細胞培養基材との密着性、細胞体の大きさ、形状（扁平、球状、紡錘状等）、神経突起の太さ、長さ、枝分かれ様式（枝分かれ数、枝分かれ位置）、伸長方向、神経細胞成長の促進、神経細胞成長の抑制（特に、成長停止）等が含まれる。
なお、本実施形態において、「神経突起」は、樹状突起および軸索を含む。 Here, the “nerve cell growth form” means various forms in which the nerve cell grows when the nerve cell is cultured using the cell culture substrate. For example, the growth form of nerve cells includes adhesion between nerve cells and cell culture substrate, cell body size and shape (flat, spherical, spindle shape, etc.), neurite thickness, length, branching mode, etc. (Number of branches, branch position), extension direction, promotion of nerve cell growth, inhibition of nerve cell growth (particularly, growth arrest), and the like.
In the present embodiment, “neurites” include dendrites and axons.

<<生体組織再生用材料の構成>>
図１は、本実施形態の生体組織再生用材料の概略構成を示す斜視図である。図１に示すように、生体組織再生用材料１は、神経細胞２と、神経細胞２が培養される培養表面に複数の凸部３１を有する細胞培養基材３とを主に含んで構成される。神経細胞２は細胞体２１と神経突起２２とを含む。
なお、図１において、培養表面は、単層シート状に形成された細胞培養基材３の上面側を示しているが、後記するように、細胞培養基材３の形状および細胞培養基材３における培養表面の位置はこれに限定されるものではない。 << Configuration of materials for living tissue regeneration >>
FIG. 1 is a perspective view showing a schematic configuration of the tissue regeneration material of the present embodiment. As shown in FIG. 1, the tissue regeneration material 1 mainly includes nerve cells 2 and a cell culture substrate 3 having a plurality of convex portions 31 on the culture surface on which the nerve cells 2 are cultured. The The nerve cell 2 includes a cell body 21 and a neurite 22.
In FIG. 1, the culture surface shows the upper surface side of the cell culture substrate 3 formed in a single-layer sheet, but as described later, the shape of the cell culture substrate 3 and the cell culture substrate 3 The position of the culture surface in is not limited to this.

[神経細胞２]
神経細胞２は、細胞培養基材３で培養できるものであれば、特に限定されるものではなく、従来公知の神経細胞２から適宜選択できる。例えば、ヒトを対象とした再生治療に適用する場合には、神経細胞２は、主にヒト由来の神経細胞２であって、患者の患部に適応する組織由来の神経細胞２が選択される。また、神経細胞２は、例えば、生体組織から単離したものであっても、幹細胞から神経細胞２に分化誘導したものであっても、さらには、これらを継代培養後に使用するものであってもよい。また、神経細胞２の分裂能の有無は問わず、本発明の神経細胞２は、例えば、胎児由来であっても、成人由来であってもよい。 [Neuron cell 2]
The nerve cell 2 is not particularly limited as long as it can be cultured on the cell culture substrate 3, and can be appropriately selected from conventionally known nerve cells 2. For example, when applied to regenerative treatment for human subjects, the neuronal cells 2 are mainly human-derived neuronal cells 2 and tissue-derived neuronal cells 2 that are adapted to the affected area of the patient are selected. Further, the neuron 2 may be, for example, isolated from a living tissue, or induced to differentiate from a stem cell to the neuron 2, and further used after passage culture. May be. Moreover, regardless of the presence or absence of the division ability of the nerve cell 2, the nerve cell 2 of the present invention may be derived from, for example, a fetus or an adult.

とりわけ、再生治療の対象となる個体自身の神経細胞２（特に、神経幹細胞が好ましい）を用いれば、移植の際に免疫抑制処理を施す必要が無いために最適である。個体自身から対応する神経細胞２を得ることができない場合、または緊急を要する場合には、個体と同種のドナー由来の神経細胞２（特に、神経幹細胞が好ましい）を用いることができる。この場合は拒絶反応が小さくなるようなドナーの選択と、移植をする際の免疫抑制が必要となる。そして、これらの神経細胞２は細胞培養基材３上で培養し、接着した状態で移植治療に供される。
換言すると、入手可能な神経細胞２から目的に応じて好適なものを適宜選択して、本実施形態に適用可能である。 In particular, the use of individual nerve cells 2 (particularly preferably neural stem cells) to be subjected to regenerative treatment is optimal because there is no need to perform immunosuppression treatment at the time of transplantation. When the corresponding neuron 2 cannot be obtained from the individual itself, or when urgent is required, the neuron 2 derived from the same kind of donor as the individual (particularly, a neural stem cell is preferable) can be used. In this case, it is necessary to select a donor with a small rejection and immunosuppression at the time of transplantation. These nerve cells 2 are cultured on the cell culture substrate 3 and are subjected to transplantation treatment in an adhered state.
In other words, a suitable one can be appropriately selected from the available nerve cells 2 according to the purpose, and can be applied to the present embodiment.

[細胞培養基材３]
細胞培養基材３は、神経細胞２を培養するための基材であって、神経細胞２が培養される培養表面には所定の形状と間隔を有する複数の凸部３１が形成されている。そして、この複数の凸部３１は、細胞培養基材３で神経細胞２が培養される際に、神経細胞２の成長形態を制御するものである。
また、神経細胞２は、細胞体２１と神経突起２２とを含む。神経細胞２と細胞培養基材３とは、一体化されている状態であり、単に神経細胞２が細胞培養基材３に載置されているだけでもよいが、好ましくは、細胞培養基材３に神経細胞２が接着されている状態である。また、細胞培養基材３に一体化される神経細胞２の数は、特に制限されず、少なくとも１個以上であればよい。 [Cell culture substrate 3]
The cell culture substrate 3 is a substrate for culturing the nerve cells 2, and a plurality of convex portions 31 having a predetermined shape and interval are formed on the culture surface on which the nerve cells 2 are cultured. The plurality of convex portions 31 controls the growth mode of the nerve cell 2 when the nerve cell 2 is cultured on the cell culture substrate 3.
The nerve cell 2 includes a cell body 21 and a neurite 22. The nerve cell 2 and the cell culture substrate 3 are in an integrated state, and the nerve cell 2 may simply be placed on the cell culture substrate 3, but preferably the cell culture substrate 3 This is a state in which the nerve cell 2 is adhered. Further, the number of nerve cells 2 integrated with the cell culture substrate 3 is not particularly limited, and may be at least one.

本実施形態に適用可能な細胞培養基材３の代表例として、例えば、本願出願人が先に出願した特開２００４−１７０９３５号公報に記載の機能性基板が挙げられる。すなわち、特開２００４−１７０９３５号公報に記載の機能性基板は、有機ポリマー製の第１の基体と、該基体から伸びた有機ポリマー製の柱状微小突起群を有し、該柱状微小突起群の相当直径が１０ｎｍから５００μｍ、高さが５０ｎｍから５０００μｍであって、該柱状微小突起群の高さ(Ｈ)に対する相当直径(Ｄ）の比（Ｈ／Ｄ）が４以上であることを特徴とする柱状微小突起群を備えた機能性基板である。
本実施形態の細胞培養基材３は、このような柱状微小突起群（本実施形態において、複数の凸部３１に対応する）を備えた機能性基板を、神経細胞２の成長形態を制御する目的で、所望する成長形態に応じて凸部３１の形状および凸部３１間の間隔を規定することによって、実現することができる。なお、アスペクト比（Ｈ／Ｄ）は特に限定されるものではなく、神経細胞や所望する成長形態に応じて適宜規定すればよい。 As a representative example of the cell culture substrate 3 applicable to the present embodiment, for example, a functional substrate described in Japanese Patent Application Laid-Open No. 2004-170935 filed earlier by the applicant of the present application can be cited. That is, the functional substrate described in Japanese Patent Application Laid-Open No. 2004-170935 includes a first base made of an organic polymer, and a columnar microprojection group made of an organic polymer extending from the base, and the columnar microprojection group The equivalent diameter is 10 nm to 500 μm, the height is 50 nm to 5000 μm, and the ratio (H / D) of the equivalent diameter (D) to the height (H) of the columnar microprojections is 4 or more. It is a functional board | substrate provided with the columnar microprotrusion group to perform.
The cell culture substrate 3 of this embodiment controls the growth form of the nerve cell 2 using a functional substrate having such a columnar microprojection group (corresponding to the plurality of convex portions 31 in this embodiment). For the purpose, it can be realized by defining the shape of the convex portions 31 and the interval between the convex portions 31 according to the desired growth form. Note that the aspect ratio (H / D) is not particularly limited, and may be appropriately determined according to the nerve cell and the desired growth form.

細胞培養基材３の主成分は、少なくとも所定の形状に加工できる程度の剛性が要求される。そのうえで、加工、保存、患者への移植中や移植後等の、製造環境および使用環境を考慮して適宜適切な材料が選択される。 The main component of the cell culture substrate 3 is required to have at least rigidity enough to be processed into a predetermined shape. In addition, an appropriate material is appropriately selected in consideration of a manufacturing environment and a use environment during processing, storage, and transplantation into a patient and after transplantation.

特に、細胞培養基材３は、その使用時に患者の体内に神経細胞２と一体に埋入されることから、生物学的安全性が高い材料により構成される。生物学的安全性に関して、細胞培養基材３は、神経組織の再生とともに体内で分解吸収されて消失する生分解性物質（水解性物質を含む）によって構成されることがより好ましい。 In particular, since the cell culture substrate 3 is embedded integrally with the nerve cells 2 in the patient's body at the time of use, the cell culture substrate 3 is made of a material having high biological safety. In terms of biological safety, the cell culture substrate 3 is more preferably composed of a biodegradable substance (including a hydrolyzable substance) that is decomposed and absorbed in the body and disappears along with regeneration of nerve tissue.

例えば、細胞培養基材３の主成分は、アルギン酸、架橋アルギン酸、キチン、キトサン、ヒアルロン酸、架橋ヒアルロン酸、セルロース、デンプン、架橋デンプンおよびこれらの誘導体等の多糖類；ゼラチン、架橋ゼラチン、コラーゲン、カゼイン、フィブリン、アルブミン等の蛋白質；ポリアスパラギン酸、ポリグルタミン酸、ポリリジン等のポリペプチド；ポリグリコール酸、ポリ乳酸、ポリ（ε−カプロラクトン）、グリコール酸／乳酸共重合体、グリコール酸／カーボネート共重合体、ポリジオキサノン、シアノアクリレート系重合体等の合成高分子材料；水酸アパタイト、リン酸三カルシウム、炭酸カルシウム等の無機材料等を挙げることができる。なかでも、ポリグリコール酸、ポリ乳酸、ポリ（ε−カプロラクトン）、グリコール酸／乳酸共重合体等の合成高分子材料を主成分とする細胞培養基材３は、剛性、安定性、柔軟性、透明性、耐熱性、耐湿熱性等の点で優れているため、好適である。
また、細胞培養基材３に所望の物性、例えば、剛性、安定性、柔軟性、透明性、耐熱性、耐湿熱性等や生分解時間（体内に移植された際に分解されるまでの時間）を得るために、複数の生分解性物質を所定の比率でブレンドしてもよい。 For example, the main component of the cell culture substrate 3 is a polysaccharide such as alginic acid, crosslinked alginic acid, chitin, chitosan, hyaluronic acid, crosslinked hyaluronic acid, cellulose, starch, crosslinked starch, and derivatives thereof; gelatin, crosslinked gelatin, collagen, Proteins such as casein, fibrin, albumin; polypeptides such as polyaspartic acid, polyglutamic acid, polylysine; polyglycolic acid, polylactic acid, poly (ε-caprolactone), glycolic acid / lactic acid copolymer, glycolic acid / carbonate copolymer Synthetic polymer materials such as polymers, polydioxanones, and cyanoacrylate polymers; inorganic materials such as hydroxyapatite, tricalcium phosphate, and calcium carbonate. Among them, the cell culture substrate 3 mainly composed of a synthetic polymer material such as polyglycolic acid, polylactic acid, poly (ε-caprolactone), glycolic acid / lactic acid copolymer has rigidity, stability, flexibility, Since it is excellent in terms of transparency, heat resistance, wet heat resistance, etc., it is preferable.
In addition, desired physical properties of the cell culture substrate 3, such as rigidity, stability, flexibility, transparency, heat resistance, heat and humidity resistance, and biodegradation time (time until decomposition when transplanted into the body) In order to obtain, a plurality of biodegradable substances may be blended at a predetermined ratio.

このような細胞培養基材３は、移植する目的の部位に応じて適宜決定することも可能である。例えば、脳等の生命に重大な影響を与える部位には生分解性の材料を選択し、そして比較的生命に重大な影響を与えない部位には、シリコーンに代表される長期的に生体に悪影響や強い刺激も与えない生体適合材料を選択することも考慮される。 Such a cell culture substrate 3 can be appropriately determined according to the target site to be transplanted. For example, biodegradable materials are selected for areas that have a significant impact on life, such as the brain, and areas that do not have a significant impact on life are adversely affected in the long term, such as silicone. It is also considered to select a biocompatible material that does not give any strong stimulation.

さらに、細胞培養基材３は、前記した主成分に加えて、神経細胞に対する誘導物質や抑制物質等を副成分として含む構成としてもよい。このような構成とすることで、細胞培養基材３の主成分として生分解性物質を選択した場合には、細胞培養基材３の生分解にともなって誘導物質や抑制物質等の副成分を放出させることができる。そして、この放出のタイミングは、細胞培養基材３内に副成分の濃度分布を形成することによって制御することができる。 Furthermore, the cell culture substrate 3 may be configured to include, in addition to the above-described main component, an inducer or inhibitor for nerve cells as a subcomponent. By adopting such a configuration, when a biodegradable substance is selected as the main component of the cell culture substrate 3, subcomponents such as inducers and inhibitors are added along with the biodegradation of the cell culture substrate 3. Can be released. The timing of the release can be controlled by forming a concentration distribution of subcomponents in the cell culture substrate 3.

誘導物質や抑制物質等の副成分を細胞培養基材３に含ませる方法は特に限定しないが、例えば、前記副成分を早い時期に放出させたい場合には、一旦、細胞培養基材３全体を主成分のみで形成し、その表面を副成分、または、主成分と副成分との混合物により被覆することで実現できる。その反対に、例えば、前記副成分を遅い時期に放出させたい場合には、一旦、細胞培養基材３全体を主成分と副成分との混合物で形成し、その表面を主成分のみで被覆することで実現できる。 The method of including subcomponents such as inducers and suppressors in the cell culture substrate 3 is not particularly limited. For example, when the subcomponents are to be released at an early stage, the entire cell culture substrate 3 is temporarily removed. It can be realized by forming only the main component and coating the surface with the subcomponent or a mixture of the main component and the subcomponent. On the other hand, for example, when it is desired to release the subcomponent at a later time, the entire cell culture substrate 3 is once formed with a mixture of the main component and the subcomponent, and the surface is covered only with the main component. This can be achieved.

図２は、細胞培養基材３の構成を示す斜視図であって、(ａ)は全体図、（ｂ）は(ａ)で示したＡ領域の部分拡大図である。図２(ａ)に示すように、細胞培養基材３は、基材ベース３２と、この基材ベース３２と一体的に形成される複数の凸部３１とを含んで構成される。図２においては、基材ベース３２は、平板状に形成されているが、所望する細胞培養基材３の形状に応じて基材ベース３２の形状も変わりうる。 2A and 2B are perspective views showing the configuration of the cell culture substrate 3, wherein FIG. 2A is an overall view, and FIG. 2B is a partially enlarged view of a region A shown in FIG. As shown in FIG. 2A, the cell culture substrate 3 includes a substrate base 32 and a plurality of convex portions 31 formed integrally with the substrate base 32. In FIG. 2, the base material base 32 is formed in a flat plate shape, but the shape of the base material base 32 can be changed according to the desired shape of the cell culture base material 3.

図２（ｂ）に示すように、凸部３１は、基材ベース３２の上面３２Ａに、基材ベース３２と一体的に複数形成されて、後記する制御領域（例えば、後記する実施形態例１〜３を参照）を構成する。そして、凸部３１は、その最上面３１Ａにおいて所定の相当直径ｒを有し、所定の間隔ｇで配列している。 As shown in FIG. 2B, a plurality of convex portions 31 are formed integrally with the base material base 32 on the upper surface 32 </ b> A of the base material base 32, and a control region to be described later (for example, Embodiment 1 to be described later). To 3). The convex portions 31 have a predetermined equivalent diameter r on the uppermost surface 31A and are arranged at a predetermined interval g.

凸部３１の配列の様式は、所定の間隔ｇを満たす範囲において、様々に規定することができる。例えば、複数の凸部３１の配列の様式は、同一の制御領域における効果の均一性を保持するために、２次元正方格子状や千鳥格子状であることが好ましい。 The arrangement pattern of the convex portions 31 can be variously defined within a range satisfying the predetermined interval g. For example, the arrangement of the plurality of convex portions 31 is preferably a two-dimensional square lattice pattern or a staggered lattice pattern in order to maintain the uniformity of the effect in the same control region.

凸部３１の最上面３１Ａの形状は、必ずしも円形である必要はない。従って、本実施形態においては、最上面３１Ａの大きさを規定する場合に、円形のみを想定した「直径」等の表現は用いず、「相当直径」として記載する。
ここで、「相当直径」とは、凸部３１の最上面３１Ａの直径または直径に相当する長さであって、最上面３１Ａの形状が円形の場合にはその直径、矩形である場合にはその一辺の長さ、また、そのいずれにも該当しない場合には、例えば、円相当径を用いることができる。円相当径は、必ずしも円形ではない最上面３１Ａの形状を、円形とみなしてその直径を規定するものである。例えば、円相当径として、最上面３１Ａの面積と同じ面積を持つ円の直径とみなす面積円相当径、最上面３１Ａの周長と同じ長さの円の直径とみなす周長円相当径、最上面３１Ａの形状に外接する円の直径とみなす外接円相当径、最上面３１Ａの形状に内接する円の直径とみなす内接円相当径等が挙げられ、最上面３１Ａの形状に応じて適宜選択することができる。 The shape of the uppermost surface 31A of the convex portion 31 is not necessarily circular. Therefore, in the present embodiment, when defining the size of the uppermost surface 31A, the expression “diameter” or the like assuming only a circle is not used, but is described as “equivalent diameter”.
Here, the “equivalent diameter” is the diameter of the uppermost surface 31A of the convex portion 31 or a length corresponding to the diameter, and when the shape of the uppermost surface 31A is a circle, the diameter is a rectangle. For example, a circle equivalent diameter can be used when the length of one side does not correspond to any of the lengths. The equivalent circle diameter defines the diameter of the uppermost surface 31A, which is not necessarily circular, as a circular shape. For example, as an equivalent circle diameter, an equivalent circle equivalent diameter regarded as the diameter of a circle having the same area as the area of the top surface 31A, a perimeter equivalent circle diameter regarded as the diameter of a circle having the same length as the circumference of the top surface 31A, A circumscribed circle equivalent diameter regarded as the diameter of the circle circumscribing the shape of the upper surface 31A, an inscribed circle equivalent diameter regarded as the diameter of the circle inscribed in the shape of the uppermost surface 31A, etc. can do.

凸部３１の相当直径ｒは、神経細胞２との接触面積を減らすために神経細胞２の直径（細胞体２１の直径）よりも小さくすることが好ましい。このような構成とすることにより、神経細胞２が凸部３１の最上面３１Ａ上に載置される場合には、神経細胞２の底面と培地との接触面積が増加し、神経細胞２と培地間の栄養物質や老廃物との交換を促進することができるため、神経細胞２の成長形態の制御に所定の効果を奏する。 The equivalent diameter r of the convex portion 31 is preferably smaller than the diameter of the nerve cell 2 (the diameter of the cell body 21) in order to reduce the contact area with the nerve cell 2. With this configuration, when the nerve cell 2 is placed on the uppermost surface 31A of the convex portion 31, the contact area between the bottom surface of the nerve cell 2 and the medium increases, and the nerve cell 2 and the medium Since it is possible to promote the exchange of nutrient substances and waste products between them, a predetermined effect is exerted in controlling the growth form of the nerve cell 2.

本実施形態において、凸部３１間の間隔ｇは、凸部３１の最上面３１Ａ外周から当該凸部３１に隣接する凸部３１の最上面３１Ａ外周までの最短距離として規定する。
例えば、図２に示すように、凸部３１の配列の様式が２次元正方格子状の場合には、凸部３１間の間隔はｇの長さである。 In the present embodiment, the interval g between the convex portions 31 is defined as the shortest distance from the outer periphery of the uppermost surface 31A of the convex portion 31 to the outer periphery of the uppermost surface 31A of the convex portion 31 adjacent to the convex portion 31.
For example, as shown in FIG. 2, when the arrangement of the protrusions 31 is a two-dimensional square lattice, the interval between the protrusions 31 is the length of g.

凸部３１の高さは、凸部３１の下方、すなわち、基材ベース３２の上面３２Ａに細胞体２１や神経突起２２が入り込み可能に設定することが好ましい。例えば、凸部３１の高さは、通常の神経細胞２に対しては、０．１μｍ程度あれば充分にその効果を得ることは可能であるが、０．１μｍ以上の高さに形成することによって、凸部３１の効果をより明確にすることができる。
なお、凸部の高さ方向の形状は、特に限定されるものではなく、例えば、柱状、錐状、逆錐状等であってもよく、また、その外周部の形状や修飾等は、特に限定されるものではない。 The height of the convex portion 31 is preferably set so that the cell body 21 and the neurite 22 can enter the lower portion of the convex portion 31, that is, the upper surface 32 </ b> A of the base material base 32. For example, if the height of the convex portion 31 is about 0.1 μm for normal nerve cells 2, the effect can be sufficiently obtained, but the height of the convex portion 31 should be 0.1 μm or more. Thereby, the effect of the convex part 31 can be clarified more.
In addition, the shape in the height direction of the convex portion is not particularly limited, and may be, for example, a columnar shape, a cone shape, an inverted cone shape, etc. It is not limited.

また、基材ベース３２の底面から凸部３１の最上面３１Ａの高さまでの細胞培養基材３の厚さｌは、０．０１〜３ｍｍの範囲内であることが好ましく、外科手術等における使用のしやすさ等の点から、０．１〜１ｍｍの範囲内であるのがより好ましい。 In addition, the thickness l of the cell culture substrate 3 from the bottom surface of the substrate base 32 to the height of the uppermost surface 31A of the convex portion 31 is preferably within a range of 0.01 to 3 mm, and is used in surgery or the like. From the standpoint of ease of handling and the like, it is more preferable that the thickness is in the range of 0.1 to 1 mm.

凸部３１や基材ベース３２の上面３２Ａを含む細胞培養基材３の培養表面は、目的に応じて、様々な処理を施すことができる。
例えば、神経細胞２の接着性の制御や表面保護のためのタンパク質等の生体高分子、金属薄膜等による表面被覆、プラズマ処理やＵＶ照射、撥水処理剤、加熱等による親水・撥水化や、ヒドロキシル基、アミノ基、スルホン基、チオール基、カルボキシル基等特定の官能基付加、酸化剤等による表面粗化等から１種類以上の表面処理を施すことができる。特に凸部３１への神経細胞２の接着促進にはポリリジン、アルブミン、コラーゲン、フィブロネクチン、フィブリノーゲン、ビトロネクチン、ラミニン等のタンパク被覆が効果的である。
また、これらの表面修飾は、細胞培養基材３の表面全体に渡って施してもよいし、限定した領域であってもよい。例えば、一部の凸部３１と、その他の凸部３１とに対し、異なる表面修飾を施してもよいし、凸部３１と、それ以外の部位とに対し、異なる表面修飾を施してもよい。また、凸部３１の最上面３１Ａと、当該凸部３１の外周面とに対し、異なる表面修飾を施してもよい。 The culture surface of the cell culture substrate 3 including the convex portion 31 and the upper surface 32A of the substrate base 32 can be subjected to various treatments depending on the purpose.
For example, biopolymers such as proteins for controlling adhesion and protecting the surface of nerve cells 2, surface coating with metal thin films, etc., plasma treatment, UV irradiation, water repellent treatment, heating, etc. One or more types of surface treatments can be applied from addition of specific functional groups such as hydroxyl group, amino group, sulfone group, thiol group, carboxyl group, and surface roughening with an oxidizing agent. In particular, protein coating such as polylysine, albumin, collagen, fibronectin, fibrinogen, vitronectin, and laminin is effective for promoting adhesion of the nerve cell 2 to the convex portion 31.
These surface modifications may be applied over the entire surface of the cell culture substrate 3 or may be a limited region. For example, different surface modifications may be applied to some of the protrusions 31 and other protrusions 31, or different surface modifications may be applied to the protrusions 31 and other parts. . Further, different surface modifications may be applied to the uppermost surface 31 </ b> A of the convex portion 31 and the outer peripheral surface of the convex portion 31.

<<生体組織再生用材料の製造方法>>
次に、生体組織再生用材料１の製造方法を図面を参照して説明する。神経細胞２および細胞培養基材３を主に含んで構成される生体組織再生用材料１の製造方法は、細胞培養基材３の製造方法と、製造された細胞培養基材３に神経細胞２を培養する培養方法とを含んでいる。 << Manufacturing method for tissue regeneration material >>
Next, the manufacturing method of the biological tissue reproduction | regeneration material 1 is demonstrated with reference to drawings. The manufacturing method of the biological tissue regeneration material 1 mainly including the nerve cell 2 and the cell culture substrate 3 includes the method for manufacturing the cell culture substrate 3, and the cell culture substrate 3 thus manufactured includes the nerve cell 2. And a culture method for culturing the cells.

[細胞培養基材の製造方法]
まず、生体組織再生用材料１の製造方法における、細胞培養基材３の製造方法を図面を参照して説明する。
図３は、細胞培養基材３の製造方法の一例であるナノインプリント法による製造工程を説明するための図である。
まず、図３（ａ）に示すように、細胞培養基材３の原料である基材原料４と金型５を用意する。基材原料４は、前記した細胞培養基材３の主成分を含む材料であって、適宜副成分が混合されている。金型５の材質は、金属、カーボンやシリコン等の無機物、および樹脂組成物等から、基材原料４の材質や凸部３１の加工精度に応じて適切に選択される。金型５表面への金型凹部６の形成法は、切削加工、光リソグラフィ法、電子線直接描画法、粒子線ビーム加工法、走査プローブ加工法等の微細加工法や微粒子の自己組織化、又はこれらの手法によって形成されたマスタからのナノインプリント法、キャスト法、射出成型法に代表される成型加工法、めっき法等から適切に選択される。 [Method for producing cell culture substrate]
First, the manufacturing method of the cell culture substratum 3 in the manufacturing method of the biological tissue regeneration material 1 is demonstrated with reference to drawings.
FIG. 3 is a diagram for explaining a manufacturing process by the nanoimprint method, which is an example of a method for manufacturing the cell culture substrate 3.
First, as shown in FIG. 3A, a base material 4 and a mold 5 which are raw materials for the cell culture base material 3 are prepared. The base material 4 is a material containing the main components of the cell culture base 3 described above, and subcomponents are appropriately mixed. The material of the mold 5 is appropriately selected according to the material of the base material 4 and the processing accuracy of the convex portion 31 from metals, inorganic materials such as carbon and silicon, and resin compositions. The method of forming the mold recess 6 on the surface of the mold 5 includes cutting, photolithographic method, electron beam direct drawing method, particle beam beam processing method, scanning probe processing method and the like, and self-organization of fine particles, Alternatively, a nanoimprint method from a master formed by these methods, a casting method, a molding method represented by an injection molding method, a plating method, or the like is appropriately selected.

次に、図３（ｂ）に示すように、基材原料４の少なくとも表面を軟化し、金型凹部６が形成された金型５を押し付けることによって、金型凹部６の形状を基材原料４に転写する。
そして、図３（ｃ）に示すように、金型５を引き剥がすことによって、基材ベース３２の培養表面に凸部３１が一体的に形成された細胞培養基材３を得ることができる。 Next, as shown in FIG. 3B, at least the surface of the base material 4 is softened, and the mold 5 in which the mold recess 6 is formed is pressed to change the shape of the mold recess 6 to the base material. Transfer to 4.
And as shown in FIG.3 (c), the cell culture base material 3 by which the convex part 31 was integrally formed on the culture surface of the base material base 32 can be obtained by peeling off the metal mold | die 5. FIG.

そして、形成された凸部３１を含む細胞培養基材３の表面に対し、必要に応じて、浸漬法、スピンコート法、蒸着法、プラズマ重合法、インクジェット法、スクリーン印刷法のように新たに層を付加する手法や、加熱、光照射、電子線照射、プラズマ処理、浸漬処理等によって、表面修飾を施すこともできる。なお、この表面修飾処理は、凸部３１の形成後に限らず、例えば、形成前の基材原料４または金型凹部６の表面にあらかじめ表面処理を施し、凸部３１の形成と同時に凸部３１を含む細胞培養基材３の表面に修飾処理を施すこととしてもよい。 And, if necessary, the surface of the cell culture substrate 3 including the convex portions 31 is newly added as in the dipping method, spin coating method, vapor deposition method, plasma polymerization method, ink jet method, and screen printing method. Surface modification can also be performed by a method of adding a layer, heating, light irradiation, electron beam irradiation, plasma treatment, immersion treatment or the like. The surface modification treatment is not limited to after the formation of the convex portion 31, and for example, the surface treatment is performed on the surface of the base material 4 or the mold concave portion 6 before the formation, and the convex portion 31 is formed simultaneously with the formation of the convex portion 31. It is good also as performing a modification process on the surface of the cell culture substratum 3 containing.

なお、細胞培養基材３の製造方法は前記したナノインプリント法に限定されず、例えば、切削加工法や印刷法、イオンビーム加工法、電子ビーム加工法、レーザ加工法、光リソグラフィ法、キャスト法、射出成型法による加工法等から、基材原料４の材質や凸部３１の加工精度に応じて適切に選択される。また、キャスト法や射出成型法で製造する場合には、前記した形成法により形成した金型５を用いることができる。 In addition, the manufacturing method of the cell culture substrate 3 is not limited to the nanoimprint method described above. For example, the cutting method, the printing method, the ion beam processing method, the electron beam processing method, the laser processing method, the photolithographic method, the casting method, The material is appropriately selected depending on the material of the base material 4 and the processing accuracy of the convex portion 31 from a processing method by an injection molding method or the like. Moreover, when manufacturing by the casting method or the injection molding method, the metal mold | die 5 formed by the above-mentioned formation method can be used.

[神経細胞の培養方法]
次に、生体組織再生用材料１の製造方法における神経細胞２の培養方法を図面を参照して説明する。
本実施形態の神経細胞２の培養条件については、選択された神経細胞２に対応する従来公知の培養条件の中から、適宜適切な条件を適用することができる。この選択された神経細胞２に対応する培養条件は、当業者であれば、容易に選択し、選択した培養条件に基づいて培養を実施することができる。 [Neurocyte culture method]
Next, a method for culturing nerve cells 2 in the method for producing biological tissue regeneration material 1 will be described with reference to the drawings.
As for the culture conditions of the neuron 2 of the present embodiment, appropriate conditions can be appropriately applied from conventionally known culture conditions corresponding to the selected neuron 2. A person skilled in the art can easily select the culture conditions corresponding to the selected nerve cells 2 and perform the culture based on the selected culture conditions.

使用する培地は、神経細胞２の培養に適切とされる従来公知の組成のものでよく、例えば、製造メーカにより提供される神経細胞培養用の培地を使用することができる。このとき、培地には、神経細胞２の細胞培養基材３への定着（接着）補助を目的として、１０％程度のウシ胎児血清等の血清を添加してもよい。また、別途誘導物質や抑制物質等を添加してもよい。
ただし、本実施形態においては、細胞培養基材３による神経細胞２の成長形態の制御効果を明確に説明する必要性に鑑み、定着を除く培養中の培地には神経細胞２の成長形態を誘導・抑制する物質を特に含有していない培地で培養を行うことを前提として説明する。 The medium to be used may be of a conventionally known composition suitable for culturing nerve cells 2, and for example, a medium for culturing nerve cells provided by the manufacturer can be used. At this time, about 10% of serum such as fetal bovine serum may be added to the medium for the purpose of assisting the fixation (adhesion) of the nerve cells 2 to the cell culture substrate 3. In addition, an inducer or a suppressor may be added separately.
However, in the present embodiment, in view of the necessity of clearly explaining the control effect of the growth mode of the nerve cell 2 by the cell culture substrate 3, the growth mode of the nerve cell 2 is induced in the culture medium other than colonization. -It demonstrates on the assumption that it culture | cultivates with the culture medium which does not contain the substance to suppress in particular.

神経細胞２の培養に使用するインキュベータは、一般的な細胞の培養に使用するものと同様のＣＯ₂インキュベータを使用することができる。通常、ＣＯ₂インキュベータは、ＣＯ₂濃度５％、温度３７℃、相対湿度８０％に設定されている。 As the incubator used for culturing the nerve cell 2, a CO ₂ incubator similar to that used for culturing general cells can be used. Usually, the CO ₂ incubator is set to a CO ₂ concentration of 5%, a temperature of 37 ° C., and a relative humidity of 80%.

ここで、神経細胞２の培養手順を図４を参照しながら説明する。図４は、神経細胞２の培養手順を説明するための図であって、細胞培養基材３上で培養されている神経細胞を示す縦断面図である。
まず、細胞培養基材３を培養容器７内部に設置し、神経細胞２を培地８とともに培養容器７内部の細胞培養基材３上に播種する。このとき、細胞培養基材３の培養表面は培地８により浸漬され、培地８中の神経細胞２は、細胞培養基材３上へと沈降する。
そして、培地８および神経細胞２が播種された細胞培養基材３をＣＯ₂インキュベータ内で所定期間静置する。
この過程で、神経細胞２は、細胞培養基材３上に定着（接着）し、培養されるが、定着後には、所定の間隔毎に培地８を交換してもよい。培養に使用する培地８は、血清培地、無血清培地、サプリメントやサイトカイン添加培地でも良く、例えば、無血清培地の場合、１日もしくは２日毎に培地８を交換することが好適である。
そして、前記所定期間経過後、神経細胞２の観察や使用を行う。この所定期間は、特に限定されるものではなく、所望する神経細胞２の成長形態に対応して延長または短縮して調節することができるが、特に、１時間以上、３０日以下であることが好ましい。
なお、本実施形態においては、例えば、播種７日後に神経細胞２の成長形態の検証等を行っている。 Here, the culture procedure of the nerve cell 2 will be described with reference to FIG. FIG. 4 is a view for explaining the culture procedure of the nerve cell 2 and is a longitudinal sectional view showing the nerve cell cultured on the cell culture substrate 3.
First, the cell culture substrate 3 is placed inside the culture vessel 7, and the nerve cells 2 are seeded on the cell culture substrate 3 inside the culture vessel 7 together with the medium 8. At this time, the culture surface of the cell culture substrate 3 is immersed in the medium 8, and the nerve cells 2 in the medium 8 settle onto the cell culture substrate 3.
Then, the cell culture substrate 3 seeded with the culture medium 8 and the nerve cells 2 is allowed to stand for a predetermined period in a CO ₂ incubator.
In this process, the nerve cells 2 are fixed (adhered) on the cell culture substrate 3 and cultured, but after the fixation, the medium 8 may be replaced at predetermined intervals. The medium 8 used for the culture may be a serum medium, a serum-free medium, a supplement or a cytokine-added medium. For example, in the case of a serum-free medium, it is preferable to change the medium 8 every day or every two days.
Then, after the predetermined period has elapsed, the neuron 2 is observed and used. The predetermined period is not particularly limited, and can be adjusted by extending or shortening according to the growth form of the desired nerve cell 2, but it is particularly preferably 1 hour or more and 30 days or less. preferable.
In the present embodiment, for example, the growth form of the nerve cell 2 is verified seven days after sowing.

以上、本実施形態に係る神経細胞２の培養方法を説明したが、細胞培養基材３に形成される凸部３１の相当直径ｒおよび間隔ｇを様々に規定することにより、神経細胞の成長形態を多様に制御することができる。
ここで、凸部３１の相当直径ｒおよび間隔ｇを規定した３種類の細胞培養基材３を使用して、神経細胞２を３通りに制御した場合の３つの実施形態例を、図面を参照して詳細に説明する。 As described above, the method for culturing the nerve cell 2 according to the present embodiment has been described, but the growth mode of the nerve cell can be determined by variously defining the equivalent diameter r and the interval g of the convex portion 31 formed on the cell culture substrate 3. Can be controlled in various ways.
Here, referring to the drawings, three exemplary embodiments in which the nerve cells 2 are controlled in three ways using the three types of cell culture substrate 3 in which the equivalent diameter r and interval g of the convex portion 31 are defined. And will be described in detail.

[実施形態例１]
図５は、実施形態例１の神経細胞２の培養方法を説明するための図である。なお、図５において、培養容器７と培地８は省略している。
図５に示すように、実施形態例１で用いる細胞培養基材３は、培養表面に形成された凸部３１の相当直径ｒおよび凸部３１間の間隔ｇが、培養する神経細胞２の直径、および神経細胞２から伸長する神経突起２２の直径よりも小さく形成されている。
このように構成された細胞培養基材３を用いて培養することにより、神経細胞２の細胞体２１は、凸部３１のない平坦な基板上における培養時に比べて平坦化し、直径が大きくなる。また、神経細胞２から伸長する神経突起２２は、凸部３１の頂点に沿って伸長し、直径が大きく、分岐数が多くなる。 [Example 1]
FIG. 5 is a diagram for explaining a method of culturing the nerve cell 2 according to the first embodiment. In FIG. 5, the culture vessel 7 and the culture medium 8 are omitted.
As shown in FIG. 5, the cell culture substrate 3 used in the first embodiment has an equivalent diameter r of the convex portions 31 formed on the culture surface and an interval g between the convex portions 31 such that the diameter of the nerve cells 2 to be cultured. , And smaller than the diameter of the neurite 22 extending from the nerve cell 2.
By culturing using the cell culture substrate 3 configured as described above, the cell body 21 of the nerve cell 2 becomes flatter and has a larger diameter than when cultured on a flat substrate without the convex portion 31. Further, the neurite 22 extending from the nerve cell 2 extends along the apex of the convex portion 31, has a large diameter, and increases the number of branches.

ここで、実施形態例１で用いる細胞培養基材３の表面における所定の凸部３１から構成される制御領域を、領域１と記載する。すなわち、図５に示す領域１で神経細胞２を培養することによって、神経細胞２と凸部３１との密着を強め、神経細胞２の神経突起２２の太さを太く、かつ、前記神経突起２２の分岐数を多くする制御を行いつつ、神経細胞２を培養することができる。 Here, the control area | region comprised from the predetermined convex part 31 in the surface of the cell culture substratum 3 used in Embodiment Example 1 is described as the area | region 1. FIG. That is, by culturing the nerve cell 2 in the region 1 shown in FIG. 5, the adhesion between the nerve cell 2 and the convex portion 31 is strengthened, the thickness of the neurite 22 of the nerve cell 2 is increased, and the neurite 22 The nerve cell 2 can be cultured while performing control to increase the number of branches.

[実施形態例２]
図６は、実施形態例２の神経細胞２の培養方法を説明するための図である。なお、図６において、培養容器７と培地８は省略している。
図６に示すように、実施形態例２で用いる細胞培養基材３は、培養表面に形成された凸部３１の相当直径ｒおよび凸部３１間の間隔ｇが培養する神経細胞２の直径よりも小さく、かつ、凸部３１間の間隔ｇが神経細胞２から伸長する神経突起２２の直径よりも大きく形成されている。
このように構成された細胞培養基材３を用いて培養することにより、神経細胞２から伸長する神経突起２２は、凸部３１の間隔に沿って、凸部３１の配列している方向に沿って伸長し、凸部３１のない平坦な基板上での培養に比べると長くなる。
ここで、実施形態例２で用いる細胞培養基材３の表面における所定の凸部３１から構成される制御領域を、領域２と記載する。すなわち、図６に示す領域２で神経細胞２を培養することによって、神経細胞２を萎縮させ、神経細胞２から伸長する神経突起２２の伸長方向を制御しつつ、神経細胞２を培養することが可能となる。 [Embodiment 2]
FIG. 6 is a diagram for explaining a method for culturing nerve cells 2 according to the second embodiment. In FIG. 6, the culture vessel 7 and the culture medium 8 are omitted.
As shown in FIG. 6, the cell culture substrate 3 used in Embodiment 2 has an equivalent diameter r of the convex portions 31 formed on the culture surface and an interval g between the convex portions 31 from the diameter of the nerve cells 2 to be cultured. And the gap g between the convex portions 31 is formed larger than the diameter of the neurite 22 extending from the nerve cell 2.
By culturing using the cell culture substrate 3 configured in this way, the neurites 22 extending from the nerve cells 2 follow the direction in which the convex portions 31 are arranged along the intervals of the convex portions 31. It becomes longer than the culture on a flat substrate without the convex portion 31.
Here, the control region constituted by the predetermined convex portion 31 on the surface of the cell culture substrate 3 used in the second embodiment is referred to as a region 2. That is, by culturing the neuron 2 in the region 2 shown in FIG. 6, the neuron 2 can be cultivated, and the neuron 2 can be cultured while controlling the extension direction of the neurite 22 extending from the neuron 2. It becomes possible.

[実施形態例３]
図７は、実施形態例３の神経細胞の培養方法を説明するための図である。なお、図７において、培養容器７と培地８は省略している。
図７に示すように、実施形態例３で用いる細胞培養基材３は、表面に形成された凸部３１の相当直径ｒが神経細胞２の直径よりも小さく、凸部３１間の間隔ｇが神経細胞２の直径の０．４倍から２倍までになるように形成されている。
このように構成された細胞培養基材３を用いて培養することにより、神経細胞２からの神経突起２２の伸長が阻害され、細胞体２１は萎縮する。
ここで、実施形態例３で用いる細胞培養基材３の表面における所定の凸部３１から構成される制御領域を、領域３と記載する。すなわち、図７に示す領域３で神経細胞２を培養することによって、神経細胞２の成長を抑制（または停止）しつつ、神経細胞２を培養することが可能となる。 [Example 3]
FIG. 7 is a diagram for explaining the nerve cell culturing method according to the third embodiment. In FIG. 7, the culture vessel 7 and the culture medium 8 are omitted.
As shown in FIG. 7, the cell culture substrate 3 used in Embodiment 3 has an equivalent diameter r of the convex portion 31 formed on the surface smaller than the diameter of the nerve cell 2, and an interval g between the convex portions 31 is. It is formed to be 0.4 to 2 times the diameter of the nerve cell 2.
By culturing using the cell culture substrate 3 configured as described above, the extension of the neurite 22 from the nerve cell 2 is inhibited, and the cell body 21 is atrophied.
Here, a control region constituted by the predetermined convex portion 31 on the surface of the cell culture substrate 3 used in Embodiment 3 is referred to as a region 3. That is, by culturing the nerve cell 2 in the region 3 shown in FIG. 7, it is possible to culture the nerve cell 2 while suppressing (or stopping) the growth of the nerve cell 2.

[領域１〜３の組み合わせ等]
前記した実施形態例１〜実施形態例３で示した神経細胞の培養方法は、それぞれ適用する培養条件は同じであって、用いる細胞培養基材３のみが異なるため、それぞれの細胞培養基材３を一つの培養容器７に配設することによって、同時に適用することができる。すなわち、２以上の制御領域を有する細胞培養基材３を用いて、神経細胞２を培養する神経細胞２の培養方法および細胞培養基材３が提供される。
ここで、図８〜図１０は、領域１〜領域３と、任意の領域である領域４とを組み合わせて形成した細胞培養基材３の上面図である。 [Combination of areas 1 to 3]
Since the culture conditions of the nerve cells shown in the above-described Embodiment 1 to Embodiment 3 are the same as each other and only the cell culture substrate 3 to be used is different, each cell culture substrate 3 Can be applied simultaneously by arranging them in one culture vessel 7. That is, a method for culturing nerve cells 2 and a cell culture substrate 3 for culturing nerve cells 2 using a cell culture substrate 3 having two or more control regions are provided.
Here, FIGS. 8 to 10 are top views of the cell culture substrate 3 formed by combining the regions 1 to 3 and the region 4 which is an arbitrary region.

具体的には、図８に示すように、領域１を領域３で囲んだ細胞培養基材３を形成することができる。図８の細胞培養基材３を用いる神経細胞２の培養方法によれば、細胞培養基材３の中央部に限定して、太い神経突起２２と大きい細胞体２１を有する神経細胞２を培養することができる。 Specifically, as shown in FIG. 8, a cell culture substrate 3 in which the region 1 is surrounded by the region 3 can be formed. According to the method for culturing nerve cells 2 using the cell culture substrate 3 of FIG. 8, the nerve cells 2 having the thick neurites 22 and the large cell bodies 21 are cultured only in the central part of the cell culture substrate 3. be able to.

また、図９に示すように、領域２を領域３で囲んだ細胞培養基材３を形成することができる。図９の細胞培養基材３を用いる神経細胞２の培養方法によれば、中央に限定して格子状の神経ネットワークを形成することができる。 In addition, as shown in FIG. 9, a cell culture substrate 3 in which the region 2 is surrounded by the region 3 can be formed. According to the method for culturing nerve cells 2 using the cell culture substrate 3 of FIG. 9, a lattice-like nerve network can be formed only at the center.

また、図１０に示すように、領域３で分離された２つの部位を持つ細胞培養基材３を形成することができる。図１０において、任意の領域である領域４は、領域１、領域２のいずれの領域であってもよく、また、凸部３１が形成されない平坦な領域であってもよい。さらには、領域４は、例えば、特表平１０−５０００３１号公報に記載の溝からなる構造であってもよい。図１０の細胞培養基材３を用いる神経細胞２の培養方法によれば、領域３は外部から伸長してくる神経突起２２は妨げないために、分離された２つの領域（領域４と領域４）に位置する神経細胞２同士を、それぞれの神経細胞２から伸長した神経突起２２のみで繋ぐことができる。 Moreover, as shown in FIG. 10, the cell culture substrate 3 having two parts separated in the region 3 can be formed. In FIG. 10, the region 4 which is an arbitrary region may be either the region 1 or the region 2, or may be a flat region where the convex portion 31 is not formed. Furthermore, the region 4 may have a structure including grooves described in Japanese Patent Application Laid-Open No. 10-500031, for example. According to the culture method of the nerve cell 2 using the cell culture substrate 3 of FIG. 10, since the region 3 does not interfere with the neurite 22 extending from the outside, the two separated regions (region 4 and region 4) are separated. 2) can be connected only by the neurites 22 extended from the respective neurons 2.

<<細胞培養基材の形状に関する変形例>>
以下に、本実施形態の細胞培養基材３の形状に関する変形例を示す。
細胞培養基材３の形状は、図１で示した単層のシート状のものに限定されず、例えば、曲面を有する形状としたり、球形、柱形、積層体、筒状等の立体的な形状としたりすることができる。また、一旦、神経細胞２を細胞培養基材３で培養した後に、積層や曲げ加工等によって立体的な形状に加工することもできる。
また、培養表面も、図１で示した細胞培養基材３の上面側に限定されるものではなく、例えば、下面側、側面側、内面側、これらの組み合わせ等、所望する神経細胞２の配置に応じて、培養表面の位置を適宜変更することができる。
以下、図面を参照して、具体的な細胞培養基材３の形状に関する変形例の説明をする。 << Modified examples of cell culture substrate shape >>
Below, the modification regarding the shape of the cell culture substratum 3 of this embodiment is shown.
The shape of the cell culture substrate 3 is not limited to the single-layer sheet-like shape shown in FIG. 1. For example, the cell culture substrate 3 has a curved shape, a three-dimensional shape such as a spherical shape, a columnar shape, a laminated body, and a cylindrical shape. Or shape. Alternatively, once the nerve cells 2 are cultured on the cell culture substrate 3, they can be processed into a three-dimensional shape by lamination or bending.
Further, the culture surface is not limited to the upper surface side of the cell culture substrate 3 shown in FIG. 1, and for example, the arrangement of desired nerve cells 2 such as the lower surface side, the side surface side, the inner surface side, or a combination thereof. Depending on the situation, the position of the culture surface can be appropriately changed.
Hereinafter, with reference to drawings, the modification regarding the shape of the specific cell culture substratum 3 is demonstrated.

[変形例１：積層体]
図１１は、積層体として形成された細胞培養基材３の概略構成を示す斜視図である。
図１１に示すように、細胞培養基材３は、図１を参照して説明した単層シート状の細胞培養基材３を積層した構成となっている。そして、各層の上面側は培養表面となっており、複数の凸部３１が形成されている。また、各層の縁部は、スペーサ３Ａを介して連結している。
細胞培養基材３を積層体とする際には、積層体の縁部に対して開口している部位と封止される部位とを形成することができる。また、積層体の形態は表面に神経細胞２の直径より小さい凸部３１が形成できるならば特に制限されず、例えば、前記したような主成分からなるフィルム、シート、マット、スポンジ等を用いて積層したもの等を挙げることができる。積層体の厚さは、０．０１〜３ｍｍの範囲内であることが好ましく、外科手術等における使用のしやすさ等の点から、０．１〜１ｍｍの範囲内であるのがより好ましい。また、積層体の面積等は特に制限されず、用途、患部の状態、外科手術の方法等に応じて種々調節することができる。 [Modification 1: Laminate]
FIG. 11 is a perspective view showing a schematic configuration of the cell culture substrate 3 formed as a laminate.
As shown in FIG. 11, the cell culture substrate 3 has a structure in which the single-layer sheet-shaped cell culture substrate 3 described with reference to FIG. 1 is laminated. And the upper surface side of each layer is a culture | cultivation surface, and the some convex part 31 is formed. Moreover, the edge part of each layer is connected via the spacer 3A.
When the cell culture substrate 3 is used as a laminate, it is possible to form a portion that is open to the edge of the laminate and a portion that is sealed. Further, the shape of the laminate is not particularly limited as long as the convex portion 31 smaller than the diameter of the nerve cell 2 can be formed on the surface, and for example, using a film, sheet, mat, sponge, or the like composed of the main component as described above. A laminated layer can be used. The thickness of the laminate is preferably in the range of 0.01 to 3 mm, and more preferably in the range of 0.1 to 1 mm from the viewpoint of ease of use in surgery and the like. The area of the laminate is not particularly limited, and can be variously adjusted according to the use, the state of the affected area, the surgical method, and the like.

[変形例２：筒状]
図１２は、筒状として形成された細胞培養基材３の概略構成を示す斜視図である。図１２に示すように、細胞培養基材３は、図１を参照して説明した単層シート状の細胞培養基材３の一組の対向する二辺３Ｂを接続して筒状とした構成となっている。
細胞培養基材３を筒状とする際には、両側の端部３Ｃ，３Ｃが開口していることが好ましい。また、チューブの形態は表面に神経細胞２の直径より小さい凸部３１が形成できるならば特に制限されず、例えば、前記したような主成分からなるフィルム、シート、マット、スポンジ等を用いて管状に形成したもの等を挙げることができる。チューブの内径は、０．２〜１０ｍｍの範囲内であることが好ましく、外科手術等における使用のしやすさ等の点から、１〜１０ｍｍの範囲内であるのがより好ましい。チューブの厚さ、長さ等は特に制限されず、用途、患部の状態、外科手術の方法等に応じて種々調節することができる。
また、筒状に形成された細胞培養基材３の一端から他端まで心材を挿通し、細胞培養基材３の強度を補強する構成としてもよい。 [Modification 2: Tubular]
FIG. 12 is a perspective view showing a schematic configuration of the cell culture substrate 3 formed in a cylindrical shape. As shown in FIG. 12, the cell culture substrate 3 has a cylindrical configuration by connecting a pair of two opposite sides 3B of the single-layer sheet-shaped cell culture substrate 3 described with reference to FIG. It has become.
When the cell culture substrate 3 is formed into a cylindrical shape, it is preferable that both end portions 3C and 3C are open. The shape of the tube is not particularly limited as long as the convex portion 31 smaller than the diameter of the nerve cell 2 can be formed on the surface. For example, the tube is tubular using a film, sheet, mat, sponge, or the like composed of the main component as described above. Can be mentioned. The inner diameter of the tube is preferably in the range of 0.2 to 10 mm, and more preferably in the range of 1 to 10 mm from the viewpoint of ease of use in surgery and the like. The thickness, length, etc. of the tube are not particularly limited, and can be variously adjusted according to the use, the state of the affected part, the method of surgery, and the like.
Moreover, it is good also as a structure which reinforces the intensity | strength of the cell culture substratum 3 by inserting a heart material from the one end to the other end of the cell culture substratum 3 formed in the cylinder shape.

<<その他>>
以上、本実施形態によれば、次のような効果を得ることができる。
生体組織再生用材料１を、細胞培養基材３と、細胞培養基材３により培養された神経細胞２とを一体に構成したことにより、再生治療に供する際に移植される神経細胞２の形態を保持し、組織に定着するまでの間は外力から保護することができる。 << Other >>
As described above, according to the present embodiment, the following effects can be obtained.
The form of the nerve cell 2 transplanted when the material for biological tissue regeneration 1 is provided with the cell culture substrate 3 and the nerve cell 2 cultured with the cell culture substrate 3 when the material is used for regenerative treatment. And can be protected from external force until it is fixed to the tissue.

また、所望する神経細胞２の成長形態に応じて、細胞培養基材３の培養表面に形成する凸部３１の形状を適宜規定することができる。従来、このように細胞形状を変化させるには特定のサイトカイン等の試薬添加が必要であったが、本実施形態においてはこのような試薬添加が不要であり、試薬の副次的な効果を考慮に入れる必要が無い。また、本実施形態を適用することにより、細胞培養基材３上に局所的に異なる効果を有する処理を実現できるために、神経細胞２の成長形態の複雑かつ高次な制御に適用することができる。 Moreover, the shape of the convex part 31 formed in the culture | cultivation surface of the cell culture substratum 3 can be prescribed | regulated suitably according to the growth form of the nerve cell 2 desired. Conventionally, in order to change the cell shape as described above, it is necessary to add a reagent such as a specific cytokine. However, in this embodiment, such a reagent is not necessary, and a secondary effect of the reagent is considered. There is no need to put it in. In addition, by applying this embodiment, processing having locally different effects on the cell culture substrate 3 can be realized, so that it can be applied to complicated and higher-order control of the growth form of the nerve cell 2. it can.

また、細胞培養基材３を生分解性物質により構成することで、生体組織の再生後に細胞培養基材を体内で分解することができ、移植した細胞の組織への一体化に寄与することができる。さらに、細胞培養基材３を生分解性物質により構成することで、細胞培養基材３に神経細胞２の誘導物質や抑制物質等の副成分を含浸させ、細胞培養基材３の分解とともに副成分を徐々に放出させることができる。その結果、神経細胞２の成長形態の制御を、凸部３１の形状や間隔で行うのと並行して、副成分の放出により行うことができる。 Further, by configuring the cell culture substrate 3 with a biodegradable substance, the cell culture substrate can be decomposed in the body after regeneration of the living tissue, which contributes to the integration of the transplanted cells into the tissue. it can. Furthermore, by constituting the cell culture substrate 3 with a biodegradable substance, the cell culture substrate 3 is impregnated with subcomponents such as inducers and inhibitors of nerve cells 2, and the cell culture substrate 3 is decomposed along with the decomposition. The ingredients can be released gradually. As a result, the growth mode of the nerve cell 2 can be controlled by releasing subcomponents in parallel with the shape and interval of the convex portions 31.

以上のことから、本実施形態の生体組織再生用材料１は、神経の再生に好適に用いることができる。すなわち、本実施形態の生体組織再生用材料１によれば、例えば、アルツハイマー症、パーキンソン症、ハンチントン症、筋萎縮性側索硬化症等の中枢神経疾患や、末梢神経における障害を包含する神経疾患の治療に好適に利用できる。また、例えば、脊椎疾患、頭部外傷や卒中等の脳血管疾患のような外傷性疾患に対しても有効である。 From the above, the biological tissue regeneration material 1 of the present embodiment can be suitably used for nerve regeneration. That is, according to the biological tissue regeneration material 1 of the present embodiment, for example, central nervous diseases such as Alzheimer's disease, Parkinsonism, Huntington's disease, amyotrophic lateral sclerosis, and neurological diseases including disorders in peripheral nerves It can utilize suitably for the treatment of this. It is also effective for traumatic diseases such as spinal diseases, cerebrovascular diseases such as head trauma and stroke.

なお、本発明は前記実施形態に限定されるものではなく、その技術思想のおよぶ範囲で様々の変更実施を行うことができる。
例えば、本発明は、本発明の生体適合性材料を神経疾患を有する動物に移植する工程を含む神経疾患を有する動物の治療方法も包含する。この場合の動物とは、当該動物に移植可能な神経細胞を入手可能な動物であれば特に限定されるものではなく、ヒト、家畜（ブタ、ウシ、ウマ等）、ペット用哺乳類（イヌ、ネコ等）、両生類、鳥類等種々の動物が挙げられる。 In addition, this invention is not limited to the said embodiment, A various change implementation can be performed in the range which the technical idea covers.
For example, the present invention also includes a method for treating an animal having a neurological disease comprising the step of transplanting the biocompatible material of the present invention into an animal having a neurological disease. The animal in this case is not particularly limited as long as it can obtain nerve cells that can be transplanted into the animal. Humans, domestic animals (pigs, cows, horses, etc.), pet mammals (dogs, cats) Etc.), amphibians, birds and the like.

また、本実施形態においては、細胞培養基材３に複数の凸部３１を形成することによって神経細胞２の成長形態を制御する構成としたが、細胞培養基材３に複数の凹部、または、凸部３１と凹部とを組み合わせた凹凸構造を形成することによって神経細胞２の成長形態を制御することも可能である。 Moreover, in this embodiment, although it was set as the structure which controls the growth form of the nerve cell 2 by forming the several convex part 31 in the cell culture base material 3, a several recessed part or the cell culture base material 3 or It is also possible to control the growth form of the nerve cell 2 by forming a concavo-convex structure combining the convex portion 31 and the concave portion.

次に、本発明のより具体的な例を実施例によって説明する。 Next, more specific examples of the present invention will be described by way of examples.

[実施例１]
実施例１は、細胞培養基材３に形成される凸部３１の相当直径および間隔と、神経細胞２の成長形態の制御効果との関係を検証した実施例である。
（１）細胞培養基材３の製造
図１２は、実施例１で作成した細胞培養基材３の上面図である。
細胞培養基材３の原料である基材原料４は、分子量85,000-160,000のポリ−L−乳酸（シグマ・アルドリッチ・ジャパン製）の厚み０．２ｍｍのシートである。
また、凸部３１の成形に用いた金型５の材質は、結晶方位（１００）、２０ｍｍ角、厚み０．７ｍｍの単結晶シリコンであって、金型凹部６は、光リソグラフィ法によって形成されたものである。 [Example 1]
Example 1 is an example in which the relationship between the equivalent diameter and interval of the convex portions 31 formed on the cell culture substrate 3 and the effect of controlling the growth form of the nerve cells 2 was verified.
(1) Production of Cell Culture Substrate 3 FIG. 12 is a top view of the cell culture substrate 3 created in Example 1. FIG.
The base material 4 which is a raw material of the cell culture base material 3 is a sheet of 0.2-mm thick poly-L-lactic acid (manufactured by Sigma Aldrich Japan) having a molecular weight of 85,000-160,000.
The material of the mold 5 used for forming the convex portion 31 is single crystal silicon having a crystal orientation (100), a 20 mm square, and a thickness of 0.7 mm. The mold concave portion 6 is formed by photolithography. It is a thing.

そして、基材原料４を１２０℃に加熱して表面を軟化し、図１１に示す基材表面（凸部３１）に対応する金型凹部６が表面に形成された金型５を、５．０ＭＰａ程度の圧力で押し付けた。このプレス工程によって、金型凹部６に基材原料４を充填した。その後、１０℃まで冷却し、金型５を離すことによって、図１２に示す基材表面（凸部３１）を形成した細胞培養基材３を得ることができた。
引き続いて、細胞培養基材３をエタノール中に浸漬して乾燥し、３時間のＵＶ滅菌を施した後にポリリジン溶液（５０ｍｇ／０．１Ｍホウ酸水溶液、ｐＨ＝８．３）に１時間浸漬後に純水で洗浄することによってポリリジンを凸部３１上を含む細胞培養基材３へ被覆した。以上の工程により、実施例１で用いる細胞培養基材３が作成された。
図１２に示すように、この細胞培養基材３には、所定の凸部３１から構成される１６箇所の制御領域が形成されている。各領域の大きさは３ｍｍ角である。各領域内において凸部３１は、２次元正方格子状に配列している。
凸部３１の高さは全て１μｍであるが、凸部３１の直径ｒは０．２５μｍから２５．０μｍに、凸部３１間の間隔ｇは直径ｒと同じ値の領域と２倍の値とした領域とを形成した。
ここで、実施例１で形成した細胞培養基材３上に形成した凸部３１の相当直径ｒと凸部３１間の間隔ｇの一覧を表１に示す。 Then, the base material 4 is heated to 120 ° C. to soften the surface, and the mold 5 in which the mold concave portion 6 corresponding to the base material surface (convex portion 31) shown in FIG. It pressed with the pressure of about 0 MPa. By this pressing step, the base material 4 was filled in the mold recess 6. Then, it cooled to 10 degreeC and the cell culture substratum 3 which formed the base-material surface (convex part 31) shown in FIG.
Subsequently, the cell culture substrate 3 was immersed in ethanol, dried, subjected to UV sterilization for 3 hours, and then immersed in a polylysine solution (50 mg / 0.1 M boric acid aqueous solution, pH = 8.3) for 1 hour. The cell culture substrate 3 including the convex portion 31 was coated with polylysine by washing with pure water. Through the above steps, the cell culture substrate 3 used in Example 1 was prepared.
As shown in FIG. 12, the cell culture substrate 3 has 16 control regions formed of predetermined convex portions 31. The size of each region is 3 mm square. Within each region, the protrusions 31 are arranged in a two-dimensional square lattice.
The heights of the convex portions 31 are all 1 μm, but the diameter r of the convex portions 31 is changed from 0.25 μm to 25.0 μm, and the interval g between the convex portions 31 is an area having the same value as the diameter r and a double value. And formed a region.
Here, Table 1 shows a list of the equivalent diameter r of the convex portion 31 formed on the cell culture substrate 3 formed in Example 1 and the interval g between the convex portions 31.

（２）マウス神経細胞の取得および増殖
まず、実施例１において使用した神経細胞２の調製手順を以下に示す。
妊娠１４日目のマウスから胎児を取り出し脳を摘出した。さらに，大脳半球から大脳皮質のみを分離して、その組織片を培地（Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ（ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）、２−Ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌ（ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ））６が入っている１５ｍｌチューブに集め、先をバーナーの火で丸めたパスツールピペットを使いピペッティングによって細胞を分散させた。その後、血球計算盤を使用して細胞数を計測し、トリパンブルー（ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）染色によって適正なＶｉａｂｉｌｉｔｙを有していることを確認した。
実施例１で得られたポリリジンコート済みの細胞培養基材３を細胞培養用シャーレ等の培養容器７内に配置し、この上に胎生１４日目のマウス大脳皮質組織から採取した神経細胞２を２．０×１０⁴／ｃｍ²の密度に播種した。培地８は培養１日目のみ血清培地（Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ、１０％ＦＢＳ（ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）、５５μＭ２−Ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌ）を使用し、細胞が定着した培養２日目以降は無血清培地（Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ、Ｂ２７ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）、５５ｍＭ２−Ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌ）を用いた。培養はＣＯ₂インキュベータ内（ＣＯ₂濃度５％、温度３７℃、相対湿度８０％）で行った。７日間培養後に、細胞培養基材３に接着した神経細胞２の形状を倒立顕微鏡および走査電子顕微鏡観察によって評価した。 (2) Acquisition and proliferation of mouse neurons First, the procedure for preparing the neurons 2 used in Example 1 is shown below.
The fetus was removed from the mouse on the 14th day of pregnancy and the brain was removed. Further, only the cerebral cortex was separated from the cerebral hemisphere, and the tissue pieces were collected in a 15 ml tube containing medium (Opti-MEM (Invitrogen Corporation), 2-Mercaptoethanol (Invitrogen Corporation)) 6, and the tip was burned by a burner. Cells were dispersed by pipetting using a Pasteur pipette rounded at. Thereafter, the number of cells was counted using a hemocytometer, and it was confirmed by Trypan Blue (Invitrogen Corporation) staining that it had appropriate Viability.
The cell culture substrate 3 coated with polylysine obtained in Example 1 is placed in a culture vessel 7 such as a petri dish for cell culture, on which neuronal cells 2 collected from mouse cerebral cortex tissue on the 14th day of embryogenesis are placed. Seeding to a density of 2.0 × 10 ⁴ / cm ² . The culture medium 8 was a serum medium (Opti-MEM, 10% FBS (Invitrogen Corporation), 55 μM 2-Mercaptoethanol) only on the first day of culture, and serum-free medium (Opti-MEM, B27 supplement (Invitrogen Corporation), 55 mM 2-Mercaptoethanol) was used. The culture was performed in a CO ₂ incubator (CO ₂ concentration 5%, temperature 37 ° C., relative humidity 80%). After culturing for 7 days, the shape of the nerve cell 2 adhered to the cell culture substrate 3 was evaluated by observation with an inverted microscope and a scanning electron microscope.

実施例１の領域ａ〜ｐに関し、それぞれ、細胞体２１の形状（表２では細胞体形状と記載）、１細胞あたりの神経突起２２の数（総数）、１細胞あたりの神経突起２２の分岐数（分岐数）、神経突起２２の長さ平均値（長さ）、神経突起２２の太さ平均値（太さ）、神経突起２２の伸長方向の配向率（配向率）、を評価した。
なお、伸長方向の配向率は、全ての神経突起数に対し、直進的に延伸する神経突起数の割合とした。
比較例として、凸部３１のない平坦なポリスチレンシャーレ上に神経細胞２を播種し、同じ条件で培養したものを評価した。
各評価結果を表２に示す。 Regarding the regions a to p of Example 1, the shape of the cell body 21 (described as the cell body shape in Table 2), the number of neurites 22 per cell (total number), and the branching of the neurites 22 per cell The number (the number of branches), the length average value (length) of the neurite 22, the thickness average value (thickness) of the neurite 22, and the orientation ratio (orientation ratio) of the neurite 22 in the extension direction were evaluated.
In addition, the orientation rate in the extending direction was the ratio of the number of neurites extending straight to the total number of neurites.
As a comparative example, nerve cells 2 were seeded on a flat polystyrene dish having no convex portion 31 and cultured under the same conditions.
Each evaluation result is shown in Table 2.

表２に示すように、領域ａ、領域ｂ、領域ｉでは、細胞体２１が扁平状となった。神経突起２２は凸部３１の上を伝って多数分岐しながら伸長し、その太さは平坦な基材上での培養時に比べると大きい値を示した。通常のマウス神経細胞においては神経細胞２の直径（細胞体２１の直径）は２〜２０μｍであり、その神経突起２２の直径は０．３〜１．０μｍである。これらの領域では凸部３１の直径ｒ、および凸部３１間の間隔ｇが神経細胞２の直径、神経突起２２の直径よりも小さい値となっている。このように凸部３１を形成することよって、実施形態例１で示したように神経細胞２の成長形態を制御できることが示された。 As shown in Table 2, in the region a, the region b, and the region i, the cell body 21 was flat. The neurite 22 extended along the convex part 31 while branching many, and the thickness showed a large value compared with the time of culture | cultivation on a flat base material. In a normal mouse nerve cell, the diameter of the nerve cell 2 (the diameter of the cell body 21) is 2 to 20 μm, and the diameter of the neurite 22 is 0.3 to 1.0 μm. In these regions, the diameter r of the convex portion 31 and the interval g between the convex portions 31 are smaller than the diameter of the nerve cell 2 and the diameter of the neurite 22. It was shown that by forming the convex portion 31 in this way, the growth form of the nerve cell 2 can be controlled as shown in the first embodiment.

領域ｃ、領域ｄ、領域ｅ、領域ｋ、領域ｌでは、細胞体２１が扁平状となった。しかし、神経突起２２の分岐数は平坦な基材上での培養時に比べると少なく、神経突起２２は分岐を抑えて成長方向を凸部３１の間を、凸部３１の配列方向に合わせて直線状に長く伸長した。前記したように通常のマウス神経細胞においては神経細胞２の直径は２〜２０μｍであり、その神経突起２２の直径は０．３〜１．０μｍである。これらの領域では凸部３１の直径ｒおよび間隔ｇが神経細胞２の直径よりも小さく、かつ、間隔ｇが伸長する神経突起２２の直径よりも大きい値となっている。このように凸部３１を形成することよって、実施形態例２で示したように神経細胞２の成長形態を制御できることが示された。 In the region c, the region d, the region e, the region k, and the region 1, the cell body 21 was flat. However, the number of branches of the neurite 22 is smaller than that when cultivating on a flat substrate, and the neurite 22 is straightened by suppressing branching so that the growth direction is between the protrusions 31 and the arrangement direction of the protrusions 31. It stretched long. As described above, in the normal mouse nerve cell, the diameter of the nerve cell 2 is 2 to 20 μm, and the diameter of the neurite 22 is 0.3 to 1.0 μm. In these regions, the diameter r and the interval g of the convex portion 31 are smaller than the diameter of the nerve cell 2 and larger than the diameter of the neurite 22 where the interval g extends. It was shown that by forming the convex portion 31 in this way, the growth form of the nerve cell 2 can be controlled as shown in the second embodiment.

領域ｆ、領域ｇ、領域ｍ、領域ｎでは、細胞体２１が萎縮して通常時よりも小さい球形となった。神経突起２２は成長が抑制され、分岐数と長さは平坦な基材上での培養時に比べると小さい値となった。前記したように通常のマウス神経細胞においては神経細胞２の直径は２〜２０μｍであり、その神経突起２２の直径は０．３〜１．０μｍである。これらの領域では凸部３１の直径ｒが神経細胞２の直径よりも小さく、間隔ｇが神経細胞２の直径の０．４倍から２．０倍までの値となっている。このように凸部３１を形成することよって、実施形態例３で示したように神経細胞２の成長形態を制御できることが示された。 In the region f, the region g, the region m, and the region n, the cell body 21 contracted and became a spherical shape smaller than normal. The growth of the neurite 22 was suppressed, and the number of branches and the length thereof were smaller than those during culture on a flat substrate. As described above, in the normal mouse nerve cell, the diameter of the nerve cell 2 is 2 to 20 μm, and the diameter of the neurite 22 is 0.3 to 1.0 μm. In these regions, the diameter r of the convex portion 31 is smaller than the diameter of the nerve cell 2, and the interval g is a value from 0.4 to 2.0 times the diameter of the nerve cell 2. It was shown that by forming the convex portion 31 in this way, the growth form of the nerve cell 2 can be controlled as shown in the third embodiment.

また、領域ｈ、領域ｌ、領域ｏでは、神経細胞２の形状に、平坦な基材における細胞形状との有意な差が見出せなかった。このことは、これらの領域では凸部３１の直径ｒ、間隔ｇが神経細胞２の直径よりも十分に大きく、各細胞にとっては凸部３１のない平坦な基材と実質的に同じ培養環境であったことを意味している。 Further, in the region h, the region 1 and the region o, no significant difference was found in the shape of the nerve cell 2 from the cell shape on the flat substrate. This is because in these regions, the diameter r and interval g of the protrusions 31 are sufficiently larger than the diameter of the nerve cell 2, and for each cell, the culture environment is substantially the same as a flat substrate without the protrusions 31. It means that there was.

以上のように、実施例１によれば、温度、培養時間、培地等の培養環境が共通であっても細胞培養基材３上の凸部３１の形状を規定することで、培養する神経細胞２の成長形態を制御できることを示した。すなわち、実施例１によれば、それぞれの特性を示す凸部３１を細胞培養基材３上に所望の形状にパターニングして成型した基材を用いることによって、あらゆる形状に神経細胞ネットワークを形成することができることを示した。 As described above, according to Example 1, even when the culture environment such as temperature, culture time, culture medium, etc. is common, by defining the shape of the convex portion 31 on the cell culture substrate 3, the nerve cells to be cultured It was shown that two growth forms can be controlled. That is, according to Example 1, a nerve cell network is formed in any shape by using a base material obtained by patterning the convex portions 31 showing the respective characteristics into a desired shape on the cell culture base material 3. Showed that it can.

[実施例２]
実施例２は、生体組織再生用材料１の一例である、ラット脳神経の再生治療等に適用可能な生体組織再生用材料１の実施例である。
（１）細胞培養基材３の製造
図１３は、実施例２の生体組織再生用材料１の製造工程を示す図である。
図１３(ａ)に示すように、細胞培養基材３の原料である基材原料４は、分子量85,000-160,000のポリ−L−乳酸（シグマ・アルドリッチ・ジャパン製）の厚み０．２ｍｍのシートである。
また、凸部３１の成形に用いた金型５の材質は、結晶方位（１００）、２０ｍｍ角、厚み０．７ｍｍの単結晶シリコンであって、金型凹部６は、光リソグラフィ法によって形成されたものである。 [Example 2]
Example 2 is an example of the biological tissue regeneration material 1 that is an example of the biological tissue regeneration material 1 and can be applied to regeneration treatment of rat cranial nerves and the like.
(1) Production of Cell Culture Substrate 3 FIG. 13 is a diagram showing a production process of the biological tissue regeneration material 1 of Example 2.
As shown in FIG. 13 (a), the base material 4 that is the raw material of the cell culture base material 3 is a sheet of 0.2-mm thick poly-L-lactic acid (manufactured by Sigma-Aldrich Japan) having a molecular weight of 85,000-160,000. It is.
The material of the mold 5 used for forming the convex portion 31 is single crystal silicon having a crystal orientation (100), a 20 mm square, and a thickness of 0.7 mm. The mold concave portion 6 is formed by photolithography. It is a thing.

基材原料４を実施例１と同様の条件でナノインプリント法を用いて加工し、図１３（ｂ）に示す細胞培養基材３を形成した。細胞培養基材３には図１３（ｂ）に示すように領域１を形成する凸部３１と、領域２を形成する凸部３１が形成されている。その後、細胞培養基材３を筒状に加工し、シートの一組の対抗する二辺３Ｂ，３Ｂを熱溶着することによって図１３（ｃ）に示す両側の端部３Ｃ，３Ｃが開口した筒状の細胞培養基材３を得た。さらにポリリジンによる被覆を細胞培養基材３に施した。以上の工程により実施例２で用いる筒状の細胞培養基材３が作成された。この筒状の細胞培養基材３は、長さ３０ｍｍ、直径５ｍｍ、厚み０．２ｍｍであった。また、筒状の細胞培養基材３の両側の端部３Ｃ，３Ｃ方向の内側には領域１を形成する直径５００ｎｍ、間隔１μｍ、高さ１μｍの凸部３１、中央部内側には領域２を形成する直径１μｍ、間隔２μｍ、高さ１μｍの凸部３１が形成された。 The substrate raw material 4 was processed using the nanoimprint method under the same conditions as in Example 1 to form the cell culture substrate 3 shown in FIG. As shown in FIG. 13B, the cell culture substrate 3 is formed with a convex portion 31 that forms the region 1 and a convex portion 31 that forms the region 2. Thereafter, the cell culture substrate 3 is processed into a cylindrical shape, and a pair of opposite sides 3B and 3B of the sheet is thermally welded to open the end portions 3C and 3C on both sides shown in FIG. 13C. A cell culture substrate 3 was obtained. Further, the cell culture substrate 3 was coated with polylysine. The cylindrical cell culture substrate 3 used in Example 2 was created through the above steps. This cylindrical cell culture substrate 3 had a length of 30 mm, a diameter of 5 mm, and a thickness of 0.2 mm. In addition, a convex portion 31 having a diameter of 500 nm, an interval of 1 μm, and a height of 1 μm is formed inside the end portions 3C and 3C on both sides of the cylindrical cell culture substrate 3, and a region 2 is formed inside the central portion. Protrusions 31 having a diameter of 1 μm, an interval of 2 μm, and a height of 1 μm were formed.

（２）マウス神経細胞の取得および増殖
細胞培養基材３を細胞培養用シャーレ等の培養容器７(図示せず)内に配置し、実施例１と同様に胎生１４日目のマウス大脳皮質組織から採取した神経細胞２を筒状の細胞培養基材３に播種した。培地８(図示せず)は培養１日目のみ血清培地（Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ、１０％ＦＢＳ（ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）、５５μＭ２−Ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌ）を使用し、神経細胞が定着した培養２日目以降は無血清培地（Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ、Ｂ２７ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）、５５ｍＭ２−Ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌ）を用いた。培養はＣＯ₂インキュベータ内（ＣＯ₂濃度５％、温度３７℃、相対湿度８０％）で行った。７日間培養後に、細胞培養基材３に接着した神経細胞２の形状を倒立顕微鏡で評価したところ、神経細胞２は細胞培養基材３の凸部３１全体に対して接着したが、図１３（ｄ）に示すように、両側の端部３Ｃ，３Ｃ方向に位置する領域１から神経突起２２が伸展し、互いに接続していることを確認することができた。中央部に位置する領域２は神経突起２２の進展を促進する効果が見られた。以上の工程により、実施例２で用いる生体組織再生用材料１が作成された。 (2) Acquisition and proliferation of mouse nerve cells The cell culture substrate 3 is placed in a culture vessel 7 (not shown) such as a cell culture petri dish, and the mouse cerebral cortex tissue on the 14th day of embryonic life as in Example 1. 2 were seeded on a cylindrical cell culture substrate 3. The medium 8 (not shown) is a serum medium (Opti-MEM, 10% FBS (Invitrogen Corporation), 55 μM 2-Mercaptoethanol) only on the first day of culture. Medium (Opti-MEM, B27 supplement (Invitrogen Corporation), 55 mM 2-Mercaptoethanol) was used. The culture was performed in a CO ₂ incubator (CO ₂ concentration 5%, temperature 37 ° C., relative humidity 80%). After culturing for 7 days, the shape of the nerve cell 2 adhered to the cell culture substrate 3 was evaluated by an inverted microscope. As a result, the nerve cell 2 adhered to the entire convex portion 31 of the cell culture substrate 3, but FIG. As shown in d), it was confirmed that the neurites 22 extended from the region 1 located in the direction of the end portions 3C and 3C on both sides and connected to each other. In the region 2 located in the central part, the effect of promoting the progress of the neurite 22 was observed. Through the above steps, the biological tissue regeneration material 1 used in Example 2 was produced.

以上のように、実施例２の生体組織再生用材料１によれば、筒状の細胞培養基材３内において両端から神経突起２２が伸展し接続した神経細胞２の形状が得られるため、再生医療に適用したときには、損傷、欠損などの生じた部位の神経回路の良好な再生効果が期待できる。また、実施例２において、図１３（ｂ）に示した領域１と領域２を組み合わせたパターンの細胞培養基材３を用いたが、領域１〜領域４のいずれかを組み合わせることで、他の神経細胞２の形状を制御することも可能である。 As described above, according to the biological tissue regeneration material 1 of Example 2, the shape of the nerve cell 2 in which the neurite 22 is extended and connected from both ends in the cylindrical cell culture substrate 3 is obtained. When applied to medical treatment, a good regeneration effect of a neural circuit in a site where damage or loss occurs can be expected. Moreover, in Example 2, the cell culture substrate 3 having a pattern in which the region 1 and the region 2 shown in FIG. 13B were combined was used. It is also possible to control the shape of the nerve cell 2.

本実施形態の生体組織再生用材料の概略構成を示す斜視図である。It is a perspective view which shows schematic structure of the biological tissue reproduction | regeneration material of this embodiment. 細胞培養基材の構成を示す斜視図であって、(ａ)は全体図、（ｂ）は(ａ)で示したＡ領域の部分拡大図である。It is a perspective view which shows the structure of a cell culture substratum, Comprising: (a) is a general view, (b) is the elements on larger scale of A area | region shown by (a). 細胞培養基材の製造方法の一例であるナノインプリント法による製造工程を説明するための図である。It is a figure for demonstrating the manufacturing process by the nanoimprint method which is an example of the manufacturing method of a cell culture substratum. 神経細胞の培養手順を説明するための図であって、細胞培養基材上で培養されている神経細胞を示す縦断面図である。It is a figure for demonstrating the culture | cultivation procedure of a nerve cell, Comprising: It is a longitudinal cross-sectional view which shows the nerve cell currently culture | cultivated on the cell culture substrate. 実施形態例１の神経細胞の培養方法を説明するための図である。FIG. 3 is a diagram for explaining a nerve cell culture method of Embodiment 1; 実施形態例２の神経細胞の培養方法を説明するための図である。6 is a diagram for explaining a nerve cell culture method according to Embodiment 2. FIG. 実施形態例３の神経細胞の培養方法を説明するための図である。It is a figure for demonstrating the culture | cultivation method of the nerve cell of Example 3 of an embodiment. 領域１と領域３とを組み合わせて形成した細胞培養基材の上面図である。It is a top view of a cell culture substrate formed by combining region 1 and region 3. 領域２と領域３とを組み合わせて形成した細胞培養基材の上面図である。It is a top view of a cell culture substrate formed by combining region 2 and region 3. 領域３と、任意の領域である領域４とを組み合わせて形成した細胞培養基材の上面図である。It is a top view of the cell culture substratum formed combining the area | region 3 and the area | region 4 which is arbitrary areas. 積層体として形成された細胞培養基材の概略構成を示す斜視図である。It is a perspective view which shows schematic structure of the cell culture substratum formed as a laminated body. 筒状として形成された細胞培養基材の概略構成を示す斜視図である。It is a perspective view which shows schematic structure of the cell culture substratum formed as a cylinder shape. 実施例２の生体組織再生用材料の製造工程を示す図である。FIG. 4 is a diagram illustrating a production process of a material for regenerating living tissue of Example 2.

Explanation of symbols

１生体組織再生用材料
２神経細胞
３細胞培養基材
４基材原料
５金型
６金型凹部
７培養容器
８培地
２１細胞体
２２神経突起
３１凸部
３１Ａ最上面
３２基材ベース
３２Ａ上面 DESCRIPTION OF SYMBOLS 1 Biological tissue regeneration material 2 Nerve cell 3 Cell culture base material 4 Base material 5 Mold 6 Mold recess 7 Culture vessel 8 Medium 21 Cell body 22 Neurite 31 Convex part 31A Top surface 32 Base material base 32A Top surface

Claims

A tissue regeneration material transplanted into a living body comprising a nerve cell and a cell culture substrate for culturing the nerve cell,
The culture surface of the cell culture substrate has a plurality of convex portions having a diameter smaller than that of the nerve cells,
The cell culture substrate has a culture control region for controlling the growth form of the nerve cell, in which a plurality of convex portions are formed on the culture surface of the nerve cell,
The culture control region is
(A) At least 1 formed by a plurality of convex portions having an equivalent diameter of the convex portions and an interval between the convex portions smaller than a diameter of the nerve cell to be cultured and a neurite extending from the nerve cell. One area,
(B) The equivalent diameter of the convex portions and the interval between the convex portions are smaller than the diameter of the nerve cell to be cultured, and the interval between the convex portions is larger than the diameter of the neurite extending from the neural cell. At least one region formed by a plurality of convex portions,
(C) A plurality of protrusions having an equivalent diameter in the culture control region smaller than the diameter of the nerve cell, and a distance between the protrusions in a range from 0.4 to 2 times the diameter of the nerve cell. A material for regenerating a living tissue, comprising at least two regions selected from the group consisting of at least one region formed by protrusions of

The material for regenerating a living tissue according to claim 1, wherein the nerve cell includes one of a neural progenitor cell and a neural stem cell.

The material for regenerating a living tissue according to claim 1, wherein the nerve cell is adhered to the culture surface of the cell culture substrate.

The living tissue regeneration material according to claim 1, wherein the cell culture substrate comprises a biodegradable substance.

The cell culture substrate is composed of polysaccharide, polysaccharide salt, crosslinked polysaccharide, crosslinked polysaccharide salt, acidic polysaccharide ester, protein, polypeptide, polyglycolic acid, polylactic acid, poly (ε-caprolactone), glycol The biodegradable material selected from an acid / lactic acid copolymer, a glycol / carbonate copolymer, a polydioxanone, and a cyanoacrylate copolymer, or a blend thereof. For living tissue regeneration.

The plurality of convex portions are composed of a plurality of convex portions having a smaller diameter than the nerve cells,
The living tissue regeneration material according to claim 1, wherein the plurality of convex portions are integrated with the cell culture substrate.

The material for regenerating a living tissue according to claim 1, wherein the cell culture substrate has a single-layer sheet shape, and the thickness including the convex portion is 0.01 mm to 3 mm.

The biological tissue regeneration material according to claim 1, wherein the cell culture substrate is a laminate of a single layer sheet.

2. The tissue regeneration according to claim 1, wherein the cell culture substrate is a laminate of single-layer sheets, and holds the nerve cells between at least one pair of adjacent single-layer sheets. Materials.

The biological tissue regeneration material according to claim 1, wherein the cell culture substrate has a cylindrical shape with a diameter of 0.2 mm to 10 mm.

The biological tissue regeneration material according to claim 1, wherein the cell culture substrate has a cylindrical shape and holds the nerve cells on an inner surface.

The biological tissue regeneration material according to claim 1, wherein a surface treatment for promoting adhesion of the nerve cell is performed on a culture surface of the cell culture substrate.

The biological tissue regeneration material according to claim 1, wherein a chemical substance that controls the growth form of the nerve cell is included in at least a part of the surface or inside of the cell culture substrate.

A non-human animal having a neurological disease, comprising the step of transplanting the biological tissue regeneration material according to any one of claims 1 to 13 to an animal other than a human having a neurological disease. Treatment methods.