JP4874798B2

JP4874798B2 - ＮＦκＢ作用抑制剤及び抗炎症剤並びにステロイド作用増強剤

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Publication number: JP4874798B2
Application number: JP2006528715A
Authority: JP
Inventors: 一起岡本; 文秀礒橋
Original assignee: 学校法人聖マリアンナ医科大学
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Filing date: 2005-06-28
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Description

本発明は、ＮＦκＢ作用抑制剤及び抗炎症剤並びにステロイド作用増強剤に関する。

炎症反応には種々のサイトカインや細胞接着分子の発現もかかわっていることが知られている。この炎症性サイトカインがそれぞれに対応した受容体と結合することによって細胞内で各種分子のリン酸化が生じる。このリン酸化のカスケードは最終的に、核内の転写因子であるＮＦκＢを活性化し、各種炎症物質の転写が促進されると考えられている。
このように炎症反応は最終的にＮＦκＢの活性化に集約されており、このＮＦκＢの活性を効果的に抑制する薬剤として、ステロイド剤が用いられている。

ステロイド薬剤は、難治性の自己免疫性肝炎、劇症肝炎及び慢性肝炎とそれにより発症する肝硬変並びに肝癌の治療の特効薬として用いられているが、非常に強力な効果を有する一方で、ステロイド潰瘍や満月様顔貌、糖尿病、骨粗鬆症などの重篤な副作用を引き起こすことも知られている。その副作用は、多くの場合、その使用量に応じて引き起こされている。またステロイド剤は、抗炎症作用以外に細胞増殖や糖代謝に多彩な作用を発揮することも知られており、ステロイド薬剤の抗炎症作用の詳細は、完全に解明されていない。

一方、ＮＦκＢは、炎症性疾患（急性及び慢性肝炎や腎炎、関節炎など）に限らず、リウマチ、膠原病などの自己免疫疾患、喘息、花粉症などのアレルギー疾患といった種々の疾患の発症に関与していることも知られている。このため、ＮＦκＢの作用を抑制することによって、ＮＦκＢが関与する症状を緩和できることが予測される。

このため、ステロイド薬剤に代わる薬剤として、また各種の治療剤として、ＮＦκＢの作用を抑制する物質の開発が、天然抽出物や合成物質などを中心に進められている（例えば、特許文献１乃至３など）。
また、特許文献４には、ＮＦκＢの特にｐ６５サブユニットに着目し、このｐ６５サブユニットに結合するＲｅ１Ａ結合性阻害因子を用いることによって、ＮＦκＢの活性を阻害する技術が記載されている。
特開平８−３１９２３８号公報特開平９−５９１５１号公報特開平１１−２７９０５７号公報特開２０００−２２４９９３号公報

しかしながら、各種の天然抽出成分や合成物質では、複雑な細胞内機構やカスケードの一部に関与しているとしてもＮＦκＢに対して直接作用するものではなく、またどのようにＮＦκＢを抑制するかについて完全に解明されてはいない。このためＮＦκＢを確実に抑制するという観点からは充分なものではない。
またＲｅ１Ａ結合性阻害因子を用いた技術では、実際のＲｅ１Ａ結合性阻害因子は、その分子量が４万のタンパク質（３５１アミノ酸）であるため、外部から細胞内に取り込ませることは難しい。

更に、ステロイド剤は、有用な薬剤であることには変わりない。その上、これまでの長い間にわたって広く使用されているので、薬効に関する情報が多く、使い勝手がよいという利点を有している。このため、ステロイド剤に種々の副作用があるとしても、使用量を調整することによって、副作用を抑制しつつ使用が継続されれば、より有効な治療を行うことが期待される。

従って、本発明の目的は、ＮＦκＢの作用を確実に且つ効果的に抑制することができるＮＦκＢ作用抑制剤を提供することである。
また、本発明の他の目的は、より効果的な抗炎症効果を有する抗炎症剤を提供することである。
本発明の更に他の目的は、ステロイドの作用を効果的に増強し、ステロイド剤の使用量を減らすことができるステロイド作用増強剤を提供することである。
また更に、本発明の目的は種々の用途を有する有用な薬学的組成物を提供することである。

本発明のＮＦκＢ作用抑制剤は、ＭＴＩ−IIをコードする核酸又はそのペプチドを含むことを特徴としている。
ここで、前記ＭＴＩ−IIが配列番号１の核酸又は配列番号２のペプチドであることが好ましく、配列番号３のペプチドを少なくとも含むものであることが特に好ましい。
また本発明の抗炎症剤は、ＭＴＩ−IIをコードする核酸又はそのペプチドを含むことを特徴としている。
更に本発明のステロイド作用増強剤は、ＭＴＩ−IIをコードする核酸又はそのペプチドを含むことを特徴としている。

本発明によれば、ＮＦκＢ作用抑制剤及び抗炎症剤のそれぞれに含まれるＭＴＩ−IIをコードする核酸又はそのペプチドが、ＮＦκＢの活性化機序に核内で直接的に抑制的に作用するため、効果的に且つ確実にＮＦκＢの作用を抑制することができ、また抗炎症効果を効果的に発揮することができる。
また本発明によれば、ＭＴＩ−IIをコードする核酸又はそのペプチドが、ステロイド受容体の転写活性を増大させてステロイド作用を効果的に増強するので、ステロイド剤の効果を増強させ、その結果、使用量を減らすことができる。
更に本発明によれば種々の用途を有する有用な薬学的組成物を提供することができる。

本発明の実施例にかかるＭＴＩ−IIによるＴＮＦα誘導ＮＦκＢ転写活性抑制効果を示すグラフである。本発明の実施例にかかるＭＴＩ−IIによるコアクチベータ存在下でのＴＮＦα誘導ＮＦκＢ転写活性抑制効果を示すグラフである。図３Ａは、本発明の実施例にかかるＭＴＩ−IIの効果を調べるために作製された各種ＭＴＩ−II変異体ベクターの概略図であり、図３Ｂは、図３Ａに示される各種ＭＴＩ−II変異体ベクターを用いたＴＮＦα誘導ＮＦκＢ転写活性抑制効果を示すグラフである。本発明の実施例にかかるＨｉｓＴａｇ−ＴＡＴ−ＭＴＩ−IIの構造を示す図である。本発明の実施例にかかるＨｉｓＴａｇ−ＴＡＴ−ＭＴＩ−ＩＩによるＴＮＦα誘導ＮＦκＢ転写活性抑制効果を示すグラフである。

本発明のＮＦκＢ作用抑制剤は、ＭＴＩ−IIをコードする核酸又はそのペプチドを含むことを特徴としている。
ＭＴＩ−IIは、ラット肝臓にて見出されたステロイド受容体核結合阻害因子であり（Biochem. Biophys. Res. Commun., (1982), 108, 1655-1660）、そのアミノ酸配列を解析したところ、パラサイモシン（Proc. Natl. Acad. Sci., (1985), 82, 1050-1053）及び亜鉛結合タンパク質（J. Biol Chem., (1886), 261, 5892-5900）と同一であることが確認されている（Eur. J. Biochem., (2000), 267, 155-162）。本発明者らは、このＭＴＩ−IIが、ステロイド受容体と核内で結合して、ＮＦκＢの転写活性を制御するＳＲＣ−１やＣＢＰ／ｐ３００などのコアクチベータに作用し、ＮＦκＢの転写活性を効果的に抑制していることを見出した。

本発明にかかるＭＴＩ−IIは、配列番号１の核酸（Gene Bank Accession No. M24398: Human parathymosin mRNA, complete cds.）又はこれに基づくアミノ酸配列（配列番号２）を有するペプチドであることが好ましい。ただし、生体内では１番目のメチオニンが翻訳後修飾で外れ、２番目のセリンがアセチル化修飾されて、修飾型（アセチル化）ＭＴＩ−IIペプチドとなる。本発明では、この修飾型ＭＴＩ−IIペプチドを直接用いてもよい。

ＭＴＩ−II自体は、１０２個のアミノ酸配列で構成された小さなポリペプチドであり、サイモシン類似領域（１−３１番目）と、酸性アミノ酸領域（３２−７５番目：配列番号３、８４−９０番目：配列番号４）と、核移行シグナル領域（７９−８１番目：配列番号５、９２−９６番目：配列番号６）とを含んでいる。サイモシン類似領域とサイモシンのホモロジーはアミノ酸レベルで５０％程度である。ＭＴＩ−IIにおけるＮＦκＢ活性抑制作用を有する部位は、酸性アミノ酸領域（配列番号３及び４）であると思われ、従って、少なくとも配列番号３で示される酸性アミノ酸領域を含んでいればよいが、核内移行の観点から配列番号３及び４の双方（３２−９０番目の配列）と核移行シグナル領域（配列番号５及び６の少なくとも一方、好ましくは双方）とを含んでいることが好ましい。
本発明における上記ＭＴＩ−IIは、ＭＴＩ−IIの活性を損なわない付加、削除、変換を含むものであってもよい。

本発明のＮＦκＢ作用抑制剤に含まれるＭＴＩ−ＩＩが核酸である場合には、適当な発現系によって機能的なＭＴＩ−IIペプチドを発現することができればよく、ＤＮＡ、ＲＮＡ又はこれらに類する核酸であってもよい。この場合、発現系としてＭＴＩ−IIをコードするｃＤＮＡを適当なベクター中の適当なプロモーターの下硫に挿入した発現ベクターを作製し、リポソーム等で細胞内に導入すればよい。この結果、細胞内に機能的なＭＴＩ−IIを発現させることができる。このために使用可能なベクター及びプロモーターは、後述するものをそのまま用いることができる。

本発明のＮＦκＢ作用抑制剤の投与量は、年齢、体重、症状、治療効果、投与方法、投与部位、処理時間等により異なるが、核酸分子或いはペプチドとして、通常、成人一人あたり、一回につき１０μｇから１００ｍｇの範囲で、一日一回から数回経口投与されるか、または成人一人あたり、一回につき１μｇから１００ｍｇの範囲で、一日一回から数回非経口投与される。ただし、前記したように投与量は種々の条件により変動するので、上記投与量より少ない量で十分な場合もあるし、また範囲を超えて必要な場合もある。

本発明におけるＭＩＴ−IIは、天然物（生体又は培養物）から精製したものを使用してもよく、またその核酸配列又はアミノ酸配列に従って得られたものであってもよい。核酸配列又はアミノ酸配列に従って得る場合には、アミノ酸配列に従ってペプチド合成してもよく、核酸配列を用いた遺伝子組換え技術により生産してもよい。純度や工業的な観点から遺伝子組換え技術による生産が好ましい。

遺伝子組み換え技術を用いてペプチドを生産するための発現系（宿主−ベクター系）としては、例えば、細菌、酵母、昆虫細胞および哺乳動物細胞の発現系が挙げられる。
例えば、大腸菌で発現させる場合には、成熟タンパク部分またはプロフォームタンパク部分をコードするｃＤＮＡの５'末端に開始コドン（ＡＴＧ）を付加し、得られたｃＤＮＡを、適当なプロモーターの下流に接続し、大腸菌内で機能するベクターに挿入して発現ベクターを作製する。
ここで用いられるプロモーターとしては、例えば、ｔｒｐプロモーター、ｌａｃプロモーター、λＰＬプロモーター、Ｔ７プロモーターなどを挙げることができ、ベクターとしては、例えば、ｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９などを挙げることができる。

次に、この発現ベクターで形質転換した大腸菌を適当な培地で培養して、その菌体より目的とするポリペプチドを得ることができる。また、バクテリアのシグナルペプチドを利用すれば、ペリプラズム中に目的とするポリペプチドを分泌することもできる。更に、他のポリペプチドとのフュージョン・プロテイン（fusion protein）を生産することもできる。
ここで用いられる大腸菌としては、例えば、E. Coli ＤＨ５α、E. Coli ＪＭ１０９、E. Coli ＨＢ１０１株などをあげることができ、シグナルペプチドとしては、例えば、ｐｅｌＢのシグナルペプチドを挙げることができる。

また、哺乳動物細胞で発現させる場合には、例えば、配列番号１で示される塩基配列をコードするｃＤＮＡを適当なベクター中の適当なプロモーターの下流に挿入して発現ベクターを作製する。次に、得られた発現ベクターで適当な哺乳動物細胞を形質転換し、形質転換体を適当な培地で培養することによって、その培養液中に目的とするペプチドが分泌される。以上のようにして得られたペプチドは、一般的な生化学的方法によって単離精製することができる。
ここで用いられるベクターとしては、例えば、レトロウイルスベクター、パピローマウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター、ＳＶ４０系ベクターなどをあげることができ、その中の適当なプロモーターとしては、例えば、ＳＶ４０プロモーター、ＳＲαプロモーター、ＬＴＲプロモーター、メタロチオネインプロモーターなどを挙げることができる。また、ここで用いられる哺乳動物細胞としては、例えば、ヒト未分化好酸球白血病ＥＯＬ細胞、ＨｅＬａ細胞、ＣＶ−１細胞、ＣＯＳ−７細胞、ＣＨＯ細胞、マウスＬ細胞などを挙げることができる。

本発明のＮＦκＢ作用抑制剤は、細胞内へのＭＴＩ−IIの導入を促進する導入手段を備えたものであることが好ましい。これにより、本発明の薬剤におけるＭＴＩ−IIの細胞内への導入が促進されて、ＮＦκＢの作用を効果的に抑制することができる。

このような細胞内導入手段としては、好ましくは、ＭＴＩ−ＩＩ分子に直接付加されたものであり、例えばタンパク質導入ドメインを挙げることができる。この場合、ＮＦκＢ作用抑制剤は、ＭＴＩ−II分子として、タンパク質導入ドメイン融合ＭＴＩ−IIタンパク質を含む。
このようなタンパク質導入ドメイン（Protein Transduction Domain：ＰＴＤ）としては、細胞膜透過性を付与することができるすべての物質を挙げることができ、好ましくは７〜１１個のアミノ酸からなるペプチド、例えば、ＨＩＶ−ＴＡＴ（配列番号７）、ＨＳＶ／ＶＰ２２（配列番号８）、ＡＮＴＥＮＮＡＰＥＤＩＡ（配列番号９）、ポリアルギニン等を挙げることができる。

ＰＴＤの融合箇所は、ＭＴＩ−IIペプチドのＮ末端又はＣ末端のいずれであってもよいが、ＭＴＩ−IIのＮＦκＢ作用抑制作用や抗炎症作用が中央部からＣ末端側にあると考えられ、またＭＴＩ−IIの核移行シグナルの１つがＣ末端側にあるので、これらの領域への影響が少ないＮ末端側に融合させることが好ましい。
また、ＰＴＤは、直接的な化学結合によって、又はリンカー分子を介して融合したものであってもよい。リンカー分子を用いる場合には、リンカー分子は２つのドメインを連結させることのできる２価の化学構造物であればよく、短いペプチド、例えば、１〜２０個のアミノ酸残基、好ましくは１〜１０個のアミノ酸残基を有するものが好ましい。

タンパク質導入ドメイン融合ＭＴＩ−IIは、ペプチドを化学合成して作製してもよいが、遺伝子工学的に作製することが、純度よく、大量に且つ容易に得ることができるため、好ましい。このような融合タンパク質の製造は、前述した方法と同様の方法で、当業者は容易に実施することができる。

なお、他の細胞内導入手段としては、リポソームを挙げることができる。この場合、常法に従って、ＭＴＩ−IIをリポソーム内に導入し、次いで細胞内に導入する。ここで用いられるリポソームとしては、細胞内に物質を導入することができればいずれのものであってもよいが、細胞膜への親和性が高い膜融合タンパク質をリポソーム表面に有する膜融合リポソームであることが好ましい。これにより、いっそう効果的に細胞内にＭＴＩ−IIを導入することができる。このような膜融合タンパク質としてはセンダイウィルス膜融合タンパク質などを挙げることができる。

また本発明のＮＦκＢ作用抑制剤は、ＭＴＩ−IIに加えてステロイド剤を含むことができる。ＭＴＩ−IIはステロイド剤と併用することによって協調的に作用し、より効果的にＮＦκＢの作用を抑制することができる。
ここでステロイド剤を含むとは、同一の薬剤中に同時に存在する場合に限らず、ステロイド剤とＭＴＩ−IIとの二剤で構成されたものも含む。二剤で構成された場合には、個別に投与された後に、体内で同時に存在し、同一の薬剤として投与した場合と同様の効果を得ることができる。

ここで用いられるステロイド剤としては、通常、生体内でステロイド作用を発揮するもの、特にステロイド受容体に高い親和性で結合して、ステロイド作用を発揮するものといった、この分野でステロイド剤として認識されているものすべて（天然物および合成物の双方を含む）を挙げることができ、例えば、トリムシノロンアセトニド、デキサメサゾン、リン酸デキサメサゾンナトリウム、パルミチン酸デキサメサゾン、ベタメタゾン、リン酸ベタメタゾンナトリウム及び酢酸ベタメタゾンなどの合成ステロイドや、ヒドロコルチゾン、酢酸フルドコルチゾン、コハク酸ヒドロコルチゾンナトリウム、リン酸ヒドロコルチゾンナトリウムなどの生理的ステロイドの合成化合物が挙げられるが、これらに限定されない。これらのステロイド剤は、市販のものをそのまま使用することができる。

本発明のＮＦκＢ作用抑制剤におけるステロイド剤の配合量は、各種ステロイド剤の最終濃度に応じて決定することができ、ステロイド剤の濃度は、各種ステロイド剤として通常使用される標準使用量から得られる濃度をそのまま適用することができる。その場合には、ＭＴＩ−IIによってステロイド剤の効果が増強されているため、通常使用される標準使用量による効果よりも高い効果を期待することができる。また、通常使用される標準使用量による効果と同等の効果を得るためには、ステロイド剤の使用量を減らすことができる。この場合には、ＭＴＩ−IIにより増強される効果の割合に応じて決定することができ、例えば、通常使用される標準使用量の１／２の量から１／１０の量とすることができる。

本発明のＮＦκＢ作用抑制剤には、薬学的に許容可能な賦形剤及び／又は担体を更に含むことができる。このような賦形剤及び担体の種類及び量は、後述するＮＦκＢ作用抑制剤の剤形に応じて、当業界でこの用途に通常用いられる既知のものから適宜選択することができる。

ＮＦκＢ作用抑制剤の剤形としては、経口投与のための固体組成物、液体組成物およびその他の組成物、非経口投与のための注射剤、外用剤、坐剤等が挙げられ、経口投与のための固体組成物としては、錠剤、丸剤、カプセル剤、散剤、顆粒剤、溶液剤等を挙げることができ、更にカプセルは、ソフトカプセルおよびハードカプセルであってもよい。これらの製造方法は、当業界で既知の方法に従って行うことができる。
また本発明のＮＦκＢ作用抑制剤は、簡便に適用部位への投与が可能な経皮吸収剤として用いることが好ましく、このような経皮吸収剤の製剤形態としては、従来外用剤として慣用されている剤型、例えばテープ剤、パッチ剤、パップ剤、軟膏剤、クリーム剤、ローション剤、液剤、ゲル製剤等の剤型の外用剤として使用できる。これらの剤型の外用剤は、通常の粘着剤、基剤等を用いて、通常の方法で製造することができる。

本発明のＮＦκＢ作用抑制剤は、ステロイド受容体の転写活性を上げてＮＦκＢの作用を抑制する作用を奏するため、これに応じた種々の活性を有している。このような活性としては、抗炎症活性、抗アレルギー活性、抗自己免疫活性が挙げられる。

この抗炎症活性は、当業界で既知の方法に従ってその活性の有無を確認することができる。このような確認方法としては、例えば炎症性サイトカイン（ＴＮＦαなど）の刺激に対するＮＦκＢの転写活性低下作用などを挙げることができる。

本発明の抗炎症剤は、ＭＴＩ−IIをコードする核酸又はそのペプチドを含むものである。ＭＴＩ−IIをコードする核酸又はそのペプチドを始めとして、本発明のＮＦκＢ作用抑制剤で記載した内容をそのまますべて、本発明の抗炎症剤に対しても適用することができる。特に、上述したステロイド剤を更に含む抗炎症剤では、ステロイド剤とＭＴＩ−IIを併用することになるため、ＭＴＩ−IIのステロイド増強効果が発揮されて、より高い抗炎症効果を期待することができる。

本発明の抗炎症剤の作用は、上述したように各種炎症性サイトカインの刺激に対する緩和を指標として、評価することができる。

本発明のステロイド作用増強剤は、ＭＴＩ−IIをコードする核酸又はそのペプチドを含むものである。ＭＴＩ−IIをコードする核酸又はそのペプチドを始めとして、本発明のＮＦκＢ作用抑制剤で記載した内容をそのまますべて、本発明のステロイド作用増強剤に対しても適用することができる。

本発明のステロイド作用増強剤が増強するステロイドは、いわゆるステロイド剤（外因性ステロイド）であってもよく、生体内に存在するステロイド骨格を有する化合物（内因性ステロイド）であってもよい。ステロイド剤を対象とする場合には、本ステロイド作用増強剤が使用される前後或いは同時に、ステロイド剤を投与すればよい。また内因性ステロイドを対象とする場合には、対象となる内因性ステロイドが存在する環境下に、本ステロイド作用増強剤を投与すればよい。

本発明で用いられるＭＴＩ−IIは、ごく小さく簡単な構造を有しているので、簡便に投与することができると共に、ＮＦκＢに直接作用することができるため、効果的に使用することができる。このため、ステロイド剤を使用する場合のような多様な反応性を考慮する必要がない。従って、抗炎症剤として効果的に使用することができる。

また抗炎症剤に限らず、ＮＦκＢの作用抑制にかかる炎症性疾患（急性及び慢性肝炎や腎炎、関節炎など）、リウマチ、膠原病などの自己免疫疾患、喘息、花粉症などのアレルギー疾患といった種々の疾患においても、有効にその症状の緩和効果をもたらすことができるため、これらの症状に対する各種薬剤として使用することもできる。従って、ＭＴＩ−IIをコードする核酸又はそのペプチドを含む本発明の薬学的組成物は、このような各種薬剤としての作用を有するものであり、広い用途に使用できるものである。

更に、ＭＴＩ−IIは、心臓、肝臓、腎臓に多く発現していることから、本発明の各種薬剤及び薬学的組成物を、これらの組織に特異的に投与する又は送り込むことによって、より強い効果を期待することができる。また、組織間での発現量に相違があることから、ＭＴＩ−IIの少ない組織にＭＴＩ−IIの作用を強く発揮させることによって、高い効果を期待することができる。

このＭＴＩ−IIのアンチセンス配列は、細胞中のＭＴＩ−IIタンパク質のレベルを制御するために使用することができる。この場合には、ＭＴＩ−IIをコードする核酸の一部又は全部をアンチセンス方向に上記ベクターに挿入する方法や、Ｕ６プロモーターを５'上流に接続したＤＮＡ若しくは２本鎖ＲＮＡを細胞内に注入する方法等によって、アンチセンス配列を容易に作成し、細胞内で利用することができる。
以下に本発明の実施例について説明するが、これに限定されるものではない。また実施例中の％は、特に断らない限り、重量（質量）基準である。

ＭＴＩ−IIのペプチド投与実験
配列番号１のＭＴＩ−II（Gene Bank Accession No. M24398）を文献（Eur. J. Biochem., (2000), 267, 155-162）の精製手法に従って、精製した。１．０ｍｇ／ｍｌの濃度で生理的食塩水に溶解し、５週齢のＩＣＲマウス、雄５匹（平均体重２８．４ｇ）と雌５匹（平均体重２５．０ｇ）の腹腔内に１０ｍｇ／ｋｇ体重となるように投与した。対照として同週齢の雄２匹と雌２匹に生理的食塩水を投与した。投与後、２４時間（８時間毎、計３回）にわたり行動異常の有無を観察した。投与２４時間目に屠殺、解剖し、肝臓、腎臓、脾臓、小腸、大腸、胸腺の腫脹および腹腔内の血管の腫脹を肉眼的に観察した。結果、すべての検体において行動異常および肝臓、腎臓、脾臓、小腸、大腸、胸腺、血管の腫脹は確認できなかった。

ＤＮＡコンストラクション
ＤＮＡトランスフェクションに使用したＭＴＩ−II発現ベクター（ｐＴｒｉ−ＭＴＩ）は、以下のようにして作製した。
ＭＴＩ−II（配列番号１；Gene Bank Accession No. M24398）のｃＤＮＡを、ＲＴ−ＰＣＲ法によって、ＨｅＬａ細胞より摂取したｍＲＮＡから増幅した。増幅したＭＴＩ−IIのｃＤＮＡを、ｐＴｒｉＥｘ−４ベクター（Novagen社、カタログ番号：70824-3）のNco I−Hind III部位に組み込んで、ＭＴＩ−II発現ベクター（ｐＴｒｉ−ＭＴＩ）を構築した。ステロイド受容体（ＧＲ）発現ベクター（ｐＴｒｉ−ＧＲ）は、ラットｍＲＮＡからＲＴ−ＰＣＲ法で増幅したＧＲのｃＤＮＡ（Gene Bank Accession No. M14053）を、ｐＴｒｉＥｘ−４ベクターのBgl II−Not I部位に組み込んで構築した。
コントロール用プラスミド（ｐＴｒｉ−ＮＣ）は、ｐＴｒｉＥｘ−４ベクターをXcm I、EcoR Iで切断除去した後にセルフライゲーションを行って構築した。ＮＦκＢ依存性ルシフェラーゼ発現プラスミド（ＮＦκＢ−Ｌｕｃ）はクローンテック社（カタログ番号：6053-1）、コントロール用ウミシイタケ・ルシフェラーゼ発現プラスミド（ｐＲＬ−ＴＫ）はプロメガ社（カタログ番号：E2241）より購入した。

ＤＮＡトランスフェクション
各種ＤＮＡのトランスフェクションは、プロメガ社のＴｒａｎｓＦａｓｔ（商品名、カタログ番号：E2431）トランスフェクションプロトコールに基本的に従って行った。以下にこれを簡単に説明する。
ＣＯＳ−７細胞を、６ウェルプレート（ファルコン社製、カタログ番号：35-3046）の１ウェルあたり３．５個〜３．８個×１０⁵細胞となるように播種し、５６℃非動化１０％ＦＢＳ（ウシ胎児血清；ハイクローン社製、カタログ番号：SH30070.03）を添加したＤＭＥＭ培地中で５％ＣＯ₂及び３７℃の条件下で培養した。１８時間後に、チャコール・デキストラン処理（Ｃ／Ｄ処理）したＦＢＳ（Ｃ／Ｄ−ＦＢＳ、ハイクローン社製、カタログ番号：SH30068.03）入りのＤＭＥＭ培地に換えた。

実施例２で構築した各プラスミドを、表１に示されるように配合して、各サンプル４．１２μｇに調整し、それぞれをＴｒａｎｓＦａｓｔ（商品名）試薬（１２．３μｌ）と混合して、１０〜１５分間インキュベートした。
各ウェルの培地を交換した後に、表１に示される量に従って各種プラスミドＤＮＡを各ウェルに添加して１時間インキュベートし、各ＤＮＡをＣＯＳ−７細胞にトランスフェクトした。導入効率は、３４％であった。

ルシフェラーゼアッセイ
上述のようにしてＤＮＡをトランスフェクトした細胞に対して、２４時間後に、終濃度１ｎｇ／ｍｌとなるように炎症性サイトカイン（ＴＮＦα、シグマ社製）及び終濃度１２０ｎＭとなるようにステロイド剤（トリアムシノロンアセトニド：ＴＡ、シグマ社製）を添加した。更に２４時間後に細胞内のルシフェラーゼ活性を、デュアル・ルシフェラーゼ定量システム（プロメガ社製）を用い、ルミノメータ（Turner BioSystems TD-20/20、プロメガ社）で測定した。結果を図１に示す。図１では縦軸にＮＦκＢの転写活性を示すルシフェラーゼ活性を示し、黒丸はＴＮＦαのみ添加、黒三角はＴＮＦα及びＴＡ双方を添加、白三角はＴＡのみ添加、白丸はＴＮＦα及びＴＡ双方を添加せず、をそれぞれ示す。

図１に示されるように、ＭＴＩ−IIが含まれていない状態（ＭＴＩ−IIが０μｇ）では、ＴＮＦαのみを添加（黒丸）すると、ＴＮＦα未添加と比較して約１０倍のルシフェラーゼ活性を示し、ＴＮＦαの添加によってＮＦκＢの転写活性が高まることが示された。また、ＴＮＦαに加えてステロイド剤を添加すると、ＮＦκＢ転写が抑制されることが示された。

これに対して、ＭＴＩ−IIを発現させると量に依存してＮＦκＢの転写活性が抑制されることが示された。特に、１μｇ以上の発現ベクターによるＭＴＩ−IIが存在するとＮＦκＢの転写抑制は著しく顕著になり、約２μｇ以上の添加量になると、ステロイドによるＮＦκＢの転写抑制効果よりも効果的であることが明らかとなった。
また、ＭＴＩ−IIとステロイド剤とを併用することによって、ＮＦκＢ作用をより一段と抑制することができた。このことは、ＭＴＩ−IIによってステロイド剤の効果が増強されることを示している。

従って、ＭＴＩ−IIには、効果的なＮＦκＢ作用抑制効果があることが明らかである。またステロイド剤と併用することによって、その抑制効果を高めることができることも明らかである。このため、ＭＴＩ−IIを含む本発明のＮＦκＢ作用抑制剤及び抗炎症剤を用いれば、効果的に且つ確実にＮＦκＢの作用を抑制し、また抗炎症効果をえることができる。更に、ステロイド剤の効果を増強することができるので、ステロイド剤の使用量を減らしても、同等の効果をもたらすことができる。

ＭＴＩ−IIのコアクチベータ存在下でのＮＦκＢ作用抑制効果
次に、ＭＴＩ−IIの作用部位を確認するために、ＮＦκＢの転写活性に作用するコアクチベータｐ３００の発現時におけるＭＴＩ−IIの作用について調べた。
コアクチベータｐ３００発現プラスミド（ｐＣＭＶβ−ｐ３００）は、アップステート社より購入した。ＤＮＡトランスフェクションは、ＤＮＡ量をそれぞれ２．０μｇとし、ｐＴｒｉ−ＮＣ又はｐＴｒｉ−ＭＴＩを１．０μｇとした以外は実施例３と同様にして行い、ＮＦκＢ転写活性測定は、実施例４と同様にして行った。結果を図２に示す。

図２に示されるように、ｐ３００の発現時ではＴＮＦαを添加するとＮＦκＢの転写活性は著しく高くなる（図３中央）。このとき、ステロイド剤を添加することによってＮＦκＢの活性は約半分に抑制することができた（図３中央）。
これに対してｐ３００と共にＭＴＩ−IIを発現させた場合及び更にステロイド剤を添加した場合では、それぞれＭＴＩ−IIを発現させなかった場合と比較して、ＮＦκＢの活性は約半分以上まで抑制された（図３右）。特に、ステロイド剤と併用した場合には、コアクチベータが発現している場合であってもコアクチベータ不存在時（図３左）の約半分までＮＦκＢの活性を抑制することができた。
従って、ＭＴＩ−IIは、コアクチベータ存在時であってもＮＦκＢの転写活性を確実に且つ効果的に抑制することができた。

酸性アミノ酸領域のＮＦκＢ作用抑制効果
次に、ＭＴＩ−IIによるＮＦκＢ作用抑制効果がＭＴＩ−IIアミノ酸のうちのどの領域によって行われているかを確認した。
図３Ａに示されるように、ＭＴＩ−IIのアミノ酸領域は、サイモシン類似領域と、酸性アミノ酸領域（配列番号３及び４）と、核移行シグナル領域（配列番号５及び６）とを含んでいる。このため、Ｎ末端側のサイモシン類似領域とＣ末端側の核移行シグナル（配列番号６）を含み、酸性アミノ酸領域を欠損した変異体［ＭＴＩ（ＴＨ）］と、酸性アミノ酸領域（配列番号３及び４）を含み、Ｎ末端側のサイモシン類似領域を欠損した変異体［ＭＴＩ（ＡＲ）］と、核移行シグナル（配列番号５及び６）を含み、Ｎ末端側のサイモシン類似領域及び中央部の酸性アミノ酸領域（配列番号３）を欠損した変異体［ＭＴＩ（ＮＬＳ）］をそれぞれ細胞内で発現するベクターを作製した。

それぞれの変異体のベクターＤＮＡ（３．０μｇ）とＮＦκＢ依存性ルシフェラーゼ発現プラスミド（１．０μｇ）とを、実施例３及び４と同様にして、ＣＯＳ−７細胞にトランスフェクトし、細胞内のルシフェラーゼ活性を測定した。結果を図３Ｂに示す。

図３Ｂに示されるように、ＴＮＦαのみを添加した場合及びステロイド剤を併用した場合の双方において、ＭＴＩ（ＴＨ）及びＭＴＩ（ＮＬＳ）の両方と比較して、ＭＴＩ（ＡＲ）ではＮＦκＢ作用抑制効果が大きかった。従って、ＭＴＩ−IIのうち、酸性アミノ酸領域がＮＦκＢ作用抑制効果に寄与していることが明らかとなった。
従って、ＭＴＩ−IIを用いる場合には、サイモシン類似領域が含まれていなくてもＮＦκＢ作用抑制効果が得られることが明らかとなった。

ＴＡＴ−ＭＴＩ−II融合タンパク質の合成
ＨｉｓＴａｇ−ＴＡＴ−ＭＴＩ−ＩＩ融合タンパク質を、以下のようにして得た。
pTriEx-4ベクターのPst I−Hind IIIサイトにＭＴＩ−IIのｃＤＮＡをインサートして、ＨｉｓＴａｇ−ＭＴＩ−II発現ベクターを作成した。次にこの発現ベクターのXcm I−Pst IサイトにＴＡＴｃＤＮＡ配列を含む合成ＤＮＡ（配列番号１０：CTCTGGTCCCCCGGGGCAGCCGTCGTCGTCAACGTCGTAAAAAACGTGGTCTGCA）をインサートした。このＨｉｓＴａｇ−ＴＡＴ−ＭＴＩ−II発現ベクターを大腸菌（Rosetta2 pLacI cell, Novagen社）にトランスフェクトし、ＩＰＴＧ存在下でＨｉｓＴａｇ−ＴＡＴ−ＭＴＩ−IIタンパク質を大量発現させた。大腸菌を大腸菌発現タンパク質抽出試薬BugBuster（Novagen社）で溶解した後、ＨｉｓＴａｇに対するアフィニティーカラム（Clontech社）および陰イオン交換体（MonoQカラム、アマシャムバイオサイエンス社）と陽イオン交換体（MonoSカラム、アマシャムバイオサイエンス社）で、電気泳動的に単一にまで精製した。これによってＨｉｓＴａｇ−ＴＡＴ融合ＭＴＩ−IIタンパク質（ＨｉｓＴａｇ−ＴＡＴ−ＭＴＩ−II）を得た（配列番号１１、図４参照）。

ＴＡＴ−ＭＴＩ−IIタンパク質の細胞導入
ＨｅＬａ細胞を６−ｗｅｌｌプレートに１ｗｅｌｌ当り２．０×１０⁵細胞になるように蒔いて、１０％ＦＢＳ(fetal bovine serum: 牛胎児血清)入りのＤＭＥＭ（HyClone社製）培養液で１８時間培養した。その後、培養液をチャコール・デキストラン処理（Ｃ／Ｄ処理）したＦＢＳ（Ｃ／Ｄ−ＦＢＳ）入りの培養液に交換した。更に２４時間後に、下記表２に示される量に従って配合した各種プラスミドＤＮＡを各ウェルに添加して、このＨｅＬａ細胞にＮＦκＢ−Ｌｕｃ遺伝子をトランスフェクトした。

トランスフェクション２４時間後に、各ウェルのＨｅＬａ細胞に対して、実施例７で作成されたＨｉｓＴａｇ−ＴＡＴ−ＭＴＩ−II融合タンパク質を表３に示される量に従って添加し、その６時間後に炎症性サイトカイン（ＴＮＦα、シグマ社製）を１ｎｇ／ｍｌの量で更に添加した。２４時間後に、実施例４と同様にして、細胞内のルシフェラーゼ活性をデュアル・ルシフェラーゼ定量システム（プロメガ社製）により定量した。結果を図４に示す。

図５に示されるように、ＴＮＦαと共にＨｉｓＴａｇ−ＴＡＴ−ＭＴＩ−IIを添加した場合には、ＴＡＴ−ＭＴＩ−IIの用量に依存して、ＮＦκＢの転写活性が抑制された。このことは、タンパク質導入ドメインとしてＴＡＴを融合させることによって、ＭＴＩ−II分子は、細胞内に効果的に輸送されて、ＮＦκＢ作用を抑制したことを示している。従って、タンパク質導入ドメインを融合したＭＴＩ−IIは、細胞内に効率よく取り込まれて本発明の作用を発揮できることが明らかとなった。

ウサギ（New Zealand White種）３羽に一次感作としてovalbumin (OVA) ＋完全フロイントアジュバント（Freund's complete adjuvant ；ＦＣＡ）を背部に１回皮内投与した。２週間後に、二次感作としてＯＶＡ＋ＦＣＡを背部に１回皮内投与した。さらに惹起投与として二次感作の５日後にＯＶＡを右膝関節内に１回投与した。ＨｉｓＴａｇ−ＴＡＴ−ＭＴＩ−II溶液（０．４ｍｇ／ｍｌＰＢＳ溶液）をＯＶＡ惹起投与1日前より、１日おきに右膝関節内に投与した。ただし、ＯＶＡ惹起投与翌日より５日間は毎日１回投与した。投与期間は１４日間（投与回数：計１０回）で、対照群にはＰＢＳを右膝関節内に投与した。血液沈降速度測定と両膝関節の病理標本より抗炎症作用の検討を行った。これらの結果は、ＴＡＴ−ＭＴＩ−II溶液投与群における抗炎症効果を示唆している。

これらの実施例で示されるように、ＭＴＩ−II、少なくともその酸性アミノ酸領域を用いることによって確実に且つ効果的にＮＦκＢの作用を抑制することができた。この効果は、ＤＮＡと同様にペプチドを投与することによっても得ることができる。従って、ＭＴＩ−IIを含む本発明のＮＦκＢ作用抑制剤及び抗炎症剤は、確実に且つ効果的にＮＦκＢの作用を抑制することができ、また炎症反応を抑制し、ＮＦκＢに関連する他の状態を緩和することができる。
またステロイド剤との併用を行うことによって、ステロイド剤の作用を増強することから、使用するステロイド剤の量を減らして同等の効果を奏することができる。

Claims

ＭＴＩ−ＩＩをコードする核酸又はそのペプチドを有効成分として含むＮＦκＢ作用抑制剤。
前記ＭＴＩ−ＩＩが、配列番号１の核酸であることを特徴とする請求項１記載のＮＦκＢ作用抑制剤。
前記ＭＴＩ−ＩＩが、配列番号２のペプチドであることを特徴とする請求項１記載のＮＦκＢ作用抑制剤。
前記ＭＴＩ−ＩＩが、配列番号３のペプチドを少なくとも含むものであることを特徴とする請求項１記載のＮＦκＢ作用抑制剤。
前記ＭＴＩ−ＩＩが、タンパク質導入ドメイン融合ＭＴＩ−ＩＩであることを特徴とする請求項１乃至４のいずれか１項記載のＮＦκＢ作用抑制剤。
ステロイド剤を更に含む請求項１乃至５のいずれか１項記載のＮＦκＢ作用抑制剤。
前記ＭＴＩ−ＩＩが、配列番号５及び／又は配列番号６のペプチド、又はそれをコードする核酸を少なくとも含むものであることを特徴とする請求項１乃至６のいずれか１項記載のＮＦκＢ作用抑制剤。
ＭＴＩ−ＩＩをコードする核酸又はそのペプチドを有効成分として含む抗炎症剤。
前記ＭＴＩ−ＩＩが、配列番号１の核酸であることを特徴とする請求項８記載の抗炎症剤。
前記ＭＴＩ−ＩＩが、配列番号２のペプチドであることを特徴とする請求項８記載の抗炎症剤。
前記ＭＴＩ−ＩＩが、タンパク質導入ドメイン融合ＭＴＩ−ＩＩであることを特徴とする請求項８乃至１０のいずれか１項記載の抗炎症剤。
更にステロイド剤を含む請求項８乃至１１のいずれか１項記載の抗炎症剤。
前記ＭＴＩ−ＩＩが、配列番号５及び／又は配列番号６のペプチド、又はそれをコードする核酸を少なくとも含むものであることを特徴とする請求項８乃至１２のいずれか１項記載の抗炎症剤。
ＭＴＩ−ＩＩをコードする核酸又はそのペプチドを有効成分として含むステロイド作用増強剤であって、ここで、前記ＭＴＩ−ＩＩをコードする核酸又はそのペプチドが、ＭＴＩ−ＩＩの酸性アミノ酸領域をコードする核酸又はそのペプチドを含む当該ステロイド作用増強剤。
前記ＭＴＩ−ＩＩの酸性アミノ酸領域が、配列番号３のペプチドを少なくとも含むものであることを特徴とする請求項１４記載のステロイド作用増強剤。
前記ＭＴＩ−ＩＩが、タンパク質導入ドメイン融合ＭＴＩ−ＩＩであることを特徴とする請求項１４又は１５記載のステロイド作用増強剤。
前記ＭＴＩ−ＩＩが、配列番号５及び／又は配列番号６のペプチド、又はそれをコードする核酸を少なくとも含むものであることを特徴とする請求項１４乃至１６のいずれか１項記載のステロイド作用増強剤。