JP4881946B2

JP4881946B2 - 動物由来蛋白なしで培養可能な猫の細胞、これを用いたウイルスの生産方法、及びワクチンの生産方法

Info

Publication number: JP4881946B2
Application number: JP2008513059A
Authority: JP
Inventors: 雅美望月
Original assignee: Kyoritsu Seiyaku Corp
Current assignee: Kyoritsu Seiyaku Corp
Priority date: 2006-04-28
Filing date: 2006-04-28
Publication date: 2012-02-22
Anticipated expiration: 2026-04-28
Also published as: EP2017333A4; EP2017333A1; US20090098159A1; ES2375087T3; WO2007125605A1; US7767451B2; CA2650676A1; JPWO2007125605A1; EP2017333B1; CA2650676C

Description

本発明は、動物由来蛋白なしで培養可能な猫の細胞株及びその作出方法に関する。また、本発明は、この細胞株を用いたウイルスの生産方法、診断用抗原の製造方法、ワクチンの製造方法、診断用試験法に関する。さらに、本発明は、この細胞株の培養に用いる培地に関する。

動物などの細胞を試験管内で培養する技術は創成されてから半世紀以上経過し、科学技術の進歩に相まって格段の進展をみている。

一般に、生きている動物を直接試験した場合は結果の理解は容易であるが、技術的にも経済的にも多くの問題点がある。そこで、動物の一部を取り出し、シャーレや試験管などの人工環境内で細胞が増殖されるようになった。これは、組織培養法又は細胞培養法と呼ばれている。そのような技術は難しくないために、この方法により、医薬品、ワクチン及び診断用抗原などを作成することが可能となった。しかし、動物細胞を生体外で培養するためには、元の生体の環境となるべく同じ条件で培養することが求められる。例えば、無菌状態、温度環境を生体と同じ温度にする等の条件である。

さらに、上記の条件を満たしても、細胞の分裂増殖のためには、栄養源として、「細胞成長因子：cell growth factor」を追加供給する必要があった。細胞成長因子としては、例えば、各種ホルモン、インスリン、プトレシン、線維芽細胞増殖因子が挙げられる。しかし、細胞成長因子は全ての細胞種で解明されたわけではない。

そこで、細胞成長因子の代わりに、その効果が非特異的に期待でき、多くの「unknown」な成分を含む動物血清が用いられる。動物血清の中でも、個体数が多く、安定的に供給可能であるということから牛血清が選択される。さらに、毒性のある蛋白質が少ない胎仔の血清が、頻繁に使われるようになった。科学的研究の場合には、牛が目的外の動物種であっても、牛に由来する蛋白を試験研究材料中に含むことが許される場合がある。しかし、牛由来の蛋白を、医薬品として人及び他の動物種に対して用いると、問題が起こる場合がある。

第１の問題はアレルギーに関する。ウシ血清が入っているワクチンや薬剤を、牛以外の人や動物に非経口的に注射した場合、初回では多くは問題にはならない。しかしながら、２回目の注射以降にはアレルギー反応として問題化する場合がある。これは免疫学的に説明される。即ち、動物は初めて暴露した高分子物質（例えば分子量が10,000ドルトン以上の蛋白質）には低い反応しか示さず、投与された物質は体内で分解処理されてしまう。しかし、免疫系組織には暴露の記憶が残される。そのため、同じ物質（抗原）の次回以降の暴露時には初回時の記憶免疫細胞が直接反応し、短時間内に初回より強く生体反応が起きてくる。人や動物の個体によっては、これら外から暴露された抗原に対して望ましくない反応をする場合がある。それが典型的にはアレルギー反応と呼ばれる。アレルギー反応により、注射局所の発熱や腫脹、ひどい場合は気管閉塞による呼吸困難、虚脱などのために死亡する。

第２番目の問題は、牛血清中に含まれる病原体又は牛血清抗体の混入に関する。例えば、牛に感染するペスチウイルス、レトロウイルス、あるいはマイコプラズマなどの汚染が有名である。最近は、牛海綿状脳症（bovine spongiform encephalopathy: BSE）、いわゆる「狂牛病」の病原体であるプリオンの混入が問題となっている。

上記の通り、牛血清の使用には問題点があるのにもかかわらず、特に動物を対象とする獣医療領域で用いられるワクチンの製造には牛血清が世界中で習慣的に使われてきている。

しかし、最近になって、牛血清を細胞培養法に用いない試み（無血清培地：SFMおよび無血清細胞培養法）や、それを用いて牛用の試作ワクチンを作成したという報告が出てきた（Makoschey et al., Serum-free produced bovine herpesvirus type 1 and bovine parainfluenza type 3 virus vaccines are efficacious and safe. Cytotechnology, 39: 139-145, 2002）。また、細胞培養液から血清成分を取り除く代わりに、既存の培地や新しく考案した培地に、各種ホルモンや細胞増殖因子らを添加して細胞を増殖させることは、以下の文献に開示されている。

（Froud, S. J. The development, benefits and disadvantages of serum-free media. Brown, F., Cartwright, T., Horaud, F., Spieser, J. M. (eds): Animal sera, animal sera derivatives and substitutes used in the manufacture of pharmaceuticals: Viral safety and regulatory aspects. Dev. Biol. Stand., Basel, Karger, 1999, vol.99, pp 157-166.
Merten, O.-W. Safety issues of animal products used in serum-free media. Brown, F., Cartwright, T., Horaud, F., Spieser, J. M. (eds): Animal sera, animal sera derivatives and substitutes used in the manufacture of pharmaceuticals: Viral safety and regulatory aspects. Dev. Biol. Stand., Basel, Karger, 1999, vol.99, pp 167-180.
Merten, O.-W. Development of serum-free media for cell growth and production of viruses/viral vaccines − Safety issues of animal products used in serum-free media. Brown, F., Hendriksen, C., Sesardic, D., Cussler, K. (eds): Advancing science and elimination of the use of laboratory animals for development and control of vaccines and hormones. Dev. Biol. Stand., Basel, Karger, 2002, vol.111, pp 233-257.）
さらに、植物由来成分を培地添加物として用いることについては、以下の文献に開示されている。

Noe et al., Fed-batch strategies for mammalian cell cultures. In, Spier, R.E., Griffiths, J.B., Berthold, W. (eds): Animal Cell Technology: products of Today, prospects for tomorrow, Oxford, Butterworth-Heinemann, 1994, pp 413-418.
渋谷和史ら、動物細胞培養用無血清培地、公表特許公報（A）、特許出願公表番号P2002-520014A（公表日2002年７月9日）。この文献には、独自に調整した培地に、ダイズ蛋白質加水分解物及び酵母抽出物を添加し、あるいはさらにコムギ蛋白質加水分解物を加えてチャイニーズハムスター卵巣細胞を培養することが開示されている。また、ダイズ蛋白質加水分解物としては、各種、例えば、消化酵素による部分的水解による可溶性ポリペプチドが開示されている。

Kwon, S.M. et al. Use of plant-derived protein hydrolysates for enhancing growth of Bombyx mori (silkworm) insect cells in suspension culture. Biotechnol. Appl. Biochem., 42: 1-7, 2005。この文献には、カイコに由来する昆虫細胞の培養に従来の牛血清の代替品として植物由来蛋白加水分解物（商品名HyPep 1510; Difco Co., Detroit, MI, USA）が使用できることが開示されているが、培地の組成については開示されていない。

Chun, B.-H. et al. Use of plant hydrolysates for varicella virus production in serum-free medium. Biotechnol. Letters 27: 243-248, 2005。この文献には、人胎子肺細胞（MRC-5）をDulbecco’s modified Eagle medium : DMEMとNutrient mixture(Ham’s F-12)の２：１混合液に牛血清を加えずに大豆蛋白加水分解物等を加えて培養し、その細胞培養系で水痘ウイルスを培養することが開示されている。しかし、用いられている培地中には組換えヒトインスリン、組換えヒト上皮細胞増殖因子、および組換えヒト線維芽細胞増殖因子が添加されており、動物蛋白を含んでいる。

バクスター・インターナショナル・インコーポレイテッド、細胞を培養するための動物性タンパク質非含有培地、特許出願公表番号P2005-532057A。この文献には、大豆加水分解物と酵母加水分解物に由来する非動物由来ペプチドを用いる細胞培養法、及び細胞として猫由来のCRFK細胞が開示されている。しかしながら、培地の組成について開示されていない。

上記の通り、従来は、動物由来蛋白を用いずに作出された猫由来細胞株、この培養に用いる培地、猫用ワクチンに用いるウイルスの増殖法は開示されていなかった。また、猫に感染するウイルスは例外なく他の動物種由来の細胞ではほとんど増殖しないため、他の動物に由来する細胞を動物由来蛋白なしで培養できたとしても、猫由来細胞に応用できない。

したがって、動物由来蛋白を含まない培地で培養される猫由来細胞、これを培養する動物由来の蛋白を含まない培地、及び猫用の安全なワクチン及び検査試薬等が望まれていた。

本発明の一態様は、猫全胎子由来細胞であるfcwf-4細胞から誘導した細胞株であって、動物由来の蛋白なしで培養可能である細胞株に関する。この細胞株は国際寄託された細胞株又はこの細胞株と同等の生物学的性質を有する細胞株であってもよい。

また、本発明の一態様は、fcwf-4細胞を、血清及び細胞増殖因子を含む培養液に順化させる工程と、Dulbecco’s modified Eagle mediumとNutrient mixture (Ham’s F-12)の1:1の混合液に複数種の大豆由来ペプトンを含有する培地であって、動物由来の蛋白を含まない培地を用いて培養し、動物由来蛋白なしで培養可能である細胞株を作出する工程とを含む細胞株の作出方法に関する。大豆由来ペプトンは、Peptone from soybean(enzymatic digest、Fluka社製、Catalogue No.87972)と、ポリペプトンS（POLYPEPTON-S、カタログ番号No.391-00125、日本製薬株式会社製）との組み合わせが好ましい。

さらに、本発明の一態様は、細胞株にウイルスを感染させる工程と、感染した細胞株を培養してウイルスを増殖させる工程とを含むウイルスの生産方法に関する。この感染した細胞株を培養する際の培地は、Dulbecco’s modified Eagle medium及びNutrient mixture(Ham’s F-12)の1:1の混合液に複数種の大豆由来ペプトンを含有する培地であって、動物由来の蛋白を含まない培地であってもよい。大豆由来ペプトンは、Peptone from soybean (enzymatic digest、Fluka社製、Catalogue No.87972)と、ポリペプトンS（POLYPEPTON-S、カタログ番号No.391-00125、日本製薬株式会社製）との組み合わせが好ましい。感染した細胞株を培養する際に浮遊培養法を用いてもよい。ウイルスは、コロナウイルス科、カリシウイルス科、ヘルペスウイルス科、パルボウイルス科からなるウイルス群から選ばれるウイルスであってもよい。また、ウイルスは、猫カリシウイルス、猫ヘルペスウイルス1 (猫伝染性鼻気管炎ウイルス)、猫パルボウイルス、猫汎白血球減少症ウイルス、２型犬パルボウイルス、猫コロナウイルス、猫腸内コロナウイルス、猫伝染性腹膜炎ウイルス、犬コロナウイルス、犬呼吸器コロナウイルス、豚伝染性胃腸炎ウイルス、豚流行性下痢症ウイルス、牛コロナウイルスから選ばれるウイルスであってもよい。

さらに、本発明の一態様は、上記の方法により生産されたウイルスを用いた診断用抗原の製造方法に関する。

さらに、本発明の一態様は、上記の方法により生産されたウイルスを用いたワクチンの製造方法に関する。

さらに、本発明の一態様は、上記の方法により生産されたウイルスまたはウイルス抗原を含有する診断用試験法に関する。

さらに、本発明の一態様は、動物由来の蛋白を含まず、Dulbecco’s modified Eagle mediumとNutrient mixture (Ham’s F-12)の1:1の混合液に、複数種の大豆由来ペプトンを含有する培地に関する。大豆由来ペプトンは、Peptone from soybean(enzymatic digest、Fluka、Catalogue No.87972)と、ポリペプトンS（POLYPEPTON-S、カタログ番号No.391-00125、日本製薬株式会社製）との組み合わせが好ましい。

本発明の一態様によると、fcwf-4細胞から誘導した細胞株は動物由来の蛋白なしで培養されるため、これを用いて生産したウイルスを、ワクチン及び検査試薬とした場合には、安全なワクチン及び検査試薬を提供することが可能である。

また、本発明の一態様によると、安価な市販の培地を用いてウイルスを増殖することができるため、これを用いて生産したウイルスをワクチンおよび検査試薬とした場合には、安価なワクチンおよび検査試薬を提供することが可能である。

さらに、本発明の一態様によると、培地は動物由来の蛋白を含まないため、ウイルスを感染させた細胞をこの培地を用いて培養した場合に、安全なワクチン及び検査試薬を提供することが可能である。

なお、本明細書において、「動物由来の蛋白を含まない」及び「動物由来の蛋白なし」とは、特に、アレルギーの原因になり得るような動物由来の蛋白成分を含まないことをいう。アレルギーの原因になり得る動物由来の蛋白としては、例えば、動物由来の血清やその一部である血清アルブミン、細胞増殖因子等の動物性蛋白、及び動物に由来する各種添加物（Bacto Peptone、Tryptose Phosphate Broth等）が挙げられる。

図1は、fcwf-SF細胞、30代目の培養4日目(培養開始後3日目に培地交換した翌日)の細胞の写真である。図2は、DFSP培地で継代34代目のfcwf-SF細胞の増殖曲線の図である。図3は、7.5% MEM（7.5％牛胎子血清を添加したEagle’s MEM培地）で培養した親細胞fcwf-4細胞と、DFSP培地で培養したfcwf-SF細胞での猫ヘルペスウイルス１型C7301株の増殖曲線の図である。図4は、7.5% MEMで培養した親細胞fcwf-4細胞と、DFSP培地で培養したfcwf-SF細胞での猫カリシウイルスF9株の増殖曲線の図である。図5は、fcwf-SF細胞における1型猫コロナウイルスである猫伝染性腹膜炎ウイルスYayoi株増殖に伴って発現したCPEの図である。図6は、fcwf-SF細胞における2型猫コロナウイルスである猫伝染性腹膜炎ウイルスM91-267株の増殖に伴って発現したCPE の図である。1型猫コロナウイルスと同じような細胞溶解性のCPEで、多核巨細胞の形成は顕著でなかった。図7は、fcwf-4細胞における2型猫コロナウイルスである猫伝染性腹膜炎ウイルスM91-267株の増殖に伴って発現したCPE の図である。多核巨細胞形成を特徴とする。図8は、7.5% MEMで培養した親細胞であるfcwf-4細胞と、DFSP培地で培養したfcwf-SF細胞での猫伝染性腹膜炎ウイルスM91-267株のウイルス増殖曲線の図である。図9は、7.5% MEMで培養した親細胞であるfcwf-4細胞と、DFSP培地で培養したfcwf-SF細胞での猫汎白血球減少症ウイルスTU-1株のウイルス増殖曲線の図である。

猫に用いることのできる、安全かつ有効なワクチンの開発をするため、よりウイルス感染スペクトルの広い猫全胎子由来細胞であるfcwf-4細胞を選択した。fcwf-4細胞は、カリフォルニア大学獣医学部のNiels C. Pedersenが1979年に作出した細胞系で、猫胎子に由来する「マクロファージ」系の細胞である（Pedersen, N.C., J.F. Boyle, and K. Floyd. 1981. Infection studies in kittens, using feline infectious peritonitis virus propagated in cell culture. Am. J. Vet. Res. 42: 363-367）。fcwf-4細胞は、作出者自身によってATCCに登録されている（no.CRL-2787）。

fcwf-4細胞は、動物由来の蛋白を含まない市販の基礎培地、例えば、Eagle’s MEM、RPMI 1640 Medium、McCoy’s 5A Medium、Leiovitz’s L-15 Medium、Dulbecco’s modified Eagle medium（DMEM）、Nutrient mixture(Ham’s F-12)では牛血清を添加しないと増殖しない。そのため、fcwf-4細胞を、段階的に順化継代する。

fcwf-4細胞の順化は、まず、牛胎子血清を含有する培地で、徐々に牛胎子血清の濃度を下げながら培養することができる。培地としては、市販培地を利用してもよく、以下の例には限定されないが、例えば、組換え上皮細胞増殖因子を10 ng/ml含む商品名「VP-SFM」（Invitrogen社製、Catalogue No.11681-020）培地が挙げられる。牛胎子血清の濃度は、0.25％から0.1％さらに0.05％に変化させても良い。

次に、無血清培地に大豆由来ペプトンを加えた培地で順化させることができる。無血清培地としては、市販の培地を利用しても良く、以下の例には限定されないが、例えば、DMEM培地（Invitrogen社製、Catalogue No.11885-084）とNutrient mixture(Ham’s F-12、Invitrogen社製、Catalogue No.11765-054)との混合培地が挙げられる。大豆由来ペプトンとしては、以下の例には限定されないが、例えば、大豆ペプトン（Peptone from soybean、enzymatic digest、Fluka社製、Catalogue No.87972）が挙げられる。培地としてDMEM培地とHam’s F-12培地に大豆ペプトンを加えた混合培地（DF培地）を用いる場合は、各培地の混合重量比は3:1〜1:3が好ましく、1:1がより好ましい。培地中の大豆ペプトンの最終濃度は、250μg/ml〜3,000μg/mlが好ましく、より好ましくは750μg/ml程度である。

次に、無血清培地であるDulbecco’s modified Eagle medium（DMEM培地）とNutrient mixture(Ham’s F-12)の混合液に、複数種の大豆由来ペプトンを加えた培地（以下、DFSP培地とする。）を用いて順化させる。DMEM培地とHam’s F-12の混合重量比は3:1〜1:3が好ましい。大豆由来ペプトンは複数種用いる。大豆由来ペプトンとしては、以下の例には限定されないが、例えば、Peptone from soybean (enzymatic digest、Fluka社製、Catalogue No.87972)や、ポリペプトンS（POLYPEPTON-S、カタログ番号No.391-00125、日本製薬株式会社製）、Pepton Hy-Soy (商標、T, Sigma社製、 Product No. P6463-250G)、Phytone (BBL社製)、Soytone (Difco社製)が挙げられる。これらの中でも、Peptone from soybeanとポリペプトンSとの組み合わせが好ましい。大豆ペプトンの合計の添加量は、培地中250μg/ml〜3,000μg/mlが好ましく、1,500μg/ml程度がより好ましい。

培地には、動物由来の蛋白を含まない限りにおいて、抗生物質等の添加物を含んでいてもよい。

以下に、DFSP培地の組成の一例を示すが、これに限定されるものではない。

（DFSP培地の作成の一例）
１） Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM、Invitrogen社製、Catalogue No.11885)を準備する。

２） F-12 Nutrient Mixture (Ham’s F-12、Invitrogen社製、Catalogue No.11765)を準備する。

３） DMEMとHam’s F-12の等量混合液を作成する。

４）大豆ペプトン（Peptone from soybean、enzymatic digest、Fluka社製、Catalogue No.87972）15グラムを1,000 ml滅菌蒸留水に溶解し、220 nmフィルターで濾過後、３）の培地100 ml当たり5 mlを添加する（最終濃度 750μg/ml）。

５）大豆ペプトン（日本製薬株式会社、ポリペプトンS：POLYPEPTON-S、カタログ番号No.391-00125、和光純薬工業株式会社販売）15グラムを1,000 ml滅菌蒸留水に溶解し、220 nmフィルターで濾過後、３）の培地100 ml当たり5 mlになるよう、添加する（最終濃度 750μg/ml）。

６） DMEMとHam’s F-12培地中にL-グルタミンが含まれていない場合は、L-グルタミンを300 mg/Lとなるよう添加する（最終濃度 300μg/ml）。

７）抗生物質として、ペニシリンGカリウムを100 U/ml、硫酸ストレプトマイシンを100μg/ml、アンフォテリシンBを2.5μg/mlとなるよう添加する（いずれも最終濃度）。

動物由来蛋白なしで培養可能な猫の細胞は、次のようにして得ることができる。まず、fcwf-4細胞を、牛胎子血清濃度が0.25％であるVP-SFM培地で5代継代し、さらに、牛胎子血清の濃度を0.1％であるVP-SFM培地で5代継代し、さらに、牛胎子血清の濃度が0.05％であるVP-SFM培地で9代継代する。次に、DMEM培地とHam’s F-12培地の混合比が1:1であり大豆ペプトンを750μg/ml含む DF培地で21代継代する。次に、DMEM培地とHam’s F-12培地の混合比が1:1である大豆ペプトン750μg/ml及びポリペプトンS 750μg/mlを含むDFSP培地で継代すると、DFSP培地に順化し、新たに誘導された細胞株が得られる。本願出願人は、さらにDFSP培地で25代まで継代した細胞株を、fcwf-SF株として、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（茨城県つくば市東1-1-1）に受領番号FERM ABP-10594（原寄託日2006年3月31日）として国際寄託した。

fcwf-SF細胞株に、fcwf-4細胞株に対して感受性のあるウイルスを感染させ、感染した細胞株を培養して増殖させることにより、ウイルスを生産することができる。ウイルスを培養する際の培地は、動物由来の蛋白を含まない培地が好ましく、上記のDFSP培地がより好ましい。

培養の際の培養器は、プラスチック製容器でもガラス製の容器のいずれでもよい。例えば、25 cm²Tフラスコ、6 cm直径プラスチックシャーレなどの非ガラス製の容器とそれに該当する再生可能なガラス製の容器が挙げられる。なかでも、培養条件を一定にすることが容易なディスポーザルのプラスチック製培養器が好ましい。

感染した細胞株の培養に、公知の方法を用いることができる。公知の方法としては、例えば、単層培養法および浮遊培養法が挙げられる。

単層培養法としては、例えば、容器内面に単層培養させた細胞に、目的とするウイルスを感染させ、静置培養あるいは回転培養することで培養上清中にウイルスを調製することができる。容器としては、例えば、平板培養容器や回転培養瓶が挙げられ、具体的には、例えば、シャーレ、Tフラスコが挙げられる。この際の容器の基質は、非ガラスが好ましく、プラスチックがより好ましい。

浮遊培養法としては、例えば、マイクロキャリアビーズを用いたマイクロキャリア法が挙げられる。マイクロキャリア法としては、例えば、バイオリアクター（培養タンク）内で微小球形粒子（マイクロキャリアビーズ）の表面に細胞を単層に増殖させ、次いで増殖したマイクロキャリアビーズ上の細胞にウイルスを感染させた後、攪拌しながら培養することでその培養液中に目的とするウイルスを調製することができる。マイクロキャリアビーズの材質としては、例えば、セラミックス、デキストラン、ガラス、シリコン、プラスチックおよびポリアクリルアミド製等が挙げられる。市販のビーズとしては、例えば、Amersham Bioscience社製のCytodex(商標)１が挙げられる。

fcwf-4細胞に感受性のあるウイルスとしては、以下の例には限定されないが、多くの猫（Felis catus）や猫科動物に感染するパルボウイルス科のウイルスである猫汎白血球減少症ウイルス（Feline panleukopenia virus）、ヘルペスウイルス科のウイルスである猫ヘルペスウイルス１（Feline herpesvirus-1; 別名、猫伝染性鼻気管炎ウイルス）、カリシウイルス科のウイルスである猫カリシウイルス（Feline calicivirus）ばかりでなく、広くコロナウイルス科の各種ウイルスが挙げられる。特にグループ１コロナウイルスに属する猫コロナウイルスである猫腸内コロナウイルス（Feline enteric coronavirus）と猫伝染性腹膜炎ウイルス（Feline infectious peritonitis virus）、犬コロナウイルス（Canine coronavirus）、豚伝染性胃腸炎ウイルス（Transmissible gastroenteritis virus）、豚流行性下痢ウイルス（Porcine epidemic diarrhea virus）、あるいはグループ２コロナウイルスに属する牛コロナウイルス（Bovine coronavirus）などのコロナウイルスにも高い感受性を示す。

本発明の方法により生産されたウイルスを回収、精製して、ワクチンや診断薬用の抗原物質として使用することができる。ウイルスの回収、精製には、公知の方法を用いることができ、例えば、細胞を凍結溶解することにより細胞を破壊し、融解液を遠心分離して細胞や細胞破壊物を取り除き、上澄液をウイルス液として回収してもよい。

ワクチンとする場合には、不活化ワクチンとしても、生ワクチンとしてもよい。不活化ワクチンとする場合は、回収、精製したウイルスをホルマリンなどにより不活化し、不活化したウイルスにアジュバントを添加して製造してもよい。また、生ワクチンの場合は、弱毒化したウイルスを、生産した後、回収・精製し、これにアジュバントを添加して製造してもよい。ワクチン中のウイルスの量は、ワクチンを接種する猫に対して、標的とするウイルスの感染を阻止できる程度の免疫を付与するに十分な量である。一般には、1×10^3.5TCID₅₀/ml〜1×10^5.0TCID₅₀/ml以上のウイルス量である。使用できるアジュバントは、ワクチンを接種する猫に、全身性感染防御免疫や局所感染防御免疫を付与できるアジュバントが挙げられる。

感染診断薬とこれを用いた診断用試験法とする場合には、上記の様に不活化したウイルスを抗原とするか、もしくはウイルスから単離した抗原をELISAプレートやニトロセルロース膜などの支持体に固定することにより調整することができる。感染診断薬は猫の血清中に存在する抗体と結合させた後、西洋ワサビパーオキシダーゼやアルカリ性フォスファターゼなどを結合させた二次抗体との反応及びそれに続く呈色反応などの公知の反応を実施することにより視覚化することができ、各種ウイルスに感染した猫の血中抗体の有無、すなわち感染の有無を検出・確認することができる。

細胞を低温保存する場合には、本発明によるDFSP培地にジメチルスルホキシド(Dimethyl sulfoxide：DMSO)を加えた培地を用いることができる。DMSOとしては、例えば、Wako Pure Chemical Industries, Ltd. 製、Catalogue No.043-07216が入手可能である。DMSOの濃度は、DFSP培地中で7.5％〜20％が好ましく、10%程度がより好ましい。

以下の実施例により、本願発明は、さらに詳細に説明されるが、これら実施例に限定されるものではない。なお、本明細書において「%」は、特に断りのない限り、「重量%」の意味である。

（実施例１ DFSP培地を用いたfcwf-SF株の作出）
まず、fcwf-4細胞の順化は、牛胎子血清を含有する市販培地で、徐々に牛胎子血清の濃度を下げながら培養した。つまり、組換え上皮細胞増殖因子を10 ng/ml含む市販無血清培地（商品名「VP-SFM」（Invitrogen社製、 Catalogue No.11681-020））に牛胎子血清0.25%を含有した培地でfcwf-4細胞を5代継代し、その後、牛胎子血清濃度を0.1%含有した培地でさらに5代、さらに0.05%含有した培地で9代継代した。なお、VP-SFM培地の血清を完全に無添加にすると継代培養ができなかった。

本実施例で用いたfcwf-4細胞は、1990年代に鹿児島大学農学部獣医学科家畜微生物学講座で本願出願人が研究用に使っていたもので、カリフォルニア大学獣医学部内科学教室のNiels C. Pedersen教授の許可のもと、既に同細胞を取得していた北里大学獣医畜産学部獣医伝染病学教室の小山弘之教授から分与された。その後、同細胞は、共立製薬株式会社臨床微生物研究所へと受け継がれてきた。臨床微生物研究所では1995年4月より、Eagle’s MEM基礎培地（日水製薬株式会社製、イーグルMEM培地「ニッスイ」(1)）に、牛胎子血清を7.5%、Tryptose Phosphate Brothを10%、およびＬ-グルタミン（0.292g/L）を含み、細菌増殖抑止を目的にペニシリン（100 U/ml）、ストレプトマイシン（100 μg/ml）、アンフォテリシンB（0.25〜0.5μg/ml）を添加した培地（7.5% MEM）で継代培養してきた。

なお、本実施例において、親細胞も、またそれから誘導した無血清培地順化fcwf-SF細胞も、継代をする場合には、0.25%トリプシン＋0.02%EDTA（エチレンジアミン四酢酸）溶液にて細胞面を２回洗浄後、37℃のインキュベーターに静置し、細胞を分散させた。用いたトリプシンは豚膵臓由来のDIFCO TRYPSIN 250（Difco社製）で、滅菌PBSに溶解後、220 nmフィルター濾過滅菌した。

次に、0.05%に牛胎子血清を含むVP-SFMに順化したfcwf-4細胞を、市販の基礎培地への順化に直接用いた。つまり、DMEM培地（Invitrogen社製、Catalogue No.11885-084）とNutrient mixture(Ham’s F-12、Invitrogen社製、Catalogue No.11765-054)との混合培地に、大豆ペプトン（Peptone from soybean、enzymatic digest、Fluka社製、Catalogue No.87972）を加えた培地（以下、DF培地とする）でfcwf-4細胞を21代継代した。DMEM培地とHam’s F-12培地の重量比は、1:1で行った。大豆ペプトンの培地中の最終濃度は750μg/mlとした。

21代継代する間、基本的には親細胞と同じ継代条件で細胞を取り扱った。即ち、約4〜5日間隔で、元細胞を3〜4倍に拡大継代した。しかし、細胞順化の過程でしばしばみられるように、時に細胞の増殖が遅延したために、その間、1〜2回、培地を新しいものと交換したり、継代倍数を2〜3倍に減弱させたりして、細胞が途切れないようにした。

なお、市販のEagle’s MEM、RPMI 1640 Medium、McCoy’s 5A Medium、Leiovitz’s L-15 Medium、Dulbecco’s modified Eagle medium（DMEM）、Nutrient mixture(Ham’s F-12)は、いずれも単独ではfcwf-4細胞の増殖を十分に促すことはできず、２〜３代の継代後に増殖を停止した。

また、DMEM培地とHam’s F-12培地との重量比は、1:3〜3:1に変化させてもfcwf-4細胞は同様に増殖した。

次に、DF培地に順化したfcwf-4細胞を、DF培地にさらに大豆ペプトン（ポリペプトンS：POLYPEPTON-S、カタログ番号No.391-00125、日本製薬株式会社製）を加えた培地（DFSP培地）で9代継代した。ポリペプトンＳは脱脂大豆を酵素分解後精製し乾燥した粉末である。ポリペプトンＳは培地中の最終濃度が750μg/mlになるように加えた。用いたDFSP培地の組成を表１に示す。

DFSP培地で9代継代した時点（血清非含有の状態で計30代）で、明らかにDFSP培地に対して順化が進み、細胞の増殖が安定してきたことが確認された。即ち、過去数代に渡って、細胞シートの形成に要する時間と継代間隔が一定になり、5〜7日間隔で3〜4倍に継代されるようになった。培養開始2〜3日後に一度培地を新しいものに交換し、さらに2〜3日培養後、継代できるようになった。この時点で無血清培地であるDFSP培地に順化し、新たに誘導された細胞株であるとして「fcwf-SF株」と命名した。

31代目からの細胞を用いてその特性を調べた。図1にはfcwf-SF細胞、30代目の培養4日目(培養開始後3日目に培地交換した翌日)の細胞シートを示した。無固定・無染色で、倒立顕微鏡下で撮影した。牛胎子血清を添加した7.5% MEM培地で培養した親細胞に比べて、ATCCに登録されているように、よりオリジナルの細胞の形態的特徴、「紡錘形から星状」に近かった。

図2には34代目のfcwf-SF細胞の増殖様相を示した。4.5 x 10⁵/mlの細胞濃度に調整した細胞浮遊液を25 cm²Tフラスコに入れ開放系で静置培養し、24時間毎に細胞数を計測した。図2に示したように6日後には、fcwf-SF細胞は約4倍に増加した。

その他のfcwf-SF細胞とその培養系の性状について、以下に記す。

本実施例においては、培養条件を一定にすることが容易なディスポーザルのプラスチック製培養器を用いた。

培養は閉鎖系でも開放形（5% CO₂炭酸ガス培養器内）でも行えるが、DF培地による培養には閉鎖系で、DFSP培地では培地のpHコントロールが容易な開放形でデータを収集した。

なお、DFSP培地中の大豆ペプトンを除くと細胞は増殖しなかった。

また、DFSP培地中の大豆由来ペプトンの量を2種類とも2倍（1.5 mg/ml）に変更しても細胞増殖性に変化はなかった。

さらに、DMEMとHam’s F-12の混合培地の代わりにRPMI 1640 Mediumに2種類の大豆由来ペプトンを加えた培地では、十分に増殖しなかった。

さらに、大豆加水分解物（Sigma-Aldrich、P6463 Peptone Hy-Soy T）あるいは麦芽抽出物（Becton, Dickinson and Company、Bacto（商標） Malt Extract、Catalogue No.218630）をDFSP培地にさらに添加しても特に変化がなかった。

さらに、酵母抽出物（Becton, Dickinson and Company、Bacto（商標） Yeast Extract、Catalogue No.212750）および小麦抽出物（Sigma-Aldrich、HyPep 4601（商標） Protein Hydrolyasate from wheat gluten）をDFSP培地にさらに添加しても細胞の増殖や形態に良い効果をもたらさなかった。添加は細胞の増殖速度や形態維持にむしろ悪作用を及ぼしているようであった。

本願出願人は、当該fcwf-SF株細胞（DF培地で21代、DFSP培地で25代、総計46代継代細胞）を独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（茨城県つくば市東1-1-1）に受領番号FERM ABP-10594（原寄託日2006年3月31日）として国際寄託している。

（実施例2 fcwf-SF細胞の低温保存）
DFSP培地にDMSO（Wako Pure Chemical Industries, Ltd.製 Catalogue No.043-07216）を10%含む細胞凍結用培地を調整した。この培地に、fcwf-SF細胞を10⁶/ml以上になるように浮遊し、凍結保存用バイアルに1.8 mlずつ分注、その後、本バイアルを冷蔵しておいた簡易細胞凍結器「BICELL（商標）」（Nihon Freezer Co., Ltd.製）に入れ、-80℃フリーザーで一晩かけて凍結、その後、液体窒素（液相）に移管することで低温保存が可能であった。

凍結保存状況の確認のために、48時間後、定法通り、液体窒素より取り出し、40℃程度の温湯中で一気に溶解、DFSP培地10mlに希釈浮遊させ、低速遠心で細胞を回収した。細胞ペレットを7.5 mlのDFSP培地に再浮遊し、25 cm²のＴフラスコに入れ、37℃で培養を開始した。

培養３日目には細胞シートを形成したので、5日目に4倍量の新しい培地に継代した。継代培養した細胞はやはり3日目に細胞シートを形成し、少なくても顕微鏡下で観察した分には本凍結法による悪影響は認められなかった。以後、非凍結の細胞と同じように継代が可能であった。このことから、本発明のfcwf-SP細胞の凍結に10% DMSO添加DFSP培地を用いることが有効であることが確認された。

（実施例3 無血清シードウイルス液の作成）
現在広く、世界中の飼い猫の予防接種に用いられているコアワクチンを構成しているウイルスは、猫ヘルペスウイルス１、猫カリシウイルスと、猫汎白血球減少症ウイルスの３種である。猫コロナウイルスで猫に感染して致死性の猫伝染性腹膜炎を起こす２型猫伝染性腹膜炎ウイルスのワクチンもある。しかしこれらのウイルス液のストックはこれまで牛胎子血清やTryptose Phosphate Brothを添加した細胞培養内で増殖させている、例えば、Eagle’s MEM培地等である。そのため、無血清培地による細胞培養内でウイルスを増殖させるためにはこれらの牛血清成分などの動物蛋白質を取り除く必要がある。そこで以下のようにして、無血清シードウイルス液を作成した。表2には上記のウイルス種のうち、実際に用いたウイルス株名と、それらを用いて作出したシードウイルス液のウイルス力価を示した。

猫ヘルペスウイルス１、猫カリシウイルス、猫伝染性腹膜炎ウイルスの実施に使用した最初のウイルス液は、ウイルス接種後、親細胞のfcwf-4細胞を牛胎子血清が2%及びTryptose Phosphate Brothが10%添加された培地でウイルス増殖を促している。そのため、その上清中には牛血清が2%、Tryptose Phosphate Brothが10%含まれることから、それらの成分の影響をなくす処置を試みた。閉鎖系フラスコ内で培養され、細胞シートを形成しているfcwf-SF細胞に各ウイルス液を接種し、１時間のウイルス吸着後、ウイルス液を吸引除去し、さらにDFSP培地で２回細胞表面を洗浄した。その後、DFSP培地を加え、37℃のインキュベーター内で静置培養し、ウイルスの増殖を図った。猫汎白血球減少症ウイルスについては、細胞が培地に浮遊された時点でウイルス接種を行った。そのために、最初のウイルス液には牛胎子血清が7.5%含有されており、他のウイルス液よりも牛血清の影響が大きい。そこでfcwf-SF細胞をDFSP培地に浮遊させた時点で、培養液の約5%量のウイルス液を加え、37℃のインキュベーター内で静置培養し、細胞が壁面に接着後の24時間後に、培養液を吸引除去、細胞面をDFSP培地で一度洗浄後、新しいDFSP培地を加えウイルスの増殖を図った。ウイルスが十分に増殖した、数日から７日後、一度、フラスコごと凍結融解し、融解液は低速遠心により細胞や細胞破砕物を取り除き、上清を第二代ウイルス液とした。この操作を合計2回繰り返して動物由来蛋白を減少させ、３代目の培養上清をストックウイルス液として-80℃フリーザー内に分注保存した。

これと比較するために、DFSP培地の代わりに7.5％牛胎子血清を含むMEM培地を用い、また、fcwf-SF細胞の代わりにfcwf-4細胞を用いて、同様にウイルスストック液を作成、保存した。

それぞれの感染価を表２に示す。作出したDFSP培地で培養したfcwf-SF細胞におけるそれぞれのウイルス種の感染価は、猫汎白血球減少症ウイルス及び猫伝染性腹膜炎ウイルスでは、親細胞であるfcwf-4細胞で増殖させた場合と同様に優れた感染価を示し、特に、猫ヘルペスウイルス１と猫カリシウイルスではfcwf-SF細胞で作成したウイルス液の方が300倍から5,000倍高かった。

（実施例4 猫ヘルペスウイルス１型）
１）25 cm²Tフラスコに親細胞であるfcwf-4細胞を7.5% MEM培地で（比較例）、及びfcwf-SF細胞をDFSP培地で（実施例）、それぞれ5% CO₂炭酸ガス培養器内で培養開始し、シートを形成した培養5日後に細胞数を計測した。

２）表2に示したストックウイルス液の中の、猫ヘルペスウイルス１型C7301株を、それぞれ同じm.o.i.（multiplicity of infection;感染の多重性、既知の数の培養細胞に加えた感染性ウイルス粒子数の比率）の0.01になるようにウイルスを希釈後、接種した。

３）37℃、１時間のウイルス吸着の後、未吸着ウイルスを吸引除去し、7.5% MEMあるいはDFSP培地を加え、静置培養した。

４）その後24時間間隔で接種後、1，2，3，4，及び6日目にフラスコごと-80℃フリーザーに凍結保存した。

５）ウイルス感染力価測定に先立ち、凍結しておいたフラスコを室温で融解し、2,500 rpm、10分間の遠心で細胞成分を除去した上清を感染価測定に用いた。

６）感染価の測定は96穴マイクロプレートを用いたMicro-titration法にて行った。即ち、５）で得たウイルス液を7.5% MEM培地で10倍階段希釈し、各希釈につき4穴に100μlづつ加え、さらに総ての穴に100μl細胞浮遊液を加え、軽く混合し、37℃の5% 炭酸ガスインキュベーター内で静置培養した。

７）細胞浮遊液は、7.5% MEM培地に1 x 10⁵/mlになるようにfcwf-4細胞を調整して用いた。

８）ウイルス接種7日後にウイルス変性効果（CPE）の有無によって感染価の終末点を算出した。

図3には7.5% MEM培地で培養した親細胞fcwf-4細胞と、動物由来蛋白不含DFSP培地で培養したfcwf-SF細胞での猫ヘルペスウイルス１型C7301株の増殖曲線を示した。ウイルス接種後翌日より、親細胞fcwf-4細胞とfcwf-SF細胞、いずれでもウイルス産生が開始され、以後増加していった。総てのタイムポイントでfcwf-SF細胞の方が25倍〜100倍高いウイルス感染価を示した。

（実施例5 猫カリシウイルス）
実施例4と同じ方法に感染価を調べたが、相異するのは、
1) ウイルス株が、猫カリシウイルスのF9株であること、
である。

図4はその結果を示す。いずれの培養細胞においても、ほとんど同じように増殖し、牛血清を添加したこれまでのウイルス培養法同等にすぐれた感染価を示した。詳細には、fcwf-SF細胞での最高ウイルス到達時間が１日遅く、そのウイルス価は若干（10^0.4）ではあるが高かった。

（実施例6 猫伝染性腹膜炎ウイルス）
実施例4と同じ方法で実施したが、相違するのは、
1）ウイルス増殖曲線作成に用いたウイルス株が2型猫コロナウイルスである猫伝染性腹膜炎ウイルスM91-267株であること、
2）ウイルス接種後速やかにCPEを起こして培養器壁より細胞が離脱したため、接種後、1、2、3、及び4日目にフラスコごと-80℃フリーザーに凍結保存したこと、及び
3) fcwf-SF細胞のウイルス感受性検査には1型猫コロナウイルスで、猫伝染性腹膜炎ウイルスであるYayoi株も用いたこと、である。

図5はfcwf-SF細胞における1型猫コロナウイルスである猫伝染性腹膜炎ウイルスYayoi株増殖に伴って発現したCPE、図6は2型猫コロナウイルスである猫伝染性腹膜炎ウイルスM91-267株の増殖に伴って発現したCPEを示す。

１型猫コロナウイルスは細胞培養で増殖しにくいことを特徴とするが、Yayoi株はDFSP培地で培養のfcwf-SF細胞で図に示したようなCPEを発現して増殖した。増殖の程度を数値化しなかったが、その程度は親細胞であるfcwf-4細胞とほぼ同じ程度であった。

一方、2型猫コロナウイルスの増殖性は一般にfcwf-4細胞でも良いことが周知されており、図6に示すようにfcwf-SF細胞でもCPEを伴って増殖した。しかし、fcwf-4細胞培養でのCPEは多核巨細胞形成を特徴としたのに対し（図7）、fcwf-SF細胞培養でのCPEは1型猫コロナウイルスと同じような細胞溶解性のCPEで、多核巨細胞の形成は顕著でなかった。

図8には2型猫コロナウイルスである猫伝染性腹膜炎ウイルスM91-267株の、親細胞であるfcwf-4と、新しく発明した動物由来蛋白不含DFSP培地で培養のfcwf-SF細胞培養でのウイルス増殖様相を示した。ともに接種後２日目にはウイルス力価がピークに達し、以後減衰した。fcwf-SF細胞培養においても十分なウイルス増殖を示した。

（実施例7 猫汎白血球減少症ウイルス）
実施例4と同じ方法で実施したが、相違するのは、
１．用いたウイルス株は猫汎白血球減少症ウイルスのTU-1株であること、
２．細胞が培地に浮遊された時点で、静置培養開始前にウイルス接種を行ったこと、
３．その後、37℃のインキュベーター内で静置培養し、細胞が壁面に接着後の24時間後に、培養液を吸引除去、細胞面をそれぞれの新しい培地で一度洗浄後、再び新しい培地を加えて、残余する接種ウイルスの影響を低減させ、この時点を０日としたこと、
４．感染価測定のMicro-titration法で用いた、感染価終末点の確定には、各希釈穴の上清中に産生されている血球凝集素の有無で行った。即ち、各穴から50μlの上清を取り出し、別に用意した血球凝集反応用マイクロプレートに移し、総ての穴に等量のpH 6.8のリン酸緩衝食塩水（PBS）とやはり等量のアカゲザル血球浮遊液を加えた。アカゲザル血球浮遊液は同じPBSに0.75%の割合で赤血球を浮遊し調整した。よく攪拌後、4℃に静置し、凝集の有無にて感染価を算出した。

以上の4点である。

図9にその結果を示す。猫汎白血球減少症ウイルスTU-1株は親細胞であるfcwf-4細胞でも、動物由来蛋白不含DFSP培地で培養したfcwf-SF細胞でも同じように優れた増殖様相を示した。

産業上の利用の可能性

本発明のfcwf-SF細胞は、その増殖に牛胎子血清やその他の動物に由来する各種蛋白添加物を必要とせず、入手に制限のない安価で既存の基礎培地（Dulbecco’s modified Eagle medium（DMEM）とNutrient mixture(Ham’s F-12)）と植物由来蛋白質の分解産物（大豆ペプトン）を混合するだけの簡単なDFSP培地で増殖する。植物由来蛋白質分解産物をも除去する必要がある場合は、ウイルスを接種した細胞培養の培養液をそれらが含まないものに置換すればよい。そのために、ワクチン用ウイルスや各種試験に用いるウイルス蛋白抗原を、安価に、かつ安全に製造することを可能とするものである。特に、仔猫は、母猫からの移行抗体をいまだ保有しているために、ワクチンによって十分な免疫を付与するためには、短期間に頻回接種しなければいけない。例えば、次のような状況下である。猫のコアウイルスである猫ヘルペスウイルス１型、猫カリシウイルス、および猫汎白血球減少症ウイルスに対する初回予防接種処置や、感染ハイリスクの猫の毎年の追加の予防接種処置が挙げられる。ワクチンは、ワクチン成分以外の蛋白質成分の混入は極力避けなければその安全性は確保できない。さらに近年問題となったプリオンに原因する、いわゆる「狂牛病」などの未知の病原体のワクチンや医薬品への混入は極めて憂慮される問題である。特に猫は狂牛病プリオンに高感受性である。本発明の動物由来蛋白不含培養液DFSP培地によるfcwf-SF細胞株の樹立は、これらの培養細胞を用いた製剤の開発や製造に極めて有効な手段を提供する。

Claims

猫全胎子由来細胞であるfcwf-4細胞から誘導した細胞株であって、動物由来の蛋白なしで培養可能である受託番号FERM BP-10594の細胞株。
請求項１の細胞株にウイルスを感染させる工程と、感染した細胞株を培養してウイルスを増殖させる工程とを含むウイルスの生産方法。
前記感染した細胞株を培養する際の培地は、Dulbecco’s modified Eagle medium及びNutrient mixture(Ham’s F-12)の1:1の混合液に複数種の大豆由来ペプトンを含有する培地であって、動物由来の蛋白を含まない培地である請求項２のウイルスの生産方法。
前記感染した細胞株を培養する際に浮遊培養法を用いる請求項２又は３のウイルスの生産方法。
前記ウイルスは、コロナウイルス科、カリシウイルス科、ヘルペスウイルス科、パルボウイルス科からなるウイルス群から選ばれる請求項２〜４のいずれかに記載のウイルスの生産方法。
前記ウイルスは、猫カリシウイルス、猫腸内コロナウイルス、猫ヘルペスウイルス１、猫パルボウイルス、２型犬パルボウイルス、猫コロナウイルス、猫伝染性腹膜炎ウイルス、犬コロナウイルス、犬呼吸器コロナウイルス、豚伝染性胃腸炎ウイルス、豚流行性下痢症ウイルス、牛コロナウイルスから選ばれる請求項２〜４のいずれかに記載のウイルスの生産方法。