JP4857276B2

JP4857276B2 - フモニシンを汚染除去するための微生物及びその使用、フモニシンを汚染除去するための方法、並びに前記微生物を含有する飼料添加物

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Publication number: JP4857276B2
Application number: JP2007540450A
Authority: JP
Inventors: シヤツツマイヤー，ゲルト; トイベル，マルテイン; ベキル，エリザベツト; ビンダー，エバ−マリア
Original assignee: エルベル・アクチエンゲゼルシヤフト
Priority date: 2004-11-16
Filing date: 2005-11-15
Publication date: 2012-01-18
Anticipated expiration: 2025-11-15
Also published as: ZA200703979B; EP1860954B1; ATE542432T1; BRPI0518433B1; SG157358A1; WO2006053357A3; CA2587405C; JP2008520194A; UA92159C2; MX2007005910A; US20070292579A1; EP1860954A2; DK1860954T3; AT501359B1; AU2005306554A1; BRPI0518433A2; CN101056541A; AU2005306554B2; CA2587405A1; EA013566B1

Description

本発明は、フモニシン及びフモニシン誘導体を汚染除去するための微生物、並びに食物及び／又は飼料中のフモニシン及びフモニシン誘導体を解毒するための、単独の又は２つ以上の株を組み合わせた、細菌又は酵母の使用、微生物を用いてフモニシン及びフモニシン誘導体を汚染除去するための方法、並びにマイコトキシン、特に、フモニシン及びフモニシン誘導体を不活化するための飼料添加物に関する。

その後食物若しくは飼料へと加工されるか、又は動物に直接給餌される複数の植物は、各毒素を検出しなければならないという事実に加えて、各毒素を解毒又は分解するための効率的且つ無害な方法を適用し、又は見出さなければならないように、最も多様な濃度で、最も多様な毒素に感染するので、複数の異なる毒素を含むマイコトキシンは、近代の食物及び飼料産業において、高まりつつある問題となっている。

特定の毒素に対して耐性である所謂トランスジェニック植物を増殖させるために、又は「遺伝的に改変された」植物の補助によって食物製品（この食物製品は、各植物の毒素に対する耐性のために、このような毒素が存在しない。）を取得するために、無毒素の植物を得るためのアプローチが試みられてきた。

極めて複雑で、込み入っていることに加え、このアプローチは多くの国で議論を巻き起こした。特にトウモロコシ中にしばしば見出され、トウモロコシの摂取後に重い障害をもたらす毒素はフモニシン及びフモニシン誘導体であり、これらは、既知の微生物によって研究室試験において分解することが可能であるが、フモニシン及びフモニシン誘導体に関しては、異なる毒素濃度及び異なる栄養素環境でこのような分解を行うことが可能である微生物が未だ発見されていない。公知の微生物は、さらに、産業又は商業的規模でのこのような微生物の使用が非実用的であるように、このような分解のために、２４時間を超える時間という多大な期間を必要とする。

食物又は飼料中のマイコトキシンと関連する別の問題は、複数の穀物又は穀物種を含有する混合された飼料又は混合された食物の無限に増加する量が産生されるという事実のために、マイコトキシンの有用な分解又は選択的な分解が必要であると思われるように、幾つかのマイコトキシンが一つ及び同一の食物又は飼料製品中に同時に生じることに存する。さらに、最近の研究によって、毒素がそれら自体の間で結合性相互作用を示し得ることが明らかとなっており、これは、各毒素の有害な効果をさらに増強する。１９９６年に、Ｈａｒｖｅｙは、例えば、ブタにおけるフモニシンとデオキシニバレノールの相乗効果について報告した。さらに、例えば、飼料中に含有され得る毒素の多くは、動物中で免疫抑制効果をもたらすと推測され、これは、マイコトキシンの平行的な発生に起因する。

本発明は、フモニシン及びフモニシン誘導体を汚染除去するための微生物であり、一方で、毒素を極めて迅速に分解することができ、及び、他方でこのような迅速な分解に加えて、最も多様な栄養素濃度の存在下でさえ前記分解を行うことができる前記微生物を提供することを目的とする。最後に、本発明は、特に、最も多様な飼料植物を使用した場合に無毒素の飼料を取得するために、フモニシンに加えて、単独の又は組み合わせた他の毒素も分解できる微生物又は微生物の組み合わせを提供することを目的とする。

この目的を解決するために、本発明に従って、フモニシン及びフモニシン誘導体を汚染除去するための微生物であり、単一段階又は複数段階反応において、フモニシンを、脱アミノ化された代謝物へと酵素的に変換する、分類群スフィンゴモナス科（Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｄａｃｅａｅ）に割り当て可能な、株ＤＳＭ１６２５４及びＤＳＭ１５２５７、分類群リゾビウム目（Ｒｈｉｚｏｂｉａｌｅｓ）に割り当て可能な株ＤＳＭ１６２５５、分類群ミクロバクテリウム科（Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）に割り当て可能な株ＤＳＭ１６２５６、分類群リゾビウム科（Ｒｈｉｚｏｂｉａｃｅａｅ）に割り当て可能な株ＤＳＭ１６２５３、分類群アルカリゲネス科（Ａｌｃａｌｉｇｅｎａｃｅａｅ）に割り当て可能な株ＤＳＭ１６２５２及びピチア種（Ｐｉｃｈｉａｓｐ．）ＤＳＭ１６５６２から選択される解毒細菌又は酵母が使用される微生物が提供される。上記微生物は、単一段階又は複数段階反応において、フモニシンを、脱アミノ化された代謝物へと酵素的に変換することができるのみならず、極めて短時間のうちに、並びに、例えば飼料又は食物などの複雑な環境の存在下でさえ、すなわち、幾つかの又は最も多様な炭素源の存在下、特に、栄養素の過剰供給の存在下でさえ、これを行うことができる。

詳細には、微生物は、以下に記載されているように、簡潔に記載することが可能である。株ＤＳＭ１６２５４は、フォワードプライマー２７（配列長６８９ｂｐ）を用いた１６ＳｒＲＮＡの部分的な配列決定後に、分類群スフィンゴモナス科に割り当てられるべきである。部分的な１６ＳｒＤＮＡ配列は、以下の塩基配列を有する。

ここに、微生物はグラム陰性であり、とりわけ、単一の細胞中に生じ、及び繊維状の鎖構造を部分的に形成する小さな棹を形成する。

同様に、株ＤＳＭ１６２５７は、１６ＳｒＤＮＡの部分的な配列決定後に（リバースプライマー３０を使用、得られた配列長４２６ｂｐ）、分類群スフィンゴモナス科に属する。以下の配列が得られる。

この微生物は、大部分、長い繊維状細胞構造で配置されている小さな棹を形成する。

ＤＳＭ１６２５５は、フォワードプライマー２７を用いた１６ＳｒＤＮＡの部分的な配列決定後に、以下の７２０塩基長の配列を産生する。

本微生物は、分類群リゾビウム目に属し、グラム陰性であり、主に単細胞中に小さな棹を形成する。

微生物ＤＳＭ１５２５６は、分類群ミクロバクテリウム科に割り当て可能である。フォワードプライマー２７を用いた１６ＳｒＤＮＡの部分的な配列決定によって、以下の７０６塩基長の配列が得られる。

本微生物はグラム陽性であり、部分的に鎖様細胞凝集物中に配置された小さな短い棹を含む。

ＤＳＭ１６２５３は、１６ＳｒＤＮＡの部分的な配列決定後に（リバースプライマー５３０、配列長３９２ｂｐ）、分類群リゾビウム科（Ｒｈｉｚｏｂｉａｃｅａｅ）に属する。配列は、以下のように読まれる。

本微生物はグラム陰性であり、とりわけ、単一細胞として生じる小さな棹を含む。

微生物ＤＳＭ１５２５２は、分類群アルカリゲネス科に割り当て可能である。１６ＳｒＤＮＡの部分的な配列決定によって、以下のヌクレオチド配列を有する４７６塩基長のＤＮＡ断片を産生する。

本微生物はグラム陰性であり、でこぼこの多細胞凝集物中に部分的に生じる小さなまっすぐの棹を含む。

ＤＳＭ１６５６２、すなわち、ピチア種は、細胞凝集物中ではなく、個別に生じる相対的に小さな楕円の酵母細胞を示す。

詳細には、前記微生物の全ては、互いに相対的に離れているが、急速に解毒する能力に加えて、複雑な環境中でさえ、フモニシンの解毒などを迅速且つ確実に行うという特性を共有していることを実証することができた。

本発明のさらなる展開によれば、細菌又は酵母は、それぞれの目的のために、任意の時点で与えることができる安定な産物を提供するために、粉末、液体又はゲルの形態で安定化される。

本発明のさらなる展開に従えば、細菌又は酵母は、微生物の使用可能な産物が迅速且つ確実に産生可能であるように、無細胞抽出物又は粗抽出物として使用される。

食物又は飼料から可能な限り完全に毒素を除去するために、本発明のさらなる展開に従って、本発明の微生物の補助により、フモニシン及びフモニシン誘導体に加えて、ゼアラレノン、アフラトキシン又はオクラトキシンから選択される少なくとも一つのさらなるマイコトキシンを解毒することが可能である。詳細には、本発明の微生物は、少なくとも１つのさらなる毒素を解毒できることが明らかとなり、このような解毒は、フモニシンの解毒と同じように迅速且つ効率的に達成可能である。従って、前記微生物を提供することによって、さらに一切の添加物を加えずに、食物又は飼料製品中、特に、食物又は飼料混合物中に含有される複数の毒素を完全に分解することが可能であり、従って、高品質な無毒素食物又は飼料製品を利用可能とすることができる。

本発明は、食物及び／又は飼料中のフモニシン及びフモニシン誘導体を解毒するための、分類群スフィンゴモナス科（Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｄａｃｅａｅ）に割り当て可能な、株ＤＳＭ１６２５４及びＤＳＭ１５２５７、分類群リゾビウム目（Ｒｈｉｚｏｂｉａｌｅｓ）に割り当て可能な株ＤＳＭ１６２５５、分類群ミクロバクテリウム科（Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）に割り当て可能な株ＤＳＭ１６２５６、分類群リゾビウム科（Ｒｈｉｚｏｂｉａｃｅａｅ）に割り当て可能な株ＤＳＭ１６２５３、分類群アルカリゲネス科（Ａｌｃａｌｉｇｅｎａｃｅａｅ）に割り当て可能な株ＤＳＭ１６２５２及びピチア種（Ｐｉｃｈｉａｓｐ．）ＤＳＭ１６５６２から選択される、単独の又は２つ以上の株を組み合わせた細菌又は酵母の使用にも関する。本発明の微生物を使用することによって、食物又は飼料中のフモニシン及びフモニシン誘導体の完全な解毒を達成することが可能であるのみならず、前記微生物が培地中で解毒可能であり、過剰な炭素供給を提供するという事実に加えて、前記微生物は、このような解毒を、極めて短期間のうちに行うことが可能である。上記微生物を使用することによって、フモニシンに加えて、ゼアラレノン、アフラトキシン又はオクラトキシンから選択される少なくとも１つのさらなるマイコトキシンを解毒することが可能である。このような使用は、特に、ヒトが消費するための混合された飼料又は混合された穀物製品において、穀類中に存在する幾つかの毒素が、本発明の微生物の補助によって安全且つ迅速に分解されることを保護する。

前記分解をさらに完結するために、本発明は、マイコトキシンを解毒するための、細菌及び／又は酵母から得られる混合された培養物の使用を想定する。混合された培養物の使用は、一つの及び同一の食物若しくは飼料製品又は飼料混合物中に同時に存在する本毒素の複数に対する選択的な攻撃を可能とし、従って、毒素の完全な汚染除去を達成する。さらに、このような使用は、幾つかのマイコトキシン種の同時発生によって引き起こされる望ましくない相乗効果の発生の安全な回避又は予防を初めて可能とした。

本発明の微生物の使用は、さらに、最も多様なマイコトキシンの極めて低い濃度、特に、１００μｇ／ｋｇ〜５００ｍｇ／ｋｇ、好ましくは２５０μｇ／ｋｇ〜２５ｍｇ／ｋｇのフモニシン及びフモニシン誘導体、１０μｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇ、好ましくは４０μｇ／ｋｇ〜２ｍｇ／ｋｇのゼアラレノン及びゼアラレノン誘導体、１μｇ／ｋｇ〜２ｍｇ／ｋｇ、好ましくは１０μｇ／ｋｇ〜７５０μｇ／ｋｇのアフラトキシン、１μｇ／ｋｇ〜２ｍｇ／ｋｇ、好ましくは５μｇ／ｋｇ〜５００μｇ／ｋｇのオクラトキシンの分解を可能となることにより、本発明の微生物の使用によって最も多様な毒素の汚染除去が実施可能となるという事実に加えて、前記毒素の極めて低濃度を攻撃及び分解し得るという事実が確保されるが、これは、従来の微生物では不可能でないとしても、これまでのところ困難であった。

例えば、混合された飼料中に含有される全ての毒素の可能な限り完全な解毒を達成するために、マイコトキシン、特にフモニシン及びフモニシン誘導体、ゼアラレノン及びゼアラレノン誘導体、オクラトキシン、トリコテセン及び／又はアフラトキシンを解毒するために、スフィンゴモナス種（Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓｓｐ．）ＤＳＭ１４１７０及びＤＳＭ１４１６７、ステノトロホモナス・ニトリトレデュセンス（Ｓｔｒｅｎｏｔｒｏｐｈｏｍｏｎａｓｎｉｔｒｉｔｒｅｄｕｃｅｎｓ）ＤＳＭ１４１６８、ステノトロフォモナス種（Ｓｔｅｎｏｔｒｏｐｈｏｍｏｎａｓｓｐ．）ＤＭ１４１６９、ラルストニア・ユートロファ（Ｒａｌｓｔｏｎｉａｅｕｔｒｏｐｈａ）ＤＳＭ１４１７１、ユウバクテリウム種（Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍｓｐ．）ＤＳＭ１４１９７、トリコスポロン・マイコトキシニボランス（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎｍｙｃｏｔｏｘｉｎｉｖｏｒａｎｓ）ＤＳＭ１４１５３、クリプトコッカス種（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓｓｐ．）ＤＳＭ１４１５４、ロドトルラ・ヤロウィ（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａｙａｒｒｏｗｉｉ）ＤＳＭ１４１５５、トリコスポロン・ムコイデス（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎｍｕｃｏｉｄｅｓ）ＤＳＭ１４１５６、トリコスポロン・ダルシタム（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎｄｕｌｃｉｔｕｍ）ＤＳＭ１４１６２又はユウバクテリウムＤＳＭ１１７９８から選択される少なくとも１つのさらなる細菌又は酵母をさらに含有する組み合わせ又は混合された培養物が使用される程度まで、本発明の使用はさらに展開される。特に、トリコテセン、ゼアラレノン又はゼアラレノン誘導体、アフラトキシン又はオクラトキシンの分解に適した少なくとも１つのさらなる細菌又は酵母をさらに含有する組み合わせ又は混合された培養物を使用することによって、本発明の微生物の解毒効果（すなわち、フモニシンの分解）に加えて、幾つかの微生物の選択された使用が、集合的に及び互いに独立に、食物製品中に存在し得る全ての毒素の迅速且つ完全な分解を可能とする程度まで、他の毒素に関してこれらの分解能力を拡張することが可能となった。

本発明の微生物を用いてフモニシン及びフモニシン誘導体を汚染除去するための方法では、特定の細菌数を有する家畜用飼料中のフモニシンが、単一段階又は複数段階反応において脱アミノ化された代謝物へと酵素的に分解される様式で、実質的に進められる。更なる展開によれば、前記解毒は、最小培地又は過剰な栄養素供給及び炭素源を有する複雑な環境中において、水性条件下で好ましく実施される。このような方法の調節は、微生物に対して使用可能な炭素の量を考慮に入れずに飼料内で解毒が直接行われる方法における、本発明の微生物の使用を可能とする。これまでに公知の微生物の大半は、最小培地中又は炭素供給が上昇していない環境中でそれらの解毒効果を示すことが可能であるに過ぎない（この理由のために、公知の微生物の多くは、大規模な炭素供給のため、食物及び飼料中で直接使用するのには適していない。）という点で、これは特に妥当である。

好ましいさらなる展開によれば、前記方法は、１５分〜１２時間以内に、及び、特に、１５分〜２時間以内に完結される様式で調節される。このような方法の調節によって、一方で、食物又は飼料製品中に含有されるマイコトキシン、特に、フモニシンの全てが分解されることが確保され、他方で、マイコトキシンを分解するのみならず、このような短時間のうちに前記分解を実施して、研究室規模に留まらず、大きな規模でこのような方法の適用を可能とすることが実行可能となる。

本発明の方法のさらなる展開に従えば、マイコトキシン、特にフモニシン及びフモニシン誘導体、ゼアラレノン及びゼアラレノン誘導体、オクラトキシン、トリコテセン及び／又はアフラトキシンを解毒するために、スフィンゴモナス種（Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓｓｐ．）ＤＳＭ１４１７０及びＤＳＭ１４１６７、ステノトロホモナス・ニトリトレデュセンス（Ｓｔｒｅｎｏｔｒｏｐｈｏｍｏｎａｓｎｉｔｒｉｔｒｅｄｕｃｅｎｓ）ＤＳＭ１４１６８、ステノトロフォモナス種（Ｓｔｅｎｏｔｒｏｐｈｏｍｏｎａｓｓｐ．）ＤＭ１４１６９、ラルストニア・ユートロファ（Ｒａｌｓｔｏｎｉａｅｕｔｒｏｐｈａ）ＤＳＭ１４１７１、ユウバクテリウム種（Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍｓｐ．）ＤＳＭ１４１９７、トリコスポロン・マイコトキシニボランス（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎｍｙｃｏｔｏｘｉｎｉｖｏｒａｎｓ）ＤＳＭ１４１５３、クリプトコッカス種（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓｓｐ．）ＤＳＭ１４１５４、ロドトルラ・ヤロウィ（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａｙａｒｒｏｗｉｉ）ＤＳＭ１４１５５、トリコスポロン・ムコイデス（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎｍｕｃｏｉｄｅｓ）ＤＳＭ１４１５６、トリコスポロン・ダルシタム（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎｄｕｌｃｉｔｕｍ）ＤＳＭ１４１６２又はユウバクテリウムＤＳＭ１１７９８から選択される少なくとも１つのさらなる細菌又は酵母をさらに含有する組み合わせ又は混合された培養物が使用される。本方法は、フモニシン及びフモニシン誘導体の分解並びに本発明の微生物によってさらに分解され得るマイコトキシンの分解に加えて、微生物の選択的な選択の使用により、食物及び／又は飼料の完全な汚染除去を達成するように調節される。

前記汚染除去を確実に完結させるために、本発明のさらなる展開は、食物及び／又は飼料を汚染除去するために、微生物が、それぞれ、０．０１重量％〜１．５重量％、及び、特に、０．０５重量％〜０．７重量％の範囲の量で前記食物及び／又は飼料とともに混合されることを想定する。

本発明は、最後に、前記飼料添加物が、２×１０^８／ｋｇ飼料添加物から２×１０^１５／ｋｇの飼料添加物までの、特に１×１０^９／ｋｇ飼料添加物から５×１０^１２／ｋｇ飼料添加物までの細菌数で、請求項１〜４の何れか一項に記載の微生物を含有することを特徴とする、マイコトキシン、特に、フモニシン及びフモニシン誘導体を不活化するための飼料添加物を含む。２×１０^８／ｋｇ飼料添加物から２×１０^１５／ｋｇの飼料添加物までの細菌数で前記微生物を含有する飼料添加物を使用することによって、本発明の微生物によって分解され得るフモニシン及びフモニシン誘導体の全ての完全な汚染除去が、実際に行われることが確保され、さらに、本発明の微生物によって分解され得るあらゆるさらなる毒素が実際に分解されることも確保される。

本発明の微生物によって部分的に又は不完全にのみ分解され得るマイコトキシンへ前記分解を拡張するために、飼料添加物は、マイコトキシン、特にフモニシン及びフモニシン誘導体、ゼアラレノン及びゼアラレノン誘導体、オクラトキシン、トリコテセン及び／又はアフラトキシンを解毒するために、スフィンゴモナス種（Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓｓｐ．）ＤＳＭ１４１７０及びＤＳＭ１４１６７、ステノトロホモナス・ニトリトレデュセンス（Ｓｔｒｅｎｏｔｒｏｐｈｏｍｏｎａｓｎｉｔｒｉｔｒｅｄｕｃｅｎｓ）ＤＳＭ１４１６８、ステノトロフォモナス種（Ｓｔｅｎｏｔｒｏｐｈｏｍｏｎａｓｓｐ．）ＤＭ１４１６９、ラルストニア・ユートロファ（Ｒａｌｓｔｏｎｉａｅｕｔｒｏｐｈａ）ＤＳＭ１４１７１、ユウバクテリウム種（Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍｓｐ．）ＤＳＭ１４１９７、トリコスポロン・マイコトキシニボランス（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎｍｙｃｏｔｏｘｉｎｉｖｏｒａｎｓ）ＤＳＭ１４１５３、クリプトコッカス種（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓｓｐ．）ＤＳＭ１４１５４、ロドトルラ・ヤロウィ（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａｙａｒｒｏｗｉｉ）ＤＳＭ１４１５５、トリコスポロン・ムコイデス（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎｍｕｃｏｉｄｅｓ）ＤＳＭ１４１５６、トリコスポロン・ダルシタム（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎｄｕｌｃｉｔｕｍ）ＤＳＭ１４１６２又はユウバクテリウムＤＳＭ１１７９８から選択される少なくとも１つのさらなる細菌又は酵母をさらに含有する程度までさらに展開される。幾つかの微生物の選択的な組み合わせによって、一つの及び同一の飼料製品中に含有される全ての毒素の完全な分解が、特に、食物又は飼料製品中の幾つかの毒素の相乗効果を安全に回避するように実施可能となる。

本発明のさらなる展開に従って、本発明の飼料添加物は、飼料製品中の又は動物の消化管中の、フモニシンＢ１、Ｂ２、Ｂ３及びフモニシン誘導体、ゼアラレノン、ゼアラレノール、ゼアラレノングリコシド、アフラトキシンＢ１、Ｂ２、Ｇ１、Ｇ２、Ｍ１、Ｍ１、デオキシニバレノール（ＤＯＮ）、Ｔ−２トキシン、ＨＴ−２トキシン、ニバレノール、モノアセトキシスシルペノール、ジアセトキシスシルペノール、トリコデルモール、ベルカリン、ロロジン、アセチルデオキシニバレノール、イソトリコデルミン、ヒドロキシイソトリコデルミン、カロネクトリン、Ｔ−２テトラオール、Ｔ−２トリオール、デアセチレンオソラニオール、ネオソラニオール、アセチレンオソラニオール、スポロトリキオール、トリコトリオール、サムブシノール及びカルモリン及び／又はオクラトキシンＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄを不活化するのに適している。

以下において、本発明は、実施例によってさらに詳細に説明され、実施例１は、最小培地中の一定の毒素濃度のフモニシンＢ１を分解する時間経過を示しており、実施例２は、異なる毒素濃度でのフモニシンＢ１の分解を示しており、実施例３は、複合培地中でのフモニシンＢ１の分解を示しており、実施例４は、食物及び飼料中でのフモニシンＢ１の分解を示しており、実施例５は、本発明の微生物を用いたオクラトキシンの分解を示しており、及び実施例６は、本発明の微生物混合物用いた給餌試験を示している。

２ｍｇ／ＬのフモニシンＢ１の毒素濃度の、最小培地中のフモニシンＢの分解又は解毒
微生物ＤＳＭ１６２５４及びＤＳＭ１６２５７並びに、比較の理由で、株エキソフィアラ・スピニフェラ（Ｅｘｏｐｈｉａｌａｓｐｉｎｉｆｅｒａ）ＤＳＭ１２１７を用いて、試験を行った。

全ての事例において、インキュベーションは、好気的条件下において、２５℃で行った。微生物の培養は、フモニシン−Ｂ１−解毒酵素が最終的に誘導され得るようにするために、一般的な培養培地中、５０ｍｇ／ＬのフモニシンＢ１の存在下で実施した。

図１から、株ＤＳＭ１６２５４及びＤＭＳ１６２５７は、インキュベーションの１時間後に既にフモニシンＢ１を１００％変換するのに対して、比較用の酵母株Ｅ．スピニフェラは、２４時間のインキュベーション期間後に、毒素の４１％以下を変換可能であるに過ぎないことが明らかである。従って、本発明の微生物は、最小培地中でフモニシンＢ１を極めて迅速に解毒することができるのみならず、このような解毒は１００％生じる。

図２は、株ＤＳＭ１６２５４、ＤＳＭ１６２５６、ＤＳＭ１６２５２、ＤＳＭ１６２５７及び比較による酵母株Ｅ．スピニフェラＤＳＭ１２１７に対して、同じ試験アッセイ（すなわち、最小培地及び２ｍｇ／Ｌの毒素濃度）における経時的な変換を示している。これらの分解試験は、本発明の微生物が極めて迅速に分解され、多くの事例で（すなわちＤＳＭ１６２５４、ＤＳＭ１６２５７、ＤＳＭ１６２５２、ＤＳＭ１６２５６）、１００％分解されることを明確に明らかにしているが、比較用の微生物ＤＳＭ１２１７では、これは不可能であった。

異なる毒素濃度のフモニシンＢ１の分解
ＤＳＭ１６２５４、ＤＳＭ１６２５７及びＤＳＭ１６２５６並びに、比較のための酵母株エキソフィアラ・スピニフェラＤＳＭ１２１７を用いて、試験を行った。適用される毒素濃度は、２、１０、５０、１００及び５００ｍｇ／ＬのフモニシンＢ１であった。インキュベーションは、２５℃の好気的条件下で実施した。このようなインキュベーション時間は、飼料中のフモニシンの解毒に関して、実施に適した期間を構成するので、アッセイのインキュベーションの５時間後に、結果が記されている。図３は、本試験の結果を示している。微生物ＤＳＭ１６２５４は、全ての濃度範囲で、フモニシンＢ１を１００％分解することが可能であり、微生物ＤＳＭ１６２５７は１００ｍｇ／ＬフモニシンＢ１の濃度範囲で９６％分解に達することが可能であったに過ぎず、ＤＳＭ１６２５６は２ｍｇ／Ｌの濃度で１００％の分解、１０ｍｇ／Ｌの濃度で５０％超の分解、５０ｍｇ／Ｌ及び１００ｍｇ／Ｌの濃度でそれぞれ３５％及び２５％の分解が可能であった。Ｅ．スピニフェラＤＳＭ１２１７との比較によって、特に極めて低い毒素濃度で、この微生物に対する分解性が極めて不良であることが示され、ＤＳＭ１２１７の最も優れた活性は、約３０％のフモニシンＢ１分解速度で、１０ｍｇ／Ｌで生じた。この比較から、本発明の微生物はあらゆる濃度範囲でＤＳＭ１２１７より優れているという結果、及び特に低毒素濃度で、１００％の分解が可能であるという結果が得られたが、これは、これまでのところ、従来技術による微生物では可能でなかった。

複合培地中でのフモニシンＢ１の分解
この試験は、微生物が、高い栄養素濃度の存在下において、複合培地中でフモニシンＢ１を解毒する能力を調べた。微生物の培養は、肉抽出物から得た５ｇ／Ｌのペプトン及び３ｇ／Ｌの肉抽出物を含み、フモニシンＢ１の２つの異なる濃度、すなわち、１０ｍｇ／Ｌ及び１００ｍｇ／Ｌを補充した複合栄養培地中で行った。変換速度の測定は、好気的条件下における２５℃での７２時間のインキュベーションの開始時と終了時にアッセイ中の毒素含量を比較することによって実施した。何れの事例においても、培地中の１０ｍｇ／ＬのフモニシンＢ１の存在下で、フモニシンＢ１の１００％の解毒又は１００％の分解が得られた。１００ｍｇ／ＬのフモニシンＢ１の存在下でさえ、何れの事例においても、１００％の解毒が達成された。この試験は、本発明の微生物が、複合培地、すなわち、栄養素供給が増大した培地中での、フモニシンの分解に適していることを明確に証明した。

食物及び飼料中のフモニシンＢ１の分解
ビール、ポレンタ及びセモリナ中の１０ｍｇ／ＬのフモニシンＢ１の毒素濃度を分解するために、微生物ＤＳＭ１６２５４及びＤＳＭ１６２５７を再び使用した。微生物を培養した後、微生物を採集し、毒素含有緩衝溶液中に再懸濁し、続いて、それぞれの食物又は飼料製品とともに、すぐにインキュベートした。フモニシンＢ１の分解率は、全ての事例で１００％であり、従って、本発明の微生物が、飼料又は食物中のフモニシンを１００％分解できることを明確に証明している。

本発明の微生物による他のマイコトキシンの分解
この事例では、典型的なマイコトキシンとしてオクラトキシンＡを使用した。株ＤＳＭ１６２５４、ＤＳＭ１６２５５、ＤＳＭ１６２５６及びＤＳＭ１６２５７を使用した。オクラトキシンの分解は、１２０時間のインキュベーションで、好気的緩衝液中、４００μｇ／ＬのオクラトキシンＡの存在下で行われた。株ＤＳＭ１６２５５は、２時間後に既に９５％の解毒を示し、２４時間後には、株ＤＳＭ１６２５４及び株ＤＳＭ１６２５５はともに、オクラトキシンＡ１００％を解毒し、４８時間後には、ＤＳＭ１６２５６で、９０％の解毒を測定することもでき、１２０時間後には、株ＤＳＭ１５２５７でさえ、オクラトキシンＡを１００％解毒した。

マイコトキシンが補充された食物及び飼料の完全な解毒のための、異なる微生物の組み合わせ又は混合された培養物を用いた給餌試験
子ブタ試験Ｉ
本試験では、添加物として、株ＤＳＭ１６２５４及びＤＳＭ１４１５３を使用した。各添加物は、１×１０^１２ＫＢＥ／ｋｇ添加物の総細菌数を有していた。試験期間は、４２日であった。各２４匹の動物の４つの群に、動物を分けた。対照群（ＫＧ）には、飼料添加物を一切含まない汚染されていない標準飼料を与えた。毒素群（ＴＧ）には、５００ｐｐｂのオクラトキシンＡ、２５０ｐｐｂのゼアラレノン及び１，５００ｐｐｂのフモニシンＢ１が補充された家畜用飼料を与えた。試験群１（ＶＧ１）及び試験群２（ＶＧ２）には、それぞれ、毒素が補充された同一の家畜用飼料を与えたが、試験群１には０．５ｋｇの添加物を加え、試験群２には１ｋｇの添加物を加えた。試験の終了時に、以下の結果が得られた。

子ブタ試験ＩＩ
本試験では、添加物として、株ＤＳＭ１６２５４、ＤＳＭ１１７９８及びＤＳＭ１４１５３を使用した。各添加物は、２．５×１０^１２ＫＢＥ／ｋｇ添加物の総細菌数を有していた。試験期間は、４２日であった。各１９匹の動物の４つの群に、動物を分けた。毒素群（ＴＧ）には、１．１ｐｐｍのデオキシニバレノール及び２ｐｐｍのフモニシンＢ１が補充されているが、添加物を含有しない家畜用飼料を与えた。試験群１（ＶＧ１）、試験群２（ＶＧ２）及び試験群３（ＶＧ３）には、それぞれ、毒素が補充された同一の家畜用飼料を与えたが、試験群１には０．５ｋｇの添加物を加え、試験群２には１ｋｇの添加物を加え、試験群３には２ｋｇの添加物を加えた。試験の終了時に、以下の結果が得られた。

子ブタ試験ＩＩＩ
本試験では、添加物として、株ＤＳＭ１６２５４を使用した。添加物は、１×１０^１１ＫＢＥ／ｋｇ添加物の総細菌数を有していた。試験期間は、４２日であった。各３０匹の動物の２つの群に、動物を分けた。毒素群（ＴＧ）には、４．５ｐｐｍのフモニシンＢ１が補充された家畜用飼料を与えた。試験群には、毒素が補充され、さらに０．５ｋｇの添加物を加えた同一の家畜用飼料を与えた。試験の終了時に、以下の結果が得られた。

若鶏試験Ｉ
本試験では、添加物として、株ＤＳＭ１６２５４を使用した。添加物は、２．５×１０^１１ＫＢＥ／ｋｇ添加物の総細菌数を有していた。各１４０，０００匹の動物の２つの群に、動物を分けた。毒素群（ＴＧ）には、３００ｐｐｍのアフラトキシンと２ｐｐｍのフモニシンが補充された家畜用飼料を与えた。試験群には、毒素が補充され、さらに１ｋｇ添加物／トン家畜用飼料が加えられた同一の家畜用飼料を与えた。試験の終了時に、以下の結果が得られた。

若鶏試験ＩＩ
本試験では、添加物として、株ＤＳＭ１６２５４及びＤＳＭ１１７９８を使用した。添加物は、４×１０^１１ＫＢＥ／ｋｇ添加物の総細菌数を有していた。各２６０匹の動物の３つの群に、動物を分けた。対照群には、汚染されていない家畜用飼料を与えた。毒素群（ＴＧ）には、３．５ｐｐｍのフモニシン及び１．８ｐｐｍのＴ−２毒素が補充された家畜用飼料を与えた。試験群には、毒素が補充され、さらに１ｋｇ添加物／トン家畜用飼料が加えられた同一の家畜用飼料を与えた。試験の終了時に、以下の結果が得られた。

国際特許協力条約に基づく施行規則の規則第１３条の２第４項に基づくリスト。

本ＰＣＴ出願ＰＣＴ／ＡＴ２００５／００４５３号に掲載されている微生物は全て、ＤＳＭＺ（ＤｅｕｔｓｃｈｅＳａｍｍｌｕｎｇｖｏｎＭｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎｕｎｄＺｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎＧｍｂＨ（ＧｅｒｍａｎＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎｏｆＭｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓａｎｄＣｅｌｌＣｕｌｔｕｒｅｓ））、ＭａｓｃｈｅｒｏｄｅｒＷｅｇ１ｂ、３８１２４Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ（ＤＥ）に寄託された。

図１はフモニシンＢ１−％で表した変換を示す。図２はフモニシンＢ１−％で表した変換を示す。図３はＦＢ１−％で表した変換を示す。図４はＯＴＡ−％で表した分解を示す。

Claims

フモニシン及びフモニシン誘導体を汚染除去するための微生物であり、単一段階又は複数段階反応において、フモニシンを脱アミノ化された代謝物へと酵素的に変換する、分類群スフィンゴモナス科（Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｄａｃｅａｅ）に割り当て可能な株ＤＳＭ１６２５４及びＤＳＭ１５２５７から選択される解毒細菌が使用される前記微生物。
前記細菌が、粉末、液体又はゲルの形態で安定化されることを特徴とする、請求項１に記載の微生物。
前記細菌が、無細胞抽出物又は粗抽出物として使用されることを特徴とする、請求項１又は２に記載の微生物。
前記細菌が、フモニシン及びフモニシン誘導体に加えて、ゼアラレノン、アフラトキシン又はオクラトキシンから選択される少なくとも１つのさらなるマイコトキシンを解毒することを特徴とする、請求項１、２又は３に記載の微生物。
食物及び／又は飼料中のフモニシン及びフモニシン誘導体を解毒するための、分類群スフィンゴモナス科（Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｄａｃｅａｅ）に割り当て可能な株ＤＳＭ１６２５４及びＤＳＭ１５２５７から選択される、単独の又は２つの株を組み合せた細菌の使用。
前記細菌が、さらに、ゼアラレノン、アフラトキシン又はオクラトキシンから選択される少なくとも１つのさらなるマイコトキシンを解毒するために使用されることを特徴とする、請求項５に記載の使用。
マイコトキシンを解毒するために細菌の培養物が使用されることを特徴とする、請求項５又は６に記載の使用。
１００μｇ／ｋｇ〜５００ｍｇ／ｋｇのフモニシン及びフモニシン誘導体、１０μｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇのゼアラレノン及びゼアラレノン誘導体、１μｇ／ｋｇ〜２ｍｇ／ｋｇのアフラトキシン、及び１μｇ／ｋｇ〜２ｍｇ／ｋｇのオクラトキシンからなる群から選択される低いマイコトキシン濃度を汚染除去するための請求項５、６又は７に記載の使用。
フモニシン及びフモニシン誘導体、ゼアラレノン及びゼアラレノン誘導体、オクラトキシン、及びトリコテセン及び／又はアフラトキシンからなる群から選択されるマイコトキシンを解毒するために、一緒に存在するフモニシン及びフモニシン誘導体、ゼアラレノン及びゼアラレノン誘導体、及びアフラトキシン又はオクラトキシンからなる群から選択されるマイコトキシンを解毒するためにスフィンゴモナス種（Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓｓｐ．）ＤＳＭ１４１７０及びＤＳＭ１４１６７、ステノトロホモナス・ニトリトレデュセンス（Ｓｔｒｅｎｏｔｒｏｐｈｏｍｏｎａｓｎｉｔｒｉｔｒｅｄｕｃｅｎｓ）ＤＳＭ１４１６８、ステノトロフォモナス種（Ｓｔｅｎｏｔｒｏｐｈｏｍｏｎａｓｓｐ．）ＤＳＭ１４１６９、ラルストニア・ユートロファ（Ｒａｌｓｔｏｎｉａｅｕｔｒｏｐｈａ）ＤＳＭ１４１７１、ユウバクテリウム種（Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍｓｐ．）ＤＳＭ１４１９７、トリコスポロン・マイコトキシニボランス（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎｍｙｃｏｔｏｘｉｎｉｖｏｒａｎｓ）ＤＳＭ１４１５３、クリプトコッカス種（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓｓｐ．）ＤＳＭ１４１５４、ロドトルラ・ヤロウィ（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａｙａｒｒｏｗｉｉ）ＤＳＭ１４１５５、トリコスポロン・ムコイデス（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎｍｕｃｏｉｄｅｓ）ＤＳＭ１４１５６、トリコスポロン・ダルシタム（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎｄｕｌｃｉｔｕｍ）ＤＳＭ１４１６２又はユウバクテリウムＤＳＭ１１７９８から選択される少なくとも１つのさらなる細菌又は酵母をさらに含有する組み合わせ又は混合された培養物が使用されることを特徴とする、請求項５〜８の何れか一項に記載の使用。
１０^３／ｇ家畜用飼料から１０^８／ｇ家畜用飼料までの細菌数を有する家畜用飼料中のフモニシンを、単一段階又は複数段階反応において、脱アミノ化された代謝物へと酵素的に変換することを含む、請求項１〜４の何れか一項に記載の微生物を用いてフモニシン及びフモニシン誘導体を汚染除去する方法。
前記解毒が、最小培地又は過剰の栄養素供給及び炭素源を有する複雑な環境中において、水性条件下で実施されることを特徴とする請求項１０に記載の方法。
１５分〜１２時間以内に実施されることを特徴とする、請求項１０又は１１に記載の方法。
ゼアラレノン、アフラトキシン又はオクラトキシンから選択される少なくとも１つのさらなるマイコトキシンが、無毒の分解産物へと変換されることを特徴とする、請求項１０、１１又は１２に記載の方法。
フモニシン及びフモニシン誘導体、ゼアラレノン及びゼアラレノン誘導体、オクラトキシン、及びトリコテセン及び／又はアフラトキシンからなる群から選択されるマイコトキシンを解毒するために、スフィンゴモナス種（Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓｓｐ．）ＤＳＭ１４１７０及びＤＳＭ１４１６７、ステノトロホモナス・ニトリトレデュセンス（Ｓｔｒｅｎｏｔｒｏｐｈｏｍｏｎａｓｎｉｔｒｉｔｒｅｄｕｃｅｎｓ）ＤＳＭ１４１６８、ステノトロフォモナス種（Ｓｔｅｎｏｔｒｏｐｈｏｍｏｎａｓｓｐ．）ＤＳＭ１４１６９、ラルストニア・ユートロファ（Ｒａｌｓｔｏｎｉａｅｕｔｒｏｐｈａ）ＤＳＭ１４１７１、ユウバクテリウム種（Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍｓｐ．）ＤＳＭ１４１９７、トリコスポロン・マイコトキシニボランス（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎｍｙｃｏｔｏｘｉｎｉｖｏｒａｎｓ）ＤＳＭ１４１５３、クリプトコッカス種（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓｓｐ．）ＤＳＭ１４１５４、ロドトルラ・ヤロウィ（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａｙａｒｒｏｗｉｉ）ＤＳＭ１４１５５、トリコスポロン・ムコイデス（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎｍｕｃｏｉｄｅｓ）ＤＳＭ１４１５６、トリコスポロン・ダルシタム（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎｄｕｌｃｉｔｕｍ）ＤＳＭ１４１６２又はユウバクテリウムＤＳＭ１１７９８から選択される少なくとも１つのさらなる細菌又は酵母をさらに含有する組み合わせ又は混合された培養物が使用されることを特徴とする、請求項１０〜１３の何れか一項に記載の方法。
食物及び／又は飼料の汚染除去のために、微生物が、それぞれ、０．０１重量％〜１．５重量％の範囲の量の前記食物及び／又は飼料と混合されることを特徴とする、請求項１０〜１３の何れか一項に記載の方法。
前記飼料添加物が、２×１０^８／ｋｇ飼料添加物から２×１０^１５／ｋｇ飼料添加物までの細菌数で、請求項１〜４の何れか一項に記載の微生物を含有することを特徴とするフモニシン及びフモニシン誘導体から選択されるマイコトキシンを不活化するための飼料添加物。
フモニシン及びフモニシン誘導体、ゼアラレノン及びゼアラレノン誘導体、オクラトキシン、及びトリコテセン及び／又はアフラトキシンからなる群から選択されるマイコトキシンを解毒するために、スフィンゴモナス種（Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓｓｐ．）ＤＳＭ１４１７０及びＤＳＭ１４１６７、ステノトロホモナス・ニトリトレデュセンス（Ｓｔｒｅｎｏｔｒｏｐｈｏｍｏｎａｓｎｉｔｒｉｔｒｅｄｕｃｅｎｓ）ＤＳＭ１４１６８、ステノトロフォモナス種（Ｓｔｅｎｏｔｒｏｐｈｏｍｏｎａｓｓｐ．）ＤＳＭ１４１６９、ラルストニア・ユートロファ（Ｒａｌｓｔｏｎｉａｅｕｔｒｏｐｈａ）ＤＳＭ１４１７１、ユウバクテリウム種（Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍｓｐ．）ＤＳＭ１４１９７、トリコスポロン・マイコトキシニボランス（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎｍｙｃｏｔｏｘｉｎｉｖｏｒａｎｓ）ＤＳＭ１４１５３、クリプトコッカス種（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓｓｐ．）ＤＳＭ１４１５４、ロドトルラ・ヤロウィ（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａｙａｒｒｏｗｉｉ）ＤＳＭ１４１５５、トリコスポロン・ムコイデス（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎｍｕｃｏｉｄｅｓ）ＤＳＭ１４１５６、トリコスポロン・ダルシタム（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎｄｕｌｃｉｔｕｍ）ＤＳＭ１４１６２又はユウバクテリウムＤＳＭ１１７９８から選択される少なくとも１つのさらなる細菌又は酵母をさらに含有することを特徴とする、請求項１６に記載の飼料添加物。
飼料製品中の又はヒトを除く動物の消化管中の、フモニシンＢ１、Ｂ２、Ｂ３及びフモニシン誘導体、ゼアラレノン及びゼアラレノン誘導体、ゼアラレノール、ゼアラレノングリコシド、アフラトキシンＢ１、Ｂ２、Ｇ１、Ｇ２、Ｍ１、Ｍ１、デオキシニバレノール（ＤＯＮ）、Ｔ−２トキシン、ＨＴ−２トキシン、ニバレノール、モノアセトキシスシルペノール、ジアセトキシスシルペノール、トリコデルモール、ベルカリン、ロロジン、アセチルデオキシニバレノール、イソトリコデルミン、ヒドロキシイソトリコデルミン、カロネクトリン、Ｔ−２テトラオール、Ｔ−２トリオール、デアセチレンオソラニオール、ネオソラニオール、アセチレンオソラニオール、スポロトリキオール、トリコトリオール、サムブシノール及びカルモリン及び／又はオクラトキシンＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄを不活化するための、請求項１６又は１７に記載の飼料添加物の使用。