JP4895826B2 - 骨形成蛋白−２の正のモジュレーター - Google Patents

Description

本発明は合成成長因子モジュレーター組成物、特に骨形成蛋白（ＢＭＰ）ファミリーのモジュレーターに関する。本発明の組成物はＢＭＰ−２受容体に特異的な結合親和性を有する１本鎖又は２本鎖のペプチド配列、リンカー、場合により疎水性リンカー、及び、非成長因子ヘパリン結合配列を有する本明細書に開示した式のもの、及び合成成長因子モジュレーターの使用方法である。

（関連出願の相互参照）
本出願は参照により全体が本明細書に組み込まれる２００４年２月２０日に出願されたＰｏｓｉｔｉｖｅ Ｍｏｄｕｌａｔｏｒ ｏｆ Ｂｏｎｅ Ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｉｃ Ｐｒｏｔｅｉｎ−２と題された米国特許暫定出願６０／５４７，０１２の出願の利益を主張する。

本出願は各々の明細書が参照により本明細書に組み込まれる２００２年８月２０日出願されたＳｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｈｅｐａｒｉｎ−Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ Ａｎａｌｏｇｓと題された米国特許出願１０／２２４，２６８の部分継続出願である２００３年８月１９日に出願されたＳｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｈｅｐａｒｉｎ−Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ Ａｎａｌｏｇｓと題された米国特許出願１０／６４４，７０３に関する。

以下の考察は多くの著作物及び年次出版物を参照しており、そして最近の出版物の日付のために特定の出版物は本発明の従来技術と見なされないものもあることに留意しなければならない。このような出版物は本明細書においては、より完全な背景のために呈示するものであり、そのような出版物は特許性を決定する目的のための従来技術であることを許容するものではない。

骨形成蛋白（ＢＭＰ）は胚から成人段階を通して広範な臓器及び組織の発達に関与している蛋白のグループである（Ｗｏｚｎｅｙ ＪＭ ２００２，Ｓｐｉｎｅ ２７（１６ Ｓｕｐｐｌ １）：Ｓ２−８）。ＢＭＰはまた傷害後の組織の修復及びリモデリングの過程において重要な役割を果たしている。特定のＢＭＰは動物モデルにおいて異所性の骨形成を誘導し、そして、重篤な大きさの分節性骨欠損の治癒を増強する。臨床試験によれば、組み換えヒトＢＭＰ（ｒｈＢＭＰ）は自家骨グラフト処置の安全で有効な代替物であることがわかっている。ｒｈＢＭＰ−２およびｒｈＢＭＰ−７はそれぞれ脊髄融合及び難治性の長骨偽関節においてヒトにおける使用が認可されている（Ｋｌｅｅｍａｎ ｅｔ ａｌ．２００１，Ｓｐｉｎｅ ２６（２４）：２７５１−６，Ｂｕｒｋｕｓ ｅｔ ａｌ．２００２，Ｓｐｉｎｅ ２７（２１）：２３９６−４０８，Ｍｃｋａｙ ｅｔ ａｌ．２００２，Ｓｐｉｎｅ ２７（１６ ｓｕｐｐｌ １）：Ｓ６６−８５， Ｐｏｙｎｔｏｎ ｅｔ ａｌ．２００２，Ｓｐｉｎｅ ２７（１６ ｓｕｐｐｌ １）：Ｓ４０−８）。

ｒｈＢＭＰ−２の有効性は用量に大きく依存していると考えられる。生理学的用量を大きく超えた用量がインビボの治療効果のために必要である。例えば１ｍｇ／ｍｌ程度のｒｈＢＭＰ−２の濃度が脊髄固定ケージにおいて使用され（８ｍｇ／ケージ以下））、この量は内因的に典型的に存在するものよりも３桁高いの量である（ＭｃＫａｙ ｅｔ ａｌ．２００２，Ｓｐｉｎｅ ２７ （１６ ｓｕｐｐｌ １）：Ｓ６６−８５）。このような高用量の組み換え蛋白を投与することは高価であるばかりでなく、骨成長亢進及び免疫応答のような副作用を伴う場合がある。従って、ＢＭＰ活性を増強するためのＢＭＰ−２の正のモジュレーターの開発が臨床的に重要である。

ＢＭＰ−２シグナリングには２つの型の膜貫通セリン／スレオニンキナーゼ受容体、即ち、Ｉ型（ＢＲＩ）及びＩＩ型（ＢＲＩＩ）が関与している（Ｈｏｏｄｌｅｓｓ ｅｔ ａｌ．１９９６，Ｃｅｌｌ ８５（４）：４８９−５００，Ｋａｗａｂａｔａ ｅｔ ａｌ．，１９９５，Ｊ．Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７０（１０）：５６２５−３０，Ｎｏｈｎｏ ｅｔ ａｌ．１９９５，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７０（３８）：２２５２２−６，Ｒｏｓｅｎｚｗｅｉｇ ｅｔ ａｌ．１９９５，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９２（１７）：７６３２−６）。活性リガンド／受容体複合体は２：２：２比のＢＭＰ−２、ＢＲＩ及びＢＲＩＩよりなる（Ｒｅｄｄｉ ＡＨ ２００１ Ｊ Ｂｏｎｅ Ｊｏｉｎｔ Ｓｕｒｇ Ａｍ ８３−Ａ Ｓｕｐｐｌ １（Ｐｔ１）：Ｓ１−６）。ＢＭＰ−２がその生物学的機能を発揮するためにはＩ型及びＩＩ型の両方の受容体が必要である。ＢＭＰ−２結合により、ＢＲＩＩによるホスホリル化の結果としてＢＲＩキナーゼが活性化される。ＢＲＩＩはＢＲＩの存在がなければＢＭＰ−２には結合せず、そしてＢＭＰ−２とＢＲＩＩの複合体はＢＲＩ非存在下でシグナリングを開始することができない。ＢＲＩ受容体におけるセリン／スレオニンキナーゼはＳｍａｄ４とのヘテロマー複合体に組みたてられ核内に転座して標的遺伝子の転写を調節するＳｍａｄ１、Ｓｍａｄ５およびＳｍａｄ８のホスホリル化に携わっていると考えられてい（Ｍａｓｓａｇｕｅ ｅｔ ａｌ．２０００，Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ １４（６）：６２７−４４，Ａｔｔｉｓａｎｏ ｅｔ ａｌ．２０００，Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ １２（２）：２３５−４３）。更に、活性化された受容体複合体はＳｍａｄ経路とは独立してｐ３８ＭＡＰキナーゼ経路を活性化することができる（Ｉｗａｓａｋｉ ｅｔ ａｌ．１９９９，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７４（３７）：２６５０３−１０，Ｍｉｙａｚｏｎｏ Ｋ２０００，Ｊ Ｃｅｌｌ Ｓｃｉ １１３（Ｐｔ７）：１１０１−９）。現在では、ＢＭＰ−２がシグナリングを開始するには２つの様式が存在すると考えられている。Ｇｉｌｂｏａ等は複数のＢＭＰ受容体オリゴマーがリガンド結合前の細胞表面に存在することを示している（Ｇｉｌｂｏａ ｅｔ ａｌ．２０００，Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ Ｃｅｌｌ １１（３）：１０２３−３５）。その後Ｎｏｈｅ等は予備形成された受容体複合体がＢＭＰ−２誘導Ｓｍａｄ経路活性化に携わっており、そしてＢＭＰ−２誘導受容体複合体がｐ３８キナーゼ経路を開始させることを示している（Ｎｏｈｅ ｅｔ ａｌ．２００２，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７７（７）：５３３０−８）。

ヘパリン結合成長因子類縁体を形成する幾つかの試みがなされている。例えば天然の血小板誘導成長因子（ＰＤＧＦ）はｈｅａｄ−ｔｏ−ｈｅａｄ（ＡＡ又はＢＢ）ホモ２量体、又は（ＡＢ又はＢＡ）ヘテロ２量体に配置したＡ鎖およびＢ鎖として存在する。即ちＪｅｈａｎｌｉ等への米国特許６，３５０，７３１は天然の活性ポリペプチド２量体を模倣したポリグリシン又はＮ−（４−カルボキシ−シクロヘキシルメチル）−マレイミド（ＳＭＣＣ）鎖を介して２つの合成ＰＤＧＦ受容体結合ドメインが共有結合したＰＤＧＦ類縁体を開示している。

Ｂｅｎ−Ｓａｓｓｏｎへの米国特許６，２３５，７１６は血管形成因子の類縁体を開示している。類縁体は多リンカー骨格により連結された血管形成相同領域２つ以上を含む分枝鎖多価リガンドである。

Ｇｏｄｏｗｓｋｉへの米国特許５，７７０，７０４（’７０４特許）は受容体チロシンキナーゼ、サイトカイン受容体及び神経成長因子受容体スーパーファミリーのメンバーを活性化するためのコンジュゲートを開示している。コンジュゲートは、同族体受容体への結合が可能な少なくとも２つのリガンドを含むことにより、それぞれのリガンドの結合がこれ等の受容体のオリゴマー化を誘導する。’７０４特許に開示されたリガンドは種々の非蛋白性重合体、特に親水性重合体、例えばポリビニルアルコール及びポリビニルピロリドン及びポリビルルアルケンエーテル類、例えばポリエチレングリコール及びポリプロピレングリコールへの共有結合により連結される。リガンドは各々が肝細胞成長因子（ＨＧＦ）受容体と結合するＨＧＦペプチド変異体を含むことにより、受容体の２量体化及びＨＧＦ受容体２量体の生物活性の活性化を誘発する。

Ｃａｌｄｗｅｌｌ等への米国特許６，２８４，５０３（’５０３特許）は細胞接着、細胞生育、細胞分類及び生物学的試験のための、疎水性表面及び疎水性コーティング表面への細胞及び生体分子の接着を調節するための組成物及び方法を開示している。組成物は反応性末端基活性化重合体にコンジュゲートされた生体分子である。末端基活性化重合体はブロック共重合体界面活性剤骨格及び活性化又は反応性の基を包含する。ブロック共重合体は疎水性表面に吸着できる疎水性領域及び疎水性領域が疎水性表面に吸着された場合に表面から隔たる方向に伸長する親水性の領域を有する何れかの界面活性剤であってよい。’５０３特許は末端基活性化重合体にコンジュゲートしてよい生体分子は天然又は組み換えの成長因子、例えばＰＤＧＦ、ＥＧＦ、ＴＧＦα、ＴＧＦβ、ＮＧＦ、ＩＧＦ−Ｉ、ＩＧＦ−ＩＩ、ＧＨ及びＧＨＲＦ並びに重複ＣＳＦ（ＩＬ−３）、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ及びＭ−ＣＳＦを包含すると開示している。

他の研究者等は線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）の相同体及び類縁体を包含する組成物を記載している。例えばＬａｐｐｉ及びＢａｉｒｄへの米国特許５，６７９，６７３；Ｄｅｉｓｈｅｒ等への米国特許５，９８９，８６６及びＦｉｄｄｅｓ等への米国特許６，２９４，３５９を参照できる。これ等の開示は毒性部分にコンジュゲートされており、ＦＧＦ受容体担持細胞にターゲティングされているか；又は、ＦＧＦ相同体又は類縁体による結合時にＦＧＦ受容体により伝達されるシグナルを介して生物学的経路をモジュレートする相同体又は類縁体のいずれかであるＦＧＦ相同体又は類縁体に関する。

Ｋｏｃｈｅｎｄｏｅｒｆｅｒ等の一連の特許出願は合成ケモカイン及び赤血球形成刺激蛋白を含む重合体修飾蛋白を開示している。例えば国際特許公開ＷＯ０２／０４１０５、ＷＯ０２／１９９６３及びＷＯ０２／２００３３を参照できる。これ等は蛋白のグリコシル化部位１つ以上に結合した水溶性重合体を有するポリペプチド鎖が生じるように合成の赤血球形成蛋白のポリペプチド鎖に化学的にライゲーションされたペプチドセグメントを含む。これらの出願はやはり重合体修飾され、拮抗剤とされている合成のケモカインも開示している。しかしながら、ヘパリン結合ドメインは開示されていない。他の赤血球形成ミメティック、例えばＷｒｉｇｈｔｏｎ等への米国特許５，７７３，５６９及び５，８３０，８５１に開示されているようなものも知られている。

Ｂａｌｌｉｎｇｅｒ及びＫａｖａｎａｕｇｈへの国際特許公開ＷＯ００／１８９２１は直接又は連結基を介して「オリゴマー化ドメイン」にアフィニティー連結されたＦＧＦ受容体を有する融合蛋白よりなる組成物を開示している。オリゴマー化ドメインの長さは約２０〜３００残基であり、転写因子、ＩｇＧのＦｃ部分、ロイシンジッパー等のコンストラクトを含んでいる。開示されたオリゴマー化ドメインはホモ２量体ドメインであり、ここでは単一のＦＧＦ受容体親和性融合蛋白が単一のドメイン、例えばロイシンジッパーに連結しており、これが次に同様の分子に対してロイシンジッパーのアミノ及びカルボキシ末端の両方においてシステイン残基により連結され、ここでは各々が単一のＦＧＦ受容体親和性融合蛋白を有する２つの平行したロイシンジッパーがジスルフィド結合により交差結合している。融合蛋白はヘパリン結合ドメインを含んでよいこと、例えばヘパリン結合ドメインとされている多量体化ドメインとしてｊｕｎを使用することが開示されている。即ちＢａｌｌｉｎｇｅｒ及びＫａｖａｎａｕｇｈにより開示されている組成物は全て、オリゴマー化ドメインに共有結合した単一の受容体結合配列よりなるものであり、これにより各々が単一の受容体結合配列を有する２つ以上の同じオリゴマー化ドメインが、オリゴマー化ドメインにより与えられる会合により接合させられているか、或いは、化学的に共有結合することにより個々の成分の共有結合を与えている。

上記した相同体、類縁体、コンジュゲート又はリガンドは、各々、受容体結合ドメインを含んでいる。しかしながら、開示された化合物又は組成物の何れも更に、ジペプチド配列への２受容体結合ドメインの連結をもたらし、更にヘパリン結合ドメインを含有する単一の非シグナリングペプチドを共に与えるリンカーを含んでいない。更にまた、これ等、又は、他の知られたヘパリン結合成長因子類縁体の何れも、本明細書に後述する利点を与えていない。更にまた、従来技術はＢＭＰ−２のような天然に存在する成長因子の効力を相乗作用により増大又は増強させるモジュレーターを開示していない。

本発明の化合物は骨形成蛋白２（ＢＭＰ−２）、特にヒトＢＭＰ−２の部分的アゴニストである。本明細書においては、「ＢＭＰ−２」とは特にヒトＢＭＰ−２を包含するが、ヒトＢＭＰ−２に限定されない。本発明の化合物はＢＭＰ−２の生物活性を大きく増強する。用途としては、本発明の化合物は脱鉱物化骨マトリックス（ＤＢＭ）に対する添加剤及びＢＭＰ−２の生物活性を最大限とする骨グラフト材料として使用できる。本発明の化合物はＤＢＭ（外因性）及び修復中の骨（内因性）において存在するＢＭＰ−２の生物活性を増強する。本発明の化合物は好ましくは固相ペプチド化学により作成される。本発明の化合物の臨床使用は用途のうちでも骨修復を加速することに適用される新しい治療手段を提供する。

本発明の化合物はＢＭＰ−２の生物有効性を実質的に増大させ、そして、ＢＭＰ−２用量閾値を実質的に低下させる。本発明の化合物＋ＢＭＰ−２はＢＭＰ−２の閾値下濃度においてアルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）活性を実質的に上昇させる。本発明の化合物はＢＭＰ受容体アイソフォームと直接相互作用し、本発明の化合物とＢＭＰ−２との組み合わせは有糸分裂促進物質活性化蛋白キナーゼ（ＭＡＰキナーゼ）の相乗作用的抑制及びＳｍａｄ活性化の相乗作用的増大を誘発する。Ｓｍａｄ活性化の相乗作用的増大は系に対するこれ等の化合物の観察された作用又は活性の大きな原因となっていると推定される。本発明の化合物はＤＢＭとともに、例えばａ）ＤＢＭで観察されるＢＭＰ−２の増強、及びｂ）骨修復において調節されないことがわかっている宿主ＢＭＰ−２の増強から相応に生じる増強された骨修復を伴って供給されてよい。同様に、本発明の化合物をリン酸３カルシウム又は硫酸カルシウムのような伝統的な骨伝導性物質と組み合わせて供給すれば、宿主のＢＭＰ−２を増強でき、そして骨誘導及び骨充填物質内への増大した細胞遊走をもたらすことができる。両方の方策はＢＭＰ−２及びその受容体が骨修復過程の間にアップレギュレートされるという事実を利用している。

本発明の１つの実施形態は、下記式Ｉ：

（式Ｉ）
[式中、
Ｘは（ｉ）最低３アミノ酸残基を有し、（ｉｉ）最高約５０アミノ酸残基を有し、そして（ｉｉｉ）骨形成蛋白−２受容体に特異的に結合するペプチド鎖であり；
Ｒ₁は独立して水素であり、これにより、末端基はＮＨ₂、Ｎ末端ＮＨ₂、ＮＨ₃ ⁺又はＮＨ基を含む直鎖又は分枝鎖のＣ₁〜Ｃ₁₇アルキル、アリール、ヘテロアリール、アルケン、アルケニル又はアラルキル鎖を有するアシル基又は相当するアシル化誘導体であるか、又は、Ｎ末端ＮＨ₂、ＮＨ₃ ⁺又はＮＨ基を有するアミノ酸、ジペプチド又はトリペプチドであり；
Ｒ₂は独立して３官能性のアルファアミノ酸残基であり、ここでＸはＲ₂の側鎖を介して共有結合しており；
Ｒ₃は独立してＲ₂に共有結合した０〜約１５骨格原子の鎖を含むリンカーであり；
Ｒ₄はＯＨであり、これにより、末端基はカルボキシル、ＮＨ₂、Ｎ末端ＮＨ₂、ＮＨ₃ ⁺又はＮＨ基を含む直鎖又は分枝鎖のＣ₁〜Ｃ₁₇アルキル、アリール、ヘテロアリール、アルケン、アルケニル又はアラルキル鎖を有するアシル基又は相当するアシル化誘導体、又はＮＨ−Ｒ₁であり；
ＹはＲ₂およびＺに共有結合した０〜約５０骨格原子の鎖を含むリンカーであり；そして、
Ｚは（ｉ）最低１ヘパリン結合モチーフ、（ｉｉ）最高約１０ヘパリン結合モチーフ、及び（ｉｉｉ）最高約３０アミノ酸を含むアミノ酸配列を含むヘパリン結合ドメインを包含する非シグナリング鎖である]の化合物である。

本発明の更に別の実施形態は式Ｉのコーティングを含有する生物活性インプラントである。本発明の更に別の実施形態は式Ｉから製造される骨患部又は変性間接状態の治療又は予防的処置のための医薬である。本発明の更に別の実施形態は医薬組成物において使用される式Ｉの化合物及び／又は製薬上許容しうるその塩又は製薬用担体である。

本発明の別の実施形態は下記式ＩＩ：

（式 ＩＩ）
[式中、
Ｘは（ｉ）最低３アミノ酸残基を有し、（ｉｉ）最高約５０アミノ酸残基を有し、そして（ｉｉｉ）骨形成蛋白−２受容体に特異的に結合するペプチド鎖であり；
Ｒ_１は独立して水素であり、これにより、末端基はＮＨ_２、Ｎ末端ＮＨ_２、ＮＨ_３ ^＋又はＮＨ基を含む直鎖又は分枝鎖のＣ_１〜Ｃ_１７アルキル、アリール、ヘテロアリール、アルケン、アルケニル又はアラルキル鎖を有するアシル基又は相当するアシル化誘導体であるか、又は、Ｎ末端ＮＨ_２、ＮＨ_３ ^＋又はＮＨ基を有するアミノ酸、ジペプチド又はトリペプチドであり；
Ｒ_６は、リンカーが０原子より大である場合、独立してＲ _５ に共有結合した０〜約１５骨格原子の鎖を含むリンカーであり；
Ｒ_５は３官能性のアルファアミノ酸残基であり、ここでＸはＲ _５ の側鎖を介して共有結合しており；
Ｒ_４はＯＨであり、これにより、末端基はカルボキシル、ＮＨ_２、Ｎ末端ＮＨ_２、ＮＨ_３ ^＋又はＮＨ基を含む直鎖又は分枝鎖のＣ_１〜Ｃ_１７アルキル、アリール、ヘテロアリール、アルケン、アルケニル又はアラルキル鎖を有するアシル基又は相当するアシル化誘導体、又はＮＨ−Ｒ_１であり；
ＹはＲ_５およびＺに共有結合した０〜約５０骨格原子の鎖を含むリンカーであり；そして、
Ｚは（ｉ）最低１ヘパリン結合モチーフ、（ｉｉ）最高約１０ヘパリン結合モチーフ、及び（ｉｉｉ）最高約３０アミノ酸を含むアミノ酸配列を含むヘパリン結合ドメインを包含する非シグナリングぺプチド鎖である]の化合物である。

本発明の別の実施形態は式ＩＩの化合物を含有する少なくとも１つのコーティングを有する生物活性インプラントである。

本発明の別の実施形態は式ＩＩの化合物又は製薬上許容しうるその塩及び製薬用担体を含有する医薬組成物である。

本発明の更に別の実施形態は、脊椎動物における骨形成の増強、骨患部の治療又は変性間接状態の治療のための方法であって、この方法は、骨形成蛋白−２活性を増強する式Ｉ又は式ＩＩの化合物有効量をそのような治療の必要な脊椎動物対象に投与することを含み、ここで化合物は非成長因子ヘパリン結合領域、リンカー及び骨形成蛋白−２受容体に特異的に結合する配列を有する合成のペプチドである。

本発明の１つの特徴は合成成長因子モジュレーターを提供する。

本発明の別の特徴はインビボでＢＭＰ−２活性の正のモジュレーターである合成成長因子類縁体である化合物を提供する。

本発明の別の特徴はインビトロでＢＭＰ−２活性の正のモジュレーターである化合物を提供する。

本発明の更に別の特徴は治療目的のための外因性に適用されるＢＭＰ−２の有効量を低減する化合物を提供する。

本発明の別の特徴は投与の必要な対象に対して送達される組み換えＢＭＰの治療有効量を低減することである。

本発明の別の特徴は骨折部位にＢＭＰファミリーの組み換えメンバーと組み合わせて本発明の化合物を提供することによる、骨傷害を有する対象を治療するための方法を提供する。

本発明の別の特徴は骨折部位に本発明の化合物を提供することによる、骨傷害を有する対象を治療するための方法を提供する。

本発明の別の特徴は治療の必要な対象の部位にＢＭＰファミリーの組み換えメンバーと組み合わせて本発明の化合物を提供することによる、骨生育の必要な対象を治療するための方法を提供する。

本発明の別の特徴は治療の必要な対象の部位に本発明の化合物を提供することによる、骨生育の必要な対象を治療するための方法を提供する。

本発明の別の特徴は本発明の化合物を含有するキットを提供することである。

本発明の別の特徴は本発明の組成物を含有するキットを提供することである。

本発明の別の特徴は本発明の化合物を含有する生物活性の移植可能な装置である。

本発明の別の特徴、利点、新規な特徴及び別の適用範囲は部分的には後述する詳細な説明において添付図面を参照しながら説明する通りであり、そして部分的には後述部分を検討すれば当業者には自明のものであり、また本発明の実施により学習されるものである。本発明の目的及び利点は添付する請求項に特に記載した装置及び組み合わせを用いることにより実現達成される。

臨床状況において、本発明の化合物はＤＢＭとともに、例えばａ）ＤＢＭで観察されるＢＭＰ−２の増強、及びｂ）骨修復においてアップレギュレートされることがわかっている宿主ＢＭＰ−２の増強から相応に生じる増強された骨修復を伴って供給されてよい。同様に、本発明の化合物をリン酸３カルシウムのような伝統的な骨伝導性物質と組み合わせて供給すれば、宿主のＢＭＰ−２を増強でき、そして骨誘導及び骨充填物質内への増大した細胞遊走をもたらすことができる。両方の方策はＢＭＰ−２及びその受容体が骨修復過程の間にアップレギュレートされるという事実を利用している。

ＢＭＰ−２の既知の活性化経路に従えば、本発明の化合物はＢＭＰ受容体アイソフォーム（ＢＲＩ及びＢＲＩＩ）と直接相互作用し、そして本発明の化合物とＢＭＰ−２との組み合わせはＢＭＰ−２単独を使用する場合と比較して、有糸分裂促進物質活性化蛋白キナーゼ（ＭＡＰキナーゼ）の相乗作用的抑制及びＳｍａｄ活性化の相乗作用的増大を誘発すると推定される。ＢＭＰ−２阻害剤は知られているが、これ等は生理学的範囲において機能する最初の知られたＢＭＰ−２エンハンサーである。

本発明の化合物はＢＭＰ受容体と直接相互作用して骨原性分化をもたらすＢＭＰ−２誘導事象を正方向にモジュレートする。本発明の化合物とＢＭＰ−２との間の相乗作用的な効果は、少なくとも２種の骨原性分化マーカー、ＡＬＰ活性及びＳｍａｄホスホリル化により測定した場合、２種の多能細胞系統、Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２及びＣ２Ｃ１２において観察された。ＢＭＰ−２の何れかの所定濃度におけるＡＬＰ活性の増強は一般的に５〜２０倍上昇であった。負の調節物質であるか、正常な生理学的条件下では機能できない物質のいずれかを有する他のＢＭＰ−２モジュレータも研究者等により発見されているが、本発明の化合物はＢＭＰ−２を正方向にモジュレートする最初のペプチド特異的調節物質である。

最近数種のＢＭＰ特異的拮抗剤が発見された。ノジン、コルジン及びグレムリンはＢＭＰ受容体と同じ親和性でＢＭＰに結合し、従ってＢＭＰを競合的に阻害することがわかっている（Ｚｉｍｍｅｒｍａｎ ｅｔ ａｌ．１９９６，Ｃｅｌｌ ８６（４）：５９９−６０６，Ｈｓｕ ｅｔ ａｌ．１９９８，Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ １（５）：６７３−８３）。ラット骨髄細胞培養物において、ｂＦＧＦはＢＭＰと相乗作用的に作用することがわかっている（Ｈａｎａｄａ ｅｔ ａｌ．１９９７，Ｊ Ｂｏｎｅ Ｍｉｎｅｒ Ｒｅｓ １２（１０）：１６０６−１４，Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ． １９９３，Ａｃｔａ Ｏｒｔｈｏｐ Ｓｃａｎｄ ６４（５）：５５７−６１）が、より高用量のｂＦＧＦはインビボで強い阻害作用を誘発している。Ｓｐｉｎｅｌｌａ−Ｊａｅｇｌｅ等によれば、ソニックヘッジホッグ（Ｓｈｈ）はＣ３Ｈ１０Ｔ１／２及びＳＴ２細胞においてＢＭＰ−２の作用を増強したが、類似の骨先駆細胞Ｃ２Ｃ１２及び前骨芽細胞ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１においてはＢＭＰ−２活性を増強できなかった。更にまた、増強作用はＳｈｈがＢＭＰ−２に応答する細胞のパーセンテージを上昇させたプライミング効果であると考えられることがわかった（Ｓｐｉｎｅｌｌａ−Ｊａｅｇｌｅ Ｓ， ｅｔ ａｌ．２００１，Ｊ Ｃｅｌｌ Ｓｃｉ １１４（Ｐｔ１１）：２０８５−９４）が、Ｓｈｈ自身はＣ３Ｈ１０Ｔ１／２においてＡＬＰ活性を誘導することができる（Ｎａｋａｍｕｒａ ｅｔ ａｌ．１９９７，Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ ２３７（２）：４６５−９，Ｋｉｎｔｏ ｅｔ ａｌ．１９９７ ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ ４０４（２−３）：３１９−２３， Ｋａｔｓｕｕｒａ ｅｔ ａｌ．１９９９，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ ４４７（２−３）：３２５−８，Ｙｕａｓａ ｅｔ ａｌ，２００２，Ｊ Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ １９３（２）：２２５−３２）。

別の系統の研究においては、ＢＭＰ活性を有するペプチドを形成する試行が満足できる結果を与えていない。骨誘導作用がＢＭＰ−７配列のストレッチに関してはＤｅｅ等により（Ｗｈｉｔｅ ｅｔ ａｌ．２００１，ｖｏｌ．ＢＥＤ−Ｖｏｌ．５０，Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｏｆ Ｍｅｃｈａｎｉｃａｌ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｓ， Ｓｎｏｗｂｉｒｄ， Ｕｔａｈ，ｐｐ２０１−２０２）、そして、ＢＭＰ−２配列の２つの重複ストレッチについてはＳｕｚｕｋｉ＆Ｔａｎｉｈａｒａ （Ｓａｉｔｏ ｅｔ ａｌ．２００３，Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ １６５１（１−２）：６０−７，Ｓｕｚｕｋｉ ｅｔ ａｌ．２０００，Ｊ Ｂｉｏｍｅｄ Ｍａｔｅｒ Ｒｅｓ ５０（３）：４０５−９）により報告されている。しかしながらこれ等の結果は、ペプチドを極めて高濃度において、および／またはそれらを数週間細胞と接触させる基盤に共有結合するという、超常的な実験系において得られたものである。例えば、最高のＢＭＰ−２様活性を有すると報告された線状ペプチド（Ｓａｉｔｏ ｅｔ ａｌ．２００３，Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ １６５１（１−２）：６０−７）は−ＢＭＰ−２より２０００倍高値の濃度−でのみ作用し、この濃度では細胞表面受容体からＢＭＰ−２を完全に置き換えるため、ＢＭＰ−２の競合物質となる。

従来技術のペプチドとは対照的に、本発明の化合物はＢＭＰ−２の活性を増強し、そしてそれを生理学的状況において推定されるＢＭＰ−２の濃度範囲において行うのである。

ＢＭＰの異なる原料はヒト用途について考慮される異なる属性を呈する。ＢＭＰは骨から精製するが、収率はきわめて低く、同種異系のドナー骨からの単離にかかわる潜在的な健康上の危険性もこの原料から得たＢＭＰの臨床用途に限界を与えている。臨床使用におけるＢＭＰの大部分は真核細胞培養物から得た組み換え蛋白である。翻訳後の修飾の複雑性と低収率のためにこれ等の組み換え蛋白は極めて高コストとなる。更にまた、ヒトへの適用において薬効を得るために必要な量は意外にも高値であることがわかった（ＭｃＫａｙ ｅｔ ａｌ．２００２， Ｓｐｉｎｅ ２７（１６ Ｓｕｐｐｌ １）：Ｓ６６−８５，Ｐｏｙｎｔｏｎ ｅｔ ａｌ．２００２， Ｓｐｉｎｅ ２７（１６ ｓｕｐｐｌ １）：Ｓ４０−８）。

ＢＭＰ特異的エンハンサー、例えば本明細書に開示するものは独特の臨床的意味を有している。ＢＭＰ−２エンハンサーを使用することにより必要なＢＭＰ−２の量を低減してよい。これは、合成ペプチドとして本発明の化合物が（ａ）製造経費がより低値であり、（ｂ）概ね化学的安定性がより高値であり、そして、（ｃ）増強された薬剤送達のために容易に化学修飾できるという理由から、医学上及び実際上の意義を有する。生物学的には、他の利点も存在する。例えば、脊椎固定の過程には骨原性関連の遺伝子発現の時間的および空間的なパターンを伴った事象の序列が含まれる。Ｍｏｒｏｎｅ等（Ｍｏｒｏｎｅ ｅｔ ａｌ．１９９８，Ｃｌｉｎ Ｏｒｔｈｏｐ（３５１）：２５２−６５）は脊椎固定における数種のＢＭＰのｍＲＮＡの発現を検討しており、そしてＢＭＰ−２及び他のものが種々の水準で種々の時点において増大したことを観察している。生物学的に旨適なスケジュールに外因性適用の組み換えＢＭＰ−２をマッチさせることは躊躇されることである。同様にＢＭＰはホモ及びヘテロ２量体として存在しえる。即ちＢＭＰエンハンサーはそれらがインサイチュで存在する場合にＢＭＰの天然の内因性の発現を増強することにより有効となる。

即ち本発明の化合物は医療機器上又はその関連の組み換えＢＭＰ−２の有効量を低減するため、脱鉱物質骨マトリックス（ＤＭＢ）のような生物学的調製物の生物活性を最大化するため、及び、骨治癒過程における宿主組織により形成されるＢＭＰ−２の内因性濃度を増強するために使用することができる。

ＤＢＭは骨誘導性であり、臨床慣行において広範に使用されている１つの代替物質である。ＤＢＭは溶媒及び酸処理によりヒト骨から加工され、そしてその最終形態においてはコラーゲン及び低濃度の成長因子を含有する。ＤＢＭは多くの製造元、例えばＷｒｉｇｈｔ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｏｓｔｅｏｔｅｃｈ、ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｒｅｄ ＣｒｏｓｓおよびＩｎｎｏｖａより入手可能である。ＤＢＭはコラーゲン成分を介して新骨形成の土台となるスカホールドを与え、そしてその低濃度の成長因子を介してある程度の骨誘導能も有している。また骨芽に分化する周囲領域からの間葉幹細胞の活性化もある程度誘発する。

しかしながらＤＢＭの骨誘導能は低く、ロット毎及び製造元毎に変動する。ＤＢＭ中の成長因子は骨先駆細胞に対して最も顕著な作用を有していると期待されるため、骨先駆細胞の利用性は脱鉱物質骨マトリックスを使用する場合には重要となる。頑健な骨誘導を誘発するＤＢＭの制限された能力はこの物質の使用において限定的な要因として広範に観察されている。

カルシウムリッチの骨グラフト物質のうち、ヒト原料から誘導されたものではない多数の市販品の骨充填剤が存在し、例えばＰｒｏ Ｏｓｔｅｏｎ（コラリンヒドロキシアパタイト、Ｉｎｔｅｒｐｏｒｅ Ｃｒｏｓｓ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）、Ｂｉｏｇｌａｓｓ（生物活性ガラスインプラント、ＵＳ Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ Ｃｏｒｐ．）、Ｃｏｌｌａｇｒａｆｔ（ヒドロキシアパタイト／リン酸３カルシウム及び純粋なウシ線維性コラーゲン、Ｚｉｍｍｅｒ）、Ｃｅｌｌｐｌｅｘ^TM（リン酸３カルシウム、合成海綿質骨、Ｗｒｉｇｈｔ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．）及び多くのリン酸カルシウム及びリン酸カルシウム充填剤が挙げられる。これらの物質は全て、骨伝道性であり、インプラント又はグラフト内への宿主からの毛細管、血管周囲組織及び骨先駆細胞の内生を支援する。しかしながらこれ等は骨誘導性ではない。

生物学において、多くの企業が自家骨髄細胞又は血小板濃縮物として使用することを意図した骨充填製品を開発している。これ等の製品はそれぞれ、グラフト中の幹細胞の数を増大させること、又は、成長因子の量を増大させることを意図している。

関連する手法において、ＩｎＦｕｓｅ脊髄ケージ製品（Ｓｏｆａｍｏｒ−Ｄａｎｅｋ、Ｍｅｄｔｒｏｎｉｃの１部門）は骨伝導物質（コラーゲン）を骨誘導剤と組み合わせる装置の例である。ＩｎＦｕｓｅは脊髄固定処置と関連して使用することを意図しており、同様の製品が新規骨折修復のために開発中である。

脛骨非偽関節において使用する場合のＩｎＦｕｓｅ、及び、程度は低値であるがＳｔｒｙｋｅｒ ＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎのＯＰ−１が良好に使用されることは、組み換え成長因子の手法において高水準の利益をもたらしている。多くの別の成長因子が整形外科及び整形生物学の分野において評価されている。種々のＢＭＰのうち、ＢＭＰ−２は最も高い程度の骨誘導を示す因子であると考えられる。

即ち骨グラフト物質の増大する臨床要求性及び成長因子の代替品又は既存の骨グラフト物質の改良への高い関心が存在している。
定義
本明細書においては、以下の用語は記載の通りの意味を有する。

「アルケン」という用語は炭素−炭素二重結合１つ以上を含有する不飽和の炭化水素である。このようなアルケンの例はエチレン、プロペン等を包含する。

「アルケニル」という用語は二重結合少なくとも１個を含有する炭素原子２〜６個の直鎖１価炭化水素基又は炭素原子３〜６個の分枝鎖１価炭化水素基を包含し；その例はエテニル、２−プロペニル等を包含する。

本明細書で特定する「アルキル」基は、直鎖又は分枝鎖の配置のいずれかにある指定の長さのアルキル基を包含する。このようなアルキル基の例はメチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、ｓ−ブチル、ｔ−ブチル、ペンチル、イソペンチル、ヘキシル、イソヘキシル等を包含する。

「アリール」という用語は６〜１２環原子の１価又は２価の芳香族炭化水素基であり、場合によりアルキル、ハロアルキル、シクロアルキル、アルコキシ、アルキルチオ、ハロ、ニトロ、アシル、シアノ、アミノ、モノ置換アミノ、ジ置換アミノ、ヒドロキシ、カルボキシ又はアルコキシカルボニルよりなる群から選択される置換基１つ以上で独立して置換されているものを包含する。アリール基の例はフェニル、ビフェニル、ナフチル、１−ナフチル及び２−ナフチル、これ等の誘導体等を包含する。

「アラルキル」という用語は基Ｒ^aＲ^bを包含し、式中、Ｒ^aはアルキレン（２価のアルキル）基でありＲ^bは上記定義したアリール基である。アラルキル基の例はベンジル、フェニルエチル、３−（３−クロロフェニル）−２−メチルペンチル等を包含する。「脂肪族」という用語は炭化水素鎖、例えばアルカン、アルケン、アルキン及びこれ等の誘導体を包含する。

「アシル」という用語は基ＲＣＯ−を包含し、ここでＲは有機基である。例はアセチル基ＣＨ₃ＣＯ−である。

ペプチド又は脂肪族の部分は、上記定義したアルキル又は置換アルキル基がカルボニル｛＝（Ｃ＝Ｏ）−｝基１つ以上を介して結合している場合に、「アシル化」されている。ペプチドは最も通常にはＮ末端においてアシル化される。

「アミド」とはカルボニル基（−ＣＯＮＨ₂）に結合した３価の窒素を有する化合物である。

「アミン」とはアミノ基（−ＮＨ₂）を含有する化合物を包含する。

「ジアミンアミノ酸」とは反応性のアミン基２個及び反応性のカルボキシル基を含有するアミノ酸又は残基である。代表例に２，３ジアミノプロピオニルアミノ酸、２，４ジアミノブチリックアミノ酸、リジン又はオルニチンを含む。

「３官能性アミノ酸」とは１つ目はＮ末端アミン、２つ目はＣ末端カルボキシ、そして３つ目は側鎖の全て又は部分を含む反応性基３個を有するアミノ酸または残基である。即ち３官能性アミノ酸は例えばジアミンアミノ酸；側鎖に反応性スルフィドリル基を有するアミノ酸、例えばメルカプトアミノ酸、例えばシステイン、ペニシラミン又は３−メルカプトフェニルアラニン；側鎖に反応性カルボキシル基を有するアミノ酸、例えばアスパラギン酸およびグルタミン酸；及び側鎖に反応性グアナジウム基を有するアミノ酸、例えばアルギニンを包含する。

（本発明の化合物）
本発明の１つの実施形態によれば、化合物は、下記式Ｉ：

（式Ｉ）
[式中、
Ｘは（ｉ）最低３アミノ酸残基を有し、（ｉｉ）最高約５０アミノ酸残基を有し、そして（ｉｉｉ）骨形成蛋白−２受容体に特異的に結合するペプチド鎖であり；
Ｒ₁は独立して水素であり、これにより、末端基はＮＨ₂、Ｎ末端ＮＨ₂、ＮＨ₃ ⁺又はＮＨ基を含む直鎖又は分枝鎖のＣ₁〜Ｃ₁₇アルキル、アリール、ヘテロアリール、アルケン、アルケニル又はアラルキル鎖を有するアシル基又は相当するアシル化誘導体であるか、又は、Ｎ末端ＮＨ₂、ＮＨ₃ ⁺又はＮＨ基を有するアミノ酸、ジペプチド又はトリペプチドであり；
Ｒ₂は独立して３官能性のアミノ酸残基であり、ここでＸはＲ₂の側鎖を介して共有結合しており；
Ｒ₃は独立してＲ₂に共有結合した０〜約１５骨格原子の鎖を含むリンカーであり；
Ｒ₄はＯＨであり、これにより、末端基はカルボキシル、ＮＨ₂、Ｎ末端ＮＨ₂、ＮＨ₃ ⁺又はＮＨ基を含む直鎖又は分枝鎖のＣ₁〜Ｃ₁₇アルキル、アリール、ヘテロアリール、アルケン、アルケニル又はアラルキル鎖を有するアシル基又は相当するアシル化誘導体、又はＮＨ−Ｒ₁であり；
ＹはＲ₂およびＺに共有結合した０〜約５０骨格原子の鎖を含むリンカーであり；そして、
Ｚは（ｉ）最低１ヘパリン結合モチーフ、（ｉｉ）最高約１０ヘパリン結合モチーフ、及び（ｉｉｉ）最高約３０アミノ酸を含むアミノ酸配列を含むヘパリン結合ドメインを包含する非シグナリングペプチド鎖であるのものである。

本発明の別の実施形態によれば、化合物は下記式ＩＩ：

（式ＩＩ）
[式中、
Ｘは（ｉ）最低３アミノ酸残基を有し、（ｉｉ）最高約５０アミノ酸残基を有し、そして（ｉｉｉ）骨形成蛋白−２受容体に特異的に結合するペプチド鎖であり；
Ｒ₁は独立して水素であり、これにより、末端基はＮＨ₂、Ｎ末端ＮＨ₂、ＮＨ₃ ⁺又はＮＨ基を含む直鎖又は分枝鎖のＣ₁〜Ｃ₁₇アルキル、アリール、ヘテロアリール、アルケン、アルケニル又はアラルキル鎖を有するアシル基又は相当するアシル化誘導体であるか、又は、Ｎ末端ＮＨ₂、ＮＨ₃ ⁺又はＮＨ基を有するアミノ酸、ジペプチド又はトリペプチドであり；
Ｒ₆は独立してＲ₅に共有結合した０〜約１５骨格原子の鎖を含むリンカーであり；
Ｒ₅は３官能性のアミノ酸残基であり、ここで第１のＸはＲ₅の側鎖を介して共有結合しており、そして第２のＸはＮ末端アミンを介して共有結合しており；
Ｒ₄はＯＨであり、これにより、末端基はカルボキシル、ＮＨ₂、Ｎ末端ＮＨ₂、ＮＨ₃ ⁺又はＮＨ基を含む直鎖又は分枝鎖のＣ₁〜Ｃ₁₇アルキル、アリール、ヘテロアリール、アルケン、アルケニル又はアラルキル鎖を有するアシル基又は相当するアシル化誘導体、又はＮＨ−Ｒ₁であり；
ＹはＲ₂およびＺに共有結合した０〜約５０原子の鎖を含むリンカーであり；そして、
Ｚは（ｉ）最低１ヘパリン結合モチーフ、（ｉｉ）最高約１０ヘパリン結合モチーフ、及び（ｉｉｉ）最高約３０アミノ酸を含むアミノ酸配列を含むヘパリン結合ドメインを包含する非シグナリングペプチド鎖である]のものである。

式Ｉ及び式ＩＩの各々において、共有結合は例えばペプチド結合又は他のアミド結合、チオエーテル結合又はエステル結合であることができる。基はそれが直接又は共有結合を含む他の基又は原子１つ以上を介して共有結合している場合に、他の基に共有結合している。

式ＩのＹ領域の原子の鎖はＲ₂に対し、そして配列Ｚに対して共有結合し、そして式ＩＩにおいては、Ｙ領域はＲ₅に対し、そして配列Ｚに対して共有結合している。共有結合は例えばペプチド、アミド、チオエーテル又はエステル結合であることができる。特に好ましいものはペプチド結合である。好ましくは、Ｙ領域は最低約７骨格原子の鎖を包含する。より好ましくは、Ｙ領域は最低約１２骨格原子の鎖を包含する。最も好ましくは、Ｙ領域は最低約１５骨格原子を包含する。例えば、Ｙ領域は少なくとも４、少なくとも５又は少なくとも６アミノ酸の鎖から形成してよい。或いは、Ｙ領域は少なくとも１、少なくとも２又は少なくとも３アミノカルボン酸、例えばアミノヘキサン酸残基の鎖から形成してよい。特に好ましいものはＹが直鎖アミノカルボン酸１つ以上である実施形態、例えば、Ｙが[ＮＨ₂−（ＣＨ₂）_pＣＯ]_qであり、ｐが１〜約１０であり、そしてｑが１〜約２０であるものである。使用してよい直鎖アミノカルボン酸の例は６−アミノヘキサン酸、７−アミノヘプタン酸、９−アミノノナン酸等を包含する。

好ましくは、Ｙ領域は最大約５０原子の鎖を包含する。より好ましくは、Ｙ領域は最大約４５原子の鎖を包含する。最も好ましくは、Ｙ領域は最大約３５原子の鎖を包含する。例えば、Ｙ領域は約２０まで、約１５まで、又は約１７までのアミノ酸の鎖から形成してよい。

Ｙ領域のアミノ酸配列は好ましくは人工の配列であり、即ち、ＢＭＰ受容体の天然のリガンド中に存在するアミノ酸残基４個以上の如何なるアミノ酸配例も包含しない。

特定の実施形態において、Ｙ領域は疎水性アミノ酸残基、又は疎水性アミノ酸残基の鎖を包含する。Ｙ領域は、例えばアミノカルボン酸残基１つ以上、例えばアミノヘキサン酸残基１、２、３つ以上を包含する。別の実施形態において、Ｙ領域はアミノ酸疎水性残基の組み合わせを包含できる。

別の特定の実施形態においては、分子のＹ領域は１〜約２０炭素原子の分枝鎖又は未分枝鎖、飽和又は不飽和のアルキル鎖を包含する。別の実施形態においては、Ｙ領域は親水性残基、例えばエチレングリコール残基の鎖を包含することができる。例えば、Ｙ領域は少なくとも約３、又は少なくとも約４、又は少なくとも約５個のエチレングリコール残基を包含することができる。

式Ｉ及び式ＩＩの分子のＺ領域はヘパリン結合領域であり、Ｖｅｒｒｅｃｃｈｉｏ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７５：７７０１（２０００）に記載の通りヘパリン結合モチーフ、ＢＢｘＢ又はＢＢＢｘｘＢの１つ以上を包含できる。或いは、Ｚ領域はＢＢｘＢ及びＢＢＢｘｘＢモチーフの両方を包含することができる（ここでＢはリジン、アルギニン又はヒスチジン、であり、そしてｘは天然に存在する、又は天然に存在しないアミノ酸である）。例えばヘパリン結合モチーフは、各々独立してリジン又はアルギニンから選択される最初の３アミノ酸と後続するリジン又はアルギニンである何れかの２アミノ酸及び第６のアミノ酸を示す配列[ＫＲ] [ＫＲ] [ＫＲ]ｘ（２）[ＫＲ]（配列番号１）で表してよい。

ヘパリン結合モチーフの数は可変である。例えば、Ｚ領域は少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３又は少なくとも５個までのヘパリン結合モチーフを包含してよい。１個より多いヘパリン結合モチーフが存在する場合、モチーフは同じかまたは異なっていてよい。或いは、Ｚ領域は最大約１０個までのヘパリン結合モチーフを包含する。別の実施形態においては、Ｚ領域は少なくとも４、少なくとも６又は少なくとも８個のアミノ酸残基を包含する。更にまた、特定の実施形態においては、Ｚ領域は約２０個まで、約２５個まで、又は約３０個までのアミノ酸残基を包含する。部分的にはヘパリンに対するＺ領域の結合親和性は選択された特定のヘパリン結合モチーフ及びＺにおけるそのようなモチーフの数により決定される。即ち、特定の用途においては、このようなモチーフの選択と数はＺ領域の旨適ヘパリン結合を与えるように変化してよい。

好ましい実施形態においては、Ｚ領域のアミノ酸配列はＲＫＲＫＬＥＲＩＡＲ（配列番号２）である。別の実施形態においては、Ｚ領域のアミノ酸配列はＲＫＲＫＬＧＲＩＡＲ（配列番号３）である。更に別の実施形態においては、Ｚ領域のアミノ酸配列はＲＫＲＫＬＷＲＡＲＡ（配列番号４）である。更に別の実施形態においては、Ｚ領域のアミノ酸配列はＲＫＲＬＤＲＩＡＲ（配列番号５）であり、Ｊｕｎ／ＡＰ−１ＤＮＡ結合ドメインの残基２７０〜２７９の配列の修飾から誘導されるヘパリン結合モチーフを与える（Ｂｕｓｃｈ ｅｔ ａｌ，Ｔｒａｎｓ−Ｒｅｐｒｅｓｓｏｒ Ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ Ｎｕｃｌｅａｒ Ｇｌｙｃｏｓａｍｉｎｏｇｌｙｃａｎｓ ｏｎ Ｆｏｓ ａｎｄ Ｊｕｎ／ＡＰ−１ Ｏｎｃｏｐｒｏｔｅｉｎ−ｍｅｄｉａｔｅｄ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ．Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１１６：３１−４２，１９９２）。更に別の実施形態においては、Ｚ領域のアミノ酸配列はＲＫＲＫＬＥＲＩＡＲＣ（配列番号６）である。末端システイン残基の存在は場合により他の分子、例えば検出用試薬、例えば蛍光団、放射性同位体及び他の検出可能なマーカーのＺ領域への連結の機会、並びに、毒素、免疫原等の連結の機会を与える。

本発明の合成骨形成蛋白蛋白類縁体、例えば式Ｉ及びＩＩのものは、Ｘ領域が以下のアミノ酸配列：
の何れかの全体又は部分又は全体又は部分の相同体である実施形態を包含する。

好ましい実施形態においては、Ｘ領域はアミノ酸配列ＩＳＭＬＹＬＤＥＮＥＫＶＶＬＫＮＹ（配列番号８）である。より好ましくは、Ｘ領域はアミノ酸配列ＬＹＦＤＥＳＳＮＶＩＬＫＫ（配列番号９）である。さらにより好ましくはＸ領域はアミノ酸配列ＡＩＳＭＬＹＬＤＥＮＥＫＶＶＬ（配列番号７）である。

本発明者等は意外にも、そして好都合にも、式Ｉ及びＩＩのものを含む本発明の化合物においてＸ領域は逆方向に合成してよいことを発見しており、その場合、従来のＮ→Ｃの方向に示してある配列ＡＩＳＭＬＹＬＤＥＮＥＫＶＶＬ（配列番号７）を想定した場合、そして式Ｉを用いた場合、Ｒ₂側鎖に結合した第１のアミノ酸はＮ末端アミノ酸残基であり、Ｎ末端アミノ酸残基に結合した第２のアミノ酸は２位の残基・・・等々となり、しかしなお、化合物は生物活性を温存しており、ＢＭＰ受容体に特異的に結合するのである。このようなコンストラクトは、従来のＮ→Ｃの方向に基づけば、逆の配列を有すると見なしてよく、即ち、Ｒ₂がジアミンアミノ酸であるイプシロンアミンとのペプチド結合を形成するものは、従来のＮ末端アミノ酸残基のカルボキシル基である。即ち、ここでもまた、従来のＮ→Ｃの方向を用いれば、上記配列を逆方向に使用してよく、得られる本発明の化合物は生物活性であり、本明細書に記載する通り使用してよい。好ましい実施形態によればＸ領域は本明細書の実施例２に開示する通り配列ＬＶＶＫＥＮＥＤＬＹＬＭＳＩＡ（配列番号１５）（やはり従来のＮ→Ｃの方向の配列を想定する）である。実施例２に記載する通り、Ｃ末端アラニン（Ａ）は式ＩのＲ₂位においてリジン（Ｋ）のイプシロンアミンに結合し、イソロイシン（Ｉ）はアラニンにペプチド結合する・・・等々となる。即ち以下の配列：

が提供され、本明細書に記載する通り生物活性である。

ＬＶＶＫＥＮＥＤＬＹＬＭＳＩＡ（配列番号１５）に加えて全体又は部分的に使用してよい他の逆配列及びその相同体は、例えば、ＹＮＫＬＶＶＫＥＮＥＤＬＹＬＭＳＩ（配列番号１６）、ＫＫＬＩＶＮＳＳＥＤＦＹＬ（配列番号１７）、ＷＤＮＷＧＶＤＳＦＤＶＹＬ（配列番号１８）、ＧＥＶＶＭＤＱＹＮＫＬＶＶＫＥ（配列番号１９）、ＬＨＤＡＬＰＦＰＣＥＧＨＣＹＦＡ（配列番号２０）、ＶＳＮＶＬＴＱＶＩＡＨＮＴＳＮＬＨＤＡＬＰＦＰ（配列番号２１）およびＬＶＶＫＥＮＥＤＬＹＬＭＳＩＡＣ（配列番号２２）を包含するが、これに限定されるものではない。

或いは、別の特定の特徴において、本発明は、表１に示す配列を有する合成ＢＭＰ、ＴＧＦ又はＧＤＦ（成長分化因子）ペプチド類縁体を提供し、ここで形質転換成長因子ファミリーメンバーペプチドは内因性又は人工のＢＭＰペプチド又はＴＧＦペプチドの活性を増強する場合に特に有用であり、ここでは式Ｉ又はＩＩの何れかのコンストラクトのＸ領域の全体又は部分を形成する配列を示す（見出し「好ましいＸ受容体結合ドメイン」の下）。見出し「好ましいＸ受容体結合ドメイン」の下に列挙された何れの配列のあるもの、又は僅か一部を用いてよく、そして、使用するＸ領域は以下に列挙する何れかの配列の部分集合であってよい。更に、Ｘ配列は以下に列挙する配列の全体又は部分に同一である必要はなく、そして全体又は部分に相同であってよく、例えば８０％〜９５％相同の配列であってよい。

（配列番号２３）

「相同である」という用語は本明細書においては、配列を並置した場合にアミノ酸位置の１つ以上においてアミノ酸配列が異なるペプチドを指す。例えば、２つの相同のペプチドのアミノ酸配列は５〜１０アミノ酸の並置されたアミノ酸配列内において僅か１アミノ酸残基のみ異なることができる。或いは、１０〜１５アミノ酸の相同ペプチド２つは並置した場合に２個以下のアミノ酸残基が異なっていることができる。別の例においては、１５〜２０以上のアミノ酸の相同ペプチド２つは並置した場合に３個以下のアミノ酸残基が異なっていることができる。より長いペプチドについては、相同ペプチドは、ペプチド相同体２つのアミノ酸配列を並置した場合にアミノ酸残基の約５％、１０％又は２０％以下が異なることができる。

式Ｉ又はＩＩのＸ領域として特に有用なアミノ酸配列は、僅か１又は２又は極めて少数の位置において天然の成長因子のアミノ酸配列と異なる天然に存在する配列のフラグメントの相同体を包含する。このような配列は好ましくは保存的な変化を包含し、その場合、元のアミノ酸はよく知られた原則に従って同様の特徴のアミノ酸で置き換えられており；例えばアラニンのような非極性アミノ酸のバリン、ロイシン、イソロイシン又はプロリンとの置き換え；又は１つの酸性又は塩基性のアミノ酸の同じ酸性又は塩基性の特徴の別のアミノ酸による置換となっている。

式ＩのＲ₃領域又は式ＩＩのＲ₆領域は原子の鎖又は鎖を形成する原子の組み合わせを含むことができる。典型的には、鎖は主に炭素原子の鎖であり、これは場合により、例えばアミノ酸（例えば上記列挙した蛋白中に存在するアミノ酸；蛋白中には存在しない天然に存在するアミノ酸、例えばオルニチン及びシトルリン；又は非天然のアミノ酸、例えばアミノヘキサン酸；又は上記アミノ酸の何れかの組み合わせ）から形成された原子の鎖の場合のように、酸素又は窒素原子を含んでいてよい。ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリエチレンオキシド（ＰＥＯ）、アミノポリエチレングリコール、ビスアミン−ＰＥＧ、及び当該分野でよく知られているポリエチレングリコールの他の変異体のような薬剤も同様に使用できることも意図している。Ｒ₃又Ｒ₆領域のために特に好ましいものは、鎖を標準的なペプチド合成法において利用してよいような、アミノ末端及びカルボキシル末端を含む鎖である。例示されるものは、何れかのアミノ酸、アミノカルボン酸、好ましくは直鎖アミノカルボン酸、及び二官能性のアミノ−ＰＥＧ−酸スペーサーを包含する。アミノ酸のうちではグリシンが好ましい。

本発明の一部の実施形態においては、式ＩのＲ₃領域の各々又は式ＩＩのＲ₆領域の各々は異なることができるが、大部分の実施形態においては、領域は同一であることが好ましい。しかしながら、そのような領域は異なっていてよく；例えば式ＩＩにおいてＲ₆はジアミンアミノ酸、例えばリジンであってよい。合成の間にオルト保護基を利用することによりアルファアミン又はイプシロンアミンの何れかを保護し、その後アミノ酸残基又は他の基を付加させてＲ₆基を形成し、そして次にオルト保護基を除去し、Ｒ₅上の脱保護アミン及びＲ₆上の末端アミンからのＸ基のパラレル合成と共に進行させることが可能である。同様の方法は式Ｉに関しても使用してよい。

（本発明の化合物の合成方法）
本発明の化合物の合成は当該分野でよく知られている種々の化学的方法の何れかにより達成できる。このような方法はベンチスケールの固相合成及び多くの市販のペプチド合成装置の何れかにおける自動ペプチド合成を包含する。好ましくは、合成装置は９９パーセント超のサイクルあたりのカップリング効率を有する。

本発明の化合物は段階的合成によるか、又は、同様のよく知られた技術によりカップリングできる一連のフラグメントの合成により製造できる。例えばＮｙｆｅｌｅｒ， Ｐｅｐｔｉｄｅ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｖｉａ ｆｒａｇｍｅｎｔ ｃｏｎｄｅｎｓａｔｉｏｎ． Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３５：３０３−１６（１９９４）；およびＭｅｒｒｉｆｉｅｌｄ， Ｃｏｎｃｅｐｔ ａｎｄ ｅａｒｌｙ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ｓｏｌｉｄ−ｐｈａｓｅ ｐｅｐｔｉｄｅ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ． Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ． ２８９：３−１３（１９９７）を参照できる。これ等の方法は個々のペプチドの製造のために日常的に使用されている。コンポーネント部分で本発明の類縁体、例えばそのＸ、ＹおよびＺのコンポーネントを構成するペプチドを組み立て、その後そのようなコンポーネント部分をカップリングして類縁体を組み立てることも可能である。例えばＤａｗｓｏｎ ａｎｄ Ｋｅｎｔ， Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ｎａｔｉｖｅ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｂｙ ｃｈｅｍｉｃａｌ ｌｉｇａｔｉｏｎ． Ａｎｎｕ． Ｒｅｖ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．６９：９２３−９６０（２０００）；およびＥｏｍ ｅｔ ａｌ．，Ｔａｎｄｅｍ ｌｉｇａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｕｌｔｉｐａｒｔｉｔｅ ｐｅｐｔｉｄｅｓ ｗｉｔｈ ｃｅｌｌ−ｐｅｒｍｅａｂｌｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２５：７３−８２（２００３）を参照できる。しかしながら好ましい実施形態においては、本発明の化合物は、樹脂に結合した式Ｉ又はＩＩのＺ領域のＣ末端残基を用いた固相合成および段階的に進行する合成により合成する。従来の保護基を必要に応じて使用し、脱保護は樹脂からのペプチドの脱離の前、最中又は後の何れかに行う。例示すれば、本発明式ＩのＲ₂位又は式ＩＩのＲ₅位の何れかに加えてリジン残基１つ以上を含有する本発明の化合物については、そのような付加的なリジン残基は従来は保護基により保護され、そして合成後に脱保護される。

（本発明の化合物の使用方法）
本発明の化合物は可溶性の予防用又は治療用の医薬品を含む種々の方法で有用である生物活性分子の安価な原料を提供する。

本発明の化合物はまた、生物学的応答を誘発するため、例えば細胞の成育および増殖、又は創傷の治癒を促進するための、例えば縫合糸、インプラント及び医療機器のような医療装置の要素として、及び医療装置のコーティングのための生物活性物質としても有用である。

１つの特徴において、本発明はＢＭＰ−２の類縁体のような本発明の化合物を提供することによる、骨傷害を有する哺乳類を治療するための方法及び組成物を提供する。例えば、本発明のこのような化合物は医薬品として投与してよく、或いは、骨マトリックス又は骨グラフト物質への添加物として使用してよい。

「医療装置」という用語は本明細書においては、生物、好ましくは哺乳類、特にヒトの臓器、組織、血液又は他の体液に接触する表面１つ以上を有する装置を意味する。医療装置は例えば患者に返送される血液に接触する血液オキシゲネーター、血液ポンプ、血液センサー、輸血用配管等のような外科的処置において使用するための体外装置を包含する。用語はまた、血管又は心臓内に移植される血管グラフト、ステント、ペースメーカー配線、心臓弁、静脈瘤コイル等のようなヒト又は動物の身体内部で血液と接触して移植される内在補綴物も包含する。用語は更に、モニタリング又は修復を目的とした血管又は心臓内に静置されるカテーテル、ガイドワイア等のような一時的血管内使用のための装置も包含する。用語は更に神経電極、筋肉電極、移植用パルスジェネレーター、移植用薬剤ポンプ及び除細動器も包含する。更にまた、医療装置という用語は、縫合糸、グラフト材料、創傷被服物、神経ガイド、骨ワックス、塞栓粒子、マイクロビーズ、歯科用インプラント、骨補綴物、骨グラフト物質、脊髄固定ケージ、骨充填物、整形外科用装置、組織スカホールド、人工関節又は制御放出薬剤送達装置を包含する。

医療装置の表面は医療装置において使用するのに適する一般的に使用されている材料の何れか、例えばステンレス、チタン、白金、タングステン、セラミックス、ポリウレタン、ポリテトラフルオロエチレン、延伸ポリテトラフルオロエチレン、ポリカーボネート、ポリエステル、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリスチレン、ポリ塩化ビニル、ポリアミド、ポリアクリレート、ポリウレタン、ポリビニルアルコール、ポリカプロラクトン、ポリラクチド、ポリグリコリド、ポリシロキサン（例えば２，４，６，８−テトラメチルシクロテトラシロキサン）、天然ゴム又は合成ゴム、またはこれ等のブロック重合体又は共重合体から形成することができる。

医療装置の表面に生物学的分子をコーティングするための方法は既知である。例えばＨｅｎｄｒｉｋｓ等への米国特許５，８６６，１１３を参照でき、その明細書は参照により本明細書に組み込まれる。Ｔｓａｎｇ等は米国特許５，９５５，５８８において、非血栓形成性コーティング組成物及び医療装置上のその使用方法を記載しており、参照により本明細書に組み込まれる。Ｚａｍｏｒａ等は米国特許６，３４２，５９１において細胞接着組成物をモジュレートするための医療装置のための両親媒性のコーティングを記載しており、参照により本明細書に組み込まれる。

本発明の化合物は医療用途及び動物飼育又は家畜用途の両方のための医薬組成物中の活性成分として使用することができる。典型的には、本発明の化合物又は医薬組成物はヒトにおいて使用するが、他の哺乳類においても使用してよい。「患者」という用語は哺乳類個体を指すことを意図しており、明細書及び請求項全体を通じてそのように使用する。本発明の基本的な適用はヒト患者が関わるものであるが、本発明は実験用、農業用、動物園、野生、ペット、競技用、又は、他の動物にも適用してよい。

本発明の化合物は何れかの製薬上許容しうる塩の形態であってよい。「製薬上許容しうる塩」という用語は製薬上許容しうる非毒性の塩基又は酸、例えば無機又は有機の塩基及び無機又は有機の酸から製造した塩を指す。無機塩基から誘導した塩は、アルミニウム、アンモニウム、カルシウム、銅、第二鉄、第一鉄、リチウム、マグネシウム、第二マンガンの塩、マンガン、カリウム、ナトリウム、亜鉛等のものを包含する。特に好ましいものはアンモニウム、カルシウム、リチウム、マグネシウム、カリウム及びナトリウム塩である。製薬上許容しうる有機非毒性塩基から誘導した塩は、第１、第２及び第３アミンの塩、置換アミン、例えば天然に存在する置換アミン、環状アミン、及び塩基性のイオン交換樹脂、例えばアルギニン、ベタイン、カフェイン、コリン、Ｎ，Ｎ’−ジベンジルエチレンジアミン、ジエチルアミン、２−ジエチルアミノエタノール、２−ジメチルアミノエタノール、エタノールアミン、エチレンジアミン、Ｎ−エチル−モルホリン、Ｎ−エチルピペリジン、グルカミン、グルコサミン、ヒスチジン、ヒドラバミン、イソプロピルアミン、リジン、メチルグルカミン、モルホリン、ピペラジン、ピペリジン、ポリアミン樹脂、プロカイン、プリン、テオブロミン、トリエチルアミン、トリメチルアミン、トリプロピルアミン、トロメタミン等の塩を包含する。

本発明の化合物が塩基性である場合は、製薬上許容しうる非毒性の酸、例えば無機又は有機の酸から酸付加塩を製造してよい。このような酸には、酢酸、ベンゼンスルホン酸、安息香酸、カンファースルホン酸、カルボン酸、クエン酸、エタンスルホン酸、蟻酸、フマル酸、グルコン酸、グルタミン酸、臭化水素酸、塩酸、イセチオン酸、乳酸、マレイン酸、リンゴ酸、マンデル酸、メタンスルホン酸、マロン酸、ムチン酸、硝酸、パモ酸、パントテン酸、リン酸、プロピオン酸、コハク酸、硫酸、酒石酸、ｐ−トルエンスルホン酸、トリフルオロ酢酸等が包含される。本発明の化合物の酸付加塩は化合物に適する溶媒、及び、過剰量の酸、例えば塩酸、臭化水素酸、硫酸、リン酸、酢酸、トリフルオロ酢酸、クエン酸、酒石酸、マレイン酸、コハク酸又はメタンスルホン酸において製造する。酢酸塩の形態が特に有用である。本発明の化合物が酸性の部分を含む場合は、適当な製薬上許容しうる塩はアルカリ金属の塩、例えばナトリウム又はカリウムの塩、又はアルカリ土類金属の塩、例えばカルシウム又はマグネシウムの塩を包含してよい。

本発明は本発明の化合物及び製薬上許容しうる担体を含む医薬組成物を提供する。担体は液体製剤であってよく、１つの実施形態においては、緩衝液とした等張性の水溶液である。製薬上許容しうる担体はまた、後述する通り、賦形剤、例えば希釈剤、担体等、及び添加剤、例えば安定化剤、保存料、可溶化剤、緩衝物質等含有する。

即ち本発明の化合物は少なくとも１種の本発明の化合物を１つ以上の製薬上許容しうる担体、例えば賦形剤、例えば希釈剤、担体等及び添加剤、例えば安定化剤、保存料、可溶化剤、緩衝物質等と共に所望に応じて含有する医薬組成物に製剤又は複合化してよい。製剤賦形剤はポリビニルピロリドン、ゼラチン、ヒドロキシセルロース、アカシア、ＰＥＧ、ＰＥＯ、マンニトール、塩化ナトリウム又はクエン酸ナトリウム、並びに多くの単糖類、例えばスクロース、デキストロース、ラクトース等及び上記したものの組み合わせを包含する。注射又は他の液体投与製剤については、緩衝成分少なくとも１つ以上を含有する水が好ましく、安定化剤、保存料及び可溶化剤をも使用してよい。固体剤型については、種々の増粘剤、充填剤、増量剤及び担体の添加剤の何れか、例えば澱粉、糖類、脂肪酸等を使用してよい。局所投与製剤については、種々のクリーム、軟膏、ゲル、ローション等の何れかを使用してよい。大部分の医薬品製剤については、非活性の成分が製剤の重量又は容量においてより大きい部分を構成する。医薬品製剤については、種々の計量放出、遅延放出又は時間指定放出の製剤及び添加剤の何れかを使用することにより、長時間に渡り本発明の化合物の送達が行われるように投薬量を調整してよい。

実際の使用においては、本発明の化合物は従来の医薬組成物製造技術に従って製薬用担体との混合物中に活性成分として組み合わせることができる。担体は投与のために望まれる製剤の形態に応じて広範な種類の剤型を取ってよく、例えば経口、非経腸（静脈内を含む）、尿道内、膣内、鼻腔内、口腔内、舌下等であってよい。経口用剤型のための組成物の製造においては、通常の医薬品用媒体の何れか、例えば懸濁液、エリキシル及び溶液のような経口用液体製剤の場合は例えば水、グリコール、油脂、アルコール、フレーバー剤、保存料、着色剤等；又は例えば粉末、ハード及びソフトカプセル又は錠剤のような経口用固体製剤の場合はでんぷん、糖類、微結晶セルロース、希釈剤、顆粒化剤、潤滑剤、結合剤、錠剤崩壊剤等を使用してよい。

注射による使用に適する剤型は滅菌水溶液又は分散液、及び滅菌注射溶液又は分散液の要時調製のための滅菌粉末を包含する。全ての場合において、剤型は滅菌されており、市臨時で投与してよい程度の流動性を有さなければならない。剤型はまた、製造及び保存の条件下で安定であり、細菌及びカビのような微生物の汚染作用に対抗して保存されなければならない。担体は例えば水、エタノール、ポリオール、例えばグリセロール、プロピレングリコール又は液体ポリエチレングリコール、これ等の適当な混合物、及び植物油を含有する溶媒又は分散媒体であることができる。

本発明を以下の非限定的な実施例により更に説明する。

材料：Ｃ１Ｃ１２細胞及びＣ３Ｈ１０Ｔ¹／₂細胞はＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）から購入した。Ｅ．ｃｏｌｉ又はチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞誘導組み換えヒトＢＭＰ−２はＲ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）から購入した。組み換えｋＢＲ１−Ｆｃキメラ蛋白としての可溶性ＢＭＰ−２受容体もＲ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓから購入した。エンドスタチン−Ｆｃ、ＦＧＦ−２及びＶＲＧＦはＢｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ Ｂｒａｎｃｈ ｏｆ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ Ｐｒｏｇｒａｍ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｒｅを通じて入手した。ＴＧＦ−ベータ１はＳｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙより購入した。ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、抗ホスホリル化ＭＡＰキナーゼ抗体及び抗ヒトＦｃ抗体セイヨウワサビパーオキシダーゼコンジュゲートはＳｉｇｍａ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）より入手した。ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、ウシ血清（ＣＢＳ）、ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地及びペニシリン／ストレプトマイシンはＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）から購入した。シリルヘパリンはベンジル−テトラ（ジメチルシリルメチル）オキシカルバモイルヘパリンであり、文献記載の通り合成した（Ｚａｍｏｒａ ｅｔ ａｌ．，２００２，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ Ｃｈｅｍ １３（５）：９２０−６）。慨すればシリルヘパリンは疎水性の基ベンジル−テトラ（ジメチルシリルメチル）−オキシカルバモイルスクシンイミドをヘパリンと反応させることにより疎水性表面に吸着できる両親媒性のヘパリン誘導体を形成することにより製造する。コーティング目的のためには、シリルヘパリンを７０％酸性化水性エタノール中の１％溶液として使用した。

アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）活性試験：Ｃ２Ｃ１２細胞及びＣ３Ｈ１０Ｔ¹／₂細胞は１０％血清、ペニシリン／ストレプトマイシンを添加したＤＭＥＭ／Ｆ１２培地で５％ＣＯ₂及び９５％空気の湿潤雰囲気下３７℃において培養した。ＢＭＰ−２誘導ＡＬＰ活性については、細胞を通常の生育培地中、９６穴（１ｘ１０⁴／ウェル）ディッシュ中にプレーティングした。２４時間後、細胞が融合性の単層を形成した時点で、培地を２％血清を添加し、指定濃度のＢＭＰ−２及び／又はＢ２Ａ２を含有したＤＭＥＭ／Ｆ１２と交換した。誘導の４〜５日後、ＡＬＰ活性をＡｋｉｙａｍａ等の記載（Ａｋｉｙａｍａ ｅｔ ａｌ．１９９７，Ｅｘｐ Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ ２３５（２）：３６２−９）に変更を加えた方法により測定した。慨すれば、細胞をリン酸塩緩衝食塩水（ＰＢＳ）で１回洗浄し、１０ｍＭＴｒｉｓＨＣｌ、ｐＨ９．０中の０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ１００で溶解した。蛋白濃度はＢＣＡ蛋白試験キット（Ｐｉｅｒｃｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）を用いて測定した。次にＡＬＰ緩衝液（１Ｍジエタノールアミン、０．５ｍＭＭｇＣｌ₂、１ｍｇ／ｍＬｐ−ニトロフェニルホスフェート、ｐＨ９．０）を添加し、３７℃でインキュベートし、吸光度（４０５ｎｍ）をマイクロプレート分光光度計（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ）を用いて１５、３０及び６０分に読み取ることにより、ＡＬＰ活性を測定した。活性は時間当たりミリグラム蛋白当たりのＯＤとして表示した。

ペプチド合成及び製造：ペプチドＢ２Ａ２及びＢ２Ａ２−Ｋ−ＮＳは実施例２および９に記載する通り従来の固相合成により合成し、Ｃ−１８上の逆相ＨＰＬＣで精製した。

ＨＰＬＣ精製ペプチドの留分をあわせ、凍結乾燥し、凍結保存した。凍結乾燥した塊状の物質の小分量を用いて市販のキット（ＢＣＡ、Ｐｉｅｒｃｅ Ｅｎｄｏｇｅｎ，Ｉｎｃ。）によりペプチド含有量を測定した。大部分の別の目的のためには、ペプチドを終濃度０．５ｍｇ／ｍｌ又は１ｍｇ／ｍｌとなるように０．０５％Ｐｌｕｒｏｎｉｃ１２７を含有する５．５％グルコース中に溶解し、０．２２ミクロンのフィルターで滅菌濾過し、そして５０又は１００μｇを含有する小分量ごとに凍結乾燥した。

受容体結合試験：固相結合試験におけるＢＭＰ受容体への結合。Ｂ２Ａ２をＥＬＩＳＡプレートに飽和するまで吸着させ、可溶性ＢＭＰ受容体免疫グロブリンＦｃ融合蛋白を添加し、そして結合した受容体をＨＲＰコンジュゲート抗Ｆｃ抗体を用いて比色試験により検出し、数値はバックグラウンドを差し引いて表示した。ＢＭＰＲ及びＡｃｔｉｖｉｎ受容体ファミリーの種々の受容体アイソフォームへのＢ２Ａ２の特異的結合は、記載した受容体Ｆｃキメラを用いて試験した。特異性を明確化する陰性対照はプレートに吸着された無関連のポリペプチド（例えばインスリン）及び無関連のキメラ蛋白（エンドスタチン−Ｆｃ）のインキュベートを包含し、その何れもＢ２Ａ２の結合をもたらさなかった。見かけ上２段階のＢＭＰＲ−Ｉｂへの結合が受容体置換実験により明らかになった。結合した受容体はｒｈＢＭＰ−２を記載した濃度で添加することにより置換された。

細胞生育：Ｌ６ラットの骨格筋芽細胞及びヒト胎児骨芽細胞系統（ｈＦＯＢ）（５）由来の細胞を標的として使用した。細胞の小分量（１〜５ｘ１０³個）を９６穴プレートのウェルに播種し、６〜２４時間結合させた。培地をペプチドを含有する低血清（２％）培地に交換した。パクリタキセル（１００ｎｇ／ｍｌ）及びアジ化ナトリウム（０．０１％）を使用する場合は、これ等を細胞毒性を誘導することがわかっている比較参照物質として使用した。培養物は典型的には３日間インキュベートした後、相対的な細胞数をテトラゾリウム塩ＭＴＳを用いて調べた。

細胞遊走：創傷辺縁部を通過する遊走に関する試験については、細胞はインビトロで成育させ、約９０％が融合した時点で使用した。刺激創傷は培養容器表面から細胞を掻き取ることにより形成した。培養物を濯いで未結合の細胞を除去し、次にペプチドの存在下又は非存在下に２％新生子ウシ血清を含有するＤＭＥＭ：Ｆ１２倍地中でインキュベートした。ＦＧＦ−２（５０ｎｇ／ｍｌ）を陽性対照比較参照物質として使用した。細胞は６時間遊走させた後、細胞を緩衝ホルマリン中に固定した。遊走は位相差顕微鏡でモニタリングした。遊走細胞は刺激創傷辺縁部を通過して遊走したものとした。

インビボマトリゲルプラグ試験：インビボのモデルにはＢＭＰ−２及びＢ２Ａ２の存在下又は非存在下の成長因子低減マトリゲルの若年成熟Ｆｉｓｈｅｒ３４４中の皮下インプラントを用いた。動物は全処置の前にケタミン（５０ｍｇ／ｋｇ）及びキシラジン（５ｍｇ／ｋｇ）を腹腔内注射することにより麻酔した。成長因子低減マトリゲルを４℃（液体状態）で食塩水（対照）、ＢＭＰ−２（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）、Ｂ２Ａ２−Ｋ−ＮＳ又はＢ２Ａ２−Ｋ−ＮＳ＋ＢＭＰ−２と混合した。上記した添加物を伴ったマトリゲルの０．５ｍｌの小分量をラットの上部胴体に皮下注射した。注射部位はステンレスの剃刀で剃毛し、漏出を防止した。マトリゲルは注射時まで氷上に保持し、針とシリンジも同様に取り扱った（針のゲル化を防止するため）。その後動物を１４日後に安楽死させ、ゲルを外科的に摘出し、カリパスで測定し、緩衝ホルマリン中に固定した。体外移植組織の大部分が全体的に長円形であり、長円の表面席は以下の式：
面積＝πａｂ
[式中ａおよびｂは長円の幅及び高さの１／２である]を用いて求めた。

固定した標本を組織学的検査用に加工処理し、ヘマトキシリン及びエオシン、又は、トルイジンブルーＯの何れかで染色した（Ｈｉｓｔｏｓｅｒｖ，Ｉｎｃ．，Ｇｅｒｍａｎｔｏｗｎ，ＭＤ）。

本発明の化合物は、Ｘが配列ＡＩＳＭＬＹＬＤＥＮＥＫＶＶＬ（配列番号７）を有するＢＭＰ−２受容体結合アミノ酸配列である式Ｉの一般構造を用いて固相ペプチド合成により合成し、その場合、配列番号７は各Ｒ₂がリジンであり、Ｒ₃が骨格原子である式ＩのＲ₂３官能性アミノ酸からパラレルに段階的に合成した。得られた合成成長モジュレーター類縁体は以下の特定の構造：

のものであり、場合によりＢ２Ａ２と称される。上記した構造において、「Ａｈｘ」は６−アミノヘキサン酸であり、場合により「６−Ａｈｘ」又は「Ｈｅｘ」とも称される。１文字は通常のコード付けされたアミノ酸に関する標準的なアミノ酸一文字略記法である。配列番号７の２鎖はリジン側鎖のイプシロンアミンでペプチド結合を介してＲ_２位のリジンに連結する。

実施例２の化合物（Ｂ２Ａ２）を細胞骨原性分化試験において試験することにより骨原性の活性を刺激する類縁体の能力について調べた。Ｂ２Ａ２はＢＭＰ受容体に結合し、そしてその受容体の活性化は骨原性転写因子Ｓｍａｄの発現およびＭＡＰＫの抑制を伴い、その後、ＡＬＰが低減される表現型の形質転換が起こる。図１Ａを参照すれば、Ｂ２Ａ２の存在下及び非存在下におけるＢＭＰ−２によるＣ３Ｈ１０Ｔ¹／₂細胞における骨原性分化の誘導が示される。Ｂ２Ａ２単独（１０μｇ／ｍｌ以下）をＣ３Ｈ１０Ｔ¹／₂細胞に投与した場合、アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）活性の増大は僅かのみであった。しかしながらＢ２Ａ２＋ＢＭＰ−２の最善に近い濃度（１００ｎｇ／ｍｌ）はＡＬＰ活性の有意な増大をもたらしている。ＢＭＰ−２のＥＣ₅₀は典型的には３００ｎｇ／ｍｌである。

Ｃ３Ｈ１０Ｔ¹／₂細胞を９６穴プレートに播種し、ＢＭＰ−２単独又はＢ２Ａ２と組み合わせて種々の濃度（●は１００ｎｇ／ｍｌのＢＭＰ−２、■は５０ｎｇ／ｍｌのＢＭＰ−２、□はＢＭＰ−２非存在下の試料を示す）。細胞を５日間インキュベートし、次にＡＬＰ活性について試験した。ＡＬＰ活性はｐ−ニトロフェノールホスフェート（ＰＮＰＰ）の変換により測定した。

Ｂ２Ａ２単独では、図１Ａに示す通り約０．０７５〜１０．０μｇ／ｍｌの用量範囲ではＡＬＰ活性に対する作用は僅かであった。ＡＬＰ活性の誘導は細胞にＢ２Ａ２と共に１００ｎｇ／ｍｌのＢＭＰ−２を投与した場合に増強された。同時投与は相加的ではなく相乗的であった。即ちＢ２Ａ２はＢＭＰ−２の部分的アゴニストである。

ここで図１Ｂを参照すれば、Ｂ２Ａ２とＢＭＰ−２の相乗作用はＢ２Ａ２濃度は約１０００ｎｇ／ｍｌで一定であるがＢＭＰ−２濃度が変動するという条件下で示されている。Ｂ２Ａ２の固定された濃度（１μｇ／ｍｌ）を用いれば、ＡＬＰ活性の増強は２５ｎｇＢＭＰ−２／ｍｌの低値から１０００ｎｇＢＭＰ−２／ｍｌの高値まで観察された。ＡＬＰのＢＭＰ−２誘導の閾値は〜３０ｎｇ／ｍｌから開始しているが、１０００ｎｇ／ｍｌのＢ２Ａ２の存在下では、閾値は約３ｎｇ／ｍｌのＢＭＰ−２まで低下した。

Ｂ２Ａ２がＣＨＯ生産ｒｈＢＭＰ−２の生物学的作用を増強するかどうかを調べるためにＢ２Ａ２を試験した。ここで図２を参照しながら、組み換えＢＭＰ−２蛋白（ｒｈ−ＢＭＰ−２）及びＢ２Ａ２によるＣ２Ｃ１２細胞におけるＡＬＰ活性の誘導を説明する。ｒｈＢＭＰ−２は力価が僅かに異なるＥ．ｃｏｌｉ又は哺乳類ＣＨＯ細胞生産方法のいずれかより商業的に得られるが、Ｂ２Ａ２は両方の型のｒｈＢＭＰ−２を増強する。マウスＣ２Ｃ１２細胞を９６穴プレートに播種し、異なる原料（●／○がＣＨＯで■／□がＥ．ｃｏｌｉである）から誘導したヒトＢＭＰ−２と組み合わせたＢ２Ａ２を投与し、４日間インキュベートし、次に記載した通りＡＬＰ活性を試験した。Ｂ２Ａ２は１０００ｎｇ／ｍｌ、そしてＢＭＰ−２はグラフ中に記載した濃度で適用した。Ｂ２Ａ２はＥ．ｃｏｌｉ誘導ＢＭＰ−２の薬効をＣＨＯ細胞誘導ＢＭＰ−２と同様の水準まで増大させ、そしてＣＨＯ誘導ＢＭＰ−２の薬効はＢ２Ａ２により更に増大した。点は５連の測定の平均±ＳＤである。

Ｂ２Ａ２をＦＧＦ−２、ＶＥＧＦ及びＴＧＦ−β１を包含する他の成長因子と組み合わせてＣ２Ｃ１２細胞におけるＡＬＰの誘導について試験した。ここで図３を参照すれば、Ｂ２Ａ２の存在下、ＢＭＰ−２によるＡＬＰ活性の誘導は観察されたが種々の他の成長因子では観察されなかった。ＦＧＦ−２、ＴＧＦ−ＢおよびＶＥＧＦ単独の投与ではＢ２Ａ２存在下にＣ２Ｃ１２細胞においてＡＬＰを誘導できず、Ｂ２Ａ２とＢＭＰ−２の組み合わせにおいてＢＭＰ−２がエフェクターであることを示している。

マウスＣ２Ｃ１２細胞を図１Ａに記載する通り培養し、Ｂ２Ａ２の存在下又は非存在下において種々の成長因子の組み合わせを投与し、３日間インキュベートし、次に図１Ａに示す通りＡＬＰ活性を試験した。ＦＧＦ−２は５０ｎｇ／ｍｌ、ＶＥＧＦは２５ｎｇ／ｍｌ、ＴＧＦ−β１は５０ｐｇ／ｍｌ、ＢＭＰ−２は５０ｎｇ／ｍｌ、そしてＢ２Ａ２は１０００ｎｇ／ｍｌで使用した。棒グラフは５連の測定の平均±ＳＤを示す。

細胞による骨原活性のＢＭＰ−２誘導に対して細胞に投与されたＢ２Ａ２＋ＢＭＰ−２の時間的分離が影響するかどうかを調べるためにＢ２Ａ２を試験した。ここで図４を参照すれば、ＡＬＰ活性の誘導はＣ２Ｃ１２細胞系統へのＢ２Ａ２及びＢＭＰ−２の添加の時間的分離にもかかわらず観察されている。薬剤の同時投与は、一連のＢ２Ａ２の添加とその後の浄化及びＢＭＰ−２の投与を１時間以下の間隔で行った場合にもＡＬＰ活性の誘導において有効であったことから、必要ではない。マウスＣ２Ｃ１２細胞は前回通り培養し、Ｂ２Ａ２（１０００ｎｇ／ｍｌ）を一部のウェルに添加した。４５分間のインキュベーションの後、全ウェルを新しい培地で洗浄し、培地を交換した。１セットのウェルにはＢＭＰ−２（２００ｎｇ／ｍｌ）を添加し、別のセットは更に３０分間インキュベートし、次にＢＭＰ−２を添加し、最後に更に別のセットを更に６０分間インキュベートし、次にＢＭＰ−２を添加した。５日後、ＡＬＰ活性を測定した。Ｂ２Ａ２とＢＭＰ−２の投与の時間的分離及びその間の浄化にもかかわらず相乗作用はなお観察された。データは３連の平均±ＳＤである。

細胞による骨原活性のＢＭＰ−２誘導に対して細胞に投与されたＢ２Ａ２＋ＢＭＰ−２の空間的分離が影響するかどうかを調べるためにＢ２Ａ２を試験した。ここで図５を参照すれば、ＡＬＰ活性の誘導はＢ２Ａ２及びＢＭＰ−２の添加の空間的分離にもかかわらず観察されている。図５Ａにおいて、９６穴プレートのポリスチレン表面をまずシリルヘパリン（白棒）、その後Ｂ２Ａ２の１μｇ／ｍｌ溶液（黒棒）でＰＢＳ中でコーティングし（１時間３７℃）、ＰＢＳ中で洗浄し、室温で乾燥した。その後Ｃ１Ｃ１２細胞を融合単層が得られる密度で播種し、結合させた後（１〜２時間）、ＢＭＰ−２を５０ｎｇ／ｍｌで培養物に添加した。ＡＬＰ活性は５日後に測定した。データは３連の平均±ＳＤで示す。シリルヘパリン単独ではＢＭＰ−２活性が強化されたが、Ｂ２Ａ２及びＢＭＰ−２が共同して誘導したＡＬＰ活性はより強力である。

図５Ｂにおいて、ステンレス製のウエハーをまずシリルヘパリン（白棒）、その後第２のコーティングとしてＰＢＳ中１００μｇ／ｍｌのＢ２Ａ２（黒棒）でＰＢＳ中でコーティング、ＰＢＳで洗浄し、室温で乾燥した。２４穴プレートのウェル内でウエハーを別々にコーティングし、新しい未処理プレートに移した後に細胞を播種した。

その後Ｃ２Ｃ１２細胞を融合単層が得られる密度で播種し、結合させた後（１〜２時間）、ＢＭＰ−２をグラフに示した濃度で培養物に添加した。ＡＬＰ活性は５日後に測定した。データは３連の平均±ＳＤで示す。データはステンレス上のＢ２Ａ２によるＢＭＰ−２の増強が強力であったことを示している。ＢＭＰ−２の存在下チタンウエハー上のシリルヘパリン＋Ｂ２Ａ２のコーティングについても同様の結果が観察された。

Ｂ２Ａ２が骨形成の異所性モデルにおいて脱鉱物化骨マトリックス物質（ＤＢＭ）を増強することができるかを調べるためにＢ２Ａ２を試験した。図６を参照しながら、骨形成に対するＤＢＭとのＢ２Ａ２の相乗的活性を説明する。Ｂ２Ａ２はＤＢＭにコーティングした。少量の水中（ｐＨ４）中のＢ２Ａ２（１００ｎｇ／ｍｌ又は３００ｍｇ／ｍｌ）をＤＢＭ（１００μｇ／ｍｌ）に添加し、混合し、３７℃で風乾した。次に得られたＤＢＭを更に真空オーブン中で一夜乾燥した。

Ｂ２Ａ２コーティングＤＢＭを無胸腺ラットの筋肉内に移植し、インプラント領域のレントゲン写真密度を３週後に測定した。Ｂ２Ａ２非存在下のＤＢＭと比較して３週後には相対骨密度に２５０％の上昇が観察され、そしてＢ２Ａ２非存在下のＤＢＭと比較して６週後には骨密度に６５０％の上昇が観察された（データ示さず）。図６に示される通り、両方の時点においてＢ２Ａ２コーティングＤＢＭにおいてはレントゲン写真密度の統計学的に有意な増大が観察された。

Ｂ２Ａ２を脱鉱物化骨マトリックス物質（ＤＢＭ）及び骨グラフト物質に対する添加物として使用することによりＢＭＰ−２の生物活性を最大限にすることができる。Ｂ２Ａ２はＤＢＭ（外因性）及び修復中の骨（内因性）中に存在するＢＭＰ−２の生物活性を増強する。Ｂ２Ａ２の臨床使用は骨修復を加速するために望ましい新しい治療方策を与えるものである。

以下の表２はＢ２Ａ２の生化学的相互作用、及びアルカリホスファターゼのモジュレーションを総括したものであり、モジュレーションはＣ２Ｃ１２細胞を用いてモニタリングした。

本発明の化合物は、Ｘが配列ＡＩＳＭＬＹＬＤＥＮＥＫＶＶＬ（配列番号７）を有するＢＭＰ−２受容体結合アミノ酸配列である式ＩＩの一般構造を用いて固相ペプチド合成により合成し、その場合、配列番号７はＲ６が０骨格原子であり、そして各Ｒ₅がリジンである式ＩＩのＲ₅３官能性アミノ酸からパラレルに段階的に合成した。得られた合成成長モジュレーター類縁体は以下の特定の構造：

のものであり、場合によりＢ２Ａ２−Ｋ−ＮＳと称される。上記の構造において、「Ａｈ
ｘ」は６−アミノヘキサン酸であり、場合により「６−Ａｈｘ」又は「Ｈｅｘ」とも称さ
れる。１文字は通常のコード付けされたアミノ酸に関する標準的なアミノ酸一文字略記法
である。配列番号７の鎖はＲ₅位のリジンのアルファ及びイプシロンアミン基から成長さ
せている。Ｂ２Ａ２−Ｋ−ＮＳの理論的分子量は５３４４である。

Ｌ６細胞に対する悪影響について実施例９の合成成長因子類縁体（Ｂ２Ａ２−Ｋ−ＮＳ）を試験した。ここで図７を参照しながら、細胞毒製剤又はＢ２Ａ２−Ｋ−ＮＳの投与後の培養物中のＬ６細胞の相対数を説明する。Ｌ６細胞には１００ｎｇ／ｍｌパクリタキセル又は０．０１％アジ化ナトリウムを投与し、これ等の細胞毒製剤の作用を、投与３日後にＢ２Ａ２−Ｋ−ＮＳを種々の濃度で投与したＬ６細胞と比較した。Ｂ２Ａ２−Ｋ−ＮＳは２〜１０μｇ／ｍｌの濃度において対照値を超えた細胞増殖を誘導した。ヒト胎児骨芽細胞、Ｃ３Ｈ１０Ｔ¹／₂細胞およびＭＣ−３Ｔ３−Ｅ１細胞についても同様の結果が得られた。

骨原活性を促進する合成成長類縁体の能力を調べるために細胞骨原分化試験においてＢ２Ａ２−Ｋ−ＮＳを試験した。ここで図８を参照しながら、ＢＭＰ−２の存在下及び非存在下における種々の濃度のＢ２Ａ２−Ｋ−ＮＳを用いた場合のＣ２Ｃ１２細胞における骨原分化の誘導を説明する。Ｂ２Ａ２−Ｋ−ＮＳ単独（１０μｇ／ｍｌ以下）のＣ１ＣＣ１２への投与は僅かに上昇したアルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）活性をもたらしたが、Ｂ２Ａ２−Ｋ−ＮＳ＋ＢＭＰ−２は通常は閾値未満の濃度のＢＭＰ−２においてさえも、ＡＬＰ活性の有意な上昇をもたらした。Ｃ２Ｃ１２細胞を９６穴プレートに播種し、１００ｎｇ／ｍｌのＢＭＰ−２の存在下（黒棒）及び非存在下（白棒）でＢ２Ａ２−Ｋ−ＮＳを種々の濃度で投与した。細胞は４日間インキュベートし、次にＡＬＰ活性について試験した。ＡＬＰ活性はｐ−ニトロフェノールホスフェート（ＰＮＰＰ）の変換により試験した。Ｂ２Ａ２−Ｋ−ＮＳは約１０μｇ／ｍｌ以下の濃度においてＡＬＰ活性の誘導に対し作用を示さなかった。Ｂ２Ａ２−Ｋ−ＮＳはＢＭＰ−２（１００ｎｇ／ｍｌ）の最善に近い量により誘導されたＡＬＰ活性を実質的に増強していた。同様の結果がＣ３Ｈ１０Ｔ¹／₂細胞においても得られた。

刺激された創傷辺縁部に前骨芽起源の細胞を遊走させる能力についてＢ２Ａ２−Ｋ−ＮＳを試験した。ネズミＣ３Ｈ１０Ｔ¹／₂細胞、ＭＣ３Ｔ３細胞又はｈＦＯＢをインビトロでほぼ融合されるとなるまで生育させた。刺激創傷は基板より細胞を掻き取ることにより作成した。細胞を６時間遊走させた後、遊走を顕微鏡でモニタリングした。ＡＮＯＶＡを用いて統計学的有意差を調べ、その後、対照群との多重比較を用いて事後検定を行った（Ｄｕｎｎｅｔｔ法）。ＦＧＦ−２を陽性対照比較参照物質として使用し、対照と比較した場合の遊走細胞の優位な増大を誘導させた（データ示さず）。表３は約０．２〜２．０μｇ／ｍｌのＢ２Ａ２−Ｋ−ＮＳにより誘導された刺激創傷辺縁部における遊走細胞の増大を総括したものである。

Ｂ２Ａ２−Ｋ−ＮＳ類縁体をそのインビボの作用について試験した。ここで図９を参照しながら、ＢＭＰ−２の存在下又は非存在でＢ２Ａ２−Ｋ−ＮＳを含有するマトリゲルを移植した領域から摘出した体外移植組織の領域の比較を説明する。成熟ラットにＢＭＰ−２及びＢ２Ａ２−Ｋ−ＮＳの存在下及び非存在下にマトリゲルを移植し、１４日後、残存ゲルを外科的に摘出して測定した。Ｂ２Ａ２−Ｋ−ＮＳ、ＢＭＰ−２及びＢＭＰ−２およびＢ２Ａ２−Ｋ−ＮＳを与えたほぼ全ての移植部位が検査時に触知可能な部位を有していたが担体のみを有していた対照インプラントは大部分が吸収されていた。更にまた、Ｂ２Ａ２−Ｋ−ＮＳ、ＢＭＰ−２又はＢＭＰ−２＋Ｂ２Ａ２−Ｋ−ＮＳの組み合わせを与えられていた部位からの体外移植組織は有意に大きい体外移植組織を有していた。体外移植組織の形態は異なる体外移植組織組成では異なっていた。担体のみを与えられた動物は小型の残存プラグを有しており、乏しい細胞組織化を伴う形態を有する傾向があった。Ｂ２Ａ２−Ｋ−ＮＳを与えられた動物は腺維軟骨に合致する形態のプラグを有していた。ＢＭＰ−２投与を受けた動物は膜骨化の発生に合致した中等度の量の組織化を伴った細胞の数が増大したプラグを形成していた。Ｂ２Ａ２−Ｋ−ＮＳ＋ＢＭＰ−２を与えた動物では、膜骨化の発生に合致した組織化と共に細胞密度の上昇が観察された。細胞密度は実験対照又はＢ２Ａ２−Ｋ−ＮＳで観察されたものよりも高値であったが、ＢＭＰ−２単独を与えられた動物から得た体外移植組織で観察された細胞密度より低値であった。(データ示さず)

Ｂ２Ａ２−Ｋ−ＮＳ類縁体を細胞骨原性分化試験において試験することにより骨原性の活性を刺激する合成成長類縁体の能力について調べた。図１０を参照すれば、Ｂ２Ａ２−Ｋ−ＮＳの最善に近い濃度（１００ｎｇ／ｍｌ）の存在下及び非存在下におけるＢ２Ａ２−Ｋ−ＮＳによるＣ２Ｃ１２細胞における骨原性分化の誘導が示される。Ｂ２Ａ２−Ｋ−ＮＳ単独（１０μｇ／ｍｌ以下）をＣ２Ｃ１２細胞に投与した場合、アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）活性の増大は僅かのみであった。しかしながらＢ２Ａ２−Ｋ−ＮＳ＋ＢＭＰ−２は通常では閾値未満のＢＭＰ−２濃度であってもＡＬＰ活性の有意な増大をもたらしている。Ｃ２Ｃ１２細胞を９６穴プレートに播種し、１００ｎｇ／ｍｌのＢＭＰ−２の存在下（黒棒）又は非存在下（白棒）において種々の濃度のＢ２Ａ２−Ｋ−ＮＳを投与した。細胞を４日間インキュベートし、次にＡＬＰ活性について試験した。ＡＬＰ活性はｐ−ニトロフェノールホスフェート（ＰＮＰＰ）の変換により測定した。

Ｂ２Ａ２−Ｋ−ＮＳ類縁体がＢＭＰ−２とは独立して細胞において表現型の発現の変化を誘導する能力について試験した。ＭＣ３Ｔ３細胞をＢ２Ａ２−Ｋ−ＮＳで刺激し、オステオカルシン、オステオポンチン及びＩＩ型コラーゲンの発現における変化を、各々に対する特異的抗体を用いた測定により観察し、これを後にＨＰＲＯにコンジュゲートした二次抗体を用いて検出した。形成された膜はスキャナでデジタル化し、ソフトウエアを用いて色反転させながらグレースケールに変換した。

ここで図１０を参照しながら、軟骨形成経路誘導蛋白に関するＣ３Ｈ１０Ｔ¹／₂細胞のアルシアン染色を説明する。Ｂ２Ａ２−Ｋ−ＮＳは刺激後１０日においてＣ３Ｈ１０Ｔ¹／₂細胞において生産されたアルシアンブルー染色性の物質の量を増大させている。最善に近い量（５０ｎｇ／ｍｌ）のＢＭＰ−２はアルシアンブルー染色性物質の増大を増強しなかった。

本発明の化合物は、Ｘが配列ＬＹＦＤＥＳＳＮＶＩＬＫＫ（配列番号９）を有するＢＭＰ受容体結合アミノ酸配列である式ＩＩの一般構造を用いて固相ペプチド合成により合成し、その場合、配列番号９はＲ_６が０原子であり、そしてＲ _５ がリジンである式ＩＩのＲ_５３官能性アミノ酸からパラレルに段階的に合成した。合成においてＲ_５リジン以外のリジン残基の側鎖は、他の反応性側鎖と同様に保護し、合成後に選択的脱保護した。得られた合成成長モジュレーター類縁体は以下の特定の構造：

のものであり、場合によりＢ７Ａ１−Ｋ−ＮＳと称される。上記した構造において、「Ａｈｘ」は６−アミノヘキサン酸であり、場合により「６−Ａｈｘ」又は「Ｈｅｘ」とも称される。１文字は通常のコード付けされたアミノ酸に関する標準的なアミノ酸一文字略記法である。配列番号９の鎖はＲ₅位のリジンのアルファ及びイプシロンアミン基から成長させている。

骨原活性を促進する合成成長類縁体の能力を調べるために細胞骨原分化試験においてＢ７Ａ１−Ｋ−ＮＳを試験した。ここで図１１を参照しながら、ＢＭＰ−２の存在下及び非存在下における種々の濃度のＢ７Ａ１−Ｋ−ＮＳを用いた場合のＣ２Ｃ１２細胞における骨原分化の誘導を説明する。Ｂ２Ａ２単独（１０μｇ／ｍｌ以下）のＣ２Ｃ１２細胞への投与はＡＬＰ活性の生成に影響しなかった。しかしながら、Ｂ７Ａ１−Ｋ−ＮＳ＋ＢＭＰ−２は通常は閾値未満の濃度（１００ｎｇ／ｍｌ）のＢＭＰ−２においてさえも、ＡＬＰ活性の有意な上昇をもたらした。Ｃ２Ｃ１２細胞を９６穴プレートに播種し、１００ｎｇ／ｍｌのＢＭＰ−２の存在下（黒棒）及び非存在下（白棒）でＢ２Ａ２を種々の濃度で投与した。細胞は４日間インキュベートし、次にＡＬＰ活性について試験した。ＡＬＰ活性はｐ−ニトロフェノールホスフェート（ＰＮＰＰ）の変換により試験した。Ｂ７Ａ１−Ｋ−ＮＳは約１０μｇ／ｍｌ以下の濃度においてＡＬＰ活性の誘導に対して作用を示さなかった。Ｂ７Ａ１−Ｋ−ＮＳはＢＭＰ−２（１００ｎｇ／ｍｌ）の最善に近い量により誘導されたＡＬＰ活性を実質的に増強していた。同様の結果がＣ３Ｈ１０Ｔ¹／₂細胞においても得られた。

本発明の化合物は、Ｘが配列ＩＳＭＬＹＬＤＥＮＥＫＶＶＬＫＮＹ（配列番号８）を有するＢＭＰ−２受容体結合アミノ酸配列である式Ｉの一般構造を用いて固相ペプチド合成により合成し、その場合、配列番号８は各Ｒ₂がリジンである式ＩのＲ₂３官能性アミノ酸からパラレルに段階的に合成した。得られた合成成長モジュレーター類縁体は以下の特定の構造：

を有していた。上記した構造において、「Ａｈｘ」は６−アミノヘキサン酸であり、場合により「６−Ａｈｘ」又は「Ｈｅｘ」とも称される。１文字は通常のコード付けされたアミノ酸に関する標準的なアミノ酸一文字略記法である。配列番号８の２鎖はリジン側鎖の第２アミンでペプチド結合を介してＲ₂位のリジンに連結する。

本発明の化合物は、Ｘが配列ＹＶＤＦＳＤＶＧＷＮＤＷ（配列番号１０）を有するＢＭＰ受容体結合アミノ酸配列である式Ｉの一般構造を用いて固相ペプチド合成により合成し、その場合、配列番号１０は各Ｒ₂がリジンである式ＩのＲ₂３官能性アミノ酸からパラレルに段階的に合成した。得られた合成成長モジュレーター類縁体は以下の特定の構造：

を有していた。上記した構造において、「Ａｈｘ」は６−アミノヘキサン酸であり、場合により「６−Ａｈｘ」又は「Ｈｅｘ」とも称される。１文字は通常のコード付けされたアミノ酸に関する標準的なアミノ酸一文字略記法である。配列番号１０の２鎖はリジン側鎖の第２アミンでペプチド結合を介してＲ₂位のリジンに連結する。

ＢＭＰファミリーの合成成長モジュレーター類縁体は、Ｘが配列ＣＡＩＳＭＬＹＬＤＥＮＥＫＶＶＬ（配列番号１２）を有するＢＭＰ受容体結合アミノ酸配列である式Ｉの一般構造を用いて固相ペプチド合成により合成し、その場合、配列番号１０は各Ｒ₂がリジンである式ＩのＲ₂３官能性アミノ酸からパラレルに段階的に合成した。得られた合成成長モジュレーター類縁体は以下の特定の構造：

を有していた。上記した構造において、「Ａｈｘ」は６−アミノヘキサン酸であり、場合により「６−Ａｈｘ」又は「Ｈｅｘ」とも称される。１文字は通常のコード付けされたアミノ酸に関する標準的なアミノ酸一文字略記法である。配列番号１２の２鎖はリジン側鎖の第２アミンでペプチド結合を介してＲ₂位のリジンに連結する。

本発明の化合物はＸが配列ＡＦＹＣＨＧＥＣＰＥＰＬＡＤＨＬ（配列番号１３）を有するＢＭＰ受容体結合アミノ酸配列である式Ｉの一般構造を用いて固相ペプチド合成により合成し、その場合、配列番号１３は各Ｒ₂がリジンである式ＩのＲ₂３官能性アミノ酸からパラレルに段階的に合成した。得られた合成成長モジュレーター類縁体は以下の特定の構造：

を有していた。上記した構造において、「Ａｈｘ」は６−アミノヘキサン酸であり、場合により「６−Ａｈｘ」又は「Ｈｅｘ」とも称される。１文字は通常のコード付けされたアミノ酸に関する標準的なアミノ酸一文字略記法である。配列番号１３の２鎖はリジン側鎖のイプシロンアミンでペプチド結合を介してＲ₂位のリジンに連結する。

本発明の化合物はＸが配列ＰＦＰＬＡＤＨＬＮＳＴＮＨＡＩＶＱＴＬＶＮＳＶ（配列番号１４）を有するＢＭＰ受容体結合アミノ酸配列である式Ｉの一般構造を用いて固相ペプチド合成により合成し、その場合、配列番号１４は各Ｒ₂がリジンである式ＩのＲ₂３官能性アミノ酸からパラレルに段階的に合成した。得られた合成成長モジュレーター類縁体は以下の特定の構造：

を有していた。上記した構造において、「Ａｈｘ」は６−アミノヘキサン酸であり、場合により「６−Ａｈｘ」又は「Ｈｅｘ」とも称される。１文字は通常のコード付けされたアミノ酸に関する標準的なアミノ酸一文字略記法である。配列番号１４の２鎖はリジン側鎖の第２アミンでペプチド結合を介してＲ₂位のリジンに連結する。

本発明の化合物は、Ｘが配列ＡＩＳＭＬＹＬＤＥＮＥＫＶＶＬ（配列番号７）を有するＢＭＰ−２受容体結合アミノ酸配列である式Ｉの一般構造を用いて固相ペプチド合成により合成し、その場合、配列番号７はＲ₃が０骨格原子であり、そして各Ｒ₂がリジンである式ＩのＲ₂３官能性アミノ酸からパラレルに段階的に合成した。得られた合成成長モジュレーター類縁体は以下の特定の構造：

のものであり、場合によりＢ２Ａ２−Ｋ２−ＮＳと称される。上記した構造において、「Ａｈｘ」は６−アミノヘキサン酸であり、場合により「６−Ａｈｘ」又は「Ｈｅｘ」とも称される。１文字は通常のコード付けされたアミノ酸に関する標準的なアミノ酸一文字略記法である。

実施例２の化合物の骨形成蛋白２受容体への特異的結合について試験した。図１２を参照しながら、精製された受容体／Ｆｃキメラ分子を利用した固相受容体結合試験の結果を説明する。キメラはポリペプチドライナーを介してヒトＩｇＧ１Ｆｃ領域のカルボキシ末端に融合した種々の受容体分子（ＢＭＰＲおよびアクチビンＲアイソフォーム）の可溶性エクトドメインの組み換えコンストラクトである。ＥＬＩＳＡプレートはＢ２Ａ２又は対照化合物、可溶性キメラ受容体／Ｆｃ抗体でコーティングし、比色ＥＬＩＳＡにより定量した。Ｂ２Ａ２は以下の順序、即ち、ＢＭＰＲ−Ｉｂ＝ＡｃｔＲ−ＩＩ＞＞ＢＭＰＲ−１ａ＝ＡｃｔＲＩＩｂ＞ＢＭＰＲ−ＩＩにおいて他のアイソフォームと同様、ＢＭＰＲ−Ｉｂ及びアクチビンＲ−ＩＩに優先的に結合することが示された。対照として使用したインスリンはＢ２Ａ２又はＢＭＰ−２の何れにも結合しなかった（データ示さず）。ここで図１３を参照しながら、ＢＭＰ−２の種々の濃度における精製ＢＭＰ−２受容体／Ｆｃキメラ分子へのＢ２Ａ２結合を説明する。受容体と共に大モル過剰量で添加したＢＭＰ−２はＢ２Ａ２への結合をブロックした。ＢＭＰ−２を種々の濃度で添加した場合、得られた置換曲線はＢＭＰＲ−ＩｂへのＢ２Ａ２の二段階結合動態を示唆している。

前述の実施例は、の実施例において使用したものに関して本発明の一般的又は特別に記載した反応体及び／又は操作条件を前述の実施例において使用したものとおき駆ることにより同様に良好に反復することができる。

これ等の好ましい実施形態を特に参照しながら本発明を詳述したが、他の実施形態も同じ結果を達成することができる。本発明の変更又は改変は当業者には自明なものであり、このような改変及び同等物は全て添付請求項に包含されることを意図している。上記において引用した参考文献、出願、特許および公開物の全開示は参照により本明細書に組み込まれる。

本明細書に組み込まれ部分を構成する添付図面は本発明の実施形態１つ以上を示すものであり、詳細な説明とともに本発明の原理を説明するものである。図面は本発明の好ましい実施形態１つ以上を示すことを目的とするのみであり、本発明を限定しない。図面は以下を包含する。
図１ＡおよびＢはＢ２Ａ２がＣ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞においてアルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）のＢＭＰ−２誘導を増強することを示すグラフである。 図２はＢ２Ａ２がＣＨＯ細胞及びＥ．ｃｏｌｉの商業的製造方法で得られた組み換えヒトＢＭＰ−２の活性を増強することを示すグラフである。 図３はＢ２Ａ２の相乗作用がＢＭＰ−２に特異的であったことを示すグラフである。 図４はＣ２Ｃ１２細胞系統へのＢ２Ａ２及びＢＭＰ−２の添加の時間的分離にもかかわらずＡＬＰ活性が誘導されたことを示すグラフである。 図５はＢ２Ａ２コーティング表面がＢＭＰ−２活性を増強したことを示すグラフである。種々の組成物の表面をまず組織培養皿中滅菌条件下シリルヘパリンでコーティングした（３７℃で３０分間インキュベートした酸エタノール中１％溶液、水で洗浄、５６℃で乾燥）。 ３週間目に移植された無胸腺ラットからの放射線撮影分析による相対強度を示すグラフである。 細胞毒製剤又はＢ２Ａ２−Ｋ−ＮＳを投与した後の培養物中のＬ６細胞の相対数を示すグラフ。 ＢＭＰ−２の存在下又は非存在下のＢ２Ａ２−Ｋ−ＮＳの種々の濃度によるＣ２Ｃ１２細胞における骨原性分化の誘導を示すグラフである。 ＢＭＰ−２を有する場合と有さない場合のＢ２Ａ２−Ｋ−ＮＫ類似体を含有するマトリゲルを移植した領域からの摘出した体外移植組織の領域を比較したグラフである。 Ｂ２Ａ２−Ｋ−ＮＳ投与により発現が刺激されたＣ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞における軟骨形性経路のＡｌｃｉａｎ染色を示すグラフである。 図１１はＢＭＰ−２の最善に近い濃度の存在下又は非存在下のＢ２Ａ７−Ｋ−ＮＳによるＣ１Ｃ１２細胞の骨原性分化の誘導を示すグラフである。 図１２は本発明の化合物とＢＭＰ−２受容体との間の特異的結合を示すグラフである。 図１３はＢＭＰ−２受容体に結合するＢＭＰ−２とＢ２Ａ２の相乗作用的活性を示すグラフである。

Claims (12)

1. 下記式：
   （式Ｉ）
   [式中、
   Ｘは配列番号７から配列番号４４のペプチド鎖からなる群より選択され；
   Ｒ₁は独立して水素であり、これにより、末端基はＮＨ₂、Ｎ末端ＮＨ₂、ＮＨ₃ ⁺又はＮＨ基を含む直鎖又は分枝鎖のＣ₁〜Ｃ₁₇アルキル、アリール、ヘテロアリール、アルケン、アルケニル又はアラルキル鎖を有するアシル基又は相当するアシル化誘導体であるか、
   又は、Ｎ末端ＮＨ₂、ＮＨ₃ ⁺又はＮＨ基を有するアミノ酸、ジペプチド又はトリペプチドであり；
   Ｒ₂は独立して３官能性のアルファアミノ酸残基であり、ここでＸはＲ₂の側鎖を介して共有結合しており；
   Ｒ₃は独立してＲ₂に共有結合した０〜１５骨格原子の鎖を含むリンカーであり；
   Ｒ₄は、
   ＯＨ、
   ＮＨ₂、
   Ｎ末端ＮＨ₂、ＮＨ₃ ⁺ 若しくはＮＨ基を含むところの直鎖若しくは分枝鎖のＣ₁〜Ｃ₁₇アルキル、アリール、ヘテロアリール、アルケン、アルケニル若しくはアラルキル鎖を有するアシル基、又は相当するアシル化誘導体、あるいは、
   ＮＨ−Ｒ₁
   であり；
   ＹはＡｈｘ−Ａｈｘ−Ａｈｘ（Ａｈｘは６−アミノヘキサン酸）を含むリンカーであり；そして、
   Ｚは配列番号１から配列番号６のペプチド鎖からなる群より選択される]
   の化合物。
2. Ｒ₂がＬ又はＤジアミンアミノ酸残基である請求項１記載の化合物。
3. Ｌ又はＤジアミンアミノ酸残基が２，３ジアミノプロピオニルアミノ酸、２，４ジアミノブチルアミノ酸、リジン又はオルニチンである請求項２記載の化合物。
4. ＸがＲ₂に共有結合し、そして共有結合がアミド、ジスルフィド、チオエーテル、シッフ塩基、還元シッフ塩基、イミド、第２アミン、カルボニル、尿素、ヒドラゾン又はオキシム結合を含む請求項１記載の化合物。
5. Ｒ₃＞０原子の場合にＸはＲ₃に共有結合し、そして共有結合がアミド、ジスルフィド、チオエーテル、シッフ塩基、還元シッフ塩基、イミド、第２アミン、カルボニル、尿素、ヒドラゾン又はオキシム結合を含む請求項１記載の化合物。
6. 下記構造：
   を有する請求項１記載の化合物。
7. 下記式：
   （式ＩＩ）
   [式中、
   Ｘは配列番号７から配列番号４４のペプチド鎖からなる群より選択され；
   Ｒ_１は独立して水素であり、これにより、末端基はＮＨ_２、Ｎ末端ＮＨ_２、ＮＨ_３ ^＋又はＮＨ基を含む直鎖又は分枝鎖のＣ_１〜Ｃ_１７アルキル、アリール、ヘテロアリール、アルケン、アルケニル又はアラルキル鎖を有するアシル基又は相当するアシル化誘導体であるか、又は、Ｎ末端ＮＨ_２、ＮＨ_３ ^＋又はＮＨ基を有するアミノ酸、ジペプチド又はトリペプチドであり；
   Ｒ_６は、ゼロ原子であり、又は、ゼロ原子でない場合には、Ｒ_６は独立してＲ_５に共有結合した１〜１５骨格原子の鎖を含むリンカーであり；
   Ｒ_５は３官能性のアルファアミノ酸残基であり、ここでＲ_６がゼロ原子である場合、Ｒ_５に対しＸが共有結合しており；
   Ｒ₄は、
   ＯＨ、
   ＮＨ₂、
   Ｎ末端ＮＨ₂、ＮＨ₃ ⁺ 若しくはＮＨ基を含むところの直鎖若しくは分枝鎖のＣ₁〜Ｃ₁₇アルキル、アリール、ヘテロアリール、アルケン、アルケニル若しくはアラルキル鎖を有するアシル基、又は相当するアシル化誘導体、あるいは、
   ＮＨ−Ｒ₁
   であり；
   ＹはＡｈｘ−Ａｈｘ−Ａｈｘ（Ａｈｘは６−アミノヘキサン酸）を含むリンカーであり；そして、
   Ｚは配列番号１から配列番号６のペプチド鎖からなる群より選択される]
   の化合物。
8. Ｒ₂がＬ又はＤジアミンアミノ酸残基である請求項７記載の化合物。
9. Ｌ又はＤジアミンアミノ酸残基が２，３ジアミノプロピオニルアミノ酸、２，４ジアミノブチルアミノ酸、リジン又はオルニチンである請求項８記載の化合物。
10. ＸがＲ₅に共有結合し、そして共有結合がアミド、ジスルフィド、チオエーテル、シッフ塩基、還元シッフ塩基、イミド、第２アミン、カルボニル、尿素、ヒドラゾン又はオキシム結合を含む請求項７記載の化合物。
11. Ｒ₆＞０原子の場合にＸはＲ₆に共有結合し、そして共有結合がアミド、ジスルフィド、チオエーテル、シッフ塩基、還元シッフ塩基、イミド、第２アミン、カルボニル、尿素、ヒドラゾン又はオキシム結合を含む請求項７記載の化合物。
12. 下記構造：
    を有する請求項７記載の化合物。