JP5020941B2 - Ｈｉｖに対して中和活性を有するがｉｌ２には中和活性を有さない抗体又はその断片 - Google Patents

Description

本発明は、ＨＩＶに対する中和活性を有し、かつＨＩＶ感染の治療及び／又は予防に役立つ、抗体又はその断片に関する。本発明は、該抗体を含む医薬組成物、診断の組成物及び受動免疫療法を提供する方法に関する。

ヒト免疫不全ウィルス（ＨＩＶ）は、動物レトロウィルスのレンチウィルス科の構成員であり、後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）の原因となる因子である。今まで、ＨＩＶタイプ１（ＨＩＶ−１）及びタイプ２（ＨＩＶ−２）の二つの近縁種が分子レベルで同定されそして特徴付けされている。

逆転写酵素阻害剤のような、ＨＩＶに対する抗ウィルス剤の導入は、ＡＩＤＳに冒された患者の状態を大いに改善することを許す。しかしながら、大抵の場合、これらのＡＩＤＳに対する薬剤の治療的な効果は部分的又は一時的であり、そしてさらに、これら薬剤は造血細胞に対する毒性又は成長阻害を示し、かつそれにより、不全となった免疫システムの再構築を阻害する。

それ故に、ＡＩＤＳ予防計画及び抗レトロウィルス薬治療（VALDISERRI, 2003, Nat. Med, 9:881）は有効な殺菌剤及びワクチンと組み合わせられるべきであることが一般に認められている。しかし、そのようなワクチンの設計及び試験は複雑であると示されている(LETVIN, et al. 2002, Annu. Rev. Immunol., 20:73; McMICHAEL & HANKE, 2003, Nat. Med., 9:874)。

粘膜表面はＨＩＶ−１の進入のための主要部位である(NICOLOSI, et al. 1994, J. Acquir. Immun. Defic. Syndr., 7:296)。ＨＩＶ−１の伝染は、精液、初乳、母乳、及び膣頸部流体のような、ＨＩＶ−１に感染した流体に粘膜の表面がさらされることを通じて起こりうる(CHERMANN, 1998, Am. J. Reprod. Immunol., 40:183; MILMAN & SCHARMA, 1994, AIDS, 10:1305)。

ＨＩＶと粘膜表面との相互作用の故に、ＨＩＶに対して意図されたワクチンの構成部分は、粘膜の免疫システムを、粘膜のウィルス伝染と潜在的な受容体の初期段階を妨げることに従事させる。

ＡＩＤＳウィルス中和性抗体が、防御において重要な役割を明らかに果たしうることが認められている。

しかしながら、実験室で増やされた特定のウィルス株に対する中和性抗体を得ることは可能だが、広い範囲の株を中和することができ、かつインビボで有効に活性である抗体の実施は、いまだ同様の成功を収めていない。

ウィルスエンベロープにおいて最も保存される領域であるＨＩＶのｇｐ４１の外ドメインは、非常に免疫原性な糖タンパク質である。

ＨＩＶウィルスのレトロウィルスエンベロープタンパク質ｇｐ４１の保存されかつ免疫優勢な領域は、ヒト免疫系のタンパク質、及び特にはＩＬ−２、の或る領域との、三次元的な構造類似及び／又は交差反応性の故に、有害な自己免疫現象に責任があるだろうことが、米国特許第６４５５２６５号から知られている。

国際公開第２００５／０１００３３号パンフレットからは、ｇｐ４１のＮ−及びＣ−ヘリックスの間の連絡ループ中のリンカー断片を含み、かつ自己免疫副作用を欠く又は減じられたｇｐ４１改変ループタンパク質が知られている。

それ故に、自己免疫副作用なしに、ＨＩＶの感染、及び特にＨＩＶ−１の感染を中和することを許す抗体の必要がある。

粘膜表面を通じたＨＩＶ感染を予防すること及び／又は減らすことを許す抗体の必要がある。

また、受動免疫療法において用いられるべきことが意図された薬剤の製造のために抗体を供給する必要がある。

診断の目的の為に用いられうる抗体の必要がある。

本発明は、それら上述の必要の全て又は一部を満たすことを目的として有する。

発明者らは、上述の満たされていない必要を満たすことを許す効率的なモノクローナル抗体を得た。

特に、本発明者らは、配列ＩＤ ＮＯ １、配列ＩＤ ＮＯ ２及び配列ＩＤ ＮＯ ３のアミノ酸配列を夫々有するＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３又はそれらの機能的類似体から選ばれる少なくとも１の相補性決定領域（ＣＤＲ）を、Ｈ鎖可変領域中に含む新規ＩｇＡ抗体Ｆａｂを同定した。

より特には、新規に同定されたＩｇＡ抗体Ｆａｂは、ｇｐ４１改変ループタンパク質又は野生型ｇｐ４１タンパク質を認識しうるが、ｇｐ４１改変ループタンパク質及び野生型ｇｐ４１タンパク質中に生じるＰ１と呼ばれるペプチドを認識し得ない。

ペプチドＰ１（配列ＩＤ ＮＯ １２）は、例えば配列ＩＤ ＮＯ １１の、かつＨＩＶ−１株のＨｘＢ２から得られる、ｇｐ４１タンパク質の野生型アミノ酸配列のアミノ酸配列６４９から６８３に対応する。

この新規に同定された抗体は、ＨＩＶ−１トランスサイトーシスを阻害しかつＣＤ４＋Ｔ細胞の感染を防ぐ能力も有する。

それ故に、その局面の一つに従い、本発明は配列ＩＤ ＮＯ １、配列ＩＤ ＮＯ ２及び配列ＩＤ ＮＯ ３のアミノ酸配列を夫々有するＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３をＨ鎖可変領域に含み、配列ＩＤ ＮＯ ４、配列ＩＤ ＮＯ ５及び配列ＩＤ ＮＯ ６のアミノ酸配列を夫々有するＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３をＬ鎖可変領域に含み、且つ、ＨＩＶを中和する能力を有するモノクローナル抗体又はその断片に関する。

その局面の他に従い、本発明は、下記に定義されるｇｐ４１改変ループタンパク質を認識し、かつ配列ＩＤ ＮＯ １２のアミノ酸配列のペプチドを認識しない、モノクローナル抗体又はその断片に関する。本発明に従う抗体により認識されうるｇｐ４１改変ループタンパク質の例として、配列ＩＤ ＮＯ １３のアミノ酸配列を有するｇｐ４１改変ループタンパク質が挙げられうる。

従って、本発明に従う抗体は、ＨＩＶの種々の株に天然に発生しうるｇｐ４１タンパク質の野生型配列も認識しうる。

その局面の他に従い、本発明は、配列ＩＤ ＮＯ １、配列ＩＤ ＮＯ ２及び配列ＩＤ ＮＯ ３のアミノ酸配列を夫々有するＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３又はそれらの機能的類似体から選ばれる少なくとも１の相補性決定領域（ＣＤＲ）を含むＬ鎖可変領域を含むモノクローナル抗体又はその断片に関する。

本明細書で用いられる語「抗体の断片」は、アミノ末端及び／又はカルボキシ末端の欠失を有するが、残存するアミノ酸配列は天然に発生する配列中において対応する位置と同一である抗体であり、かつその生物学的特性を維持された又は不利に影響されていないものを云う。この抗体の断片は、アミノ酸残基の挿入、欠失、及び／若しくは置換のような追加的な修正、並びに／又はキメラタンパク質を作成するための他のペプチド又はタンパク質との融合を含みうる。語「抗体の断片」は、抗体の様々な部分、すなわち定常、可変、重及び軽鎖をも包含しうる。

本発明の意味において、ペプチドに関する表現「機能的類似体」は、他のアミノ酸配列とのアミノ酸配列の相同性又は同一性を有し、かつ該他のペプチド配列と比較して類似の又は保存された生物学的特性を有するペプチドを云うことが意図されている。典型的には、ペプチド類似体は、天然に発生する配列に対して保存的なアミノ酸の置換（及び／又は挿入及び／又は欠失）を含んだ。

他の局面に従い、本発明は、配列ＩＤ ＮＯ ３、配列ＩＤ ＮＯ ４、配列ＩＤ ＮＯ ５のアミノ酸配列を夫々有するＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３又はそれらの機能的類似体から選ばれる少なくとも１のＣＤＲを含むＨ鎖可変領域にも関する。

その面の他に従い、本発明は、下記に定義されるｇｐ４１改変ループタンパク質を認識し、かつ例えば配列ＩＤ ＮＯ １３のペプチド配列を有し、かつ配列ＩＤ ＮＯ １２のアミノ酸配列のペプチドを認識しないＨ鎖可変領域に向けられる。

その面の他に従い、本発明の抗体又はその断片は、ＨＩＶを中和する能力を有する。

その面の他に従い、本発明は、本発明の抗体又はその断片をコードする核酸配列、同様に該核酸配列を含む発現ベクター及び宿主細胞にも関係する。

その面の他に従い、本発明は、活性な剤として、本発明の抗体若しくはその断片、本発明の核酸配列、本発明のベクター又は本発明の宿主細胞、及び適当なキャリアから選ばれる剤の有効量を含む医薬組成物に関する。

その面の他に従い、本発明は、サンプル中のＨＩＶ株をインビトロで検出するための、診断の組成物及び方法にも向けられる。

その面の他に従い、本発明は、少なくとも１の本発明の抗体又はその断片の治療的に有効量を投与することを含む、ＨＩＶに感染しうる個人の受動免疫療法を提供する方法にも関係する。

抗体
本発明に従う抗体は、完全な免疫グロブリン、又はその断片、及び特にその抗原結合性部分を云う。

免疫グロブリンは４量体分子であり、ポリペプチド鎖の２つの同一なペアからなり、夫々のペアは１つの“軽”（Ｌ）鎖（約２５ｋＤａ）及び一つの“重”（Ｈ）鎖（約５０〜７０ｋＤａ）を有する。夫々の鎖のアミノ末端部分は約１００〜１１０又はそれ以上のアミノ酸の可変領域（Ｖ）を含み、主として抗原認識に責任がある。夫々の鎖のカルボキシ末端部分は、主としてエフェクター機能に責任がある定常領域（Ｃ）を定める。ヒト軽鎖はκ及びλ軽鎖に分類される。重鎖定常領域はμ、δ、γ、α、又はεとして分類され、抗体アイソタイプをＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡ、及びＩｇＥとして夫々定める。軽／重鎖ペア夫々の可変領域は、完全な免疫グロブリンが概して少なくとも２つの結合部位を有するように、抗体結合部位を形成する。

本発明の特定の実施態様では、本発明のモノクローナル抗体又はその断片は、ＩｇＡ、及びより特には分泌型ＩｇＡ（Ｓ−ＩｇＡ）であってよい。

他の実施態様に従い、本発明のモノクローナル抗体又はその断片はヒト抗体であってよい。

免疫グロブリン鎖は、相補性決定領域又はＣＤＲとも呼ばれるフリーの超可変領域の隣に、比較的保存されたフレームワーク領域（ＦＲ）継ぎ目の同じ一般構造を表す。それぞれのペアの２つの鎖からのＣＤＲは、フレームワーク領域の隣に整列させられており、特定のエピトープ（抗体の抗原を結合する部分）に結合することを可能とする。Ｎ末端からＣ末端にかけて、軽及び重鎖のいずれも、ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３及びＦＲ４ドメインを含む。

実施態様に従い、本発明に従う抗体は、配列ＩＤ ＮＯ １、配列ＩＤ ＮＯ ２及び配列ＩＤ ＮＯ ３のアミノ酸配列を夫々有するＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３又はそれらの機能的類似体から選ばれる少なくとも１の相補性決定領域（ＣＤＲ）を、Ｈ鎖可変領域中に有する。

特定の実施態様に従い、本発明の抗体又はその断片のＨ鎖可変領域は、ＣＤＲとして、配列ＩＤ ＮＯ １、配列ＩＤ ＮＯ２及び配列ＩＤ ＮＯ３のアミノ酸配列を夫々有するＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３又はそれらの機能的類似体を含む。

他の実施態様の範囲内で、本発明の抗体は、前に定義されたＨ鎖可変領域である。特に、本発明のＨ鎖可変領域は、配列ＩＤ ＮＯ １、配列ＩＤ ＮＯ ２及び配列ＩＤ ＮＯ ３のアミノ酸配列を夫々有するＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３又はそれらの機能的類似体から選ばれる少なくとも１のＣＤＲを含みうる。

他の実施態様に従い、本発明のＨ鎖可変領域はＣＤＲとして、配列ＩＤ ＮＯ １、配列ＩＤ ＮＯ２及び配列ＩＤ ＮＯ３のアミノ酸配列を夫々有するＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３又はそれらの機能的類似体を含む。

本発明に従う抗体、又は本発明のＨ鎖可変領域は、Ｐ１と呼ばれかつ配列ＩＤ ＮＯ １２のアミノ酸配列を有するペプチドを認識し得ない。

本発明の他の実施態様の範囲内で、本発明に従う抗体又はその断片は、配列ＩＤ ＮＯ ４、配列ＩＤ ＮＯ ５及び配列ＩＤ ＮＯ ６のアミノ酸配列を夫々有するＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３又はそれらの機能的類似体から選ばれる少なくとも１の相補性決定領域を有するＬ鎖可変領域をも含みうる。

それ故に、他の実施態様に従い、本発明は配列ＩＤ ＮＯ ４、配列ＩＤ ＮＯ ５及び配列ＩＤ ＮＯ ６のアミノ酸配列を夫々有するＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３又はそれらの機能的類似体から選ばれる少なくとも１の相補性決定領域を含むＬ鎖可変領域にも関する。

他の実施態様に従い、本発明のＬ鎖可変領域はＣＤＲとして、配列ＩＤ ＮＯ ４、配列ＩＤ ＮＯ ５及び配列ＩＤ ＮＯ ６のアミノ酸配列を夫々有するＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３又はそれらの機能的類似体を含む。

実施態様に従い、本発明に従う抗体は、配列ＩＤ ＮＯ ７及び配列ＩＤ ＮＯ ８のアミノ酸配列を夫々有するＨ鎖可変領域及びＬ鎖可変領域又はそれらの機能的類似体を含む。特定の実施態様では、本発明の抗体は、実験の説明の個所においてクローン６９として同定され、かつ該Ｈ及びＬ鎖可変領域を含むＦａｂである。

他の実施態様に従い、本発明の抗体は組み換え抗ＨＩＶ抗体又はその断片であってよい。組み換え抗体は本発明のＨ鎖可変領域を含みうる。

他の実施態様に従い、本発明の組み換え抗体は追加的に、本発明のＬ鎖可変領域を含みうる。

従って、本発明のＨ鎖可変領域のＣＤＲ、又は全体としてのＨ鎖可変領域は、例えばＩｇＧアイソタイプのフレームワークのように、ＩｇＡアイソタイプと異なるフレームワークを有するキメラの又は組み換え抗体を構築するために用いられうる。そのような構築物は、“Molecular Cloning - A Laboratory Manual” (2nded.), Sambrook et al.,1989, Coldspring Harbor Laboratory, Coldspring Harbor Press, N.Y. (Sambrook)に記載されているような当技術分野で既知のいずれの分子生物学的手段により得られうる。キメラの又は組み換え抗体は、抗体全体又はその断片であってよい。

従って、本発明のＨ鎖可変領域又はＬ鎖可変領域のＣＤＲの機能的類似体は、本発明に従う抗体の当初配列の代わりにいったん挿入されると、下記で定義されるｇｐ４１改変ループタンパク質、又は野生型ｇｐ４１タンパク質を認識する該抗体の能力を維持し又はその能力に不都合な影響を及ぼさない。例として、ｇｐ４１改変ループタンパク質は配列ＩＤ ＮＯ １３のアミノ酸配列を有し得、そしてｇｐ４１の野生型配列は、例えば、配列ＩＤ ＮＯ １１のアミノ酸配列又はその機能的類似体を有しうる。更に、配列ＩＤ ＮＯ １２の配列のペプチドを認識しないその能力、及びＨＩＶを中和しかつ／又はＨＩＶ感染を阻害するその能力は、同様に維持される。

本発明は、本発明のヒト交代に由来するＦａｂ断片及び、ＩｇＧ及び同様物のような他のＩｇサブタイプに由来するヒトＦｃドメインを含む抗体にも関する。

それ故に、実施態様に従い、前に定義されたＨ鎖可変領域を含む、本発明に従う抗体又はその断片の抗原結合部分にも向けられ得る。この抗原結合部分は任意的に、前に定義されたＬ鎖可変領域を含みうる。

抗原結合部分は、いずれかの既知の組み換えＤＮＡ技術により、又は完全な抗体の酵素的又は化学的開裂により製造されうる。抗原結合部分は、とりわけ、Ｆａｂ（ＶＬ、ＶＨ、ＣＬ及びＣＨ１ドメインからなる１価断片）、Ｆ（ａｂ’）_２（ヒンジ領域でジスルフィド架橋により連結された２つのＦａｂ断片を含む２価断片）、Ｆｖ（抗体の一つの腕のＶＬ及びＶＨドメインからなる断片）、Ｆｄ（ＶＨ及びＣＨ１ドメインからなる断片）、ｄＡｂ断片（ＶＨドメインからなる）、ｓｃＦｖ（ＶＬ及びＶＨ領域が対にされて、合成リンカーを介して1価分子を形成している抗体からなる）、キメラ抗体、二重特異性抗体、及び相補性決定領域（ＣＤＲ）断片を含みうる。

本発明の抗体又はその断片のＨＩＶを中和する能力は、以下に示されそして実施例に表されるように、トランスサイトーシスの阻害分析及びＣＤ４＋ Ｔ細胞の感染の遮断分析を通じて評価されうる。

ＧＰ４１改変ループタンパク質
本発明の抗体は、ＨＩＶのｇｐ４１糖タンパク質の野生型アミノ酸配列に由来するｇｐ４１改変ループタンパク質を認識しうる。本発明を実施するために召集されうるｇｐ４１タンパク質の野生型アミノ酸配列の例として、ＨＩＶ−１株ＨｘＢ２に由来する、配列ＩＤ ＮＯ １１のアミノ酸配列が挙げられ得る。

本発明を実施するために有用であり得るｇｐ４１改変ループタンパク質は、自己免疫反応を引き起こす危険を回避又は減ずるように、ヒトインターロイキン−２（ＩＬ−２）との相同性を減少させるため、免疫優勢の領域にいくつかの変異（欠失、置換及び／又は挿入）を導入することにより入手されうる。そのようなｇｐ４１改変ループタンパク質は特に、引用することにより本明細書に組み込まれる国際公開第２００５／０１００３３号パンフレットに記載されている。

本明細書において、「変異」は、ポリペプチドの領域（任意的に一つのアミノ酸残基に減少される）の、物理的手段、化学的手段（共有結合的又は非共有結合的修飾）及び／又は生物学的手段（１以上のアミノ酸の置換、欠失及び／又は挿入による変異）による何らかの修飾を云い、該領域（「変異領域」と称される）の構成アミノ酸の機能的な能力の改変をもたらす。例として、ジスルフィド結合、水素結合、静電気的相互作用及び／又は疎水性相互作用の特性の、廃止、獲得及び／又は調節、タンパク質のヘテロ複合体を形成する能力の改変、あるいは代わりにオリゴマータンパク質の場合にはオリゴマー化の状態又はオリゴマーの安定性の改変をもたらす変異を実施することが可能である

免疫優性領域の改変は、親水性かつ非又は弱免疫原性の柔軟なリンカーの並びに任意的に変異の、ループ中への導入又はループの一部の置換を結果する。

ｇｐ４１改変ループタンパク質は、その免疫優性領域に少なくとも１の変異を更に含んでよく、これは宿主タンパク質との、特にはＩＬ−２との、Ｂ型及び／Ｔ型の、インビトロでの交差反応性を与える。

抗原性におけるこの変化に影響を与えるのに決定的ないくつかの変異は、米国特許第６４５５２６５号明細書及び国際公開第２００５／０１００３３号パンフレットに開示されており、それらの教示は引用することにより本明細書にそっくりそのまま組み込まれる。

本発明に役立つｇｐ４１改変ループタンパク質は、国際公開第２００５／０１００３３号パンフレットに記載されるように、Ｎ−若しくはＣ−末端でのアミノ酸配列の一部の切断のような修正、又はＨｉｓ−Ｔａｇ又はＨＡ−Ｔａｇのような、キメラタンパク質を製造するためのペプチド配列の付加をも含みうる。

本発明に用いられるべきｇｐ４１改変ループタンパク質を調製するために、“Molecular Cloning - A Laboratory Manual” (2nded.), Sambrook et al.,1989, Coldspring Harbor Laboratory, Coldspring Harbor Press, N.Y. (Sambrook)に記載されているような、ペプチド合成又は遺伝子工学の技術のいずれかの既知の方法を用いることが可能である。

特定の実施態様に従い、本発明の抗体は、配列ＩＤ ＮＯ １３のアミノ酸配列を有するｇｐ４１改変ループタンパク質又はその類似体を認識しうる。

追加的に、本発明に従う抗体又はその断片は、例えば配列ＩＤ ＮＯ １３のアミノ酸配列を有する、ｇｐ４１改変ループタンパク質を認識するだけでなく、野生型ｇｐ４１タンパク質も認識するが、配列ＩＤ ＮＯ １２のペプチド配列を認識することはない。

本発明の抗体により認識されうる野生型ｇｐ４１タンパク質の例として、ＨＩＶ株ＨｘＢ２に由来し、かつそのアミノ酸配列５４０から６８３に対応する、配列ＩＤ ＮＯ １１のアミノ酸配列を有するｇｐ４１タンパク質が挙げられる。

ペプチドＰ１
本発明の抗体は、Ｐ１と呼ばれ、かつ配列ＩＤ ＮＯ １２のペプチド配列を有するペプチド又はその類似体を認識しない。

ペプチドＰ１は、ＨＩＶエンベロープタンパク質ｇｐ４１中に存在するアミノ酸配列に対応し、ウィルスが標的細胞と相互作用する前にはｇｐ４１はウィルス粒子の表面に露出されている。例として、ＨＩＶ−１ ＨｘＢ２株では、この配列は野生型ｇｐ４１タンパク質のアミノ酸６４９からアミノ酸６８３からなる。

水溶液中において、このペプチドは、構造化された、濃度依存的オリゴマーの状態、すなわち２量体又は４量体の状態を取る(ALFSEN & BOMSEL, 2002, J. Biol. Chem., 277: 25649)。

それ故に、本発明に従う抗体若しくはＨ鎖可変領域又はそれら断片は、モノマー又はオリゴマーの形態下のペプチドＰ１を認識しない。

抗体の中和活性
ＨＩＶに対する、本発明の抗体又はその断片の中和活性は、

実施態様に従い、中和されるＨＩＶは、より特にはＨＩＶ−１株である。

本発明のモノクローナル抗体の、細胞を横切るＨＩＶのトランスサイトーシスを阻害する能力の評価は、極性が与えられたいずれかの細胞において実施されうる。一つの実施態様では、極性が与えられた細胞は、例えば腸細胞株ＨＴ−２９若しくは子宮内膜細胞株ＨＥＣ−１のような上皮細胞、又はヒト粘膜バイオプシーからの細胞であってよい(Bomsel et al., Immunity, 1998, 3:277)。典型的には、細胞株が、２つの独立したチャンバー（上方のものは上皮単層の頂端面を浴につけ、下方のものは基底面を浴につける）の間の境界面を形成する（例えば０．４５μｍの孔径を有する）透過性フィルター支持体上に、すき間無い、極性が与えられた単層のように増殖させられるか、あるいはバイオプシーが用いるチャンバー中に据え付けられる。

トランスサイトーシスは、例えばＨＩＶ−１に感染した末梢血単核球（ＰＢＭＣ）のような、ＨＩＶに感染した細胞を、頂端チャンバー（apical chamber）で接触させることにより開始されうる。

試験されるべき抗体は、ＨＩＶに感染した細胞の適用の前若しくは後で、頂端チャンバーに施与されうる、又はＨＩＶ−１ウィルス若しくはＨＩＶ−１に感染した細胞とともに予備インキュベートされうる。

試験されるべき本発明の抗体は、さまざまな濃度、例えば約０．０１から約１０ｎｇ／ｍｌ、特に約０．１から５ｎｇ／ｍｌ又はさらに特には約０．５から約１ｎｇ／ｍｌで適用されてよい。

ウィルストランスサイトーシス及び可能ならばその阻害の評価は、ＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲ、又はＥＬＩＳＡのような当技術分野で既知のいずれかの技術により、基底側培地中におけるＨＩＶの核酸又はタンパク質の検出により実施されうる。

一つの実施態様では、ウィルストランスサイトーシスの評価のために用いられうるＨＩＶペプチドは、例えばＰＡＳＴＥＵＲ−ＳＡＮＯＦＩ（フランス）により用意されるキットを用いた、ＥＬＩＳＡ分析により検出されうるｐ２４ペプチドであってよい。

特定の実施形態では、本発明のモノクローナル抗体又はその断片が、約１０６の、ＨＩＶ−１に感染したＰＢＭＣに、約０．５ｎｇ／ｍｌから約５ｎｇ／ｍｌの濃度で添加され、そして、約１７℃又は約４℃で約１時間培養され、その後頂端チャンバーへ感染した細胞が植え付けられたときは、本発明のモノクローナル抗体又はその断片は、１０６のＨＩＶ−１＋ＰＢＭＣの頂端チャンバーへの添加により開始されるウィルストランスサイトーシスを、抗体なしで実施されたウィルストランスサイトーシスに比べて、少なくとも約５０％だけ、特には少なくとも約７５％だけ、さらに特には少なくとも約９５％だけ阻害しうる。

他の実施態様では、ＨＩＶ感染ＰＢＭＣの添加に先立って、本発明の抗体又はその断片は頂端チャンバーに添加されうる。そのような実施態様では、トランスサイトーシスの阻害は、抗体なしで実施されたウィルストランスサイトーシスに比べて少なくとも約５０％でありうる。

例として、本発明の対象でもあるクローン６９のＦａｂ及びＦｄは、ＨＩＶトランスサイトーシスを夫々少なくとも約７０％及び約８０％だけ阻害しうる。

特定の実施態様では、本発明の対象でもあるクローン６９のＦａｂ及びＦｄは、本技術分野で既知の慣用の方法に従い、フローサイトメトリー分析により測定されるように、ＨＩＶ−１（ＪＲＣＳＦ クローン Ｒ５）に感染したＰＢＭＣの表面で発現されているｇｐ４１に特異的に結合することができる。

他の実施態様では、本発明に従うモノクローナル抗体又はその断片は、ＣＤ４＋Ｔ細胞のＨＩＶ感染を阻害する能力を示す。

特定の実施態様では、本発明の抗体又はその断片と共に、ウィルスを約１ｎｇ／ｍｌで約３７℃で約３０分間の培養した後で、ＨＩＶによるＣＤ４＋Ｔ細胞の感染が、抗体を伴わないで又はウィルスを認識しない非特異的抗体と共に、ＣＤ４＋Ｔ細胞のＨＩＶ感染が実施された場合に比べて、少なくとも約７５％だけ、及びさらに特には少なくとも約９５％だけ阻害されうる。

例として、本発明の対象であるＦａｂクローン６９はＣＤ４＋Ｔ細胞のＨＩＶ感染を少なくとも９５％だけ阻害しうる。

核酸、ベクター及び宿主細胞
本発明の抗体は、実施例の部分において記載されているように得られるＦａｂ ＩｇＡファージディスプレイライブラリーのスクリーニングにより同定される。

コンビナトリアルライブラリーの製造及び操作の方法は、文献中に広く記載されてきており、かつ当技術分野の当業者の一般的な知識に由来する。

コンビナトリアルＦａｂファージディスプレイライブラリーは、２段階の方法において選抜される。

第１工程では、Ｆａｂファージディスプレイライブラリーが、（酵素結合免疫吸着検定（ＥＬＩＳＡ）プレートのような）固体支持体上に固定化された、配列ID ＮＯ １２の配列を有するペプチドＰ１に上でスクリーンされ、これはこのペプチドを認識する抗体のライブラリーをなくすためである。

この第１段階は、約１００μＭの抗原濃度を用いて実施され、この濃度ではペプチドＰ１は２量体／４量体のオリゴマー化状態を採る。

第２工程では、Ｆａｂファージディスプレイライブラリーが、固体支持体上に固定化された抗原に対する反復のパンニングにより、ｇｐ４１改変ループタンパク質に対して選抜された。本方法はマイクロパンニングとして知られており、Azzay & Highsmith（Clinical Biochemistry, 2002, 35:425-445）中に記載されている。

本発明のＦａｂファージディスプレイライブラリーを選抜するために用いられうるｇｐ４１改変ループタンパク質は、例えば、配列ＩＤ ＮＯ １３のアミノ酸配列又はその機能的類似体を有しうる。

出発量は、例えば約２から約１μｇであってよく、すると、その量は夫々のパンニングラウンドにおいて２回分割されうる。

抗原、すなわちｇｐ４１改変ループタンパク質とバクテリオファージの外側に配置される抗原結合ドメインとの間の相互作用の検出は、当技術分野で既知のいずれかの技術により評価されうる。例えば、ＥＬＩＳＡ分析が用いられてよく、ここでｇｐ４１改変ループタンパク質はプレートのウェル中に塗付され、そしてその後ライブラリーからのファージが適用される。

夫々のファージに特有である、抗原結合部位をコードする遺伝子は、その後、選択されたファージのファージ核酸から回収され、完全な抗体分子又は上記のＦａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）２、又はｓｃＦｖのようなその類似体のための遺伝子を構築するために配列決定されそして用いられる。

選択されたファージから回収された、抗原結合部位をコードする遺伝子の配列は、当技術分野の当業者に由来する既知のいずれかの技術に従い配列決定されうる。

例えば、配列決定は、Ｔａｑ蛍光ジデオキシヌクレオチドターミネーターサイクルシーケンシングキット（Applied Biosystems）により、自動化されたＤＮＡシーケンサーを用いることにより実施されうる。二本鎖ＤＮＡは、例えばバクテリアから調製され、配列決定は、ＦａｂのＨ及びＬ鎖（夫々のＦａｂ鎖の上及び下流）のクローニングのために用いられるベクターに特異的にアニールするプライマーのセットを用いて実施されうる。例えば、ｐＣｏｍｂ３Ｘベクターを用いる場合、表２に説明される配列を有するプライマーが用いられうる。

それゆえに、他の実施態様に従い、本発明は、本発明の重及び軽鎖可変領域アミノ酸配列（これら配列は夫々配列ID ＮＯ ７及び配列ID ＮＯ ８である）をコードするｃＤＮＡ、ＲＮＡ、及びその同様物のような核酸分子にも関する。

特に、本発明の核酸配列は、Ｈ鎖可変領域については配列ID ＮＯ ９であり得、そしてＬ鎖可変領域については配列ID ＮＯ １０の配列でありうる。

もちろん、遺伝コードの縮重により、配列ID ＮＯ ７の重鎖可変領域アミノ酸配列及び配列ID ＮＯ ８の軽鎖可変領域アミノ酸配列を含む抗体又はその機能的類似体産生に向けられることができる核酸配列をもたらすであろう配列ID ＮＯ ９及び配列ID ＮＯ １０に夫々示される重及び軽鎖可変領域の核酸配列において、変異が考慮されてよい。

実施態様に従い、本発明は、本発明の抗体又はその断片をコードする核酸配列にも関する。この核酸は、ＲＮＡ、ｃＤＮＡ及びその同様物であってよい。本発明の核酸配列は、当技術分野の既知のいずれかの分子生物学的技術によりキメラタンパク質を構築するために、他の核酸配列に融合されうる。例えば、本発明の核酸配列は、その後例えば本発明の抗体を精製するために用いられる、ＨＡ−Ｔａｇ又はＨｉｓ−Ｔａｇをコードする核酸に融合されうる。

他の実施態様に従い、本発明は、本発明によるモノクローナル抗体又はその断片をコードする核酸配列を含む発現ベクターにも関する。

そのような発現ベクターは、様々な種類の細胞中で、本発明に従うモノクローナル抗体又はその断片の発現のために用いられうる。そのようなベクターは、プラスミド又はウィルス性ベクターであってよい。そのようなベクターは、宿主細胞中での自律複製の能力があり、又は宿主細胞のゲノムに組み込まれうる。

本発明を達成するために召集しうるベクターの例として、ｐＣｏｍｂ３Ｘ又はｐＡＳＫ８８が挙げられうる。

本発明は、バクテリア、哺乳動物細胞（ＣＨＯ又はＨＥＫ２９３）、昆虫細胞（Ｓｆ９細胞のような）、又は植物細胞（タバコ、トマト）のような、様々な宿主細胞による、本発明の抗体又はその断片の発現も意図している。

発現後、本発明の抗体は、当技術分野における既知のいずれかの技術により単離され及び精製されうる。例えば、抗体はＨｉｓ−Ｔａｇ又はＨＡ−Ｔａｇを用いて発現され、そしてその後、ニッケルカラム上で又は当技術分野で通常的に実施されるような特異的な抗体により精製されうる。

それ故に、本発明は、本発明によるモノクローナル抗体又はその断片をコードする核酸配列により形質転換された宿主細胞にも向けられる。宿主細胞は、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム技術、リポフェクション、例えば組み換えウィルスを用いた感染のような、当技術分野で既知のいずれかの形質転換の技術に従い入手されうる。本発明は、バクテリアの場合はエレクトロポレーション、若しくは哺乳動物細胞（ＣＨＯ）の場合はリポフェクションのような、本発明によるモノクローナル抗体又はその断片をコードする核酸配列により形質転換された宿主細胞に向けられる。

医薬組成物
一つの実施態様に従い、本発明は、活性な剤として、本発明の抗体、特にはクローン６９、若しくはその断片、本発明のＨ鎖可変領域、本発明の組み換え抗ＨＩＶ抗体若しくはその断片、本発明に従う核酸、本発明に従う発現ベクター又は本発明に従う宿主細胞、及び適当なキャリアから選ばれる剤の少なくとも１の有効量を含む医薬組成物に関する。

他の実施態様に従い、上記の活性な剤が、ＨＩＶ感染の、及び特にはＨＩＶ−１感染の、予防及び／又は治療において用いられることが意図される医薬の製造のために用いられうる。

語「有効量」は、期待される効果、すなわちＨＩＶの中和及び／又はＨＩＶ感染の予防、を認めるのに必要な最小の量を意味する。個々の患者に対する本発明に従う抗体又はその断片の治療的又は予防的有効量は、副作用を最小限にしながら、治療的又は予防的効果（すなわち感染の減少又は予防）に至るために個人に与えられた抗体の量として定義されうる。有効量は、個人のＨＩＶ抗原の量の血清学的な減少により測定されうる。

本発明の抗体又はその断片の治療的又は予防的有効量のための、典型的であり、限定的でない範囲は、約０．１〜１００ｍｇ／ｋｇ、より特には約０．５〜５０ｍｇ／ｋｇ、より特には約１〜２０ｍｇ／ｋｇ、及びさらにより特には約１〜１０ｍｇ／ｋｇである。

他の実施態様に従い、本発明のモノクローナル抗体若しくはその断片、又は本発明の医薬組成物は、ＨＩＶに感染しうる又はＨＩＶにさらされやすい個人、あるいはＨＩＶにさらされた個人に、少なくとも１の本発明に従う抗体若しくはその断片、又は本発明の医薬組成物の治療的有効量を投与することにより、受動免疫療法に用いられうる。本発明の受動免疫療法は、ＨＩＶ感染により引き起こされるＡＩＤＳ又は関係する状態を示す個人に、若しくはＨＩＶ感染の恐れのある個人に実施されうる。

一つの実施態様に従い、本発明の受動免疫療法は、予防的に、すなわちＨＩＶへの起こりやすい曝露の前に、実施されてもよい。

本発明の医薬組成物は、経口で、注射で（静脈内に若しくは鼻腔内に、又は同様の方法で）、局所的に、経直腸的に、経膣的に、又は同様の方法で投与されうる。

それ故に、本発明の医薬組成物は、注射可能な又は不溶解性の滅菌溶液、分散物又は懸濁物、錠剤、丸薬、粉薬、リポソーム、座薬及びクリームのような、様々なガレノス形態下に調製されうる。

本発明の医薬組成物の製造において用いられる適当なキャリアは、実施されることが意図されるガレノス形態に従い採用されるべきである。そのような適当なキャリアは、水、生理食塩水、リン酸塩緩衝生理食塩水、デキストロース、グリセロール、及び同様物、並びにそれらの組み合わせを含むが、これらに限定されない。湿潤剤若しくは乳化剤、保存剤又は緩衝剤のような医薬的に許容される物質も、本発明の医薬組成物に含まれうる。

本発明の医薬組成物は、本発明の活性な剤に加えて、抗レトロウィルス剤のような、ＨＩＶに対する他の活性な剤も含みうる。他の実施態様に従い、そのような追加的抗レトロウィルス剤は、本発明の医薬組成物との組み合わせで、同時に、別々に、又は時間的に連続的に、投与されうる。

他の実施態様の範囲内で、本発明の抗体又はその断片は、治療用の目的のために標識されてもよく、その場合には、標識剤は、放射性同位体又は放射性核種（１３１Ｉ、９９Ｔｃ、１１１Ｉｎ又は同様物）、百日咳毒素、タキソール、サイトカラシンＢ、ドキソルビシン及び同様物のような、薬物複合体又は毒素でありうる。

診断用組成物及び応用
本発明のモノクローナル抗体又はその断片は、サンプル中のＨＩＶ株、特にはＨＩＶ−１株をインビトロで検出するための方法において診断的な剤としても用いられうる。

その実施態様の一つでは、本発明の方法は少なくとも
ａ）サンプルを少なくともの１の本発明の抗体又はその断片と、該抗体又はその断片とｇｐ４１タンパク質又はその機能的類似体との間で複合体を形成する為に適当な条件下で接触させること、及び
ｂ）該複合体の存在を検出すること
の工程を含む。

本発明に従う抗体と複合されうるｇｐ４１タンパク質の例として、例えば配列ＩＤ ＮＯ １１のアミノ酸配列を有するｇｐ４１タンパク質のような野生型ｇｐ４１タンパク質、若しくはその機能的類似体、又は例えば配列ＩＤ ＮＯ １３のアミノ酸配列を有するｇｐ４１改変ループタンパク質のような改変ｇｐ４１タンパク質、若しくはその機能的類似体が挙げられる。

複合体の検出は、当技術分野で既知のいずれかの免疫アッセイにより実施されうる。

そのようなアッセイは、放射免疫アッセイ、ウェスタンブロットアッセイ、免疫蛍光アッセイ、（ＥＬＩＳＡのような）酵素免疫アッセイ、化学発光アッセイ、免疫組織化学的アッセイ、及び同様方法を含むが、これらに限定されない。

さらに検出の容易のために、本発明のモノクローナル抗体又はその断片が、検出可能なマーカーにより標識されうる。標識剤の例として、フルオレセイン若しくはローダミンのような蛍光化合物、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ若しくはルシフェラーゼのような酵素、アビジン若しくはストレプトアビジン結合の間接的測定を通じた検出を許すビオチン、又は例えば放射性同位体若しくは放射性核種として３Ｈ、１４Ｃ若しくは１２５Ｉを含む放射性標識されたアミノ酸が挙げられる。

その実施態様の他に従い、本発明は、本発明による抗体又はその断片を含む診断用組成物にも向けられる。

本発明をより理解されるように、以下の実施例が説明される。

これら実施例は、説明の目的のためのみであり、何らかの様式に本発明の範囲を限定するとして解釈されるものでない。

図面の説明
図１：高度に曝露された、持続的にＩｇＧ血清陰性（ＨＥＰＳ）の個人の抗ＨＩＶ−１ ＩｇＡ含有膣頸部分泌物にさらされたｇｐ４１由来のＨＩＶ−１タンパク質のイムノブロットを表す。陽性対照として、ｇｐ４１ペプチドのイムノブロットが、ＨＩＶ血清陽性の個人から得られた血清を用いて行われた。そして、陰性対照として、同じ実験がＨＩＶ血清陰性の個人の血清を用いて行われた。

図２：プラスミドｐＣｏｍｂ３Ｘの概略図を表しており、Ｆａｂ ＩｇＡファージライブラリー由来の重及び軽鎖の可変及び定常領域は、夫々制限酵素部位Ｓａｃ １とＸｂａ １の間、及びＸｈｏ １とＳｐｅ １の間に挿入されている。

図３：選択されたＩｇＡ Ｆａｂクローンによる子宮内膜ＨＥＣ−１細胞株を横切るＨＩＶ−１のトランスサイトーシスの阻害を表す。陰性対照は、抗体なしの（標準）又は空のプラスミドＴＯＰ１０により得られたファージライブラリーの選抜から生じた産物を用いた実験の実施により得られた。陽性対照は、２Ｆ５抗体ＩｇＡを用いることにより得られた。

図４：ＨＩＶ株ＨｘＢ２（アミノ酸５４６から６８２）の野生型ｇｐ４１タンパク質、ロイシンジッパー、ＢＳＡ及びリゾチームについて、クローンＦａｂ６９及び抗体αＩｇＡ ２Ｆ５により実施されたドットブロットを表す。ニトロセルロース膜の洗浄後、抗体タンパク質複合体は、Ｆａｂクローン６９についてはマウス抗Ｈｉｓ抗体、２Ｆ５抗体についてはマウス抗ヒト抗体とともにインキュベートされた。両方とも、ホースラディッシュペルオキシダーゼに結合されたヤギ抗マウス抗体により明らかにされ、そしてＥＣＬ及びオートラジオグラフィーが続いた。

図５：本発明に従う抗体のＨ鎖可変領域の相補性決定配列（配列ＩＤ ＮＯ １としてＣＤＲ１、配列ＩＤ ＮＯ ２としてＣＤＲ２、配列ＩＤ ＮＯ ３としてＣＤＲ３）、及び本発明に従う抗体のＬ鎖可変領域のＣＤＲ（配列ＩＤ ＮＯ ４、配列ＩＤ ＮＯ ５及び配列ＩＤ ＮＯ ６のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３）に対応するアミノ酸配列を表す。

図６Ａ及び６Ｂ：クローンＦａｂ６９の重鎖可変領域（配列ID ＮＯ ７及び配列ID ＮＯ ９）及び軽鎖可変領域（配列ID ＮＯ ８及び配列ID ＮＯ １０）のアミノ酸配列及び核酸配列を表す。

図７：オンラインで無料で利用できる（かつＭ．Ｐ．ＬＥＦＲＡＮＣ，フランスにより作られた）ＩＭＴＧプログラムを用いて得られたＦａｂ ＩｇＡクローン６９の軽及び重鎖のフレームワーク（ＦＲ）領域及び相補性決定領域（ＣＤＲ）のアミノ酸配列を表す。ＩＭＧＴ／Ｖ−ＱＵＥＳＴ ソフトウェア（http://imgt.cines.fr）。

図８：野生型ｇｐ４１タンパク質に対応するアミノ酸配列、配列ＩＤ ＮＯ １１（ＨＩＶ−１株ＨｘＢ２）、ペプチドＰ１配列ＩＤ ＮＯ １２を表す。

図９：ｇｐ４１改変ループタンパク質のアミノ酸配列、配列ＩＤ ＮＯ １３を表す。

表１：ＨＥＰＳ個人から得られたＤＮＡを増幅するために用いられたプライマーの配列を表す。

表2：ファージディスプレイライブラリーからＦａｂ ＩｇＡの核酸配列を同定し及び配列決定するために用いられたプライマーの配列を表す。

実施例１
高度に曝露された、持続的にＩｇＧ血清陰性（ＨＥＰＳ）の個人の膣頸部分泌物中の抗ＨＩＶ−１ ＩｇＡの同定

カンボジア出身の５６のＨＥＰＳの頸部分泌物がＨＩＶ−エンベロープ糖タンパク質 Ｓ−ＩｇＡについて試験された。分泌物は、３ｍｌの滅菌ＰＢＳを用いて２日の性的禁欲後に集められた。サンプルは、遠心され、そして冷凍され、そして−８０℃で保存された。精液によるサンプルの汚染が、インキュベート時間を増加させ及び基質としてオルト−フェニレンジアミンジヒドロクロライドを用いて最適化されたこと以外は製造業者に従う精液検出分析（SEMA; HUMANGEN FERTILITY DIAGNOSTICS, Charlottesville, VA）を用いて測定された。汚染されたサンプルは廃棄された。

ＨＩＶに対する特異的なＩｇＡ抗体の存在が、市販入手可能なキット（New Lav Blot1, Sanofi-Pasteur, フランス）を用いて、製造業者に従う手順を用いて、ウェスタンブロットにより試験された。

試験されたサンプルのうち、２２は高水準の抗ＨＩＶエンベロープｇｐ４１分泌型ＩｇＡ（Ｓ−ＩｇＡ）を含有した（図１）。

実施例２
ＩｇＡのＦａｂを発現するコンビナトリアルファージディスプレイライブラリーの構築

実施例１の２２の同定されたＨＥＰＳの粘膜のＢ細胞が、ＩｇＡのＦａｂを発現するコンビナトリアルファージディスプレイライブラリーを構築するために用いられた。

全ＲＮＡは、２２のＨＥＰＳ個人の膣頸部分泌物由来の濃縮されたＢ細胞集団から、標準的な技術を用いて調製された。全ＲＮＡ（60μｇ）は、迅速な一段階のグアニジンイソチオシアネート／フェノールクロロホルムに基づくＲＮＡ単離により、頸部Ｂ細胞から精製された（CHOMCZYNSKI & SACCHI, Anal. Biochm., 1987, 162:156-9.）。この全ＲＮＡは逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）を用いて、相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）に転換された。得られたｃＤＮＡライブラリーは、表1に表される粘膜Ｆａｂ ＩｇＡ特異的プライマーを用いて増幅された。

増幅されたＤＮＡはその後、軽鎖（Ｌ）に対してはＳａｃ 1及びＸｂａ １、並びに重鎖（Ｈ）に対してはＸｈｏ １及びＳｐｅ １により消化され、そして消化産物は同じ酵素により消化されたベクターｐＣｏｍｂ３Ｘ（BARBAS et al., Proc Natl Acad Sci U S A, 1991, 88:7978-82）中に挿入された。消化されたベクターと消化されたＰＣＲ産物はＴ４ファージのＤＮＡリガーゼを用いて連結された（４の挿入物と１のベクターとＴ４ＤＮＡリガーゼ、１４℃で一晩）（図２）。得られた組み換えプラスミドはその後、エレクトロポレーションによりバクテリアＥ．ｃｏｌｉ（ｐｉｌｕｓ+，ｍａｌｅ）ＴＧ１を形質転換するために用いられた。

バクテリアの形質転換後の培養液中における抗体ｃＤＮＡのライブラリーがその後、ヘルパーファージＶＣＳ−Ｍ１３（１０１２pfu）（Strategene, La Jolla, CA）による重感染によりバクテリオファージ上で発現された。

ファージ調製物が回収された。ファージは２０％（重量／体積）ポリエチレングリコール８０００及び２．５Ｍ ＮａＣｌの添加と、それに続く１時間の氷上でのインキュベーションにより沈殿された。遠心後、ファージペレットがリン酸塩緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）に再懸濁され、そして数分間微量遠心されペレットデブリにされた。

タイタープレートからのコロニーの制限消化分析は、約３５％のファージがＦａｂ ＩｇＡを含むこと、及びライブラリーに含有される力価は概して１０^７cfu/mlであり、そして１０^７の種々のクローンであった。

実施例３
ｇｐ４１改変ループタンパク質（配列ID ＮＯ １３）上でのＦａｂ ＩｇＡファージライブラリーのスクリーニング

Ｆａｂ ＩｇＡファージディスプレイライブラリーがマイクロパンニングにより選抜された。マイクロパンニングにおいて抗原濃度はそれぞれのラウンドで異なる状態であった。スクリーニングに用いられた抗原はｇｐ４１改変ループタンパク質（配列ＩＤ ＮＯ １３）であった。用いられたペプチドＰ１の開始量は２０μｇであった、そしてその量はそれぞれのラウンドで２で割られ、最終的に第４回目でその量は２．５μｇに至った。

ｇｐ４１改変ループタンパク質（配列ＩＤ ＮＯ １３）によるＦａｂ ＩｇＡファージディスプレイライブラリーの選抜に先立ち、第１のパンニングラウンドが、２０μｇ（１００μＭ）の量のペプチドＰ１（配列ＩＤ ＮＯ １２）（ALFSEN & BOMSEL, 2002, J. Biol. Chem., 277:25649-59; ベルギー王国、Eurogentecより入手）（この量でこのペプチドはオリゴマー化状態になる）により実施された。そのような手順は、オリゴマー化状態のペプチドＰ１に結合しうるいずれかのＦａｂ ＩｇＡを捨て去ることを許す。

用いられたｇｐ４１改変ループタンパク質の出発量は、１μｇであり、そしてその量は夫々のラウンドで２で割られ、最終的には第４回目において１２５ｎｇの量に至った。

９６−プレートのウェル（Exiqon peptide Immobilirez, 10202-111-10）が１μｇのｇｐ４１改変ループタンパク質で覆われ、その後、ウェルはＢＳＡにより３７℃で２時間ブロックされた。ライブラリーから調製された濃縮ファージがその後、ウェルに１０１２〜１０１３pfuで加えられ、３７℃で２時間置かれた。結合されなかったファージはその後激しい洗浄、第１回目及び第２回目の選抜のラウンドでは、０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０を含有するＰＢＳにより１０回、それから界面活性剤を除去するためにＰＢＳにより１０回、により除去された。選抜の後のラウンドでは、洗浄は０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０を含むＰＢＳで２０回実施され、その後ＰＢＳで２０回実施された。ｇｐ４１改変ループタンパク質結合性表面Ｆａｂのエピトープを持つファージの特異的な溶出が、０．１Ｍグリシン−ＨＣＬによる処理により、ｐＨ２．２に調節されて１０分間実施された。溶出液はすぐに中和され、そして新鮮な２ｍｌのＥ．ｃｏｌｉ ＴＧ１ バクテリア培養液（ＯＤ６００＝１）を感染するために用いられた。バクテリアは、３０℃で３０分間インキュベートされ、培養液の体積は増加させられ、そして培養液は３７℃の振とう器中で１時間インキュベートされ、そしてその後１０１２pfu/mlのＶＣＳ−Ｍ１３ヘルパーファージが、組み換えファージの一晩かけての製造のために添加された。溶出されたファージは、それぞれのパンニングラウンドの間に増幅された。

パンニング後、４つのラウンドからの個々のクローンが増殖させられ、そしてＦａｂの存在が、表2に示される、ベクターにＦａｂ軽及び重鎖に対して上流及び下流でハイブリダイズする、特異的なプライマーを用いてＰＣＲにより監視された。Ｆａｂ ＩｇＡを含有するクローンは、Ｅ．ｃｏｌｉアンバー非サプレッサー株に形質転換することにより可溶化Ｆａｂに転換され、そしてＩＭＧＴ／Ｖ−ＱＵＥＳＴソフトウェアを用いて重（Ｈ）及び軽（Ｌ）鎖の可変領域配列を決定するために配列決定された（図７）。

免疫グロブリン遺伝子の配列決定
配列決定は、Ｔａｑ蛍光ジデオキシヌクレオチドターミネーターサイクルシーケンシングキット（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて自動化されたＤＮＡシーケンサーを用いて行われた。二本鎖ＤＮＡはバクテリアから調製され、そして配列決定はｐＣｏｍｂ３Ｘベクターに夫々のＦａｂ鎖の上及び下流で特異的にアニールするプライマーのセット（表2参照）を用いて実施された。

図６Ａ及び６Ｂは、クローン６９のＨ及びＬ鎖可変領域の配列決定の結果を示す（配列ID ＮＯ ９及び配列ID ＮＯ １０）。

図７は、ＩＭＧＴソフトウェアを用いた相補性決定領域の対応するアミノ酸配列の同定結果を示す。

クローニングのために用いられたベクターは、タグ（Ｈｉｓ−ｔａｇ及びＨＡ−ｔａｇ）配列及びファージタンパク質ｐIIIの間にアンバーコドンを有し、ＴＧ１のようなＥ．ｃｏｌｉサプレッサー株を用いてファージのコートタンパク質と融合された抗体を製造するため、又はＴＯＰ−１０のような非サプレッサー株中においてベクターを発現することにより可溶化抗体を製造するための機会を提供する。この利点を考慮し、ファージのＤＮＡは、ｐIII融合タンパク質なしで可溶Ｆａｂ断片を発現するために、ＴＯＰ−１０Ｅ．ｃｏｌｉ（アンバー非サプレッサー株）を形質転換するために用いられた。Ｆａｂ発現は１ｍＭイソプロピルｂ−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を用いて誘導された。

本発明のモノクローナル抗体の大規模発現のために、オペロン全体がｐＣｏｍｂ３ＸからベクターｐＡＳＫ８８に移された（SKERRA A,. Gene, 1994, 151(1-2): p. 131-5; Gene, 1994, 141(1): p. 79-84; SKERRA A,. et al., Biotechnology(N Y), 1991. 9(3), p.273-8; SKERRA A. & A. PLUCKTHUN,Protein Eng, 1991, 4(8):p971-9）。

本発明のモノクローナル抗体のＦａｂ ＤＮＡは、ｐＡＳＫ８８ベクター中へのサブクローニングに必要とされる制限部位を導入する特異的なプライマーを用いて増幅された。増幅産物はアガロースゲル電気泳動により精製され、そして重鎖の場合は制限酵素Ｐｓｔ1及びＮｃｏ1により、軽鎖の場合はＳａｃ1及びＨｉｎｄIIIにより切断された。Ｆｄ（ＶＨ−ＣＨ１）及び軽鎖（ＶＬ−ＣＬ）遺伝子は、標準的なプロトコルを用いて、同じ制限酵素により消化されたｐＡＳＫ８８中に別個に挿入され、そして連結された。連結産物はサーモコンピテントＪＭ８３（Ｓｋｅｒｒａ博士より提供）バクテリアの細胞中に形質転換され、個々のクローンにおいて分離するためにプレートされた。いくつかのクローンについてのプラスミドＤＮＡは、制限消化により、及びそれらのうちのいくつかについては、特異的なプライマーを用いた二本鎖配列決定により分析された（SKERRA A,. Gene, 1994, 151(1-2): p. 131-5; Gene, 1994, 141(1): p. 79-84; SKERRA A,. et al., Biotechnology(N Y), 1991. 9(3), p.273-8; SKERRA A. & A. PLUCKTHUN,Protein Eng, 1991, 4(8):p971-9）。

発現ベクターｐＡＳＫ８８は、免疫グロブリンの可変ドメイン遺伝子の簡便なクローニング並びにエシェリヒア コリにおいて対応するＦａｂ断片のペリプラズムの分泌のために設計された。このプラスミドにおいて、発現はテトラサイクリンプロモーターの制御下にあった。

大量の本発明のモノクローナル抗体が、このベクターを用いて得られた。予備的発現は１リットルスケールで実施され、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｋ−１２ ＪＭ８３を発現宿主として採用した。細胞は、対数増殖期中期に増殖させられ、そしてその後Ｆａｂ発現が０．２ｍｇ／Ｌアンヒドロテトラサイクリンにより４時間又は一晩誘導された。

本発明のモノクローナル抗体の精製は、Ｎｉ−ＮＴＡスピンカラム（Ｑｉａｇｅｎ）上でＨｉｓ−ｔａｇとの相互作用により実施された。滅菌されたペリプラズム画分フィルターがカラム上に適用され、そしてクロマトグラフィーバッファー中の２５０〜５００ｍＭの勾配がサンプルを集めるために加えられた。

実施例４
ファージディスプレイライブラリーからの可溶ＩｇＡ Ｆａｂクローンにより実施されたＥＬＩＳＡアッセイ

ＥＬＩＳＡはＴＯＰ−１０Ｆ’バクテリア（ｐＣｏｍｂ３Ｘ系）から得られた可溶ＩｇＡ Ｆａｂにより及びＫ−１２ ＪＭ８３バクテリア（ｐＡＳＫ８８系）から得られた可溶ＩｇＡ Ｆａｂにより実施された。

プレート（固定化されたExiqonペプチド, 10202-111-10又はNUNC, 439454）のウェルが１００ｎｇのｇｐ４１改変ループタンパク質（配列ＩＤ ＮＯ １３）により覆われ、そしてＢＳＡにより３７℃で２時間ブロックされた。それから、精製されたＩｇＡが２ｎｇ／ｍｌで添加され、そして３７℃で２時間インキュベートされた。検出は、マウス抗Ｈａ抗体（クローン１２ＣＡ５、Ｒｏｃｈｅ）又は抗Ｈｉｓ（ＰｅｎｔａＨｉｓ、Ｑｉａｇｅｎ ３４６６０）、及び続くホースラディッシュペルオキシダーゼヤギ抗マウス抗体（Caltag Laboratories,H1003）により、行われた。酵素の反応は基質としてＴＭＢ（3,3’,5,5’-テトラメチルベンジジン, Kikergaard & Perry Laboratories Inc.）を添加することにより進展され、吸収は、１Ｍリン酸の添加後に、ＥＬＩＳＡリーダーを用いて４５０ｎｍで測定された。陽性対照は２Ｆ５抗体であり、陰性対照はパンニング後に得られた、ＥＬＩＳＡによりｇｐ４１改変ループタンパク質を認識しないクローンであった。

実施例５
トランスサイトーシスの阻害

上皮細胞を横切るＨＩＶ−１トランスサイトーシス及び抗体によるトランスサイトーシスの中和が、２つの独立したチャンバー（上皮単層の頂端（発光）面を浴につける上部のもの及び基底（漿膜）面を浴につける下部のもの）の間に境界面を形成する透過性フィルター支持体（０．４５μｍ孔径）上に、７日間、すき間の無い、極性が与えられた単層として増殖させられた腸細胞株ＨＥＣ−１上で実施された。

ＰＢＭＣはLAGAYAら（J. Virol, 2001, 75:4780）において示されたように得られ、そして調製された。それから、ＰＢＭＣは、フィトヘマグルチニン（ＰｈＡ）により４８時間活性化され、そしてＨＩＶ−１ ＪＲＣＳＦクローンＲ５又はＹＵ２を接種され、そして感染後７日で用いられた。精製されたＳ−ＩｇＡ（５ｎｇ／ｍｌ）は頂端側のチャンバーに添加され、そして３７℃で１０分間インキュベートされた。

ウィルストランスサイトーシスを開始するために、２．１０６ＨＩＶ−１+ＰＢＭＣが頂端側のチャンバーに添加された。ＨＩＶ−１+ＰＢＭＣと上皮細胞単層の間の接触は、ＨＩＶ−１ウィルス粒子の迅速な発芽を結果し、上皮細胞の頂端側から基底側の極へのそれらのトランスサイトーシスが続いた。２時間後、抗体によるトランスサイトーシスの阻害が、ＥＬＩＳＡ（Coulter, France or PASTEUR SANOFI, FRANCE）による基底側培地中のＨＩＶのタンパク質ｐ２４の検出により決定された。抗体の不存在における若しくはｇｐ４１改変ループタンパク質非特異的Ｆａｂの存在における、又は対照ＩｇＡ ２Ｆ５の存在における、ｐ２４の水準が、夫々陰性又は陽性の対照として、夫々１００、９８及び３５％の値で測定された。陰性対照の値は、トランスサイトーシスの１００％として扱われ、そして結果を表すために用いられた。

実験は、３つの独立した実験において行われた。

結果は、５０％超だけＨＩＶトランスサイトーシスを阻害できた３つのクローンを確認することを許し、それらはクローン６９であった（図３）。

実施例６
ドットブロット

ＢＳＡ、ロイシンジッパー、リゾチーム及びＨＩＶ株ＨｘＢ２の野生型ｇｐ４１タンパク質（５４６から６８２のアミノ酸配列、ＡＢＩから入手）が、夫々１００ｎｇ／ｍｌでニトロセルロース膜にドットされた。その後、Ｆａｂクローン６９が５ｎｇ／ｍｌで、又は抗体２Ｆ５ α ＩｇＡが２μｇ／ｍｌ １：２５００で、ニトロセルロース膜とインキュベートされた。

ニトロセルロース膜の洗浄後（ウェスタンブロッキング試薬、Ｒｏｃｈｅ：製造者説明書に従い、ブロッキングには１％、抗体結合には０．１％）、免疫複合体が、Ｆａｂクローン６９ついてはマウス抗Ｈｉｓ抗体（Ｑｉａｇｅｎ、０．２ｍｇ／ｍｌ、１：５０００）と共に、２Ｆ５ α ＩｇＡについてはマウス抗ヒト抗体と共に、インキュベートされた。両方とも、ホースラディッシュペルオキシダーゼに結合したヤギ抗マウス抗体（Ｃａｔａｌｏｇ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｈ１００３ １／４０００）を明らかにし、ＥＣＬ及びオートラジオグラフィー（ＥＣＬ、Ａｍｅｒｓｈａｍ、製造者の説明書に従った）が続いた。

図４は、２回繰り返された実験の代表的結果である。

ｇｐ４１由来のHIV-1タンパク質のイムノブロットの結果の図である。 プラスミドpＣｏｍｂ3Xの概略図である。 選択されたＩｇＡ ＦａｂクローンによるＨＩＶ−１のトランスサイトーシスの阻害結果を表すグラフである。 ＨＩＶ−１株ＨｘＢ２の野生型ｇｐ４１タンパク質に対して、クローンＦａｂ６９及び抗体α ＩｇＡ ２Ｆ５と共に実施されたドットブロットの結果の図である。 本発明に従うＨ鎖可変領域及びＬ鎖可変領域の相補性決定領域に相当するアミノ酸配列である。 クローンＦａｂ６９の重鎖可変領域及び軽鎖可変領域のアミノ酸配列並びにクローンＦａｂ６９の重鎖可変領域の核酸配列である。 クローンＦａｂ６９の軽鎖可変領域の核酸配列である。 Ｆａｂ ＩｇＡクローン６９の軽及び重鎖のフレームワーク（ＦＲ）領域及び相補性決定領域（ＣＤＲ）のアミノ酸配列である。 野生型ｇｐ４１タンパク質に相当するアミノ酸配列及びペプチドＰ１配列である。 ｇｐ４１改変ループタンパク質のアミノ酸配列である。

Claims (18)

1. 配列ＩＤ ＮＯ １、配列ＩＤ ＮＯ ２、配列ＩＤ ＮＯ ３のアミノ酸配列を夫々有するＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を、Ｈ鎖可変領域中に含み、配列ＩＤ ＮＯ ４、配列ＩＤ ＮＯ ５、配列ＩＤ ＮＯ ６のアミノ酸配列を夫々有するＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を、Ｌ鎖可変領域中に含み、且つ、ＨＩＶを中和する能力を有するモノクローナル抗体。
2. 配列ＩＤ ＮＯ １２のアミノ酸配列のペプチドを認識しない、請求項１に従うモノクローナル抗体。
3. ＩｇＡである、請求項１又は２に従うモノクローナル抗体。
4. ヒト抗体である、請求項１〜３のいずれか１項に従うモノクローナル抗体。
5. Ｈ鎖可変領域が配列ＩＤ ＮＯ ７のアミノ酸配列を有し、かつＬ鎖可変領域が配列ＩＤ ＮＯ ８のアミノ酸配列を有する、請求項１〜４のいずれか１項に従うモノクローナル抗体。
6. 中和されるＨＩＶがＨＩＶ−１株である、請求項１〜５のいずれか１項に従うモノクローナル抗体。
7. 配列ＩＤ ＮＯ １、配列ＩＤ ＮＯ ２、配列ＩＤ ＮＯ ３のアミノ酸配列を夫々有するＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含む、組み換え抗ＨＩＶ抗体のＨ鎖可変領域。
8. 請求項７に従うＨ鎖可変領域であって、配列ＩＤ ＮＯ １２のアミノ酸配列のペプチドを認識しないＨ鎖可変領域。
9. 請求項７又は８に従うＨ鎖可変領域を含み、且つ、配列ＩＤ ＮＯ ４、配列ＩＤ ＮＯ ５、配列ＩＤ ＮＯ ６のアミノ酸配列を夫々有するＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を、Ｌ鎖可変領域中に含む、組み換え抗ＨＩＶ抗体。
10. 請求項１〜６のいずれか１項に従い定義されるモノクローナル抗体をコードする核酸。
11. Ｈ鎖の核酸配列が配列ＩＤ ＮＯ ９である、請求項１０に従う核酸。
12. Ｌ鎖の核酸配列が配列ＩＤ ＮＯ １０である、請求項１１に従う核酸。
13. 請求項１０〜１２のいずれか１項に従い定義される核酸を含む発現ベクター。
14. 請求項１０〜１２のいずれか１項に従い定義される核酸により又は請求項１３に従い定義される発現ベクターにより形質転換された宿主細胞。
15. 請求項１〜６及び９のいずれか１項に従い定義される抗体、請求項１０〜１２のいずれか１項に従い定義される核酸、請求項１３に従い定義される発現ベクター、又は請求項１４に従い定義される宿主細胞から選ばれる有効量の剤を、活性な剤として、及び適当なキャリアを含む、医薬組成物。
16. 請求項１〜６及び９のいずれか１項に従い定義される抗体、請求項１０〜１２のいずれか１項に従い定義される核酸、請求項１３に従い定義される発現ベクター、又は請求項１４に従い定義される宿主細胞を、適当なキャリアと一緒にする工程を含む、ＨＩＶ感染の予防及び／又は治療において用いられることが意図される医薬の製造のために使用する方法。
17. 請求項１〜６及び９のいずれか１項に従い定義される、抗体を含む診断用組成物。
18. サンプル中のＨＩＶ株をインビトロで検出する方法において、少なくとも
    ａ）該サンプルと、請求項１〜６及び９のいずれか１項に従い定義される少なくとも１の抗体とを、該抗体とｇｐ４１タンパク質との間で複合体を形成する為に適当な条件下で、接触させること、及び
    ｂ）該複合体の存在を検出すること
    の工程を含む方法。

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