JP4900984B2 - Manufacturing method of sustained-release preparation - Google Patents

Description

〔式中、Ａ¹及びＡ²はそれぞれプロトン受容基又はプロトン受容基に変換し得る基を、Ｄはヘテロ原子及び／又は５もしくは６員環を介していてもよい２ないし６の原子鎖のスペーサー（但し、５もしくは６員環は結合位置により２又は３原子鎖と換算する）を、Ｒ¹は水素原子又は炭化水素基を、Ｒ²は水素原子又はα−アミノ酸から−ＣＨ(ＮＨ₂)ＣＯＯＨを除いた残基を示すか、又はＲ¹とＲ²は結合して５もしくは６員環を形成してもよく、Ｐはヘテロ原子及び／又は５もしくは６員環を介していてもよい１ないし１０の原子鎖のスペーサー（但し、５もしくは６員環は結合位置により２又は３原子鎖と換算する）を、Ｙはエステル化又はアミド化されていてもよいカルボキシル基を、ｎは０ないし８の整数を示す。〕で表される2-ピペラジノン-1-酢酸誘導体またはその塩である上記(6)記載の製造法、
（8）2-ピペラジノン-1-酢酸誘導体（I)が(S)-4-(4-グアニジノベンゾイルアミノ)アセチル-3-[3-(4-グアニジノベンゾイルアミノ)]プロピル-2-オキソピペラジン-1-酢酸である上記(7)記載の製造法、
（9）2-ピペラジノン-1-酢酸誘導体(I)の塩が(S)-4-(4-グアニジノベンゾイルアミノ)アセチル-3-[3-(4-グアニジノベンゾイルアミノ)]プロピル-2-オキソピペラジン-1-酢酸 塩酸塩である上記(7)記載の製造法、
（10）2-ピペラジノン-1-酢酸誘導体(I)の塩が(S)-4-(4-グアニジノベンゾイルアミノ)アセチル-3-[3-(4-グアニジノベンゾイルアミノ)]プロピル-2-オキソピペラジン-1-酢酸 ２塩酸塩である上記(7)記載の製造法、
（11）生体内分解性高分子重合物が脂肪族ポリエステルである上記(1)記載の製造法、
（12）脂肪族ポリエステルが乳酸・グリコール酸共重合物である上記(11)記載の製造法、
（13）油脂類が脂溶性ビタミンである上記(1)記載の製造法、
（14）脂溶性ビタミンがα−トコフェロールである上記(13)記載の製造法、
【０００６】
（15）油脂類の徐放性マイクロカプセル全量に対する最終含有率が約３％ないし約３０％(w/w)である上記(1)記載の製造法、
（16）水溶性生理活性物質と塩基性物質とを含む水溶液を内水相とし、生体内分解性高分子重合物と油脂類とを含む均一有機溶媒溶液を油相とするＷ／Ｏ型乳化物を水相に分散させてＷ／Ｏ／Ｗ型乳化物を形成させ、水中乾燥に付し有機溶媒を除去する上記(1)記載の製造法、
（17）塩基性物質が塩基性アミノ酸である上記(3)または(16)記載の製造法、
（18）塩基性アミノ酸がL-アルギニンである上記(17)記載の製造法、
（19）塩基性物質の徐放性マイクロカプセル全量に対する最終含有率が約１％ないし約８％(w/w)である上記(3)または(16)記載の製造法、
（20）水溶性生理活性ペプチドの金属複合体を、生体内分解性高分子重合物と油脂類とを含む均一有機溶媒溶液に分散させたＳ／Ｏ型分散液より有機溶媒を除去することを特徴とする徐放性マイクロカプセルの製造法、
（21）Ｓ／Ｏ型分散液を水相に分散させてＳ／Ｏ／Ｗ型乳化物を形成させ、水中乾燥法により有機溶媒を除去する上記(20)記載の製造法、
（22）水溶性生理活性ペプチドがヒト成長ホルモンである上記(20)記載の製造法、
（23）水溶性生理活性ペプチドの金属複合体がヒト成長ホルモンの亜鉛複合体である上記(20)記載の製造法、
（24）上記(1)記載の製造法で製造される徐放性マイクロカプセル、
（25）上記(20)記載の製造法で製造される徐放性マイクロカプセル、
（26）水溶性生理活性物質を含む水溶液を内水相とし、生体内分解性高分子重合物を含む有機溶媒溶液を油相とするｗ／ｏ型乳化物を形成させ、有機溶媒を除去することを特徴とする徐放性マイクロカプセルの製造のための油脂類の使用、
（27）水溶性生理活性ペプチドの金属複合体の徐放性マイクロカプセルの製造のための油脂類の使用、などに関する。
【０００７】
本明細書において、アミノ酸、ペプチド、保護基などに関して略号で表示する場合、IUPAC-IUB Commission on Biochemical Nomenclatureによる略号あるいは当該分野における慣用略号に基づくものとし、またアミノ酸に光学異性体がありうる場合は、特に明示しなければＬ体を示すものとする。
本明細書中マイクロカプセルとは、生理活性物質と高分子重合物を含有する微粒子マイクロスフェア、マイクロパーティクル、ナノパーティクル、ナノスフェア、ナノカプセルの総称を意味する。
本明細書中Ｓ/Ｏ/Ｗ型乳化物およびＷ/Ｏ/Ｗ型乳化物とは、それぞれ固/油/水(水中油中固相)型乳化物および水/油/水(水中油中水相)型乳化物を意味する。
本発明に用いられる水溶性生理活性物質としては水溶性の薬物であれば特に限定されないが、生理活性ポリペプチドあるいは抗血小板剤（例えば、インテグリン拮抗物質）、抗腫瘍剤、抗生物質、解熱鎮痛消炎剤、鎮咳去痰剤、鎮静剤、筋弛緩剤、抗てんかん剤、抗潰瘍剤、抗鬱剤、抗アレルギー剤、強心剤、不整脈治療剤、血管拡張剤、降圧利尿剤、糖尿病治療剤、抗凝血剤、止血剤、抗結核剤、ホルモン剤、麻薬拮抗剤、骨吸収抑制剤、骨形成促進剤、血管新生抑制剤などとして用いられる化合物などが挙げられる。
【０００８】
該水溶性生理活性物質としては、２５℃において水に対する溶解度が０．１％（w/w）以上、好ましくは１％（w/w）以上であるものが具体的に挙げられる。
本発明の構成成分である生理活性ポリペプチドとしては、哺乳動物にとって有用な生理活性を有し、臨床上用いることができる種々のペプチドまたはタンパク質が挙げられる。該「生理活性ポリペプチド」は、その分子量が、モノマーとして、例えば約２００ないし約２００,０００のものが用いられ、好ましくは約２００ないし約８０,０００のものが汎用される。好ましい生理活性ポリペプチドには、生化学の分野で高次構造を有すると云われるタンパク質に分類される高分子が含まれる。本発明で用いられる生理活性ポリペプチドの種類は、本発明の目的が達成される限り特に限定されないが、その活性の代表的なものとしては、例えば成長因子類、サイトカイン類、酵素類およびホルモン類などが挙げられる。より具体的には、例えば以下のペプチドないしタンパク質などが挙げられる。
【０００９】
（１）成長因子類としては、例えば神経成長因子(ＮＧＦ−１，ＮＧＦ−１など)、神経栄養因子(ＮＴＦ)、上皮細胞成長因子(ＥＧＦ)、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ)、インスリン様成長因子(ＩＧＦ−１，ＩＧＦ−２，ＩＧＦ−３など)、繊維芽細胞増殖因子（ａＦＧＦ，ｂＦＧＦ)、骨形成原成長因子（ＢＭＰ−１，ＢＭＰ−２，ＢＭＰ−３，ＢＭＰ−４など)、心房性ナトリウム利尿因子（ＡＮＰ)、軟骨誘導因子などが挙げられる。
（２）サイトカイン類としては、例えばインターフェロン類(ＩＦＮ−α，−β，−γなど)、インターロイキン類（ＩＬ−１〜ＩＬ−１１など)、カケクチン、オンコスタチン、コロニー刺激因子類(Ｇ−ＣＳＦ，Ｍ−ＣＳＦ，ＧＭ−ＣＳＦなど)、トロンボポエチン(ＴＰＯ)，エリスロポエチン(ＥＰＯ)などが挙げられる。
（３）酵素類としては、例えば組織プラスミノーゲン・アクチベータ（ｔＰＡ)、ウロキナーゼ（ＵＫ）、ストレプトキナーゼ、プロテインＣ、メタロプロテアーゼ類、スーパーオキシド・ディスムターゼ（ＳＯＤ)、第ＶＩＩＩ及びＩＸ因子などが挙げられる。
（４）ホルモン類としては、例えば成長ホルモン（ＧＨ)、成長ホルモン放出因子(ＧＲＦ)、インスリン、グルカゴン、ガストリン、プロラクチン、副腎皮質刺激ホルモン(ＡＣＴＨ)、甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ)、卵胞刺激ホルモン(ＦＳＨ)、黄体形成ホルモン(ＬＨ)、ヒト絨毛性ゴナドトロピン(ｈＣＧ)、カルシトニンなどが挙げられる。
該生理活性ポリペプチドの好ましい例としては、例えばホルモン類〔例えば、成長ホルモン類（ヒト成長ホルモン類など)、インスリン類（ヒトインスリン類など)など〕、サイトカイン類（例えば、インターフェロン類、インターロイキン類など)などが挙げられる。
【００１０】
本発明で用いられる生理活性ポリペプチドは、天然由来あるいは遺伝子組換えやペプチド合成技術によって人工的に得られた合成品、半合成品、遺伝子組換体〔例えば、遺伝子組換えヒト成長ホルモン（以下、rhＧＨと略称することがある）〕いずれでもよい。これらはその活性に影響のない限り糖鎖を有していてもよく、また糖鎖構造が本来の構造と異なっていてもよい。さらに、これらは任意の生理活性ポリペプチドまたは蛋白のムテイン、誘導体、類縁体および活性フラグメントなども含む。以下において「生理活性ポリペプチド」、「成長ホルモン類」、「インスリン類」、「インターフェロン類」、「インターロイキン類」は、それぞれこれら糖鎖を有しているもの、ムテイン、誘導体、類縁体および活性フラグメントを含む。さらに生理活性ポリペプチドが任意のポリペプチドのムテイン、誘導体、類縁体である場合、その作用機作は作動性あるい拮抗性のいずれでもよい。
また、本発明で用いられる生理活性ポリペプチドは、金属原子と複合体（コンプレックス）を形成していてもよい。ポリペプチドの金属複合体（金属コンプレックス）としては、ポリペプチドの水不溶性または水難溶性多価金属複合体や金属錯体などが挙げられる。かかる金属複合体を形成させる金属としては、生体に悪影響をおよぼさない金属であれば特に限定されないが、水溶性多価金属（２価、３価あるいは４価の金属、例えば鉄、銅、亜鉛等の遷移金属、アルミニウム等のIIIb族金属、錫等のIVb族金属など）が好ましい。また、ポリペプチドの金属複合体としては、生理活性ポリペプチドと水溶性多価金属塩(例えば、前記多価金属と塩酸、硫酸、硝酸、チオシアン酸等の無機酸との塩あるいは前記多価金属と脂肪族カルボン酸（例えば、脂肪族モノ、ジ、トリカルボン酸、好ましくは、炭素数２ないし９の脂肪族カルボン酸など）、芳香族酸（例えば、安息香酸、サリチル酸など）などの有機酸との塩）の接触により得られる生理活性ポリペプチド金属塩が好ましい。該生理活性ペプチド金属塩は、生理活性ポリペプチドと水溶性多価金属塩とを両者の溶解性を極端に下げない範囲で選択されたｐＨに調製された水溶液中で混合することにより生成され得る。この際、生理活性ポリペプチドと水溶性多価金属塩との量比(モル比)は、例えば１：１〜１：１０００、好ましくは１：１〜１：１００、より好ましくは１：１〜１：５０であり、両者の濃度はそれぞれ単独の溶解度範囲内でかつ生成する複合体の溶解度以上である事が望まれる。また水溶液は、必要に応じて弱酸性、中性あるいは弱酸性に調製される。
生理活性ポリペプチドが分子内に酸性基（例、カルボキシル基、スルホ基など）を有する場合、マイクロカプセルへの取り込み率の向上、及び放出性のコントロールの目的で、多価金属との水不溶性または水難溶性複合体とすることは有効である。
【００１１】
抗血小板剤としてはインテグリン拮抗物質、さらにはＧＰIIb／IIIa 拮抗物質が挙げられる。ＧＰIIb／IIIa 拮抗物質としては例えば、蛇毒ペプチド（例、バルブリン（barbourin）、あるいはＡrg−Ｇly−Ａsp 配列を有するペプチド、例えばＡrg−Ｇly−Ａsp−Ｓer、（Ａrg−Ｇly−Ａsp−Ｓer）テトラマー、Ｇly−Ａrg−Ｇly−Ａsp−Ｓer−Ｐro、シクロ−Ｓ,Ｓ−〔Ａc−Ｃys(Ｎα−メチル)Ａrg−Ｇly−Ｄ−Ａsn−ペニシラミン〕−ＮＨ₂（ＳＫ＆Ｆ−１０６７６０：ファーマシューティカル リサーチ（Pharm. Res.)，11巻，1358-1390頁 1994年)、さらにＧＰIIb／IIIa 拮抗作用と同様の活性を有する化合物、例えば(Ｓ)−４−〔(４−アミジノベンゾイル)グリシル〕−３−メトキシ−カルボニルメチル−２−オキソピペラジン−１−酢酸、４−(４−アミジノベンゾイルグリシル)−２−オキソピペラジン−１，３−２酢酸・塩酸塩、Ｌ−Ｔyr−Ｎ−(ブチルスルホニル)−Ｏ−〔４−(４−ピペリジニル)ブチル〕モノハイドロクロライド（Ｌ−７００４６２／ＭＫ−３８３：サーキュレーション（Circulation) 88巻，1512-1517頁，1993年)、エチル ３Ｓ−〔４−〔〔４−(アミノイミノメチル)フェニル〕アミノ〕−１，４−ジオキソブチル〕アミノ−４−ペンチノエート 塩酸塩（ＳＣ−５４６８４Ａ：Circulation，91巻，403-410頁，1995年)、〔１−〔Ｎ−(ｐ−アミジノフェニル)−Ｌ−Ｔyr〕−４−ピペリジニル〕酢酸（Ｒo−４４−９８８３：Thromb. Haemostas.，70巻，817-821頁，1993年)、サイクリック〔Ｄ−２−アミノブチリル−Ｎ−２−メチル−Ｌ−Ａrg−Ｇly−Ｌ−Ａsp−３−アミノメチル−安息香酸〕メタンスルフォン酸塩（ＤＭＰ７２８：Circulation，89巻，3-12頁，1994年）、式
【化３】

で表される(3S-trans)-5-[[[4'-(アミノイミノメチル)-[1,1'-ビフェニル]-4-イル]オキシ]メチル]-2-オキソ-ピロリジン-3-酢酸 (Fradafiban; BIBU 52: Circulation, 96, 1130-1138, 1997)、2(S)-[(p-トルエンスルホニル)アミノ]-3-[[[5,6,7,8-テトラヒドロ-4-オキソ-5-[2-(ピペリジン-4-イル)エチル]-4H-ピラゾロ[1,5-a][1,4]ジアゼピン-2-イル]カルボニル]アミノ]プロピオン酸 (L-738,167: The Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics, 281, 677-689, 1997)、式
【化４】

で表されるイントリフィバン（Intrifiban）[インテグリン（Integrelin）] (Circulation, 94, 2083-2089, 1996)、式
【化５】

で表されるＦＫ−６３３(特開平５−１４８２０７)、などが挙げられる。
またＧＰIIb／IIIa 拮抗物質としては例えば、前記式(Ｉ)で表される２-ピペラジノン-1-酢酸誘導体（I）またはその塩が挙げられる。前記式(Ｉ)で表される２-ピペラジノン-1-酢酸誘導体（I）としては、例えば、ＷＯ９６／３３９８２に記載された化合物などが挙げられるが、なかでも、Ａ¹及びＡ²がそれぞれ（１）置換基としてＣ_2-8アルコキシカルボニルオキシ基またはＣ_2-8アルコキシカルボニル基をそれぞれ有していてもよいアミジノ基またはグアニジノ基、（２）オキソ基またはハロゲン化されていてもよいＣ_1-4アルキル基で置換されていてもよいオキサジアゾリル基を有していてもよいアミノ基、または（３）オキソ基またはハロゲン化されていてもよいＣ_1-4アルキル基で置換されていてもよいオキサジアゾリル基［好ましくは、（１）メトキシカルボニルオキシをそれぞれ有していてもよいアミジノ基またはグアニジノ基または（２）置換基として５−オキソ−１,２,４−オキサジアゾール−３−イルまたは５−トリフルオロメチル−１,２,４−オキサジアゾール−３−イルを有していてもよいアミノ基］であり、Ｄが式
【化６】

〔式中、ａは０〜２の整数を示す〕で表される基［好ましくは、フェニレン基］であり、Ｒ¹が水素原子であり、Ｒ²が水素原子又はＣ_1-4アルコキシ基で置換されていてもよいフェニル基を有していてもよいＣ_1-4アルキル基［好ましくは、水素原子又はｐ−メトキシベンジル基］であり、Ｐが式−Ｚ−Ｂ−〔式中、Ｚは結合手、−ＮＨ−または−ＮＨ−ＣＯ−を示し、Ｂは式
【化７】

（式中、ｂは０〜１の整数を示し、ｃは１〜５の整数を示す）で表される基を示す〕で表される基［好ましくは、式
【化８】

で表される基］であり、Ｙが式−ＣＯ−Ｒ⁷〔式中、Ｒ⁷は（１）ヒドロキシ基、（２）置換基としてＣ_1-4アルコキシ−カルボニル基または５−メチル−２−オキソ−１,３−ジオキソレン−４−イル基をそれぞれ有していてもよいＣ_1-8アルコキシ基またはＣ_2-12アルケニリルオキシ基、または（３）式−ＯＣＨ(Ｒ^7a)ＯＣＯＲ⁸（式中、Ｒ^7aは水素原子またはＣ_1-6アルキル基を示し、Ｒ⁸はＣ_1-6アルキル基またはＣ_5-7シクロアルキルオキシ基を示す）で表される基を示す〕で表される基［好ましくは、カルボキシル基］であり、ｎが１〜４の整数［好ましくは、２〜３の整数］である2-ピペラジノン-1-酢酸誘導体が好ましく、さらに２-ピペラジノン-1-酢酸誘導体としては（Ｓ)-４-(４-グアニジノベンゾイルアミノ)アセチル-３-[３-(４-グアニジノベンゾイルアミノ)]プロピル-２-オキソピペラジン-１-酢酸や（Ｓ)-４-(４-アミジノベンゾイルアミノ)アセチル-３-[３-(４-アミジノベンゾイルアミノ)]プロピル-２-オキソピペラジン-１-酢酸、あるいはその塩酸塩や酢酸塩などが挙げられる。なかでも、（Ｓ)-４-(４-グアニジノベンゾイルアミノ)アセチル-３-[３-(４-グアニジノベンゾイルアミノ)]プロピル-２-オキソピペラジン-１-酢酸の塩酸塩、とりわけ、（Ｓ)-４-(４-グアニジノベンゾイルアミノ)アセチル-３-[３-(４-グアニジノベンゾイルアミノ)]プロピル-２-オキソピペラジン-１-酢酸モノ塩酸塩または（Ｓ)-４-(４-グアニジノベンゾイルアミノ)アセチル-３-[３-(４-グアニジノベンゾイルアミノ)]プロピル-２-オキソピペラジン-１-酢酸ジ塩酸塩が好ましく用いられ、（Ｓ)-４-(４-グアニジノベンゾイルアミノ)アセチル-３-[３-(４-グアニジノベンゾイルアミノ)]プロピル-２-オキソピペラジン-１-酢酸ジ塩酸塩は、（Ｓ)-４-(４-グアニジノベンゾイルアミノ)アセチル-３-[３-(４-グアニジノベンゾイルアミノ)]プロピル-２-オキソピペラジン-１-酢酸モノ塩酸塩を含有する溶液に濃塩酸を加え、ｐＨを約１〜２（好ましくは約１．５）に調整することにより製造することができる。また、得られた（Ｓ)-４-(４-グアニジノベンゾイルアミノ)アセチル-３-[３-(４-グアニジノベンゾイルアミノ)]プロピル-２-オキソピペラジン-１-酢酸ジ塩酸塩は、エタノールなどを用いて結晶化することもできる。
【００１２】
前記抗腫瘍剤としては、ブレオマイシン，メソトレキセート，アクチノマイシンＤ，マイトマイシンＣ，硫酸ビンブラスチン，硫酸ビンクリスチン，ダウノルビシン，アドリアマイシン，ネオカルチノスタチン，シトシンアラビノシド，フルオロウラシル，テトラヒドロフリル−５−フルオロウラシル，クレスチン，ピシバニール，レンチナン，レバミゾール，ベスタチン，グリチルリチン，ポリＩＣ，ポリＡＵ，ポリＩＣＬＣなどのポリ核酸類［免疫応答（山村雄一、森沢成司編；1977年発行）１４３頁］などが挙げられる。
上記抗生物質としては、例えばゲンタマイシン，ジベカシン，カネンドマイシン，リビドマイシン，トブラマイシン，アミカシン，フラジオマイシン，シソマイシン，塩酸テトラサイクリン，塩酸オキシテトラサイクリン，ロリテトラサイクリン，塩酸ドキシサイクリン，アンピシリン，ピペラシリン，チカルシリン，セファロチン，セファロリジン，セフォチアム，セフスロジン，セフメノキシム，セフメタゾール，セファゾリン，セフォタキシム，セフォペラゾン，セフチゾキシム，モキサラクタム，チエナマイシン，スルファゼシン，アズスレオナムなどが挙げられる。
【００１３】
前記の解熱，鎮痛，消炎剤としては、サリチル酸，スルピリン，フルフェナム酸，ジクロフェナック，インドメタシン，モルヒネ，塩酸ペチジン，酒石酸レボルファノール，オキシモルフォンなどが挙げられる。
鎮咳去痰剤としては、塩酸エフェドリン，塩酸メチルエフェドリン，塩酸ノスカピン，リン酸コデイン，リン酸ジヒドロコデイン，塩酸アロクラマイド，塩酸クロフェダノール，塩酸ピコペリダミン，クロペラスチン，塩酸プロトキロール，塩酸イソプロテレノール，硫酸サルブタモール，硫酸テルブタリンなどが挙げられる。
鎮静剤としては、クロルプロマジン，プロクロルペラジン，トリフロペラジン，硫酸アトロピン，臭化メチルスコポラミンなどが挙げられる。
筋弛緩剤としては、メタンスルホン酸プリジノール，塩化ツボクラリン，臭化パンクロニウムなどが挙げられる。
抗てんかん剤としては、フェニトイン，エトサクシミド，アセタゾラミドナトリウム，クロルジアゼポキシドなどが挙げられる。
抗潰瘍剤としては、メトクロプロミド，塩酸ヒスチジンなどが挙げられる。
抗うつ剤としては、イミプラミン，クロミプラミン，ノキシプチリン，硫酸フェネルジンなどが挙げられる。
抗アレルギー剤としては、塩酸ジフェンヒドラミン，マレイン酸クロルフェニラミン，塩酸トリペレナミン，塩酸クレミゾール，塩酸ジフェニルピラリン，塩酸メトキシフェナミンなどが挙げられる。
【００１４】
強心剤としては、トランスパイオキソカンファー，テオフィロール，アミノフィリン，塩酸エチレフリンなどが挙げられる。
不整脈治療剤としては、プロプラノール，アルプレノロール，ブフェトロール，オキシプレノロールなどが挙げられる。
血管拡張剤としては、塩酸オキシフェドリン，ジルチアゼム，塩酸トラゾリン，ヘキソベンジン，硫酸バメタンなどが挙げられる。
降圧利尿剤としては、ヘキサメトニウムブロミド，ペントリニウム，塩酸メカミルアミン，塩酸エカラジン，クロニジンなどが挙げられる。
糖尿病治療剤としては、グリミジンナトリウム，グリピザイド，塩酸フェンフォルミン，塩酸ブフォルミン，メトフォルミンなどが挙げられる。
抗凝血剤としては、ヘパリンナトリウム，クエン酸ナトリウムなどが挙げられる。
止血剤としては、トロンボプラスチン，トロンビン，メナジオン亜硫酸水素ナトリウム，アセトメナフトン，ε−アミノカプロン酸，トラネキサム酸，カルバゾクロムスルホン酸ナトリウム，アドレノクロムモノアミノグアニジンメタンスルホン酸塩などが挙げられる。
抗結核剤としては、イソニアジド，エタンブトール，パラアミノサリチル酸などが挙げられる。
ホルモン剤としては、プレドニゾロン，リン酸ナトリウムプレドニゾロン，デキサメタゾン硫酸ナトリウム，ベタメタゾンリン酸ナトリウム，リン酸ヘキセストロール，酢酸ヘキセストロール，メチマゾールなどが挙げられる。
【００１５】
麻薬拮抗剤としては、酒石酸レバロルファン，塩酸ナロルフィン，塩酸ナロキソンなどが挙げられる。
骨吸収抑制剤としては、（硫黄含有アルキル）アミノメチレンビスフォスフォン酸などが挙げられる。
骨形成促進剤としては、ビタミンＫ₂や副甲状腺ホルモン、あるいは式（II)
【化９】

〔式中、環Ａは置換されていてもよいベンゼン環を、Ｒは水素原子または置換されていてもよい炭化水素基を、Ｂはエステル化またはアミド化されていてもよいカルボキシル基を、Ｘは−ＣＨ(ＯＨ)−または−ＣＯ−を、ｋは０または１を、k'は０、１または２を示す〕で表される化合物またはその塩などが挙げられる（特開平３−２３２８８０号、特開平４−３６４１７９号公報）。
【００１６】
血管新生抑制剤としては、血管新生抑制ステロイド［サイエンス(Science), 221巻, 719頁(1983)］、フマギリン［ヨーロッパ特許公開第325199号公報］、フマギロール誘導体［ヨーロッパ特許公開第357061号、同第359036号、同第386667号、同第415294号公報］などが挙げられる。
生理活性物質はそれ自身（遊離体）であっても、薬理学的に許容される塩（例えば、生理活性物質がアミノ基などの塩基性基を有する場合、無機酸、例えば塩酸、硫酸、硝酸、あるいは有機酸、例えば炭酸、コハク酸などとの塩、生理活性物質がカルボキシル基などの酸性基を有する場合、無機塩基、例えばナトリウム、カリウムなどのアルカリ金属、あるいは有機塩基化合物、例えばトリエチルアミンなどの有機アミン類、アルギニンなどの塩基性アミノ酸類との塩）であってもよい。生理活性物質の遊離体が水溶性でない場合、水溶性の塩に変換して用いてもよい。
徐放性マイクロカプセルにおいて、生理活性物質の配合量はその種類、所望の薬理効果あるいは効果の持続時間などによって異なるが、例えばマイクロカプセルに対して好ましくは約０.０１％〜約５０％(W/W)が用いられる。さらに好ましくは約０.１％〜約３０％(W/W)が用いられる。
【００１７】
本発明で用いる生体内分解性高分子重合物の具体例としては、ポリ脂肪酸エステル（例、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリクエン酸、ポリリンゴ酸、ポリ乳酸カプロラクトンなど）、ポリ−α−シアノアクリル酸エステル、ポリ−β−ヒドロキシ酪酸、ポリアルキレンオキサレート（例、ポリトリメチレンオキサレート、ポリテトラメチレンオキサレートなど)、ポリオルソエステル、ポリオルソカーボネート、あるいはその他のポリカーボネート（例、ポリエチレンカーボネート、ポリエチレンプロピレンカーボネートなど)、ポリアミノ酸（例、ポリ−γ−ベンジル−Ｌ−グルタミン酸、ポリ−Ｌ−アラニン、ポリ−γ−メチル−Ｌ−グルタミン酸など)、ヒアルロン酸エステルなどが挙げられる。
これらの高分子重合物は１種（単独重合物）でもよく、また２種以上の共重合物、あるいは単なる混合物でもよく、またそれらの塩でもよい。
【００１８】
これらの生体内分解性高分子重合物の生体内分解性は、例えば高分子重合物を注射剤として投与した場合、高分子重合物から分解生成した水溶性低分子量断片の高分子重合物投与総量に対する割合（w/w％）で定義され、一般に、皮下又は筋肉内投与後の３カ月間で１０％以上、好ましくは、皮下又は筋肉内投与後の１年間で８０％以上である。該生体内分解性高分子重合物は好ましくは脂肪族ポリエステル（脂肪酸ポリエステル）である。該生体内分解性高分子重合物の好ましい具体例としては、脂肪族ポリエステルが挙げられ、とりわけヒドロキシカルボン酸の単独重合物または共重合物あるいはそれらの混合物などが挙げられる。
該ヒドロキシカルボン酸としては特に限定されないが、一般式
【化１０】

[式中、Ｒは水素又はアルキル基を示す。]で表わされるヒドロキシカルボン酸が好ましい具体例として挙げられる。
上記式中、Ｒで示されるアルキル基としては、例えば炭素数１から８の直鎖あるいは分枝状のアルキル基（例、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、第３級ブチル、ペンチル、ヘキシル、ヘプチル、オクチル等）が好ましい。これらの中で、炭素数１〜３の直鎖あるいは分枝状のアルキル基が特に好ましい。
【００１９】
上記ヒドロキシカルボン酸の好ましい具体例としては、例えばグリコール酸、乳酸、ヒドロキシ酪酸（例、２-ヒドロキシ酪酸）、２'-ヒドロキシ吉草酸、２-ヒドロキシ-３-メチル酪酸、２-ヒドロキシカプロン酸、２-ヒドロキシイソカプロン酸、２-ヒドロキシカプリル酸などが挙げられる。このうち特に、グリコール酸、乳酸、２-ヒドロキシ酪酸、２-ヒドロキシ-３-メチル酪酸、２-ヒドロキシカプロン酸が好ましい。さらに、グリコール酸、乳酸、２-ヒドロキシ酪酸が特に好ましい。これらのヒドロキシカルボン酸において、Ｄ−体、Ｌ−体及びＤ,Ｌ−体が存在するものは、そのいずれを用いてもよいが、Ｄ,Ｌ−体が好ましい。
該共重合物の共重合の形式は、ランダム、ブロック、グラフトの何れでもよい。これらのグリコール酸共重合物においては、生体内での分解が比較的速やかで単独で用いた場合の放出期間が１ケ月以内のものが好ましい。特に、乳酸・グリコール酸単独重合物または共重合物（以下、どちらか一方の酸の単独重合物及び相方の共重合物を含めて、単に、乳酸・グリコール酸重合物と称する。また、ＰＬＧＡと略記することがある）又はヒドロキシ酪酸・グリコール酸重合物（以下、どちらか一方の酸の単独重合物及び相方の共重合物を含め単にヒドロキシ酪酸・グリコール酸共重合物と称す）が好ましい。
本発明に使用される生体内分解性高分子重合物は、一般的な合成法（例えば、特開昭６１−２８５２１号公報参照）で問題なく合成できる。
【００２０】
本発明に使用されるこれらの生体内分解性高分子重合物の重量平均分子量は、約２,０００ないし約８００,０００のものが好ましく、より好ましくは約５,０００ないし約２００,０００の範囲から選定される。
上記高分子重合物として乳酸・グリコール酸共重合物を用いる場合、乳酸／グリコール酸のモル比は、好ましくは約１００／０ないし約２５／７５、より好ましくは約１００／０ないし約５０／５０である。乳酸・グリコール酸共重合物の重量平均分子量は、好ましくは約５,０００ないし約３０,０００、より好ましくは約５,０００から約２０,０００である。
上記の高分子重合物としてヒドロキシ酪酸・グリコール酸共重合物（例、２−ヒドロキシ酪酸・グリコール酸共重合物）を用いる場合、ヒドロキシ酪酸／グリコール酸のモル比は好ましくは１００／０ないし約２５／７５、より好ましくは約１００／０ないし約５０／５０である。特に、２−ヒドロキシ酪酸／グリコール酸のモル比は好ましくは約６０／４０ないし約３０／７０である。ヒドロキシ酪酸・グリコール酸共重合物の重量平均分子量は好ましくは約５,０００ないし約２５,０００、より好ましくは約５,０００から約２０,０００である。
上記高分子重合物として酪酸・グリコール酸共重合物を用いる場合、酪酸／グリコール酸のモル比は好ましくは約１００／０ないし約２５／７５である。
上記高分子重合物として例えばポリ乳酸（Ａ）とグリコール酸・２−ヒドロキシ酪酸共重合物（Ｂ）との混合物を用いる場合、(Ａ)/(Ｂ)で表わされる混合比が約１０／９０から約９０／１０（重量比）の範囲で使用される。好ましくは約２５／７５から約７５／２５（重量比）の範囲である。
ポリ乳酸の重量平均分子量は約５,０００から約３０,０００のものが好ましい。さらに約６,０００から約２０,０００のものが特に好ましい。
【００２１】
なお、本明細書における重量平均分子量とは、ポリスチレンを基準物質とするゲルパーミェーションクロマトグラフィー（ＧＰＣ）で測定した高分子重合物のポリスチレン重量換算の平均分子量をいう。
さらに具体的には、重量平均分子量が１２０,０００、５２,０００、２２,０００、９,２００、５,０５０、２,９５０、１,０５５、５８０、１６２の９種類のポリスチレンを基準物質とし、ＧＰＣカラムＫＦ８０４Ｌ×２（昭和電工製）、ＲIモニターＬ−３３００（日立製作所製）を使用、移動相としてクロロホルムを用いたＧＰＣで測定したポリスチレン換算の分子量をいう。
該高分子重合物の多分散性は重量平均分子量／数平均分子量として定義され、一般に１ないし３.５、好ましくは１.５ないし２.５である。
これら生体内分解性高分子重合物の使用量は、生理活性物質の薬理活性の強さと、該物質の放出の速度及び期間などによって決まり、例えば生理活性物質に対して約０.２ないし約１００００倍（重量比）、好ましくは約１ないし約１０００倍（重量比）の量をマイクロカプセル基剤として用いるのがよい。
油相中の生体内分解性高分子重合物の濃度は、約０.５ないし約９０％（W/W）、さらに好ましくは約２ないし約６０％（W/W）から選ばれる。
【００２２】
上記生体内分解性高分子重合物の有機溶媒液に添加する油脂類としては、該有機溶媒液中において相分離を起こすことなく溶解し、かつ生体内で分解・吸収されるものであればいずれでもよいが、脂肪酸またはその塩、グリセリン脂肪酸エステルおよびプロピレングリコール脂肪酸エステルを除く油脂類が好ましく、例えば脂溶性ビタミン（ビタミンＡ、ビタミンＤ、ビタミンＥ、ビタミンＫなど）、中鎖脂肪酸トリグリセリド（ミグリオールなどの炭素数８〜１２の脂肪酸のトリグリセロール）、コレステロール、リン脂質類などが挙げられる。
上記生体内分解性高分子重合物の有機溶媒液に添加する油脂類としては、脂溶性ビタミン、コレステロール、リン脂質類などが好ましく用いられ、なかでも、脂溶性ビタミンが好ましく、とりわけ、α−トコフェロール（ビタミンＥ）または酢酸トコフェロール（ビタミンＥ酢酸塩）などが好ましく用いられる。
生体内分解性高分子重合物の有機溶媒液中に添加する油脂類は、徐放性マイクロカプセル全量に対する油脂類の最終含有率が約１％〜約５０％(W/W)、さらに好ましくは約３％〜約３０％(W/W)となる量が用いられる。
また本発明において、Ｗ/Ｏ法あるいはＷ/Ｏ/Ｗ法により徐放性マイクロカプセルを製造する場合、生理活性物質を含有する水相にさらに塩基性物質を添加してもよく、生理活性物質が酸性の薬物あるいは薬物の酸性塩（塩酸塩など）（例えば水相の pＨが６以下となる）の場合に添加することが望ましい。塩基性物質としては例えば、L-ヒスチジン、L-アルギニン、L-リジンなどの塩基性アミノ酸や N-メチルグルカミンなどが挙げられる。
生理活性物質の水溶液中に添加する塩基性物質は、徐放性マイクロカプセル全量に対する塩基性物質の最終含有率が約０.１％〜約２０％(W/W)、さらに好ましくは約１％〜約８％(W/W)となる量が用いられる。
【００２３】
本発明製造法においては、有機溶媒の除去に水中乾燥法を適用する場合、外水相に浸透圧調節剤を含有させることが好ましい。該浸透圧調節剤としては、水溶液とした場合、浸透圧を示すものであればいかなる物質であってもよい。
該浸透圧調節剤の具体例としては、例えば水溶性の多価アルコール類、水溶性の一価アルコール類、水溶性の無機物（例、無機塩)、水溶性の単糖類、二糖類、オリゴ糖及び多糖類あるいはそれらの誘導体、水溶性の有機酸又はその塩、水溶性のアミノ酸、水溶性のペプチド、タンパク質あるいはそれらの誘導体などが挙げられる。これらのうち水溶性の多価アルコール類、水溶性の無機物、水溶性の単糖類、二糖類、オリゴ糖及び多糖類あるいはそれらの誘導体、水溶性の有機酸又はその塩が好ましい。さらに、塩類、水溶性の多価アルコール類及び水溶性の無機物が特に好ましい。
上記水溶性の無機塩としては、例えば塩化カリウム、塩化ナトリウム、臭化カリウム、臭化ナトリウム、ヨウ化カリウム、ヨウ化ナトリウム等のハロゲン化アルカリ金属、塩化カルシウム、塩化マグネシウム等のハロゲン化アルカリ土類金属、硫酸ナトリウム、硫酸カリウム等のアルカリ金属硫酸塩、硫酸マグネシウム、硫酸カルシウム等のアルカリ土類金属硫酸塩、リン酸二水素カリウム、リン酸水素二カリウム、リン酸カリウム、リン酸二水素ナトリウム、リン酸水素二ナトリウム、リン酸ナトリウム等のアルカリ金属リン酸塩類などが挙げられる。このうち、塩化ナトリウムが好ましい。
【００２４】
上記水溶性の多価アルコール類としては、例えばグリセリン等の二価アルコール類、アラビトール、キシリトール、アドニトール等の五価アルコール類、マンニトール、ソルビトール等の六価アルコール類などが挙げられる。これらのうち六価のアルコール類が好ましい。
上記水溶性の一価アルコール類としては、例えばメタノール、エタノール、イソプロピルアルコール等が挙げられる。これらのうちエタノールが好ましい。
上記水溶性の単糖類としては、例えばアラビノース、キシロース、リボース、２−デオキシリボース等の五炭糖類、ブドウ糖、果糖、ガラクトース、マンノース、ソルボース、ラムノース、フコース等の六炭糖類が挙げられる。これらのうち六炭糖類が好ましい。
上記水溶性の二糖類としては、例えば麦芽糖、セロビオース、α−トレハロース、乳糖、ショ糖などが挙げられる。これらのうち乳糖及びショ糖が好ましい。
【００２５】
上記水溶性のオリゴ糖としては、例えばマルトトリオース、ラフィノース等の三糖類、スタキオース等の四糖類などが挙げられる。これらのうち三糖類が好ましい。
上記水溶性の多糖類としては、例えばセルロース、デンプン、グリコーゲン等のグルカン類、ペクチン酸等のガラクツロナン類、アルギン酸等のマンヌロナン類、イヌリン、レバン等のフルクタン類、キチン等のＮ−アセチルグリコサミン重合体類、イネワラのキシラン等のキシラン類、マンナン、グルコマンナン、ガラクトマンナン、ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸、ヘパリン等のジヘテログルカン類などが挙げられる。これらのうちグルカン類、ジヘテログルカン類が好ましい。
上記水溶性の単糖類、二糖類、オリゴ糖及び多糖類の誘導体としては、例えばグルコサミン、ガラクトサミン、グルクロン酸、ガラクツロン酸などが挙げられる。
【００２６】
上記水溶性の有機酸又はその塩としては、例えばクエン酸、酒石酸、リンゴ酸、これらのアルカリ金属塩（例、ナトリウム塩、カリウム塩等）などが挙げられる。
上記水溶性のアミノ酸としては、例えばグリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、セリン、トレオニン、プロリン、ヒドロキシプロリン、システイン、メチオニン等の中性アミノ酸、アスパラギン酸、グルタミン酸等の酸性アミノ酸、リジン、アルギニン、ヒスチジン等の塩基性アミノ酸等が挙げられる。またこれらの水溶性アミノ酸の酸（例、塩酸、硫酸、リン酸等）又はアルカリ（例、ナトリウム、カリウム等のアルカリ金属等）との塩を用いてもよい。
水溶性のペプチド、タンパク質あるいはそれらの誘導体としては、例えばカゼイン、グロブリン、プロラミン、アルブミン、ゼラチン、プロタミン、ヒストンなどが挙げられる。
【００２７】
浸透圧調節剤は単独で使用しても、１種以上を混合して使用してもよい。これらの浸透圧調節剤の外水相中での濃度は、浸透圧調節剤が非イオン性物質の場合、約０.００１ないし約６０％(W/W)で、好ましくは約０.０１ないし約４０％(W/W)、より好ましくは約０.０５ないし約３０％(W/W)である。また、浸透圧調節剤がイオン性物質の場合、上記の濃度を全体のイオン価で除した濃度が用いられる。浸透圧調節剤の添加濃度は、その溶解度以下である必要はなく、一部が有機溶媒中で分散状態であってもよい。
以下に、本発明の製造法の各工程について詳述する。
水溶性生理活性物質の水溶液を水相として用いるマイクロカプセルの製造法においては、まず、水溶性生理活性物質（以下、薬物と略することもある）を水に溶解し、これに必要であれば前記の塩基性アミノ酸などの塩基性物質、さらに薬物保持物質（例えば、ゼラチン、寒天、ポリビニールアルコールなど）を加えて溶解し、水相（内水相）を調製する。
内水相における薬物の濃度は、好ましくは約０．１ないし約１５０％（W/V）である。さらに好ましくは約２０ないし約１３０％（W/V）である。特に好ましくは約６０ないし約１２０％（W/V）である。
該水相には、薬物の安定性、溶解性を保つためのｐＨ調整剤として、炭酸、酢酸、シュウ酸、クエン酸、リン酸、塩酸等、水酸化ナトリウム、アルギニン、リジンおよびそれらの塩などを添加してもよい。また、さらに薬物の安定化剤として、アルブミン、ゼラチン、クエン酸、エチレンジアミン四酢酸ナトリウム、デキストリン、亜硫酸水素ナトリウム、ポリエチレングリコール等のポリオール化合物などを、あるいは保存剤として、一般に用いられるパラオキシ安息香酸エステル類（メチルパラベン、プロピルパラベンなど)、ベンジルアルコール、クロロブタノール、チメロサールなどを添加してもよい。
【００２８】
このようにして得られた水相を、生体内分解性高分子重合物（以下、ポリマーと略することもある）および油脂類を含む均一な有機溶媒溶液（油相）中に加え、ついで乳化操作を行い、Ｗ／Ｏ型乳化物を製造する。該乳化操作は、公知の分散法、例えば断続振とう法、プロペラ型撹拌機あるいはタービン型撹拌機などのミキサーによる方法、コロイドミル法、ホモジナイザー法、超音波照射法等により行われる。
上記したポリマー溶液（油相）は、ポリマーを水と実質的に混和しない有機溶媒に溶解したものが用いられる。該有機溶媒の水に対する溶解度は、好ましくは、常温（２０℃）で３％（W/W）以下である。また有機溶媒の沸点は１２０℃以下であることが好ましい。有機溶媒としては、例えばハロゲン化炭化水素（例、ジクロロメタン，クロロホルム，クロロエタン，トリクロロエタン，四塩化炭素など）、炭素数３以上のアルキルエーテル類（例、イソプロピルエーテルなど）、脂肪酸のアルキル（炭素数４以上）エステル（例、酢酸ブチルなど）、芳香族炭化水素（例、ベンゼン，トルエン，キシレンなど）等が挙げられる。これらは２種以上適宜の割合で混合して用いてもよい。有機溶媒は、さらに好ましくはハロゲン化炭化水素（例、ジクロロメタン，クロロホルム，クロロエタン，トリクロロエタン，四塩化炭素など）である。有機溶媒は、特に好ましくはジクロロメタンである。
【００２９】
ついで、このようにして製造されたＷ／Ｏ型乳化物から有機溶媒を常法に従い除去する。溶媒の除去方法としては、例えば噴霧乾燥法や水中乾燥法などが挙げられるが水中乾燥法が好ましく用いられる。噴霧乾燥法は、得られたＷ／Ｏ型乳化物をノズル等を用いてスプレードライヤ（噴霧乾燥器）の乾燥室内に噴霧し、極めて短期間内に微粒化液滴内の溶媒を揮発させる方法であり、該ノズルとしては例えば、二流体ノズル型、圧力ノズル型、回転ディスク型等がある。該水中乾燥法は、Ｗ／Ｏ型乳化物を水相（外水相）中に加え、Ｗ／Ｏ／Ｗ型乳化物を形成させた後、油相中の溶媒を除去することにより行われる。
外水相の体積は、一般的には油相体積の約１ないし約１０,０００倍から選ばれる。さらに好ましくは、約２ないし約５,０００倍から選ばれる。特に好ましくは、約５ないし約２,０００倍から選ばれる。
上記外水相中に乳化剤を加えてもよい。該乳化剤は、一般に安定なＷ／Ｏ／Ｗ型乳化物を形成できるものであればいずれでもよい。具体的には、例えばアニオン性界面活性剤（オレイン酸ナトリウム，ステアリン酸ナトリウム，ラウリル硫酸ナトリウムなど）、非イオン性界面活性剤（ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル〔ツイーン（Tween）８０，ツイーン（Tween）６０，アトラスパウダー社〕，ポリオキシエチレンヒマシ油誘導体〔HCO-60，HCO-50，日光ケミカルズ〕など），ポリビニルピロリドン，ポリビニルアルコール，カルボキシメチルセルロース，レシチン，ゼラチン，ヒアルロン酸などが挙げられる。乳化剤は、好ましくはポリビニルアルコールである。これら乳化剤の中の１種類か、いくつかを組み合わせて使用してもよい。使用の際の濃度は、約０.００１から約２０％（W/W）の範囲から適宜選択できる。さらに好ましくは約０.０１から約１０％（W/W）の範囲で用いられる。特に好ましくは約０.０５から約５％（W/W）の範囲で用いられる。
また、外水相中に前記した浸透圧調節剤を加えてもよい。
【００３０】
本発明の製造法において、Ｗ／Ｏ／Ｗ型乳化物を形成させる際にＷ／Ｏ型乳化物の粘度を約１５０センチポアズ(ｃｐ)ないし約１０,０００ｃｐに調整することが好ましい。粘度を調整する方法としては、例えば（１）油相の生体内分解性高分子重合物の濃度を調整する、（２）水相と油相との量比を調整する、（３）Ｗ／Ｏ型乳化物の温度を調整する、（４）外水相の温度を調整する、（５）Ｗ／Ｏ型乳化物を外水相に注入する際に、例えばラインヒーター、クーラーなどでＷ／Ｏ型乳化物の温度を調整するなどの方法が挙げられ、これらの方法は単独でも、組み合わせて使用してもよい。
上記方法においては、要は、Ｗ／Ｏ型乳化物がＷ／Ｏ／Ｗ型乳化物になる時のＷ／Ｏ型乳化物の粘度が約１５０ｃｐないし約１０,０００ｃｐになるようにしさえすればよい。
上記（１）において、油相の生体内分解性ポリマーの濃度を調整する場合の濃度は、生体内分解性ポリマーの種類、有機溶媒の種類等で変化するので一義的に決定されるものではないが、好ましくは約１０ないし約８０％（W/W）である。上記（２）において、水相と油相との量比を調整する場合の量比は、薬物の種類および量、油相の性質によって一義的に決定されるものではないが、好ましくはＷ／Ｏ＝約１％ないし約５０％（Ｖ／Ｖ）である。
【００３１】
上記（３）において、Ｗ／Ｏ型乳化物の温度を調整する場合の温度は、例えば約−２０℃ないし有機溶媒の沸点の範囲、好ましくは約０℃ないし約３０℃、更に好ましくは約１０℃ないし約２０℃である。
Ｗ／Ｏ型乳化物の粘度の調整の時期は、上記（１）および（２）の場合は、Ｗ／Ｏ型乳化物を製造する時点で行うことができる。
また、上記（４）において、例えば外水相にＷ／Ｏ型乳化物を添加する際に外水相の温度をあらかじめ調整しておくことにより、上記（３）と同様の結果となるようにすればよい。外水相の温度は、例えば約５℃ないし約３０℃、好ましくは約１０℃ないし約２５℃、更に好ましくは約１２℃ないし約２０℃である。
有機溶媒を除去する方法は、自体公知の方法に従って行うことができる。例えばプロペラ型撹拌機あるいはマグネチックスターラーなどで撹拌しながら常圧もしくは徐々に減圧にして有機溶媒を蒸発させる方法、ロータリーエバポレーターなどを用いて真空度を調節しながら有機溶媒を蒸発させる方法などが挙げられる。
【００３２】
一方、水難溶性の生理活性ペプチドの金属塩を生理活性物質として用いる場合には、生理活性ペプチド金属塩を生体内分解性高分子重合物と油脂類とを含有する有機溶媒液に分散させて得られた分散液をよく混合して、生理活性ペプチド金属塩が有機溶媒液中において実質的に均一に分散・懸濁している分散安定性の高い有機溶媒分散液（以下、便宜上S/O型乳化物と称することがある）を得る。
上記有機溶媒としては、前記Ｗ／Ｏ型乳化物の調製において生体内分解性高分子重合物と油脂類とを含有する油相の調製に用いられるのと同様の有機溶媒が用いられる。
上記s／o型乳化物の調製には、公知の分散法が用いられる。該分散法としては、例えば、断続振とう法、プロペラ型撹拌機あるいはタービン型撹拌機などのミキサーによる方法、コロイドミル法、ホモジナイザー法、超音波照射法などが挙げられる。この場合、所望により水不溶性溶媒と共に水溶性溶媒を用いることも有効である。該水溶性溶媒は、水溶性を有し、上記水不溶性溶媒と混合し得るものであればいかなるものでもよい。該水溶性溶媒の具体例としては、例えばアルコール類(例、メタノール、エタノール、プロピルアルコール、イソプロピルアルコール等)、アセトン、アセトニトリルなどが挙げられる。ｓ／ｏ型乳化物の調製においては、生理活性物質をより細かく微粒化して分散させることが好ましく、微粒子の粒径は通常約１nmないし約３０μm、好ましくは約１nmないし約５μm、最も好ましくは約１nmないし約１μmである。
【００３３】
次いで、このようにして製造されたＳ／Ｏ型乳化物は、前記Ｗ／Ｏ型乳化物の場合と同様の手法により有機溶媒除去に付されるが、好ましくは水中乾燥法に付す。好ましくは、外水相中に上記濃度の浸透圧調節剤を含有させて行う。すなわち、該油相をさらに浸透圧調節剤を含有した第２相目の水相中に加え、Ｓ／Ｏ／Ｗ型乳化物を形成させた後、油相中の有機溶媒を除去させ、マイクロカプセルを製造する。
Ｓ／Ｏ／Ｗ型水中乾燥法における外水相に乳化剤を加えてもよく、その例としては、前記Ｗ／Ｏ／Ｗ型乳化物を形成する際に用いられるものと同様の乳化剤が用いられる。
【００３４】
油相中の有機溶媒の除去は、通常用いられる方法が採用される。該方法としては、プロペラ型撹拌機、あるいはマグネチックスターラーなどで撹拌しながら徐々に減圧して行うか、ロータリーエバポレーターなどを用いて、真空度を調節しながら除去する。この場合、高分子重合物の固化がある程度進行し、内層から生理活性物質の放出による損失が減少した時点で、溶媒の除去をより完全にする目的で、Ｓ／Ｏ／Ｗ型乳化物を徐々に加温して行うと所要時間を短縮することができる。また、温度以外の方法で増粘化及び固化を行う場合は、単にＳ／Ｏ／Ｗ型乳化物を撹拌下放置するか、加温するか、窒素ガスなどを吹き付けるか、することなどによって除去してもよい。この溶媒の除去過程は生理活性物質の放出をコントロールするマイクロカプセルの表面構造を大きく左右する重要な過程である。例えば、除去の速度を速く行うことによって、表面に多くの細孔を生じ、またより大きな細孔となり、生理活性物質の放出速度を高める。
【００３５】
このようにして得られたマイクロカプセルは遠心分離あるいは濾過して分取した後、マイクロカプセルの表面に付着している遊離の生理活性物質、該生理活性物質の保持物質などを、蒸留水で数回繰り返し洗浄し、必要であれば加温し減圧下でマイクロカプセル中の水分の除去及びマイクロカプセル剤中の溶媒の除去をより完全に行う。
得られたマイクロカプセルは、通常蒸留水などに再分散後、凍結乾燥して保管されるが凍結乾燥の際に、凝集防止剤を加えてもよい。該凝集防止剤としては、例えばマンニトールなどの水溶性多糖類、澱粉類（例、コーンスターチなど）、無機塩類、アミノ酸、タンパク質などが挙げられる。これらのうち好ましくはマンニトールである。マイクロカプセルと凝集防止剤との混合比（重量比）は、約５０：１ないし約１：１、好ましくは約２０：１ないし約１：１、更に好ましくは約１０：１ないし約５：１である。
洗浄中の粒子同士の凝集を防ぐために、洗浄液である蒸留水に凝集防止剤を加えてもよい。該凝集防止剤としては、例えばマンニトール，ラクトース，ブドウ糖，などの水溶性多糖、グリシン等のアミノ酸、フィブリン，コラーゲン等のタンパク質、塩化ナトリウム，リン酸水素ナトリウム等の無機塩類などが挙げられる。凝集防止剤は、好ましくはマンニトールである。
【００３６】
また、凍結乾燥の後、所望により、減圧下加温してマイクロカプセル中の水分および有機溶媒の除去をさらに行ってもよい。加熱温度が基剤として用いた生体内分解性ポリマーのガラス転移温度未満では、生理活性ペプチドの過剰量の初期放出性改善の効果がなく、また高温過ぎるとマイクロカプセルの融着，変形，生理活性物質の分解，劣化等の危険性が増大する。加熱温度は一概にいえないが、基剤として用いた生体内分解性ポリマーの物性（例、分子量，安定性等），生理活性ペプチド，マイクロカプセルの平均粒子径，加熱時間，マイクロカプセルの乾燥程度，加熱方法等を考慮し適宜決定することができる。
好ましくは、基剤として用いた生体内分解性ポリマーのガラス転移温度以上で、該マイクロカプセルの各粒子が互いに付着しない程度の温度で加熱乾燥する。より好ましくは、基剤として用いた生体内分解性ポリマーのガラス転移温度からガラス転移温度より約３０℃高い温度範囲内で加熱乾燥する。ここにおいて、ガラス転移温度とは、示差走査熱量計を用い、加温速度毎分１０または２０℃で昇温した際に得られる中間点ガラス転移温度をいう。
【００３７】
加熱乾燥時間も加熱温度，処理するマイクロカプセル量などによって異なるが、一般的にはマイクロカプセル自体の温度が所定の温度に達した後、約２４ないし約１２０時間が好ましい。さらに約４８ないし約１２０時間が好ましい。
加熱方法は特に限定されないが、マイクロカプセルが均一に加熱される方法であればいかなる方法を用いてもよい。
上記で得られたマイクロカプセルは、必要であれば軽く粉砕した後、篩過して、大きすぎるマイクロカプセル部分を除去する。マイクロカプセルの粒子径は、徐放性の程度により懸濁剤として使用する場合には、その分散性、通針性を満足させる範囲であればよく、例えば、平均径として約０.５〜４００μmの範囲が挙げられ、より好ましくは約２〜２００μmの範囲にあることが望まれる。
マイクロカプセルを無菌製剤にするには、製造全工程を無菌にする方法、ガンマ線を滅菌する方法、防腐剤を添加する方法などが挙げられるが、特に限定されない。
【００３８】
本発明製造法により製造されたマイクロカプセルは、経口的および非経口的に投与できる。例えば、筋肉内、皮下、血管、臓器、あるいは関節腔、腫瘍などの病巣に容易に注射剤及び埋め込み剤として投与することができる。また、種々の製剤に成型して投与することもでき、そのような製剤を製造する際の原料物質としても使用され得る。
上記製剤としては、注射剤、経口投与製剤（例、散剤、顆粒剤、カプセル剤、錠剤）、経鼻投与製剤、坐剤（例、直腸坐剤、膣坐剤）などが挙げられる。
これらの製剤は、常法に従って製造することができる。
例えば、本発明のマイクロカプセルを注射剤とするには、本発明のマイクロカプセルを分散剤（例、ツイーン（Ｔween）８０、ＨＣＯ ６０（日光ケミカルズ製）、カルボキシメチルセルロース、アルギン酸ナトリウムなど）、保存剤（例、メチルパラベン、プロピルパラベン、ベジールアルコール、クロロブタノールなど）、等張化剤（例、塩化ナトリウム、グリセリン、ソルビトール、ブドウ糖など）などと共に水性懸濁剤に、あるいはオリーブ油、ゴマ油、ラッカセイ油、綿実油、コーン油などの植物油、プロピレングリコールなどに分散して油性懸濁剤に成形され、徐放性注射剤とする。
さらに、上記のマイクロカプセルの徐放性注射剤は、懸濁剤として、上記の組成以外に、賦形剤（例、マンニトール、ソルビトール、ラクトース、ブドウ糖など）を加えて、再分散した後、凍結乾燥もしくは噴霧乾燥して固型化し、用時に、注射用蒸留水あるいは適当な分散剤を加えると、より安定した徐放性注射剤が得られる。
【００３９】
本発明製造法により得られるマイクロカプセルを例えば錠剤にするには、一般に公知の製法に準じて行うことができる。例えば賦形剤（例、乳糖、結晶セルロース、白糖、トウモロコシデンプン等のデンプン類など）、崩壊剤（例、トウモロコシデンプン等のデンプン類、クロスカルメロースナトリウム、カルボキシメチルスターチナトリウム、炭酸カルシウムなど）、結合剤（例、結晶セルロース、アラビアゴム、デキストリン、カルボキシメチルセルロース、ポリビニールピロリドン、ヒドロキシプロピルセルロースなど）又は滑沢剤（例、タルク、ステアリン酸マグネシウム、ポリエチレングリコール６０００など）などを添加して圧縮成形する。
【００４０】
本発明製造法により得られるマイクロカプセルを例えば経鼻投与製剤にするには、固状、半固状又は液状のものに成形され、いずれも一般に用いられる製法で行うことができる。例えば、上記固状のものとしては、該マイクロカプセルをそのまま、あるいは賦形剤（例、グルコース、マンニトール、デンプン、微結晶セルロースなど）、増粘剤（例、天然ガム類、セルロース誘導体、アクリル酸重合物など）などを添加、混合して粉状の組成物とする。上記液状のものとしては、注射剤の場合とほとんど同様で、油性あるいは水性懸濁剤とする。半固状の場合は、水性又は油性のゲル剤、あるいは軟膏状のものがよい。また、これらはいずれも、pＨ調節剤（例、炭酸、リン酸、クエン酸、塩酸、水酸化ナトリウムなど）、防腐剤（例、パラオキシ安息香酸エステル類、クロロブタノール、塩化ベンザルコニウムなど）などを加えてもよい。
【００４１】
本発明製造法により得られるマイクロカプセルを坐剤とするには、油性又は水性の固状、半固状あるいは液状のものをそれぞれ油性基剤又は水性基剤として用いて、自体公知の方法で製造しうる。上記組成物に用いる油性基剤としては、マイクロカプセルを溶解しないものであればよく、例えば高級脂肪酸のグリセリド[例、カカオ脂、ワイテプゾル類（ダイナマイトノーベル社）など]、中鎖脂肪酸トリグリセリド[例、ミグリオール類（ダイナマイトノーベル社）など]、あるいは植物油（例、ゴマ油、大豆油、綿実油など）などが挙げられる。また、水性基剤としては、例えばポリエチレングリコール類、プロピレングリコール、水性ゲル基剤としては、例えば天然ガム類、セルロース誘導体、ビニール重合体、アクリル酸重合体などが挙げられる。
【００４２】
本発明製造法により得られるマイクロカプセルは、初期バーストが抑制されかつ一定した薬物量を長期に亘って放出するため、低毒性で一定した薬効が得られ、安全で効能の高い徐放剤となり得る。しかも、慢性疾患の治療に応用することによりこれまで頻回投与を余儀なくされた患者に対しては、その肉体的負担をなくしコンプライアンスを得ることが出来る。
例えば下垂体小人症の場合には、成長ホルモンの投与はかかせないものであり、従来乳幼児あるいは若年患者に対しては数カ月から10年以上の長期に亘り連日あるいは隔日に皮下あるいは筋肉内投与されているが、本発明製造法により得られる徐放性マイクロカプセルにおいては数週間から数カ月に一度の投与で十分な薬効が得られるため、これらの患者のコンプライアンスの改善に大いに寄与できる。
また例えば水溶性生理活性物質が、抗血栓剤である本発明の徐放性マイクロカプセルを血栓症の治療に用いる場合には、通常の投与法では抗血栓作用の副作用として出血傾向が懸念されるが、本発明の徐放性マイクロカプセルでは副作用を発現しない薬効濃度領域内に血中濃度を長期に亘って安定的に維持できるため、長期に亘る当該慢性疾患の治療だけでなく、その予防にも積極的に使用できる。このように、本発明のマイクロカプセルは、副作用や毒性が低いので（例えば、マウス、ラット、イヌ、ウマ、ウシ、ヒトなどの温血哺乳動物）に安全に投与できる。
【００４３】
徐放性マイクロカプセルの投与量としては、主薬である生理活性物質の種類と含量、剤形、薬物放出の持続時間、投与対象動物、投与目的により種々異なるが、該主薬の有効量であればよい。
例えば生理活性ペプチドあるいはその塩の徐放性マイクロカプセルが１週間型製剤である場合、好ましくは、成人１人当たり約０.０００１ないし１０mg／kg体重の範囲から適宜選ぶことができる。さらに好ましくは約０.０００５ないし１mg／kg体重の範囲から適宜選ぶことができる。投与回数は、１週間に１回、２週間に１回、あるいは１ケ月に１回など、該生理活性ペプチドの種類と含量、剤型、放出の持続時間、対象疾患、対象動物などによって適宜選ぶことができる。
徐放性製剤の有効成分である生理活性ポリペプチドが、例えばヒト成長ホルモンで、２週間型製剤を下垂体性小人症の患者に投与する場合には、有効成分として通常、約０.０１ないし約５mg／kg体重、好ましくは約０.０３ないし約１mg／kg体重の範囲から適宜選び、２週間に１回投与するのがよい。また生理活性物質がインスリンの場合、糖尿病患者に対する投与量は、有効成分として通常、約０.００１ないし約１mg／kg体重、好ましくは約０.０１ないし約０.２mg／kgの範囲から適宜選び、１週間に１回投与するのがよい。
【００４４】
例えば抗血小板薬である前記一般式（Ｉ)で表わされる２-ピペラジノン-１-酢酸誘導体又はその塩の徐放性マイクロカプセルを、不安定狭心症患者、ＰＴＣＡ（経皮的冠動脈内血管形成術）又は冠動脈血栓溶解療法施行時の虚血性合併症又は冠動脈の再閉塞もしくは再狭窄発症患者に経口投与する場合、成人（体重５０kg）に１回当たりの投与量として、マイクロカプセルの適量が約１mgないし１０ｇ、好ましくは約１mgないし２ｇの範囲（通常、主薬である化合物（I）として１回につき約１ないし５００mg、好ましくは約１０ないし２００mgになる範囲）から、適宜選択することができる。又、不安定狭心症患者、ＰＴＣＡ又は冠動脈血栓溶解療法施行後の虚血性合併症又は冠動脈の再閉塞もしくは再狭窄発症患者に非経口投与する場合、例えば上記注射剤として投与する場合の懸濁溶液の容量は、約０.１ないし５ml、好ましくは約０.５ないし３mlの範囲（通常、成人（体重５０kg）の１回当たりの投与量が、主薬である化合物（I）として、約０.０５〜５０mg、好ましくは１〜２０mgになるような範囲）から適宜選ぶことができる。
本発明製造法により得られる徐放性マイクロカプセルは、常温あるいは冷所に保存されるが、好ましくは冷所である。ここでいう常温あるいは冷所とは日本薬局方において定義されるものである。すなわち、常温とは１５ないし２５℃、冷所とは１５℃以下を意味する。
【００４５】
【発明の実施の形態】
以下に実施例および試験例を挙げて、さらに具体的に説明するが、これらは本発明を限定するものではない。
【実施例】
実施例１
(Ｓ)-４-(４-グアニジノベンゾイルアミノ)アセチル-３-[３-(４-グアニジノベンゾイルアミノ)]プロピル-２-オキソピペラジン-1-酢酸（以下、化合物Ａと略称する）の塩酸塩５００mg及びＬ−アルギニン１５０mgを蒸留水１mlに溶解し、内水相とした。一方、乳酸・グリコール酸共重合体（乳酸／グリコール酸＝５０/５０（モル％），重量平均分子量８,０００）３８５０mg及びビタミンＥ５００mgを塩化メチレン７.５mlに溶解し油相とした。油相を内水相に加え、小型ホモジナイザー（ポリトロン）で乳化しＷ/Ｏ型乳化物を得た。このＷ/Ｏ乳化物を１５℃に冷却した２.７％ＮａＣｌ含有０.１％ＰＶＡ水溶液８００ml（外水相）中でホモミキサーを使用して乳化し、Ｗ/Ｏ/Ｗ型乳化物とした。この後、通常のプロペラ撹拌機で３時間緩徐に撹拌し、塩化メチレンの揮散と共にマイクロカプセルが固化するのを待って遠心分離機を用いて捕集した。捕集したマイクロカプセルは、精製水で水洗後、凍結乾燥に供した。
マイクロカプセル２０mgをアセトニトリル／蒸留水の２：１混液３mlに溶解後、０.５Ｎ ＫＯＨ−エタノール溶液３mlを添加して２５℃で２０時間加水分解した。窒素ガス気流下で蒸発乾固した残渣を０.５Ｎ ＨＣｌで中和後、最終アミノ酸濃度約２００nmol/mlとなるように０.０１Ｎ ＨＣｌを用いて希釈し、アミノ酸分析計（日立L-8500A）に供してアルギニンを定量した。
マイクロカプセル中アルギニン含量は１．６％で、また、後述の実施例５に記載の方法で定量したマイクロカプセル中ビタミンＥ含量は１０％であった。
【００４６】
実施例２
化合物Ａの塩酸塩５００mg及びL-アルギニン１５０mgを蒸留水１mlに溶解し、内水相とした。一方、乳酸・グリコール酸共重合体（乳酸／グリコール酸＝５０/５０（モル％)，重量平均分子量８,０００）４１００mg及びビタミンＥ２５０mgを塩化メチレン８mlに溶解し油相とした。油相を内水相に加え、小型ホモジナイザー（ポリトロン）で乳化しＷ/Ｏ型乳化物を得た。このＷ/Ｏ乳化物を１５℃に冷却した２.７％ＮａＣｌ含有０.１％ ＰＶＡ水溶液８００ml（外水相）中でホモミキサーを使用して乳化し、Ｗ/Ｏ/Ｗ型乳化物とした。この後、通常のプロペラ撹拌機で３時間緩徐に撹拌し、塩化メチレンの揮散と共にマイクロカプセルが固化するのを待って遠心分離機を用いて捕集した。捕集したマイクロカプセルは、精製水で水洗後、マンニトール４４０mgを加えて凍結乾燥した。
【００４７】
実施例３
化合物Ａの塩酸塩７５０mg及びL-アルギニン１５０mgを蒸留水２mlに溶解し、内水相とした。一方、乳酸・グリコール酸共重合体（乳酸／グリコール酸＝５０/５０（モル％)，重量平均分子量９,０００）３６００mg及びビタミンＥ５００mgを塩化メチレン１０mlに溶解し油相とした。以下、実施例２と同様にＷ/Ｏ型乳化物、さらにＷ/Ｏ/Ｗ型乳化物を調製しマイクロカプセル凍結乾燥品を得た。得られたマイクロカプセル中のアルギニン及びビタミンＥの含量はそれぞれ１.５％（w/w）及び１０％（w/w）であった。
実施例４
化合物Ａの塩酸塩５００mg及びL-アルギニン１５０mgを蒸留水１mlに溶解し、内水相とした。一方、乳酸・グリコール酸共重合体（乳酸／グリコール酸＝５０/５０（モル％)，重量平均分子量９,０００）４１００mg及びビタミンＥ２５０mgを塩化メチレン８mlに溶解し油相とした。以下、実施例２と同様にＷ/Ｏ型乳化物、さらにＷ/Ｏ/Ｗ型乳化物を調製しマイクロカプセル凍結乾燥品を得た。得られたマイクロカプセル中のアルギニン含量及びビタミンＥの含量はそれぞれ１.８％（w/w）及び５.２％（w/w）であった。
【００４８】
比較例１
化合物Ａ２００mgを蒸留水０.５mlに溶解し、内水相とした。一方、乳酸・グリコール酸共重合体（乳酸／グリコール酸＝５０/５０（モル％)，重量平均分子量９,０００）１８００mgを塩化メチレン２mlに溶解し油相とした。以下、実施例３と同様にＷ/Ｏ型乳化物、さらにＷ/Ｏ/Ｗ型乳化物を調製しマイクロカプセル凍結乾燥品を得た。〔表１〕に実施例４および比較例１で得られたマイクロカプセルの特性を示す。
【表１】

〔表１〕の結果より、化合物Aの塩酸塩を用いて内水相に３％アルギニンを、油相に５％ビタミンＥを添加してマイクロカプセルを調製することにより、マイクロカプセル中への薬物封入率が向上し、in vitro溶出試験での初期放出（１日放出量）を抑制することが可能となった。
【００４９】
試験例１
前記実施例１及び比較例１で得られたそれぞれのマイクロカプセルを、ＳＤラット（雄性、６週齢）に薬物量として２０mg/kgで皮下投与し、投与後の血漿中濃度をＥＬＩＳＡにより測定した。得られた結果を〔図１〕に示す。
〔図１〕においては、実施例１によるマイクロカプセルを曲線Ａ、比較例１によるマイクロカプセルを曲線Ｂで示す。投与１時間後の薬物血漿中濃度は、実施例１および比較例１のマイクロカプセルにおいて、それぞれ６８９ng/mlおよび２９２６ng/mlであった。化合物Ａの塩酸塩を用いて内水相に３％アルギニンを、油相に１０％ビタミンＥを添加して調製したマイクロカプセルにおいては、投与後初期の薬物濃度の上昇が抑制され、その後の血漿中濃度の変動も少なく、約２週間有効血漿中濃度を安定して持続させることが可能となった。
【００５０】
参考例１
アミノ末端にメチオニン付加した組換え型ヒト成長ホルモン（特開昭６２−１７１６９９号公報の参考例１４に記載の方法に準じて製造した。以下、Ｍet-ｈＧＨ と略記する）水溶液(７１０mg/３５５ml ５mＭ ＮＨ₄ＨＣＯ₃, pＨ７.８)に、Ｚｎ(ＯＡc)₂ ２Ｈ₂Ｏ (７１mg/５ml Ｈ₂Ｏ)溶液３.５ml (Ｍet-ｈＧＨ：Ｚｎ=１:７ モル)を撹拌しながら徐々に滴下した。生成した不溶性Ｍet-ｈＧＨ/Ｚｎ複合体を２,５００rpmで２０分間遠心分離し、上清を除去した後、蒸留水１００mlを加えて再分散し 凍結乾燥した。
【００５１】
実施例５
乳酸・グリコール酸共重合体（乳酸／グリコール酸＝５０/５０（モル％），重量平均分子量１５,０００ 和光純薬製）１２７５mg及びビタミンＥ １５０mgを塩化メチレン ２.０mlとアセトニトリル ０.４mlとの混液に溶解し油相とした。この油相に参考例１で得たＭet-ｈＧＨ/Ｚｎ複合体 ７５mgを分散し、まず超音波照射にて５分間、さらに小型ホモジナイザー（ポリトロン）を用いて１５,０００ rpmで１分間微粒化した。このＳ/Ｏ分散液を１５℃に冷却した１０％マンニトール含有０.１％ポリビニルピロリドン（ＰＶＡ）水溶液８００mlに添加し、ホモミキサーを用いて乳化しＳ/Ｏ/Ｗ型乳化物を得た。次いで通常のプロペラ撹拌機で３時間緩徐に撹拌し、塩化メチレンの揮散と共に生成するマイクロカプセルを遠心分離機を用いて捕集し、精製水で水洗後、凍結乾燥に供した。
得られたマイクロカプセル２０mgに５mlの酢酸エチルと１mlの０.１Ｍ酢酸緩衝液（pＨ=４)を加えて１０分間振盪し、２，５００rpm, １０分間遠心分離した。得られた酢酸エチル層の紫外線（UV）吸収（２９４nm）を吸光度計（Beckman DU 7400）で測定し、マイクロカプセル中ビタミンＥ含量を定量した。
マイクロカプセル中ビタミンＥ含量は１０％であった。
【００５２】
実施例６
乳酸・グリコール酸共重合体（乳酸／グリコール酸＝５０/５０（モル％)，重量平均分子量１５,０００）１３５０mg及びビタミンＥ ３００mgを塩化メチレン２.０mlとアセトニトリル ０.４mlとの混液に溶解し油相とした。この油相に参考例１で得たｈＧＨ/Ｚｎ複合体 ７５mgを分散し、まず超音波照射にて５分間、さらに小型ホモジナイザー（ポリトロン）を用いて１５,０００rpmで１分間微粒化した。以下、実施例５と同様にＳ/Ｏ分散液、さらにＳ/Ｏ/Ｗ型乳化物の調製を経て、マイクロカプセル凍結乾燥品を得た。また、実施例５に記載の方法で定量したマイクロカプセル中のビタミンＥ含量は１７％であった。
【００５３】
比較例２
乳酸・グリコール酸共重合体（乳酸／グリコール酸＝５０/５０（モル％），重量平均分子量１５，０００）１４２５mgを塩化メチレン２.０mlとアセトニトリル０.４mlとの混液に溶解し油相とした。この油相に実施例１で得たＭet-ｈＧＨ/Ｚｎ複合体７５mgを分散し、まず超音波照射にて5分間、さらに小型ホモジナイザー（ポリトロン）を用いて１５,０００rpmで１分間微粒化した。以下、実施例６と同様にＳ/Ｏ分散液、さらにＳ/Ｏ/Ｗ型乳化物の調製を経て、マイクロカプセル凍結乾燥品を得た。
【００５４】
試験例２
実施例５、６及び比較例２で得られたマイクロカプセルをＳＤラット(雄性、６週齢)に皮下投与し(ｈＧＨとして１５mg/kg)、血清中濃度をＲＩＡにより測定した。得られた結果を〔図２〕に示す。
〔図２〕に示すように、比較例２のマイクロカプセルを曲線Ａ、実施例５および６のマイクロカプセルをそれぞれ曲線ＢおよびＣで示す。投与１時間後のｈＧＨ血漿中濃度は、比較例２、実施例５および６のマイクロカプセルにおいて、それぞれ８１３ng/ml, ６３３ng/mlおよび８４４ng/mlであった。投与２週後までの血中薬物濃度時間曲線下面積(ＡＵＣ）から算出した生物学的利用能(ＢＡ)は、ｈＧＨ溶液の静脈内投与に比較してそれぞれ４２％, ５６％および５７％であった。また投与２週後までのＡＵＣに対する投与１日後までのＡＵＣの割合を初期バースト率(ＩＢ)とした時、それぞれ８３％, ７９％および７２％であった。
油相に１０％ビタミンＥを添加して調製された実施例１のマイクロカプセルでは、投与後初期（１時間後）のｈＧＨ血漿中濃度（Ｃ１h）の上昇が抑制され、その後２週に亘り高い血清中濃度を維持し、ＢＡの増大とＩＢの抑制が達成された。
また油相に１７％ビタミンＥを添加して調製された実施例１のマイクロカプセルでは、Ｃ１ｈに大きな変化はないが、その後２週間に亘り高い血清中濃度を維持し、同様にＢＡの増大とＩＢの抑制が達成された。
【００５５】
実施例７
化合物Ａの２塩酸塩５００mg及びＬ−アルギニン３００mgを蒸留水１mlに溶解し、内水相とした。一方、乳酸・グリコール酸共重合体（乳酸／グリコール酸＝５０/５０（モル％），重量平均分子量８,０００）３９５０mg及びビタミンＥ２５０mgを塩化メチレン７.５mlに溶解し油相とした。油相を内水相に加え、小型ホモジナイザー（ポリトロン）で乳化しＷ/Ｏ型乳化物を得た。このＷ/Ｏ乳化物を１５℃に冷却した２.７％ＮａＣｌ含有０.１％ＰＶＡ水溶液８００ml（外水相）中でホモミキサーを使用して乳化し、Ｗ/Ｏ/Ｗ型乳化物とした。この後、通常のプロペラ撹拌機で３時間緩徐に撹拌し、塩化メチレンの揮散と共にマイクロカプセルが固化するのを待って遠心分離機を用いて捕集した。捕集したマイクロカプセルは、精製水で水洗後、凍結乾燥に供した。
マイクロカプセル中、薬物封入率は９０％であった。
【００５６】
実施例８
化合物Ａの２塩酸塩５００mg及びＬ−アルギニン３００mgを蒸留水１mlに溶解し、内水相とした。一方、乳酸・グリコール酸共重合体（乳酸／グリコール酸＝５０/５０（モル％），重量平均分子量１０,０００）３１６０mg及び乳酸・グリコール酸共重合体（乳酸／グリコール酸＝５０/５０（モル％），重量平均分子量７,０００）７９０mgの２種類の乳酸・グリコール酸共重合体３９５０mgとビタミンＥ２５０mgとを塩化メチレン１５mlに溶解し油相とした。油相を内水相に加え、小型ホモジナイザー（ポリトロン）で乳化しＷ/Ｏ型乳化物を得た。このＷ/Ｏ乳化物を１５℃に冷却した２.７％ＮａＣｌ含有０.１％ＰＶＡ水溶液８００ml（外水相）中でホモミキサーを使用して乳化し、Ｗ/Ｏ/Ｗ型乳化物とした。この後、通常のプロペラ撹拌機で３時間緩徐に撹拌し、塩化メチレンの揮散と共にマイクロカプセルが固化するのを待って遠心分離機を用いて捕集した。捕集したマイクロカプセル中、薬物封入率は９１％であった。
【００５７】
【発明の効果】
本発明において、生体内分解性高分子重合物の有機溶媒液に相分離を起こすことなく溶解する油脂類を添加することにより、生理活性物質を高含量に含有し、かつ初期放出の少ない安定した放出性を示すマイクロカプセルを調製できる。このマイクロカプセルを使用することにより、生理活性物質の副作用を軽減させつつ長期にわたる投与が可能となり、また投与回数の減少により患者のコンプライアンスの向上が図れる。
【図面の簡単な説明】
【図１】試験例１で用いたマイクロカプセル投与後の薬物血中濃度の経時変化を示す。
【図２】試験例２で用いたマイクロカプセル投与後の薬物血漿中濃度の経時変化を示す。[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
The present invention relates to a sustained-release microcapsule that suppresses the initial release of an excessive amount of a physiologically active substance immediately after administration and stably releases a certain amount of the physiologically active substance immediately after administration, and a method for producing the same.
[0002]
[Prior art]
There are many reports on sustained release microcapsules of various physiologically active polypeptides and low molecular weight water-soluble drugs [Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 12, 1 -9 (1995); JP-T 2-503315; EPA 0586238; Journal of Pharmaceutical Science (J. Pharm. Sci.), 75, 750-755 (1986); JP 57-755 118512], many of them are (1) large leakage of drug into the external aqueous phase in the production process and low drug encapsulation rate. (2) The resulting capsule is generally porous and has a large initial release. In addition, (3) the bioactive substance is denatured by the production process, and a sufficient bioavailability cannot be obtained, and satisfactory long-term sustained release is not achieved. is the current situation.
Regarding the improvement of sustained release of microspheres, JP-A-61-63613 describes an activity for the purpose of preventing a decrease in the release rate of the active ingredient after a certain period of administration of microspheres based on polylactic acid. It is described that fat-soluble additives (medium chain fatty acid triglycerides, lower fatty acid triglycerides, etc.) that are dissolved in the solvent and digested in vivo are uniformly dissolved in an organic solvent solution of polylactic acid in which the components are dispersed. ing. However, there is no suggestion about application to other bases or preparation of microcapsules using an aqueous solution of the active ingredient.
JP-A-8-15321 discloses a microcapsule containing an amorphous water-soluble physiologically active substance and a polymer and produced from an S / O / W emulsion. There is no description of a method for producing microcapsules using an aqueous solution as an inner aqueous phase or a method using a metal complex of a water-soluble physiologically active peptide.
EP 0765660 describes a microcapsule containing an amorphous 2-piperazinone-1-acetic acid derivative, and an S / O / W emulsion is used in the production thereof. However, there is no description of a method for producing microcapsules using an aqueous drug phase as an inner aqueous phase or a method using a metal complex of a water-soluble physiologically active peptide.
In general, in the production of microcapsules of water-soluble physiologically active substances, the W / O type is superior to the S / O type, for example, in which the drug is used in a solid form in terms of homogeneity of drug content and operability. In mass production on an industrial scale, it is desired to use the W / O type.
[0003]
[Problems to be solved by the invention]
The sustained-release preparation using the biodegradable polymer polymer suppresses the initial release of the physiologically active substance, in particular, the excessive release within one day of administration, and a certain amount of the physiologically active substance is present over a long period of time. It is preferable that it is released stably. An object of the present invention is to provide a production method capable of easily producing homogeneous microcapsules having a low initial release and a constant sustained release property over a long period of time while maintaining the physiological activity of such a physiologically active substance.
[0004]
[Means for Solving the Problems]
As a result of diligent research to solve the above-mentioned problems, the inventors of the present invention have prepared a method for producing a sustained-release microcapsule of a water-soluble physiologically active substance in advance in an organic solvent solution of the biodegradable polymer. By using a homogeneous organic solvent solution to which about 3% to about 30% is added as an oil phase, the initial release of an excessive amount of a physiologically active substance immediately after administration is suppressed, and a constant release property is exhibited over a long period of time. It has been found that very excellent sustained-release microcapsules can be produced. As a result of further earnest research based on this, the present invention was completed.
That is, the present invention
(1) In the method for producing microcapsules of a water-soluble physiologically active substance, an aqueous solution containing the water-soluble physiologically active substance is used as the inner aqueous phase, and a homogeneous organic solvent solution containing the biodegradable polymer and fats and oils is used as the oil phase. Forming a w / o emulsion, and removing the organic solvent, a method for producing sustained-release microcapsules,
(2) The production method according to (1) above, wherein the w / o emulsion is dispersed in an aqueous phase, and the organic solvent is removed by an underwater drying method.
(3) The production method according to (1) above, wherein an aqueous solution containing a water-soluble physiologically active substance and a basic substance is used as an inner aqueous phase.
(4) The production method according to the above (1), wherein the water-soluble physiologically active substance is a polypeptide having a molecular weight of about 200 to about 80,000,
(5) The production method according to the above (1), wherein the water-soluble physiologically active substance is an integrin antagonist,
[0005]
(6) The production method according to the above (5), wherein the integrin antagonist is a GPIIb / IIIa antagonist,
(7) A GPIIb / IIIa antagonist is represented by the formula (I)
[Chemical formula 2]

[Where A ¹ And A ² Is a proton-accepting group or a group that can be converted to a proton-accepting group, D is a heteroatom and / or a spacer of a 2 to 6 atom chain optionally via a 5- or 6-membered ring (provided that it is a 5- or 6-membered ring) Is converted to a 2 or 3 atom chain depending on the bond position), R ¹ Is a hydrogen atom or hydrocarbon group, R ² Is a hydrogen atom or an α-amino acid to —CH (NH ₂ ) Represents a residue excluding COOH or R ¹ And R ² May be bonded to form a 5- or 6-membered ring, and P is a spacer of a 1 to 10 atom chain which may be interposed via a heteroatom and / or a 5- or 6-membered ring (provided that the 5- or 6-membered ring is present) Represents a 2 or 3 atom chain depending on the bonding position), Y represents a carboxyl group which may be esterified or amidated, and n represents an integer of 0 to 8. The production method according to the above (6), which is a 2-piperazinone-1-acetic acid derivative represented by the following formula:
(8) 2-Piperazinone-1-acetic acid derivative (I) is (S) -4- (4-guanidinobenzoylamino) acetyl-3- [3- (4-guanidinobenzoylamino)] propyl-2-oxopiperazine- The production method according to the above (7), which is 1-acetic acid,
(9) The salt of 2-piperazinone-1-acetic acid derivative (I) is (S) -4- (4-guanidinobenzoylamino) acetyl-3- [3- (4-guanidinobenzoylamino)] propyl-2-oxo Piperazine-1-acetic acid hydrochloride, the production method according to the above (7),
(10) The salt of 2-piperazinone-1-acetic acid derivative (I) is (S) -4- (4-guanidinobenzoylamino) acetyl-3- [3- (4-guanidinobenzoylamino)] propyl-2-oxo The process according to the above (7), which is piperazine-1-acetic acid dihydrochloride,
(11) The production method according to the above (1), wherein the biodegradable polymer is an aliphatic polyester,
(12) The production method according to the above (11), wherein the aliphatic polyester is a lactic acid / glycolic acid copolymer,
(13) The production method according to the above (1), wherein the fats and oils are fat-soluble vitamins,
(14) The production method according to the above (13), wherein the fat-soluble vitamin is α-tocopherol,
[0006]
(15) The production method according to the above (1), wherein the final content of oils and fats with respect to the total amount of sustained-release microcapsules is about 3% to about 30% (w / w),
(16) W / O type emulsification in which an aqueous solution containing a water-soluble physiologically active substance and a basic substance is used as an inner aqueous phase and a homogeneous organic solvent solution containing a biodegradable polymer and fats and oils is used as an oil phase. The method according to the above (1), wherein the product is dispersed in an aqueous phase to form a W / O / W type emulsion, dried in water to remove the organic solvent,
(17) The production method according to the above (3) or (16), wherein the basic substance is a basic amino acid,
(18) The production method according to the above (17), wherein the basic amino acid is L-arginine,
(19) The production method according to the above (3) or (16), wherein the final content of the basic substance relative to the total amount of sustained-release microcapsules is about 1% to about 8% (w / w),
(20) removing an organic solvent from an S / O dispersion in which a metal complex of a water-soluble bioactive peptide is dispersed in a homogeneous organic solvent solution containing a biodegradable polymer and fats and oils A method for producing a sustained-release microcapsule,
(21) The production method according to the above (20), wherein the S / O type dispersion is dispersed in an aqueous phase to form an S / O / W type emulsion, and the organic solvent is removed by an underwater drying method,
(22) The production method according to the above (20), wherein the water-soluble physiologically active peptide is human growth hormone,
(23) The production method according to the above (20), wherein the metal complex of the water-soluble physiologically active peptide is a zinc complex of human growth hormone,
(24) Sustained release microcapsules produced by the production method described in (1) above,
(25) Sustained release microcapsules produced by the production method according to (20) above,
(26) Forming a w / o emulsion using an aqueous solution containing a water-soluble physiologically active substance as an inner aqueous phase and an organic solvent solution containing a biodegradable polymer as an oil phase, and removing the organic solvent The use of fats and oils for the manufacture of sustained release microcapsules, characterized in that
(27) Use of fats and oils for the production of sustained-release microcapsules of metal complexes of water-soluble physiologically active peptides.
[0007]
In this specification, when abbreviations for amino acids, peptides, protecting groups, etc. are used, they shall be based on abbreviations by IUPAC-IUB Commission on Biochemical Nomenclature or conventional abbreviations in the field, and amino acids may have optical isomers. Unless otherwise specified, the L form is indicated.
In the present specification, the microcapsule means a general term for fine particle microspheres, microparticles, nanoparticles, nanospheres, and nanocapsules containing a physiologically active substance and a polymer.
In this specification, the S / O / W emulsion and the W / O / W emulsion are solid / oil / water (solid phase in oil-in-water) type emulsion and water / oil / water (in oil-in-water), respectively. (Water phase) type emulsion.
The water-soluble physiologically active substance used in the present invention is not particularly limited as long as it is a water-soluble drug. However, the physiologically active polypeptide or antiplatelet agent (for example, integrin antagonist), antitumor agent, antibiotic, antipyretic analgesic / antiinflammatory agent Agent, antitussive expectorant, sedative, muscle relaxant, antiepileptic agent, antiulcer agent, antidepressant, antiallergic agent, cardiotonic agent, antiarrhythmic agent, vasodilator, antihypertensive diuretic, antidiabetic agent, anticoagulant , Compounds used as hemostatic agents, antituberculosis agents, hormone agents, narcotic antagonists, bone resorption inhibitors, osteogenesis promoters, angiogenesis inhibitors and the like.
[0008]
Specific examples of the water-soluble physiologically active substance include those having a solubility in water at 25 ° C. of 0.1% (w / w) or more, preferably 1% (w / w) or more.
Examples of the physiologically active polypeptide that is a component of the present invention include various peptides or proteins that have physiological activity useful for mammals and can be used clinically. The “bioactive polypeptide” has a molecular weight of, for example, about 200 to about 200,000, preferably about 200 to about 80,000 as a monomer. Preferred bioactive polypeptides include macromolecules classified as proteins that are said to have a higher order structure in the field of biochemistry. The type of the physiologically active polypeptide used in the present invention is not particularly limited as long as the object of the present invention is achieved, but typical examples of the activity include growth factors, cytokines, enzymes and hormones. Etc. More specifically, for example, the following peptides or proteins can be mentioned.
[0009]
(1) Examples of growth factors include nerve growth factor (NGF-1, NGF-1, etc.), neurotrophic factor (NTF), epidermal growth factor (EGF), platelet-derived growth factor (PDGF), insulin-like growth Factor (IGF-1, IGF-2, IGF-3, etc.), Fibroblast growth factor (aFGF, bFGF), Osteogenic growth factor (BMP-1, BMP-2, BMP-3, BMP-4, etc.) , Atrial natriuretic factor (ANP), cartilage inducing factor, and the like.
(2) Examples of cytokines include interferons (such as IFN-α, -β, and -γ), interleukins (such as IL-1 to IL-11), cachectin, oncostatin, and colony-stimulating factors (G- CSF, M-CSF, GM-CSF, etc.), thrombopoietin (TPO), erythropoietin (EPO) and the like.
(3) Examples of enzymes include tissue plasminogen activator (tPA), urokinase (UK), streptokinase, protein C, metalloproteases, superoxide dismutase (SOD), factor VIII and factor IX. It is done.
(4) Examples of hormones include growth hormone (GH), growth hormone releasing factor (GRF), insulin, glucagon, gastrin, prolactin, adrenocorticotropic hormone (ACTH), thyroid stimulating hormone (TSH), follicle stimulating hormone ( FSH), luteinizing hormone (LH), human chorionic gonadotropin (hCG), calcitonin and the like.
Preferred examples of the physiologically active polypeptide include hormones [eg, growth hormones (eg, human growth hormones), insulins (eg, human insulins)], cytokines (eg, interferons, interleukins). Etc.).
[0010]
The physiologically active polypeptide used in the present invention is a synthetic product, a semi-synthetic product, a genetically modified product [for example, a recombinant human growth hormone (hereinafter referred to as may be abbreviated as rhGH)]]. These may have a sugar chain as long as the activity is not affected, and the sugar chain structure may be different from the original structure. In addition, these include muteins, derivatives, analogs and active fragments of any bioactive polypeptide or protein. In the following, “bioactive polypeptide”, “growth hormones”, “insulins”, “interferons”, “interleukins” are those having these sugar chains, muteins, derivatives, analogs and Contains active fragments. Further, when the physiologically active polypeptide is a mutein, derivative or analog of any polypeptide, its mechanism of action may be either agonistic or antagonistic.
Moreover, the physiologically active polypeptide used in the present invention may form a complex with the metal atom. Examples of the metal complex (metal complex) of a polypeptide include a water-insoluble or poorly water-soluble polyvalent metal complex and metal complex of a polypeptide. The metal that forms such a metal complex is not particularly limited as long as it is a metal that does not adversely affect the living body, but water-soluble polyvalent metals (divalent, trivalent, or tetravalent metals such as iron, copper, Transition metals such as zinc, IIIb group metals such as aluminum, and IVb group metals such as tin are preferred. The polypeptide metal complex includes a physiologically active polypeptide and a water-soluble polyvalent metal salt (for example, a salt of the polyvalent metal with an inorganic acid such as hydrochloric acid, sulfuric acid, nitric acid, thiocyanic acid, or the polyvalent metal). Organic acids such as aliphatic carboxylic acids (for example, aliphatic mono-, di-, and tricarboxylic acids, preferably aliphatic carboxylic acids having 2 to 9 carbon atoms), aromatic acids (for example, benzoic acid, salicylic acid, etc.) A physiologically active polypeptide metal salt obtained by contacting with The bioactive peptide metal salt can be produced by mixing a bioactive polypeptide and a water-soluble polyvalent metal salt in an aqueous solution adjusted to a pH selected within a range that does not extremely reduce the solubility of both. . In this case, the quantitative ratio (molar ratio) between the physiologically active polypeptide and the water-soluble polyvalent metal salt is, for example, 1: 1 to 1: 1000, preferably 1: 1 to 1: 100, more preferably 1: 1 to 1. It is desired that the concentration of the two is in the single solubility range and is equal to or higher than the solubility of the resulting complex. The aqueous solution is prepared to be weakly acidic, neutral or weakly acidic as necessary.
When the bioactive polypeptide has an acidic group (eg, carboxyl group, sulfo group, etc.) in the molecule, it is insoluble in water with a polyvalent metal for the purpose of improving the uptake rate into microcapsules and controlling the release property. It is effective to use a poorly water-soluble complex.
[0011]
Antiplatelet agents include integrin antagonists and further GPIIb / IIIa antagonists. Examples of GPIIb / IIIa antagonists include snake venom peptides (eg, barbourin, or peptides having an Arg-Gly-Asp sequence, such as Arg-Gly-Asp-Ser, (Arg-Gly-Asp-Ser) tetramers, Gly-Arg-Gly-Asp-Ser-Pro, cyclo-S, S- [Ac-Cys (Nα-methyl) Arg-Gly-D-Asn-penicillamine] -NH ₂ (SK & F-106760: Pharmaceutical Research (Pharm. Res.), 11, 1358-1390, 1994), and compounds having similar activity to GPIIb / IIIa antagonism, such as (S) -4-[( 4-amidinobenzoyl) glycyl] -3-methoxy-carbonylmethyl-2-oxopiperazine-1-acetic acid, 4- (4-amidinobenzoylglycyl) -2-oxopiperazine-1,3-2 acetic acid / hydrochloride, L-Tyr-N- (butylsulfonyl) -O- [4- (4-piperidinyl) butyl] monohydrochloride (L-700462 / MK-383: Circulation 88, 1512-1517, 1993 ), Ethyl 3S- [4-[[4- (aminoiminomethyl) phenyl] amino] -1,4-dioxobutyl] amino-4-pentinoate hydrochloride (SC-54684A: Circuit lation, 91, 403-410, 1995), [1- [N- (p-amidinophenyl) -L-Tyr] -4-piperidinyl] acetic acid (Ro-44-9883: Thromb. Haemostas., 70 817-821 (1993), cyclic [D-2-aminobutyryl-N-2-methyl-L-Arg-Gly-L-Asp-3-aminomethyl-benzoic acid] methanesulfonate (DMP728) : Circulation, 89, 3-12, 1994), formula
[Chemical 3]

(3S-trans) -5-[[[4 '-(Aminoiminomethyl)-[1,1'-biphenyl] -4-yl] oxy] methyl] -2-oxo-pyrrolidine-3- Acetic acid (Fradafiban; BIBU 52: Circulation, 96, 1130-1138, 1997), 2 (S)-[(p-toluenesulfonyl) amino] -3-[[[[5,6,7,8-tetrahydro-4- Oxo-5- [2- (piperidin-4-yl) ethyl] -4H-pyrazolo [1,5-a] [1,4] diazepin-2-yl] carbonyl] amino] propionic acid (L-738,167: The Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics, 281, 677-689, 1997), formula
[Formula 4]

Intrifiban [Integrelin] (Circulation, 94, 2083-2089, 1996), formula
[Chemical formula 5]

FK-633 (JP-A-5-148207) represented by
Examples of the GPIIb / IIIa antagonist include 2-piperazinone-1-acetic acid derivative (I) represented by the above formula (I) or a salt thereof. Examples of the 2-piperazinone-1-acetic acid derivative (I) represented by the formula (I) include compounds described in WO96 / 33982. ¹ And A ² Each (1) C as a substituent _2-8 An alkoxycarbonyloxy group or C _2-8 An amidino group or a guanidino group which may have an alkoxycarbonyl group, respectively, (2) an oxo group or an optionally halogenated C _1-4 An amino group optionally having an oxadiazolyl group optionally substituted with an alkyl group, or (3) an oxo group or an optionally halogenated C _1-4 An oxadiazolyl group optionally substituted with an alkyl group [preferably (1) an amidino group or guanidino group optionally having methoxycarbonyloxy, or (2) 5-oxo-1,2,4 as a substituent -Amino group optionally having oxadiazol-3-yl or 5-trifluoromethyl-1,2,4-oxadiazol-3-yl], and D is the formula
[Chemical 6]

[Wherein, a represents an integer of 0 to 2] [preferably a phenylene group], and R ¹ Is a hydrogen atom and R ² Is a hydrogen atom or C _1-4 C optionally having a phenyl group optionally substituted with an alkoxy group _1-4 An alkyl group [preferably a hydrogen atom or a p-methoxybenzyl group], and P represents a formula —Z—B— [wherein Z represents a bond, —NH— or —NH—CO—, and B represents a formula
[Chemical 7]

(Wherein b represents an integer of 0 to 1 and c represents an integer of 1 to 5)], preferably represented by the formula
[Chemical 8]

Y is a group represented by the formula —CO—R ⁷ [In the formula, R ⁷ (1) hydroxy group, (2) C as substituent _1-4 Each optionally having an alkoxy-carbonyl group or a 5-methyl-2-oxo-1,3-dioxolen-4-yl group _1-8 An alkoxy group or C _2-12 An alkenylyloxy group, or (3) the formula -OCH (R ^7a OCOR ⁸ (Wherein R ^7a Is a hydrogen atom or C _1-6 Represents an alkyl group, R ⁸ Is C _1-6 Alkyl group or C _5-7 2 represents a cycloalkyloxy group), preferably a carboxyl group, and n is an integer of 1 to 4 [preferably an integer of 2 to 3] -Piperazinone-1-acetic acid derivatives are preferred, and the 2-piperazinone-1-acetic acid derivatives are (S) -4- (4-guanidinobenzoylamino) acetyl-3- [3- (4-guanidinobenzoylamino)] propyl -2-oxopiperazine-1-acetic acid, (S) -4- (4-amidinobenzoylamino) acetyl-3- [3- (4-amidinobenzoylamino)] propyl-2-oxopiperazine-1-acetic acid, or Its hydrochloride and acetate are mentioned. Among them, (S) -4- (4-guanidinobenzoylamino) acetyl-3- [3- (4-guanidinobenzoylamino)] propyl-2-oxopiperazine-1-acetic acid hydrochloride, especially (S) -4- (4-Guanidinobenzoylamino) acetyl-3- [3- (4-guanidinobenzoylamino)] propyl-2-oxopiperazine-1-acetic acid monohydrochloride or (S) -4- (4-guanidinobenzoyl) Amino) acetyl-3- [3- (4-guanidinobenzoylamino)] propyl-2-oxopiperazine-1-acetic acid dihydrochloride is preferably used, and (S) -4- (4-guanidinobenzoylamino) acetyl- 3- [3- (4-Guanidinobenzoylamino)] propyl-2-oxopiperazine-1-acetic acid dihydrochloride is (S) -4- (4-guanidinobenzoylamino) acetyl-3- [3- (4 -Guanidinobenzoylamino)] propyl-2-oxopiperazi Concentrated hydrochloric acid is added to a solution containing N-1-acetic acid monohydrochloride, and the pH is adjusted to about 1-2 (preferably about 1.5). The obtained (S) -4- (4-guanidinobenzoylamino) acetyl-3- [3- (4-guanidinobenzoylamino)] propyl-2-oxopiperazine-1-acetic acid dihydrochloride is obtained from ethanol, etc. It can also crystallize using.
[0012]
Examples of the antitumor agents include bleomycin, methotrexate, actinomycin D, mitomycin C, vinblastine sulfate, vincristine sulfate, daunorubicin, adriamycin, neocartinostatin, cytosine arabinoside, fluorouracil, tetrahydrofuryl-5-fluorouracil, krestin, picibanil , Lentinan, levamisole, bestatin, glycyrrhizin, poly IC, poly AU, poly ICLC and other nucleic acids [Immune Response (Yuichi Yamamura, edited by Seiji Morisawa; published in 1977) page 143] and the like.
Examples of the antibiotics include gentamicin, dibekacin, canendomycin, ribidomycin, tobramycin, amikacin, fradiomycin, sisomycin, tetracycline hydrochloride, oxytetracycline hydrochloride, loritetracycline, doxycycline hydrochloride, ampicillin, piperacillin, ticarcillin, cephalothin, cephalolidine , Cefotiam, cefsulosin, cefmenoxime, cefmethazole, cefazoline, cefotaxime, cefoperazone, cefizoxime, moxalactam, thienamycin, sulfazecin, azuleonam, and the like.
[0013]
Examples of the antipyretic, analgesic and anti-inflammatory agents include salicylic acid, sulpyrine, flufenamic acid, diclofenac, indomethacin, morphine, pethidine hydrochloride, levorphanol tartrate, oxymorphone, and the like.
Antitussive expectorants include ephedrine hydrochloride, methylephedrine hydrochloride, noscapine hydrochloride, codeine phosphate, dihydrocodeine phosphate, aloclamide hydrochloride, clofedanol hydrochloride, picoperidamine hydrochloride, cloperastine, protochelol hydrochloride, isoproterenol hydrochloride, salbutamol hydrochloride, Examples include terbutaline sulfate.
Examples of sedatives include chlorpromazine, prochlorperazine, trifluoroperazine, atropine sulfate, methyl scopolamine bromide and the like.
Examples of the muscle relaxant include pridinol methanesulfonate, tubocurarine chloride, and pancuronium bromide.
Antiepileptic agents include phenytoin, ethosuximide, acetazolamide sodium, chlordiazepoxide and the like.
Examples of the anti-ulcer agent include metoclopromide and histidine hydrochloride.
Examples of the antidepressant include imipramine, clomipramine, noxiptillin, phenelzine sulfate and the like.
Examples of the antiallergic agents include diphenhydramine hydrochloride, chlorpheniramine maleate, tripelenamine hydrochloride, clemizole hydrochloride, diphenylpyraline hydrochloride, methoxyphenamine hydrochloride, and the like.
[0014]
Examples of the cardiotonic agent include transpioxocamphor, theophylol, aminophylline, and ethylephrine hydrochloride.
Examples of the arrhythmia therapeutic agent include propranol, alprenolol, bufetrol, oxyprenolol and the like.
Examples of the vasodilator include oxyfedrine hydrochloride, diltiazem, tolazoline hydrochloride, hexobenzine, and bamethane sulfate.
Examples of antihypertensive diuretics include hexamethonium bromide, pentolinium, mecamylamine hydrochloride, ecarazine hydrochloride, and clonidine.
Examples of the therapeutic agent for diabetes include grimidine sodium, glipizide, phenformin hydrochloride, buformin hydrochloride, metformin and the like.
Examples of the anticoagulant include heparin sodium and sodium citrate.
Examples of hemostatic agents include thromboplastin, thrombin, sodium menadione bisulfite, acetomenaphton, ε-aminocaproic acid, tranexamic acid, sodium carbazochrome sulfonate, and adrenochrome monoaminoguanidine methanesulfonate.
Examples of antituberculosis agents include isoniazid, ethambutol, and paraaminosalicylic acid.
Examples of the hormone agent include prednisolone, sodium prednisolone phosphate, dexamethasone sodium sulfate, betamethasone sodium phosphate, hexestrol phosphate, hexestrol acetate, and methimazole.
[0015]
Examples of narcotic antagonists include levalorphan tartrate, narolphine hydrochloride, naloxone hydrochloride, and the like.
Examples of the bone resorption inhibitor include (sulfur-containing alkyl) aminomethylene bisphosphonic acid.
As an osteogenesis promoter, vitamin K ₂ Or parathyroid hormone or formula (II)
[Chemical 9]

[Wherein ring A represents an optionally substituted benzene ring, R represents a hydrogen atom or an optionally substituted hydrocarbon group, B represents an esterified or amidated carboxyl group, X Represents —CH (OH) — or —CO—, k represents 0 or 1, and k ′ represents 0, 1 or 2] or a salt thereof (Japanese Patent Laid-Open No. 3-232880). JP-A-4-364179).
[0016]
Angiogenesis inhibitors include angiogenesis-inhibiting steroids [Science, Vol. 221, 719 (1983)], fumagillin [European Patent Publication No. 325199], fumagillol derivatives [European Patent Publication No. 357061, No. No. 359036, No. 386667, No. 415294] and the like.
Even if the physiologically active substance itself (free form), a pharmacologically acceptable salt (for example, when the physiologically active substance has a basic group such as an amino group, an inorganic acid such as hydrochloric acid, sulfuric acid, nitric acid) Or a salt with an organic acid such as carbonic acid or succinic acid, or a physiologically active substance having an acidic group such as a carboxyl group, an inorganic base such as an alkali metal such as sodium or potassium, or an organic base compound such as triethylamine And salts with basic amino acids such as organic amines and arginine). If the free form of the physiologically active substance is not water-soluble, it may be converted into a water-soluble salt and used.
In the sustained-release microcapsule, the blending amount of the physiologically active substance varies depending on the type, desired pharmacological effect or duration of the effect, but is preferably about 0.01% to about 50% (W / W) is used. More preferably, about 0.1% to about 30% (W / W) is used.
[0017]
Specific examples of the biodegradable polymer used in the present invention include poly fatty acid esters (eg, polylactic acid, polyglycolic acid, polycitric acid, polymalic acid, polylactic caprolactone, etc.), poly-α-cyanoacrylic acid. Esters, poly-β-hydroxybutyric acid, polyalkylene oxalates (eg, polytrimethylene oxalate, polytetramethylene oxalate, etc.), polyorthoesters, polyorthocarbonates, or other polycarbonates (eg, polyethylene carbonate, polyethylene propylene) Carbonate, etc.), polyamino acids (eg, poly-γ-benzyl-L-glutamic acid, poly-L-alanine, poly-γ-methyl-L-glutamic acid, etc.), hyaluronic acid esters and the like.
These high molecular weight polymers may be one kind (homopolymer), two or more kinds of copolymers, a simple mixture, or a salt thereof.
[0018]
The biodegradability of these biodegradable high molecular weight polymers is, for example, when the high molecular weight polymer is administered as an injection, and the total amount of water-soluble low molecular weight fragments produced by decomposition from the high molecular weight polymer is administered. Is generally 10% or more for 3 months after subcutaneous or intramuscular administration, and preferably 80% or more for one year after subcutaneous or intramuscular administration. The biodegradable polymer is preferably an aliphatic polyester (fatty acid polyester). Preferable specific examples of the biodegradable polymer are aliphatic polyesters, particularly hydroxycarboxylic acid homopolymers or copolymers, or mixtures thereof.
Although it does not specifically limit as this hydroxycarboxylic acid, General formula
[Chemical Formula 10]

[Wherein, R represents hydrogen or an alkyl group. A preferred specific example is a hydroxycarboxylic acid represented by the formula
In the above formula, the alkyl group represented by R is, for example, a linear or branched alkyl group having 1 to 8 carbon atoms (eg, methyl, ethyl, propyl, isopropyl, butyl, isobutyl, tertiary butyl, pentyl). Hexyl, heptyl, octyl, etc.). Among these, a linear or branched alkyl group having 1 to 3 carbon atoms is particularly preferable.
[0019]
Preferable specific examples of the hydroxycarboxylic acid include glycolic acid, lactic acid, hydroxybutyric acid (eg, 2-hydroxybutyric acid), 2′-hydroxyvaleric acid, 2-hydroxy-3-methylbutyric acid, 2-hydroxycaproic acid, Examples include 2-hydroxyisocaproic acid, 2-hydroxycaprylic acid and the like. Of these, glycolic acid, lactic acid, 2-hydroxybutyric acid, 2-hydroxy-3-methylbutyric acid, and 2-hydroxycaproic acid are particularly preferable. Furthermore, glycolic acid, lactic acid and 2-hydroxybutyric acid are particularly preferable. In these hydroxycarboxylic acids, any of D-form, L-form and D, L-form may be used, but D, L-form is preferred.
The form of copolymerization of the copolymer may be random, block or graft. Of these glycolic acid copolymers, those having a relatively rapid degradation in vivo and a release period of less than one month when used alone are preferred. In particular, lactic acid / glycolic acid homopolymer or copolymer (hereinafter referred to simply as lactic acid / glycolic acid polymer, including either one of the acid homopolymer and the other copolymer). May be abbreviated) or a hydroxybutyric acid / glycolic acid polymer (hereinafter referred to simply as a hydroxybutyric acid / glycolic acid copolymer including a homopolymer of one of the acids and a copolymer of the other).
The biodegradable polymer used in the present invention can be synthesized without problems by a general synthesis method (see, for example, JP-A No. 61-28521).
[0020]
The weight average molecular weight of these biodegradable polymer used in the present invention is preferably about 2,000 to about 800,000, more preferably about 5,000 to about 200,000. Selected from.
When a lactic acid / glycolic acid copolymer is used as the polymer, the molar ratio of lactic acid / glycolic acid is preferably about 100/0 to about 25/75, more preferably about 100/0 to about 50/50. It is. The weight average molecular weight of the lactic acid / glycolic acid copolymer is preferably about 5,000 to about 30,000, more preferably about 5,000 to about 20,000.
When a hydroxybutyric acid / glycolic acid copolymer (eg, 2-hydroxybutyric acid / glycolic acid copolymer) is used as the polymer, the molar ratio of hydroxybutyric acid / glycolic acid is preferably 100/0 to about 25. / 75, more preferably from about 100/0 to about 50/50. In particular, the molar ratio of 2-hydroxybutyric acid / glycolic acid is preferably about 60/40 to about 30/70. The weight average molecular weight of the hydroxybutyric acid / glycolic acid copolymer is preferably about 5,000 to about 25,000, more preferably about 5,000 to about 20,000.
When a butyric acid / glycolic acid copolymer is used as the polymer, the butyric acid / glycolic acid molar ratio is preferably about 100/0 to about 25/75.
For example, when a mixture of polylactic acid (A) and glycolic acid / 2-hydroxybutyric acid copolymer (B) is used as the polymer, the mixing ratio represented by (A) / (B) is about 10/90. To about 90/10 (weight ratio). Preferably, it is in the range of about 25/75 to about 75/25 (weight ratio).
The polylactic acid preferably has a weight average molecular weight of about 5,000 to about 30,000. Further, those of about 6,000 to about 20,000 are particularly preferred.
[0021]
In addition, the weight average molecular weight in this specification means the average molecular weight of polystyrene weight conversion of the high molecular weight polymer measured by the gel permeation chromatography (GPC) which uses polystyrene as a reference substance.
More specifically, nine types of polystyrene having a weight average molecular weight of 120,000, 52,000, 22,000, 9,200, 5,050, 2,950, 1,055, 580, 162 are used as reference materials. GPC column KF804L × 2 (manufactured by Showa Denko), RI monitor L-3300 (manufactured by Hitachi, Ltd.) is used, and the molecular weight in terms of polystyrene measured by GPC using chloroform as the mobile phase.
The polydispersity of the polymer is defined as weight average molecular weight / number average molecular weight, and is generally 1 to 3.5, preferably 1.5 to 2.5.
The amount of the biodegradable polymer polymer used depends on the strength of the pharmacological activity of the physiologically active substance and the release rate and duration of the substance. For example, about 0.2 to about 10,000 with respect to the physiologically active substance. Double (weight ratio), preferably about 1 to about 1000 times (weight ratio) should be used as the microcapsule base.
The concentration of the biodegradable polymer in the oil phase is selected from about 0.5 to about 90% (W / W), more preferably from about 2 to about 60% (W / W).
[0022]
The fats and oils to be added to the organic solvent liquid of the biodegradable polymer may be any one that dissolves in the organic solvent liquid without causing phase separation and is decomposed and absorbed in vivo. However, fats and oils other than fatty acids or salts thereof, glycerin fatty acid esters and propylene glycol fatty acid esters are preferable, such as fat-soluble vitamins (vitamin A, vitamin D, vitamin E, vitamin K, etc.), medium chain fatty acid triglycerides (miglyol, etc.) Triglycerol of fatty acids having 8 to 12 carbon atoms), cholesterol, phospholipids and the like.
As fats and oils to be added to the organic solvent solution of the above biodegradable polymer, fat-soluble vitamins, cholesterol, phospholipids and the like are preferably used, among which fat-soluble vitamins are preferred, and in particular, α-tocopherol. (Vitamin E) or tocopherol acetate (vitamin E acetate) is preferably used.
The fats and oils added to the organic solvent solution of the biodegradable polymer may have a final content of fats and oils of about 1% to about 50% (W / W) with respect to the total amount of sustained-release microcapsules, more preferably An amount of about 3% to about 30% (W / W) is used.
In the present invention, when producing sustained release microcapsules by the W / O method or the W / O / W method, a basic substance may be further added to the aqueous phase containing the physiologically active substance. Is preferably added when the drug is an acidic drug or an acidic salt (hydrochloride, etc.) of the drug (for example, the pH of the aqueous phase is 6 or less). Examples of basic substances include basic amino acids such as L-histidine, L-arginine, and L-lysine, and N-methylglucamine.
The basic substance added to the aqueous solution of the physiologically active substance has a final content of the basic substance of about 0.1% to about 20% (W / W), more preferably about 1% with respect to the total amount of sustained-release microcapsules. An amount of ~ 8% (W / W) is used.
[0023]
In the production method of the present invention, when an underwater drying method is applied to the removal of the organic solvent, it is preferable to contain an osmotic pressure regulator in the outer aqueous phase. The osmotic pressure regulator may be any substance as long as it shows an osmotic pressure when used as an aqueous solution.
Specific examples of the osmotic pressure regulator include, for example, water-soluble polyhydric alcohols, water-soluble monohydric alcohols, water-soluble inorganic substances (eg, inorganic salts), water-soluble monosaccharides, disaccharides, and oligosaccharides. And polysaccharides or derivatives thereof, water-soluble organic acids or salts thereof, water-soluble amino acids, water-soluble peptides, proteins or derivatives thereof. Of these, water-soluble polyhydric alcohols, water-soluble inorganic substances, water-soluble monosaccharides, disaccharides, oligosaccharides and polysaccharides or derivatives thereof, water-soluble organic acids or salts thereof are preferable. Furthermore, salts, water-soluble polyhydric alcohols and water-soluble inorganic substances are particularly preferable.
Examples of the water-soluble inorganic salt include alkali metal halides such as potassium chloride, sodium chloride, potassium bromide, sodium bromide, potassium iodide and sodium iodide, and alkaline earth halides such as calcium chloride and magnesium chloride. Metals, alkali metal sulfates such as sodium sulfate and potassium sulfate, alkaline earth metal sulfates such as magnesium sulfate and calcium sulfate, potassium dihydrogen phosphate, dipotassium hydrogen phosphate, potassium phosphate, sodium dihydrogen phosphate, Examples thereof include alkali metal phosphates such as disodium hydrogen phosphate and sodium phosphate. Of these, sodium chloride is preferred.
[0024]
Examples of the water-soluble polyhydric alcohols include dihydric alcohols such as glycerin, pentahydric alcohols such as arabitol, xylitol, and adonitol, and hexahydric alcohols such as mannitol and sorbitol. Of these, hexavalent alcohols are preferred.
Examples of the water-soluble monohydric alcohols include methanol, ethanol, isopropyl alcohol and the like. Of these, ethanol is preferred.
Examples of the water-soluble monosaccharide include pentoses such as arabinose, xylose, ribose and 2-deoxyribose, and hexoses such as glucose, fructose, galactose, mannose, sorbose, rhamnose and fucose. Of these, hexose is preferred.
Examples of the water-soluble disaccharide include maltose, cellobiose, α-trehalose, lactose, and sucrose. Of these, lactose and sucrose are preferred.
[0025]
Examples of the water-soluble oligosaccharide include trisaccharides such as maltotriose and raffinose, and tetrasaccharides such as stachyose. Of these, trisaccharides are preferred.
Examples of the water-soluble polysaccharide include glucans such as cellulose, starch and glycogen, galacturonans such as pectinic acid, mannuronans such as alginic acid, fructans such as inulin and levan, and N-acetylglycosamine weight such as chitin. Examples thereof include xylans such as coalescence, rice straw xylan, and diheteroglucans such as mannan, glucomannan, galactomannan, hyaluronic acid, chondroitin sulfate, and heparin. Of these, glucans and diheteroglucans are preferred.
Examples of the water-soluble monosaccharide, disaccharide, oligosaccharide and polysaccharide derivatives include glucosamine, galactosamine, glucuronic acid, galacturonic acid and the like.
[0026]
Examples of the water-soluble organic acid or salt thereof include citric acid, tartaric acid, malic acid, and alkali metal salts thereof (eg, sodium salt, potassium salt, etc.).
Examples of the water-soluble amino acids include neutral amino acids such as glycine, alanine, valine, leucine, isoleucine, phenylalanine, tyrosine, tryptophan, serine, threonine, proline, hydroxyproline, cysteine, and methionine, and acidic acids such as aspartic acid and glutamic acid. Examples include amino acids, basic amino acids such as lysine, arginine and histidine. Further, salts of these water-soluble amino acids with acids (eg, hydrochloric acid, sulfuric acid, phosphoric acid and the like) or alkalis (eg, alkali metals such as sodium and potassium) may be used.
Examples of water-soluble peptides, proteins or derivatives thereof include casein, globulin, prolamin, albumin, gelatin, protamine, histone and the like.
[0027]
The osmotic pressure regulator may be used alone or in combination of one or more. The concentration of these osmotic pressure regulators in the outer aqueous phase is about 0.001 to about 60% (W / W), preferably about 0.01 to about 0.0% when the osmotic pressure regulator is a nonionic substance. About 40% (W / W), more preferably about 0.05 to about 30% (W / W). When the osmotic pressure regulator is an ionic substance, a concentration obtained by dividing the above concentration by the total ionic value is used. The addition concentration of the osmotic pressure regulator need not be lower than the solubility thereof, and a part thereof may be dispersed in an organic solvent.
Below, each process of the manufacturing method of this invention is explained in full detail.
In a method for producing microcapsules using an aqueous solution of a water-soluble physiologically active substance as an aqueous phase, first, a water-soluble physiologically active substance (hereinafter sometimes abbreviated as a drug) is dissolved in water, and if necessary An aqueous phase (inner aqueous phase) is prepared by adding a basic substance such as the basic amino acid and a drug-retaining substance (for example, gelatin, agar, polyvinyl alcohol, etc.) and dissolving them.
The concentration of drug in the inner aqueous phase is preferably about 0.1 to about 150% (W / V). More preferably, it is about 20 to about 130% (W / V). Particularly preferred is about 60 to about 120% (W / V).
In the aqueous phase, as a pH adjuster for maintaining the stability and solubility of the drug, carbonic acid, acetic acid, oxalic acid, citric acid, phosphoric acid, hydrochloric acid, etc., sodium hydroxide, arginine, lysine and their salts, etc. May be added. Further, as a drug stabilizer, polyol compounds such as albumin, gelatin, citric acid, sodium ethylenediaminetetraacetate, dextrin, sodium hydrogen sulfite, polyethylene glycol, etc., or commonly used paraoxybenzoates as preservatives (Methylparaben, propylparaben, etc.), benzyl alcohol, chlorobutanol, thimerosal, etc. may be added.
[0028]
The aqueous phase thus obtained is added to a biodegradable polymer (hereinafter sometimes abbreviated as polymer) and a uniform organic solvent solution (oil phase) containing fats and oils, and then emulsified. Operation is performed to produce a W / O emulsion. The emulsification operation is performed by a known dispersion method, for example, an intermittent shaking method, a method using a mixer such as a propeller-type stirrer or a turbine-type stirrer, a colloid mill method, a homogenizer method, and an ultrasonic irradiation method.
As the polymer solution (oil phase) described above, a solution obtained by dissolving a polymer in an organic solvent substantially immiscible with water is used. The solubility of the organic solvent in water is preferably 3% (W / W) or less at room temperature (20 ° C.). The boiling point of the organic solvent is preferably 120 ° C. or lower. Examples of the organic solvent include halogenated hydrocarbons (eg, dichloromethane, chloroform, chloroethane, trichloroethane, carbon tetrachloride, etc.), alkyl ethers having 3 or more carbon atoms (eg, isopropyl ether), fatty acid alkyls (carbon number 4). And the like) esters (eg, butyl acetate, etc.), aromatic hydrocarbons (eg, benzene, toluene, xylene, etc.). Two or more of these may be mixed and used at an appropriate ratio. The organic solvent is more preferably a halogenated hydrocarbon (eg, dichloromethane, chloroform, chloroethane, trichloroethane, carbon tetrachloride, etc.). The organic solvent is particularly preferably dichloromethane.
[0029]
Next, the organic solvent is removed from the W / O emulsion thus produced according to a conventional method. Examples of the solvent removal method include a spray drying method and an underwater drying method, and an underwater drying method is preferably used. In the spray drying method, the obtained W / O emulsion is sprayed into the drying chamber of a spray dryer (spray dryer) using a nozzle or the like, and the solvent in the atomized droplets is volatilized within a very short period of time. Examples of the nozzle include a two-fluid nozzle type, a pressure nozzle type, and a rotating disk type. The underwater drying method is performed by adding a W / O emulsion to an aqueous phase (outer aqueous phase) to form a W / O / W emulsion and then removing the solvent in the oil phase. .
The volume of the outer water phase is generally selected from about 1 to about 10,000 times the oil phase volume. More preferably, it is selected from about 2 to about 5,000 times. Particularly preferably, it is selected from about 5 to about 2,000 times.
An emulsifier may be added to the outer aqueous phase. The emulsifier may be any as long as it can generally form a stable W / O / W emulsion. Specifically, for example, anionic surfactants (sodium oleate, sodium stearate, sodium lauryl sulfate, etc.), nonionic surfactants (polyoxyethylene sorbitan fatty acid ester [Tween 80, Tween) 60, Atlas Powder Co., Ltd.], polyoxyethylene castor oil derivatives [HCO-60, HCO-50, Nikko Chemicals], etc.), polyvinyl pyrrolidone, polyvinyl alcohol, carboxymethyl cellulose, lecithin, gelatin, hyaluronic acid and the like. The emulsifier is preferably polyvinyl alcohol. One of these emulsifiers or some of them may be used in combination. The concentration at the time of use can be appropriately selected from the range of about 0.001 to about 20% (W / W). More preferably, it is used in the range of about 0.01 to about 10% (W / W). Particularly preferably, it is used in the range of about 0.05 to about 5% (W / W).
Moreover, you may add an above-mentioned osmotic pressure regulator to an external water phase.
[0030]
In the production method of the present invention, when forming the W / O / W emulsion, it is preferable to adjust the viscosity of the W / O emulsion to about 150 centipoise (cp) to about 10,000 cp. Examples of methods for adjusting the viscosity include (1) adjusting the concentration of the biodegradable polymer in the oil phase, (2) adjusting the quantitative ratio of the water phase and the oil phase, and (3) W / Adjust the temperature of the O-type emulsion, (4) Adjust the temperature of the outer aqueous phase, (5) When injecting the W / O-type emulsion into the outer aqueous phase, for example, W / Examples of the method include adjusting the temperature of the O-type emulsion, and these methods may be used alone or in combination.
In the above method, the point is that the viscosity of the W / O emulsion when the W / O emulsion becomes a W / O / W emulsion is about 150 cp to about 10,000 cp. Good.
In the above (1), the concentration in the case of adjusting the concentration of the biodegradable polymer in the oil phase is not uniquely determined because it varies depending on the type of biodegradable polymer, the type of organic solvent, and the like. Is preferably about 10 to about 80% (W / W). In the above (2), the amount ratio in the case of adjusting the amount ratio between the aqueous phase and the oil phase is not uniquely determined by the kind and amount of the drug and the nature of the oil phase, but preferably W / O = about 1% to about 50% (V / V).
[0031]
In the above (3), the temperature for adjusting the temperature of the W / O emulsion is, for example, in the range of about -20 ° C to the boiling point of the organic solvent, preferably about 0 ° C to about 30 ° C, more preferably about 10 ° C. ° C to about 20 ° C.
In the case of the above (1) and (2), the time for adjusting the viscosity of the W / O emulsion can be adjusted when the W / O emulsion is produced.
Further, in (4) above, for example, when the W / O emulsion is added to the outer aqueous phase, the temperature of the outer aqueous phase is adjusted in advance so that the same result as in (3) above is obtained. do it. The temperature of the outer aqueous phase is, for example, about 5 ° C. to about 30 ° C., preferably about 10 ° C. to about 25 ° C., more preferably about 12 ° C. to about 20 ° C.
The method for removing the organic solvent can be carried out according to a method known per se. For example, a method of evaporating an organic solvent under normal pressure or gradually reducing pressure while stirring with a propeller type stirrer or a magnetic stirrer, a method of evaporating an organic solvent while adjusting the degree of vacuum using a rotary evaporator, etc. It is done.
[0032]
On the other hand, when using a metal salt of a poorly water-soluble physiologically active peptide as a physiologically active substance, the physiologically active peptide metal salt is obtained by dispersing it in an organic solvent liquid containing a biodegradable polymer and fats and oils. The resulting dispersion is mixed well, and the bioactive peptide metal salt is dispersed and suspended substantially uniformly in the organic solvent liquid. May be referred to as a thing).
As the organic solvent, the same organic solvent as that used in the preparation of the oil phase containing the biodegradable polymer and fats and oils in the preparation of the W / O emulsion is used.
A known dispersion method is used for preparing the s / o emulsion. Examples of the dispersion method include an intermittent shaking method, a method using a mixer such as a propeller type stirrer or a turbine type stirrer, a colloid mill method, a homogenizer method, and an ultrasonic irradiation method. In this case, it is also effective to use a water-soluble solvent together with a water-insoluble solvent if desired. The water-soluble solvent may be any water-soluble solvent as long as it is water-soluble and can be mixed with the water-insoluble solvent. Specific examples of the water-soluble solvent include alcohols (eg, methanol, ethanol, propyl alcohol, isopropyl alcohol, etc.), acetone, acetonitrile and the like. In the preparation of the s / o emulsion, it is preferable to finely finely disperse the physiologically active substance, and the particle size of the fine particles is usually about 1 nm to about 30 μm, preferably about 1 nm to about 5 μm, and most preferably about 1 nm to about 1 μm.
[0033]
Next, the S / O type emulsion thus produced is subjected to organic solvent removal by the same method as in the case of the W / O type emulsion, but is preferably subjected to an underwater drying method. Preferably, the osmotic pressure regulator of the above concentration is contained in the outer water phase. That is, the oil phase is further added to the second aqueous phase containing an osmotic pressure regulator to form an S / O / W emulsion, and then the organic solvent in the oil phase is removed, Produce capsules.
An emulsifier may be added to the outer aqueous phase in the S / O / W type underwater drying method. For example, the same emulsifier as that used in forming the W / O / W type emulsion is used. .
[0034]
For the removal of the organic solvent in the oil phase, a commonly used method is adopted. As this method, the pressure is gradually reduced while stirring with a propeller type stirrer or a magnetic stirrer, or the vacuum degree is adjusted using a rotary evaporator or the like. In this case, when the solidification of the polymer polymer proceeds to some extent and the loss due to the release of the physiologically active substance from the inner layer is reduced, the S / O / W emulsion is gradually added for the purpose of more complete solvent removal. The time required can be shortened by heating at a low temperature. In addition, when thickening and solidifying by a method other than temperature, the S / O / W emulsion is simply removed by stirring, heating, or blowing nitrogen gas. May be. This process of removing the solvent is an important process that greatly affects the surface structure of the microcapsule that controls the release of the physiologically active substance. For example, by increasing the removal rate, a large number of pores are formed on the surface, and the pores become larger, thereby increasing the release rate of the physiologically active substance.
[0035]
The microcapsules thus obtained are separated by centrifugation or filtration, and then the free physiologically active substance adhering to the surface of the microcapsules, the substance holding the physiologically active substance, etc. are counted with distilled water. Washing repeatedly, heating if necessary, and removing moisture in the microcapsule and solvent in the microcapsule more completely under reduced pressure.
The obtained microcapsules are usually re-dispersed in distilled water or the like and then lyophilized and stored. However, an anti-aggregation agent may be added during lyophilization. Examples of the aggregation inhibitor include water-soluble polysaccharides such as mannitol, starches (eg, corn starch, etc.), inorganic salts, amino acids, proteins, and the like. Of these, mannitol is preferred. The mixing ratio (weight ratio) between the microcapsules and the anti-aggregation agent is about 50: 1 to about 1: 1, preferably about 20: 1 to about 1: 1, more preferably about 10: 1 to about 5: 1. It is.
In order to prevent aggregation of particles during cleaning, an aggregation inhibitor may be added to distilled water as a cleaning liquid. Examples of the aggregation inhibitor include water-soluble polysaccharides such as mannitol, lactose and glucose, amino acids such as glycine, proteins such as fibrin and collagen, and inorganic salts such as sodium chloride and sodium hydrogenphosphate. The aggregation inhibitor is preferably mannitol.
[0036]
Further, after lyophilization, if desired, the water and organic solvent in the microcapsules may be further removed by heating under reduced pressure. If the heating temperature is less than the glass transition temperature of the biodegradable polymer used as the base, there is no effect of improving the initial release of an excessive amount of the bioactive peptide, and if it is too high, the microcapsules are fused, deformed, or bioactive. The risk of decomposition and deterioration of the substance increases. Although the heating temperature cannot be generally specified, the physical properties (eg, molecular weight, stability, etc.) of the biodegradable polymer used as the base, the bioactive peptide, the average particle size of the microcapsules, the heating time, the degree of drying of the microcapsules , Can be appropriately determined in consideration of the heating method and the like.
Preferably, the microcapsules are heat-dried at a temperature not lower than the glass transition temperature of the biodegradable polymer used as the base so that the particles of the microcapsules do not adhere to each other. More preferably, the biodegradable polymer used as the base is heat-dried within a temperature range from the glass transition temperature to about 30 ° C. higher than the glass transition temperature. Here, the glass transition temperature refers to a midpoint glass transition temperature obtained when a differential scanning calorimeter is used and the temperature is increased at a heating rate of 10 or 20 ° C. per minute.
[0037]
Although the heating and drying time also varies depending on the heating temperature, the amount of microcapsules to be treated, etc., generally, about 24 to about 120 hours are preferable after the temperature of the microcapsules itself reaches a predetermined temperature. Further about 48 to about 120 hours are preferred.
The heating method is not particularly limited, and any method may be used as long as the microcapsules are uniformly heated.
The microcapsules obtained above are lightly pulverized if necessary, and then sieved to remove excessively large microcapsule portions. The particle size of the microcapsules may be in a range satisfying the dispersibility and needle penetration when used as a suspension depending on the degree of sustained release, for example, an average diameter of about 0.5 to 400 μm. More preferably, it is desired to be in the range of about 2 to 200 μm.
In order to make a microcapsule into a sterile preparation, there are a method of sterilizing the whole manufacturing process, a method of sterilizing gamma rays, a method of adding a preservative, and the like.
[0038]
Microcapsules produced by the production method of the present invention can be administered orally and parenterally. For example, it can be easily administered as an injection or an implant into a lesion such as intramuscular, subcutaneous, blood vessel, organ, joint cavity, or tumor. Moreover, it can also be shape | molded and administered to a various formulation, and can be used also as a raw material substance at the time of manufacturing such a formulation.
Examples of the preparation include injections, oral preparations (eg, powders, granules, capsules, tablets), nasal preparations, suppositories (eg, rectal suppositories, vaginal suppositories) and the like.
These preparations can be produced according to a conventional method.
For example, in order to use the microcapsule of the present invention as an injection, the microcapsule of the present invention is used as a dispersant (eg, Tween 80, HCO 60 (manufactured by Nikko Chemicals), carboxymethylcellulose, sodium alginate, etc.), preservative (Eg, methylparaben, propylparaben, bezial alcohol, chlorobutanol, etc.), isotonic agents (eg, sodium chloride, glycerin, sorbitol, glucose, etc.) and the like in aqueous suspensions, or olive oil, sesame oil, peanut oil, It is dispersed in vegetable oil such as cottonseed oil and corn oil, propylene glycol and the like, and formed into an oily suspension to form a sustained-release injection.
Further, the sustained-release injection of the above microcapsules is prepared by adding an excipient (eg, mannitol, sorbitol, lactose, glucose, etc.) as a suspension in addition to the above composition, re-dispersing, and then freezing. When solidified by drying or spray-drying and adding distilled water for injection or an appropriate dispersant at the time of use, a more stable sustained-release injection can be obtained.
[0039]
In order to make the microcapsule obtained by the production method of the present invention into a tablet, for example, it can be generally carried out according to a known production method. For example, excipients (eg, lactose, crystalline cellulose, sucrose, starches such as corn starch), disintegrating agents (eg, starches such as corn starch, croscarmellose sodium, carboxymethyl starch sodium, calcium carbonate, etc.), Compression molding by adding a binder (eg, crystalline cellulose, gum arabic, dextrin, carboxymethylcellulose, polyvinylpyrrolidone, hydroxypropylcellulose, etc.) or lubricant (eg, talc, magnesium stearate, polyethylene glycol 6000, etc.) To do.
[0040]
In order to make the microcapsules obtained by the production method of the present invention into, for example, a nasal preparation, it is formed into a solid, semi-solid or liquid form, and any of them can be carried out by a generally used production method. For example, as the solid state, the microcapsules are used as they are, or excipients (eg, glucose, mannitol, starch, microcrystalline cellulose, etc.), thickeners (eg, natural gums, cellulose derivatives, acrylic acid) Polymerized products) are added and mixed to form a powdery composition. The liquid form is almost the same as in the case of injections, and is an oily or aqueous suspension. In the case of a semi-solid state, an aqueous or oily gel or an ointment is preferable. In addition, these are all pH regulators (eg, carbonic acid, phosphoric acid, citric acid, hydrochloric acid, sodium hydroxide, etc.), preservatives (eg, paraoxybenzoic acid esters, chlorobutanol, benzalkonium chloride, etc.), etc. May be added.
[0041]
In order to use the microcapsules obtained by the production method of the present invention as a suppository, an oily or aqueous solid, semi-solid or liquid is used as an oily base or aqueous base, respectively, and is produced by a method known per se. Yes. The oily base used in the composition is not particularly limited as long as it does not dissolve the microcapsules. For example, higher fatty acid glycerides [eg, cacao butter, waitepsol (Dynamite Nobel), etc.], medium chain fatty acid triglycerides [eg, Miglyols (Dynamite Nobel), etc.] or vegetable oils (eg, sesame oil, soybean oil, cottonseed oil, etc.). Examples of the aqueous base include polyethylene glycols and propylene glycol. Examples of the aqueous gel base include natural gums, cellulose derivatives, vinyl polymers, and acrylic acid polymers.
[0042]
The microcapsules obtained by the production method of the present invention can suppress the initial burst and release a constant amount of drug over a long period of time, so that a low toxic and constant medicinal effect can be obtained, and it can be a safe and highly effective sustained release agent. . Moreover, by applying it to the treatment of chronic diseases, the physical burden can be eliminated and compliance can be obtained for patients who have been forced to do so frequently.
For example, in the case of pituitary dwarfism, growth hormone administration is indispensable, and for conventional infants or young patients, it is subcutaneously or intramuscularly administered every day or every other day for several months to over 10 years. However, the sustained-release microcapsules obtained by the production method of the present invention can sufficiently contribute to the improvement of the compliance of these patients because sufficient drug effects can be obtained by administration once every several weeks to several months.
Further, for example, when the sustained-release microcapsule of the present invention, which is a water-soluble physiologically active substance, is an antithrombotic agent, is used for the treatment of thrombosis, there is a concern about bleeding tendency as a side effect of antithrombotic activity in the usual administration method. However, the sustained-release microcapsules of the present invention can stably maintain the blood concentration over a long period of time within a medicinal concentration range that does not cause side effects. Can also be used actively. Thus, since the microcapsules of the present invention have low side effects and toxicity (for example, warm-blooded mammals such as mice, rats, dogs, horses, cows, and humans), they can be safely administered.
[0043]
The dosage of the sustained-release microcapsule varies depending on the type and content of the physiologically active substance that is the main drug, the dosage form, the duration of drug release, the animal to be administered, and the purpose of administration. Good.
For example, when a sustained release microcapsule of a physiologically active peptide or a salt thereof is a one-week preparation, it can be suitably selected from the range of about 0.0001 to 10 mg / kg body weight per adult. More preferably, it can be appropriately selected from the range of about 0.0005 to 1 mg / kg body weight. The frequency of administration is selected as appropriate according to the type and content of the physiologically active peptide, dosage form, duration of release, target disease, target animal, etc. once a week, once every two weeks, or once a month. be able to.
When the bioactive polypeptide that is the active ingredient of the sustained-release preparation is human growth hormone, for example, when a 2-week preparation is administered to a patient with pituitary dwarfism, the active ingredient is usually about 0.01. To about 5 mg / kg body weight, preferably about 0.03 to about 1 mg / kg body weight, and administered once every two weeks. When the physiologically active substance is insulin, the dosage for diabetic patients is usually appropriately selected from the range of about 0.001 to about 1 mg / kg body weight, preferably about 0.01 to about 0.2 mg / kg as an active ingredient. It should be administered once a week.
[0044]
For example, a sustained-release microcapsule of 2-piperazinone-1-acetic acid derivative represented by the above general formula (I), which is an antiplatelet drug, or a salt thereof is used in patients with unstable angina, PTCA (percutaneous intracoronary angiogenesis) Surgery) or orally administered to patients with ischemic complications during coronary thrombolysis or coronary artery re-occlusion or restenosis, the appropriate dose of microcapsules is about 1 dose per adult (50 kg body weight) It can be appropriately selected from the range of 1 mg to 10 g, preferably about 1 mg to 2 g (usually in the range of about 1 to 500 mg, preferably about 10 to 200 mg as compound (I) as the main agent). In addition, when administered parenterally to patients with unstable angina, patients with ischemic complications after coronary thrombolysis therapy or coronary artery re-occlusion or restenosis, for example, the suspension when administered as the above injection The volume of the solution is in the range of about 0.1 to 5 ml, preferably about 0.5 to 3 ml (usually about 0 as the compound (I) as the active ingredient). 0.05 to 50 mg, preferably 1 to 20 mg).
The sustained-release microcapsules obtained by the production method of the present invention are stored at room temperature or in a cold place, preferably in a cold place. The normal temperature or cold place here is defined in the Japanese Pharmacopoeia. That is, normal temperature means 15 to 25 ° C., and cold place means 15 ° C. or less.
[0045]
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
Hereinafter, the present invention will be described more specifically with reference to examples and test examples, but these examples do not limit the present invention.
【Example】
Example 1
Hydrochloride of (S) -4- (4-guanidinobenzoylamino) acetyl-3- [3- (4-guanidinobenzoylamino)] propyl-2-oxopiperazine-1-acetic acid (hereinafter abbreviated as Compound A) 500 mg and L-arginine 150 mg were dissolved in 1 ml of distilled water to obtain an inner aqueous phase. On the other hand, 3850 mg of lactic acid / glycolic acid copolymer (lactic acid / glycolic acid = 50/50 (mol%), weight average molecular weight 8,000) and 500 mg of vitamin E were dissolved in 7.5 ml of methylene chloride to obtain an oil phase. The oil phase was added to the inner aqueous phase and emulsified with a small homogenizer (Polytron) to obtain a W / O type emulsion. This W / O emulsion was emulsified using a homomixer in 800 ml of an aqueous 0.1% PVA solution containing 2.7% NaCl and cooled to 15 ° C. (outer aqueous phase). did. Thereafter, the mixture was gently stirred for 3 hours with an ordinary propeller stirrer, and the microcapsules solidified with the evaporation of methylene chloride, and then collected using a centrifuge. The collected microcapsules were washed with purified water and then freeze-dried.
After dissolving 20 mg of microcapsules in 3 ml of a 2: 1 mixture of acetonitrile / distilled water, 3 ml of 0.5 N KOH-ethanol solution was added and hydrolyzed at 25 ° C. for 20 hours. The residue evaporated and dried under a nitrogen gas stream is neutralized with 0.5N HCl, diluted with 0.01N HCl to a final amino acid concentration of about 200 nmol / ml, and an amino acid analyzer (Hitachi L-8500A). To determine the amount of arginine.
The arginine content in the microcapsule was 1.6%, and the vitamin E content in the microcapsule determined by the method described in Example 5 described later was 10%.
[0046]
Example 2
Compound A hydrochloride (500 mg) and L-arginine (150 mg) were dissolved in 1 ml of distilled water to obtain an inner aqueous phase. On the other hand, 4100 mg of lactic acid / glycolic acid copolymer (lactic acid / glycolic acid = 50/50 (mol%), weight average molecular weight 8,000) and 250 mg of vitamin E were dissolved in 8 ml of methylene chloride to obtain an oil phase. The oil phase was added to the inner aqueous phase and emulsified with a small homogenizer (Polytron) to obtain a W / O type emulsion. This W / O emulsion was emulsified in 800 ml of a 2.7% NaCl-containing 0.1% PVA aqueous solution (outer aqueous phase) cooled to 15 ° C. using a homomixer, and a W / O / W type emulsion was obtained. did. Thereafter, the mixture was gently stirred for 3 hours with an ordinary propeller stirrer, and the microcapsules solidified with the evaporation of methylene chloride, and then collected using a centrifuge. The collected microcapsules were washed with purified water, added with 440 mg of mannitol and freeze-dried.
[0047]
Example 3
750 mg of Compound A hydrochloride and 150 mg of L-arginine were dissolved in 2 ml of distilled water to obtain an inner aqueous phase. On the other hand, 3600 mg of lactic acid / glycolic acid copolymer (lactic acid / glycolic acid = 50/50 (mol%), weight average molecular weight 9,000) and 500 mg of vitamin E were dissolved in 10 ml of methylene chloride to obtain an oil phase. Thereafter, a W / O emulsion and a W / O / W emulsion were prepared in the same manner as in Example 2 to obtain lyophilized microcapsules. The contents of arginine and vitamin E in the obtained microcapsules were 1.5% (w / w) and 10% (w / w), respectively.
Example 4
Compound A hydrochloride (500 mg) and L-arginine (150 mg) were dissolved in 1 ml of distilled water to obtain an inner aqueous phase. On the other hand, 4100 mg of lactic acid / glycolic acid copolymer (lactic acid / glycolic acid = 50/50 (mol%), weight average molecular weight 9,000) and 250 mg of vitamin E were dissolved in 8 ml of methylene chloride to obtain an oil phase. Thereafter, a W / O emulsion and a W / O / W emulsion were prepared in the same manner as in Example 2 to obtain lyophilized microcapsules. The arginine content and vitamin E content in the obtained microcapsules were 1.8% (w / w) and 5.2% (w / w), respectively.
[0048]
Comparative Example 1
Compound A (200 mg) was dissolved in distilled water (0.5 ml) to obtain an inner aqueous phase. On the other hand, 1800 mg of lactic acid / glycolic acid copolymer (lactic acid / glycolic acid = 50/50 (mol%), weight average molecular weight 9,000) was dissolved in 2 ml of methylene chloride to obtain an oil phase. Thereafter, a W / O emulsion and a W / O / W emulsion were prepared in the same manner as in Example 3 to obtain a microcapsule freeze-dried product. Table 1 shows the characteristics of the microcapsules obtained in Example 4 and Comparative Example 1.
[Table 1]

From the results of [Table 1], by preparing 3% arginine in the inner aqueous phase and 5% vitamin E in the oil phase using the hydrochloride of compound A, the microcapsules were prepared. The encapsulation rate was improved, and it was possible to suppress the initial release (daily release amount) in the in vitro dissolution test.
[0049]
Test example 1
The respective microcapsules obtained in Example 1 and Comparative Example 1 were subcutaneously administered to SD rats (male, 6 weeks old) at a drug amount of 20 mg / kg, and the plasma concentration after administration was measured by ELISA. . The obtained results are shown in FIG.
In FIG. 1, the microcapsules according to Example 1 are indicated by curve A, and the microcapsules according to comparative example 1 are indicated by curve B. The drug plasma concentrations one hour after administration were 689 ng / ml and 2926 ng / ml in the microcapsules of Example 1 and Comparative Example 1, respectively. In the microcapsules prepared by adding 3% arginine to the inner aqueous phase and 10% vitamin E to the oil phase using the hydrochloride of Compound A, the increase in the initial drug concentration after administration is suppressed, and the subsequent plasma There was little fluctuation in the medium concentration, and the effective plasma concentration could be stably maintained for about 2 weeks.
[0050]
Reference example 1
Recombinant human growth hormone added with methionine at the amino terminus (produced according to the method described in Reference Example 14 of JP-A-62-171699. Hereinafter, abbreviated as Met-hGH) aqueous solution (710 mg / 355 ml 5 mM) NH _Four HCO _Three , pH 7.8) to Zn (OAc) ₂ 2H ₂ O (71 mg / 5 ml H ₂ O) 3.5 ml of the solution (Met-hGH: Zn = 1: 7 mol) was gradually added dropwise with stirring. The resulting insoluble Met-hGH / Zn complex was centrifuged at 2,500 rpm for 20 minutes, the supernatant was removed, 100 ml of distilled water was added, and then redispersed and lyophilized.
[0051]
Example 5
Lactic acid / glycolic acid copolymer (lactic acid / glycolic acid = 50/50 (mol%), weight average molecular weight 15,000, manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) 1275 mg and vitamin E 150 mg were mixed with 2.0 ml of methylene chloride and 0.4 ml of acetonitrile. The oil phase was dissolved in the mixture. In this oil phase, 75 mg of the Met-hGH / Zn complex obtained in Reference Example 1 was dispersed and first atomized for 5 minutes by ultrasonic irradiation and further atomized at 15,000 rpm for 1 minute using a small homogenizer (Polytron). . This S / O dispersion was added to 800 ml of a 0.1% polyvinylpyrrolidone (PVA) aqueous solution containing 10% mannitol cooled to 15 ° C. and emulsified using a homomixer to obtain an S / O / W type emulsion. Next, the mixture was gently stirred with a normal propeller stirrer for 3 hours, and the microcapsules generated along with the evaporation of methylene chloride were collected using a centrifuge, washed with purified water, and then subjected to lyophilization.
To 20 mg of the obtained microcapsules, 5 ml of ethyl acetate and 1 ml of 0.1 M acetate buffer (pH = 4) were added, shaken for 10 minutes, and centrifuged at 2500 rpm for 10 minutes. Ultraviolet (UV) absorption (294 nm) of the obtained ethyl acetate layer was measured with an absorptiometer (Beckman DU 7400) to quantify the vitamin E content in the microcapsules.
The vitamin E content in the microcapsules was 10%.
[0052]
Example 6
Lactic acid / glycolic acid copolymer (lactic acid / glycolic acid = 50/50 (mol%), weight average molecular weight 15,000) 1350 mg and vitamin E 300 mg were dissolved in a mixture of methylene chloride 2.0 ml and acetonitrile 0.4 ml. An oil phase was obtained. In this oil phase, 75 mg of the hGH / Zn complex obtained in Reference Example 1 was dispersed and first atomized for 5 minutes by ultrasonic irradiation, and further atomized at 15,000 rpm for 1 minute using a small homogenizer (Polytron). Thereafter, an S / O dispersion and an S / O / W emulsion were prepared in the same manner as in Example 5 to obtain a microcapsule freeze-dried product. Moreover, the vitamin E content in the microcapsule quantified by the method described in Example 5 was 17%.
[0053]
Comparative Example 2
1425 mg of lactic acid / glycolic acid copolymer (lactic acid / glycolic acid = 50/50 (mol%), weight average molecular weight 15,000) was dissolved in a mixture of 2.0 ml of methylene chloride and 0.4 ml of acetonitrile to form an oil phase. . In this oil phase, 75 mg of the Met-hGH / Zn complex obtained in Example 1 was dispersed and first atomized for 5 minutes by ultrasonic irradiation, and further at 15,000 rpm for 1 minute using a small homogenizer (Polytron). Thereafter, in the same manner as in Example 6, an S / O dispersion and an S / O / W emulsion were prepared, and a microcapsule lyophilized product was obtained.
[0054]
Test example 2
The microcapsules obtained in Examples 5 and 6 and Comparative Example 2 were subcutaneously administered to SD rats (male, 6 weeks old) (15 mg / kg as hGH), and the serum concentration was measured by RIA. The obtained results are shown in FIG.
As shown in FIG. 2, the microcapsules of Comparative Example 2 are indicated by curve A, and the microcapsules of Examples 5 and 6 are indicated by curves B and C, respectively. The plasma concentration of hGH 1 hour after administration was 813 ng / ml, 633 ng / ml and 844 ng / ml in the microcapsules of Comparative Example 2, Examples 5 and 6, respectively. The bioavailability (BA) calculated from the area under the blood drug concentration time curve (AUC) up to 2 weeks after administration was 42%, 56% and 57%, respectively, compared with intravenous administration of hGH solution. there were. Further, the initial burst rate (IB) was defined as 83%, 79%, and 72%, respectively, when the ratio of AUC until 1 day after administration was 2 weeks after administration.
In the microcapsules of Example 1 prepared by adding 10% vitamin E to the oil phase, the increase in hGH plasma concentration (C1h) at the initial stage (1 hour) after administration was suppressed, and then increased for 2 weeks. Serum concentrations were maintained, increasing BA and suppressing IB.
In addition, in the microcapsules of Example 1 prepared by adding 17% vitamin E to the oil phase, there was no significant change in C1h, but the high serum concentration was maintained for 2 weeks thereafter, and the increase in BA was also observed. Inhibition of IB was achieved.
[0055]
Example 7
Compound A dihydrochloride (500 mg) and L-arginine (300 mg) were dissolved in 1 ml of distilled water to obtain an inner aqueous phase. On the other hand, 3950 mg of lactic acid / glycolic acid copolymer (lactic acid / glycolic acid = 50/50 (mol%), weight average molecular weight 8,000) and 250 mg of vitamin E were dissolved in 7.5 ml of methylene chloride to obtain an oil phase. The oil phase was added to the inner aqueous phase and emulsified with a small homogenizer (Polytron) to obtain a W / O type emulsion. This W / O emulsion was emulsified using a homomixer in 800 ml of an aqueous 0.1% PVA solution containing 2.7% NaCl and cooled to 15 ° C. (outer aqueous phase). did. Thereafter, the mixture was gently stirred for 3 hours with an ordinary propeller stirrer, and the microcapsules solidified with the evaporation of methylene chloride, and then collected using a centrifuge. The collected microcapsules were washed with purified water and then freeze-dried.
In the microcapsule, the drug encapsulation rate was 90%.
[0056]
Example 8
Compound A dihydrochloride (500 mg) and L-arginine (300 mg) were dissolved in 1 ml of distilled water to obtain an inner aqueous phase. On the other hand, lactic acid / glycolic acid copolymer (lactic acid / glycolic acid = 50/50 (mol%), weight average molecular weight 10,000) 3160 mg and lactic acid / glycolic acid copolymer (lactic acid / glycolic acid = 50/50 (mol) %), Weight average molecular weight 7,000) 790 mg of two types of lactic acid / glycolic acid copolymer 3950 mg and vitamin E 250 mg were dissolved in 15 ml of methylene chloride to obtain an oil phase. The oil phase was added to the inner aqueous phase and emulsified with a small homogenizer (Polytron) to obtain a W / O type emulsion. This W / O emulsion was emulsified using a homomixer in 800 ml of an aqueous 0.1% PVA solution containing 2.7% NaCl and cooled to 15 ° C. (outer aqueous phase). did. Thereafter, the mixture was gently stirred for 3 hours with an ordinary propeller stirrer, and the microcapsules solidified with the evaporation of methylene chloride, and then collected using a centrifuge. In the collected microcapsules, the drug encapsulation rate was 91%.
[0057]
【Effect of the invention】
In the present invention, by adding fats and oils that dissolve without causing phase separation to the organic solvent liquid of the biodegradable polymer, the bioactive substance is contained in a high content, and the initial release is stable. Microcapsules exhibiting releasability can be prepared. By using this microcapsule, administration over a long period of time can be achieved while reducing the side effects of physiologically active substances, and patient compliance can be improved by reducing the number of administrations.
[Brief description of the drawings]
FIG. 1 shows changes in drug blood concentration over time after administration of microcapsules used in Test Example 1.
FIG. 2 shows changes over time in drug plasma concentration after administration of microcapsules used in Test Example 2.

Claims (14)

In the method for producing a microcapsule of a water-soluble physiologically active substance,
Water-soluble physiologically active substances and
An aqueous solution containing a basic substance selected from the group consisting of L-histidine, L-arginine, L-lysine and N-methylglucamine is used as the inner aqueous phase,
Biodegradable polymer and biodegradable polymer
The oily phase is a homogeneous organic solvent solution containing fat-soluble vitamins .
forming a w / o emulsion,
dispersing the w / o emulsion in the aqueous phase to form a w / o / w emulsion,
It is characterized by removing the organic solvent by drying in water,
It final content of 3% to for sustained-release microcapsule total amount of fat-soluble vitamins 30% (w / w) der is, to a final content of 1 to% of sustained-release microcapsule total amount of basic material 8% ( w / w) Ru der, process for the preparation of sustained-release microcapsules. The method according to claim 1, wherein the water-soluble physiologically active substance is a polypeptide having a molecular weight of 200 to 80,000. The process according to claim 1, wherein the water-soluble physiologically active substance is an integrin antagonist. The production method according to claim 3, wherein the integrin antagonist is a GPIIb / IIIa antagonist. A GPIIb / IIIa antagonist is a compound of formula (I)

[Wherein, A ¹ and A ² are each a proton accepting group or a group that can be converted into a proton accepting group, D is a hetero atom and / or a chain of 2 to 6 atoms optionally via a 5- or 6-membered ring] A spacer (wherein a 5- or 6-membered ring is converted to a 2 or 3 atom chain depending on the bonding position), R ¹ is a hydrogen atom or a hydrocarbon group, R ² is a hydrogen atom or an α-amino acid to —CH (NH ₂ ) Represents a residue excluding COOH, or R ¹ and R ² may combine to form a 5 or 6 membered ring, and P may be via a heteroatom and / or a 5 or 6 membered ring A spacer of 1 to 10 atomic chains (provided that a 5 or 6-membered ring is converted to a 2 or 3 atomic chain depending on the bonding position), Y is a carboxyl group which may be esterified or amidated, n is An integer of 0 to 8 is shown. A production method according to claim 4, which is a 2-piperazinone-1-acetic acid derivative represented by the formula: The 2-piperazinone-1-acetic acid derivative is (S) -4- (4-guanidinobenzoylamino) acetyl-3- [3- (4-guanidinobenzoylamino)] propyl-2-oxopiperazine-1-acetic acid The manufacturing method of Claim 5. The salt of 2-piperazinone-1-acetic acid derivative is (S) -4- (4-guanidinobenzoylamino) acetyl-3- [3- (4-guanidinobenzoylamino)] propyl-2-oxopiperazine-1-acetic acid The production method according to claim 5, which is hydrochloride. The salt of 2-piperazinone-1-acetic acid derivative is (S) -4- (4-guanidinobenzoylamino) acetyl-3- [3- (4-guanidinobenzoylamino)] propyl-2-oxopiperazine-1-acetic acid 6. The process according to claim 5, which is a dihydrochloride. The production method according to claim 1, wherein the biodegradable polymer is an aliphatic polyester. The method according to claim 9, wherein the aliphatic polyester is a lactic acid / glycolic acid copolymer. Fat-soluble vitamins, The process of Claim 1 which is α- tocopherol. The process according to claim 1, wherein the basic substance is L-histidine, L-arginine or L-lysine. The process according to claim 1, wherein the basic substance is L-arginine. A sustained-release microcapsule produced by the production method according to claim 1.

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