JP4864064B2

JP4864064B2 - 抗糖尿病作用を有するペプチドおよびその用途

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Publication number: JP4864064B2
Application number: JP2008280031A
Authority: JP
Inventors: 恭一香川; 千津子福濱; 純寧童; 由香笹川
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Priority date: 2008-10-30
Filing date: 2008-10-30
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Description

本発明は、血糖値上昇抑制作用およびインスリン分泌亢進作用を有する新規ペプチドに関する。さらに本発明は、上記薬理作用を有するペプチドの各種用途に関する。

体内の血糖値は、インスリンの血糖降下作用とアドレナリン、グルカゴン又は糖質コルチコイド等が有する血糖上昇作用とのバランスによって調節されている。具体的には、インスリンは肝臓でのグリコーゲン分解や糖新生を抑制してグルコース生成量を減少させて肝臓から血中への放出量を減少させるとともに、骨格筋や白色脂肪組織へのグルコースの取り込みを増加させて、血糖値を低下させる。一方、アドレナリンやグルカゴン等は逆に肝臓でのグリコーゲン分解や糖新生を促し肝臓からのグルコースの放出を促進して血糖値を上昇させる。

糖尿病は、上記インスリンの作用が急性的にまたは慢性的に低下することによって、高血糖状態が持続し、糖、脂質及びアミノ酸などの代謝異常を生じる代謝性疾患である。

糖尿病にはインスリン依存型とインスリン非依存型がある。インスリン依存型糖尿病は、インスリン分泌能が低下・消失しているため、食餌療法や経口血糖降下剤では治療効果がなく、インスリンによってのみ治療可能である。一方、糖尿病患者の９割以上を占めるインスリン非依存型の糖尿病は、インスリン作用が正常者よりも低下してはいるものの治療には必ずしもインスリンを必要とせず、食餌療法や運動療法を基本として、それで充分でない場合に血糖降下剤による薬物療法が併用される。

前述するように、糖尿病は高血糖状態が持続することによって代謝異常を招く疾患であるため、同時に眼、腎臓、神経系、心血管系及び皮膚などに種々の合併症を伴うやっかいな疾患である。こうした合併症は、一般に血糖値を正常に近い値に制御することによって減少すると考えられている（非特許文献１）。

高血糖状態を是正する医薬製剤としては、インスリン製剤、スルホニルウレア製剤、ビグアナイド剤、インスリン抵抗性を改善する製剤、及びα−グルコシダーゼ阻害剤などが知られている。ここでインスリン製剤はインスリン依存性糖尿病に対する治療薬であり、確実に血糖値を低下することができるが、低血糖になるおそれもある。スルホニルウレア製剤は、膵臓β細胞を刺激して内因性インスリンの分泌を促進することによって血糖値を低下させる薬物であるが、血糖値とは無関係にインスリンが分泌する結果、副作用として低血糖を招く場合がある。一方、ビグアナイド剤は、肝臓での糖新生の抑制、骨格筋等での糖の利用増大、または糖の腸管吸収を抑制することによって血糖を低下させる薬物であり、健常人や糖尿病患者のいずれにも低血糖症を招かないという利点はあるものの、比較的重篤な乳酸性アシドーシスを起こしやすいという問題がある。インスリン抵抗性を改善する薬剤（例えばチアゾリジン誘導体等）は、インスリン作用を増強し、インスリン受容体キナーゼを活性化することによって血糖値を低下させる薬物であるが、副作用として消化器症状や浮腫などが起こり、赤血球数、ヘマトクリット及びヘモグロビンの低下とＬＤＨの上昇が起こることが指摘されている（非特許文献２）。また、α−グルコシダーゼ阻害剤は、消化管における糖質の消化や吸収を遅延させ食後の血糖上昇を抑制する作用があるが、膨満感、腹鳴、及び下痢などの副作用が問題となっている（非特許文献３）。

このように、現状では糖尿病やその合併症に対して有効な治療または予防方法がいまだ充分に確立されていないといえる。

ところで、最近、血糖値の上昇を抑制する作用（血糖値上昇抑制作用）やインスリンの分泌を亢進させる作用（インスリン分泌亢進作用）を有するペプチドも注目されており、例えば特許文献１〜３には、かかるペプチドを抗糖尿病剤の有効成分とすることが提案されている。
最新医学大辞典、p.1211、1988年、医歯薬出版新しい糖尿病治療薬、90〜99頁、(1994)、医薬ジャーナル社 JOSLIN’S DIABETES MELLITUS 13Th Edition 521-522 特表２００７−５２４５８４号公報ＷＯ２００３／０３０９３６特表２００８−５１９７５８号公報

本発明は、上記の血糖値上昇抑制作用またはインスリン分泌亢進作用を有する新規ペプチドを提供することを課題とする。また本発明は、かかるペプチドを有効成分とすることによって、血糖値上昇抑制作用またはインスリン分泌亢進作用を備えた医薬組成物、食品組成物または飼料組成物を提供することを課題とする。さらに本発明は、これらの組成物を、血糖上昇抑制用組成物、インスリン分泌亢進用組成物、または糖尿病若しくはその合併症の治療または予防用の組成物として提供することを課題とする。

本発明者らは、上記課題を解決すべく日夜鋭意検討していたところ、人為的に高血糖状態にしたマウスに、テトラペプチド(Leu-Ser-Glu-Leu)を投与することにより、有意に血糖値が低下し、高血糖状態が改善されることを見出した。また、さらなる研究により、本発明者らは、そのペプチドLSELの血糖値上昇抑制作用がインスリン分泌亢進作用に起因していることを確認した。

これらの知見から、本発明者らは、上記ペプチドLSELが、糖尿病患者または糖尿病の前状態にある境界型糖尿病患者に対して、その高血糖状態を抑制および改善して（高血糖状態の血糖値を降下させて）、糖尿病やその合併症など、高血糖に起因する疾病の予防または治療のために有効であることを確信した。本発明は、これらの知見に基づいて完成したものである。

すなわち、本発明は下記の態様を包含するものである。

（Ｉ）新規ペプチド
（I-1）Leu-Ser-Glu-Leuで示されるアミノ酸配列からなるペプチド。

（II）組成物
（II-1）（I）に記載するペプチドを有効成分とする医薬組成物、食品組成物または飼料組成物。
（II-2）（I）に記載するペプチドを有効成分とする血糖値上昇抑制用組成物。
（II-3）（I）に記載するペプチドを有効成分とするインスリン分泌亢進用組成物。
（II-4）（I）に記載するペプチドを有効成分とする、高血糖に起因する疾患の予防または治療用組成物。
（II-5）高血糖に起因する疾患が、糖尿病、並びに糖尿病アシドーシス、糖尿病性黄色腫、糖尿病性筋萎縮症、糖尿病性ケトーシス、糖尿病性昏睡、糖尿病性胃障害、糖尿性壊疽、糖尿病性潰瘍、糖尿病性合併症、糖尿病性下痢症、糖尿病性細小血管症、糖尿病性子宮体硬化症、糖尿病性心筋症、糖尿病性ニューロパシー、糖尿病性腎症、糖尿病性水疱、糖尿病性白内障、糖尿病性皮膚障害、糖尿病性浮腫性硬化症、糖尿病性網膜症、糖尿病性リポイド類壊死症、糖尿病性血流障害等の糖尿病の合併症である（II-4）に記載する組成物。
（II-6）高血糖に起因する疾患が、II型糖尿病またはその合併症である（II-4）に記載する組成物。

（１）ペプチド(Leu-Ser-Glu-Leu)
本発明は、Leu-Ser-Glu-Leuのアミノ酸配列からなるテトラペプチド（以下、「ペプチドLSEL」、または「本発明のペプチド」ともいう）を提供する。当該ペプチドは、人為的に高血糖状態にした正常マウスおよび糖尿病モデルマウスに対して行った実験例（後述）で示すように、経口投与および非経口投与によって、血糖値上昇抑制作用およびインスリン分泌亢進作用を発揮する。すなわち、当該ペプチドは、血糖値上昇抑制作用およびインスリン分泌亢進作用を有する生理活性ペプチドである。

本発明のペプチドは、そのアミノ酸配列に従って、一般的な化学合成法により製造することができる。当該方法には、通常の液相法及び固相法によるペプチド合成法が包含される。かかるペプチド合成法は、より詳しくは、本発明で提供するアミノ酸配列情報に基づいて、各アミノ酸を１個ずつ逐次結合させ鎖を延長させていくステップワイズエロゲーション法と、アミノ酸数個からなるフラグメントを予め合成し、次いで各フラグメントをカップリング反応させるフラグメント・コンデンセーション法とを包含する。本発明のペプチドの合成は、そのいずれによることもできる。

上記ペプチド合成に採用される縮合法も、公知の各種方法に従うことができる。その具体例としては、例えばアジド法、混合酸無水物法、ＤＣＣ法、活性エステル法、酸化還元法、ＤＰＰＡ(ジフェニルホスホリルアジド)法、ＤＣＣ＋添加物(1−ヒドロキシベンゾトリアゾール、Ｎ−ヒドロキシサクシンアミド、N−ヒドロキシ−５−ノルボルネン−２,３−ジカルボキシイミド等)、ウッドワード法等を例示できる。これら各方法に利用できる溶媒もこの種ペプチド縮合反応に使用されることがよく知られている一般的なものから適宜選択することができる。その例としては、例えばジメチルホルムアミド(ＤＭＦ)、ジメチルスルホキシド(ＤＭＳＯ)、ヘキサホスホロアミド、ジオキサン、テトラヒドロフラン(ＴＨＦ)、酢酸エチル等及びこれらの混合溶媒等を挙げることができる。

尚、上記ペプチド合成反応に際して、反応に関与しないアミノ酸及至ペプチドにおけるカルボキシル基は、一般にはエステル化により、例えばメチルエステル、エチルエステル、第三級ブチルエステル等の低級アルキルエステル、例えばベンジルエステル、ｐ−メトキシベンジルエステル、ｐ−ニトロベンジルエステルアラルキルエステル等として保護することができる。上記保護基を有するアミノ酸、ペプチド及び最終的に得られる本発明のペプチドにおけるこれら保護基の脱保護反応もまた、慣用される方法、例えば接触還元法や、液体アンモニア／ナトリウム、フッ化水素、臭化水素、塩化水素、トリフルオロ酢酸、酢酸、蟻酸、メタンスルホン酸等を用いる方法等に従って、実施することができる。

かくして得られる本発明のペプチドは、通常の方法に従って、例えばイオン交換樹脂、分配クロマトグラフィー、ゲルクロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー(ＨＰＬＣ)、向流分配法等のペプチド化学の分野で汎用されている方法に従って、適宜その精製を行うことができる。

なお、本発明のペプチドは、上記化学合成法によって製造できるほか、上記アミノ酸配列（Leu-Ser-Glu-Leu）を一部に含むポリペプチドまたはタンパク質を酵素分解または加水分解することによっても調製することもできる。かかるポリペプチドまたはタンパク質の由来は特に制限されず、動物、魚介類および植物のいずれであってもよい。参考までに、日本ＤＮＡデータバンク運営のアミノ酸配列のデータベース「FASTA」から、当該アミノ酸配列（Leu-Ser-Glu-Leu）を一部に含むポリペプチドまたはタンパク質を有する動物、魚介類、および植物を検索した結果を図１に示す。

ペプチドLSELは、前述するように、経口投与および非経口投与により、血糖値上昇抑制作用およびインスリン分泌亢進作用といった生理活性作用（薬理作用）を有するため、医薬組成物、食品組成物または飼料組成物の有効成分として好適に用いることができる。

以下、かかるペプチドLSELを有効成分とする医薬組成物、食品組成物および飼料組成物について説明する。

（２）医薬組成物
本発明の医薬組成物は、上記ペプチドLSELを有効成分として含有することを特徴とする。

本発明が提供する医薬組成物には、血糖値上昇抑制用組成物（血糖値上昇抑制剤）、インスリン分泌亢進用組成物（インスリン分泌亢進剤）、及び高血糖に起因する疾患の予防または治療用組成物（高血糖に起因する疾患の予防または治療剤）が含まれる。

血糖上昇抑制用組成物は、糖尿病患者または糖尿病の前状態にある所謂境界型糖尿病患者の高血糖状態を予防または改善する（血糖値の上昇を抑制する）有効量のペプチドLSELを含有することを特徴とする。またインスリン分泌亢進用組成物は、糖尿病患者または境界型糖尿病患者のインスリン分泌を亢進する有効量のペプチドLSELを含有することを特徴とする。さらに、高血糖に起因する疾患の予防または治療用組成物は、上記血糖値上昇抑制作用またはインスリン分泌亢進作用を発揮して、上記疾患の予防または治療に有効量のペプチドLSELを含有するものである。

本発明の医薬組成物は、上記のペプチドLSELを、血糖値上昇抑制作用またはインスリン分泌亢進作用を発揮する有効量含有するものであれば、ペプチドLSELだけからなるものであってもよいが、通常上記有効成分に加えて薬学的に許容された担体または添加剤とともに調製される。

ここで担体としては、医薬組成物（製剤）の投与形態に応じて通常使用される賦形剤、希釈剤、結合剤、付湿剤、崩壊剤、崩壊抑制剤、吸収促進剤、滑沢剤、溶解補助剤、緩衝剤、乳化剤、懸濁剤などが例示できる。また添加剤としては、製剤の投与形態に応じて通常使用される安定化剤、保存剤、緩衝剤、等張化剤、キレート剤、pH調整剤、界面活性剤、着色剤、香料、風味剤、甘味剤などが例示できる。

またかかる医薬組成物の投与単位形態（医薬製剤形態）は、投与経路に応じて各種適宜選択することができ、これらは大きく経口投与製剤および非経口投与製剤（例えば、経肺投与剤、経鼻剤、舌下剤、注射剤、点滴剤）に分類される。これらは常法に従って、錠剤、丸剤、散剤、粉末剤、顆粒剤、及びカプセル剤などの固体投与形態；溶液、懸濁剤、乳剤、シロップ、及びエリキシルなどの液剤投与形態に、調合、成形乃至調製することができる。また、使用前に適当な担体の添加によって液状となし得る乾燥品として調製されてもよい。これらはいずれも常法に従い調製することができる。

本発明の医薬組成物に配合されるペプチドLSELの割合は、特に制限されないが、通常、各投与形態に応じて約0.1〜80重量％程度を含有する製剤形態に調製することができる。

このようにして得られる医薬組成物の投与量は、医薬組成物の目的（血糖値上昇抑制、インスリン分泌亢進、高血糖状態に起因する疾患の予防または治療）、当該組成物の投与方法、投与形態、投与する患者の年齢や体重または症状（糖尿病の重篤度）等に応じて適宜選択される。一般には、ペプチドLSELの投与量が１日成人一人当り、約10mg〜1000mg程度となる範囲で投与するのが好ましい。

なお、当該投与は必ずしも１日１回である必要はなく１日３〜４回に分割して投与することも可能である。上記各種形態の医薬製剤は、その形態に応じた適切な投与経路、例えば注射剤形態においては、静脈内、筋肉内、皮下、皮内、腹腔内投与等により、固剤形態の医薬製剤は、経口投与等により投与され得る。

本発明の医薬組成物は、後記実験例で示すようにペプチドLSELに起因してインスリン分泌亢進作用を有し、インスリン作用の低下または欠乏によって生じる高血糖状態を改善し、血糖値上昇を抑制する作用を発揮する。このため、本発明の医薬組成物は、インスリン作用の低下または欠乏によって生じる高血糖状態に起因する各種の疾患の予防または治療用組成物として有効である。

かかる疾患としては、糖尿病及び糖尿病の合併症を挙げることができる。ここで対象とする糖尿病は、好適にはインスリン非依存性の２型糖尿病である。また糖尿病合併症とは糖尿病（好ましくはインスリン非依存性の２型糖尿病）を直接または間接的な要因として併発する全身性もしくは局所性の疾患であり、具体的には、糖尿病アシドーシス、糖尿病性黄色腫、糖尿病性筋萎縮症、糖尿病性ケトーシス、糖尿病性昏睡、糖尿病性胃障害、糖尿性壊疽、糖尿病性潰瘍、糖尿病性合併症、糖尿病性下痢症、糖尿病性細小血管症、糖尿病性子宮体硬化症、糖尿病性心筋症、糖尿病性ニューロパシー、糖尿病性腎症、糖尿病性水疱、糖尿病性白内障、糖尿病性皮膚障害、糖尿病性浮腫性硬化症、糖尿病性網膜症、糖尿病性リポイド類壊死症、糖尿病性血流障害等を例示することができる。

なお、本発明の医薬組成物には、ヒトの医薬組成物のみならず、動物の医薬組成物も含まれる。

（３）食品組成物
本発明の食品組成物は、前述するペプチドLSELを有効成分として含有することを特徴とする。

本発明が提供する食品組成物には、血糖値上昇抑制機能を付与した特定保健用食品（条件付き特定保健用食品を含む）、インスリン分泌亢進機能を付与した特定保健用食品（条件付き特定保健用食品を含む）、血糖値上昇抑制作用またはインスリン分泌亢進機能作用を有することによって高血糖に起因する疾患の予防または改善のために用いられる特定保健用食品（条件付き特定保健用食品を含む）が含まれる。

上記血糖値上昇抑制機能を付与した特定保健用食品は、糖尿病患者または境界型糖尿病患者の高血糖状態を予防または改善する（血糖値上昇を抑制する）有効量のペプチドLSELを含有することを特徴とするものであって、食品の包装パッケージまたは広告にその作用効果（血糖値上昇抑制作用）に関する記載を付することが可能な食品である。またインスリン分泌亢進機能を付与した特定保健用食品は、糖尿病患者または境界型糖尿病患者のインスリン分泌を亢進する有効量のペプチドLSELを含有することを特徴とするものであって、食品の包装パッケージまたは広告にその作用効果（インスリン分泌亢進）に関する記載を付することが可能な食品である。さらに、高血糖に起因する疾患の予防または改善のために用いられる特定保健用食品は、上記血糖値上昇抑制作用またはインスリン分泌亢進作用に基づいて、上記疾患に対して予防または改善効果を発揮する有効量のペプチドLSELを含有するものであって、食品の包装パッケージまたは広告にその作用効果（抗糖尿病作用）に関する記載を付することが可能な食品である。

本発明の食品組成物は、上記のペプチドLSELを、血糖値上昇抑制作用またはインスリン分泌亢進作用を発揮する有効量含有するものであれば、ペプチドLSELだけからなるものであってもよいが、通常上記有効成分に加えて食品として使用が可能な担体または添加剤とともに調製される。なお、ペプチドLSELを動物、魚介類または植物から調製する場合、そのペプチドLSELは、血糖上昇抑制作用またはインスリン分泌亢進作用を有する限り、精製ペプチドLSELである必要はなく、それを含む蛋白分解物またはそのフラクションを本発明の食品組成物の有効成分として用いてもよい。

本発明の食品組成物には、上記ペプチドLSELを、必要に応じて食品上許容される担体や添加剤とともに、錠剤、丸剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、粉末剤、または溶液（ドリンク）等の形態に調製してなるサプリメント（機能性食品）や食品添加物、並びに上記ペプチドLSELを配合した一般の飲食物が含まれる。

かかる飲食物として、例えば乳飲料、乳酸菌飲料、果汁入り清涼飲料、清涼飲料、炭酸飲料、果汁飲料、野菜飲料、野菜・果実飲料、アルコール飲料、粉末飲料、コーヒー飲料、紅茶飲料、緑茶飲料、麦茶飲料などの飲料類；カスタードプリン、ミルクプリン、スフレプリン、果汁入りプリン等のプリン類、ゼリー、ババロア及びヨーグルト等のデザート類；アイスクリーム、アイスミルク、ラクトアイス、ミルクアイスクリーム、果汁入りアイスクリーム及びソフトクリーム、アイスキャンディー、シャーベット、氷菓等の冷菓類；チューインガムや風船ガム等のガム類（板ガム、糖衣状粒ガム）；マーブルチョコレート等のコーティングチョコレートの他、イチゴチョコレート、ブルーベリーチョコレート及びメロンチョコレート等の風味を付加したチョコレート等のチョコレート類；ハードキャンディー（ボンボン、バターボール、マーブル等を含む）、ソフトキャンディー（キャラメル、ヌガー、グミキャンディー、マシュマロ等を含む）、ドロップ、タフィ等のキャラメル類；ハードビスケット、クッキー、おかき、煎餅等の焼き菓子類（以上、菓子類）；コンソメスープ、ポタージュスープ等のスープ類；ストロベリージャム、ブルーベリージャム、マーマレード、リンゴジャム、杏ジャム、プレザーブ等のジャム類；赤ワイン等の果実酒；シロップ漬のチェリー、アンズ、リンゴ、イチゴ、桃等の加工用果実；ハム、ソーセージ、焼き豚等の畜肉加工品；魚肉ハム、魚肉ソーセージ、魚肉すり身、蒲鉾、竹輪、はんぺん、薩摩揚げ、伊達巻き、鯨ベーコン等の水産練り製品；うどん、冷麦、そうめん、ソバ、中華そば、スパゲッティ、マカロニ、ビーフン、はるさめ及びワンタン等の麺類；その他、各種総菜及び麩、田麩等の種々の加工食品を挙げることができる。好ましくは飲料及び菓子類である。

上記食品組成物中に含有されるべき有効成分（ペプチドLSEL）の量、または摂取量は、特に限定されず、食品組成物の種類、目的とする改善効果の度合い、並びにその他の諸条件などに応じて広範囲より適宜選択される。摂取量は、食品組成物の種類によっても異なるが、体重60kgのヒトに対して１回摂取あたりのペプチドLSELの量に換算して、約10〜1000mg／60kgの範囲から適宜選択することができる。

本発明の食品組成物は、ペプチドLSELに起因してインスリン分泌亢進作用を有し、インスリン作用の低下または欠乏によって生じる高血糖状態を改善し、血糖値の上昇を抑制する作用を発揮する。このため、本発明の食品組成物は、インスリン作用の低下または欠乏によって生じる高血糖状態に起因する各種の疾患を予防したり、また改善するための食品組成物として有効に使用することができる。

（４）飼料組成物
本発明の飼料組成物は、ペプチドLSELを有効成分として含有することを特徴とする。

本発明が提供する飼料組成物には、血糖値上昇抑制機能を付与した飼料、インスリン分泌亢進機能を付与した飼料、血糖値上昇抑制作用またはインスリン分泌亢進機能作用を有することによって高血糖に起因する疾患の予防または改善のために用いられる飼料が含まれる。当該飼料は、特に犬や猫等のペット動物の餌料として好適に用いることができる。上記血糖値上昇抑制機能を付与した飼料は、糖尿病またはその前状態になる動物の高血糖状態を予防または改善する（血糖値の上昇を抑制する）有効量のペプチドLSELを含有することを特徴とする。またインスリン分泌亢進機能を付与した飼料は、糖尿病またはその前状態になる動物のインスリン分泌を亢進する有効量のペプチドLSELを含有することを特徴とする。さらに、高血糖に起因する疾患の予防または改善のために用いられる飼料は、上記血糖値上昇抑制作用またはインスリン分泌亢進作用を発揮する有効量のペプチドLSELを含有するものである。

当該飼料組成物には、上記ペプチドLSELを、必要に応じて飼料に配合可能な担体や添加剤とともに、錠剤、丸剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、粉末剤、または溶液等の形態に調製してなるもののほか、上記ペプチドLSELを配合した一般の飼料が含まれる。なお、ペプチドLSELを動物、魚介類または植物から調製する場合、そのペプチドLSELは、血糖上昇抑制作用またはインスリン分泌亢進作用を有する限り、精製ペプチドLSELである必要はなく、それを含む蛋白分解物またはそのフラクションを本発明の飼料組成物の有効成分として用いてもよい。

飼料組成物中に含有されるべき有効成分（ペプチドLSEL）の量、または摂取量は、特に限定されず、飼料組成物の種類、飼料を摂取する動物の種類や、目的とする改善効果やその度合い、並びにその他の諸条件などに応じて広範囲より適宜選択される。摂取量は、飼料組成物の種類によっても異なるが、体重10kgの動物に対して１回摂取あたりのペプチドLSELの量に換算して、約1〜100mg／10kgの範囲から適宜選択することができる。

以下、本発明を調製例および実験例によって更に詳細に説明する。但し、これらの実験例は本発明を何ら限定するものではない。なお、下記の実験例において、特に言及しない限り、％は重量％を意味するものとする。

調製例１ペプチドLSELの合成
アミノ酸配列Leu-Ser-Glu-Leu（配列番号１）からなるペプチド(ペプチドLSEL)を、定法の液相法に従って合成した（Shanghai C-Strong社(上海，中国)に製造委託）。得られたペプチドについて、液相自動エドマン分解法(装置：アプライドバイオシステムズ製Procise HT, Protein Sequencing System)によりアミノ酸配列を分析したところ、上記アミノ酸配列からなるテトラペプチドであることが確認された。

実験例１ペプチドLSEL経口投与または皮下投与時のグルコース負荷正常マウスの血糖値に及ぼす影響
調製例１で調製したペプチドLSELをグルコース負荷正常マウスに経口投与または皮下投与して、当該ペプチドの上記マウスの血糖値に及ぼす影響を調べた。試験には、7週齢の雄性ICRマウス（日本エスエルシー）を用いた。

まず、一晩（約18時間）絶食させたマウスの血糖値を測定し、得られた血糖値に基づきマウスを６群に分けた（３群：LSEL経口投与群、１群：LSEL皮下投与群、１群：経口投与対照群、１群：皮下投与対照群）。表１にLSEL経口投与群とLSEL皮下投与群のペプチドLSEL投与量、投与経路および例数を示す。

LSEL経口投与群には、グルコース（2g/kg体重）とペプチドLSEL（10mg/kg体重、25mg/kg体重、または50mg/kg体重）を混合して同時に経口投与し、投与から30分、60分、90分および120分後に血糖値を測定した。またLSEL皮下投与群には、グルコース（2g/kg体重）を経口投与した直後にペプチドLSEL（25mg/kg体重）を皮下投与し、投与から30分、60分、90分および120分後に血糖値を測定した。また経口投与の対照群（n=24）には、グルコース（2g/kg体重）と蒸留水を混合して同時に経口投与し、皮下投与の対照群（n=11）には、グルコース（2g/kg体重）を経口投与した直後に生理食塩水を皮下投与し、同様に、投与から30分、60分、90分および120分後に血糖値を測定した。なお、グルコースは投与容量が10 mL/kgとなるように生理食塩水に溶解して用いた（以下の実験でも同じ。）。ちなみに、血糖値は、尾静脈より採血した血液1滴を用い、小型血糖測定器ケアシスト（ロシュ）により測定した。

LSEL経口投与群（ペプチドLSEL投与量：50mg/kg体重）と対照群の血糖値の経時的変化を図２に、LSEL皮下投与群（ペプチドLSEL投与量：25mg/kg体重）と対照群の血糖値の経時的変化を図３に示す。また各群について２時間曲線下面積（AUC_0-2h）を求め、下記式から血糖AUC_0-2h抑制率（％）を求めた。その結果を表１に示す。

図２および表１から分かるように、ペプチドLSELをグルコース負荷正常マウスに経口投与することにより、用量依存的に血糖値の上昇抑制が認められた。特に、ペプチドLSELを 50 mg/kg投与することにより、２時間曲線下面積（AUC_0-2h）が対照群と比較して13.2%低下した（P<0.1）。また、図３および表１から分かるように、ペプチドLSEL（25mg/kg体重）をグルコース負荷正常マウスに皮下投与することにより、２時間曲線下面積（AUC_0-2h）が対照群と比較して23.2%低下した（P<0.05）。

以上の結果より、ペプチドLSELは、経口投与および皮下投与の両方において、血糖上昇を抑制する作用を発揮することが判明した。

実験例２ペプチドLSEL経口投与時のグルコース負荷２型糖尿病モデルKK-Ayマウスの血糖値に及ぼす影響
調製例１で調製したペプチドLSELをグルコース負荷KK-Ayマウスに経口投与して、当該ペプチドの上記マウスの血糖値に及ぼす影響を調べた。試験には、9週齢の雄性２型糖尿病モデルKK-Ayマウス（日本クレア）を用いた。

具体的には、一晩（約18時間）絶食させたマウスの血糖値を測定し、得られた血糖値に基づきマウスを４群に分けた（３群：LSEL経口投与群、１群：対照群）。表２にLSEL経口投与群のペプチドLSEL投与量および例数を示す。LSEL経口投与群には、グルコース（2 g/kg体重）とペプチドLSEL（25mg/kg体重、50 mg/kg体重または100 mg/kg体重）を混合して同時に経口投与し、投与から30分、60分、90分および120分後に血糖値を測定した。また対照群（n=11）には、グルコース（2g/kg体重）と蒸留水を混合して同時に経口投与し、同様に、投与から30分、60分、90分および120分後に血糖値を測定した。なお、スクロースは投与容量が10 mL/kgとなるように生理食塩水に溶解して用いた。血糖値は、尾静脈より採血した血液1滴を用いて、ケアシスト（ロシュ）で測定した。

LSEL経口投与群（投与量：100mg/kg体重）と対照群の血糖値の経時的変化を図４に示す。また、経口投与の各群について、２時間曲線下面積（AUC_0-2h）を求め、上記数１に従って血糖AUC_0-2h抑制率（％）を求めた。その結果を表２に示す。

図４および表２から分かるように、２型糖尿病モデルマウスに対しても、ペプチドLSELを経口投与することにより、用量依存的に血糖値の上昇抑制が認められた。特にペプチドLSEL 100 mg/kg投与により、２時間曲線下面積（AUC_0-2h）は対照群と比較して15.3%低下した（P<0.1）。

実験例１の結果と合わせて、正常マウス（ICRマウス）および２型糖尿病モデルマウス（KK-Ayマウス）のいずれにおいても、ペプチドLSELを投与することにより、対照群と比較して、グルコース負荷後の血糖値の上昇が有意に抑制されることが認められた。

実験例３ペプチドLSEL経口投与時のスクロース負荷ICRマウスの血糖値に及ぼす影響
調製例１で調製したペプチドLSELを、スクロース負荷正常マウスに経口投与して、当該ペプチドの上記マウスの血糖値に及ぼす影響を調べた。試験には7週齢の雄性ICRマウス（日本エスエルシー）を用いた。

具体的には、一晩（約18時間）絶食させたマウスの血糖値を測定し、得られた血糖値に基づきマウスを２群に分けた（１群：LSEL経口投与群、１群：対照群）。表３に、LSEL経口投与群のペプチドLSEL投与量および例数を示す。

LSEL経口投与群には、スクロース（2 g/kg体重）とペプチドLSEL（25mg/kg体重）を混合して同時に経口投与し、投与から30分、60分、90分および120分後に血糖値を測定した。また対照群（n=11）には、スクロース（2g/kg体重）と蒸留水を混合して同時に経口投与し、同様に、投与から30分、60分、90分および120分後に血糖値を測定した。血糖値は、尾静脈より採血した血液1滴を用いて、ケアシスト（ロシュ）で測定した。

LSEL経口投与群と対照群の血糖値の経時的変化を図５に示す。また、経口投与の各群について、２時間曲線下面積（AUC_0-2h）を求め、上記数１に従って血糖AUC_0-2h抑制率（％）を求めた。その結果を表３に示す。

図５および表３から分かるように、スクロース負荷正常マウスに対しても、ペプチドLSELを経口投与することにより、血糖値の上昇抑制が認められた。またペプチドLSEL 25 mg/kg投与により、２時間曲線下面積（AUC_0-2h）は対照群と比較して22.9%低下した（P<0.05）。

実験例１および実験例２の結果と合わせて、ペプチドLSELはグルコース負荷のみでなく、スクロース負荷による血糖値の上昇も抑制することが明らかとなった。

実験例４ペプチドLSEL経口投与時のグルコース負荷ICRマウスの血漿インスリン濃度に及ぼす影響
調製例１で調製したペプチドLSELを、グルコース負荷正常マウスに経口投与して、当該ペプチドの上記マウスの血漿インスリン濃度に及ぼす影響を調べた。試験には7週齢の雄性ICRマウス（日本エスエルシー）を用いた。

具体的には、一晩（約18時間）絶食させたマウスの血糖値を測定し、得られた血糖値に基づき２群に分けた（LSEL経口投与群、対照群）。表４にLSEL経口投与群のペプチドLSEL投与量および例数を示す。

LSEL経口投与群には、グルコース（2 g/kg体重）とペプチドLSEL（50 mg/kg体重）を混合して同時に経口投与し、投与から15分、30分、60分、90分および120分後の血漿インスリン濃度を測定した。また対照群（n=6）には、グルコース（2g/kg体重）と蒸留水を混合して同時に経口投与し、同様に、投与から15分、30分、60分、90分および120分後の血漿インスリン濃度を測定した。血漿インスリン濃度は、眼窩よりヘパリンを用いて採血し、遠心分離して得た血漿を用いて、インスリン測定用キット（レビスインスリン-マウスT、（株）シバヤギ製）で測定した。

LSEL経口投与群と対照群の血漿インスリン濃度の経時的変化を図６に示す。また、LSEL経口投与群について、２時間曲線下面積（AUC_0-2h）を求め、下式に従ってインスリンAUC_0-2h上昇率（％）を求めた。

結果を表４に示す。

図６および表４から分かるように、ペプチドLSEL 50 mg/kgの経口投与により、血漿インスリン濃度の２時間曲線下面積（AUC_0-2h）は、対照群に比して252.0%上昇した（p<0.05）。

実験例１の結果と合わせて考えると、ペプチドLSELはインスリンの分泌亢進を介して、血糖上昇を抑制する可能性が高いと考えられる。

実験例５安全性について
調製例１で調製したペプチドLSELをマウスに経口投与した場合、2g/kg体重でも全く毒性を発現しなかった。このことから、ペプチドLSEL のLD₅₀は2g/kg体重をはるかに上まわることが判明した。

実施例１緑茶飲料
緑茶8kgを80℃の熱水300Lに入れ、同温度で4分間抽出した。得られた抽出液を冷却後、遠心分離し、清澄な上清を採取してこれを緑茶抽出物とした。この抽出物にビタミンCを0.4kg配合し、さらに調製例１で調製したペプチドLSELを50g添加して、熱水で最終容量が1000Lになるよう調製した。これを85℃以上に加熱し、金属缶に充填して、レトルト殺菌(125℃、5分)して緑茶飲料とした。

実施例２錠剤
下記の全成分を、常法により練合および造粒し、乾燥後打錠して１錠(200mg)中、ペプチドLSELを5重量％（10mg）の割合で含む錠剤を得た。当該錠剤は、ペプチドLSELの薬理作用（血糖値上昇抑制作用、インスリン分泌亢進作用、抗糖尿病作用）を有する医薬製剤またはサプリメントとして提供することができる。

＜処方＞１錠あたり
ペプチドLSEL（調製例１） 50mg
ソルビトール 190mg
ショ糖脂肪酸エステル 10mg
合計 250mg。

実施例３飼料
ビタミン、ミネラル等が配合されたプレミックスに調製例１で調製したペプチドLSELを0.1％の割合で配合し、これを市販のドッグ用飼料に10％の割合で添加し、インスリン分泌亢進作用または血糖値上昇抑制作用を有するドッグフードを調製した。

本発明によれば、ペプチドLSELを有効成分として含むことによって血糖値上昇抑制作用またはインスリン分泌亢進作用を有する、医薬組成物、食品組成物、または飼料組成物を提供することができる。これらの組成物は、血糖値上昇抑制作用またはインスリン分泌亢進作用に基づき、糖尿病またはその前状態にある被験者（ヒトおよび動物を含む）について、高血糖状態にある血糖値を降下させる作用を有する。このため、本発明の組成物は、高血糖に起因する疾患、具体的には糖尿病や糖尿病合併症の予防または治療のために有効に用いることができる。

アミノ酸配列（Leu-Ser-Glu-Leu）を一部に含むポリペプチドまたはタンパク質を有する動物、魚介類、および植物を示す。実験例１においてLSEL経口投与時のグルコース負荷ICRマウスの血糖値の変化を示す。実験例１においてLSEL皮下投与時のグルコース負荷ICRマウスの血糖値の変化を示す。実験例２においてLSEL経口投与時のグルコース負荷KK-Ayマウスの血糖値の変化を示す。実験例３においてLSEL経口投与時のスクロース負荷ICRマウスの血糖値の変化を示す図。実験例４においてLSEL経口投与時のグルコース負荷ICRマウスの血漿中インスリン濃度の変化を示す。

Claims

Leu-Ser-Glu-Leuで示されるアミノ酸配列からなるペプチド。
請求項１に記載するペプチドを有効成分とする医薬組成物、食品組成物または飼料組成物。
請求項１に記載するペプチドを有効成分とする血糖値上昇抑制用組成物。
請求項１に記載するペプチドを有効成分とするインスリン分泌亢進用組成物。
請求項１に記載するペプチドを有効成分とする、高血糖に起因する疾患の予防または治療用組成物。
高血糖に起因する疾患が糖尿病である請求項５に記載する組成物。
請求項１に記載するペプチドを有効成分とする、糖尿病合併症の予防用組成物。