JP4852211B2 - 原核生物における必須遺伝子の同定 - Google Patents

Description

【０００１】
［配列表］
本出願は、電子フォーマットの配列表を含有する「コピー１」および「コピー２」と印をつけたＣＤ−ＲＯＭの２通のコピーとともに提出されている。ＣＤ−ＲＯＭの２通のコピーは各々、３７，４８７，９１２バイトのサイズのＳＥＱＬＩＳＴ＿ＦＩＮＡＬ＿９ＰＭ（２００１年３月２０日作製）と表題を付したファイルを含有する。
【０００２】
［発明の背景］
ペニシリンの発見以来、細菌感染の被害を治療するための抗生物質の使用は何百万人もの命を救ってきた。これらの「奇跡の薬」の出現に伴い、人類はこれを最後に細菌感染の苦悩から救済される、と一時は一般に考えられた。実際、１９８０年代ならびに１９９０年代初頭、多数の大製薬会社が抗生物質の研究および開発を削減、または撤廃した。細菌により引き起こされる感染性疾患は遂に征服され、そして新薬の市場は限定されたと考えられた。残念ながら、この確信はあまりにも楽観的であった。
【０００３】
薬剤耐性細菌の報告がより頻繁になっているように、形勢は細菌の利益となるように向きを変え始めている。米国疾患管理センター（United States Centers for Disease Control｝は、最も強力な既知の抗生物質の１つ、バンコマイシンが一般的スタフィロコッカス・オーレウス（Staphylococcusaureus）（staph）の感染を治療できなかったと発表した。この生物は一般にわれわれの環境中に見出され、多数の院内感染に関与する。この発表の意味は、スタフィロコッカススピーシーズ(Staphylococcus species)ならびにその他の細菌の頑強菌株により引き起こされる感染を治療するためにバンコマイシンが長年用いられたと考えた場合に明らかになる。要約すれば、細菌は、われわれの最も強力な抗生物質に対して耐性になりつつある。この傾向が続けば、ちょっとした細菌感染と目下考えられているものが致命的疾患になる時代に戻ると考えられる。
【０００４】
幾人かの医者による過剰処方および不適正処方習癖は、一般の人々に対する抗生物質の利用可能性の見境のない増大を生じてきた。患者は、しばしば薬剤を不適正に使用し、それにより伝統的抗生物質に対して全体的にまたは一部耐性である細菌のさらに別の集団を生じるために、彼等も部分的に関与している。
【０００５】
人類を悩ました細菌病原体は、それらが引き起こす疾患を処置するための現代科学的実践の発展にもかかわらず、残存している。薬剤耐性細菌は、現在、人類の健康に対する脅威をますます増大しつつある。細菌が示す未決の健康脅威を今一度処理するためには、抗生物質の新規の生成が必要とされている。
【０００６】
新規の抗生物質の発見
ますます多くの細菌株が、利用可能な抗生物質のパネルに対して耐性になるにつれ、感染を治療するために新規の抗生物質が必要とされる。過去においては、薬理学の開業医は、疾患の治療のための新規の安全かつ有効な化合物を生成するためには薬剤発見の伝統的方法に頼らねばならなかった。伝統的薬剤発見法は、何らかの疾患に対する有効な治療であることを立証し得るという希望の下に、しばしば無作為に選択された、考え得る薬剤候補分子を盲検することを含む。本過程は、骨の折れ、かつ労力を要するものであり、成功の保証はない。今日、新規の薬剤を発見し、開発するための平均コストは５億米国ドルを超え、そして研究室から患者までの平均時間は１５年である。この過程の改良は、漸増的であっても、新規の抗菌剤の生成における巨大な進歩を示す。
【０００７】
薬剤発見における新生の実務は、多数の生化学的技法を利用して、それらを無作為に発見するというよりむしろ、新薬を創製するために向けられるアプローチを提供する。例えば、細胞または微生物の増殖に必要とされる遺伝子配列およびそれによりコードされるタンパク質は、これらの標的に対して活性な化合物への細菌の曝露が細胞または微生物の不活性化を生じるために、優れた標的をとなる。いったん標的が同定されれば、その標的の生化学的分析を用いて、標的と相互作用し、標的の機能を変える分子を発見または設計し得る。このような標的と相互作用する化合物を得るために、標的の構造的および生化学的特性を分析するための物理的技術およびコンピュータ技術の使用は、合理的薬剤設計と呼ばれ、多大な可能性を提供する。したがって新生薬剤発見実践は、分子モデリング技法、コンビナトリアルケミストリーアプローチおよび多数の候補化合物を生成、スクリーニングおよび／または設計するためのその他の手段を使用する。
【０００８】
薬剤発見へのこのアプローチは明らかに将来性を有する方法であるにもかかわらず、一方では問題が残存する。例えば、研究のための分子標的を同定する初期段階は、非常に時間を要する仕事であり得る。コンピュータモデリング技法を用いることにより標的と相互作用する分子を設計することも難しいことであり得る。さらに、標的の機能が既知でないかまたは十分に理解されていない場合、標的と相互作用し、標的の機能を変える分子を検出するためのアッセイを設計するのは困難であり得る。新規薬剤の発見および開発の速度を改善するためには、病原細胞または微生物中の重要な分子標的を同定する方法、およびこのような分子標的と相互作用し、その機能を変える分子を同定する方法が緊急に必要とされる。
【０００９】
スタフィロコッカス・オーレウスは、多数の感染性疾患の原因物質であるグラム陽性微生物である。スタフィロコッカス・オーレウスによる局所感染は、皮膚上の膿瘍および皮下組織の蜂巣炎を引き起こし得るし、毒素関連疾患、例えば中毒性ショックおよび熱傷様皮膚症候群を生じ得る。スタフィロコッカス・オーレウスは、重篤な全身性感染、例えば骨髄炎、心内膜炎、肺炎、および敗血症を引き起こし得る。スタフィロコッカス・オーレウスは、しばしば調理済食品と感染食品産業労働者の間の接触から発生する食中毒の一般的原因でもある。すべての利用可能な抗生物質に対して目下耐性であるものを含むスタフィロコッカス・オーレウスの抗生物質耐性菌株が近年同定され、それにより医者が利用可能な治療の選択を厳しく制限している。
【００１０】
シュードモナス・アエルギノーサ（Pseudomonasaeruginosa）は、重要なグラム陰性日和見病原体である。それは、院内感染において見出される最も一般的なグラム陰性菌である。シュードモナス・アエルギノーサは、院内肺炎症例の１６％、病院獲得性尿路感染の１２％、外科手術的創傷感染の８％、および血流感染の１０％の原因である。免疫無防備状態患者、例えば好中球減少性癌および骨髄移植患者は、日和見感染に特に罹りやすい。この群の患者においては、シュードモナス・アエルギノーサは、死因の３０％を占める肺炎および敗血症の病因である。シュードモナス・アエルギノーサは、直接的な死亡率が３８％に達する挿管患者における換気装置関連肺炎の原因である最も一般的なそして致死的な病原体の１つでもある。熱傷患者におけるシュードモナス・アエルギノーサ発生は稀であるが、しかしそれは６０％の死亡率を伴う。エイズ集団では、シュードモナス・アエルギノーサは死亡の５０％に関連する。嚢胞性線維症患者はシュードモナス・アエルギノーサによる慢性感染に特徴的に感染しやすく、このことが高率の疾病および死亡の原因である。一般的抗生物質はＣＦ感染に対して十分に働かない（Van Delden & Igelwski. 1998. Emerging Infectious Disease4:551-560；references therein）。
【００１１】
グラム陰性腸内細菌属のサルモネラ属（Salmonella）は、少なくとも２つの種を含む。これらのうちの１つであるサルモネラ・エンテリカ（S.enterica）は、多数の亜種および数千の血清型または血液型亜型に分けられる（Brenner, et al. 2000 J. Clin. Microbiol. 38:2465-2467）。Ｓ・エンテリカヒト病原体としては、血液型亜型サルモネラ・チフィ（Typhi）、サルモネラ・パラチフィ（Paratyphi）、サルモネラ・チフィムリウム（Typhimurium）、ブタコレラ菌（Cholerasuis）、ならびにそれらが広範な種の変異体であるよう密接に関連すると思われる多数のその他のものが挙げられる。世界中で、サルモネラにより引き起こされるヒトの疾患は、非常に重大な問題である。多くの開発途上国においては、サルモネラ・チフィ(S. enterica ser. Typhi）は未だにしばしば致死的チフス熱を引き起こす。この問題は、富んだ産業国においては低減されるかまたは排除されてきた。しかしながら、サルモネラにより誘発される腸炎はあまねく蔓延しており、米国における汚染食品により引き起こされる２番目に最も一般的な疾患である（Edwards, BH 1999 "Salmonella and Shigella species" Clin.Lab Med. 19(3):469-487）。通常は健常個体においては自己限定性であるが、しかし他の者、例えば小児、年長者、ならびに疑わしい疾病を有するものは、重大な疾病および死亡の非常に大きな危険に直面する可能性がある。
【００１２】
いくつかのＳ・エンテリカ血液型亜型(例えばサルモネラ・チフィムリウム)は、消化管における限局性感染を引き起こす。その他の血液型亜型(すなわちサルモネラ・チフィおよびサルモネラ・パラチフィ)は、より重篤な全身性感染を引き起こす。動物モデルでは、これらの役割は逆転され得るが、このことがチフス熱作因であるサルモネラ・チフィ（S. enterica ser Typhimarium）に代わるマウスにおける代理物としての相対的に安全なサルモネラ・チフィムリウム（S. enterica ser Typhimarium）の使用を可能にした。マウスにおいては、サルモネラ・チフィムリウム（S. enterica ser Typhimarium）は、結果においてチフス熱の結果に類似する全身性感染を引き起こす。サルモネラについての長年の研究は、動物およびヒトにおけるビルレンスの多数の決定因子の同定をもたらした。サルモネラは、腸上皮に局在し、侵襲し、ある種の細胞リモデリングタンパク質の注入により標的細胞の形態的変化を誘導し、そして膜結合小胞中に細胞内に存在するその能力が興味深い（Wallis, TS and Galyov, EE 2000 "Molecular basis ofSalmonella-induced enteritis." Molec. Microb. 36: 997-1005; Falkow, S"The evolution of pathogenicity in Escherichia, Shigella, and Salmonella,"Chap. 149 in Neidhardt, et al. eds pp 2723-2729; Gulig, PA "Pathogenesisof Systemic Disease," Chap. 152 in Neidhardt, et al. ppp 2774-2787）。即時感染は、しばしば重篤な水様下痢を生じるが、サルモネラはいくつかの個体においては無症状性キャリア状態を確立し、保持することもできる。蔓延は、汚水に汚染された食物を介して生じる。
【００１３】
サルモネラ病因に関与する遺伝子産物としては、３型分泌系（ＴＴＳＳ）、すなわち、標的細胞の細胞質構造に影響を及ぼすタンパク質、宿主中のサルモネラの生存および増殖に必要な機能を実行する多数のタンパク質、ならびに「伝統的」因子、例えば内毒素および分泌外毒素が挙げられる。さらに、種特異的疾病を媒介する因子が存在しなければならない。これにもかかわらず、ほとんどのサルモネラ・チフィ（S. enterica ser. Typhi）（ゲノムデータベースに関しては、http://www.sanger.ac.uk/Projects/S typhi参照）およびサルモネラ・チフィムリウム（S. enterica ser.Typhimurium）（ゲノムデータベースに関しては、http://genome.wustl.edu/gsc/bacterial/salmonella.shtml参照）のゲノムは高度に保存され、そして多血液型亜型における遺伝子同定のために相互に有用である。サルモネラは他のグラム陰性腸内菌、例えばエシェリヒア・コリに類似するが別個の疾患を引き起こす腸内細菌の複合群であり、前世紀中は生物医学的研究の中心であった。
【００１４】
グラム陽性菌であるエンテロコッカス・フェカリス（Enterococcus faecalis）は、断然、ヒトにおける感染を引き起こすエンテロコッカス菌の最も一般的な成員である。エンテロコッカス・フェカリスは一般に、臨床的単離物の２０％未満を占める。エンテロコッカス菌感染はほとんどが病院獲得性であるが、それらはいくつかの共同体獲得性感染にも関連する。院内感染エンテロコッカス菌は、菌血症症例の１２％、外科手術創傷感染の１５％、尿路感染の１４％および心内膜炎の５〜１５％を占める（Huycke, M.M., D.F., Sahm and M.S. Gilmore. 1998. Emerging InfectiousDiseases 4:239-249）。さらにエンテロコッカス菌は、腹腔内および骨盤内感染に高頻度で関連する。エンテロコッカス菌感染は、それらが厖大な抗菌薬、例えばアミノグリコシド、ペニシリン、アンピシリンおよびバンコマイシンに耐性であるために、しばしば治療が困難である。多薬剤耐性（ＭＤＲ）エンテロコッカス菌の発生は、この細菌を院内感染の治療に関する大きな関心事にさせた。
【００１５】
これらの理由は、スタフィロコッカス・オーレウス、サルモネラ・チフィムリウム（Salmonella typhimurium）、クレブシエラ・ニューモニエ（Klebsiella pneumoniae）、シュードモナス・アエルギノーサおよびエンテロコッカス・フェカリスに対して有効である新規の抗生物質の開発の緊急性を強調する。したがって、増殖に関与する遺伝子産物をコードし、それにより抗生物質開発のための考え得る新規の標的になる細菌ゲノム配列を同定し、特性化するためのより新規の方法が緊急に必要とされている。本発明以前には、微生物の増殖に必要とされるスタフィロコッカス・オーレウス、サルモネラ・チフィムリウム、クレブシエラ・ニューモニエ、シュードモナス・アエルギノーサおよびエンテロコッカス・フェカリス遺伝子の発見は、骨の折れ、かつ遅い過程であった。スタフィロコッカス・オーレウス、サルモネラ・チフィムリウム、クレブシエラ・ニューモニエ、シュードモナス・アエルギノーサまたはエンテロコッカス・フェカリス細胞内の新規の細胞性薬剤標的の検出は新規の抗生物質開発のための鍵であり、本発明以前の利用可能な薬剤標的発見の一般的方法は、長年の労力を要する骨の折れる過程を必要としてきた。
【００１６】
［発明の概要］
本発明の幾つかの態様を、以下の番号のついた項に記載する。
【００１７】
１．配列番号８〜３７９５の１つから本質的に構成されるヌクレオチド配列を含む精製または単離された核酸配列であって、上記核酸の発現は細胞増殖を抑制する、核酸配列。
【００１８】
２．上記ヌクレオチド配列は、発現が細胞増殖に必要である遺伝子のコード配列の少なくとも一部に相補的である、項１に記載の核酸配列。
【００１９】
３．上記核酸配列は、細胞増殖に必要なＲＮＡのヌクレオチド配列の少なくとも一部に相補的である、項１に記載の核酸。
【００２０】
４．上記ＲＮＡは、１つより多い遺伝子産物をコードするヌクレオチドの配列を含むＲＮＡである、項３に記載の核酸。
【００２１】
５．配列番号８〜３７９５の１つの断片を含む精製または単離された核酸であって、上記断片は、配列番号８〜３７９５の１つの少なくとも１０個、少なくとも２０個、少なくとも２５個、少なくとも３０個、少なくとも５０個、および５０個より多い連続ヌクレオチドを含む断片からなる群から選ばれる核酸。
【００２２】
６．上記断片は、アナプラスマ・マルギナレ(Anaplasmamarginale)、アスペルギルス・フミガツス(Aspergillusfumigatus)、バチルス・アンスラシス(Bacillusanthracis)、バクテリオイデス・フラギリス(Bacterioidesfragilis)、百日咳菌(Bordetellapertussis)、ブルクホルデリア・セパシア(Burkholderiacepacia)、カンピロバクター・イェジュニィ(Campylobacterjejuni)、カンジダ・アルビカンス (Candidaalbicans)、カンジダ・グラブラタ(Candidaglabrata)（トルロプシス・グラブラタ(Torulopsisglabrata)とも呼ばれる）、カンジダ・トロピカリス(Candidatropicalis)、カンジダ・パラプシロシス(Candidaparapsilosis)、カンジダ・ギルリエルモンジイ(Candidaguilliermondii)、カンジダ・クルセイ(Candidakrusei)、カンジダ・ケフィア(Candidakefyr)（カンジダ・シュードトロピカリス(Candidapseudotropicalis)とも呼ばれる）、カンジダ・デュブリニエンシス(Candida dubliniensis)、クラミジア・ニューモニエ(Chlamydia pneumoniae)、トラコーマ・クラミジア(Chlamydia trachomatus)、クロストリジウム・ボツリヌム(Clostridium botulinum)、クロストリジウム・ジフィシル(Clostridium difficile)、クロストリジウム・パーフリンゲンス(Clostridium perfringens)、コクシジオデス・イミチス(Coccidiodes immitis)、コリネバクテリウム・ジフテリア(Corynebacterium diptheriae)、クリプトコックス・ネオフォルマンス(Cryptococcus neoformans)、エンテロバクター・クロアカエ(Enterobacter cloacae)、エンテロコックス・フェカリス(Enterococcus faecalis)、エンテロコックス・ファエシウム(Enterococcus faecium)、エシェリヒア・コリ(Escherichia coli)、ヘモフィルス・インフルエンザ(Haemophilus influenzae)、ヘリコバクター・ピロリ(Helicobacter pylori)、ヒストプラスマ・カプスラツム(Histoplasma capsulatum)、クレブシエラ・ニューモニエ(Klebsiella pneumoniae)、リステリア・モノサイトゲネス(Listeria monocytogenes)、マイコバクテリウム・レプラエ(Mycobacterium leprae)、マイコバクテリウム・ツベルクローシス(Mycobacterium tuberculosis)、ナイセリア・ゴノローエ(Neisseria gonorrhoeae)、髄膜炎菌(Neisseria meningitidis)、ノカルジア・アステロイデス(Nocardia asteroides)、パスツレラ・ヘモリチカ(Pasteurella haemolytica)、パスツレラ・ムルトシダ(Pasteurella multocida)、ニューモシスティス・カリニー(Pneumocystis carinii)、プロテウス・ブルガリス(Proteus vulgaris)、シュードモナス・アエルギノーサ(Pseudomonas aeruginosa)、サルモネラ・ボンゴリ(Salmonella bongori)、サルモネラ・コレラスイス(Salmonella cholerasuis)、サルモネラ・エンテリカ(Salmonella enterica)、サルモネラ・パラチフィ(Salmonella paratyphi)、サルモネラ・チフィ(Salmonella typhi)、サルモネラ・チフィムリウム(Salmonella typhimurium)、スタフィロコッカス・オーレウス(Staphylococcus aureus)、リステリア・モノサイトゲネス(Listeria monocytogenes)、モクサレラ・カタルハリス(Moxarella catarrhalis)、シゲラ・ボイディ(Shigella boydii)、シゲラ・ディッセンリイ(Shigelladysenteriae)、シゲラ・フレックスネリ(Shigellaflexneri)、シゲラ・ソネイ(Shigellasonnei)、スタフィロコッカス・エピダーミディス(Staphylococcusepidermidis)、ストレプトコッカス・ニューモニエ(Streptococcuspneumoniae)、ストレプトコッカス・ミュータンス(Streptococcusmutans)、トレポネーマ・パリダム(Treponemapallidum)、エルシニア・エンテロコリチカ(Yersiniaenterocolitica)、エルシニア・ペスティス(Yersiniapestis)、および上記種のいずれかの属に属する任意の種からなる群から選ばれる生物から得られる核酸に含まれる、項５に記載の断片。
【００２３】
７．上記断片は、エシェリヒア・コリ以外の生物から得られる核酸に含まれる、項５に記載の断片。
【００２４】
８．項１〜７のいずれか１項に記載の核酸に作動可能に連結されたプロモーターを含むベクター。
【００２５】
９．上記プロモーターは、アナプラスマ・マルギナレ(Anaplasma marginale)、アスペルギルス・フミガツス(Aspergillus fumigatus)、バチルス・アンスラシス(Bacillus anthracis)、バクテリオイデス・フラギリス(Bacterioides fragilis)、百日咳菌(Bordetella pertussis)、ブルクホルデリア・セパシア(Burkholderia cepacia)、カンピロバクター・イェジュニィ(Campylobacter jejuni)、カンジダ・アルビカンス (Candida albicans)、カンジダ・グラブラタ(Candida glabrata)（トルロプシス・グラブラタ(Torulopsis glabrata)とも呼ばれる）、カンジダ・トロピカリス(Candida tropicalis)、カンジダ・パラプシロシス(Candida parapsilosis)、カンジダ・ギルリエルモンジイ(Candida guilliermondii)、カンジダ・クルセイ(Candida krusei)、カンジダ・ケフィア(Candidakefyr)（カンジダ・シュードトロピカリス(Candidapseudotropicalis)とも呼ばれる）、カンジダ・デュブリニエンシス(Candida dubliniensis)、クラミジア・ニューモニエ(Chlamydia pneumoniae)、トラコーマ・クラミジア(Chlamydia trachomatus)、クロストリジウム・ボツリヌム(Clostridium botulinum)、クロストリジウム・ジフィシル(Clostridium difficile)、クロストリジウム・パーフリンゲンス(Clostridium perfringens)、コクシジオデス・イミチス(Coccidiodes immitis)、コリネバクテリウム・ジフテリア(Corynebacterium diptheriae)、クリプトコックス・ネオフォルマンス(Cryptococcus neoformans)、エンテロバクター・クロアカエ(Enterobacter cloacae)、エンテロコックス・フェカリス(Enterococcus faecalis)、エンテロコックス・ファエシウム(Enterococcus faecium)、エシェリヒア・コリ(Escherichia coli)、ヘモフィルス・インフルエンザ(Haemophilus influenzae)、ヘリコバクター・ピロリ(Helicobacter pylori)、ヒストプラスマ・カプスラツム(Histoplasma capsulatum)、クレブシエラ・ニューモニエ(Klebsiella pneumoniae)、リステリア・モノサイトゲネス(Listeria monocytogenes)、マイコバクテリウム・レプラエ(Mycobacterium leprae)、マイコバクテリウム・ツベルクローシス(Mycobacterium tuberculosis)、ナイセリア・ゴノローエ(Neisseria gonorrhoeae)、髄膜炎菌(Neisseria meningitidis)、ノカルジア・アステロイデス(Nocardia asteroides)、パスツレラ・ヘモリチカ(Pasteurella haemolytica)、パスツレラ・ムルトシダ(Pasteurella multocida)、ニューモシスティス・カリニー(Pneumocystis carinii)、プロテウス・ブルガリス(Proteus vulgaris)、シュードモナス・アエルギノーサ(Pseudomonas aeruginosa)、サルモネラ・ボンゴリ(Salmonella bongori)、サルモネラ・コレラスイス(Salmonella cholerasuis)、サルモネラ・エンテリカ(Salmonella enterica)、サルモネラ・パラチフィ(Salmonella paratyphi)、サルモネラ・チフィ(Salmonella typhi)、サルモネラ・チフィムリウム(Salmonella typhimurium)、スタフィロコッカス・オーレウス(Staphylococcus aureus)、リステリア・モノサイトゲネス(Listeria monocytogenes)、モクサレラ・カタルハリス(Moxarella catarrhalis)、シゲラ・ボイディ(Shigella boydii)、シゲラ・ディッセンリイ(Shigelladysenteriae)、シゲラ・フレックスネリ(Shigellaflexneri)、シゲラ・ソネイ(Shigellasonnei)、スタフィロコッカス・エピダーミディス(Staphylococcusepidermidis)、ストレプトコッカス・ニューモニエ(Streptococcuspneumoniae)、ストレプトコッカス・ミュータンス(Streptococcusmutans)、トレポネーマ・パリダム(Treponemapallidum)、エルシニア・エンテロコリチカ(Yersiniaenterocolitica)、エルシニア・ペスティス(Yersiniapestis)、および上記種のいずれかの属に属する任意の種からなる群から選ばれる微生物において活性である、項８に記載のベクター。
【００２６】
１０．項８または項９に記載のベクターを含有する宿主細胞。
【００２７】
１１．配列番号８〜３７９５の１つの配列のヌクレオチド配列を含むアンチセンス核酸により活性または発現が抑制される増殖に必要な遺伝子を含むオペロン内の遺伝子内配列、遺伝子間配列、２つまたはそれ以上の遺伝子の少なくとも一部にまたがる配列、５’非コード領域、または３’非コード領域の少なくとも一部に相補的なヌクレオチド配列を含む精製または単離されたアンチセンス核酸。
【００２８】
１２．上記アンチセンス核酸は、アナプラスマ・マルギナレ(Anaplasma marginale)、アスペルギルス・フミガツス(Aspergillus fumigatus)、バチルス・アンスラシス(Bacillus anthracis)、バクテリオイデス・フラギリス(Bacterioides fragilis)、百日咳菌(Bordetella pertussis)、ブルクホルデリア・セパシア(Burkholderia cepacia)、カンピロバクター・イェジュニィ(Campylobacter jejuni)、カンジダ・アルビカンス (Candida albicans)、カンジダ・グラブラタ(Candida glabrata)（トルロプシス・グラブラタ(Toprulopsis glabrata)とも呼ばれる）、カンジダ・トロピカリス(Candida tropicalis)、カンジダ・パラプシロシス(Candida parapsilosis)、カンジダ・ギルリエルモンジイ(Candida guilliermondii)、カンジダ・クルセイ(Candida krusei)、カンジダ・ケフィア(Candidakefyr)（カンジダ・シュードトロピカリス(Candidapseudotropicalis)とも呼ばれる）、カンジダ・デュブリニエンシス(Candida dubliniensis)、クラミジア・ニューモニエ(Chlamydia pneumoniae)、トラコーマ・クラミジア(Chlamydia trachomatus)、クロストリジウム・ボツリヌム(Clostridium botulinum)、クロストリジウム・ジフィシル(Clostridium difficile)、クロストリジウム・パーフリンゲンス(Clostridium perfringens)、コクシジオデス・イミチス(Coccidiodes immitis)、コリネバクテリウム・ジフテリア(Corynebacterium diptheriae)、クリプトコックス・ネオフォルマンス(Cryptococcus neoformans)、エンテロバクター・クロアカエ(Enterobacter cloacae)、エンテロコックス・フェカリス(Enterococcus faecalis)、エンテロコックス・ファエシウム(Enterococcus faecium)、エシェリヒア・コリ(Escherichia coli)、ヘモフィルス・インフルエンザ(Haemophilus influenzae)、ヘリコバクター・ピロリ(Helicobacter pylori)、ヒストプラスマ・カプスラツム(Histoplasma capsulatum)、クレブシエラ・ニューモニエ(Klebsiella pneumoniae)、リステリア・モノサイトゲネス(Listeria monocytogenes)、マイコバクテリウム・レプラエ(Mycobacterium leprae)、マイコバクテリウム・ツベルクローシス(Mycobacterium tuberculosis)、ナイセリア・ゴノローエ(Neisseria gonorrhoeae)、髄膜炎菌(Neisseria meningitidis)、ノカルジア・アステロイデス(Nocardia asteroides)、パスツレラ・ヘモリチカ(Pasteurella haemolytica)、パスツレラ・ムルトシダ(Pasteurella multocida)、ニューモシスティス・カリニー(Pneumocystis carinii)、プロテウス・ブルガリス(Proteus vulgaris)、シュードモナス・アエルギノーサ(Pseudomonas aeruginosa)、サルモネラ・ボンゴリ(Salmonella bongori)、サルモネラ・コレラスイス(Salmonella cholerasuis)、サルモネラ・エンテリカ(Salmonella enterica)、サルモネラ・パラチフィ(Salmonella paratyphi)、サルモネラ・チフィ(Salmonella typhi)、サルモネラ・チフィムリウム(Salmonella typhimurium)、スタフィロコッカス・オーレウス(Staphylococcus aureus)、リステリア・モノサイトゲネス(Listeria monocytogenes)、モクサレラ・カタルハリス(Moxarella catarrhalis)、シゲラ・ボイディ(Shigella boydii)、シゲラ・ディッセンリイ(Shigelladysenteriae)、シゲラ・フレックスネリ(Shigellaflexneri)、シゲラ・ソネイ(Shigellasonnei)、スタフィロコッカス・エピダーミディス(Staphylococcusepidermidis)、ストレプトコッカス・ニューモニエ(Streptococcuspneumoniae)、ストレプトコッカス・ミュータンス(Streptococcusmutans)、トレポネーマ・パリダム(Treponemapallidum)、エルシニア・エンテロコリチカ(Yersiniaenterocolitica)、エルシニア・ペスティス(Yersiniapestis)、および上記種のいずれかの属に属する任意の種からなる群から選ばれる生物由来の核酸に相補的である、項１１に記載の精製または単離されたアンチセンス核酸。
【００２９】
１３．上記ヌクレオチド配列は、エシェリヒア・コリ以外の生物由来の核酸のヌクレオチド配列に相補的である、項１１に記載の精製または単離されたアンチセンス核酸。
【００３０】
１４．上記増殖に必要な遺伝子は、配列番号３７９６〜３８００、３８０６〜４８６０、５９１６〜１００１２からなる群から選ばれるヌクレオチド配列を含む、項１１に記載の精製または単離されたアンチセンス核酸。
【００３１】
１５．デフォルトパラメータでＢＬＡＳＴＮバージョン２．０を用いて決定される場合に、配列番号８〜３７９５、配列番号８〜３７９５の少なくとも２５個の連続ヌクレオチドを含む断片、配列番号８〜３７９５に相補的なヌクレオチド配列、および配列番号８〜３７９５の少なくとも２５個の連続ヌクレオチドを含む断片に相補的な配列からなる群から選ばれるヌクレオチド配列に対して少なくとも７０％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む精製または単離された核酸。
【００３２】
１６．上記核酸は、アナプラスマ・マルギナレ(Anaplasmamarginale)、アスペルギルス・フミガツス(Aspergillusfumigatus)、バチルス・アンスラシス(Bacillusanthracis)、バクテリオイデス・フラギリス(Bacterioidesfragilis)、百日咳菌(Bordetellapertussis)、ブルクホルデリア・セパシア(Burkholderiacepacia)、カンピロバクター・イェジュニィ(Campylobacterjejuni)、カンジダ・アルビカンス (Candidaalbicans)、カンジダ・グラブラタ(Candidaglabrata)（トルロプシス・グラブラタ(Toprulopsisglabrata)とも呼ばれる）、カンジダ・トロピカリス(Candidatropicalis)、カンジダ・パラプシロシス(Candidaparapsilosis)、カンジダ・ギルリエルモンジイ(Candidaguilliermondii)、カンジダ・クルセイ(Candidakrusei)、カンジダ・ケフィア(Candidakefyr)（カンジダ・シュードトロピカリス(Candidapseudotropicalis)とも呼ばれる）、カンジダ・デュブリニエンシス(Candida dubliniensis)、クラミジア・ニューモニエ(Chlamydia pneumoniae)、トラコーマ・クラミジア(Chlamydia trachomatus)、クロストリジウム・ボツリヌム(Clostridium botulinum)、クロストリジウム・ジフィシル(Clostridium difficile)、クロストリジウム・パーフリンゲンス(Clostridium perfringens)、コクシジオデス・イミチス(Coccidiodes immitis)、コリネバクテリウム・ジフテリア(Corynebacterium diptheriae)、クリプトコックス・ネオフォルマンス(Cryptococcus neoformans)、エンテロバクター・クロアカエ(Enterobacter cloacae)、エンテロコックス・フェカリス(Enterococcus faecalis)、エンテロコックス・ファエシウム(Enterococcus faecium)、エシェリヒア・コリ(Escherichia coli)、ヘモフィルス・インフルエンザ(Haemophilus influenzae)、ヘリコバクター・ピロリ(Helicobacter pylori)、ヒストプラスマ・カプスラツム(Histoplasma capsulatum)、クレブシエラ・ニューモニエ(Klebsiella pneumoniae)、リステリア・モノサイトゲネス(Listeria monocytogenes)、マイコバクテリウム・レプラエ(Mycobacterium leprae)、マイコバクテリウム・ツベルクローシス(Mycobacterium tuberculosis)、ナイセリア・ゴノローエ(Neisseria gonorrhoeae)、髄膜炎菌(Neisseria meningitidis)、ノカルジア・アステロイデス(Nocardia asteroides)、パスツレラ・ヘモリチカ(Pasteurella haemolytica)、パスツレラ・ムルトシダ(Pasteurella multocida)、ニューモシスティス・カリニー(Pneumocystis carinii)、プロテウス・ブルガリス(Proteus vulgaris)、シュードモナス・アエルギノーサ(Pseudomonas aeruginosa)、サルモネラ・ボンゴリ(Salmonella bongori)、サルモネラ・コレラスイス(Salmonella cholerasuis)、サルモネラ・エンテリカ(Salmonella enterica)、サルモネラ・パラチフィ(Salmonella paratyphi)、サルモネラ・チフィ(Salmonella typhi)、サルモネラ・チフィムリウム(Salmonella typhimurium)、スタフィロコッカス・オーレウス(Staphylococcus aureus)、リステリア・モノサイトゲネス(Listeria monocytogenes)、モクサレラ・カタルハリス(Moxarella catarrhalis)、シゲラ・ボイディ(Shigella boydii)、シゲラ・ディッセンリイ(Shigelladysenteriae)、シゲラ・フレックスネリ(Shigellaflexneri)、シゲラ・ソネイ(Shigellasonnei)、スタフィロコッカス・エピダーミディス(Staphylococcusepidermidis)、ストレプトコッカス・ニューモニエ(Streptococcuspneumoniae)、ストレプトコッカス・ミュータンス(Streptococcusmutans)、トレポネーマ・パリダム(Treponemapallidum)、エルシニア・エンテロコリチカ(Yersiniaenterocolitica)、エルシニア・ペスティス(Yersiniapestis)、および上記種のいずれかの属に属する任意の種からなる群から選ばれる生物から得られる、項１５に記載の精製または単離された核酸。
【００３３】
１７．上記核酸は、エシェリヒア・コリ以外の生物から得られる、項１５に記載の核酸。
【００３４】
１８．配列番号８〜３７９５のいずれか１つのヌクレオチド配列を含むアンチセンス核酸により発現が抑制されるポリペプチドをコードする核酸に作動可能的に連結されたプロモーターを含むベクター。
【００３５】
１９．上記ポリペプチドをコードする上記核酸は、アナプラスマ・マルギナレ(Anaplasma marginale)、アスペルギルス・フミガツス(Aspergillus fumigatus)、バチルス・アンスラシス(Bacillus anthracis)、バクテリオイデス・フラギリス(Bacterioides fragilis)、百日咳菌(Bordetella pertussis)、ブルクホルデリア・セパシア(Burkholderia cepacia)、カンピロバクター・イェジュニィ(Campylobacter jejuni)、カンジダ・アルビカンス (Candida albicans)、カンジダ・グラブラタ(Candida glabrata)（トルロプシス・グラブラタ(Torulopsis glabrata)とも呼ばれる）、カンジダ・トロピカリス(Candida tropicalis)、カンジダ・パラプシロシス(Candida parapsilosis)、カンジダ・ギルリエルモンジイ(Candida guilliermondii)、カンジダ・クルセイ(Candida krusei)、カンジダ・ケフィア(Candidakefyr)（カンジダ・シュードトロピカリス(Candidapseudotropicalis)とも呼ばれる）、カンジダ・デュブリニエンシス(Candida dubliniensis)、クラミジア・ニューモニエ(Chlamydia pneumoniae)、トラコーマ・クラミジア(Chlamydia trachomatus)、クロストリジウム・ボツリヌム(Clostridium botulinum)、クロストリジウム・ジフィシル(Clostridium difficile)、クロストリジウム・パーフリンゲンス(Clostridium perfringens)、コクシジオデス・イミチス(Coccidiodes immitis)、コリネバクテリウム・ジフテリア(Corynebacterium diptheriae)、クリプトコックス・ネオフォルマンス(Cryptococcus neoformans)、エンテロバクター・クロアカエ(Enterobacter cloacae)、エンテロコックス・フェカリス(Enterococcus faecalis)、エンテロコックス・ファエシウム(Enterococcus faecium)、エシェリヒア・コリ(Escherichia coli)、ヘモフィルス・インフルエンザ(Haemophilus influenzae)、ヘリコバクター・ピロリ(Helicobacter pylori)、ヒストプラスマ・カプスラツム(Histoplasma capsulatum)、クレブシエラ・ニューモニエ(Klebsiella pneumoniae)、リステリア・モノサイトゲネス(Listeria monocytogenes)、マイコバクテリウム・レプラエ(Mycobacterium leprae)、マイコバクテリウム・ツベルクローシス(Mycobacterium tuberculosis)、ナイセリア・ゴノローエ(Neisseria gonorrhoeae)、髄膜炎菌(Neisseria meningitidis)、ノカルジア・アステロイデス(Nocardia asteroides)、パスツレラ・ヘモリチカ(Pasteurella haemolytica)、パスツレラ・ムルトシダ(Pasteurella multocida)、ニューモシスティス・カリニー(Pneumocystis carinii)、プロテウス・ブルガリス(Proteus vulgaris)、シュードモナス・アエルギノーサ(Pseudomonas aeruginosa)、サルモネラ・ボンゴリ(Salmonella bongori)、サルモネラ・コレラスイス(Salmonella cholerasuis)、サルモネラ・エンテリカ(Salmonella enterica)、サルモネラ・パラチフィ(Salmonella paratyphi)、サルモネラ・チフィ(Salmonella typhi)、サルモネラ・チフィムリウム(Salmonella typhimurium)、スタフィロコッカス・オーレウス(Staphylococcus aureus)、リステリア・モノサイトゲネス(Listeria monocytogenes)、モクサレラ・カタルハリス(Moxarella catarrhalis)、シゲラ・ボイディ(Shigella boydii)、シゲラ・ディッセンリイ(Shigelladysenteriae)、シゲラ・フレックスネリ(Shigellaflexneri)、シゲラ・ソネイ(Shigellasonnei)、スタフィロコッカス・エピダーミディス(Staphylococcusepidermidis)、ストレプトコッカス・ニューモニエ(Streptococcuspneumoniae)、ストレプトコッカス・ミュータンス(Streptococcusmutans)、トレポネーマ・パリダム(Treponemapallidum)、エルシニア・エンテロコリチカ(Yersiniaenterocolitica)、エルシニア・ペスティス(Yersiniapestis)、および上記種のいずれかの属に属する任意の種からなる群から選ばれる生物から得られる、項１８に記載のベクター。
【００３６】
２０．上記ポリペプチドをコードする上記ヌクレオチド配列は、エシェリヒア・コリ以外の生物から得られる、項１８に記載のベクター。
【００３７】
２１．項１８に記載のベクターを含有する宿主細胞。
【００３８】
２２．上記ポリペプチドは、配列番号３８０１〜３８０５、４８６１〜５９１５、１００１３〜１４１１０からなる群から選ばれるアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む、項１８に記載のベクター。
【００３９】
２３．上記プロモーターは、配列番号３７９６〜３８００、３８０６〜４８６０、５９１６〜１００１２からなる群から選ばれるヌクレオチド配列を含む核酸に作動可能に連結された、項１８に記載のベクター。
【００４０】
２４．配列番号８〜３７９５のいずれか１つのヌクレオチド配列を含むアンチセンス核酸により発現が抑制されるポリペプチド、または上記ポリペプチドの１つの少なくとも５個、少なくとも１０個、少なくとも２０個、少なくとも３０個、少なくとも４０個、少なくとも５０個、少なくとも６０個、もしくは６０個より多い連続アミノ酸を含む断片からなる群から選ばれる断片を含む精製または単離されたポリペプチド。
【００４１】
２５．上記ポリペプチドは、配列番号３８０１〜３８０５、４８６１〜５９１５、１００１３〜１４１１０のいずれか１つのアミノ酸配列、または配列番号３８０１〜３８０５、４８６１〜５９１５、１００１３〜１４１１０からなる群から選ばれるアミノ酸配列を含むポリペプチドの少なくとも５個、少なくとも１０個、少なくとも２０個、少なくとも３０個、少なくとも４０個、少なくとも５０個、少なくとも６０個、もしくは６０個以上の連続アミノ酸を含む断片を含む、項２４に記載のポリペプチド。
【００４２】
２６．上記ポリペプチドは、アナプラスマ・マルギナレ(Anaplasma marginale)、アスペルギルス・フミガツス(Aspergillus fumigatus)、バチルス・アンスラシス(Bacillus anthracis)、バクテリオイデス・フラギリス(Bacterioides fragilis)、百日咳菌(Bordetella pertussis)、ブルクホルデリア・セパシア(Burkholderia cepacia)、カンピロバクター・イェジュニィ(Campylobacter jejuni)、カンジダ・アルビカンス (Candida albicans)、カンジダ・グラブラタ(Candida glabrata)（トルロプシス・グラブラタ(Torulopsis glabrata)とも呼ばれる）、カンジダ・トロピカリス(Candida tropicalis)、カンジダ・パラプシロシス(Candida parapsilosis)、カンジダ・ギルリエルモンジイ(Candida guilliermondii)、カンジダ・クルセイ(Candida krusei)、カンジダ・ケフィア(Candidakefyr)（カンジダ・シュードトロピカリス(Candidapseudotropicalis)とも呼ばれる）、カンジダ・デュブリニエンシス(Candida dubliniensis)、クラミジア・ニューモニエ(Chlamydia pneumoniae)、トラコーマ・クラミジア(Chlamydia trachomatus)、クロストリジウム・ボツリヌム(Clostridium botulinum)、クロストリジウム・ジフィシル(Clostridium difficile)、クロストリジウム・パーフリンゲンス(Clostridium perfringens)、コクシジオデス・イミチス(Coccidiodes immitis)、コリネバクテリウム・ジフテリア(Corynebacterium diptheriae)、クリプトコックス・ネオフォルマンス(Cryptococcus neoformans)、エンテロバクター・クロアカエ(Enterobacter cloacae)、エンテロコックス・フェカリス(Enterococcus faecalis)、エンテロコックス・ファエシウム(Enterococcus faecium)、エシェリヒア・コリ(Escherichia coli)、ヘモフィルス・インフルエンザ(Haemophilus influenzae)、ヘリコバクター・ピロリ(Helicobacter pylori)、ヒストプラスマ・カプスラツム(Histoplasma capsulatum)、クレブシエラ・ニューモニエ(Klebsiella pneumoniae)、リステリア・モノサイトゲネス(Listeria monocytogenes)、マイコバクテリウム・レプラエ(Mycobacterium leprae)、マイコバクテリウム・ツベルクローシス(Mycobacterium tuberculosis)、ナイセリア・ゴノローエ(Neisseria gonorrhoeae)、髄膜炎菌(Neisseria meningitidis)、ノカルジア・アステロイデス(Nocardia asteroides)、パスツレラ・ヘモリチカ(Pasteurella haemolytica)、パスツレラ・ムルトシダ(Pasteurella multocida)、ニューモシスティス・カリニー(Pneumocystis carinii)、プロテウス・ブルガリス(Proteus vulgaris)、シュードモナス・アエルギノーサ(Pseudomonas aeruginosa)、サルモネラ・ボンゴリ(Salmonella bongori)、サルモネラ・コレラスイス(Salmonella cholerasuis)、サルモネラ・エンテリカ(Salmonella enterica)、サルモネラ・パラチフィ(Salmonella paratyphi)、サルモネラ・チフィ(Salmonella typhi)、サルモネラ・チフィムリウム(Salmonella typhimurium)、スタフィロコッカス・オーレウス(Staphylococcus aureus)、リステリア・モノサイトゲネス(Listeria monocytogenes)、モクサレラ・カタルハリス(Moxarella catarrhalis)、シゲラ・ボイディ(Shigella boydii)、シゲラ・ディッセンリイ(Shigelladysenteriae)、シゲラ・フレックスネリ(Shigellaflexneri)、シゲラ・ソネイ(Shigellasonnei)、スタフィロコッカス・エピダーミディス(Staphylococcusepidermidis)、ストレプトコッカス・ニューモニエ(Streptococcuspneumoniae)、ストレプトコッカス・ミュータンス(Streptococcusmutans)、トレポネーマ・パリダム(Treponemapallidum)、エルシニア・エンテロコリチカ(Yersiniaenterocolitica)、エルシニア・ペスティス(Yersiniapestis)、および上記種のいずれかの属に属する任意の種からなる群から選ばれる生物から得られる、項２４に記載のポリペプチド。
【００４３】
２７．上記ポリペプチドは、エシェリヒア・コリ以外の生物から得られる、項２４に記載のポリペプチド。
【００４４】
２８．デフォルトパラメータでＦＡＳＴＡバージョン３．０ｔ７８を用いて決定される場合に、配列番号８〜３７９５からなる群から選ばれるヌクレオチド配列を含む核酸により発現が抑制されるポリペプチドに対して少なくとも２５％のアミノ酸同一性、または配列番号８〜３７９５からなる群から選ばれるヌクレオチド配列を含む核酸により発現が抑制されるポリペプチドの少なくとも１０個、少なくとも２０個、少なくとも３０個、少なくとも４０個、少なくとも５０個、少なくとも６０個、もしくは６０個より多い連続アミノ酸を含む断片に対して少なくとも２５％のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む精製または単離されたポリペプチド。
【００４５】
２９．上記ポリペプチドは、デフォルトパラメータでＦＡＳＴＡバージョン３．０ｔ７８を用いて決定される場合に、配列番号３８０１〜３８０５、４８６１〜５９１５、１００１３〜１４１１０の１つを含むポリペプチドに対して少なく２５％の同一性、または配列番号３８０１〜３８０５、４８６１〜５９１５、１００１３〜１４１１０の１つを含むポリペプチドの少なくとも５個、少なくとも１０個、少なくとも２０個、少なくとも３０個、少なくとも４０個、少なくとも５０個、少なくとも６０個、もしくは６０個より多い連続アミノ酸を含む断片に対して少なくとも２５％の同一性を有する、項２８に記載のポリペプチド。
【００４６】
３０．上記ポリペプチドは、アナプラスマ・マルギナレ(Anaplasma marginale)、アスペルギルス・フミガツス(Aspergillus fumigatus)、バチルス・アンスラシス(Bacillus anthracis)、バクテリオイデス・フラギリス(Bacterioides fragilis)、百日咳菌(Bordetella pertussis)、ブルクホルデリア・セパシア(Burkholderia cepacia)、カンピロバクター・イェジュニィ(Campylobacter jejuni)、カンジダ・アルビカンス (Candida albicans)、カンジダ・グラブラタ(Candida glabrata)（トルロプシス・グラブラタ(Torulopsis glabrata)とも呼ばれる）、カンジダ・トロピカリス(Candida tropicalis)、カンジダ・パラプシロシス(Candida parapsilosis)、カンジダ・ギルリエルモンジイ(Candida guilliermondii)、カンジダ・クルセイ(Candida krusei)、カンジダ・ケフィア(Candidakefyr)（カンジダ・シュードトロピカリス(Candidapseudotropicalis)とも呼ばれる）、カンジダ・デュブリニエンシス(Candida dubliniensis)、クラミジア・ニューモニエ(Chlamydia pneumoniae)、トラコーマ・クラミジア(Chlamydia trachomatus)、クロストリジウム・ボツリヌム(Clostridium botulinum)、クロストリジウム・ジフィシル(Clostridium difficile)、クロストリジウム・パーフリンゲンス(Clostridium perfringens)、コクシジオデス・イミチス(Coccidiodes immitis)、コリネバクテリウム・ジフテリア(Corynebacterium diptheriae)、クリプトコックス・ネオフォルマンス(Cryptococcus neoformans)、エンテロバクター・クロアカエ(Enterobacter cloacae)、エンテロコックス・フェカリス(Enterococcus faecalis)、エンテロコックス・ファエシウム(Enterococcus faecium)、エシェリヒア・コリ(Escherichia coli)、ヘモフィルス・インフルエンザ(Haemophilus influenzae)、ヘリコバクター・ピロリ(Helicobacter pylori)、ヒストプラスマ・カプスラツム(Histoplasma capsulatum)、クレブシエラ・ニューモニエ(Klebsiella pneumoniae)、リステリア・モノサイトゲネス(Listeria monocytogenes)、マイコバクテリウム・レプラエ(Mycobacterium leprae)、マイコバクテリウム・ツベルクローシス(Mycobacterium tuberculosis)、ナイセリア・ゴノローエ(Neisseria gonorrhoeae)、髄膜炎菌(Neisseria meningitidis)、ノカルジア・アステロイデス(Nocardia asteroides)、パスツレラ・ヘモリチカ(Pasteurella haemolytica)、パスツレラ・ムルトシダ(Pasteurella multocida)、ニューモシスティス・カリニー(Pneumocystis carinii)、プロテウス・ブルガリス(Proteus vulgaris)、シュードモナス・アエルギノーサ(Pseudomonas aeruginosa)、サルモネラ・ボンゴリ(Salmonella bongori)、サルモネラ・コレラスイス(Salmonella cholerasuis)、サルモネラ・エンテリカ(Salmonella enterica)、サルモネラ・パラチフィ(Salmonella paratyphi)、サルモネラ・チフィ(Salmonella typhi)、サルモネラ・チフィムリウム(Salmonella typhimurium)、スタフィロコッカス・オーレウス(Staphylococcus aureus)、リステリア・モノサイトゲネス(Listeria monocytogenes)、モクサレラ・カタルハリス(Moxarella catarrhalis)、シゲラ・ボイディ(Shigella boydii)、シゲラ・ディッセンリイ(Shigelladysenteriae)、シゲラ・フレックスネリ(Shigellaflexneri)、シゲラ・ソネイ(Shigellasonnei)、スタフィロコッカス・エピダーミディス(Staphylococcusepidermidis)、ストレプトコッカス・ニューモニエ(Streptococcuspneumoniae)、ストレプトコッカス・ミュータンス(Streptococcusmutans)、トレポネーマ・パリダム(Treponemapallidum)、エルシニア・エンテロコリチカ(Yersiniaenterocolitica)、エルシニア・ペスティス(Yersiniapestis)、および上記種のいずれかの属に属する任意の種からなる群から選ばれる生物から得られる、項２８に記載のポリペプチド。
【００４７】
３１．上記ポリペプチドは、エシェリヒア・コリ以外の生物から得られる、項２８に記載のポリペプチド。
【００４８】
３２．項２８〜３１の１項に記載のポリペプチドを特異的に結合することが可能な抗体。
【００４９】
３３．ポリペプチドを産生する方法であって、配列番号８〜３７９５の１つを含むアンチセンス核酸により発現が抑制されるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸に作動可能に連結されたプロモーターを含むベクターを細胞に導入することを含む方法。
【００５０】
３４．上記ポリペプチドを単離する工程をさらに含む、項３３に記載の方法。
【００５１】
３５．上記ポリペプチドは、配列番号３８０１〜３８０５、４８６１〜５９１５、１００１３〜１４１１０からなる群から選ばれるアミノ酸配列含む、項３３に記載の方法。
【００５２】
上記ポリペプチドをコードする上記核酸は、アナプラスマ・マルギナレ(Anaplasma marginale)、アスペルギルス・フミガツス(Aspergillus fumigatus)、バチルス・アンスラシス(Bacillus anthracis)、バクテリオイデス・フラギリス(Bacterioides fragilis)、百日咳菌(Bordetella pertussis)、ブルクホルデリア・セパシア(Burkholderia cepacia)、カンピロバクター・イェジュニィ(Campylobacter jejuni)、カンジダ・アルビカンス (Candida albicans)、カンジダ・グラブラタ(Candida glabrata)（トルロプシス・グラブラタ(Torulopsis glabrata)とも呼ばれる）、カンジダ・トロピカリス(Candida tropicalis)、カンジダ・パラプシロシス(Candida parapsilosis)、カンジダ・ギルリエルモンジイ(Candida guilliermondii)、カンジダ・クルセイ(Candida krusei)、カンジダ・ケフィア(Candidakefyr)（カンジダ・シュードトロピカリス(Candidapseudotropicalis)とも呼ばれる）、カンジダ・デュブリニエンシス(Candida dubliniensis)、クラミジア・ニューモニエ(Chlamydia pneumoniae)、トラコーマ・クラミジア(Chlamydia trachomatus)、クロストリジウム・ボツリヌム(Clostridium botulinum)、クロストリジウム・ジフィシル(Clostridium difficile)、クロストリジウム・パーフリンゲンス(Clostridium perfringens)、コクシジオデス・イミチス(Coccidiodes immitis)、コリネバクテリウム・ジフテリア(Corynebacterium diptheriae)、クリプトコックス・ネオフォルマンス(Cryptococcus neoformans)、エンテロバクター・クロアカエ(Enterobacter cloacae)、エンテロコックス・フェカリス(Enterococcus faecalis)、エンテロコックス・ファエシウム(Enterococcus faecium)、エシェリヒア・コリ(Escherichia coli)、ヘモフィルス・インフルエンザ(Haemophilus influenzae)、ヘリコバクター・ピロリ(Helicobacter pylori)、ヒストプラスマ・カプスラツム(Histoplasma capsulatum)、クレブシエラ・ニューモニエ(Klebsiella pneumoniae)、リステリア・モノサイトゲネス(Listeria monocytogenes)、マイコバクテリウム・レプラエ(Mycobacterium leprae)、マイコバクテリウム・ツベルクローシス(Mycobacterium tuberculosis)、ナイセリア・ゴノローエ(Neisseria gonorrhoeae)、髄膜炎菌(Neisseria meningitidis)、ノカルジア・アステロイデス(Nocardia asteroides)、パスツレラ・ヘモリチカ(Pasteurella haemolytica)、パスツレラ・ムルトシダ(Pasteurella multocida)、ニューモシスティス・カリニー(Pneumocystis carinii)、プロテウス・ブルガリス(Proteus vulgaris)、シュードモナス・アエルギノーサ(Pseudomonas aeruginosa)、サルモネラ・ボンゴリ(Salmonella bongori)、サルモネラ・コレラスイス(Salmonella cholerasuis)、サルモネラ・エンテリカ(Salmonella enterica)、サルモネラ・パラチフィ(Salmonella paratyphi)、サルモネラ・チフィ(Salmonella typhi)、サルモネラ・チフィムリウム(Salmonella typhimurium)、スタフィロコッカス・オーレウス(Staphylococcus aureus)、リステリア・モノサイトゲネス(Listeria monocytogenes)、モクサレラ・カタルハリス(Moxarella catarrhalis)、シゲラ・ボイディ(Shigella boydii)、シゲラ・ディッセンリイ(Shigelladysenteriae)、シゲラ・フレックスネリ(Shigellaflexneri)、シゲラ・ソネイ(Shigellasonnei)、スタフィロコッカス・エピダーミディス(Staphylococcusepidermidis)、ストレプトコッカス・ニューモニエ(Streptococcuspneumoniae)、ストレプトコッカス・ミュータンス(Streptococcusmutans)、トレポネーマ・パリダム(Treponemapallidum)、エルシニア・エンテロコリチカ(Yersiniaenterocolitica)、エルシニア・ペスティス(Yersiniapestis)、および上記種のいずれかの属に属する任意の種からなる群から選ばれる生物から得られる、項３３に記載の方法。
【００５３】
３７．上記ポリペプチドをコードする上記核酸は、エシェリヒア・コリ以外の生物から得られる、項３３に記載の方法。
【００５４】
３８．上記プロモーターは、配列番号３７９６〜３８００、３８０６〜４８６０、５９１６〜１００１２からなる群から選ばれるヌクレオチド配列を含む核酸に作動可能に連結された、項３３に記載の方法。
【００５５】
３９．個体において細胞増殖を抑制する方法であって、配列番号８〜３７９５からなる群から選ばれるヌクレオチド配列を含むアンチセンス核酸により発現が抑制される遺伝子産物の活性を抑制すること、またはその遺伝子産物の量を低減させること、または上記遺伝子産物をコードする核酸の活性を抑制すること、もしくはその核酸の量を低減させることを含む方法。
【００５６】
４０．上記方法は、アナプラスマ・マルギナレ(Anaplasmamarginale)、アスペルギルス・フミガツス(Aspergillusfumigatus)、バチルス・アンスラシス(Bacillusanthracis)、バクテリオイデス・フラギリス(Bacterioidesfragilis)、百日咳菌(Bordetellapertussis)、ブルクホルデリア・セパシア(Burkholderiacepacia)、カンピロバクター・イェジュニィ(Campylobacterjejuni)、カンジダ・アルビカンス (Candidaalbicans)、カンジダ・グラブラタ(Candidaglabrata)（トルロプシス・グラブラタ(Torulopsisglabrata)とも呼ばれる）、カンジダ・トロピカリス(Candidatropicalis)、カンジダ・パラプシロシス(Candidaparapsilosis)、カンジダ・ギルリエルモンジイ(Candidaguilliermondii)、カンジダ・クルセイ(Candidakrusei)、カンジダ・ケフィア(Candidakefyr)（カンジダ・シュードトロピカリス(Candidapseudotropicalis)とも呼ばれる）、カンジダ・デュブリニエンシス(Candida dubliniensis)、クラミジア・ニューモニエ(Chlamydia pneumoniae)、トラコーマ・クラミジア(Chlamydia trachomatus)、クロストリジウム・ボツリヌム(Clostridium botulinum)、クロストリジウム・ジフィシル(Clostridium difficile)、クロストリジウム・パーフリンゲンス(Clostridium perfringens)、コクシジオデス・イミチス(Coccidiodes immitis)、コリネバクテリウム・ジフテリア(Corynebacterium diptheriae)、クリプトコックス・ネオフォルマンス(Cryptococcus neoformans)、エンテロバクター・クロアカエ(Enterobacter cloacae)、エンテロコックス・フェカリス(Enterococcus faecalis)、エンテロコックス・ファエシウム(Enterococcus faecium)、エシェリヒア・コリ(Escherichia coli)、ヘモフィルス・インフルエンザ(Haemophilus influenzae)、ヘリコバクター・ピロリ(Helicobacter pylori)、ヒストプラスマ・カプスラツム(Histoplasma capsulatum)、クレブシエラ・ニューモニエ(Klebsiella pneumoniae)、リステリア・モノサイトゲネス(Listeria monocytogenes)、マイコバクテリウム・レプラエ(Mycobacterium leprae)、マイコバクテリウム・ツベルクローシス(Mycobacterium tuberculosis)、ナイセリア・ゴノローエ(Neisseria gonorrhoeae)、髄膜炎菌(Neisseria meningitidis)、ノカルジア・アステロイデス(Nocardia asteroides)、パスツレラ・ヘモリチカ(Pasteurella haemolytica)、パスツレラ・ムルトシダ(Pasteurella multocida)、ニューモシスティス・カリニー(Pneumocystis carinii)、プロテウス・ブルガリス(Proteus vulgaris)、シュードモナス・アエルギノーサ(Pseudomonas aeruginosa)、サルモネラ・ボンゴリ(Salmonella bongori)、サルモネラ・コレラスイス(Salmonella cholerasuis)、サルモネラ・エンテリカ(Salmonella enterica)、サルモネラ・パラチフィ(Salmonella paratyphi)、サルモネラ・チフィ(Salmonella typhi)、サルモネラ・チフィムリウム(Salmonella typhimurium)、スタフィロコッカス・オーレウス(Staphylococcus aureus)、リステリア・モノサイトゲネス(Listeria monocytogenes)、モクサレラ・カタルハリス(Moxarella catarrhalis)、シゲラ・ボイディ(Shigella boydii)、シゲラ・ディッセンリイ(Shigelladysenteriae)、シゲラ・フレックスネリ(Shigellaflexneri)、シゲラ・ソネイ(Shigellasonnei)、スタフィロコッカス・エピダーミディス(Staphylococcusepidermidis)、ストレプトコッカス・ニューモニエ(Streptococcuspneumoniae)、ストレプトコッカス・ミュータンス(Streptococcusmutans)、トレポネーマ・パリダム(Treponemapallidum)、エルシニア・エンテロコリチカ(Yersiniaenterocolitica)、エルシニア・ペスティス(Yersiniapestis)、および上記種のいずれかの属に属する任意の種からなる群から選ばれる生物における遺伝子産物の上記活性を抑制すること、またはその遺伝子産物の上記量を低減させることを含む、項３９に記載の方法。
【００５７】
４１．上記方法は、エシェリヒア・コリ以外の生物における遺伝子産物の上記活性を抑制すること、またはその遺伝子産物の上記量を低減させることを含む、項３９に記載の方法。
【００５８】
４２．上記遺伝子産物は、エシェリヒア・コリ以外の生物中に存在する、項３９に記載の方法。
【００５９】
４３．上記遺伝子産物は、配列番号３８０１〜３８０５、４８６１〜５９１５、１００１３〜１４１１０からなる群から選ばれる配列を含むポリペプチドを含む、項３９に記載の方法。
【００６０】
４４．増殖に必要な遺伝子産物の活性に影響を与える化合物を同定する方法であって、上記遺伝子産物は、配列番号８〜３７９５からなる群から選ばれるヌクレオチド配列を含むアンチセンス核酸により発現が抑制される遺伝子産物を含み、
上記遺伝子産物を、候補化合物と接触させ、
上記遺伝子産物の活性に上記化合物が影響を与えるかどうかを決定すること
を含む方法。
【００６１】
４５．上記遺伝子産物は、アナプラスマ・マルギナレ(Anaplasma marginale)、アスペルギルス・フミガツス(Aspergillus fumigatus)、バチルス・アンスラシス(Bacillus anthracis)、バクテリオイデス・フラギリス(Bacterioides fragilis)、百日咳菌(Bordetella pertussis)、ブルクホルデリア・セパシア(Burkholderia cepacia)、カンピロバクター・イェジュニィ(Campylobacter jejuni)、カンジダ・アルビカンス (Candida albicans)、カンジダ・グラブラタ(Candida glabrata)（トルロプシス・グラブラタ(Torulopsis glabrata)とも呼ばれる）、カンジダ・トロピカリス(Candida tropicalis)、カンジダ・パラプシロシス(Candida parapsilosis)、カンジダ・ギルリエルモンジイ(Candida guilliermondii)、カンジダ・クルセイ(Candida krusei)、カンジダ・ケフィア(Candidakefyr)（カンジダ・シュードトロピカリス(Candidapseudotropicalis)とも呼ばれる）、カンジダ・デュブリニエンシス(Candida dubliniensis)、クラミジア・ニューモニエ(Chlamydia pneumoniae)、トラコーマ・クラミジア(Chlamydia trachomatus)、クロストリジウム・ボツリヌム(Clostridium botulinum)、クロストリジウム・ジフィシル(Clostridium difficile)、クロストリジウム・パーフリンゲンス(Clostridium perfringens)、コクシジオデス・イミチス(Coccidiodes immitis)、コリネバクテリウム・ジフテリア(Corynebacterium diptheriae)、クリプトコックス・ネオフォルマンス(Cryptococcus neoformans)、エンテロバクター・クロアカエ(Enterobacter cloacae)、エンテロコックス・フェカリス(Enterococcus faecalis)、エンテロコックス・ファエシウム(Enterococcus faecium)、エシェリヒア・コリ(Escherichia coli)、ヘモフィルス・インフルエンザ(Haemophilus influenzae)、ヘリコバクター・ピロリ(Helicobacter pylori)、ヒストプラスマ・カプスラツム(Histoplasma capsulatum)、クレブシエラ・ニューモニエ(Klebsiella pneumoniae)、リステリア・モノサイトゲネス(Listeria monocytogenes)、マイコバクテリウム・レプラエ(Mycobacterium leprae)、マイコバクテリウム・ツベルクローシス(Mycobacterium tuberculosis)、ナイセリア・ゴノローエ(Neisseria gonorrhoeae)、髄膜炎菌(Neisseria meningitidis)、ノカルジア・アステロイデス(Nocardia asteroides)、パスツレラ・ヘモリチカ(Pasteurella haemolytica)、パスツレラ・ムルトシダ(Pasteurella multocida)、ニューモシスティス・カリニー(Pneumocystis carinii)、プロテウス・ブルガリス(Proteus vulgaris)、シュードモナス・アエルギノーサ(Pseudomonas aeruginosa)、サルモネラ・ボンゴリ(Salmonella bongori)、サルモネラ・コレラスイス(Salmonella cholerasuis)、サルモネラ・エンテリカ(Salmonella enterica)、サルモネラ・パラチフィ(Salmonella paratyphi)、サルモネラ・チフィ(Salmonella typhi)、サルモネラ・チフィムリウム(Salmonella typhimurium)、スタフィロコッカス・オーレウス(Staphylococcus aureus)、リステリア・モノサイトゲネス(Listeria monocytogenes)、モクサレラ・カタルハリス(Moxarella catarrhalis)、シゲラ・ボイディ(Shigella boydii)、シゲラ・ディッセンリイ(Shigelladysenteriae)、シゲラ・フレックスネリ(Shigellaflexneri)、シゲラ・ソネイ(Shigellasonnei)、スタフィロコッカス・エピダーミディス(Staphylococcusepidermidis)、ストレプトコッカス・ニューモニエ(Streptococcuspneumoniae)、ストレプトコッカス・ミュータンス(Streptococcusmutans)、トレポネーマ・パリダム(Treponemapallidum)、エルシニア・エンテロコリチカ(Yersiniaenterocolitica)、エルシニア・ペスティス(Yersiniapestis)、および上記種のいずれかの属に属する任意の種からなる群から選ばれる生物由来である、項４４に記載の方法。
【００６２】
４６．上記遺伝子産物は、エシェリヒア・コリ以外の生物由来である、項４４に記載の方法。
【００６３】
４７．上記遺伝子産物は、ポリペプチドであり、上記活性は、酵素活性である、項４４に記載の方法。
【００６４】
４８．上記遺伝子産物は、ポリペプチドであり、上記活性は、炭素化合物異化作用活性である、項４４に記載の方法。
【００６５】
４９．上記遺伝子産物は、ポリペプチドであり、上記活性は、生合成活性である、項４４に記載の方法。
【００６６】
５０．上記遺伝子産物は、ポリペプチドであり、上記活性は、トランスポーター（transporter）活性である、項４４に記載の方法。
【００６７】
５１．上記遺伝子産物は、ポリペプチドであり、上記活性は、転写活性である、項４４に記載の方法。
【００６８】
５２．上記遺伝子産物は、ポリペプチドであり、上記活性は、ＤＮＡ複製活性である、項４４に記載の方法。
【００６９】
５３．上記遺伝子産物は、ポリペプチドであり、上記活性は、細胞分裂活性である、項４４に記載の方法。
【００７０】
５４．上記遺伝子産物は、ＲＮＡである、項４４に記載の方法。
【００７１】
５５．上記遺伝子産物は、配列番号３８０１〜３８０５、４８６１〜５９１５、１００１３〜１４１１０からなる群から選ばれるアミノ酸配列を含むポリペプチドである、項４４に記載の方法。
【００７２】
５６．項４４に記載の方法を用いて同定される化合物。
【００７３】
５７．増殖に必要な遺伝子産物の活性もしくはレベルを低減させる能力を有する化合物または核酸を同定する方法であって、上記遺伝子産物は、配列番号８〜３７９５からなる群から選ばれるヌクレオチド配列を含むアンチセンス核酸により活性または発現が抑制される遺伝子産物を含み、上記方法は、
（ａ）上記遺伝子産物をコードする標的遺伝子またはＲＮＡを、候補化合物または核酸と接触させることと、
（ｂ）上記標的の活性を測定すること
とを含む方法。
【００７４】
５８．上記標的遺伝子またはＲＮＡは、アナプラスマ・マルギナレ(Anaplasma marginale)、アスペルギルス・フミガツス(Aspergillus fumigatus)、バチルス・アンスラシス(Bacillus anthracis)、バクテリオイデス・フラギリス(Bacterioides fragilis)、百日咳菌(Bordetella pertussis)、ブルクホルデリア・セパシア(Burkholderia cepacia)、カンピロバクター・イェジュニィ(Campylobacter jejuni)、カンジダ・アルビカンス (Candida albicans)、カンジダ・グラブラタ(Candida glabrata)（トルロプシス・グラブラタ(Torulopsis glabrata)とも呼ばれる）、カンジダ・トロピカリス(Candida tropicalis)、カンジダ・パラプシロシス(Candida parapsilosis)、カンジダ・ギルリエルモンジイ(Candida guilliermondii)、カンジダ・クルセイ(Candida krusei)、カンジダ・ケフィア(Candidakefyr)（カンジダ・シュードトロピカリス(Candidapseudotropicalis)とも呼ばれる）、カンジダ・デュブリニエンシス(Candida dubliniensis)、クラミジア・ニューモニエ(Chlamydia pneumoniae)、トラコーマ・クラミジア(Chlamydia trachomatus)、クロストリジウム・ボツリヌム(Clostridium botulinum)、クロストリジウム・ジフィシル(Clostridium difficile)、クロストリジウム・パーフリンゲンス(Clostridium perfringens)、コクシジオデス・イミチス(Coccidiodes immitis)、コリネバクテリウム・ジフテリア(Corynebacterium diptheriae)、クリプトコックス・ネオフォルマンス(Cryptococcus neoformans)、エンテロバクター・クロアカエ(Enterobacter cloacae)、エンテロコックス・フェカリス(Enterococcus faecalis)、エンテロコックス・ファエシウム(Enterococcus faecium)、エシェリヒア・コリ(Escherichia coli)、ヘモフィルス・インフルエンザ(Haemophilus influenzae)、ヘリコバクター・ピロリ(Helicobacter pylori)、ヒストプラスマ・カプスラツム(Histoplasma capsulatum)、クレブシエラ・ニューモニエ(Klebsiella pneumoniae)、リステリア・モノサイトゲネス(Listeria monocytogenes)、マイコバクテリウム・レプラエ(Mycobacterium leprae)、マイコバクテリウム・ツベルクローシス(Mycobacterium tuberculosis)、ナイセリア・ゴノローエ(Neisseria gonorrhoeae)、髄膜炎菌(Neisseria meningitidis)、ノカルジア・アステロイデス(Nocardia asteroides)、パスツレラ・ヘモリチカ(Pasteurella haemolytica)、パスツレラ・ムルトシダ(Pasteurella multocida)、ニューモシスティス・カリニー(Pneumocystis carinii)、プロテウス・ブルガリス(Proteus vulgaris)、シュードモナス・アエルギノーサ(Pseudomonas aeruginosa)、サルモネラ・ボンゴリ(Salmonella bongori)、サルモネラ・コレラスイス(Salmonella cholerasuis)、サルモネラ・エンテリカ(Salmonella enterica)、サルモネラ・パラチフィ(Salmonella paratyphi)、サルモネラ・チフィ(Salmonella typhi)、サルモネラ・チフィムリウム(Salmonella typhimurium)、スタフィロコッカス・オーレウス(Staphylococcus aureus)、リステリア・モノサイトゲネス(Listeria monocytogenes)、モクサレラ・カタルハリス(Moxarella catarrhalis)、シゲラ・ボイディ(Shigella boydii)、シゲラ・ディッセンリイ(Shigelladysenteriae)、シゲラ・フレックスネリ(Shigellaflexneri)、シゲラ・ソネイ(Shigella sonnei)、スタフィロコッカス・エピダーミディス(Staphylococcusepidermidis)、ストレプトコッカス・ニューモニエ(Streptococcuspneumoniae)、ストレプトコッカス・ミュータンス(Streptococcusmutans)、トレポネーマ・パリダム(Treponemapallidum)、エルシニア・エンテロコリチカ(Yersiniaenterocolitica)、エルシニア・ペスティス(Yersiniapestis)、および上記種のいずれかの属に属する任意の種からなる群から選ばれる生物由来である、項５７に記載の方法。
【００７５】
５９．上記標的遺伝子またはＲＮＡは、エシェリヒア・コリ以外の生物由来である、項５７に記載の方法。
【００７６】
６０．上記遺伝子産物は、エシェリヒア・コリ以外の生物由来である、項５７に記載の方法。
【００７７】
６１．上記標的は、メッセンジャーＲＮＡ分子であり、上記活性は、上記メッセンジャーＲＮＡの翻訳である、項５７に記載の方法。
【００７８】
６２．上記標的は、メッセンジャーＲＮＡ分子であり、上記活性は、上記メッセンジャーＲＮＡをコードする遺伝子の転写である、項５７に記載の方法。
【００７９】
６３．上記標的は、遺伝子であり、上記活性は、上記遺伝子の転写である、項５７に記載の方法。
【００８０】
６４．上記標的は、非翻訳ＲＮＡであり、上記活性は、上記非翻訳ＲＮＡのプロセシングまたはフォールディング、または上記非翻訳ＲＮＡの、タンパク質／ＲＮＡ複合体への集合である、項５７に記載の方法。
【００８１】
６５．上記標的は、配列番号３８０１〜３８０５、４８６１〜５９１５、１００１３〜１４１１０からなる群から選ばれるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするメッセンジャーＲＮＡ分子である、項５７に記載の方法。
【００８２】
６６．上記標的は、配列番号３７９６〜３８００、３８０６〜４８６０、５９１６〜１００１２からなる群から選ばれるアミノ酸を含む、項５７に記載の方法。
【００８３】
６７．項５７に記載の方法を用いて同定される化合物または核酸。
【００８４】
６８．細胞増殖に必要な遺伝子産物の活性またはレベルを低減させる化合物を同定する方法であって、上記遺伝子産物の活性または発現は、配列番号８〜３７９５からなる群から選ばれるヌクレオチド配列を含むアンチセンス核酸により抑制され、上記方法は、
（ａ）細胞において、致死量以下のレベルの、上記遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列を含む核酸に相補的なヌクレオチド配列を含むアンチセンス核酸を提供して、上記細胞における上記遺伝子産物の活性または量を低減させて、それにより感作細胞を生産し、（ｂ）上記感作細胞を化合物と接触させ、
（ｃ）上記化合物が、上記アンチセンス核酸を含有しない細胞に比べて、上記感作細胞の増殖を抑制する度合いを決定する工程
を含む方法。
【００８５】
６９．上記決定工程は、上記化合物が非感作細胞の成長を抑制するよりも高度に、上記化合物が上記感作細胞の成長を抑制するかどうかを決定することを含む、項６８に記載の方法。
【００８６】
７０．上記細胞は、グラム陽性菌である、項６８に記載の方法。
【００８７】
７１．上記グラム陽性菌は、スタフィロコッカススピーシーズ、ストレプトコッカススピーシーズ、エンテロコッカススピーシーズ、ミコバクテリウムスピーシーズ、クロストリジウムスピーシーズ、およびバチルススピーシーズからなる群から選ばれる、項６８に記載の方法。
【００８８】
７２．上記細菌は、スタフィロコッカス・オーレウスである、項６８に記載の方法。
【００８９】
７３．上記スタフィロコッカススピーシーズは、コアグラーゼ陰性である、項７２に記載の方法。
【００９０】
７４．上記細菌は、スタフィロコッカス・オーレウスＲＮ４５０およびスタフィロコッカス・オーレウスＲＮ４２２０からなる群から選ばれる、項７２に記載の方法。
【００９１】
７５．上記細胞は、アナプラスマ・マルギナレ(Anaplasmamarginale)、アスペルギルス・フミガツス(Aspergillusfumigatus)、バチルス・アンスラシス(Bacillusanthracis)、バクテリオイデス・フラギリス(Bacterioidesfragilis)、百日咳菌(Bordetellapertussis)、ブルクホルデリア・セパシア(Burkholderiacepacia)、カンピロバクター・イェジュニィ(Campylobacterjejuni)、カンジダ・アルビカンス (Candidaalbicans)、カンジダ・グラブラタ(Candidaglabrata)（トルロプシス・グラブラタ(Toprulopsisglabrata)とも呼ばれる）、カンジダ・トロピカリス(Candidatropicalis)、カンジダ・パラプシロシス(Candidaparapsilosis)、カンジダ・ギルリエルモンジイ(Candidaguilliermondii)、カンジダ・クルセイ(Candidakrusei)、カンジダ・ケフィア(Candidakefyr)（カンジダ・シュードトロピカリス(Candidapseudotropicalis)とも呼ばれる）、カンジダ・デュブリニエンシス(Candida dubliniensis)、クラミジア・ニューモニエ(Chlamydia pneumoniae)、トラコーマ・クラミジア(Chlamydia trachomatus)、クロストリジウム・ボツリヌム(Clostridium botulinum)、クロストリジウム・ジフィシル(Clostridium difficile)、クロストリジウム・パーフリンゲンス(Clostridium perfringens)、コクシジオデス・イミチス(Coccidiodes immitis)、コリネバクテリウム・ジフテリア(Corynebacterium diptheriae)、クリプトコックス・ネオフォルマンス(Cryptococcus neoformans)、エンテロバクター・クロアカエ(Enterobacter cloacae)、エンテロコックス・フェカリス(Enterococcus faecalis)、エンテロコックス・ファエシウム(Enterococcus faecium)、エシェリヒア・コリ(Escherichia coli)、ヘモフィルス・インフルエンザ(Haemophilus influenzae)、ヘリコバクター・ピロリ(Helicobacter pylori)、ヒストプラスマ・カプスラツム(Histoplasma capsulatum)、クレブシエラ・ニューモニエ(Klebsiella pneumoniae)、リステリア・モノサイトゲネス(Listeria monocytogenes)、マイコバクテリウム・レプラエ(Mycobacterium leprae)、マイコバクテリウム・ツベルクローシス(Mycobacterium tuberculosis)、ナイセリア・ゴノローエ(Neisseria gonorrhoeae)、髄膜炎菌(Neisseria meningitidis)、ノカルジア・アステロイデス(Nocardia asteroides)、パスツレラ・ヘモリチカ(Pasteurella haemolytica)、パスツレラ・ムルトシダ(Pasteurella multocida)、ニューモシスティス・カリニー(Pneumocystis carinii)、プロテウス・ブルガリス(Proteus vulgaris)、シュードモナス・アエルギノーサ(Pseudomonas aeruginosa)、サルモネラ・ボンゴリ(Salmonella bongori)、サルモネラ・コレラスイス(Salmonella cholerasuis)、サルモネラ・エンテリカ(Salmonella enterica)、サルモネラ・パラチフィ(Salmonella paratyphi)、サルモネラ・チフィ(Salmonella typhi)、サルモネラ・チフィムリウム(Salmonella typhimurium)、スタフィロコッカス・オーレウス(Staphylococcus aureus)、リステリア・モノサイトゲネス(Listeria monocytogenes)、モクサレラ・カタルハリス(Moxarella catarrhalis)、シゲラ・ボイディ(Shigella boydii)、シゲラ・ディッセンリイ(Shigelladysenteriae)、シゲラ・フレックスネリ(Shigellaflexneri)、シゲラ・ソネイ(Shigella sonnei)、スタフィロコッカス・エピダーミディス(Staphylococcusepidermidis)、ストレプトコッカス・ニューモニエ(Streptococcuspneumoniae)、ストレプトコッカス・ミュータンス(Streptococcusmutans)、トレポネーマ・パリダム(Treponemapallidum)、エルシニア・エンテロコリチカ(Yersiniaenterocolitica)、エルシニア・ペスティス(Yersiniapestis)、および上記種のいずれかの属に属する任意の種からなる群から選ばれる生物である、項６８に記載の方法。
【００９２】
７６．上記細胞は、エシェリヒア・コリ細胞ではない、項６８に記載の方法。
【００９３】
７７．上記遺伝子産物は、エシェリヒア・コリ以外の生物由来である、項６８に記載の方法。
【００９４】
７８．上記アンチセンス核酸は、誘導性プロモーターから転写される、項６８に記載の方法。
【００９５】
７９．上記細胞を、上記アンチセンス核酸の転写を致死量以下のレベルに誘導する誘導物質濃度と接触させる工程をさらに含む、項６８に記載の方法。
【００９６】
８０．成長抑制は、培養成長溶液の吸光度をモニターすることにより測定される、項６８に記載の方法。
【００９７】
８１．上記遺伝子産物は、ポリペプチドである、項６８に記載の方法。
【００９８】
８２．上記ポリペプチドは、配列番号３８０１〜３８０５、４８６１〜５９１５、１００１３〜１４１１０からなる群から選ばれるアミノ酸配列を含む、項８１に記載の方法。
【００９９】
８３．上記遺伝子産物は、ＲＮＡである、項６８に記載の方法。
【０１００】
８４．上記遺伝子産物をコードする核酸は、配列番号３７９６〜３８００、３８０６〜４８６０、５９１６〜１００１２からなる群から選ばれるヌクレオチド配列を含む、項６８に記載の方法。
【０１０１】
８５．項６８に記載の方法を用いて同定される化合物。
【０１０２】
８６．細胞増殖を抑制する方法であって、有効量の、配列番号８〜３７９５からなる群から選ばれるヌクレオチド配列を含むアンチセンス核酸により活性または発現が抑制される遺伝子に対する活性を有する化合物、または上記遺伝子の産物に対する活性を有する化合物を、上記遺伝子を発現する細胞集団に導入することを含む方法。
【０１０３】
８７．上記化合物は、配列番号８〜３７９５からなる群から選ばれるヌクレオチド配列、またはそれらの増殖抑制部分を含むアンチセンス核酸である、項８６に記載の方法。
【０１０４】
８８．配列番号８〜３７９５の１つの上記増殖抑制部分は、配列番号８〜３７９５の１つの少なくとも１０個、少なくとも２０個、少なくとも２５個、少なくとも３０個、少なくとも５０個、または５１個より多い連続ヌクレオチドを含む断片である、項８６に記載の方法。
【０１０５】
８９．上記集団は、グラム陽性菌の集団である、項８６に記載の方法。
【０１０６】
９０．上記グラム陽性菌の集団は、スタフィロコッカススピーシーズ、ストレプトコッカススピーシーズ、エンテロコッカススピーシーズ、ミコバクテリウムスピーシーズ、クロストリジウムスピーシーズ、およびバチルススピーシーズの集団からなる群から選ばれる、項８９に記載の方法。
【０１０７】
９１．上記集団は、スタフィロコッカス・オーレウスの集団である、項８６に記載の方法。
【０１０８】
９２．上記集団は、スタフィロコッカス・オーレウスＲＮ４５０およびスタフィロコッカス・オーレウスＲＮ４２２０からなる群から選ばれる細菌の集団である、項９１に記載の方法。
【０１０９】
９３．上記集団は、アナプラスマ・マルギナレ(Anaplasmamarginale)、アスペルギルス・フミガツス(Aspergillusfumigatus)、バチルス・アンスラシス(Bacillusanthracis)、バクテリオイデス・フラギリス(Bacterioidesfragilis)、百日咳菌(Bordetellapertussis)、ブルクホルデリア・セパシア(Burkholderiacepacia)、カンピロバクター・イェジュニィ(Campylobacterjejuni)、カンジダ・アルビカンス (Candidaalbicans)、カンジダ・グラブラタ(Candidaglabrata)（トルロプシス・グラブラタ(Torulopsisglabrata)とも呼ばれる）、カンジダ・トロピカリス(Candidatropicalis)、カンジダ・パラプシロシス(Candidaparapsilosis)、カンジダ・ギルリエルモンジイ(Candidaguilliermondii)、カンジダ・クルセイ(Candidakrusei)、カンジダ・ケフィア(Candidakefyr)（カンジダ・シュードトロピカリス(Candidapseudotropicalis)とも呼ばれる）、カンジダ・デュブリニエンシス(Candida dubliniensis)、クラミジア・ニューモニエ(Chlamydia pneumoniae)、トラコーマ・クラミジア(Chlamydia trachomatus)、クロストリジウム・ボツリヌム(Clostridium botulinum)、クロストリジウム・ジフィシル(Clostridium difficile)、クロストリジウム・パーフリンゲンス(Clostridium perfringens)、コクシジオデス・イミチス(Coccidiodes immitis)、コリネバクテリウム・ジフテリア(Corynebacterium diptheriae)、クリプトコックス・ネオフォルマンス(Cryptococcus neoformans)、エンテロバクター・クロアカエ(Enterobacter cloacae)、エンテロコックス・フェカリス(Enterococcus faecalis)、エンテロコックス・ファエシウム(Enterococcus faecium)、エシェリヒア・コリ(Escherichia coli)、ヘモフィルス・インフルエンザ(Haemophilus influenzae)、ヘリコバクター・ピロリ(Helicobacter pylori)、ヒストプラスマ・カプスラツム(Histoplasma capsulatum)、クレブシエラ・ニューモニエ(Klebsiella pneumoniae)、リステリア・モノサイトゲネス(Listeria monocytogenes)、マイコバクテリウム・レプラエ(Mycobacterium leprae)、マイコバクテリウム・ツベルクローシス(Mycobacterium tuberculosis)、ナイセリア・ゴノローエ(Neisseria gonorrhoeae)、髄膜炎菌(Neisseria meningitidis)、ノカルジア・アステロイデス(Nocardia asteroides)、パスツレラ・ヘモリチカ(Pasteurella haemolytica)、パスツレラ・ムルトシダ(Pasteurella multocida)、ニューモシスティス・カリニー(Pneumocystis carinii)、プロテウス・ブルガリス(Proteus vulgaris)、シュードモナス・アエルギノーサ(Pseudomonas aeruginosa)、サルモネラ・ボンゴリ(Salmonella bongori)、サルモネラ・コレラスイス(Salmonella cholerasuis)、サルモネラ・エンテリカ(Salmonella enterica)、サルモネラ・パラチフィ(Salmonella paratyphi)、サルモネラ・チフィ(Salmonella typhi)、サルモネラ・チフィムリウム(Salmonella typhimurium)、スタフィロコッカス・オーレウス(Staphylococcus aureus)、リステリア・モノサイトゲネス(Listeria monocytogenes)、モクサレラ・カタルハリス(Moxarella catarrhalis)、シゲラ・ボイディ(Shigella boydii)、シゲラ・ディッセンリイ(Shigelladysenteriae)、シゲラ・フレックスネリ(Shigellaflexneri)、シゲラ・ソネイ(Shigellasonnei)、スタフィロコッカス・エピダーミディス(Staphylococcusepidermidis)、ストレプトコッカス・ニューモニエ(Streptococcuspneumoniae)、ストレプトコッカス・ミュータンス(Streptococcusmutans)、トレポネーマ・パリダム(Treponemapallidum)、エルシニア・エンテロコリチカ(Yersiniaenterocolitica)、エルシニア・ペスティス(Yersiniapestis)、および上記種のいずれかの属に属する任意の種からなる群から選ばれる細菌の集団である、項８６に記載の方法。
【０１１０】
９４．上記集団は、エシェリヒア・コリ以外の生物の集団である、項８６に記載の方法。
【０１１１】
９５．上記遺伝子の上記産物は、エシェリヒア・コリ以外の生物由来である、項８６に記載の方法。
【０１１２】
９６．上記遺伝子は、配列番号３８０１〜３８０５、４８６１〜５９１５、１００１３〜１４１１０からなる群から選ばれるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする、項８６に記載の方法。
【０１１３】
９７．上記遺伝子は、配列番号３７９６〜３８００、３８０６〜４８６０、５９１６〜１００１２からなる群から選ばれるヌクレオチド配列を含む、項８６に記載の方法。
【０１１４】
９８．薬学的に許容可能な担体中に、有効濃度の、配列番号８〜３７９５からなる群から選ばれるヌクレオチド配列、またはそれらの増殖抑制部分を含むアンチセンス核酸を含む組成物。
【０１１５】
９９．配列番号８〜３７９５の１つの上記増殖抑制部分は、配列番号８〜３７９５の１つの少なくとも２０個、少なくとも２５個、少なくとも３０個、少なくとも５０個、または５０個より多い連続ヌクレオチドを含む、項９８に記載の組成物。
【０１１６】
１００．増殖に必要なオペロンにおける遺伝子の活性または発現を抑制する方法であって、上記オペロンにおける少なくとも１つの遺伝子の活性または発現は、配列番号８〜３７９５からなる群から選ばれる配列を含むアンチセンス核酸により抑制され、上記方法は、細胞集団中の細胞を、上記オペロンの少なくとも一部に相補的なアンチセンス核酸と接触させることを含む方法。
【０１１７】
１０１．上記アンチセンス核酸は、配列番号８〜３７９５からなる群から選ばれるヌクレオチド配列、またはそれらの増殖抑制部分を含む、項１００に記載の方法。
【０１１８】
１０２．上記細胞は、アナプラスマ・マルギナレ(Anaplasmamarginale)、アスペルギルス・フミガツス(Aspergillusfumigatus)、バチルス・アンスラシス(Bacillusanthracis)、バクテリオイデス・フラギリス(Bacterioidesfragilis)、百日咳菌(Bordetellapertussis)、ブルクホルデリア・セパシア(Burkholderiacepacia)、カンピロバクター・イェジュニィ(Campylobacterjejuni)、カンジダ・アルビカンス (Candidaalbicans)、カンジダ・グラブラタ(Candidaglabrata)（トルロプシス・グラブラタ(Torulopsisglabrata)とも呼ばれる）、カンジダ・トロピカリス(Candidatropicalis)、カンジダ・パラプシロシス(Candidaparapsilosis)、カンジダ・ギルリエルモンジイ(Candidaguilliermondii)、カンジダ・クルセイ(Candidakrusei)、カンジダ・ケフィア(Candidakefyr)（カンジダ・シュードトロピカリス(Candidapseudotropicalis)とも呼ばれる）、カンジダ・デュブリニエンシス(Candida dubliniensis)、クラミジア・ニューモニエ(Chlamydia pneumoniae)、トラコーマ・クラミジア(Chlamydia trachomatus)、クロストリジウム・ボツリヌム(Clostridium botulinum)、クロストリジウム・ジフィシル(Clostridium difficile)、クロストリジウム・パーフリンゲンス(Clostridium perfringens)、コクシジオデス・イミチス(Coccidiodes immitis)、コリネバクテリウム・ジフテリア(Corynebacterium diptheriae)、クリプトコックス・ネオフォルマンス(Cryptococcus neoformans)、エンテロバクター・クロアカエ(Enterobacter cloacae)、エンテロコックス・フェカリス(Enterococcus faecalis)、エンテロコックス・ファエシウム(Enterococcus faecium)、エシェリヒア・コリ(Escherichia coli)、ヘモフィルス・インフルエンザ(Haemophilus influenzae)、ヘリコバクター・ピロリ(Helicobacter pylori)、ヒストプラスマ・カプスラツム(Histoplasma capsulatum)、クレブシエラ・ニューモニエ(Klebsiella pneumoniae)、リステリア・モノサイトゲネス(Listeria monocytogenes)、マイコバクテリウム・レプラエ(Mycobacterium leprae)、マイコバクテリウム・ツベルクローシス(Mycobacterium tuberculosis)、ナイセリア・ゴノローエ(Neisseria gonorrhoeae)、髄膜炎菌(Neisseria meningitidis)、ノカルジア・アステロイデス(Nocardia asteroides)、パスツレラ・ヘモリチカ(Pasteurella haemolytica)、パスツレラ・ムルトシダ(Pasteurella multocida)、ニューモシスティス・カリニー(Pneumocystis carinii)、プロテウス・ブルガリス(Proteus vulgaris)、シュードモナス・アエルギノーサ(Pseudomonas aeruginosa)、サルモネラ・ボンゴリ(Salmonella bongori)、サルモネラ・コレラスイス(Salmonella cholerasuis)、サルモネラ・エンテリカ(Salmonella enterica)、サルモネラ・パラチフィ(Salmonella paratyphi)、サルモネラ・チフィ(Salmonella typhi)、サルモネラ・チフィムリウム(Salmonella typhimurium)、スタフィロコッカス・オーレウス(Staphylococcus aureus)、リステリア・モノサイトゲネス(Listeria monocytogenes)、モクサレラ・カタルハリス(Moxarella catarrhalis)、シゲラ・ボイディ(Shigella boydii)、シゲラ・ディッセンリイ(Shigelladysenteriae)、シゲラ・フレックスネリ(Shigellaflexneri)、シゲラ・ソネイ(Shigellasonnei)、スタフィロコッカス・エピダーミディス(Staphylococcusepidermidis)、ストレプトコッカス・ニューモニエ(Streptococcuspneumoniae)、ストレプトコッカス・ミュータンス(Streptococcusmutans)、トレポネーマ・パリダム(Treponemapallidum)、エルシニア・エンテロコリチカ(Yersiniaenterocolitica)、エルシニア・ペスティス(Yersiniapestis)、および上記種のいずれかの属に属する任意の種からなる群から選ばれる、項１００に記載の方法。
【０１１９】
１０３．上記細胞は、エシェリヒア・コリ細胞ではない、項１００に記載の方法。
【０１２０】
１０４．上記遺伝子は、エシェリヒア・コリ以外の生物由来である、項１００に記載の方法。
【０１２１】
１０５．上記アンチセンス核酸を発現するプラスミドを、上記細胞集団に導入することにより、上記細胞を上記アンチセンス核酸と接触させる、項１００に記載の方法。
【０１２２】
１０６．上記アンチセンス核酸をコードするファージを、上記細胞集団に導入することにより、上記細胞を上記アンチセンス核酸と接触させる、項１００に記載の方法。
【０１２３】
１０７．上記細胞集団において細胞の染色体から上記アンチセンス核酸を発現させることにより、上記細胞を上記アンチセンス核酸と接触させる、項１００に記載の方法。
【０１２４】
１０８．プロモーターが上記アンチセンス核酸の転写を誘導するように、上記アンチセンス核酸の染色体コピーに隣接するプロモーターを導入することにより、上記細胞を上記アンチセンス核酸と接触させる、項１００に記載の方法。
【０１２５】
１０９．上記アンチセンス核酸を発現するレトロン(retron)を、上記細胞集団に導入することにより、上記細胞を上記アンチセンス核酸と接触させる、項１００に記載の方法。
【０１２６】
１１０．上記細胞集団にリボザイムを導入することにより、上記細胞を上記アンチセンス核酸と接触させる方法であって、上記リボザイムの結合部分は、上記アンチセンス核酸を含む、項１００に記載の方法。
【０１２７】
１１１．上記アンチセンス核酸を含むリポソームを、上記細胞に導入することにより、上記細胞を上記アンチセンス核酸と接触させる、項１００に記載の方法。
【０１２８】
１１２．上記アンチセンス核酸の、上記細胞へのエレクトロポレーションにより、上記細胞を上記アンチセンス核酸と接触させる、項１００に記載の方法。
【０１２９】
１１３．上記アンチセンス核酸は、配列番号８〜３７９５の１つの少なくとも１０個、少なくとも２０個、少なくとも２５個、少なくとも３０個、少なくとも５０個、または５０個より多い連続ヌクレオチドを含む断片である、項１００に記載の方法。
【０１３０】
１１４．上記アンチセンス核酸は、合成オリゴヌクレオチドである、項１００に記載の方法。
【０１３１】
１１５．上記遺伝子は、配列番号３７９６〜３８００、３８０６〜４８６０、５９１６〜１００１２からなる群から選ばれるヌクレオチド配列を含む、項１００に記載の方法。
【０１３２】
１１６．細胞増殖に必要な遺伝子を同定する方法であって、
（ａ）細胞を、配列番号８〜３７９５からなる群から選ばれるヌクレオチド配列を含むアンチセンス核酸と接触させ（ここで、上記細胞は、上記核酸が得られた生物以外の細胞である）、
（ｂ）上記核酸が上記細胞の増殖を抑制するかどうかを決定し、
（ｃ）上記アンチセンス核酸またはその一部に相補的なｍＲＮＡをコードする、上記細胞中の遺伝子を同定すること
を含む方法。
【０１３３】
１１７．上記細胞は、スタフィロコッカススピーシーズ、ストレプトコッカススピーシーズ、エンテロコッカススピーシーズ、ミコバクテリウムスピーシーズ、クロストリジウムスピーシーズ、およびバチルススピーシーズからなる群から選ばれる、項１１６記載の方法。
【０１３４】
１１８．上記細胞は、アナプラスマ・マルギナレ(Anaplasmamarginale)、アスペルギルス・フミガツス(Aspergillusfumigatus)、バチルス・アンスラシス(Bacillusanthracis)、バクテリオイデス・フラギリス(Bacterioidesfragilis)、百日咳菌(Bordetellapertussis)、ブルクホルデリア・セパシア(Burkholderiacepacia)、カンピロバクター・イェジュニィ(Campylobacterjejuni)、カンジダ・アルビカンス (Candidaalbicans)、カンジダ・グラブラタ(Candidaglabrata)（トルロプシス・グラブラタ(Torulopsisglabrata)とも呼ばれる）、カンジダ・トロピカリス(Candidatropicalis)、カンジダ・パラプシロシス(Candidaparapsilosis)、カンジダ・ギルリエルモンジイ(Candidaguilliermondii)、カンジダ・クルセイ(Candidakrusei)、カンジダ・ケフィア(Candidakefyr)（カンジダ・シュードトロピカリス(Candidapseudotropicalis)とも呼ばれる）、カンジダ・デュブリニエンシス(Candida dubliniensis)、クラミジア・ニューモニエ(Chlamydia pneumoniae)、トラコーマ・クラミジア(Chlamydia trachomatus)、クロストリジウム・ボツリヌム(Clostridium botulinum)、クロストリジウム・ジフィシル(Clostridium difficile)、クロストリジウム・パーフリンゲンス(Clostridium perfringens)、コクシジオデス・イミチス(Coccidiodes immitis)、コリネバクテリウム・ジフテリア(Corynebacterium diptheriae)、クリプトコックス・ネオフォルマンス(Cryptococcus neoformans)、エンテロバクター・クロアカエ(Enterobacter cloacae)、エンテロコックス・フェカリス(Enterococcus faecalis)、エンテロコックス・ファエシウム(Enterococcus faecium)、エシェリヒア・コリ(Escherichia coli)、ヘモフィルス・インフルエンザ(Haemophilus influenzae)、ヘリコバクター・ピロリ(Helicobacter pylori)、ヒストプラスマ・カプスラツム(Histoplasma capsulatum)、クレブシエラ・ニューモニエ(Klebsiella pneumoniae)、リステリア・モノサイトゲネス(Listeria monocytogenes)、マイコバクテリウム・レプラエ(Mycobacterium leprae)、マイコバクテリウム・ツベルクローシス(Mycobacterium tuberculosis)、ナイセリア・ゴノローエ(Neisseria gonorrhoeae)、髄膜炎菌(Neisseria meningitidis)、ノカルジア・アステロイデス(Nocardia asteroides)、パスツレラ・ヘモリチカ(Pasteurella haemolytica)、パスツレラ・ムルトシダ(Pasteurella multocida)、ニューモシスティス・カリニー(Pneumocystis carinii)、プロテウス・ブルガリス(Proteus vulgaris)、シュードモナス・アエルギノーサ(Pseudomonas aeruginosa)、サルモネラ・ボンゴリ(Salmonella bongori)、サルモネラ・コレラスイス(Salmonella cholerasuis)、サルモネラ・エンテリカ(Salmonella enterica)、サルモネラ・パラチフィ(Salmonella paratyphi)、サルモネラ・チフィ(Salmonella typhi)、サルモネラ・チフィムリウム(Salmonella typhimurium)、スタフィロコッカス・オーレウス(Staphylococcus aureus)、リステリア・モノサイトゲネス(Listeria monocytogenes)、モクサレラ・カタルハリス(Moxarella catarrhalis)、シゲラ・ボイディ(Shigella boydii)、シゲラ・ディッセンリイ(Shigelladysenteriae)、シゲラ・フレックスネリ(Shigellaflexneri)、シゲラ・ソネイ(Shigellasonnei)、スタフィロコッカス・エピダーミディス(Staphylococcusepidermidis)、ストレプトコッカス・ニューモニエ(Streptococcuspneumoniae)、ストレプトコッカス・ミュータンス(Streptococcusmutans)、トレポネーマ・パリダム(Treponemapallidum)、エルシニア・エンテロコリチカ(Yersiniaenterocolitica)、エルシニア・ペスティス(Yersiniapestis)、および上記種のいずれかの属に属する任意の種からなる群から選ばれる、項１１６に記載の方法。
【０１３５】
１１９．上記細胞は、エシェリヒア・コリではない、項１１６に記載の方法。
【０１３６】
１２０．上記細胞において機能的なプロモーターに上記アンチセンス核酸を作動可能に連結し（上記プロモーターはベクター中に含まれている）、上記ベクターを上記細胞に導入することをさらに含む、項１１６に記載の方法。
【０１３７】
１２１．細胞増殖を抑制する能力を有する化合物を同定する方法であって、
（ａ）試験細胞において、配列番号８〜３７９５からなる群から選ばれるヌクレオチド配列を含む核酸により活性もしくはレベルが抑制される遺伝子または遺伝子産物の相同体を同定し（ここで、上記試験細胞は、上記核酸が得られた細胞ではない）、
（ｂ）上記試験細胞において上記相同体の活性を抑制する抑制性核酸配列を同定し、
（ｃ）上記試験細胞を、致死量以下のレベルの上記抑制性核酸と接触させて、上記細胞を感作し、
（ｄ）工程（ｃ）の感作細胞を化合物と接触させ、
（ｅ）上記化合物が、上記抑制性核酸を含有しない細胞に比べて、上記感作細胞の増殖を抑制する度合いを決定する工程
を含む方法。
【０１３８】
１２２．上記決定工程は、上記化合物が非感作試験細胞の増殖を抑制するよりも高度に、上記化合物が上記感作試験細胞の増殖を抑制するかどうかを決定することを含む、項１２１に記載の方法。
【０１３９】
１２３．工程（ａ）は、データベースにて以下の相同核酸または相同ポリペプチドをコードする以下の核酸を同定するために、デフォルトパラメータでのＢＬＡＳＴＮバージョン２．０およびデフォルトパラメータでのＦＡＳＴＡバージョン３．０ｔ７８アルゴリズムからなる群から選ばれるアリゴリズムを用いて、配列番号８〜３７９５からなる群から選ばれる核酸により活性もしくはレベルが抑制される遺伝子または遺伝子産物に相同的な核酸、または配列番号８〜３７９５からなる群から選ばれる核酸により活性またはレベルが抑制されるポリペプチドに対する相同ポリペプチドをコードする核酸を同定することを含む、項１２１に記載の方法。
【０１４０】
１２４．工程（ａ）は、配列番号８〜３７９５からなる群から選ばれる核酸にハイブリダイズする核酸、または配列番号８〜３７９５からなる群から選ばれる核酸の相補体(complement)を同定することにより、相同核酸または相同ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸を同定することを含む、項１２１に記載の方法。
【０１４１】
１２５．工程（ａ）は、上記試験細胞において配列番号８〜３７９５からなる群から選ばれる核酸を発現させることを含む、項１２１に記載の方法。
【０１４２】
１２６．工程（ａ）は、アナプラスマ・マルギナレ(Anaplasmamarginale)、アスペルギルス・フミガツス(Aspergillusfumigatus)、バチルス・アンスラシス(Bacillusanthracis)、バクテリオイデス・フラギリス(Bacterioidesfragilis)、百日咳菌(Bordetellapertussis)、ブルクホルデリア・セパシア(Burkholderiacepacia)、カンピロバクター・イェジュニィ(Campylobacterjejuni)、カンジダ・アルビカンス (Candidaalbicans)、カンジダ・グラブラタ(Candidaglabrata)（トルロプシス・グラブラタ(Torulopsisglabrata)とも呼ばれる）、カンジダ・トロピカリス(Candidatropicalis)、カンジダ・パラプシロシス(Candidaparapsilosis)、カンジダ・ギルリエルモンジイ(Candidaguilliermondii)、カンジダ・クルセイ(Candidakrusei)、カンジダ・ケフィア(Candidakefyr)（カンジダ・シュードトロピカリス(Candidapseudotropicalis)とも呼ばれる）、カンジダ・デュブリニエンシス(Candida dubliniensis)、クラミジア・ニューモニエ(Chlamydia pneumoniae)、トラコーマ・クラミジア(Chlamydia trachomatus)、クロストリジウム・ボツリヌム(Clostridium botulinum)、クロストリジウム・ジフィシル(Clostridium difficile)、クロストリジウム・パーフリンゲンス(Clostridium perfringens)、コクシジオデス・イミチス(Coccidiodes immitis)、コリネバクテリウム・ジフテリア(Corynebacterium diptheriae)、クリプトコックス・ネオフォルマンス(Cryptococcus neoformans)、エンテロバクター・クロアカエ(Enterobacter cloacae)、エンテロコックス・フェカリス(Enterococcus faecalis)、エンテロコックス・ファエシウム(Enterococcus faecium)、エシェリヒア・コリ(Escherichia coli)、ヘモフィルス・インフルエンザ(Haemophilus influenzae)、ヘリコバクター・ピロリ(Helicobacter pylori)、ヒストプラスマ・カプスラツム(Histoplasma capsulatum)、クレブシエラ・ニューモニエ(Klebsiella pneumoniae)、リステリア・モノサイトゲネス(Listeria monocytogenes)、マイコバクテリウム・レプラエ(Mycobacterium leprae)、マイコバクテリウム・ツベルクローシス(Mycobacterium tuberculosis)、ナイセリア・ゴノローエ(Neisseria gonorrhoeae)、髄膜炎菌(Neisseria meningitidis)、ノカルジア・アステロイデス(Nocardia asteroides)、パスツレラ・ヘモリチカ(Pasteurella haemolytica)、パスツレラ・ムルトシダ(Pasteurella multocida)、ニューモシスティス・カリニー(Pneumocystis carinii)、プロテウス・ブルガリス(Proteus vulgaris)、シュードモナス・アエルギノーサ(Pseudomonas aeruginosa)、サルモネラ・ボンゴリ(Salmonella bongori)、サルモネラ・コレラスイス(Salmonella cholerasuis)、サルモネラ・エンテリカ(Salmonella enterica)、サルモネラ・パラチフィ(Salmonella paratyphi)、サルモネラ・チフィ(Salmonella typhi)、サルモネラ・チフィムリウム(Salmonella typhimurium)、スタフィロコッカス・オーレウス(Staphylococcus aureus)、リステリア・モノサイトゲネス(Listeria monocytogenes)、モクサレラ・カタルハリス(Moxarella catarrhalis)、シゲラ・ボイディ(Shigella boydii)、シゲラ・ディッセンリイ(Shigelladysenteriae)、シゲラ・フレックスネリ(Shigellaflexneri)、シゲラ・ソネイ(Shigellasonnei)、スタフィロコッカス・エピダーミディス(Staphylococcusepidermidis)、ストレプトコッカス・ニューモニエ(Streptococcuspneumoniae)、ストレプトコッカス・ミュータンス(Streptococcusmutans)、トレポネーマ・パリダム(Treponemapallidum)、エルシニア・エンテロコリチカ(Yersiniaenterocolitica)、エルシニア・ペスティス(Yersiniapestis)、および上記種のいずれかの属に属する任意の種からなる群から選ばれる試験細胞において、相同核酸または相同ポリペプチドをコードする核酸を同定することを含む、項１２１に記載の方法。
【０１４３】
１２７．工程（ａ）は、エシェリヒア・コリ以外の試験細胞において、相同核酸または相同ポリペプチドをコードする核酸を同定することを含む、項１２１に記載の方法。
【０１４４】
１２８．上記抑制性核酸は、アンチセンス核酸である、項１２１に記載の方法。
【０１４５】
１２９．上記抑制性核酸は、上記相同体の一部に対するアンチセンス核酸を含む、項１２１に記載の方法。
【０１４６】
１３０．上記抑制性核酸は、上記相同体をコードするオペロンの一部に対するアンチセンス核酸を含む、項１２１に記載の方法。
【０１４７】
１３１．上記細胞を致死量以下のレベルの上記抑制性核酸と接触させる工程は、上記細胞の表面を、上記抑制性核酸と直接接触させることを含む、項１２１に記載の方法。
【０１４８】
１３２．上記細胞を致死量以下のレベルの上記抑制性核酸と接触させる工程は、上記細胞において上記相同体から転写されるＲＮＡの少なくとも一部に相補的なアンチセンス核酸を転写することを含む、項１２１に記載の方法。
【０１４９】
１３３．上記遺伝子産物は、配列番号３８０１〜３８０５、４８６１〜５９１５、１００１３〜１４１１０からなる群から選ばれるアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む、項１２１に記載の方法。
【０１５０】
１３４．上記遺伝子は、配列番号３７９６〜３８００、３８０６〜４８６０、５９１６〜１００１２からなる群から選ばれるヌクレオチド配列を含む、項１２１に記載の方法。
【０１５１】
１３５．項１２１に記載の方法を用いて同定される化合物。
【０１５２】
１３６．増殖を抑制する能力を有する化合物を同定する方法であって、
（ａ）試験細胞を、致死量以下のレベルの、配列番号８〜３７９５からなる群から選ばれるヌクレオチド配列を含む核酸、またはそれらの、上記核酸が得られた細胞の増殖を抑制する部分と接触させて、上記試験細胞を感作し、
（ｂ）工程（ａ）の感作試験細胞を、化合物と接触させ、
（ｃ）上記化合物が、上記核酸を含有しない細胞に比べて、上記感作試験細胞の増殖を抑制する度合いを決定する工程
を含む方法。
【０１５３】
１３７．上記決定工程は、上記化合物が非感作試験細胞の増殖を抑制するよりも高度に、上記化合物が上記感作試験細胞の増殖を抑制するかどうかを決定することを含む、項１３６に記載の方法。
【０１５４】
１３８．項１３６に記載の方法を用いて同定される化合物。
【０１５５】
１３９．上記試験細胞は、アナプラスマ・マルギナレ(Anaplasma marginale)、アスペルギルス・フミガツス(Aspergillus fumigatus)、バチルス・アンスラシス(Bacillus anthracis)、バクテリオイデス・フラギリス(Bacterioides fragilis)、百日咳菌(Bordetella pertussis)、ブルクホルデリア・セパシア(Burkholderia cepacia)、カンピロバクター・イェジュニィ(Campylobacter jejuni)、カンジダ・アルビカンス (Candida albicans)、カンジダ・グラブラタ(Candida glabrata)（トルロプシス・グラブラタ(Torulopsis glabrata)とも呼ばれる）、カンジダ・トロピカリス(Candida tropicalis)、カンジダ・パラプシロシス(Candida parapsilosis)、カンジダ・ギルリエルモンジイ(Candida guilliermondii)、カンジダ・クルセイ(Candida krusei)、カンジダ・ケフィア(Candidakefyr)（カンジダ・シュードトロピカリス(Candidapseudotropicalis)とも呼ばれる）、カンジダ・デュブリニエンシス(Candida dubliniensis)、クラミジア・ニューモニエ(Chlamydia pneumoniae)、トラコーマ・クラミジア(Chlamydia trachomatus)、クロストリジウム・ボツリヌム(Clostridium botulinum)、クロストリジウム・ジフィシル(Clostridium difficile)、クロストリジウム・パーフリンゲンス(Clostridium perfringens)、コクシジオデス・イミチス(Coccidiodes immitis)、コリネバクテリウム・ジフテリア(Corynebacterium diptheriae)、クリプトコックス・ネオフォルマンス(Cryptococcus neoformans)、エンテロバクター・クロアカエ(Enterobacter cloacae)、エンテロコックス・フェカリス(Enterococcus faecalis)、エンテロコックス・ファエシウム(Enterococcus faecium)、エシェリヒア・コリ(Escherichia coli)、ヘモフィルス・インフルエンザ(Haemophilus influenzae)、ヘリコバクター・ピロリ(Helicobacter pylori)、ヒストプラスマ・カプスラツム(Histoplasma capsulatum)、クレブシエラ・ニューモニエ(Klebsiella pneumoniae)、リステリア・モノサイトゲネス(Listeria monocytogenes)、マイコバクテリウム・レプラエ(Mycobacterium leprae)、マイコバクテリウム・ツベルクローシス(Mycobacterium tuberculosis)、ナイセリア・ゴノローエ(Neisseria gonorrhoeae)、髄膜炎菌(Neisseria meningitidis)、ノカルジア・アステロイデス(Nocardia asteroides)、パスツレラ・ヘモリチカ(Pasteurella haemolytica)、パスツレラ・ムルトシダ(Pasteurella multocida)、ニューモシスティス・カリニー(Pneumocystis carinii)、プロテウス・ブルガリス(Proteus vulgaris)、シュードモナス・アエルギノーサ(Pseudomonas aeruginosa)、サルモネラ・ボンゴリ(Salmonella bongori)、サルモネラ・コレラスイス(Salmonella cholerasuis)、サルモネラ・エンテリカ(Salmonella enterica)、サルモネラ・パラチフィ(Salmonella paratyphi)、サルモネラ・チフィ(Salmonella typhi)、サルモネラ・チフィムリウム(Salmonella typhimurium)、スタフィロコッカス・オーレウス(Staphylococcus aureus)、リステリア・モノサイトゲネス(Listeria monocytogenes)、モクサレラ・カタルハリス(Moxarella catarrhalis)、シゲラ・ボイディ(Shigella boydii)、シゲラ・ディッセンリイ(Shigelladysenteriae)、シゲラ・フレックスネリ(Shigellaflexneri)、シゲラ・ソネイ(Shigellasonnei)、スタフィロコッカス・エピダーミディス(Staphylococcusepidermidis)、ストレプトコッカス・ニューモニエ(Streptococcuspneumoniae)、ストレプトコッカス・ミュータンス(Streptococcusmutans)、トレポネーマ・パリダム(Treponemapallidum)、エルシニア・エンテロコリチカ(Yersiniaenterocolitica)、エルシニア・ペスティス(Yersiniapestis)、および上記種のいずれかの属に属する任意の種からなる群から選ばれる、項１３６に記載の方法。
【０１５６】
１４０．上記試験細胞は、エシェリヒア・コリではない、項１３６に記載の方法。
【０１５７】
１４１．増殖に必要な生物学的経路に対する活性を有する化合物を同定する方法であって、
（ａ）細胞において、致死量以下のレベルの、増殖に必要な遺伝子産物をコードする核酸に相補的なアンチセンス核酸を提供して、上記遺伝子産物の活性または量を低減させることにより上記細胞を感作し（ここで、上記遺伝子産物の活性または発現は、配列番号８〜３７９５からなる群から選ばれるヌクレオチド配列を含むアンチセンス核酸により抑制される）、
（ｂ）上記感作細胞を、化合物と接触させ、
（ｃ）上記化合物が、上記アンチセンス核酸を含有しない細胞に比べて、上記感作細胞の成長を抑制する度合いを決定する工程
を含む方法。
【０１５８】
１４２．上記決定工程は、上記化合物が非感作細胞の成長を抑制するよりも高度に、上記化合物が上記感作細胞の成長を抑制するかどうかを決定することを含む、項１４１に記載の方法。
【０１５９】
１４３．上記細胞は、細菌細胞、真菌細胞、植物細胞、および動物細胞からなる群から選ばれる、項１４１に記載の方法。
【０１６０】
１４４．上記細胞は、グラム陽性菌である、項１４１に記載の方法。
【０１６１】
１４５．上記グラム陽性菌は、スタフィロコッカススピーシーズ、ストレプトコッカススピーシーズ、エンテロコッカススピーシーズ、ミコバクテリウムスピーシーズ、クロストリジウムスピーシーズ、およびバチルススピーシーズからなる群から選ばれる、項１４４に記載の方法。
【０１６２】
１４６．上記グラム陽性菌は、スタフィロコッカス・オーレウスである、項１４５に記載の方法。
【０１６３】
１４７．上記グラム陽性菌は、スタフィロコッカス・オーレウスＲＮ４５０およびスタフィロコッカス・オーレウスＲＮ４２２０からなる群から選ばれる、項１４６に記載の方法。
【０１６４】
１４８．上記細胞は、アナプラスマ・マルギナレ(Anaplasmamarginale)、アスペルギルス・フミガツス(Aspergillusfumigatus)、バチルス・アンスラシス(Bacillusanthracis)、バクテリオイデス・フラギリス(Bacterioidesfragilis)、百日咳菌(Bordetellapertussis)、ブルクホルデリア・セパシア(Burkholderiacepacia)、カンピロバクター・イェジュニィ(Campylobacterjejuni)、カンジダ・アルビカンス (Candidaalbicans)、カンジダ・グラブラタ(Candidaglabrata)（トルロプシス・グラブラタ(Torulopsisglabrata)とも呼ばれる）、カンジダ・トロピカリス(Candidatropicalis)、カンジダ・パラプシロシス(Candidaparapsilosis)、カンジダ・ギルリエルモンジイ(Candidaguilliermondii)、カンジダ・クルセイ(Candidakrusei)、カンジダ・ケフィア(Candidakefyr)（カンジダ・シュードトロピカリス(Candidapseudotropicalis)とも呼ばれる）、カンジダ・デュブリニエンシス(Candida dubliniensis)、クラミジア・ニューモニエ(Chlamydia pneumoniae)、トラコーマ・クラミジア(Chlamydia trachomatus)、クロストリジウム・ボツリヌム(Clostridium botulinum)、クロストリジウム・ジフィシル(Clostridium difficile)、クロストリジウム・パーフリンゲンス(Clostridium perfringens)、コクシジオデス・イミチス(Coccidiodes immitis)、コリネバクテリウム・ジフテリア(Corynebacterium diptheriae)、クリプトコックス・ネオフォルマンス(Cryptococcus neoformans)、エンテロバクター・クロアカエ(Enterobacter cloacae)、エンテロコックス・フェカリス(Enterococcus faecalis)、エンテロコックス・ファエシウム(Enterococcus faecium)、エシェリヒア・コリ(Escherichia coli)、ヘモフィルス・インフルエンザ(Haemophilus influenzae)、ヘリコバクター・ピロリ(Helicobacter pylori)、ヒストプラスマ・カプスラツム(Histoplasma capsulatum)、クレブシエラ・ニューモニエ(Klebsiella pneumoniae)、リステリア・モノサイトゲネス(Listeria monocytogenes)、マイコバクテリウム・レプラエ(Mycobacterium leprae)、マイコバクテリウム・ツベルクローシス(Mycobacterium tuberculosis)、ナイセリア・ゴノローエ(Neisseria gonorrhoeae)、髄膜炎菌(Neisseria meningitidis)、ノカルジア・アステロイデス(Nocardia asteroides)、パスツレラ・ヘモリチカ(Pasteurella haemolytica)、パスツレラ・ムルトシダ(Pasteurella multocida)、ニューモシスティス・カリニー(Pneumocystis carinii)、プロテウス・ブルガリス(Proteus vulgaris)、シュードモナス・アエルギノーサ(Pseudomonas aeruginosa)、サルモネラ・ボンゴリ(Salmonella bongori)、サルモネラ・コレラスイス(Salmonella cholerasuis)、サルモネラ・エンテリカ(Salmonella enterica)、サルモネラ・パラチフィ(Salmonella paratyphi)、サルモネラ・チフィ(Salmonella typhi)、サルモネラ・チフィムリウム(Salmonella typhimurium)、スタフィロコッカス・オーレウス(Staphylococcus aureus)、リステリア・モノサイトゲネス(Listeria monocytogenes)、モクサレラ・カタルハリス(Moxarella catarrhalis)、シゲラ・ボイディ(Shigella boydii)、シゲラ・ディッセンリイ(Shigelladysenteriae)、シゲラ・フレックスネリ(Shigellaflexneri)、シゲラ・ソネイ(Shigellasonnei)、スタフィロコッカス・エピダーミディス(Staphylococcusepidermidis)、ストレプトコッカス・ニューモニエ(Streptococcuspneumoniae)、ストレプトコッカス・ミュータンス(Streptococcusmutans)、トレポネーマ・パリダム(Treponemapallidum)、エルシニア・エンテロコリチカ(Yersiniaenterocolitica)、エルシニア・ペスティス(Yersiniapestis)、および上記種のいずれかの属に属する任意の種からなる群から選ばれる、項１４１に記載の方法。
【０１６５】
１４９．上記細胞は、エシェリヒア・コリ細胞ではない、項１４１に記載の方法。
【０１６６】
１５０．上記遺伝子産物は、エシェリヒア・コリ以外の生物由来である、項１４１に記載の方法。
【０１６７】
１５１．上記アンチセンス核酸は、誘導性プロモーターから転写される、項１４１に記載の方法。
【０１６８】
１５２．上記細胞を、上記誘導性プロモーターからの上記アンチセンス核酸の転写を誘導する物質と接触させることをさらに含む方法であって、上記アンチセンス核酸は、致死量以下のレベルで転写される、項１４１に記載の方法。
【０１６９】
１５３．増殖抑制は、液体培養液の吸光度をモニターすることにより測定される、項１４１に記載の方法。
【０１７０】
１５４．上記遺伝子産物は、配列番号３８０１〜３８０５、４８６１〜５９１５、１００１３〜１４１１０からなる群から選ばれるアミノ酸配列を含むポリぺプチドを含む、項１４１に記載の方法。
【０１７１】
１５５．上記遺伝子産物をコードする上記核酸は、配列番号３７９６〜３８００、３８０６〜４８６０、５９１６〜１００１２からなる群から選ばれるヌクレオチド配列を含む、項１４１に記載の方法。
【０１７２】
１５６．項１４１に記載の方法を用いて同定される化合物。
【０１７３】
１５７．細胞増殖を抑制する能力を有する化合物を同定する方法であって、
（ａ）細胞を、上記細胞の増殖に必要な遺伝子産物の活性またはレベルを低減させる物質と接触させ（ここで、上記遺伝子産物は、配列番号８〜３７９５からなる群から選ばれるヌクレオチド配列を含むアンチセンス核酸により活性または発現が抑制される遺伝子産物である）、
（ｂ）上記細胞を化合物と接触させ、
（ｃ）上記化合物が、上記遺伝子産物に作用することにより上記接触細胞の増殖を低減させるかどうかを決定する工程
を含む方法。
【０１７４】
１５８．上記決定工程は、上記化合物が上記物質と接触させていない細胞の増殖を低減するよりも高度に、上記化合物が上記接触細胞の増殖を低減させるかどうかを決定することを含む、項１５７に記載の方法。
【０１７５】
１５９．上記細胞は、アナプラスマ・マルギナレ(Anaplasmamarginale)、アスペルギルス・フミガツス(Aspergillusfumigatus)、バチルス・アンスラシス(Bacillusanthracis)、バクテリオイデス・フラギリス(Bacterioidesfragilis)、百日咳菌(Bordetellapertussis)、ブルクホルデリア・セパシア(Burkholderiacepacia)、カンピロバクター・イェジュニィ(Campylobacterjejuni)、カンジダ・アルビカンス (Candidaalbicans)、カンジダ・グラブラタ(Candidaglabrata)（トルロプシス・グラブラタ(Torulopsisglabrata)とも呼ばれる）、カンジダ・トロピカリス(Candidatropicalis)、カンジダ・パラプシロシス(Candidaparapsilosis)、カンジダ・ギルリエルモンジイ(Candidaguilliermondii)、カンジダ・クルセイ(Candidakrusei)、カンジダ・ケフィア(Candida kefyr)（カンジダ・シュードトロピカリス(Candida pseudotropicalis)とも呼ばれる）、カンジダ・デュブリニエンシス(Candida dubliniensis)、クラミジア・ニューモニエ(Chlamydia pneumoniae)、トラコーマ・クラミジア(Chlamydia trachomatus)、クロストリジウム・ボツリヌム(Clostridium botulinum)、クロストリジウム・ジフィシル(Clostridium difficile)、クロストリジウム・パーフリンゲンス(Clostridium perfringens)、コクシジオデス・イミチス(Coccidiodes immitis)、コリネバクテリウム・ジフテリア(Corynebacterium diptheriae)、クリプトコックス・ネオフォルマンス(Cryptococcus neoformans)、エンテロバクター・クロアカエ(Enterobacter cloacae)、エンテロコックス・フェカリス(Enterococcus faecalis)、エンテロコックス・ファエシウム(Enterococcus faecium)、エシェリヒア・コリ(Escherichia coli)、ヘモフィルス・インフルエンザ(Haemophilus influenzae)、ヘリコバクター・ピロリ(Helicobacter pylori)、ヒストプラスマ・カプスラツム(Histoplasma capsulatum)、クレブシエラ・ニューモニエ(Klebsiella pneumoniae)、リステリア・モノサイトゲネス(Listeria monocytogenes)、マイコバクテリウム・レプラエ(Mycobacterium leprae)、マイコバクテリウム・ツベルクローシス(Mycobacteriumtuberculosis)、ナイセリア・ゴノローエ(Neisseriagonorrhoeae)、髄膜炎菌(Neisseriameningitidis)、ノカルジア・アステロイデス(Nocardiaasteroides)、パスツレラ・ヘモリチカ(Pasteurellahaemolytica)、パスツレラ・ムルトシダ(Pasteurellamultocida)、ニューモシスティス・カリニー(Pneumocystiscarinii)、プロテウス・ブルガリス(Proteusvulgaris)、シュードモナス・アエルギノーサ(Pseudomonasaeruginosa)、サルモネラ・ボンゴリ(Salmonellabongori)、サルモネラ・コレラスイス(Salmonellacholerasuis)、サルモネラ・エンテリカ(Salmonellaenterica)、サルモネラ・パラチフィ(Salmonellaparatyphi)、サルモネラ・チフィ(Salmonellatyphi)、サルモネラ・チフィムリウム(Salmonellatyphimurium)、スタフィロコッカス・オーレウス(Staphylococcusaureus)、リステリア・モノサイトゲネス(Listeriamonocytogenes)、モクサレラ・カタルハリス(Moxarellacatarrhalis)、シゲラ・ボイディ(Shigellaboydii)、シゲラ・ディッセンリイ(Shigelladysenteriae)、シゲラ・フレックスネリ(Shigellaflexneri)、シゲラ・ソネイ(Shigellasonnei)、スタフィロコッカス・エピダーミディス(Staphylococcusepidermidis)、ストレプトコッカス・ニューモニエ(Streptococcuspneumoniae)、ストレプトコッカス・ミュータンス(Streptococcusmutans)、トレポネーマ・パリダム(Treponemapallidum)、エルシニア・エンテロコリチカ(Yersiniaenterocolitica)、エルシニア・ペスティス(Yersiniapestis)、および上記種のいずれかの属に属する任意の種からなる群から選ばれる、項１５７に記載の方法。
【０１７６】
１６０．上記細胞は、エシェリヒア・コリ細胞ではない、項１５７に記載の方法。
【０１７７】
１６１．上記遺伝子産物は、エシェリヒア・コリ以外の生物由来である、項１５７に記載の方法。
【０１７８】
１６２．上記細胞の増殖に必要な遺伝子産物の活性またはレベルを低減させる上記物質は、増殖に必要な遺伝子またはオペロンに対するアンチセンス核酸を含む、項１５７に記載の方法。
【０１７９】
１６３．上記細胞の増殖に必要な遺伝子産物の活性またはレベルを低減させる上記物質は、細胞の成長または増殖を抑制することが知られている化合物を含む、項１５７に記載の方法。
【０１８０】
１６４．上記細胞は、上記細胞の増殖に必要な上記遺伝子産物の活性またはレベルを低減させる突然変異を含む、項１５７に記載の方法。
【０１８１】
１６５．上記突然変異は、温度感受性突然変異である、項１５７に記載の方法。
【０１８２】
１６６．上記遺伝子産物は、配列番号３８０１〜３８０５、４８６１〜５９１５、１００１３〜１４１１０からなる群から選ばれるアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む、項１５７に記載の方法。
【０１８３】
１６７．項１５７に記載の方法を用いて同定される化合物。
【０１８４】
１６８．増殖に必要な遺伝子またはその遺伝子産物が見出される生物学的経路を同定する方法であって、上記遺伝子または遺伝子産物は、配列番号８〜３７９５からなる群から選ばれる配列を含むアンチセンス核酸により活性もしくは発現が抑制される遺伝子または遺伝子産物を含み、上記方法は、
（ａ）試験細胞において、致死量以下のレベルの、上記増殖に必要な遺伝子または遺伝子産物の活性を抑制するアンチセンス核酸を提供し、
（ｂ）上記試験細胞を、細胞の成長または増殖を抑制することが知られている化合物と接触させ（ここで、上記化合物が作用する生物学的経路は既知である）、
（ｃ）上記試験細胞の上記増殖が、上記化合物と接触させていない細胞に比べて、抑制される度合いを決定する工程
を含む方法。
【０１８５】
１６９．上記決定工程は、上記試験細胞が、上記致死量以下のレベルの上記アンチセンス核酸を発現しない細胞よりも、上記化合物に対して実質的に高度な感受性を有するかどうかを決定することを含む、項１６８に記載の方法。
【０１８６】
１７０．上記遺伝子産物は、配列番号３８０１〜３８０５、４８６１〜５９１５、１００１３〜１４１１０からなる群から選ばれるアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む、項１６８に記載の方法。
【０１８７】
１７１．上記試験細胞は、アナプラスマ・マルギナレ(Anaplasma marginale)、アスペルギルス・フミガツス(Aspergillus fumigatus)、バチルス・アンスラシス(Bacillus anthracis)、バクテリオイデス・フラギリス(Bacterioides fragilis)、百日咳菌(Bordetella pertussis)、ブルクホルデリア・セパシア(Burkholderia cepacia)、カンピロバクター・イェジュニィ(Campylobacter jejuni)、カンジダ・アルビカンス (Candida albicans)、カンジダ・グラブラタ(Candida glabrata)（トルロプシス・グラブラタ(Torulopsis glabrata)とも呼ばれる）、カンジダ・トロピカリス(Candida tropicalis)、カンジダ・パラプシロシス(Candida parapsilosis)、カンジダ・ギルリエルモンジイ(Candida guilliermondii)、カンジダ・クルセイ(Candida krusei)、カンジダ・ケフィア(Candidakefyr)（カンジダ・シュードトロピカリス(Candidapseudotropicalis)とも呼ばれる）、カンジダ・デュブリニエンシス(Candida dubliniensis)、クラミジア・ニューモニエ(Chlamydia pneumoniae)、トラコーマ・クラミジア(Chlamydia trachomatus)、クロストリジウム・ボツリヌム(Clostridium botulinum)、クロストリジウム・ジフィシル(Clostridium difficile)、クロストリジウム・パーフリンゲンス(Clostridium perfringens)、コクシジオデス・イミチス(Coccidiodes immitis)、コリネバクテリウム・ジフテリア(Corynebacterium diptheriae)、クリプトコックス・ネオフォルマンス(Cryptococcus neoformans)、エンテロバクター・クロアカエ(Enterobacter cloacae)、エンテロコックス・フェカリス(Enterococcus faecalis)、エンテロコックス・ファエシウム(Enterococcus faecium)、エシェリヒア・コリ(Escherichia coli)、ヘモフィルス・インフルエンザ(Haemophilus influenzae)、ヘリコバクター・ピロリ(Helicobacter pylori)、ヒストプラスマ・カプスラツム(Histoplasma capsulatum)、クレブシエラ・ニューモニエ(Klebsiella pneumoniae)、リステリア・モノサイトゲネス(Listeria monocytogenes)、マイコバクテリウム・レプラエ(Mycobacterium leprae)、マイコバクテリウム・ツベルクローシス(Mycobacterium tuberculosis)、ナイセリア・ゴノローエ(Neisseria gonorrhoeae)、髄膜炎菌(Neisseria meningitidis)、ノカルジア・アステロイデス(Nocardia asteroides)、パスツレラ・ヘモリチカ(Pasteurella haemolytica)、パスツレラ・ムルトシダ(Pasteurella multocida)、ニューモシスティス・カリニー(Pneumocystis carinii)、プロテウス・ブルガリス(Proteus vulgaris)、シュードモナス・アエルギノーサ(Pseudomonas aeruginosa)、サルモネラ・ボンゴリ(Salmonella bongori)、サルモネラ・コレラスイス(Salmonella cholerasuis)、サルモネラ・エンテリカ(Salmonella enterica)、サルモネラ・パラチフィ(Salmonella paratyphi)、サルモネラ・チフィ(Salmonella typhi)、サルモネラ・チフィムリウム(Salmonella typhimurium)、スタフィロコッカス・オーレウス(Staphylococcus aureus)、リステリア・モノサイトゲネス(Listeria monocytogenes)、モクサレラ・カタルハリス(Moxarella catarrhalis)、シゲラ・ボイディ(Shigella boydii)、シゲラ・ディッセンリイ(Shigelladysenteriae)、シゲラ・フレックスネリ(Shigellaflexneri)、シゲラ・ソネイ(Shigellasonnei)、スタフィロコッカス・エピダーミディス(Staphylococcusepidermidis)、ストレプトコッカス・ニューモニエ(Streptococcuspneumoniae)、ストレプトコッカス・ミュータンス(Streptococcusmutans)、トレポネーマ・パリダム(Treponemapallidum)、エルシニア・エンテロコリチカ(Yersiniaenterocolitica)、エルシニア・ペスティス(Yersiniapestis)、および上記種のいずれかの属に属する任意の種からなる群から選ばれる、項１６８に記載の方法。
【０１８８】
１７２．上記試験細胞は、エシェリヒア・コリ細胞ではない、項１６８に記載の方法。
【０１８９】
１７３．上記遺伝子産物は、エシェリヒア・コリ以外の生物由来である、項１６８に記載の方法。
【０１９０】
１７４．試験化合物が作用する生物学的経路を決定する方法であって、
（ａ）第１の細胞において、致死量以下のレベルの増殖に必要な核酸に相補的なアンチセンス核酸を提供すること（ここで、上記増殖に必要な核酸の活性または発現は、配列番号８〜３７９５からなる群から選ばれる配列を含むアンチセンス核酸により抑制され、また上記増殖に必要な核酸または上記増殖に必要な核酸によりコードされるタンパク質が見出される生物学的経路は既知である）と、
（ｂ）上記第１の細胞を、上記試験化合物と接触させることと、
（ｃ）上記試験化合物が、上記アンチセンス核酸を含有しない細胞に比べて、上記第１の細胞の増殖を抑制する度合いを決定する工程
とを含む方法。
【０１９１】
１７５．上記決定工程は、上記第１の細胞が、上記致死量以下のレベルの上記アンチセンス核酸を発現しない細胞よりも、上記試験化合物に対して実質的に高度な感受性を有するかどうかを決定することを含む、項１７４に記載の方法。
【０１９２】
１７６．（ｄ）第２の細胞において、致死量以下のレベルの、第２の増殖に必要な核酸に対して相補的な第２のアンチセンス核酸を提供し（ここで、上記第２の増殖に必要な核酸は、工程（ａ）における上記増殖に必要な核酸と異なる生物学的経路に存在する）、
（ｅ）上記第２の細胞が、上記致死量以下のレベルの上記第２のアンチセンス核酸を発現しない細胞よりも、上記試験化合物に対して実質的に高度な感受性を有しないかどうかを決定すること
をさらに含み、上記第１の細胞が、上記第２の細胞よりも、上記試験化合物に対して実質的に高度な感受性を有する場合、上記試験化合物は、工程（ａ）のアンチセンス核酸が作用する生物学的経路に特異的である、項１７４に記載の方法。
【０１９３】
１７７．上記第１の細胞は、アナプラスマ・マルギナレ(Anaplasma marginale)、アスペルギルス・フミガツス(Aspergillus fumigatus)、バチルス・アンスラシス(Bacillus anthracis)、バクテリオイデス・フラギリス(Bacterioides fragilis)、百日咳菌(Bordetella pertussis)、ブルクホルデリア・セパシア(Burkholderia cepacia)、カンピロバクター・イェジュニィ(Campylobacter jejuni)、カンジダ・アルビカンス (Candida albicans)、カンジダ・グラブラタ(Candida glabrata)（トルロプシス・グラブラタ(Torulopsis glabrata)とも呼ばれる）、カンジダ・トロピカリス(Candida tropicalis)、カンジダ・パラプシロシス(Candida parapsilosis)、カンジダ・ギルリエルモンジイ(Candida guilliermondii)、カンジダ・クルセイ(Candida krusei)、カンジダ・ケフィア(Candidakefyr)（カンジダ・シュードトロピカリス(Candidapseudotropicalis)とも呼ばれる）、カンジダ・デュブリニエンシス(Candida dubliniensis)、クラミジア・ニューモニエ(Chlamydia pneumoniae)、トラコーマ・クラミジア(Chlamydia trachomatus)、クロストリジウム・ボツリヌム(Clostridium botulinum)、クロストリジウム・ジフィシル(Clostridium difficile)、クロストリジウム・パーフリンゲンス(Clostridium perfringens)、コクシジオデス・イミチス(Coccidiodes immitis)、コリネバクテリウム・ジフテリア(Corynebacterium diptheriae)、クリプトコックス・ネオフォルマンス(Cryptococcus neoformans)、エンテロバクター・クロアカエ(Enterobacter cloacae)、エンテロコックス・フェカリス(Enterococcus faecalis)、エンテロコックス・ファエシウム(Enterococcus faecium)、エシェリヒア・コリ(Escherichia coli)、ヘモフィルス・インフルエンザ(Haemophilus influenzae)、ヘリコバクター・ピロリ(Helicobacter pylori)、ヒストプラスマ・カプスラツム(Histoplasma capsulatum)、クレブシエラ・ニューモニエ(Klebsiella pneumoniae)、リステリア・モノサイトゲネス(Listeria monocytogenes)、マイコバクテリウム・レプラエ(Mycobacterium leprae)、マイコバクテリウム・ツベルクローシス(Mycobacterium tuberculosis)、ナイセリア・ゴノローエ(Neisseria gonorrhoeae)、髄膜炎菌(Neisseria meningitidis)、ノカルジア・アステロイデス(Nocardia asteroides)、パスツレラ・ヘモリチカ(Pasteurella haemolytica)、パスツレラ・ムルトシダ(Pasteurella multocida)、ニューモシスティス・カリニー(Pneumocystis carinii)、プロテウス・ブルガリス(Proteus vulgaris)、シュードモナス・アエルギノーサ(Pseudomonas aeruginosa)、サルモネラ・ボンゴリ(Salmonella bongori)、サルモネラ・コレラスイス(Salmonella cholerasuis)、サルモネラ・エンテリカ(Salmonella enterica)、サルモネラ・パラチフィ(Salmonella paratyphi)、サルモネラ・チフィ(Salmonella typhi)、サルモネラ・チフィムリウム(Salmonella typhimurium)、スタフィロコッカス・オーレウス(Staphylococcus aureus)、リステリア・モノサイトゲネス(Listeria monocytogenes)、モクサレラ・カタルハリス(Moxarella catarrhalis)、シゲラ・ボイディ(Shigella boydii)、シゲラ・ディッセンリイ(Shigelladysenteriae)、シゲラ・フレックスネリ(Shigellaflexneri)、シゲラ・ソネイ(Shigellasonnei)、スタフィロコッカス・エピダーミディス(Staphylococcusepidermidis)、ストレプトコッカス・ニューモニエ(Streptococcuspneumoniae)、ストレプトコッカス・ミュータンス(Streptococcusmutans)、トレポネーマ・パリダム(Treponemapallidum)、エルシニア・エンテロコリチカ(Yersiniaenterocolitica)、エルシニア・ペスティス(Yersiniapestis)、および上記種のいずれかの属に属する任意の種からなる群から選ばれる、項１７４に記載の方法。
【０１９４】
１７８．上記第１の細胞は、エシェリヒア・コリ細胞ではない、項１７４に記載の方法。
【０１９５】
１７９．上記増殖に必要な核酸は、エシェリヒア・コリ以外の生物由来である、項１７４に記載の方法。
【０１９６】
１８０．配列番号８〜３７９５からなる群から選ばれる配列を含む精製または単離された核酸。
【０１９７】
１８１．増殖を抑制するための、配列番号８〜３７９５の１つのヌクレオチド配列を含むアンチセンス核酸により活性もしくは発現が抑制される遺伝子または遺伝子産物と相互作用する化合物。
【０１９８】
１８２．上記遺伝子産物は、配列番号３８０１〜３８０５、４８６１〜５９１５、１００１３〜１４１１０の１つを含むポリペプチドである、項１８１に記載の化合物。
【０１９９】
１８３．上記遺伝子は、配列番号３７９６〜３８００、３８０６〜４８６０、５９１６〜１００１２からなる群から選ばれるヌクレオチド配列を含む、項１８１に記載の化合物。
【０２００】
１８４．増殖を抑制するための、配列番号８〜３７９５の１つのヌクレオチド配列を含むアンチセンス核酸により発現が抑制される遺伝子産物と相互作用する化合物。
【０２０１】
１８５．抗生物質を製造する方法であって、
１つまたはそれ以上の候補化合物をスクリーニングして、増殖に必要な遺伝子産物の活性またはレベルを低減させる化合物を同定する工程（ここで、上記遺伝子産物は、配列番号８〜３７９５からなる群から選ばれるヌクレオチド配列を含むアンチセンス核酸によって活性または発現が抑制される遺伝子産物を含む）と、
このように同定された化合物を製造する工程
を含む方法。
【０２０２】
１８６．上記スクリーニング工程は、項４４、６８、１２１、１３６、１４１、および１５７に記載の方法のいずれか１つを実施することを含む、項１８５に記載の方法。
【０２０３】
１８７．上記遺伝子産物は、配列番号３８０１〜３８０５、４８６１〜５９１５、１００１３〜１４１１０の１つを含むポリペプチドである、項１８５に記載の方法。
【０２０４】
１８８．被験体における細胞増殖を抑制する方法であって、有効量の、上記細胞の増殖に必要な遺伝子産物の活性またはレベルを低減させる化合物を、上記被験体に投与すること（ここで、上記遺伝子産物は、配列番号８〜３７９５からなる群から選ばれるヌクレオチド配列を含むアンチセンス核酸により活性または発現が抑制される遺伝子産物を含む）を含む方法。
【０２０５】
１８９．上記被験体は、脊椎動物、哺乳動物、鳥類、およびヒトからなる群から選ばれる、項１８８に記載の方法。
【０２０６】
１９０．上記遺伝子産物は、配列番号３８０１〜３８０５、４８６１〜５９１５、１００１３〜１４１１０からなる群から選ばれるアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む、項１８８に記載の方法。
【０２０７】
１９１．上記細胞は、アナプラスマ・マルギナレ(Anaplasmamarginale)、アスペルギルス・フミガツス(Aspergillusfumigatus)、バチルス・アンスラシス(Bacillusanthracis)、バクテリオイデス・フラギリス(Bacterioidesfragilis)、百日咳菌(Bordetellapertussis)、ブルクホルデリア・セパシア(Burkholderiacepacia)、カンピロバクター・イェジュニィ(Campylobacterjejuni)、カンジダ・アルビカンス (Candidaalbicans)、カンジダ・グラブラタ(Candidaglabrata)（トルロプシス・グラブラタ(Torulopsisglabrata)とも呼ばれる）、カンジダ・トロピカリス(Candidatropicalis)、カンジダ・パラプシロシス(Candidaparapsilosis)、カンジダ・ギルリエルモンジイ(Candidaguilliermondii)、カンジダ・クルセイ(Candidakrusei)、カンジダ・ケフィア(Candida kefyr)（カンジダ・シュードトロピカリス(Candida pseudotropicalis)とも呼ばれる）、カンジダ・デュブリニエンシス(Candida dubliniensis)、クラミジア・ニューモニエ(Chlamydia pneumoniae)、トラコーマ・クラミジア(Chlamydia trachomatus)、クロストリジウム・ボツリヌム(Clostridium botulinum)、クロストリジウム・ジフィシル(Clostridium difficile)、クロストリジウム・パーフリンゲンス(Clostridium perfringens)、コクシジオデス・イミチス(Coccidiodes immitis)、コリネバクテリウム・ジフテリア(Corynebacterium diptheriae)、クリプトコックス・ネオフォルマンス(Cryptococcus neoformans)、エンテロバクター・クロアカエ(Enterobacter cloacae)、エンテロコックス・フェカリス(Enterococcus faecalis)、エンテロコックス・ファエシウム(Enterococcus faecium)、エシェリヒア・コリ(Escherichia coli)、ヘモフィルス・インフルエンザ(Haemophilus influenzae)、ヘリコバクター・ピロリ(Helicobacter pylori)、ヒストプラスマ・カプスラツム(Histoplasma capsulatum)、クレブシエラ・ニューモニエ(Klebsiella pneumoniae)、リステリア・モノサイトゲネス(Listeria monocytogenes)、マイコバクテリウム・レプラエ(Mycobacterium leprae)、マイコバクテリウム・ツベルクローシス(Mycobacteriumtuberculosis)、ナイセリア・ゴノローエ(Neisseriagonorrhoeae)、髄膜炎菌(Neisseriameningitidis)、ノカルジア・アステロイデス(Nocardiaasteroides)、パスツレラ・ヘモリチカ(Pasteurellahaemolytica)、パスツレラ・ムルトシダ(Pasteurellamultocida)、ニューモシスティス・カリニー(Pneumocystiscarinii)、プロテウス・ブルガリス(Proteusvulgaris)、シュードモナス・アエルギノーサ(Pseudomonasaeruginosa)、サルモネラ・ボンゴリ(Salmonellabongori)、サルモネラ・コレラスイス(Salmonellacholerasuis)、サルモネラ・エンテリカ(Salmonellaenterica)、サルモネラ・パラチフィ(Salmonellaparatyphi)、サルモネラ・チフィ(Salmonellatyphi)、サルモネラ・チフィムリウム(Salmonellatyphimurium)、スタフィロコッカス・オーレウス(Staphylococcusaureus)、リステリア・モノサイトゲネス(Listeriamonocytogenes)、モクサレラ・カタルハリス(Moxarellacatarrhalis)、シゲラ・ボイディ(Shigellaboydii)、シゲラ・ディッセンリイ(Shigelladysenteriae)、シゲラ・フレックスネリ(Shigellaflexneri)、シゲラ・ソネイ(Shigellasonnei)、スタフィロコッカス・エピダーミディス(Staphylococcusepidermidis)、ストレプトコッカス・ニューモニエ(Streptococcuspneumoniae)、ストレプトコッカス・ミュータンス(Streptococcusmutans)、トレポネーマ・パリダム(Treponemapallidum)、エルシニア・エンテロコリチカ(Yersiniaenterocolitica)、エルシニア・ペスティス(Yersiniapestis)、および上記種のいずれかの属に属する任意の種からなる群から選ばれる、項１８８に記載の方法。
【０２０８】
１９２．上記細胞は、エシェリヒア・コリではない、項１８８に記載の方法。
【０２０９】
１９３．上記遺伝子産物は、エシェリヒア・コリ以外の生物由来である、項１８８に記載の方法。
【０２１０】
１９４．配列番号３７９６〜３８００、３８０６〜４８６０、５９１６〜１００１２の１つのコード配列から本質的に構成される精製または単離された核酸。
【０２１１】
１９５．上記断片は、配列番号３７９６〜３８００、３８０６〜４８６０、５９１６〜１００１２の１つの少なくとも１０個、少なくとも２０個、少なくとも２５個、少なくとも３０個、少なくとも５０個、または５０個より多い連続ヌクレオチドを含む、項８に記載の核酸断片。
【０２１２】
１９６．デフォルトパラメータでＢＬＡＳＴＮバージョン２．０を用いて決定される場合に、配列番号３７９６〜３８００、３８０６〜４８６０、５９１６〜１００１２、配列番号３７９６〜３８００、３８０６〜４８６０、５９１６〜１００１２の少なくとも２５個の連続ヌクレオチドを含む断片、配列番号３７９６から３８００、３８０６〜４８６０、５９１６〜１００１２に相補的なヌクレオチド配列、および配列番号３７９６〜３８００、３８０６〜４８６０、５９１６〜１００１２の少なくとも２５個の連続ヌクレオチドを含む断片に相補的なヌクレオチド配列からなる群から選ばれるヌクレオチド配列に対して少なくとも７０％のヌクレオチド配列同一性を有する核酸を含む精製または単離された核酸。
【０２１３】
１９７．上記核酸は、アナプラスマ・マルギナレ(Anaplasmamarginale)、アスペルギルス・フミガツス(Aspergillusfumigatus)、バチルス・アンスラシス(Bacillusanthracis)、バクテリオイデス・フラギリス(Bacterioidesfragilis)、百日咳菌(Bordetellapertussis)、ブルクホルデリア・セパシア(Burkholderiacepacia)、カンピロバクター・イェジュニィ(Campylobacterjejuni)、カンジダ・アルビカンス (Candidaalbicans)、カンジダ・グラブラタ(Candidaglabrata)（トルロプシス・グラブラタ(Torulopsisglabrata)とも呼ばれる）、カンジダ・トロピカリス(Candidatropicalis)、カンジダ・パラプシロシス(Candidaparapsilosis)、カンジダ・ギルリエルモンジイ(Candidaguilliermondii)、カンジダ・クルセイ(Candidakrusei)、カンジダ・ケフィア(Candidakefyr)（カンジダ・シュードトロピカリス(Candidapseudotropicalis)とも呼ばれる）、カンジダ・デュブリニエンシス(Candida dubliniensis)、クラミジア・ニューモニエ(Chlamydia pneumoniae)、トラコーマ・クラミジア(Chlamydia trachomatus)、クロストリジウム・ボツリヌム(Clostridium botulinum)、クロストリジウム・ジフィシル(Clostridium difficile)、クロストリジウム・パーフリンゲンス(Clostridium perfringens)、コクシジオデス・イミチス(Coccidiodes immitis)、コリネバクテリウム・ジフテリア(Corynebacterium diptheriae)、クリプトコックス・ネオフォルマンス(Cryptococcus neoformans)、エンテロバクター・クロアカエ(Enterobacter cloacae)、エンテロコックス・フェカリス(Enterococcus faecalis)、エンテロコックス・ファエシウム(Enterococcus faecium)、エシェリヒア・コリ(Escherichia coli)、ヘモフィルス・インフルエンザ(Haemophilus influenzae)、ヘリコバクター・ピロリ(Helicobacter pylori)、ヒストプラスマ・カプスラツム(Histoplasma capsulatum)、クレブシエラ・ニューモニエ(Klebsiella pneumoniae)、リステリア・モノサイトゲネス(Listeria monocytogenes)、マイコバクテリウム・レプラエ(Mycobacterium leprae)、マイコバクテリウム・ツベルクローシス(Mycobacterium tuberculosis)、ナイセリア・ゴノローエ(Neisseria gonorrhoeae)、髄膜炎菌(Neisseria meningitidis)、ノカルジア・アステロイデス(Nocardia asteroides)、パスツレラ・ヘモリチカ(Pasteurella haemolytica)、パスツレラ・ムルトシダ(Pasteurella multocida)、ニューモシスティス・カリニー(Pneumocystis carinii)、プロテウス・ブルガリス(Proteus vulgaris)、シュードモナス・アエルギノーサ(Pseudomonas aeruginosa)、サルモネラ・ボンゴリ(Salmonella bongori)、サルモネラ・コレラスイス(Salmonella cholerasuis)、サルモネラ・エンテリカ(Salmonella enterica)、サルモネラ・パラチフィ(Salmonella paratyphi)、サルモネラ・チフィ(Salmonella typhi)、サルモネラ・チフィムリウム(Salmonella typhimurium)、スタフィロコッカス・オーレウス(Staphylococcus aureus)、リステリア・モノサイトゲネス(Listeria monocytogenes)、モクサレラ・カタルハリス(Moxarella catarrhalis)、シゲラ・ボイディ(Shigella boydii)、シゲラ・ディッセンリイ(Shigelladysenteriae)、シゲラ・フレックスネリ(Shigellaflexneri)、シゲラ・ソネイ(Shigellasonnei)、スタフィロコッカス・エピダーミディス(Staphylococcusepidermidis)、ストレプトコッカス・ニューモニエ(Streptococcuspneumoniae)、ストレプトコッカス・ミュータンス(Streptococcusmutans)、トレポネーマ・パリダム(Treponemapallidum)、エルシニア・エンテロコリチカ(Yersiniaenterocolitica)、エルシニア・ペスティス(Yersiniapestis)、および上記種のいずれかの属に属する任意の種からなる群から選ばれる生物由来である、項１９６に記載の核酸。
【０２１４】
１９８．上記核酸は、エシェリヒア・コリ以外の生物由来である、項１９６に記載の核酸。
【０２１５】
１９９．細胞において遺伝子産物の活性を抑制すること、またはその遺伝子産物の量を低減させること、または細胞において上記遺伝子産物をコードする核酸の活性を抑制すること、もしくは上記遺伝子産物の量を低減させることを含む、細胞増殖を抑制する方法であって、上記遺伝子産物は、配列番号８〜３７９５からなる群から選ばれるヌクレオチド配列を含むアンチセンス核酸により発現が抑制される遺伝子産物に対して、デフォルトパラメータでＢＬＡＳＴＮバージョン２．０を用いて決定される場合に少なくとも７０％のヌクレオチド配列同一性を有する遺伝子産物、配列番号８〜３７９５からなる群から選ばれるヌクレオチド配列を含むアンチセンス核酸により発現が抑制される遺伝子産物をコードする核酸に対して、デフォルトパラメータでＢＬＡＳＴＮバージョン２．０を用いて決定される場合に少なくとも７０％のヌクレオチド配列同一性を有する核酸によりコードされる遺伝子産物、配列番号８〜３７９５からなる群から選ばれるヌクレオチド配列を含むアンチセンス核酸により発現が抑制される遺伝子産物に対して、デフォルトパラメータでＦＡＳＴＡバージョン３．０ｔ７８を用いて決定される場合に少なくとも２５％のアミノ酸同一性を有する遺伝子産物、配列番号８〜３７９５からなる群から選ばれるヌクレオチド配列を含む核酸に、ストリンジェントな条件下にてハイブリダイズする核酸によりコードされる遺伝子産物、配列番号８〜３７９５からなる群から選ばれるヌクレオチド配列を含む核酸に、穏やかな条件下にてハイブリダイズする核酸によりコードされる遺伝子産物、および配列番号８〜３７９５からなる群から選ばれるヌクレオチド配列を含む核酸により活性が抑制される遺伝子産物により、活性が補完され得る遺伝子産物からなる群から選ばれる方法。
【０２１６】
２００．上記方法は、アナプラスマ・マルギナレ(Anaplasmamarginale)、アスペルギルス・フミガツス(Aspergillusfumigatus)、バチルス・アンスラシス(Bacillusanthracis)、バクテリオイデス・フラギリス(Bacterioidesfragilis)、百日咳菌(Bordetellapertussis)、ブルクホルデリア・セパシア(Burkholderiacepacia)、カンピロバクター・イェジュニィ(Campylobacterjejuni)、カンジダ・アルビカンス (Candidaalbicans)、カンジダ・グラブラタ(Candidaglabrata)（トルロプシス・グラブラタ(Torulopsisglabrata)とも呼ばれる）、カンジダ・トロピカリス(Candidatropicalis)、カンジダ・パラプシロシス(Candidaparapsilosis)、カンジダ・ギルリエルモンジイ(Candidaguilliermondii)、カンジダ・クルセイ(Candidakrusei)、カンジダ・ケフィア(Candidakefyr)（カンジダ・シュードトロピカリス(Candidapseudotropicalis)とも呼ばれる）、カンジダ・デュブリニエンシス(Candida dubliniensis)、クラミジア・ニューモニエ(Chlamydia pneumoniae)、トラコーマ・クラミジア(Chlamydia trachomatus)、クロストリジウム・ボツリヌム(Clostridium botulinum)、クロストリジウム・ジフィシル(Clostridium difficile)、クロストリジウム・パーフリンゲンス(Clostridium perfringens)、コクシジオデス・イミチス(Coccidiodes immitis)、コリネバクテリウム・ジフテリア(Corynebacterium diptheriae)、クリプトコックス・ネオフォルマンス(Cryptococcus neoformans)、エンテロバクター・クロアカエ(Enterobacter cloacae)、エンテロコックス・フェカリス(Enterococcus faecalis)、エンテロコックス・ファエシウム(Enterococcus faecium)、エシェリヒア・コリ(Escherichia coli)、ヘモフィルス・インフルエンザ(Haemophilus influenzae)、ヘリコバクター・ピロリ(Helicobacter pylori)、ヒストプラスマ・カプスラツム(Histoplasma capsulatum)、クレブシエラ・ニューモニエ(Klebsiella pneumoniae)、リステリア・モノサイトゲネス(Listeria monocytogenes)、マイコバクテリウム・レプラエ(Mycobacterium leprae)、マイコバクテリウム・ツベルクローシス(Mycobacterium tuberculosis)、ナイセリア・ゴノローエ(Neisseria gonorrhoeae)、髄膜炎菌(Neisseria meningitidis)、ノカルジア・アステロイデス(Nocardia asteroides)、パスツレラ・ヘモリチカ(Pasteurella haemolytica)、パスツレラ・ムルトシダ(Pasteurella multocida)、ニューモシスティス・カリニー(Pneumocystis carinii)、プロテウス・ブルガリス(Proteus vulgaris)、シュードモナス・アエルギノーサ(Pseudomonas aeruginosa)、サルモネラ・ボンゴリ(Salmonella bongori)、サルモネラ・コレラスイス(Salmonella cholerasuis)、サルモネラ・エンテリカ(Salmonella enterica)、サルモネラ・パラチフィ(Salmonella paratyphi)、サルモネラ・チフィ(Salmonella typhi)、サルモネラ・チフィムリウム(Salmonella typhimurium)、スタフィロコッカス・オーレウス(Staphylococcus aureus)、リステリア・モノサイトゲネス(Listeria monocytogenes)、モクサレラ・カタルハリス(Moxarella catarrhalis)、シゲラ・ボイディ(Shigella boydii)、シゲラ・ディッセンリイ(Shigelladysenteriae)、シゲラ・フレックスネリ(Shigellaflexneri)、シゲラ・ソネイ(Shigellasonnei)、スタフィロコッカス・エピダーミディス(Staphylococcusepidermidis)、ストレプトコッカス・ニューモニエ(Streptococcuspneumoniae)、ストレプトコッカス・ミュータンス(Streptococcusmutans)、トレポネーマ・パリダム(Treponemapallidum)、エルシニア・エンテロコリチカ(Yersiniaenterocolitica)、エルシニア・ペスティス(Yersiniapestis)、および上記種のいずれかの属に属する任意の種からなる群から選ばれる生物において、上記遺伝子産物の上記活性を抑制すること、またはその上記量を低減させること、または上記遺伝子産物をコードする核酸の活性を抑制すること、もしくはその量を低減させることを含む、項１９９に記載の方法。
【０２１７】
２０１．上記方法は、エシェリヒア・コリ以外の生物にて、上記遺伝子産物の上記活性を抑制すること、またはその上記量を低減させること、または上記遺伝子産物をコードする核酸の活性を抑制すること、もしくはその量を低減させることを含む、項１９９に記載の方法。
【０２１８】
２０２．上記遺伝子産物は、エシェリヒア・コリ以外の生物由来である、項１９９に記載の方法。
【０２１９】
２０３．上記遺伝子産物は、配列番号３８０１〜３８０５、４８６１〜５９１５、１００１３〜１４１１０からなる群から選ばれるポリペプチドに対して、ＦＡＳＴＡバージョン３．０ｔ７８を用いて決定される場合に少なくとも２５％のアミノ酸同一性を有するポリペプチド、および配列番号３８０１〜３８０５、４８６１〜５９１５、１００１３〜１４１１０からなる群から選ばれるポリペプチドにより活性が補完され得るポリペプチドからなる群から選ばれるポリペプチドを含む、項１９９に記載の方法。
【０２２０】
２０４．上記遺伝子産物は、配列番号３７９６〜３８００、３８０６〜４８６０、５９１６〜１００１２からなる群から選ばれるヌクレオチド配列に対して、デフォルトパラメータでＢＬＡＳＴＮバージョン２．０を用いて決定される場合に少なくとも７０％のヌクレオチド配列同一性を有する核酸を含む核酸、配列番号３７９６〜３８００、３８０６〜４８６０、５９１６〜１００１２からなる群から選ばれる配列に、ストリンジェントな条件下にてハイブリダイズするヌクレオチド配列を含む核酸、および配列番号３７９６〜３８００、３８０６〜４８６０、５９１６〜１００１２からなる群から選ばれるヌクレオチド配列に、穏やかな条件下にてハイブリダイズするヌクレオチド配列を含む核酸からなる群から選ばれる核酸によりコードされる、項１９９に記載の方法。
【０２２１】
２０５．増殖に必要な遺伝子産物の活性に影響を与える化合物を同定する方法であって、
配列番号８〜３７９５からなる群から選ばれるヌクレオチド配列を含むアンチセンス核酸により発現が抑制される遺伝子産物に対して、デフォルトパラメータでＢＬＡＳＴＮバージョン２．０を用いて決定される場合に少なくとも７０％のヌクレオチド配列同一性を有する遺伝子産物、配列番号８〜３７９５からなる群から選ばれるヌクレオチド配列を含むアンチセンス核酸により発現が抑制される遺伝子産物をコードする核酸に対して、デフォルトパラメータでＢＬＡＳＴＮバージョン２．０を用いて決定される場合に少なくとも７０％のヌクレオチド配列同一性を有する核酸によりコードされる遺伝子産物、配列番号８〜３７９５からなる群から選ばれるヌクレオチド配列を含むアンチセンス核酸により発現が抑制される遺伝子産物に対して、デフォルトパラメータでＦＡＳＴＡバージョン３．０ｔ７８を用いて決定される場合に少なくとも２５％のアミノ酸同一性を有する遺伝子産物、配列番号８〜３７９５からなる群から選ばれる核酸に、ストリンジェントな条件下にてハイブリダイズするヌクレオチド配列を含む核酸によりコードされる遺伝子産物、配列番号８〜３７９５からなる群から選ばれる核酸に、穏やかな条件下にてハイブリダイズするヌクレオチド配列を含む核酸によりコードされる遺伝子産物、および配列番号８〜３７９５からなる群から選ばれる核酸により活性が抑制される遺伝子産物により、活性が補完され得る遺伝子産物からなる群から選ばれる遺伝子産物と、候補化合物とを接触させ、
上記候補化合物が、上記遺伝子産物の活性に影響を与えるかどうかを決定すること
を含む方法。
【０２２２】
２０６．上記遺伝子産物は、アナプラスマ・マルギナレ(Anaplasma marginale)、アスペルギルス・フミガツス(Aspergillus fumigatus)、バチルス・アンスラシス(Bacillus anthracis)、バクテリオイデス・フラギリス(Bacterioides fragilis)、百日咳菌(Bordetella pertussis)、ブルクホルデリア・セパシア(Burkholderia cepacia)、カンピロバクター・イェジュニィ(Campylobacter jejuni)、カンジダ・アルビカンス (Candida albicans)、カンジダ・グラブラタ(Candida glabrata)（トルロプシス・グラブラタ(Torulopsis glabrata)とも呼ばれる）、カンジダ・トロピカリス(Candida tropicalis)、カンジダ・パラプシロシス(Candida parapsilosis)、カンジダ・ギルリエルモンジイ(Candida guilliermondii)、カンジダ・クルセイ(Candida krusei)、カンジダ・ケフィア(Candidakefyr)（カンジダ・シュードトロピカリス(Candidapseudotropicalis)とも呼ばれる）、カンジダ・デュブリニエンシス(Candida dubliniensis)、クラミジア・ニューモニエ(Chlamydia pneumoniae)、トラコーマ・クラミジア(Chlamydia trachomatus)、クロストリジウム・ボツリヌム(Clostridium botulinum)、クロストリジウム・ジフィシル(Clostridium difficile)、クロストリジウム・パーフリンゲンス(Clostridium perfringens)、コクシジオデス・イミチス(Coccidiodes immitis)、コリネバクテリウム・ジフテリア(Corynebacterium diptheriae)、クリプトコックス・ネオフォルマンス(Cryptococcus neoformans)、エンテロバクター・クロアカエ(Enterobacter cloacae)、エンテロコックス・フェカリス(Enterococcus faecalis)、エンテロコックス・ファエシウム(Enterococcus faecium)、エシェリヒア・コリ(Escherichia coli)、ヘモフィルス・インフルエンザ(Haemophilus influenzae)、ヘリコバクター・ピロリ(Helicobacter pylori)、ヒストプラスマ・カプスラツム(Histoplasma capsulatum)、クレブシエラ・ニューモニエ(Klebsiella pneumoniae)、リステリア・モノサイトゲネス(Listeria monocytogenes)、マイコバクテリウム・レプラエ(Mycobacterium leprae)、マイコバクテリウム・ツベルクローシス(Mycobacterium tuberculosis)、ナイセリア・ゴノローエ(Neisseria gonorrhoeae)、髄膜炎菌(Neisseria meningitidis)、ノカルジア・アステロイデス(Nocardia asteroides)、パスツレラ・ヘモリチカ(Pasteurella haemolytica)、パスツレラ・ムルトシダ(Pasteurella multocida)、ニューモシスティス・カリニー(Pneumocystis carinii)、プロテウス・ブルガリス(Proteus vulgaris)、シュードモナス・アエルギノーサ(Pseudomonas aeruginosa)、サルモネラ・ボンゴリ(Salmonella bongori)、サルモネラ・コレラスイス(Salmonella cholerasuis)、サルモネラ・エンテリカ(Salmonella enterica)、サルモネラ・パラチフィ(Salmonella paratyphi)、サルモネラ・チフィ(Salmonella typhi)、サルモネラ・チフィムリウム(Salmonella typhimurium)、スタフィロコッカス・オーレウス(Staphylococcus aureus)、リステリア・モノサイトゲネス(Listeria monocytogenes)、モクサレラ・カタルハリス(Moxarella catarrhalis)、シゲラ・ボイディ(Shigella boydii)、シゲラ・ディッセンリイ(Shigelladysenteriae)、シゲラ・フレックスネリ(Shigellaflexneri)、シゲラ・ソネイ(Shigellasonnei)、スタフィロコッカス・エピダーミディス(Staphylococcusepidermidis)、ストレプトコッカス・ニューモニエ(Streptococcuspneumoniae)、ストレプトコッカス・ミュータンス(Streptococcusmutans)、トレポネーマ・パリダム(Treponemapallidum)、エルシニア・エンテロコリチカ(Yersiniaenterocolitica)、エルシニア・ペスティス(Yersiniapestis)、および上記種のいずれかの属に属する任意の種からなる群から選ばれる生物由来である、項２０５に記載の方法。
【０２２３】
２０７．上記遺伝子産物は、エシェリヒア・コリ以外の生物由来である、項２０５に記載の方法。
【０２２４】
２０８．上記遺伝子産物は、配列番号３８０１〜３８０５、４８６１〜５９１５、１００１３〜１４１１０からなる群から選ばれるポリペプチドに対して、ＦＡＳＴＡバージョン３．０ｔ７８を用いて決定される場合に少なくとも２５％のアミノ酸同一性を有するポリペプチド、および配列番号３８０１〜３８０５、４８６１〜５９１５、１００１３〜１４１１０からなる群から選ばれるポリペプチドにより活性が補完され得るポリペプチドからなる群から選ばれるポリペプチドである、項２０５に記載の方法。
【０２２５】
２０９．上記遺伝子産物は、配列番号３７９６〜３８００、３８０６〜４８６０、５９１６〜１００１２からなる群から選ばれるヌクレオチド配列に対して、デフォルトパラメータでＢＬＡＳＴＮバージョン２．０を用いて決定される場合に少なくとも７０％のヌクレオチド配列同一性を有する核酸を含む核酸、配列番号３７９６〜３８００、３８０６〜４８６０、５９１６〜１００１２からなる群から選ばれる配列に、ストリンジェントな条件下にてハイブリダイズする核酸、および配列番号３７９６〜３８００、３８０６〜４８６０、５９１６〜１００１２からなる群から選ばれる配列に、穏やかな条件下にてハイブリダイズする核酸からなる群から選ばれる核酸によりコードされる、項２０５に記載の方法。
【０２２６】
２１０．項２０５に記載の方法を用いて同定される化合物。
【０２２７】
２１１．増殖に必要な遺伝子産物の活性もしくはレベルを低減させる能力を有する化合物または核酸を同定する方法であって、
（ａ）遺伝子またはＲＮＡである標的であって、配列番号８〜３７９５からなる群から選ばれるヌクレオチド配列を含むアンチセンス核酸により発現が抑制される遺伝子産物に対して、デフォルトパラメータでＢＬＡＳＴＮバージョン２．０を用いて決定される場合に少なくとも７０％のヌクレオチド配列同一性を有する遺伝子産物、配列番号８〜３７９５からなる群から選ばれるヌクレオチド配列を含むアンチセンス核酸により発現が抑制される遺伝子産物をコードする核酸に対して、デフォルトパラメータでＢＬＡＳＴＮバージョン２．０を用いて決定される場合に少なくとも７０％の核酸同一性を有する核酸によりコードされる遺伝子産物、配列番号８〜３７９５からなる群から選ばれる配列を含むアンチセンス核酸により発現が抑制される遺伝子産物に対して、デフォルトパラメータでＦＡＳＴＡバージョン３．０ｔ７８を用いて決定される場合に少なくとも２５％のアミノ酸同一性を有する遺伝子産物、配列番号８〜３７９５からなる群から選ばれる核酸に、ストリンジェントな条件下にてハイブリダイズするヌクレオチド配列を含む核酸によりコードされる遺伝子産物、配列番号８〜３７９５からなる群から選ばれる核酸に、穏やかな条件下にてハイブリダイズするヌクレオチド配列を含む核酸によりコードされる遺伝子産物、および配列番号８〜３７９５からなる群から選ばれる核酸により活性が抑制される遺伝子産物により、活性が補完され得る遺伝子産物からなる群から選ばれる遺伝子産物をコードする核酸を含む標的を提供し、
（ｂ）上記標的を、候補化合物または核酸と接触させ、
（ｃ）上記標的の活性を測定すること
を含む方法。
【０２２８】
２１２．上記標的遺伝子またはＲＮＡは、アナプラスマ・マルギナレ(Anaplasma marginale)、アスペルギルス・フミガツス(Aspergillus fumigatus)、バチルス・アンスラシス(Bacillus anthracis)、バクテリオイデス・フラギリス(Bacterioides fragilis)、百日咳菌(Bordetella pertussis)、ブルクホルデリア・セパシア(Burkholderia cepacia)、カンピロバクター・イェジュニィ(Campylobacter jejuni)、カンジダ・アルビカンス (Candida albicans)、カンジダ・グラブラタ(Candida glabrata)（トルロプシス・グラブラタ(Torulopsis glabrata)とも呼ばれる）、カンジダ・トロピカリス(Candida tropicalis)、カンジダ・パラプシロシス(Candida parapsilosis)、カンジダ・ギルリエルモンジイ(Candida guilliermondii)、カンジダ・クルセイ(Candida krusei)、カンジダ・ケフィア(Candidakefyr)（カンジダ・シュードトロピカリス(Candidapseudotropicalis)とも呼ばれる）、カンジダ・デュブリニエンシス(Candida dubliniensis)、クラミジア・ニューモニエ(Chlamydia pneumoniae)、トラコーマ・クラミジア(Chlamydia trachomatus)、クロストリジウム・ボツリヌム(Clostridium botulinum)、クロストリジウム・ジフィシル(Clostridium difficile)、クロストリジウム・パーフリンゲンス(Clostridium perfringens)、コクシジオデス・イミチス(Coccidiodes immitis)、コリネバクテリウム・ジフテリア(Corynebacterium diptheriae)、クリプトコックス・ネオフォルマンス(Cryptococcus neoformans)、エンテロバクター・クロアカエ(Enterobacter cloacae)、エンテロコックス・フェカリス(Enterococcus faecalis)、エンテロコックス・ファエシウム(Enterococcus faecium)、エシェリヒア・コリ(Escherichia coli)、ヘモフィルス・インフルエンザ(Haemophilus influenzae)、ヘリコバクター・ピロリ(Helicobacter pylori)、ヒストプラスマ・カプスラツム(Histoplasma capsulatum)、クレブシエラ・ニューモニエ(Klebsiella pneumoniae)、リステリア・モノサイトゲネス(Listeria monocytogenes)、マイコバクテリウム・レプラエ(Mycobacterium leprae)、マイコバクテリウム・ツベルクローシス(Mycobacterium tuberculosis)、ナイセリア・ゴノローエ(Neisseria gonorrhoeae)、髄膜炎菌(Neisseria meningitidis)、ノカルジア・アステロイデス(Nocardia asteroides)、パスツレラ・ヘモリチカ(Pasteurella haemolytica)、パスツレラ・ムルトシダ(Pasteurella multocida)、ニューモシスティス・カリニー(Pneumocystis carinii)、プロテウス・ブルガリス(Proteus vulgaris)、シュードモナス・アエルギノーサ(Pseudomonas aeruginosa)、サルモネラ・ボンゴリ(Salmonella bongori)、サルモネラ・コレラスイス(Salmonella cholerasuis)、サルモネラ・エンテリカ(Salmonella enterica)、サルモネラ・パラチフィ(Salmonella paratyphi)、サルモネラ・チフィ(Salmonella typhi)、サルモネラ・チフィムリウム(Salmonella typhimurium)、スタフィロコッカス・オーレウス(Staphylococcus aureus)、リステリア・モノサイトゲネス(Listeria monocytogenes)、モクサレラ・カタルハリス(Moxarella catarrhalis)、シゲラ・ボイディ(Shigella boydii)、シゲラ・ディッセンリイ(Shigelladysenteriae)、シゲラ・フレックスネリ(Shigellaflexneri)、シゲラ・ソネイ(Shigellasonnei)、スタフィロコッカス・エピダーミディス(Staphylococcusepidermidis)、ストレプトコッカス・ニューモニエ(Streptococcuspneumoniae)、ストレプトコッカス・ミュータンス(Streptococcusmutans)、トレポネーマ・パリダム(Treponemapallidum)、エルシニア・エンテロコリチカ(Yersiniaenterocolitica)、エルシニア・ペスティス(Yersiniapestis)、および上記種のいずれかの属に属する任意の種からなる群から選ばれる生物由来である、項２１１に記載の方法。
【０２２９】
２１３．上記標的遺伝子またはＲＮＡは、エシェリヒア・コリ以外の生物由来である、項２１１に記載の方法。
【０２３０】
２１４．上記遺伝子産物は、エシェリヒア・コリ以外の生物由来である、項２１１に記載の方法。
【０２３１】
２１５．上記標的は、メッセンジャーＲＮＡ分子であり、上記活性は、上記メッセンジャーＲＮＡの翻訳である、項２１１に記載の方法。
【０２３２】
２１６．上記化合物は、核酸であり、上記活性は、上記遺伝子産物の翻訳である、項２１１に記載の方法。
【０２３３】
２１７．上記標的は、遺伝子であり、上記活性は、上記遺伝子の転写である、項２１１に記載の方法。
【０２３４】
２１８．上記標的は、非翻訳ＲＮＡであり、上記活性は、上記非翻訳ＲＮＡのプロセシングまたはフォールディング、または上記非翻訳ＲＮＡの、タンパク質／ＲＮＡ複合体への集合である、項２１１に記載の方法。
【０２３５】
２１９．上記標的遺伝子は、配列番号３８０１〜３８０５、４８６１〜５９１５、１００１３〜１４１１０からなる群から選ばれるポリペプチドに対して、ＦＡＳＴＡバージョン３．０ｔ７８を用いて決定される場合に少なくとも２５％のアミノ酸同一性を有するポリペプチド、および配列番号３８０１〜３８０５、４８６１〜５９１５、１００１３〜１４１１０からなる群から選ばれるポリペプチドにより活性が補完され得るポリペプチドからなる群から選ばれるポリペプチドをコードするメッセンジャーＲＮＡ分子である、項２１１に記載の方法。
【０２３６】
２２０．上記標的遺伝子は、配列番号３７９６〜３８００、３８０６〜４８６０、５９１６〜１００１２からなる群から選ばれるヌクレオチド配列に対して、デフォルトパラメータでＢＬＡＳＴＮバージョン２．０を用いて決定される場合に少なくとも７０％のヌクレオチド配列同一性を有する核酸を含む核酸、配列番号３７９６〜３８００、３８０６〜４８６０、５９１６〜１００１２からなる群から選ばれる配列に、ストリンジェントな条件下にてハイブリダイズする核酸、および配列番号３７９６〜３８００、３８０６〜４８６０、５９１６〜１００１２からなる群から選ばれる配列に、穏やかな条件下にてハイブリダイズする核酸からなる群から選ばれる核酸を含む、項２１１に記載の方法。
【０２３７】
２２１．項２１１に記載の方法により同定される化合物または核酸。
【０２３８】
２２２．細胞増殖に必要な遺伝子産物の活性またはレベルを低減させる化合物を同定する方法であって、
（ａ）細胞において、致死量以下のレベルの上記遺伝子産物をコードする核酸に相補的なアンチセンス核酸を提供して、上記細胞における遺伝子産物の活性または量を低減させて、それにより感作細胞を生産し（ここで上記遺伝子産物は、配列番号８〜３７９５からなる群から選ばれるヌクレオチド配列を含むアンチセンス核酸により発現が抑制される遺伝子産物に対して、デフォルトパラメータでＢＬＡＳＴＮバージョン２．０を用いて決定される場合に少なくとも７０％の核酸同一性を有する遺伝子産物、配列番号８〜３７９５からなる群から選ばれるヌクレオチド配列を含むアンチセンス核酸により発現が抑制される遺伝子産物をコードする核酸に対して、デフォルトパラメータでＢＬＡＳＴＮバージョン２．０を用いて決定される場合に少なくとも７０％のヌクレオチド配列同一性を有する核酸によりコードされる遺伝子産物、配列番号８〜３７９５からなる群から選ばれるヌクレオチド配列を含むアンチセンス核酸により発現が抑制される遺伝子産物に対して、デフォルトパラメータでＦＡＳＴＡバージョン３．０ｔ７８を用いて決定される場合に少なくとも２５％のアミノ酸同一性を有する遺伝子産物、配列番号８〜３７９５からなる群から選ばれる核酸に、ストリンジェントな条件下にてハイブリダイズするヌクレオチド配列を含む核酸によりコードされる遺伝子産物、配列番号８〜３７９５からなる群から選ばれるヌクレオチド配列を含む核酸に、穏やかな条件下にてハイブリダイズするヌクレオチド配列を含む核酸によりコードされる遺伝子産物、および配列番号８〜３７９５からなる群から選ばれる核酸により活性が抑制される遺伝子産物により、活性が補完され得る遺伝子産物からなる群から選ばれる）、
（ｂ）上記感作細胞を化合物と接触させ、
（ｃ）上記化合物が、上記アンチセンス核酸を含有しない細胞に比べて、上記感作細胞の成長を抑制する度合いを決定する工程
を含む方法。
【０２３９】
２２３．上記決定工程は、上記化合物が非感作細胞の成長を抑制するよりも高度に、上記化合物が上記感作細胞の成長を抑制するかどうかを決定することを含む、項２２２に記載の方法。
【０２４０】
２２４．上記感作細胞は、グラム陽性菌である、項２２２に記載の方法。
【０２４１】
２２５．上記グラム陽性菌は、スタフィロコッカススピーシーズ、ストレプトコッカススピーシーズ、エンテロコッカススピーシーズ、ミコバクテリウムスピーシーズ、クロストリジウムスピーシーズ、およびバチルススピーシーズからなる群から選ばれる、項２２４に記載の方法。
【０２４２】
２２６．上記細菌は、スタフィロコッカス・オーレウスである、項２２５に記載の方法。
【０２４３】
２２７．上記スタフィロコッカススピーシーズは、コアグラーゼ陰性である、項２２４に記載の方法。
【０２４４】
２２８．上記細菌は、スタフィロコッカス・オーレウスＲＮ４５０およびスタフィロコッカス・オーレウスＲＮ４２２０からなる群から選ばれる、項２２６に記載の方法。
【０２４５】
２２９．上記感作細胞は、アナプラスマ・マルギナレ(Anaplasma marginale)、アスペルギルス・フミガツス(Aspergillus fumigatus)、バチルス・アンスラシス(Bacillus anthracis)、バクテリオイデス・フラギリス(Bacterioides fragilis)、百日咳菌(Bordetella pertussis)、ブルクホルデリア・セパシア(Burkholderia cepacia)、カンピロバクター・イェジュニィ(Campylobacter jejuni)、カンジダ・アルビカンス (Candida albicans)、カンジダ・グラブラタ(Candida glabrata)（トルロプシス・グラブラタ(Torulopsis glabrata)とも呼ばれる）、カンジダ・トロピカリス(Candida tropicalis)、カンジダ・パラプシロシス(Candida parapsilosis)、カンジダ・ギルリエルモンジイ(Candida guilliermondii)、カンジダ・クルセイ(Candida krusei)、カンジダ・ケフィア(Candidakefyr)（カンジダ・シュードトロピカリス(Candidapseudotropicalis)とも呼ばれる）、カンジダ・デュブリニエンシス(Candida dubliniensis)、クラミジア・ニューモニエ(Chlamydia pneumoniae)、トラコーマ・クラミジア(Chlamydia trachomatus)、クロストリジウム・ボツリヌム(Clostridium botulinum)、クロストリジウム・ジフィシル(Clostridium difficile)、クロストリジウム・パーフリンゲンス(Clostridium perfringens)、コクシジオデス・イミチス(Coccidiodes immitis)、コリネバクテリウム・ジフテリア(Corynebacterium diptheriae)、クリプトコックス・ネオフォルマンス(Cryptococcus neoformans)、エンテロバクター・クロアカエ(Enterobacter cloacae)、エンテロコックス・フェカリス(Enterococcus faecalis)、エンテロコックス・ファエシウム(Enterococcus faecium)、エシェリヒア・コリ(Escherichia coli)、ヘモフィルス・インフルエンザ(Haemophilus influenzae)、ヘリコバクター・ピロリ(Helicobacter pylori)、ヒストプラスマ・カプスラツム(Histoplasma capsulatum)、クレブシエラ・ニューモニエ(Klebsiella pneumoniae)、リステリア・モノサイトゲネス(Listeria monocytogenes)、マイコバクテリウム・レプラエ(Mycobacterium leprae)、マイコバクテリウム・ツベルクローシス(Mycobacterium tuberculosis)、ナイセリア・ゴノローエ(Neisseria gonorrhoeae)、髄膜炎菌(Neisseria meningitidis)、ノカルジア・アステロイデス(Nocardia asteroides)、パスツレラ・ヘモリチカ(Pasteurella haemolytica)、パスツレラ・ムルトシダ(Pasteurella multocida)、ニューモシスティス・カリニー(Pneumocystis carinii)、プロテウス・ブルガリス(Proteus vulgaris)、シュードモナス・アエルギノーサ(Pseudomonas aeruginosa)、サルモネラ・ボンゴリ(Salmonella bongori)、サルモネラ・コレラスイス(Salmonella cholerasuis)、サルモネラ・エンテリカ(Salmonella enterica)、サルモネラ・パラチフィ(Salmonella paratyphi)、サルモネラ・チフィ(Salmonella typhi)、サルモネラ・チフィムリウム(Salmonella typhimurium)、スタフィロコッカス・オーレウス(Staphylococcus aureus)、リステリア・モノサイトゲネス(Listeria monocytogenes)、モクサレラ・カタルハリス(Moxarella catarrhalis)、シゲラ・ボイディ(Shigella boydii)、シゲラ・ディッセンリイ(Shigelladysenteriae)、シゲラ・フレックスネリ(Shigellaflexneri)、シゲラ・ソネイ(Shigellasonnei)、スタフィロコッカス・エピダーミディス(Staphylococcusepidermidis)、ストレプトコッカス・ニューモニエ(Streptococcuspneumoniae)、ストレプトコッカス・ミュータンス(Streptococcusmutans)、トレポネーマ・パリダム(Treponemapallidum)、エルシニア・エンテロコリチカ(Yersiniaenterocolitica)、エルシニア・ペスティス(Yersiniapestis)、および上記種のいずれかの属に属する任意の種からなる群から選ばれる生物である、項２２２に記載の方法。
【０２４６】
２３０．上記細胞は、エシェリヒア・コリ以外の生物である、項２２２に記載の方法。
【０２４７】
２３１．上記遺伝子産物は、エシェリヒア・コリ以外の生物由来である、項２２２に記載の方法。
【０２４８】
２３２．上記アンチセンス核酸は、誘導性プロモーターから転写される、項２２２に記載の方法。
【０２４９】
２３３．上記細胞を、上記アンチセンス核酸の転写を致死量以下のレベルに誘導する誘導物質濃度と接触させる工程をさらに含む、項２２２に記載の方法。
【０２５０】
２３４．成長抑制は、培地の吸光度をモニターすることにより測定される、項２２２に記載の方法。
【０２５１】
２３５．上記遺伝子産物は、ポリペプチドである、項２２２に記載の方法。
【０２５２】
２３６．上記ポリペプチドは、配列番号３８０１〜３８０５、４８６１〜５９１５、１００１３〜１４１１０からなる群から選ばれるポリペプチドに対して、ＦＡＳＴＡバージョン３．０ｔ７８を用いて決定される場合に少なくとも２５％のアミノ酸同一性を有するポリペプチド、および配列番号３８０１〜３８０５、４８６１〜５９１５、１００１３〜１４１１０からなる群から選ばれるポリペプチドにより活性が補完され得るポリペプチドからなる群から選ばれるポリペプチドを含む、項２３５に記載の方法。
【０２５３】
２３７．上記遺伝子産物は、ＲＮＡである、項２２２に記載の方法。
【０２５４】
２３８．上記遺伝子産物をコードする上記核酸は、配列番号３７９６〜３８００、３８０６〜４８６０、５９１６〜１００１２からなる群から選ばれる配列に対して、デフォルトパラメータでＢＬＡＳＴＮバージョン２．０を用いて決定される場合に少なくとも７０％の核酸同一性を有する核酸を含む核酸、配列番号３７９６〜３８００、３８０６〜４８６０、５９１６〜１００１２からなる群から選ばれる配列に、ストリンジェントな条件下にてハイブリダイズする核酸、および配列番号３７９６〜３８００、３８０６〜４８６０、５９１６〜１００１２からなる群から選ばれる配列に、穏やかな条件下にてハイブリダイズする核酸からなる群から選ばれる核酸を含む、項２２２に記載の方法。
【０２５５】
２３９．項２２２に記載の方法を用いて同定される化合物。
【０２５６】
２４０．遺伝子産物に対して活性を有する化合物、または上記遺伝子産物をコードする遺伝子に対して活性を有する化合物を、上記遺伝子産物を発現する細胞集団に導入することを含む、細胞増殖を抑制する方法であって、上記遺伝子産物は、配列番号８〜３７９５からなる群から選ばれるヌクレオチド配列を含むアンチセンス核酸により発現が抑制される遺伝子産物に対して、デフォルトパラメータでＢＬＡＳＴＮバージョン２．０を用いて決定される場合に少なくとも７０％のヌクレオチド配列同一性を有する遺伝子産物、配列番号８〜３７９５からなる群から選ばれるヌクレオチド配列を含むアンチセンス核酸により発現が抑制される遺伝子産物をコードする核酸に対して、デフォルトパラメータでＢＬＡＳＴＮバージョン２．０を用いて決定される場合に少なくとも７０％のヌクレオチド配列同一性を有する核酸によりコードされる遺伝子産物、配列番号８〜３７９５からなる群から選ばれるヌクレオチド配列を含むアンチセンス核酸により発現が抑制される遺伝子産物に対して、デフォルトパラメータでＦＡＳＴＡバージョン３．０ｔ７８を用いて決定される場合に少なくとも２５％のアミノ酸同一性を有する遺伝子産物、配列番号８〜３７９５からなる群から選ばれる核酸に、ストリンジェントな条件下にてハイブリダイズするヌクレオチド配列を含む核酸によりコードされる遺伝子産物、配列番号８〜３７９５からなる群から選ばれる核酸に、穏やかな条件下にてハイブリダイズするヌクレオチド配列を含む核酸によりコードされる遺伝子産物、および配列番号８〜３７９５からなる群から選ばれる核酸により活性が抑制される遺伝子産物により、活性が補完され得る遺伝子産物からなる群から選ばれる方法。
【０２５７】
２４１．上記化合物は、配列番号８〜３７９５からなる群から選ばれるヌクレオチド配列、またはそれらの増殖抑制部分を含むアンチセンス核酸である、項２４０に記載の方法。
【０２５８】
２４２．配列番号８〜３７９５の１つの上記増殖抑制部分は、配列番号８〜３７９５の１つの少なくとも１０個、少なくとも２０個、少なくとも２５個、少なくとも３０個、少なくとも５０個、または５１個より多い連続ヌクレオチドを含む断片である、項２４０に記載の方法。
【０２５９】
２４３．上記集団は、グラム陽性菌の集団である、項２４０に記載の方法。
【０２６０】
２４４．上記グラム陽性菌の集団は、スタフィロコッカススピーシーズ、ストレプトコッカススピーシーズ、エンテロコッカススピーシーズ、ミコバクテリウムスピーシーズ、クロストリジウムスピーシーズ、およびバチルススピーシーズの集団からなる群から選ばれる、項２４３に記載の方法。
【０２６１】
２４５．上記集団は、スタフィロコッカス・オーレウスの集団である、項２４３に記載の方法。
【０２６２】
２４６．上記集団は、スタフィロコッカス・オーレウスＲＮ４５０およびスタフィロコッカス・オーレウスＲＮ４２２０からなる群から選ばれる細菌の集団である、項２４５に記載の方法。
【０２６３】
２４７．上記集団は、アナプラスマ・マルギナレ(Anaplasmamarginale)、アスペルギルス・フミガツス(Aspergillusfumigatus)、バチルス・アンスラシス(Bacillusanthracis)、バクテリオイデス・フラギリス(Bacterioidesfragilis)、百日咳菌(Bordetellapertussis)、ブルクホルデリア・セパシア(Burkholderiacepacia)、カンピロバクター・イェジュニィ(Campylobacterjejuni)、カンジダ・アルビカンス (Candidaalbicans)、カンジダ・グラブラタ(Candidaglabrata)（トルロプシス・グラブラタ(Toprulopsisglabrata)とも呼ばれる）、カンジダ・トロピカリス(Candidatropicalis)、カンジダ・パラプシロシス(Candidaparapsilosis)、カンジダ・ギルリエルモンジイ(Candidaguilliermondii)、カンジダ・クルセイ(Candidakrusei)、カンジダ・ケフィア(Candidakefyr)（カンジダ・シュードトロピカリス(Candidapseudotropicalis)とも呼ばれる）、カンジダ・デュブリニエンシス(Candida dubliniensis)、クラミジア・ニューモニエ(Chlamydia pneumoniae)、トラコーマ・クラミジア(Chlamydia trachomatus)、クロストリジウム・ボツリヌム(Clostridium botulinum)、クロストリジウム・ジフィシル(Clostridium difficile)、クロストリジウム・パーフリンゲンス(Clostridium perfringens)、コクシジオデス・イミチス(Coccidiodes immitis)、コリネバクテリウム・ジフテリア(Corynebacterium diptheriae)、クリプトコックス・ネオフォルマンス(Cryptococcus neoformans)、エンテロバクター・クロアカエ(Enterobacter cloacae)、エンテロコックス・フェカリス(Enterococcus faecalis)、エンテロコックス・ファエシウム(Enterococcus faecium)、エシェリヒア・コリ(Escherichia coli)、ヘモフィルス・インフルエンザ(Haemophilus influenzae)、ヘリコバクター・ピロリ(Helicobacter pylori)、ヒストプラスマ・カプスラツム(Histoplasma capsulatum)、クレブシエラ・ニューモニエ(Klebsiella pneumoniae)、リステリア・モノサイトゲネス(Listeria monocytogenes)、マイコバクテリウム・レプラエ(Mycobacterium leprae)、マイコバクテリウム・ツベルクローシス(Mycobacterium tuberculosis)、ナイセリア・ゴノローエ(Neisseria gonorrhoeae)、髄膜炎菌(Neisseria meningitidis)、ノカルジア・アステロイデス(Nocardia asteroides)、パスツレラ・ヘモリチカ(Pasteurella haemolytica)、パスツレラ・ムルトシダ(Pasteurella multocida)、ニューモシスティス・カリニー(Pneumocystis carinii)、プロテウス・ブルガリス(Proteus vulgaris)、シュードモナス・アエルギノーサ(Pseudomonas aeruginosa)、サルモネラ・ボンゴリ(Salmonella bongori)、サルモネラ・コレラスイス(Salmonella cholerasuis)、サルモネラ・エンテリカ(Salmonella enterica)、サルモネラ・パラチフィ(Salmonella paratyphi)、サルモネラ・チフィ(Salmonella typhi)、サルモネラ・チフィムリウム(Salmonella typhimurium)、スタフィロコッカス・オーレウス(Staphylococcus aureus)、リステリア・モノサイトゲネス(Listeria monocytogenes)、モクサレラ・カタルハリス(Moxarella catarrhalis)、シゲラ・ボイディ(Shigella boydii)、シゲラ・ディッセンリイ(Shigelladysenteriae)、シゲラ・フレックスネリ(Shigellaflexneri)、シゲラ・ソネイ(Shigellasonnei)、スタフィロコッカス・エピダーミディス(Staphylococcusepidermidis)、ストレプトコッカス・ニューモニエ(Streptococcuspneumoniae)、ストレプトコッカス・ミュータンス(Streptococcusmutans)、トレポネーマ・パリダム(Treponemapallidum)、エルシニア・エンテロコリチカ(Yersiniaenterocolitica)、エルシニア・ペスティス(Yersiniapestis)、および上記種のいずれかの属に属する任意の種からなる群から選ばれる細菌の集団である、項２４０に記載の方法。
【０２６４】
２４８．上記集団は、エシェリヒア・コリ以外の生物の集団である、項２４０に記載の方法。
【０２６５】
２４９．上記遺伝子の上記産物は、エシェリヒア・コリ以外の生物由来である、項２４０に記載の方法。
【０２６６】
２５０．上記遺伝子産物は、配列番号３８０１〜３８０５、４８６１〜５９１５、１００１３〜１４１１０からなる群から選ばれるポリペプチドに対して、ＦＡＳＴＡバージョン３．０ｔ７８を用いて決定される場合に少なくとも２５％のアミノ酸同一性を有するポリペプチド、および配列番号３８０１〜３８０５、４８６１〜５９１５、１００１３〜１４１１０からなる群から選ばれるポリペプチドにより活性が補完され得るポリペプチドからなる群から選ばれる、項２４０に記載の方法。
【０２６７】
２５１．上記遺伝子は、配列番号３７９６〜３８００、３８０６〜４８６０、５９１６〜１００１２からなる群から選ばれるヌクレオチド配列に対して、デフォルトパラメータでＢＬＡＳＴＮバージョン２．０を用いて決定される場合に少なくとも７０％のヌクレオチド配列同一性を有する核酸を含む核酸、配列番号３７９６〜３８００、３８０６〜４８６０、５９１６〜１００１２からなる群から選ばれるヌクレオチド配列に、ストリンジェントな条件下にてハイブリダイズするヌクレオチド配列を含む核酸、および配列番号３７９６〜３８００、３８０６〜４８６０、５９１６〜１００１２からなる群から選ばれるヌクレオチド配列に、穏やかな条件下にてハイブリダイズするヌクレオチド配列を含む核酸からなる群から選ばれる核酸を含む、項２４０に記載の方法。
【０２６８】
２５２．薬学的に許容可能な担体中に有効濃度のアンチセンス核酸を含む調製物であって、上記アンチセンス核酸は、配列番号８〜３７９５からなる群から選ばれるヌクレオチド配列またはそれらの増殖抑制部分に対して、デフォルトパラメータでＢＬＡＳＴＮバージョン２．０を用いて決定される場合に少なくとも７０％のヌクレオチド配列同一性を有する配列を含む核酸、配列番号８〜３７９５からなる群から選ばれる核酸に、ストリンジェントな条件下にてハイブリダイズするヌクレオチド配列を含む核酸、および配列番号８〜３７９５からなる群から選ばれる核酸に、穏やかな条件下にてハイブリダイズするヌクレオチド配列を含む核酸からなる群から選ばれる調製物。
【０２６９】
２５３．配列番号８〜３７９５の１つの上記増殖抑制部分は、配列番号８〜３７９５の１つの少なくとも１０個、少なくとも２０個、少なくとも２５個、少なくとも３０個、少なくとも５０個、または５０個より多い連続ヌクレオチドを含む、項２５２に記載の調製物。
【０２７０】
２５４．細胞集団中の細胞を、アンチセンス方向にて増殖に必要な遺伝子産物をコードするオペロンの少なくとも増殖抑制部分を含むアンチセンス核酸と接触させることを含む、上記オペロンにおいて遺伝子の活性または発現を抑制する方法であって、上記遺伝子産物は、配列番号８〜３７９５からなる群から選ばれるヌクレオチド配列を含むアンチセンス核酸により発現が抑制される遺伝子産物に対して、デフォルトパラメータでＢＬＡＳＴＮバージョン２．０を用いて決定される場合に少なくとも７０％のヌクレオチド配列同一性を有する遺伝子産物、配列番号８〜３７９５からなる群から選ばれるヌクレオチド配列を含むアンチセンス核酸により発現が抑制される遺伝子産物をコードする核酸に対して、デフォルトパラメータでＢＬＡＳＴＮバージョン２．０を用いて決定される場合に少なくとも７０％のヌクレオチド配列同一性を有する核酸によりコードされる遺伝子産物、配列番号８〜３７９５からなる群から選ばれるヌクレオチド配列を含むアンチセンス核酸により発現が抑制される遺伝子産物に対して、デフォルトパラメータでＦＡＳＴＡバージョン３．０ｔ７８を用いて決定される場合に少なくとも２５％のアミノ酸同一性を有する遺伝子産物、配列番号８〜３７９５からなる群から選ばれる核酸に、ストリンジェントな条件下にてハイブリダイズするヌクレオチド配列を含む核酸によりコードされる遺伝子産物、配列番号８〜３７９５からなる群から選ばれる核酸に、穏やかな条件下にてハイブリダイズするヌクレオチド配列を含む核酸によりコードされる遺伝子産物、および配列番号８〜３７９５からなる群から選ばれる核酸により活性が抑制される遺伝子産物により、活性が補完され得る遺伝子産物からなる群から選ばれる方法。
【０２７１】
２５５．上記アンチセンス核酸は、配列番号８〜３７９５からなる群から選ばれるヌクレオチド配列またはそれらの増殖抑制部分に対して、デフォルトパラメータでＢＬＡＳＴＮバージョン２．０を用いて決定される場合に少なくとも７０％のヌクレオチド配列同一性を有するヌクレオチド配列、配列番号８〜３７９５からなる群から選ばれる核酸に、ストリンジェントな条件下にてハイブリダイズするヌクレオチド配列を含む核酸、および配列番号８〜３７９５からなる群から選ばれる核酸に、穏やかな条件下にてハイブリダイズするヌクレオチド配列を含む核酸を含む、項２５４に記載の方法。
【０２７２】
２５６．上記細胞は、アナプラスマ・マルギナレ(Anaplasmamarginale)、アスペルギルス・フミガツス(Aspergillusfumigatus)、バチルス・アンスラシス(Bacillusanthracis)、バクテリオイデス・フラギリス(Bacterioidesfragilis)、百日咳菌(Bordetellapertussis)、ブルクホルデリア・セパシア(Burkholderiacepacia)、カンピロバクター・イェジュニィ(Campylobacterjejuni)、カンジダ・アルビカンス (Candidaalbicans)、カンジダ・グラブラタ(Candidaglabrata)（トルロプシス・グラブラタ(Toprulopsisglabrata)とも呼ばれる）、カンジダ・トロピカリス(Candidatropicalis)、カンジダ・パラプシロシス(Candidaparapsilosis)、カンジダ・ギルリエルモンジイ(Candidaguilliermondii)、カンジダ・クルセイ(Candidakrusei)、カンジダ・ケフィア(Candidakefyr)（カンジダ・シュードトロピカリス(Candidapseudotropicalis)とも呼ばれる）、カンジダ・デュブリニエンシス(Candida dubliniensis)、クラミジア・ニューモニエ(Chlamydia pneumoniae)、トラコーマ・クラミジア(Chlamydia trachomatus)、クロストリジウム・ボツリヌム(Clostridium botulinum)、クロストリジウム・ジフィシル(Clostridium difficile)、クロストリジウム・パーフリンゲンス(Clostridium perfringens)、コクシジオデス・イミチス(Coccidiodes immitis)、コリネバクテリウム・ジフテリア(Corynebacterium diptheriae)、クリプトコックス・ネオフォルマンス(Cryptococcus neoformans)、エンテロバクター・クロアカエ(Enterobacter cloacae)、エンテロコックス・フェカリス(Enterococcus faecalis)、エンテロコックス・ファエシウム(Enterococcus faecium)、エシェリヒア・コリ(Escherichia coli)、ヘモフィルス・インフルエンザ(Haemophilus influenzae)、ヘリコバクター・ピロリ(Helicobacter pylori)、ヒストプラスマ・カプスラツム(Histoplasma capsulatum)、クレブシエラ・ニューモニエ(Klebsiella pneumoniae)、リステリア・モノサイトゲネス(Listeria monocytogenes)、マイコバクテリウム・レプラエ(Mycobacterium leprae)、マイコバクテリウム・ツベルクローシス(Mycobacterium tuberculosis)、ナイセリア・ゴノローエ(Neisseria gonorrhoeae)、髄膜炎菌(Neisseria meningitidis)、ノカルジア・アステロイデス(Nocardia asteroides)、パスツレラ・ヘモリチカ(Pasteurella haemolytica)、パスツレラ・ムルトシダ(Pasteurella multocida)、ニューモシスティス・カリニー(Pneumocystis carinii)、プロテウス・ブルガリス(Proteus vulgaris)、シュードモナス・アエルギノーサ(Pseudomonas aeruginosa)、サルモネラ・ボンゴリ(Salmonella bongori)、サルモネラ・コレラスイス(Salmonella cholerasuis)、サルモネラ・エンテリカ(Salmonella enterica)、サルモネラ・パラチフィ(Salmonella paratyphi)、サルモネラ・チフィ(Salmonella typhi)、サルモネラ・チフィムリウム(Salmonella typhimurium)、スタフィロコッカス・オーレウス(Staphylococcus aureus)、リステリア・モノサイトゲネス(Listeria monocytogenes)、モクサレラ・カタルハリス(Moxarella catarrhalis)、シゲラ・ボイディ(Shigella boydii)、シゲラ・ディッセンリイ(Shigelladysenteriae)、シゲラ・フレックスネリ(Shigellaflexneri)、シゲラ・ソネイ(Shigellasonnei)、スタフィロコッカス・エピダーミディス(Staphylococcusepidermidis)、ストレプトコッカス・ニューモニエ(Streptococcuspneumoniae)、ストレプトコッカス・ミュータンス(Streptococcusmutans)、トレポネーマ・パリダム(Treponemapallidum)、エルシニア・エンテロコリチカ(Yersiniaenterocolitica)、エルシニア・ペスティス(Yersiniapestis)、および上記種のいずれかの属に属する任意の種からなる群から選ばれる、項２５４に記載の方法。
【０２７３】
２５７．上記細胞は、エシェリヒア・コリ細胞ではない、項２５４に記載の方法。
【０２７４】
２５８．上記遺伝子は、エシェリヒア・コリ以外の生物由来である、項２５４に記載の方法。
【０２７５】
２５９．上記アンチセンス核酸を転写するプラスミドを、上記細胞集団に導入することにより、上記細胞を上記アンチセンス核酸と接触させる、項２５４に記載の方法。
【０２７６】
２６０．上記アンチセンス核酸を転写するファージを、上記細胞集団に導入することにより、上記細胞を上記アンチセンス核酸と接触させる、項２５４に記載の方法。
【０２７７】
２６１．上記細胞集団において細胞の染色体から上記アンチセンス核酸を転写することにより、上記細胞を上記アンチセンス核酸と接触させる、項２５４に記載の方法。
【０２７８】
２６２．プロモーターが上記アンチセンス核酸合成を誘導するように、上記アンチセンス核酸の染色体コピーに隣接するプロモーターを導入することにより、上記細胞を上記アンチセンス核酸と接触させる、項２５４に記載の方法。
【０２７９】
２６３．上記アンチセンス核酸を発現するレトロンを、上記細胞集団に導入することにより、上記細胞を上記アンチセンス核酸と接触させる、項２５４に記載の方法。
【０２８０】
２６４．上記細胞集団にリボザイムを導入することにより、上記細胞を上記アンチセンス核酸と接触させる方法であって、上記リボザイムの結合部分は、上記アンチセンスオリゴヌクレオチドに相補的である、項２５４に記載の方法。
【０２８１】
２６５．上記アンチセンスオリゴヌクレオチドを含むリポソームを、上記細胞に導入することにより、上記細胞を上記アンチセンス核酸と接触させる、項２５４に記載の方法。
【０２８２】
２６６．上記アンチセンス核酸の、上記細胞へのエレクトロポレーションにより、上記細胞を上記アンチセンス核酸と接触させる、項２５４に記載の方法。
【０２８３】
２６７．上記アンチセンス核酸は、配列番号８〜３７９５の１つの少なくとも１０個、少なくとも２０個、少なくとも２５個、少なくとも３０個、少なくとも５０個、または５０個より多い連続ヌクレオチドを含むヌクレオチド配列に対して、デフォルトパラメータでＢＬＡＳＴＮバージョン２．０を用いて決定される場合に少なくとも７０％のヌクレオチド配列同一性を有する、項２５４に記載の方法。
【０２８４】
２６８．上記アンチセンス核酸は、合成オリゴヌクレオチドである、項２５４に記載の方法。
【０２８５】
２６９．上記遺伝子は、配列番号３７９６〜３８００、３８０６〜４８６０、５９１６〜１００１２からなる群から選ばれるヌクレオチド配列に対して、デフォルトパラメータでＢＬＡＳＴＮバージョン２．０を用いて決定される場合に少なくとも７０％のヌクレオチド配列同一性を有する核酸を含む核酸、配列番号３７９６〜３８００、３８０６〜４８６０、５９１６〜１００１２からなる群から選ばれる配列に、ストリンジェントな条件下にてハイブリダイズするヌクレオチド配列を含む核酸、および配列番号３７９６〜３８００、３８０６〜４８６０、５９１６〜１００１２からなる群から選ばれるヌクレオチド配列に、穏やかな条件下にてハイブリダイズするヌクレオチド配列を含む核酸からなる群から選ばれる核酸を含む、項２５４に記載の方法。
【０２８６】
２７０．細胞増殖に必要な遺伝子を同定する方法であって、
（ａ）配列番号８〜３７９５からなる群から選ばれるヌクレオチド配列またはそれらの増殖抑制部分に対して、デフォルトパラメータでＢＬＡＳＴＮバージョン２．０を用いて決定される場合に少なくとも７０％のヌクレオチド配列同一性を有する核酸、配列番号８〜３７９５からなる群から選ばれる核酸に、ストリンジェントな条件下にてハイブリダイズするヌクレオチド配列を含む核酸、および配列番号８〜３７９５からなる群から選ばれる核酸に、穏やかな条件下にてハイブリダイズするヌクレオチド配列を含む核酸からなる群から選ばれるアンチセンス核酸と、細胞とを接触させ（ここで、上記細胞は、上記核酸が得られた生物以外の細胞である）、
（ｂ）上記核酸が、上記細胞の増殖を抑制するかどうかを決定し、
（ｃ）上記アンチセンス核酸またはその一部に相補的なｍＲＮＡをコードする上記細胞中の遺伝子を同定すること
を含む方法。
【０２８７】
２７１．上記細胞は、スタフィロコッカススピーシーズ、ストレプトコッカススピーシーズ、エンテロコッカススピーシーズ、ミコバクテリウムスピーシーズ、クロストリジウムスピーシーズ、およびバチルススピーシーズからなる群から選ばれる、項２７０に記載の方法。
【０２８８】
２７２．上記細胞は、アナプラスマ・マルギナレ(Anaplasmamarginale)、アスペルギルス・フミガツス(Aspergillusfumigatus)、バチルス・アンスラシス(Bacillusanthracis)、バクテリオイデス・フラギリス(Bacterioidesfragilis)、百日咳菌(Bordetellapertussis)、ブルクホルデリア・セパシア(Burkholderiacepacia)、カンピロバクター・イェジュニィ(Campylobacterjejuni)、カンジダ・アルビカンス (Candidaalbicans)、カンジダ・グラブラタ(Candidaglabrata)（トルロプシス・グラブラタ(Toprulopsisglabrata)とも呼ばれる）、カンジダ・トロピカリス(Candidatropicalis)、カンジダ・パラプシロシス(Candidaparapsilosis)、カンジダ・ギルリエルモンジイ(Candidaguilliermondii)、カンジダ・クルセイ(Candidakrusei)、カンジダ・ケフィア(Candidakefyr)（カンジダ・シュードトロピカリス(Candidapseudotropicalis)とも呼ばれる）、カンジダ・デュブリニエンシス(Candida dubliniensis)、クラミジア・ニューモニエ(Chlamydia pneumoniae)、トラコーマ・クラミジア(Chlamydia trachomatus)、クロストリジウム・ボツリヌム(Clostridium botulinum)、クロストリジウム・ジフィシル(Clostridium difficile)、クロストリジウム・パーフリンゲンス(Clostridium perfringens)、コクシジオデス・イミチス(Coccidiodes immitis)、コリネバクテリウム・ジフテリア(Corynebacterium diptheriae)、クリプトコックス・ネオフォルマンス(Cryptococcus neoformans)、エンテロバクター・クロアカエ(Enterobacter cloacae)、エンテロコックス・フェカリス(Enterococcus faecalis)、エンテロコックス・ファエシウム(Enterococcus faecium)、エシェリヒア・コリ(Escherichia coli)、ヘモフィルス・インフルエンザ(Haemophilus influenzae)、ヘリコバクター・ピロリ(Helicobacter pylori)、ヒストプラスマ・カプスラツム(Histoplasma capsulatum)、クレブシエラ・ニューモニエ(Klebsiella pneumoniae)、リステリア・モノサイトゲネス(Listeria monocytogenes)、マイコバクテリウム・レプラエ(Mycobacterium leprae)、マイコバクテリウム・ツベルクローシス(Mycobacterium tuberculosis)、ナイセリア・ゴノローエ(Neisseria gonorrhoeae)、髄膜炎菌(Neisseria meningitidis)、ノカルジア・アステロイデス(Nocardia asteroides)、パスツレラ・ヘモリチカ(Pasteurella haemolytica)、パスツレラ・ムルトシダ(Pasteurella multocida)、ニューモシスティス・カリニー(Pneumocystis carinii)、プロテウス・ブルガリス(Proteus vulgaris)、シュードモナス・アエルギノーサ(Pseudomonas aeruginosa)、サルモネラ・ボンゴリ(Salmonella bongori)、サルモネラ・コレラスイス(Salmonella cholerasuis)、サルモネラ・エンテリカ(Salmonella enterica)、サルモネラ・パラチフィ(Salmonella paratyphi)、サルモネラ・チフィ(Salmonella typhi)、サルモネラ・チフィムリウム(Salmonella typhimurium)、スタフィロコッカス・オーレウス(Staphylococcus aureus)、リステリア・モノサイトゲネス(Listeria monocytogenes)、モクサレラ・カタルハリス(Moxarella catarrhalis)、シゲラ・ボイディ(Shigella boydii)、シゲラ・ディッセンリイ(Shigelladysenteriae)、シゲラ・フレックスネリ(Shigellaflexneri)、シゲラ・ソネイ(Shigellasonnei)、スタフィロコッカス・エピダーミディス(Staphylococcusepidermidis)、ストレプトコッカス・ニューモニエ(Streptococcuspneumoniae)、ストレプトコッカス・ミュータンス(Streptococcusmutans)、トレポネーマ・パリダム(Treponemapallidum)、エルシニア・エンテロコリチカ(Yersiniaenterocolitica)、エルシニア・ペスティス(Yersiniapestis)、および上記種のいずれかの属に属する任意の種からなる群から選ばれる、項２７０に記載の方法。
【０２８９】
２７３．上記細胞は、エシェリヒア・コリではない、項２６０に記載の方法。
【０２９０】
２７４．上記細胞において機能的なプロモーターであって、ベクター中に含まれているプロモーターに上記アンチセンス核酸を作動可能に連結することと、上記ベクターを上記細胞に導入することとをさらに含む、項２７０に記載の方法。
【０２９１】
２７５．細胞増殖を抑制する能力を有する化合物を同定する方法であって、
（ａ）試験細胞においてアンチセンス核酸により活性もしくはレベルが抑制される遺伝子または遺伝子産物の相同体を同定し（ここで、上記試験細胞は、上記アンチセンス核酸が得られた微生物ではなく、また上記アンチセンス核酸は、配列番号８〜３７９５からなる群から選ばれるヌクレオチド配列に対して、デフォルトパラメータでＢＬＡＳＴＮバージョン２．０を用いて決定される場合に少なくとも７０％のヌクレオチド配列同一性を有する核酸、配列番号８〜３７９５からなる群から選ばれる核酸に、ストリンジェントな条件下にてハイブリダイズするヌクレオチド配列を含む核酸、および配列番号８〜３７９５からなる群から選ばれる核酸に、穏やかな条件下にてハイブリダイズするヌクレオチド配列を含む核酸からなる群から選ばれる）、
（ｂ）上記試験細胞において上記相同体の活性を抑制する抑制性核酸配列を同定し、
（ｃ）上記試験細胞を、致死量以下のレベルの上記抑制性核酸と接触させて、上記細胞を感作し、
（ｄ）工程（ｃ）の感作細胞を、化合物と接触させ、
（ｅ）上記化合物が、上記抑制性核酸を発現しない細胞に比べて、上記感作細胞の増殖を抑制する度合いを決定する工程
を含む方法。
【０２９２】
２７６．上記決定工程は、上記化合物が非感作試験細胞の増殖を抑制するよりも高度に、上記化合物が上記感作試験細胞の増殖を抑制するかどうかを決定することを含む、項２７５に記載の方法。
【０２９３】
２７７．工程（ａ）は、データベースにて以下の相同核酸または相同ポリペプチドをコードする以下の核酸を同定するために、デフォルトパラメータでのＢＬＡＳＴＮバージョン２．０およびデフォルトパラメータでのＦＡＳＴＡバージョン３．０ｔ７８アルゴリズムからなる群から選ばれるアルゴリズムを用いて、配列番号８〜３７９５からなる群から選ばれるヌクレオチド配列に対して、デフォルトパラメータでＢＬＡＳＴＮバージョン２．０を用いて決定される場合に少なくとも７０％のヌクレオチド配列同一性を有する核酸により活性もしくはレベルが抑制される遺伝子または遺伝子産物に対する相同核酸、または配列番号８〜３７９５からなる群から選ばれるヌクレオチド配列に対して、デフォルトパラメータでＢＬＡＳＴＮバージョン２．０を用いて決定される場合に少なくとも７０％のヌクレオチド配列同一性を有する核酸により活性またはレベルが抑制されるポリペプチドに対する相同ポリペプチドをコードする核酸を同定することを含む、項２７５に記載の方法。
【０２９４】
２７８．上記工程（ａ）は、配列番号８〜３７９５からなる群から選ばれるヌクレオチド配列に対して、デフォルトパラメータでＢＬＡＳＴＮバージョン２．０を用いて決定される場合に少なくとも７０％のヌクレオチド配列同一性を有する上記核酸にハイブリダイズするヌクレオチド配列を含むヌクレオチド配列、または配列番号８〜３７９５からなる群から選ばれる上記核酸のヌクレオチド配列の相補体を同定することにより、相同核酸または相同ポリペプチドをコードする核酸を同定することを含む、項２７５に記載の方法。
【０２９５】
２７９．工程（ａ）は、上記試験細胞において、配列番号８〜３７９５からなる群から選ばれる配列に対して、デフォルトパラメータでＢＬＡＳＴＮバージョン２．０を用いて決定される場合に少なくとも７０％の核酸同一性を有する核酸を発現させることを含む、項２７５に記載の方法。
【０２９６】
２８０．上記工程（ａ）は、アナプラスマ・マルギナレ(Anaplasma marginale)、アスペルギルス・フミガツス(Aspergillus fumigatus)、バチルス・アンスラシス(Bacillus anthracis)、バクテリオイデス・フラギリス(Bacterioides fragilis)、百日咳菌(Bordetella pertussis)、ブルクホルデリア・セパシア(Burkholderia cepacia)、カンピロバクター・イェジュニィ(Campylobacter jejuni)、カンジダ・アルビカンス (Candida albicans)、カンジダ・グラブラタ(Candida glabrata)（トルロプシス・グラブラタ(Toprulopsis glabrata)とも呼ばれる）、カンジダ・トロピカリス(Candida tropicalis)、カンジダ・パラプシロシス(Candida parapsilosis)、カンジダ・ギルリエルモンジイ(Candida guilliermondii)、カンジダ・クルセイ(Candida krusei)、カンジダ・ケフィア(Candidakefyr)（カンジダ・シュードトロピカリス(Candidapseudotropicalis)とも呼ばれる）、カンジダ・デュブリニエンシス(Candida dubliniensis)、クラミジア・ニューモニエ(Chlamydia pneumoniae)、トラコーマ・クラミジア(Chlamydia trachomatus)、クロストリジウム・ボツリヌム(Clostridium botulinum)、クロストリジウム・ジフィシル(Clostridium difficile)、クロストリジウム・パーフリンゲンス(Clostridium perfringens)、コクシジオデス・イミチス(Coccidiodes immitis)、コリネバクテリウム・ジフテリア(Corynebacterium diptheriae)、クリプトコックス・ネオフォルマンス(Cryptococcus neoformans)、エンテロバクター・クロアカエ(Enterobacter cloacae)、エンテロコックス・フェカリス(Enterococcus faecalis)、エンテロコックス・ファエシウム(Enterococcus faecium)、エシェリヒア・コリ(Escherichia coli)、ヘモフィルス・インフルエンザ(Haemophilus influenzae)、ヘリコバクター・ピロリ(Helicobacter pylori)、ヒストプラスマ・カプスラツム(Histoplasma capsulatum)、クレブシエラ・ニューモニエ(Klebsiella pneumoniae)、リステリア・モノサイトゲネス(Listeria monocytogenes)、マイコバクテリウム・レプラエ(Mycobacterium leprae)、マイコバクテリウム・ツベルクローシス(Mycobacterium tuberculosis)、ナイセリア・ゴノローエ(Neisseria gonorrhoeae)、髄膜炎菌(Neisseria meningitidis)、ノカルジア・アステロイデス(Nocardia asteroides)、パスツレラ・ヘモリチカ(Pasteurella haemolytica)、パスツレラ・ムルトシダ(Pasteurella multocida)、ニューモシスティス・カリニー(Pneumocystis carinii)、プロテウス・ブルガリス(Proteus vulgaris)、シュードモナス・アエルギノーサ(Pseudomonas aeruginosa)、サルモネラ・ボンゴリ(Salmonella bongori)、サルモネラ・コレラスイス(Salmonella cholerasuis)、サルモネラ・エンテリカ(Salmonella enterica)、サルモネラ・パラチフィ(Salmonella paratyphi)、サルモネラ・チフィ(Salmonella typhi)、サルモネラ・チフィムリウム(Salmonella typhimurium)、スタフィロコッカス・オーレウス(Staphylococcus aureus)、リステリア・モノサイトゲネス(Listeria monocytogenes)、モクサレラ・カタルハリス(Moxarella catarrhalis)、シゲラ・ボイディ(Shigella boydii)、シゲラ・ディッセンリイ(Shigelladysenteriae)、シゲラ・フレックスネリ(Shigellaflexneri)、シゲラ・ソネイ(Shigellasonnei)、スタフィロコッカス・エピダーミディス(Staphylococcusepidermidis)、ストレプトコッカス・ニューモニエ(Streptococcuspneumoniae)、ストレプトコッカス・ミュータンス(Streptococcusmutans)、トレポネーマ・パリダム(Treponemapallidum)、エルシニア・エンテロコリチカ(Yersiniaenterocolitica)、エルシニア・ペスティス(Yersiniapestis)、および上記種のいずれかの属に属する任意の種からなる群から選ばれる試験細胞において、相同核酸または相同ポリペプチドをコードする核酸を同定することを含む、項２７５に記載の方法。
【０２９７】
２８１．工程（ａ）は、エシェリヒア・コリ以外の試験細胞において、相同核酸または相同ポリペプチドをコードする核酸を同定することを含む、項２７５に記載の方法。
【０２９８】
２８２．上記抑制性核酸は、アンチセンス核酸である、項２７５に記載の方法。
【０２９９】
２８３．上記抑制性核酸は、上記相同体の一部に対するアンチセンス核酸を含む、項２７５に記載の方法。
【０３００】
２８４．上記抑制性核酸は、上記相同体をコードするオペロンの一部に対するアンチセンス核酸を含む、項２７５に記載の方法。
【０３０１】
２８５．上記細胞を致死量以下のレベルの上記抑制性核酸と接触させる工程は、上記細胞を上記抑制性核酸と直接接触させることを含む、項２７５に記載の方法。
【０３０２】
２８６．上記細胞を致死量以下のレベルの上記抑制性核酸と接触させる工程は、上記細胞において、上記相同体に対するアンチセンス核酸を発現させることを含む、項２７５に記載の方法。
【０３０３】
２８７．上記遺伝子産物は、配列番号３８０１〜３８０５、４８６１〜５９１５、１００１３〜１４１１０からなる群から選ばれるアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む、項２７５に記載の方法。
【０３０４】
２８８．上記遺伝子は、配列番号３７９６〜３８００、３８０６〜４８６０、５９１６〜１００１２からなる群から選ばれる配列に対して、デフォルトパラメータでＢＬＡＳＴＮバージョン２．０を用いて決定される場合に少なくとも７０％のヌクレオチド配列同一性を有する核酸を含む核酸、配列番号３７９６〜３８００、３８０６〜４８６０、５９１６〜１００１２からなる群から選ばれるヌクレオチド配列に、ストリンジェントな条件下にてハイブリダイズするヌクレオチド配列を含む核酸、および配列番号３７９６〜３８００、３８０６〜４８６０、５９１６〜１００１２からなる群から選ばれるヌクレオチド配列に、穏やかな条件下にてハイブリダイズするヌクレオチド配列を含む核酸からなる群から選ばれる核酸を含む、項２７５に記載の方法。
【０３０５】
２８９．項２７５に記載の方法を用いて同定される化合物。
【０３０６】
２９０．増殖を抑制する能力を有する化合物を同定する方法であって、
（ａ）試験細胞を、致死量以下のレベルのアンチセンス核酸と接触させることにより、上記試験細胞を感作し（ここで、上記アンチセンス核酸は、配列番号８〜３７９５からなる群から選ばれるヌクレオチド配列またはそれらの、上記核酸が得られた細胞増殖を抑制する部分に対して、デフォルトパラメータでＢＬＡＳＴＮバージョン２．０を用いて決定される場合に少なくとも７０％のヌクレオチド配列同一性を有する核酸、配列番号８〜３７９５からなる群から選ばれる核酸に、ストリンジェントな条件下にてハイブリダイズするヌクレオチド配列を含む核酸、および配列番号８〜３７９５からなる群から選ばれる核酸に、穏やかな条件下にてハイブリダイズするヌクレオチド配列を含む核酸からなる群から選ばれる）、
（ｂ）工程（ａ）の感作試験細胞を化合物と接触させ、
（ｃ）上記化合物が、上記アンチセンス核酸を含有しない細胞に比べて、上記感作試験細胞の増殖を抑制する度合いを決定する工程
とを含む方法。
【０３０７】
２９１．上記決定工程は、上記化合物が非感作試験細胞を抑制するよりも高度に、上記化合物が上記感作試験細胞の増殖を抑制するかどうかを決定することを含む、項２９０に記載の方法。
【０３０８】
２９２．項２９０に記載の方法を用いて同定される化合物。
【０３０９】
２９３．上記試験細胞は、アナプラスマ・マルギナレ(Anaplasma marginale)、アスペルギルス・フミガツス(Aspergillus fumigatus)、バチルス・アンスラシス(Bacillus anthracis)、バクテリオイデス・フラギリス(Bacterioides fragilis)、百日咳菌(Bordetella pertussis)、ブルクホルデリア・セパシア(Burkholderia cepacia)、カンピロバクター・イェジュニィ(Campylobacter jejuni)、カンジダ・アルビカンス (Candida albicans)、カンジダ・グラブラタ(Candida glabrata)（トルロプシス・グラブラタ(Toprulopsis glabrata)とも呼ばれる）、カンジダ・トロピカリス(Candida tropicalis)、カンジダ・パラプシロシス(Candida parapsilosis)、カンジダ・ギルリエルモンジイ(Candida guilliermondii)、カンジダ・クルセイ(Candida krusei)、カンジダ・ケフィア(Candidakefyr)（カンジダ・シュードトロピカリス(Candidapseudotropicalis)とも呼ばれる）、カンジダ・デュブリニエンシス(Candida dubliniensis)、クラミジア・ニューモニエ(Chlamydia pneumoniae)、トラコーマ・クラミジア(Chlamydia trachomatus)、クロストリジウム・ボツリヌム(Clostridium botulinum)、クロストリジウム・ジフィシル(Clostridium difficile)、クロストリジウム・パーフリンゲンス(Clostridium perfringens)、コクシジオデス・イミチス(Coccidiodes immitis)、コリネバクテリウム・ジフテリア(Corynebacterium diptheriae)、クリプトコックス・ネオフォルマンス(Cryptococcus neoformans)、エンテロバクター・クロアカエ(Enterobacter cloacae)、エンテロコックス・フェカリス(Enterococcus faecalis)、エンテロコックス・ファエシウム(Enterococcus faecium)、エシェリヒア・コリ(Escherichia coli)、ヘモフィルス・インフルエンザ(Haemophilus influenzae)、ヘリコバクター・ピロリ(Helicobacter pylori)、ヒストプラスマ・カプスラツム(Histoplasma capsulatum)、クレブシエラ・ニューモニエ(Klebsiella pneumoniae)、リステリア・モノサイトゲネス(Listeria monocytogenes)、マイコバクテリウム・レプラエ(Mycobacterium leprae)、マイコバクテリウム・ツベルクローシス(Mycobacterium tuberculosis)、ナイセリア・ゴノローエ(Neisseria gonorrhoeae)、髄膜炎菌(Neisseria meningitidis)、ノカルジア・アステロイデス(Nocardia asteroides)、パスツレラ・ヘモリチカ(Pasteurella haemolytica)、パスツレラ・ムルトシダ(Pasteurella multocida)、ニューモシスティス・カリニー(Pneumocystis carinii)、プロテウス・ブルガリス(Proteus vulgaris)、シュードモナス・アエルギノーサ(Pseudomonas aeruginosa)、サルモネラ・ボンゴリ(Salmonella bongori)、サルモネラ・コレラスイス(Salmonella cholerasuis)、サルモネラ・エンテリカ(Salmonella enterica)、サルモネラ・パラチフィ(Salmonella paratyphi)、サルモネラ・チフィ(Salmonella typhi)、サルモネラ・チフィムリウム(Salmonella typhimurium)、スタフィロコッカス・オーレウス(Staphylococcus aureus)、リステリア・モノサイトゲネス(Listeria monocytogenes)、モクサレラ・カタルハリス(Moxarella catarrhalis)、シゲラ・ボイディ(Shigella boydii)、シゲラ・ディッセンリイ(Shigelladysenteriae)、シゲラ・フレックスネリ(Shigellaflexneri)、シゲラ・ソネイ(Shigella sonnei)、スタフィロコッカス・エピダーミディス(Staphylococcusepidermidis)、ストレプトコッカス・ニューモニエ(Streptococcuspneumoniae)、ストレプトコッカス・ミュータンス(Streptococcusmutans)、トレポネーマ・パリダム(Treponemapallidum)、エルシニア・エンテロコリチカ(Yersiniaenterocolitica)、エルシニア・ペスティス(Yersiniapestis)、および上記種のいずれかの属に属する任意の種からなる群から選ばれる、項２９０に記載の方法。
【０３１０】
２９４．上記試験細胞は、エシェリヒア・コリではない、項２９０に記載の方法。
【０３１１】
２９５．増殖に必要な生物学的経路に対する活性を有する化合物を同定する方法であって、
（ａ）致死量以下のレベルの、増殖に必要な遺伝子産物をコードする核酸に相補的なアンチセンス核酸を提供することにより細胞を感作し（ここで、上記遺伝子産物は、配列番号８〜３７９５からなる群から選ばれるヌクレオチド配列を含むアンチセンス核酸により発現が抑制される遺伝子産物に対して、デフォルトパラメータでＢＬＡＳＴＮバージョン２．０を用いて決定される場合に少なくとも７０％のヌクレオチド配列同一性を有する遺伝子産物、配列番号８〜３７９５からなる群から選ばれるヌクレオチド配列を含むアンチセンス核酸により発現が抑制される遺伝子産物をコードする核酸に対して、デフォルトパラメータでＢＬＡＳＴＮバージョン２．０を用いて決定される場合に少なくとも７０％のヌクレオチド配列同一性を有する核酸によりコードされる遺伝子産物、配列番号８〜３７９５からなる群から選ばれるヌクレオチド配列を含むアンチセンス核酸により発現が抑制される遺伝子産物に対して、デフォルトパラメータでＦＡＳＴＡバージョン３．０ｔ７８を用いて決定される場合に少なくとも２５％のアミノ酸同一性を有する遺伝子産物、配列番号８〜３７９５からなる群から選ばれる核酸に、ストリンジェントな条件下にてハイブリダイズするヌクレオチド配列を含む核酸によりコードされる遺伝子産物、配列番号８〜３７９５からなる群から選ばれる核酸に、穏やかな条件下にてハイブリダイズするヌクレオチド配列を含む核酸によりコードされる遺伝子産物、および配列番号８〜３７９５からなる群から選ばれる核酸により活性が抑制される遺伝子産物により、活性が補完され得る遺伝子産物からなる群から選ばれる）、
（ｂ）上記感作細胞を化合物と接触させ、
（ｃ）上記化合物が、上記アンチセンス核酸を含有しない細胞に比べて、上記感作細胞の成長と抑制する程度を決定する工程
を含む方法。
【０３１２】
２９６．上記決定工程は、上記化合物が非感作細胞の成長を抑制するよりも高度に、上記感作細胞の成長を抑制するかどうかを決定することを含む、項２９６に記載の方法。
【０３１３】
２９７．上記細胞は、細菌細胞、真菌細胞、植物細胞、および動物細胞からなる群から選ばれる、項２９５に記載の方法。
【０３１４】
２９８・上記細胞は、グラム陽性菌である、項２９５に記載の方法。
【０３１５】
２９９．上記グラム陽性菌は、スタフィロコッカススピーシーズ、ストレプトコッカススピーシーズ、エンテロコッカススピーシーズ、ミコバクテリウムスピーシーズ、クロストリジウムスピーシーズ、およびバチルススピーシーズからなる群から選ばれる、項２９８に記載の方法。
【０３１６】
３００．上記グラム陽性菌は、スタフィロコッカス・オーレウスである、項２９９に記載の方法。
【０３１７】
３０１．上記グラム陽性菌は、スタフィロコッカス・オーレウスＲＮ４５０およびスタフィロコッカス・オーレウスＲＮ４２２０からなる群から選ばれる、項２９８に記載の方法。
【０３１８】
３０２．上記細胞は、アナプラスマ・マルギナレ(Anaplasmamarginale)、アスペルギルス・フミガツス(Aspergillusfumigatus)、バチルス・アンスラシス(Bacillusanthracis)、バクテリオイデス・フラギリス(Bacterioidesfragilis)、百日咳菌(Bordetellapertussis)、ブルクホルデリア・セパシア(Burkholderiacepacia)、カンピロバクター・イェジュニィ(Campylobacterjejuni)、カンジダ・アルビカンス (Candidaalbicans)、カンジダ・グラブラタ(Candidaglabrata)（トルロプシス・グラブラタ(Toprulopsisglabrata)とも呼ばれる）、カンジダ・トロピカリス(Candidatropicalis)、カンジダ・パラプシロシス(Candidaparapsilosis)、カンジダ・ギルリエルモンジイ(Candidaguilliermondii)、カンジダ・クルセイ(Candidakrusei)、カンジダ・ケフィア(Candidakefyr)（カンジダ・シュードトロピカリス(Candidapseudotropicalis)とも呼ばれる）、カンジダ・デュブリニエンシス(Candida dubliniensis)、クラミジア・ニューモニエ(Chlamydia pneumoniae)、トラコーマ・クラミジア(Chlamydia trachomatus)、クロストリジウム・ボツリヌム(Clostridium botulinum)、クロストリジウム・ジフィシル(Clostridium difficile)、クロストリジウム・パーフリンゲンス(Clostridium perfringens)、コクシジオデス・イミチス(Coccidiodes immitis)、コリネバクテリウム・ジフテリア(Corynebacterium diptheriae)、クリプトコックス・ネオフォルマンス(Cryptococcus neoformans)、エンテロバクター・クロアカエ(Enterobacter cloacae)、エンテロコックス・フェカリス(Enterococcus faecalis)、エンテロコックス・ファエシウム(Enterococcus faecium)、エシェリヒア・コリ(Escherichia coli)、ヘモフィルス・インフルエンザ(Haemophilus influenzae)、ヘリコバクター・ピロリ(Helicobacter pylori)、ヒストプラスマ・カプスラツム(Histoplasma capsulatum)、クレブシエラ・ニューモニエ(Klebsiella pneumoniae)、リステリア・モノサイトゲネス(Listeria monocytogenes)、マイコバクテリウム・レプラエ(Mycobacterium leprae)、マイコバクテリウム・ツベルクローシス(Mycobacterium tuberculosis)、ナイセリア・ゴノローエ(Neisseria gonorrhoeae)、髄膜炎菌(Neisseria meningitidis)、ノカルジア・アステロイデス(Nocardia asteroides)、パスツレラ・ヘモリチカ(Pasteurella haemolytica)、パスツレラ・ムルトシダ(Pasteurella multocida)、ニューモシスティス・カリニー(Pneumocystis carinii)、プロテウス・ブルガリス(Proteus vulgaris)、シュードモナス・アエルギノーサ(Pseudomonas aeruginosa)、サルモネラ・ボンゴリ(Salmonella bongori)、サルモネラ・コレラスイス(Salmonella cholerasuis)、サルモネラ・エンテリカ(Salmonella enterica)、サルモネラ・パラチフィ(Salmonella paratyphi)、サルモネラ・チフィ(Salmonella typhi)、サルモネラ・チフィムリウム(Salmonella typhimurium)、スタフィロコッカス・オーレウス(Staphylococcus aureus)、リステリア・モノサイトゲネス(Listeria monocytogenes)、モクサレラ・カタルハリス(Moxarella catarrhalis)、シゲラ・ボイディ(Shigella boydii)、シゲラ・ディッセンリイ(Shigelladysenteriae)、シゲラ・フレックスネリ(Shigellaflexneri)、シゲラ・ソネイ(Shigellasonnei)、スタフィロコッカス・エピダーミディス(Staphylococcusepidermidis)、ストレプトコッカス・ニューモニエ(Streptococcuspneumoniae)、ストレプトコッカス・ミュータンス(Streptococcusmutans)、トレポネーマ・パリダム(Treponemapallidum)、エルシニア・エンテロコリチカ(Yersiniaenterocolitica)、エルシニア・ペスティス(Yersiniapestis)、および上記種のいずれかの属に属する任意の種からなる群から選ばれる、項２９５に記載の方法。
【０３１９】
３０３．上記細胞は、エシェリヒア・コリではない、項２９５に記載の方法。
【０３２０】
３０４．上記遺伝子産物が、エシェリヒア・コリ以外の生物由来である、項２９５に記載の方法。
【０３２１】
３０５．上記アンチセンス核酸は、誘導性プロモーターから転写される、項２９５に記載の方法。
【０３２２】
３０６．上記細胞を、上記誘導性プロモーターから上記アンチセンス核酸の発現を誘導する物質と接触させることをさらに含む方法であって、上記アンチセンス核酸は、致死量以下のレベルで発現される、項３０５に記載の方法。
【０３２３】
３０７．増殖抑制は、液体培養液の吸光度をモニターすることにより測定される、項２９５に記載の方法。
【０３２４】
３０８．上記遺伝子産物は、配列番号３８０１〜３８０５、４８６１〜５９１５、１００１３〜１４１１０からなる群から選ばれる配列に対して、デフォルトパラメータでＦＡＳＴＡバージョン３．０ｔ７８を用いて決定される場合に少なくとも２５％のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む、項２９５に記載の方法。
【０３２５】
３０９．上記遺伝子産物をコードする上記核酸は、配列番号３７９６〜３８００、３８０６〜４８６０、５９１６〜１００１２からなる群から選ばれるヌクレオチド配列に対して、デフォルトパラメータでＢＬＡＳＴＮバージョン２．０を用いて決定される場合に少なくとも７０％のヌクレオチド配列同一性を有する核酸を含む核酸、配列番号３７９６〜３８００、３８０６〜４８６０、５９１６〜１００１２からなる群から選ばれるヌクレオチド配列に、ストリンジェントな条件下にてハイブリダイズするヌクレオチド配列を含む核酸、および配列番号３７９６〜３８００、３８０６〜４８６０、５９１６〜１００１２からなる群から選ばれるヌクレオチド配列に、穏やかな条件下にてハイブリダイズするヌクレオチド配列を含む核酸からなる群から選ばれる核酸を含む、項２９５に記載の方法。
【０３２６】
３１０．項２９５に記載の方法を用いて同定される化合物。
【０３２７】
３１１．細胞増殖を抑制する能力を有する化合物を同定する方法であって、
（ａ）細胞を、上記細胞の増殖に必要な遺伝子産物の活性またはレベルを低減させる物質と接触させ（ここで、上記遺伝子産物は、配列番号８〜３７９５からなる群から選ばれるヌクレオチド配列を含むアンチセンス核酸により発現が抑制される遺伝子産物に対して、デフォルトパラメータでＢＬＡＳＴＮバージョン２．０を用いて決定される場合に少なくとも７０％のヌクレオチド配列同一性を有する遺伝子産物、配列番号８〜３７９５からなる群から選ばれるヌクレオチド配列を含むアンチセンス核酸により発現が抑制される遺伝子産物をコードする核酸に対して、デフォルトパラメータでＢＬＡＳＴＮバージョン２．０を用いて決定される場合に少なくとも７０％のヌクレオチド配列同一性を有する核酸によりコードされる遺伝子産物、配列番号８〜３７９５からなる群から選ばれるヌクレオチド配列を含むアンチセンス核酸により発現が抑制される遺伝子産物に対して、デフォルトパラメータでＦＡＳＴＡバージョン３．０ｔ７８を用いて決定される場合に少なくとも２５％のアミノ酸同一性を有する遺伝子産物、配列番号８〜３７９５からなる群から選ばれる核酸に、ストリンジェントな条件下にてハイブリダイズするヌクレオチド配列を含む核酸によりコードされる遺伝子産物、配列番号８〜３７９５からなる群から選ばれる核酸に、穏やかな条件下にてハイブリダイズするヌクレオチド配列を含む核酸によりコードされる遺伝子産物、および配列番号８〜３７９５からなる群から選ばれる核酸により活性が抑制される遺伝子産物により、活性が補完され得る遺伝子産物からなる群から選ばれる）、
（ｂ）上記細胞を化合物と接触させ、
（ｃ）上記化合物が、上記物質と接触させていない細胞に比べて、上記接触細胞の増殖を低減させる度合いを決定する工程
を含む方法。
【０３２８】
３１２．上記決定工程は、上記化合物が上記物質と接触させていない細胞の増殖を低減させるよりも高度に、上記化合物が上記接触細胞の増殖を低減させるかどうかを決定することを含む、項３１１に記載の方法。
【０３２９】
３１３．上記細胞は、アナプラスマ・マルギナレ(Anaplasmamarginale)、アスペルギルス・フミガツス(Aspergillusfumigatus)、バチルス・アンスラシス(Bacillusanthracis)、バクテリオイデス・フラギリス(Bacterioidesfragilis)、百日咳菌(Bordetellapertussis)、ブルクホルデリア・セパシア(Burkholderiacepacia)、カンピロバクター・イェジュニィ(Campylobacterjejuni)、カンジダ・アルビカンス (Candidaalbicans)、カンジダ・グラブラタ(Candidaglabrata)（トルロプシス・グラブラタ(Toprulopsisglabrata)とも呼ばれる）、カンジダ・トロピカリス(Candidatropicalis)、カンジダ・パラプシロシス(Candidaparapsilosis)、カンジダ・ギルリエルモンジイ(Candidaguilliermondii)、カンジダ・クルセイ(Candidakrusei)、カンジダ・ケフィア(Candidakefyr)（カンジダ・シュードトロピカリス(Candidapseudotropicalis)とも呼ばれる）、カンジダ・デュブリニエンシス(Candida dubliniensis)、クラミジア・ニューモニエ(Chlamydia pneumoniae)、トラコーマ・クラミジア(Chlamydia trachomatus)、クロストリジウム・ボツリヌム(Clostridium botulinum)、クロストリジウム・ジフィシル(Clostridium difficile)、クロストリジウム・パーフリンゲンス(Clostridium perfringens)、コクシジオデス・イミチス(Coccidiodes immitis)、コリネバクテリウム・ジフテリア(Corynebacterium diptheriae)、クリプトコックス・ネオフォルマンス(Cryptococcus neoformans)、エンテロバクター・クロアカエ(Enterobacter cloacae)、エンテロコックス・フェカリス(Enterococcus faecalis)、エンテロコックス・ファエシウム(Enterococcus faecium)、エシェリヒア・コリ(Escherichia coli)、ヘモフィルス・インフルエンザ(Haemophilus influenzae)、ヘリコバクター・ピロリ(Helicobacter pylori)、ヒストプラスマ・カプスラツム(Histoplasma capsulatum)、クレブシエラ・ニューモニエ(Klebsiella pneumoniae)、リステリア・モノサイトゲネス(Listeria monocytogenes)、マイコバクテリウム・レプラエ(Mycobacterium leprae)、マイコバクテリウム・ツベルクローシス(Mycobacterium tuberculosis)、ナイセリア・ゴノローエ(Neisseria gonorrhoeae)、髄膜炎菌(Neisseria meningitidis)、ノカルジア・アステロイデス(Nocardia asteroides)、パスツレラ・ヘモリチカ(Pasteurella haemolytica)、パスツレラ・ムルトシダ(Pasteurella multocida)、ニューモシスティス・カリニー(Pneumocystis carinii)、プロテウス・ブルガリス(Proteus vulgaris)、シュードモナス・アエルギノーサ(Pseudomonas aeruginosa)、サルモネラ・ボンゴリ(Salmonella bongori)、サルモネラ・コレラスイス(Salmonella cholerasuis)、サルモネラ・エンテリカ(Salmonella enterica)、サルモネラ・パラチフィ(Salmonella paratyphi)、サルモネラ・チフィ(Salmonella typhi)、サルモネラ・チフィムリウム(Salmonella typhimurium)、スタフィロコッカス・オーレウス(Staphylococcus aureus)、リステリア・モノサイトゲネス(Listeria monocytogenes)、モクサレラ・カタルハリス(Moxarella catarrhalis)、シゲラ・ボイディ(Shigella boydii)、シゲラ・ディッセンリイ(Shigelladysenteriae)、シゲラ・フレックスネリ(Shigellaflexneri)、シゲラ・ソネイ(Shigellasonnei)、スタフィロコッカス・エピダーミディス(Staphylococcusepidermidis)、ストレプトコッカス・ニューモニエ(Streptococcuspneumoniae)、ストレプトコッカス・ミュータンス(Streptococcusmutans)、トレポネーマ・パリダム(Treponemapallidum)、エルシニア・エンテロコリチカ(Yersiniaenterocolitica)、エルシニア・ペスティス(Yersiniapestis)、および上記種のいずれかの属に属する任意の種からなる群から選ばれる、項３１１に記載の方法。
【０３３０】
３１４．上記細胞は、エシェリヒア・コリではない、項３１１に記載の方法。
【０３３１】
３１５．上記遺伝子産物は、エシェリヒア・コリ以外の生物由来である、項３１１に記載の方法。
【０３３２】
３１６．上記細胞の増殖に必要な遺伝子産物の活性またはレベルを低減させる上記物質は、増殖に必要な遺伝子またはオペロンに対するアンチセンス核酸を含む、項３１１に記載の方法。
【０３３３】
３１７．上記細胞の増殖に必要な遺伝子産物の活性またはレベルを低減させる上記物質は、細胞の成長または増殖を抑制することが知られている化合物を含む、項３１１に記載の方法。
【０３３４】
３１８．上記細胞は、上記細胞の増殖に必要な上記遺伝子産物の活性またはレベルを低減させる突然変異を含有する、項３１１に記載の方法。
【０３３５】
３１９．上記突然変異は、温度感受性突然変異である、項３１１に記載の方法。
【０３３６】
３２０．上記遺伝子産物は、配列番号３８０１〜３８０５、４８６１〜５９１５、１００１３〜１４１１０からなる群から選ばれるアミノ酸配列に対して、デフォルトパラメータでＦＡＳＴＡバージョン３．０ｔ７８を用いて決定される場合に少なくとも２５％のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む、項３１１に記載の方法。
【０３３７】
３２１．項３１１に記載の方法を用いて同定される化合物。
【０３３８】
３２２．増殖に必要な遺伝子産物または増殖に必要な遺伝子産物をコードする遺伝子が見出される生物学的経路を同定する方法であって、
（ａ）試験細胞において、致死量以下のレベルの、増殖に必要な遺伝子産物をコードする上記遺伝子、または上記増殖に必要な遺伝子産物の活性を抑制するか、またはそのレベルを低減させるアンチセンス核酸を提供し（ここで、上記増殖に必要な遺伝子産物は、配列番号８〜３７９５からなる群から選ばれるヌクレオチド配列を含むアンチセンス核酸により発現が抑制される遺伝子産物に対して、デフォルトパラメータでＢＬＡＳＴＮバージョン２．０を用いて決定される場合に少なくとも７０％のヌクレオチド配列同一性を有する遺伝子産物、配列番号８〜３７９５からなる群から選ばれるヌクレオチド配列を含むアンチセンス核酸により発現が抑制される遺伝子産物をコードする核酸に対して、デフォルトパラメータでＢＬＡＳＴＮバージョン２．０を用いて決定される場合に少なくとも７０％のヌクレオチド配列同一性を有する核酸によりコードされる遺伝子産物、配列番号８〜３７９５からなる群から選ばれるヌクレオチド配列を含むアンチセンス核酸により発現が抑制される遺伝子産物に対して、デフォルトパラメータでＦＡＳＴＡバージョン３．０ｔ７８を用いて決定される場合に少なくとも２５％のアミノ酸同一性を有する遺伝子産物、配列番号８〜３７９５からなる群から選ばれる核酸に、ストリンジェントな条件下にてハイブリダイズするヌクレオチド配列を含む核酸によりコードされる遺伝子産物、配列番号８〜３７９５からなる群から選ばれる核酸に、穏やかな条件下にてハイブリダイズするヌクレオチド配列を含む核酸によりコードされる遺伝子産物、および配列番号８〜３７９５からなる群から選ばれる核酸により活性が抑制される遺伝子産物により、活性が補完され得る遺伝子産物からなる群から選ばれる）、
（ｂ）上記試験細胞を、細胞の成長または増殖を抑制することが知られている化合物と接触させ（ここで、上記化合物が作用する生物学的経路は既知である）、
（ｃ）上記化合物が、上記アンチセンス核酸を含有しない細胞に比べて、上記接触細胞の増殖を抑制する度合いを決定する工程
を含む方法。
【０３３９】
３２３．上記決定工程は、上記試験細胞が、上記致死量以下のレベルの上記アンチセンス核酸を発現しない細胞よりも、上記化合物に対して実質的に高度な感受性を有するかどうかを決定することを含む、項３２２に記載の方法。
【０３４０】
３２４．上記遺伝子産物は、配列番号３８０１〜３８０５、４８６１〜５９１５、１００１３〜１４１１０からなる群から選ばれるアミノ酸配列に対して、デフォルトパラメータでＦＡＳＴＡバージョン３．０ｔ７８を用いて決定される場合に少なくとも２５％のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む、項３２２に記載の方法。
【０３４１】
３２５．上記試験細胞は、アナプラスマ・マルギナレ(Anaplasma marginale)、アスペルギルス・フミガツス(Aspergillus fumigatus)、バチルス・アンスラシス(Bacillus anthracis)、バクテリオイデス・フラギリス(Bacterioides fragilis)、百日咳菌(Bordetella pertussis)、ブルクホルデリア・セパシア(Burkholderia cepacia)、カンピロバクター・イェジュニィ(Campylobacter jejuni)、カンジダ・アルビカンス (Candida albicans)、カンジダ・グラブラタ(Candida glabrata)（トルロプシス・グラブラタ(Toprulopsis glabrata)とも呼ばれる）、カンジダ・トロピカリス(Candida tropicalis)、カンジダ・パラプシロシス(Candida parapsilosis)、カンジダ・ギルリエルモンジイ(Candida guilliermondii)、カンジダ・クルセイ(Candida krusei)、カンジダ・ケフィア(Candidakefyr)（カンジダ・シュードトロピカリス(Candidapseudotropicalis)とも呼ばれる）、カンジダ・デュブリニエンシス(Candida dubliniensis)、クラミジア・ニューモニエ(Chlamydia pneumoniae)、トラコーマ・クラミジア(Chlamydia trachomatus)、クロストリジウム・ボツリヌム(Clostridium botulinum)、クロストリジウム・ジフィシル(Clostridium difficile)、クロストリジウム・パーフリンゲンス(Clostridium perfringens)、コクシジオデス・イミチス(Coccidiodes immitis)、コリネバクテリウム・ジフテリア(Corynebacterium diptheriae)、クリプトコックス・ネオフォルマンス(Cryptococcus neoformans)、エンテロバクター・クロアカエ(Enterobacter cloacae)、エンテロコックス・フェカリス(Enterococcus faecalis)、エンテロコックス・ファエシウム(Enterococcus faecium)、エシェリヒア・コリ(Escherichia coli)、ヘモフィルス・インフルエンザ(Haemophilus influenzae)、ヘリコバクター・ピロリ(Helicobacter pylori)、ヒストプラスマ・カプスラツム(Histoplasma capsulatum)、クレブシエラ・ニューモニエ(Klebsiella pneumoniae)、リステリア・モノサイトゲネス(Listeria monocytogenes)、マイコバクテリウム・レプラエ(Mycobacterium leprae)、マイコバクテリウム・ツベルクローシス(Mycobacterium tuberculosis)、ナイセリア・ゴノローエ(Neisseria gonorrhoeae)、髄膜炎菌(Neisseria meningitidis)、ノカルジア・アステロイデス(Nocardia asteroides)、パスツレラ・ヘモリチカ(Pasteurella haemolytica)、パスツレラ・ムルトシダ(Pasteurella multocida)、ニューモシスティス・カリニー(Pneumocystis carinii)、プロテウス・ブルガリス(Proteus vulgaris)、シュードモナス・アエルギノーサ(Pseudomonas aeruginosa)、サルモネラ・ボンゴリ(Salmonella bongori)、サルモネラ・コレラスイス(Salmonella cholerasuis)、サルモネラ・エンテリカ(Salmonella enterica)、サルモネラ・パラチフィ(Salmonella paratyphi)、サルモネラ・チフィ(Salmonella typhi)、サルモネラ・チフィムリウム(Salmonella typhimurium)、スタフィロコッカス・オーレウス(Staphylococcus aureus)、リステリア・モノサイトゲネス(Listeria monocytogenes)、モクサレラ・カタルハリス(Moxarella catarrhalis)、シゲラ・ボイディ(Shigella boydii)、シゲラ・ディッセンリイ(Shigelladysenteriae)、シゲラ・フレックスネリ(Shigellaflexneri)、シゲラ・ソネイ(Shigella sonnei)、スタフィロコッカス・エピダーミディス(Staphylococcusepidermidis)、ストレプトコッカス・ニューモニエ(Streptococcuspneumoniae)、ストレプトコッカス・ミュータンス(Streptococcusmutans)、トレポネーマ・パリダム(Treponemapallidum)、エルシニア・エンテロコリチカ(Yersiniaenterocolitica)、エルシニア・ペスティス(Yersiniapestis)、および上記種のいずれかの属に属する任意の種からなる群から選ばれる、項３２２に記載の方法。
【０３４２】
３２６．上記試験細胞は、エシェリヒア・コリではない、項３２２に記載の方法。
【０３４３】
３２７．上記遺伝子産物は、エシェリヒア・コリ以外の生物由来である、項３２２に記載の方法。
【０３４４】
３２８．試験化合物が作用する生物学的経路を決定する方法であって、
（ａ）細胞において、致死量以下のレベルの増殖に必要な核酸に相補的なアンチセンス核酸を提供し、それにより感作細胞を生産し（ここで、上記アンチセンス核酸は、配列番号８〜３７９５からなる群から選ばれるヌクレオチド配列またはそれらの増殖抑制部分に対して、デフォルトパラメータでＢＬＡＳＴＮバージョン２．０を用いて決定される場合に少なくとも７０％のヌクレオチド配列同一性を有する核酸、配列番号８〜３７９５からなる群から選ばれる核酸に、ストリンジェントな条件下にてハイブリダイズするヌクレオチド配列を含む核酸、および配列番号８〜３７９５からなる群から選ばれる核酸に、穏やかな条件下にてハイブリダイズするヌクレオチド配列を含む核酸からなる群から選ばれ、また上記増殖に必要な核酸または上記増殖に必要なポリペプチドによりコードされりタンパク質が見出される生物学的経路は既知である）、
（ｂ）上記細胞を、上記化合物と接触させ、
（ｃ）上記化合物が、上記アンチセンス核酸を含有しない細胞に比べて、上記感作細胞の増殖を抑制する度合いを決定する工程
とを含む方法。
【０３４５】
３２９．上記決定工程は、上記感作細胞が、上記致死量以下のレベルの上記アンチセンス核酸を発現しない細胞よりも、上記試験化合物に対して実質的に高度な感受性を有するかどうかを決定することを含む、項３２８に記載の方法。
【０３４６】
３３０．（ｄ）第２の細胞において、致死量以下のレベルの、第２の増殖に必要な核酸に相補的な第２のアンチセンス核酸を提供し（ここで、第２の増殖に必要な核酸は、工程（ａ）における上記増殖に必要な核酸と異なる生物学的経路に存在する）、
（ｅ）上記第２の細胞が、上記致死量以下のレベルの上記第２のアンチセンス核酸を発現しない細胞よりも、上記試験化合物に対して実質的に高度な感受性を有するかどうかを決定すること
を含み、上記感作細胞が、上記第２の細胞よりも、上記試験化合物に対して実質的に高度な感受性を有する場合、上記試験化合物は、工程（ａ）のアンチセンス核酸が作用する生物学的経路に特異的である、項３２８に記載の方法。
【０３４７】
３３１．上記感作細胞は、アナプラスマ・マルギナレ(Anaplasma marginale)、アスペルギルス・フミガツス(Aspergillus fumigatus)、バチルス・アンスラシス(Bacillus anthracis)、バクテリオイデス・フラギリス(Bacterioides fragilis)、百日咳菌(Bordetella pertussis)、ブルクホルデリア・セパシア(Burkholderia cepacia)、カンピロバクター・イェジュニィ(Campylobacter jejuni)、カンジダ・アルビカンス (Candida albicans)、カンジダ・グラブラタ(Candida glabrata)（トルロプシス・グラブラタ(Toprulopsis glabrata)とも呼ばれる）、カンジダ・トロピカリス(Candida tropicalis)、カンジダ・パラプシロシス(Candida parapsilosis)、カンジダ・ギルリエルモンジイ(Candida guilliermondii)、カンジダ・クルセイ(Candida krusei)、カンジダ・ケフィア(Candidakefyr)（カンジダ・シュードトロピカリス(Candidapseudotropicalis)とも呼ばれる）、カンジダ・デュブリニエンシス(Candida dubliniensis)、クラミジア・ニューモニエ(Chlamydia pneumoniae)、トラコーマ・クラミジア(Chlamydia trachomatus)、クロストリジウム・ボツリヌム(Clostridium botulinum)、クロストリジウム・ジフィシル(Clostridium difficile)、クロストリジウム・パーフリンゲンス(Clostridium perfringens)、コクシジオデス・イミチス(Coccidiodes immitis)、コリネバクテリウム・ジフテリア(Corynebacterium diptheriae)、クリプトコックス・ネオフォルマンス(Cryptococcus neoformans)、エンテロバクター・クロアカエ(Enterobacter cloacae)、エンテロコックス・フェカリス(Enterococcus faecalis)、エンテロコックス・ファエシウム(Enterococcus faecium)、エシェリヒア・コリ(Escherichia coli)、ヘモフィルス・インフルエンザ(Haemophilus influenzae)、ヘリコバクター・ピロリ(Helicobacter pylori)、ヒストプラスマ・カプスラツム(Histoplasma capsulatum)、クレブシエラ・ニューモニエ(Klebsiella pneumoniae)、リステリア・モノサイトゲネス(Listeria monocytogenes)、マイコバクテリウム・レプラエ(Mycobacterium leprae)、マイコバクテリウム・ツベルクローシス(Mycobacterium tuberculosis)、ナイセリア・ゴノローエ(Neisseria gonorrhoeae)、髄膜炎菌(Neisseria meningitidis)、ノカルジア・アステロイデス(Nocardia asteroides)、パスツレラ・ヘモリチカ(Pasteurella haemolytica)、パスツレラ・ムルトシダ(Pasteurella multocida)、ニューモシスティス・カリニー(Pneumocystis carinii)、プロテウス・ブルガリス(Proteus vulgaris)、シュードモナス・アエルギノーサ(Pseudomonas aeruginosa)、サルモネラ・ボンゴリ(Salmonella bongori)、サルモネラ・コレラスイス(Salmonella cholerasuis)、サルモネラ・エンテリカ(Salmonella enterica)、サルモネラ・パラチフィ(Salmonella paratyphi)、サルモネラ・チフィ(Salmonella typhi)、サルモネラ・チフィムリウム(Salmonella typhimurium)、スタフィロコッカス・オーレウス(Staphylococcus aureus)、リステリア・モノサイトゲネス(Listeria monocytogenes)、モクサレラ・カタルハリス(Moxarella catarrhalis)、シゲラ・ボイディ(Shigella boydii)、シゲラ・ディッセンリイ(Shigelladysenteriae)、シゲラ・フレックスネリ(Shigellaflexneri)、シゲラ・ソネイ(Shigellasonnei)、スタフィロコッカス・エピダーミディス(Staphylococcusepidermidis)、ストレプトコッカス・ニューモニエ(Streptococcuspneumoniae)、ストレプトコッカス・ミュータンス(Streptococcusmutans)、トレポネーマ・パリダム(Treponemapallidum)、エルシニア・エンテロコリチカ(Yersiniaenterocolitica)、エルシニア・ペスティス(Yersiniapestis)、および上記種のいずれかの属に属する任意の種からなる群から選ばれる、項３２８に記載の方法。
【０３４８】
３３２．上記感作細胞は、エシェリヒア・コリではない、項３２８に記載の方法。
【０３４９】
３３３．上記増殖に必要な核酸は、エシェリヒア・コリ以外の生物由来である、項３２８に記載の方法。
【０３５０】
３３４．増殖に必要な遺伝子産物をコードする遺伝子、または増殖に必要な遺伝子産物と相互作用することにより増殖を抑制する化合物であって、上記遺伝子産物は、配列番号８〜３７９５からなる群から選ばれるヌクレオチド配列を含むアンチセンス核酸により発現が抑制される遺伝子産物に対して、デフォルトパラメータでＢＬＡＳＴＮバージョン２．０を用いて決定される場合に少なくとも７０％のヌクレオチド配列同一性を有する遺伝子産物、配列番号８〜３７９５からなる群から選ばれるヌクレオチド配列を含むアンチセンス核酸により発現が抑制される遺伝子産物をコードする核酸に対して、デフォルトパラメータでＢＬＡＳＴＮバージョン２．０を用いて決定される場合に少なくとも７０％のヌクレオチド配列同一性を有する核酸によりコードされる遺伝子産物、配列番号８〜３７９５からなる群から選ばれるヌクレオチド配列を含むアンチセンス核酸により発現が抑制される遺伝子産物に対して、デフォルトパラメータでＦＡＳＴＡバージョン３．０ｔ７８を用いて決定される場合に少なくとも２５％のアミノ酸同一性を有する遺伝子産物、配列番号８〜３７９５からなる群から選ばれる核酸に、ストリンジェントな条件下にてハイブリダイズするヌクレオチド配列を含む核酸によりコードされる遺伝子産物、配列番号８〜３７９５からなる群から選ばれる核酸に、穏やかな条件下にてハイブリダイズするヌクレオチド配列を含む核酸によりコードされる遺伝子産物、および配列番号８〜３７９５からなる群から選ばれる核酸により活性が抑制される遺伝子産物により、活性が補完され得る遺伝子産物からなる群から選ばれる化合物。
【０３５１】
３３５．上記遺伝子産物は、配列番号３８０１〜３８０５、４８６１〜５９１５、１００１３〜１４１１０からなる群から選ばれる配列に対して、デフォルトパラメータでＦＡＳＴＡバージョン３．０ｔ７８を用いて決定される場合に少なくとも２５％のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む、項３３４に記載の化合物。
【０３５２】
３３６．上記遺伝子は、配列番号３７９６〜３８００、３８０６〜４８６０、５９１６〜１００１２からなる群から選ばれるヌクレオチド配列に対して、デフォルトパラメータでＢＬＡＳＴＮバージョン２．０を用いて決定される場合に少なくとも７０％のヌクレオチド配列同一性を有する核酸を含む核酸、配列番号３７９６〜３８００、３８０６〜４８６０、５９１６〜１００１２からなる群から選ばれるヌクレオチド配列に、ストリンジェントな条件下にてハイブリダイズするヌクレオチド配列を含む核酸、および配列番号３７９６〜３８００、３８０６〜４８６０、５９１６〜１００１２からなる群から選ばれるヌクレオチド配列に、穏やかな条件下にてハイブリダイズするヌクレオチド配列を含む核酸からなる群から選ばれる核酸を含む、項３３４に記載の方法。
【０３５３】
３３７．抗生物質を製造する方法であって、
１つまたはそれ以上の候補化合物をスクリーニングして、増殖に必要な遺伝子産物の活性またはレベルを低減させる化合物を同定する工程（ここで、上記遺伝子産物は、配列番号８〜３７９５からなる群から選ばれるヌクレオチド配列を含むアンチセンス核酸により発現が抑制される遺伝子産物に対して、デフォルトパラメータでＢＬＡＳＴＮバージョン２．０を用いて決定される場合に少なくとも７０％のヌクレオチド配列同一性を有する遺伝子産物、配列番号８〜３７９５からなる群から選ばれるヌクレオチド配列を含むアンチセンス核酸により発現が抑制される遺伝子産物をコードする核酸に対して、デフォルトパラメータでＢＬＡＳＴＮバージョン２．０を用いて決定される場合に少なくとも７０％のヌクレオチド配列同一性を有する核酸によりコードされる遺伝子産物、配列番号８〜３７９５からなる群から選ばれるヌクレオチド配列を含むアンチセンス核酸により発現が抑制される遺伝子産物に対して、デフォルトパラメータでＦＡＳＴＡバージョン３．０ｔ７８を用いて決定される場合に少なくとも２５％のアミノ酸同一性を有する遺伝子産物、配列番号８〜３７９５からなる群から選ばれる核酸に、ストリンジェントな条件下にてハイブリダイズするヌクレオチド配列を含む核酸によりコードされる遺伝子産物、配列番号８〜３７９５からなる群から選ばれる核酸に、穏やかな条件下にてハイブリダイズするヌクレオチド配列を含む核酸によりコードされる遺伝子産物、および配列番号８〜３７９５からなる群から選ばれる核酸により活性が抑制される遺伝子産物により、活性が補完され得る遺伝子産物からなる群から選ばれる）と、
このように同定された化合物を製造する工程
とを含む方法。
【０３５４】
３３８．上記スクリーニング工程は、項２０５、２１１、２２２、２７５、２９０、３１１の方法のいずれか１つを実施することを含む、項３３７に記載の方法。
【０３５５】
３３９．上記遺伝子産物は、配列番号３８０１〜３８０５、４８６１〜５９１５、１００１３〜１４１１０からなる群から選ばれる配列に対して、デフォルトパラメータでＦＡＳＴＡバージョン３．０ｔ７８を用いて決定される場合に少なくとも２５％のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む、項３３７に記載の方法。
【０３５６】
３４０．被験体における細胞増殖を抑制する方法であって、有効量の、上記細胞の増殖に必要な遺伝子産物の活性またはレベルを低減させる化合物を投与すること（ここで、上記遺伝子産物は、配列番号８〜３７９５からなる群から選ばれるヌクレオチド配列を含むアンチセンス核酸により発現が抑制される遺伝子産物に対して、デフォルトパラメータでＢＬＡＳＴＮバージョン２．０を用いて決定される場合に少なくとも７０％のヌクレオチド配列同一性を有する遺伝子産物、配列番号８〜３７９５からなる群から選ばれるヌクレオチド配列を含むアンチセンス核酸により発現が抑制される遺伝子産物をコードする核酸に対して、デフォルトパラメータでＢＬＡＳＴＮバージョン２．０を用いて決定される場合に少なくとも７０％のヌクレオチド配列同一性を有する核酸によりコードされる遺伝子産物、配列番号８〜３７９５からなる群から選ばれるヌクレオチド配列を含むアンチセンス核酸により発現が抑制される遺伝子産物に対して、デフォルトパラメータでＦＡＳＴＡバージョン３．０ｔ７８を用いて決定される場合に少なくとも２５％のアミノ酸同一性を有する遺伝子産物、配列番号８〜３７９５からなる群から選ばれる核酸に、ストリンジェントな条件下にてハイブリダイズするヌクレオチド配列を含む核酸によりコードされる遺伝子産物、配列番号８〜３７９５からなる群から選ばれる核酸に、穏やかな条件下にてハイブリダイズするヌクレオチド配列を含む核酸によりコードされる遺伝子産物、および配列番号８〜３７９５からなる群から選ばれる核酸により活性が抑制される遺伝子産物により、活性が補完され得る遺伝子産物からなる群から選ばれる）を含む方法。
【０３５７】
３４１．上記被験体は、脊椎動物、哺乳動物、鳥類、およびヒトからなる群から選ばれる、項３４０に記載の方法。
【０３５８】
３４２．上記遺伝子産物は、配列番号３８０１〜３８０５、４８６１〜５９１５、１００１３〜１４１１０からなる群から選ばれる配列に対して、デフォルトパラメータでＦＡＳＴＡバージョン３．０ｔ７８を用いて決定される場合に少なくとも２５％のアミノ酸同一性を有するポリペプチドを含む、項３４０に記載の方法。
【０３５９】
３４３．上記細胞は、アナプラスマ・マルギナレ(Anaplasmamarginale)、アスペルギルス・フミガツス(Aspergillusfumigatus)、バチルス・アンスラシス(Bacillusanthracis)、バクテリオイデス・フラギリス(Bacterioidesfragilis)、百日咳菌(Bordetella pertussis)、ブルクホルデリア・セパシア(Burkholderia cepacia)、カンピロバクター・イェジュニィ(Campylobacter jejuni)、カンジダ・アルビカンス (Candida albicans)、カンジダ・グラブラタ(Candida glabrata)（トルロプシス・グラブラタ(Toprulopsis glabrata)とも呼ばれる）、カンジダ・トロピカリス(Candida tropicalis)、カンジダ・パラプシロシス(Candida parapsilosis)、カンジダ・ギルリエルモンジイ(Candida guilliermondii)、カンジダ・クルセイ(Candida krusei)、カンジダ・ケフィア(Candida kefyr)（カンジダ・シュードトロピカリス(Candida pseudotropicalis)とも呼ばれる）、カンジダ・デュブリニエンシス(Candida dubliniensis)、クラミジア・ニューモニエ(Chlamydia pneumoniae)、トラコーマ・クラミジア(Chlamydia trachomatus)、クロストリジウム・ボツリヌム(Clostridium botulinum)、クロストリジウム・ジフィシル(Clostridium difficile)、クロストリジウム・パーフリンゲンス(Clostridium perfringens)、コクシジオデス・イミチス(Coccidiodes immitis)、コリネバクテリウム・ジフテリア(Corynebacterium diptheriae)、クリプトコックス・ネオフォルマンス(Cryptococcus neoformans)、エンテロバクター・クロアカエ(Enterobacter cloacae)、エンテロコックス・フェカリス(Enterococcus faecalis)、エンテロコックス・ファエシウム(Enterococcus faecium)、エシェリヒア・コリ(Escherichia coli)、ヘモフィルス・インフルエンザ(Haemophilus influenzae)、ヘリコバクター・ピロリ(Helicobacter pylori)、ヒストプラスマ・カプスラツム(Histoplasma capsulatum)、クレブシエラ・ニューモニエ(Klebsiella pneumoniae)、リステリア・モノサイトゲネス(Listeria monocytogenes)、マイコバクテリウム・レプラエ(Mycobacterium leprae)、マイコバクテリウム・ツベルクローシス(Mycobacteriumtuberculosis)、ナイセリア・ゴノローエ(Neisseriagonorrhoeae)、髄膜炎菌(Neisseriameningitidis)、ノカルジア・アステロイデス(Nocardiaasteroides)、パスツレラ・ヘモリチカ(Pasteurellahaemolytica)、パスツレラ・ムルトシダ(Pasteurellamultocida)、ニューモシスティス・カリニー(Pneumocystiscarinii)、プロテウス・ブルガリス(Proteusvulgaris)、シュードモナス・アエルギノーサ(Pseudomonasaeruginosa)、サルモネラ・ボンゴリ(Salmonellabongori)、サルモネラ・コレラスイス(Salmonellacholerasuis)、サルモネラ・エンテリカ(Salmonellaenterica)、サルモネラ・パラチフィ(Salmonellaparatyphi)、サルモネラ・チフィ(Salmonellatyphi)、サルモネラ・チフィムリウム(Salmonellatyphimurium)、スタフィロコッカス・オーレウス(Staphylococcusaureus)、リステリア・モノサイトゲネス(Listeriamonocytogenes)、モクサレラ・カタルハリス(Moxarellacatarrhalis)、シゲラ・ボイディ(Shigellaboydii)、シゲラ・ディッセンリイ(Shigelladysenteriae)、シゲラ・フレックスネリ(Shigellaflexneri)、シゲラ・ソネイ(Shigellasonnei)、スタフィロコッカス・エピダーミディス(Staphylococcusepidermidis)、ストレプトコッカス・ニューモニエ(Streptococcuspneumoniae)、ストレプトコッカス・ミュータンス(Streptococcusmutans)、トレポネーマ・パリダム(Treponemapallidum)、エルシニア・エンテロコリチカ(Yersiniaenterocolitica)、エルシニア・ペスティス(Yersiniapestis)、および上記種のいずれかの属に属する任意の種からなる群から選ばれる、項３４０に記載の方法。
【０３６０】
３４４．上記細胞は、エシェリヒア・コリではない、項３４０に記載の方法。
【０３６１】
３４５．上記遺伝子産物は、エシェリヒア・コリ以外の生物由来である、項３４０に記載の方法。
【０３６２】
定義
「生物学的経路」とは、遺伝子産物または遺伝子産物のサブセットにより遂行される任意の個々別々の細胞機能または過程を意味する。生物学的経路としては、同化、異化、酵素的、生化学的および代謝経路、ならびに細胞構造、例えば細胞壁の生成に関与する経路が挙げられる。通常は細胞または微生物の増殖に必要な生物学的経路としては、細胞分裂、ＤＮＡ合成および複製、ＲＮＡ合成（転写）、タンパク質合成（翻訳）、タンパク質プロセシング、タンパク質輸送、脂肪酸生合成、電子伝達系、細胞壁合成、細胞膜生成、合成および維持等が挙げられるが、これらに限定されない。
【０３６３】
「遺伝子または遺伝子産物の活性を抑制する」とは、遺伝子の発現を減少するような方法で、遺伝子の産物のレベルまたは活性を低減するような方法で、または遺伝子もしくは遺伝子産物とその活性に必要な他の生物学的分子との相互作用を抑制するような方法で遺伝子または遺伝子産物の機能を妨害する能力を有することを意味する。遺伝子の活性を抑制する物質としては、遺伝子の転写を抑制する物質、遺伝子の転写物のプロセシングを抑制する物質、遺伝子の転写物の安定性を低減する物質、および遺伝子から転写されたｍＲＮＡの翻訳を抑制する物質が挙げられる。微生物中では、遺伝子の活性を抑制する物質は、遺伝子が存在するオペロンの発現を低減するか、または遺伝子産物のレベルまたは活性を低減するためにオペロンＲＮＡのフォールディングまたはプロセシングを変えるよう作用し得る。遺伝子産物は、非翻訳ＲＮＡ（例えばリボソームＲＮＡ）、翻訳ＲＮＡ（ｍＲＮＡ）または遺伝子ｍＲＮＡの翻訳に起因するタンパク質産物であり得る。本発明に特に有益なのは、特異的にハイブリダイズするオペロンまたは遺伝子に対する活性を有するアンチセンスＲＮＡである。
【０３６４】
「遺伝子産物に対する活性」とは、細胞中での遺伝子産物の機能を抑制するか、またはレベルまたは活性を低減する能力を有することを意味する。この例としては、遺伝子産物の酵素活性の抑制、またはその活性に必要な他の生物学的分子と相互作用する、遺伝子産物の能力、例えば多量体構造への遺伝子産物の集合の抑制が挙げられるが、これらに限定されない。
【０３６５】
「タンパク質に対する活性」とは、細胞中でのタンパク質の機能を抑制するか、またはレベルまたは活性を低減する能力を有することを意味する。この例としては、タンパク質の酵素活性の抑制、またはその活性に必要な他の生物学的分子と相互作用する、タンパク質の能力、例えば多量体構造へのタンパク質の集合の抑制が挙げられるが、これらに限定されない。
【０３６６】
「核酸に対する活性」とは、細胞中での核酸の機能を抑制するか、またはレベルまたは活性を低減する能力を有することを意味する。この例としては、その活性に必要な他の生物学的分子と相互作用する核酸の能力、例えば多量体構造への核酸の集合の抑制が挙げられるが、これらに限定されない。
【０３６７】
「遺伝子に対する活性」とは、細胞中での遺伝子の機能または発現を抑制する能力を有することを意味する。この例としては、その活性に必要な他の生物学的分子と相互作用する遺伝子の能力が挙げられるが、これらに限定されない。
【０３６８】
「オペロンに対する活性」とは、細胞中での１つまたはそれ以上のオペロンの産物の機能を抑制するか、またはレベルを低減する能力を有することを意味する。この例としては、１つまたはそれ以上のオペロンの産物の酵素活性の抑制、またはその活性に必要な他の生物学的分子と相互作用する、１つまたはそれ以上のオペロンの産物の能力が挙げられるが、これらに限定されない。
【０３６９】
「抗生物質」とは、細胞または微生物の増殖を抑制する物質を意味する。
【０３７０】
「エシェリヒア・コリ（E. coliまたはEscherichia coli）」とは、エシェリヒア・コリ、または赤痢菌属（Shigella）の一種として以前は分類された任意の生物、例えばシゲラ・ボイディ（Shigellaboydii）、シゲラ・フレックスネリ（Shigellaflexneri）、シゲラ・ディッセンリイ（Shigelladysenteriae）、シゲラ・ソネイ（Shigellasonnei）、シゲラ・２Ａ（Shigella ２Ａ）を意味する。
【０３７１】
「相同コード核酸」とは、配列番号８〜３７９５からなる群から選ばれる核酸またはその一部により活性またはレベルが抑制される遺伝子産物をコードする核酸に相同的な核酸を意味する。いくつかの実施形態では、相同コード核酸は、配列番号３７９６〜３８００、３８０６〜４８６０、５９１６〜１００１２からなる群から選ばれるヌクレオチド配列、およびその少なくとも１０個、１５個、２０個、２５個、３０個、３５個、４０個、５０個、７５個、１００個、１５０個、２００個、３００個、４００個、または５００個の連続ヌクレオチドを含む断片に対して少なくとも９７％、少なくとも９５％、少なくとも９０％、少なくとも８５％、少なくとも８０％、または少なくとも７０％のヌクレオチド配列同一性を有し得る。他の実施形態では、相同コード核酸は、配列番号８〜３７９５の１つに相補的なヌクレオチド配列からなる群から選ばれるヌクレオチド配列、およびその少なくとも１０個、１５個、２０個、２５個、３０個，３５個、４０個、５０個、７５個、１００個、１５０個、２００個、３００個、４００個、または５００個の連続ヌクレオチドを含む断片に対して少なくとも９７％、少なくとも９５％、少なくとも９０％、少なくとも８５％、少なくとも８０％、もしくは少なくとも７０％のヌクレオチド配列同一性を有し得る。同一性は、デフォルトパラメーターでのＢＬＡＳＴＮバージョン２．０またはデフォルトパラメーターでのｔＢＬＡＳＴＸを用いて測定され得る（Altschul, S.F.ら Gapped BLASTand PSI-BLAST: A New Generation of Protein Database Search Programs, NucleicAcid Res. 25: 3389-3402(1997)）。あるいは、「相同コード核酸」は、機能性オーソログクラスターへの当該遺伝子の帰属関係により同定され得る。そのオーソログクラスターのすべての他の成員は、同族体であると考えられた。機能性オーソログクラスターのこのようなライブラリーは、http://www.ncbi.nlm.nih.gov/COG.で見出され得る。遺伝子は、上記のウエブサイトから利用可能なＣＯＧＮＩＴＯＲプログラムを用いることにより、または当該遺伝子とＣＯＧの成員との直接ＢＬＡＳＴＰ比較、ならびにTatusov, R.L., Galperin, M.Y., Natale, D.A. and Koonin, E.V.(2000)The COG database: a tool for genome-scale analysis of protein functions andevolution. Nucleic Acids Research v.28 n. 1, pp33-36により記載されているようなこれらの結果の分析により、オーソログ群またはＣＯＧのクラスターに分類され得る。
【０３７２】
「相同コード核酸」という用語は、デフォルトパラメーターでＦＡＳＴＡバージョン３．０ｔ７８アルゴリズムを用いて決定される場合に、配列番号３８０１〜３８０５、４８６１〜５９１５、１００１３〜１４１１０の１つのアミノ酸配列を含むポリペプチドに対して、または配列番号８〜３７９５の１つのヌクレオチド配列、または少なくとも５個、１０個、１５個、２０個、２５個、３０個、３５個、４０個、５０個、７５個、１００個、もしくは１５０個の連続アミノ酸を含むその断片を含む核酸により発現が抑制されるポリペプチドに対して少なくとも９９％、９５％、少なくとも９０％、少なくとも８５％、少なくとも８０％、少なくとも７０％、少なくとも６０％、少なくとも５０％、少なくとも４０％もしくは少なくとも２５％のアミノ酸同一性または類似性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸も含む。あるいは、タンパク質同一性または類似性は、デフォルトパラメーターでのＢＬＡＳＴＰ、デフォルトパラメーターでのＢＬＡＳＴＸ、デフォルトパラメーターでのＴＢＬＡＳＴＮ、またはデフォルトパラメーターでのｔＢＬＡＳＴＸを用いて同定され得る（Altschul, S.F. ら Gapped BLASTand PSI-BLAST: A New Generation of Protein Database Search Programs, NucleicAcid Res. 25: 3389-3402(1997)）。
【０３７３】
「相同コード核酸」という用語は、配列番号３７９６〜３８００、３８０６〜４８６０、５９１６〜１００１２の１つに相補的なヌクレオチド配列からなる群から選ばれる核酸配列にストリンジェントな条件下でハイブリダイズするコード核酸、ならびに配列番号３７９６〜３８００、３８０６〜４８６０、５９１６〜１００１２の１つに相補的な配列の少なくとも１０個、１５個、２０個、２５個、３０個、３５個、４０個、５０個、７５個、１００個、１５０個、２００個、３００個、４００個、または５００個の連続ヌクレオチドを含む断片にストリンジェントな条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列を含むコード核酸も含む。本明細書中で用いる場合、「ストリンジェントな条件」とは、約４５℃で６×ＳＳＣ中でのフィルター結合核酸とのハイブリダイゼーションと、その後の約６８℃で０．１×ＳＳＣ／０．２％ＳＤＳ中での１回またはそれ以上の洗浄を意味する。他の代表的なストリンジェントな条件は、例えば、使用中の特定のプローブに適切であるような、３７℃、４８℃、５５℃、および６０℃での６×ＳＳＣ／０．０５％ピロリン酸ナトリウム中での洗浄を指す。
【０３７４】
「相同コード核酸」という用語は、配列番号３７９６〜３８００、３８０６〜４８６０、５９１６〜１００１２の１つに相補的な配列からなる群から選ばれるヌクレオチド配列に穏やかな条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列を含むコード核酸、ならびに配列番号３７９６〜３８００、３８０６〜４８６０、５９１６〜１００１２の１つに相補的な配列の少なくとも１０個、１５個、２０個、２５個、３０個、３５個、４０個、５０個、７５個、１００個、１５０個、２００個、３００個、４００個、または５００個の連続ヌクレオチドを含む断片に穏やかな条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列を含むコード核酸も含む。本明細書中で用いる場合、「穏やかな条件」とは、約４５℃で６×塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）中でのフィルター結合ＤＮＡとのハイブリダイゼーションと、その後の約４２〜６５℃で０．２×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ中での１回またはそれ以上の洗浄を意味する。
【０３７５】
「相同コード核酸」という用語は、配列番号８〜３７９５からなる群から選ばれるヌクレオチド配列を含む核酸により活性が抑制される遺伝子産物をコードする遺伝子により、その活性が補完され得る遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列を含む核酸も含む。いくつかの実施形態では、相同コード核酸は、配列番号３７９６〜３８００、３８０６〜４８６０、５９１６〜１００１２からなる群から選ばれるヌクレオチド配列を含む核酸によりコードされる遺伝子産物により活性が補完される遺伝子産物をコードし得る。他の実施形態では、相同コード核酸は、配列番号３７４５〜４７７３のポリペプチドの１つにより活性が補完される遺伝子産物をコードする核酸を含み得る。
【０３７６】
「相同アンチセンス核酸」という用語は、配列番号８〜３７９５の配列の１つからなる群から選ばれるヌクレオチド配列、およびその少なくとも１０個、１５個、２０個、２５個、３０個，３５個、４０個、５０個、７５個、１００個、１５０個、２００個、３００個、４００個、または５００個の連続ヌクレオチドを含む断片に対して、少なくとも９７％、少なくとも９５％、少なくとも９０％、少なくとも８５％、少なくとも８０％、または少なくとも７０％のヌクレオチド配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む核酸を含む。相同アンチセンス核酸はまた、配列番号３７９６〜３８００、３８０６〜４８６０、５９１６〜１００１２の配列の１つに相補的な配列からなる群から選ばれるヌクレオチド配列、およびその少なくとも１０個、１５個、２０個、２５個、３０個，３５個、４０個、５０個、７５個、１００個、１５０個、２００個、３００個、４００個、または５００個の連続ヌクレオチドを含む断片に対して、少なくとも９７％、少なくとも９５％、少なくとも９０％、少なくとも８５％、少なくとも８０％、または少なくとも７０％のヌクレオチド配列同一性を有するヌクレオチド配列を含み得る。核酸同一性は、上記と同様に決定され得る。
【０３７７】
「相同アンチセンス核酸」という用語はまた、配列番号８〜３７９５の１つに相補的なヌクレオチド配列にストリンジェントな条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列を含むアンチセンス核酸、ならびに配列番号８〜３７９５の１つに相補的な配列の少なくとも１０個、１５個、２０個、２５個、３０個、３５個、４０個、５０個、７５個、１００個、１５０個、２００個、３００個、４００個、または５００個の連続ヌクレオチドを含む断片に、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列を含むアンチセンス核酸を含む。相同アンチセンス核酸は、配列番号３７９６〜３８００、３８０６〜４８６０、５９１６〜１００１２からなる群から選ばれるヌクレオチド配列に、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列を含むアンチセンス核酸、ならびに配列番号３７９６〜３８００、３８０６〜４８６０、５９１６〜１００１２の１つの少なくとも１０個、１５個、２０個、２５個、３０個、３５個、４０個、５０個、７５個、１００個、１５０個、２００個、３００個、４００個、または５００個の連続ヌクレオチドを含む断片に、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列を含むアンチセンス核酸も含む。
【０３７８】
「相同アンチセンス核酸」という用語はまた、配列番号８〜３７９５の１つに相補的なヌクレオチド配列に穏やかな条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列を含むアンチセンス核酸、ならびに配列番号８〜３７９５の１つに相補的な配列の少なくとも１０個、１５個、２０個、２５個、３０個、３５個、４０個、５０個、７５個、１００個、１５０個、２００個、３００個、４００個、または５００個の連続ヌクレオチドを含む断片に、穏やかな条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列を含むアンチセンス核酸を含む。相同アンチセンス核酸は、配列番号３７９６〜３８００、３８０６〜４８６０、５９１６〜１００１２からなる群から選ばれるヌクレオチド配列に、穏やかな条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列を含むアンチセンス核酸、ならびに配列番号３７９６〜３８００、３８０６〜４８６０、５９１６〜１００１２の１つの少なくとも１０個、１５個、２０個、２５個、３０個、３５個、４０個、５０個、７５個、１００個、１５０個、２００個、３００個、４００個、または５００個の連続ヌクレオチドを含む断片に、穏やかな条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列を含むアンチセンス核酸も含む。
【０３７９】
「相同ポリペプチド」とは、配列番号８〜３７９５からなる群から選ばれるヌクレオチド配列を含む核酸により、または相同アンチセンス核酸により活性またはレベルが抑制されるポリペプチドに相同的なポリペプチドを意味する。「相同ポリペプチド」は、配列番号８〜３７９５からなる群から選ばれる核酸により、または相同アンチセンス核酸により活性またはレベルが抑制されるポリペプチドに対して少なくとも９９％、９５％、少なくとも９０％、少なくとも８５％、少なくとも８０％、少なくとも７０％、少なくとも６０％、少なくとも５０％、少なくとも４０％もしくは少なくとも２５％のアミノ酸同一性または類似性を有するポリペプチド、または配列番号８〜３７９５からなる群から選ばれる核酸により、または相同アンチセンス核酸により活性またはレベルが抑制されるポリペプチドと少なくとも５個、１０個、１５個、２０個、２５個、３０個，３５個、４０個、５０個、７５個、１００個もしくは１５０個の連続アミノ酸を含む断片に対して少なくとも９９％、９５％、少なくとも９０％、少なくとも８５％、少なくとも８０％、少なくとも７０％、少なくとも６０％、少なくとも５０％、少なくとも４０％もしくは少なくとも２５％のアミノ酸同一性または類似性を有するポリペプチドを含む。同一性または類似性は、デフォルトパラメーターでＦＡＳＴＡバージョン３．０ｔ７８アルゴリズムを用いて測定され得る。または、タンパク質同一性もしくは類似性は、デフォルトパラメーターでのＢＬＡＳＴＰ、デフォルトパラメーターでのＢＬＡＳＴＸ、またはデフォルトパラメーターでのＴＢＬＡＳＴＮを用いて同定され得る（Altschul, S.F.ら Gapped BLASTand PSI-BLAST: A New Generation of Protein Database Search Programs, NucleicAcid Res. 25: 3389-3402(1997)）。
【０３８０】
相同ポリペプチドという用語は、配列番号３８０１〜３８０５、４８６１〜５９１５、１００１３〜１４１１０からなる群から選ばれるポリペプチドに対して少なくとも９９％、９５％、少なくとも９０％、少なくとも８５％、少なくとも８０％、少なくとも７０％、少なくとも６０％、少なくとも５０％、少なくとも４０％もしくは少なくとも２５％のアミノ酸同一性または類似性を有するポリペプチド、ならびに配列番号３８０１〜３８０５、４８６１〜５９１５、１００１３〜１４１１０からなる群から選ばれるポリペプチドの少なくとも５個、１０個、１５個、２０個、２５個、３０個、３５個、４０個、５０個、７５個、１００個、または１５０個の連続アミノ酸を含む断片に対して少なくとも９９％、９５％、少なくとも９０％、少なくとも８５％、少なくとも８０％、少なくとも７０％、少なくとも６０％、少なくとも５０％、少なくとも４０％もしくは少なくとも２５％のアミノ酸同一性または類似性を有するポリペプチドも含む。
【０３８１】
本発明は、配列番号８〜３７９５、配列番号３７９６〜３８００、３８０６〜４８６０、５９１６〜１００１２の核酸、または上記核酸のいずれかの相補体の１つにハイブリダイズするポリヌクレオチド、好ましくはＤＮＡ分子も含む。このようなハイブリダイゼーションは、上記のようなストリンジェントな条件または穏やかな条件下で、または特定のハイブリダイゼーションを可能にするその他の条件下であり得る。これらのＤＮＡ配列にハイブリダイズする本発明の核酸分子は、高ストリンジェントまたはストリンジェントな条件下で標的遺伝子にハイブリダイズするオリゴデオキシヌクレオチド（「オリゴ」）を含む。概して、１４〜７０ヌクレオチド長のオリゴに関しては、融解温度（Ｔｍ）は、次式を用いて算定される：
【０３８２】
Ｔｍ（℃）＝８１．５＋１６．６（ｌｏｇ［一価陽イオン（モル）］＋０．４１（％Ｇ＋Ｃ）−（５００／Ｎ）
【０３８３】
（式中、Ｎはプローブの長さである）。ハイブリダイゼーションがホルムアミドを含有する溶液中で実行される場合、融解温度は、以下の方程式を用いて算定され得る：
【０３８４】
Ｔｍ（℃）＝８１．５＋１６．６（ｌｏｇ［一価陽イオン（モル）］＋０．４１（％Ｇ＋Ｃ）−（０．６１）（％ホルムアミド）−（５００／Ｎ）
【０３８５】
（式中、Ｎはプローブの長さである）。概してハイブリダイゼーションは、Ｔｍより約２０〜２５℃低い（ＤＮＡ−ＤＮＡハイブリッドに関して）またはＴｍより約１０〜１５℃低い（ＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッドに関して）温度で実行される。
【０３８６】
その他のハイブリダイゼーション条件は、当業者には明らかである（例えば、Ausubel, F.M. ら,eds., 1989,Current Protocols in Molecular Biology, Vol.I, Green Publishing Associates,Inc. and John Wiley & Sons, Inc., New York, at pp. 6.3.1-6.3.6 and 2.10.3参照）。
【０３８７】
サルモネラという用語は、エシェリヒア・コリと密接に関連するグラム陰性腸内細菌の大群に対する属名である。サルモネラにより引き起こされる疾患はしばしば、食品または上水道の汚染によるものであり、毎年数百万の人々に影響を及ぼす。サルモネラ分類の伝統的方法は、各血清学的識別可能菌株に別々の種名を割り当てることに基づいていた（Kauffmann, F 1966 The bacteriology of the Enterobacteriaceae. Munksgaard,Copenhagen）。サルモネラの血清は、表面抗原に基づいている（Ｏ［菌体］およびＨ［鞭毛］）。サルモネラの２，４００を上回る血清型または血液型亜型が既知である（Popoff, et al. 2000 Res. Microbiol. 151:63-65）。したがって各血清型は別々の種であると考えられ、しばしばそれに応じて名称が与えられる（例えば、サルモネラ・パラチフィ（S. paratyphi）、サルモネラ・チフィムリウム（S.typhimurium）、サルモネラ・チフィ（S. typhi）、腸炎菌（S. Enteriditis）等）。
【０３８８】
しかしながら、１９７０年代および１９８０年代までには、この系は扱いにくいだけでなく不正確であると認識された。次いで多数のサルモネラスピーシーズが単一種にひとまとめにされ（すべての血清型および亜属Ｉ、ＩＩ、およびＩＶならびにアリゾナ属（Arizona）のすべての血清型）、第二亜種Ｓ．ボンゴリ（S. bongorii）も認識された（Crosaら, 1973, J. Bacteriol. 115:307-315）。種名称は高可変性表面抗原に基づいているが、しかしサルモネラは病原性決定基を除いて他の点では非常によく似ている。
【０３８９】
サルモネラスピーシーズのための正しい名称に関する多少の論争が存在した。一般に（Brennerら 2000 J. Clin.Microbiol. 38:2465-2467）、許容された名称はサルモネラ・エンテリカ（Salmonella enterica）である。サルモネラ・エンテリカは、６つの亜種（Ｉ, S. enterica subsp. enterica、ＩＩ, S. enterica subsp. salamae、ＩＩＩａ, S. enterica subsp. arizonae、ＩＩＩｂ, S. enterica subsp. diarizonae、ＩＶ, S. enterica subsp. houtenae、およびＶＩ, S. enterica subsp. indica）に分けられる。亜種Ｉ内では、血清型は血清型（serotypeおよびserovar）の各々（例えばS. enterica serotype Enteriditis、S. enterica serotype Typhimurium、S. enterica serotype Typhi、およびS. enterica serotype Choleraesuis等）を区別するために用いられる。現在の慣習は、これを第一の使用法（S. entericaser. Typhimurium）に関して理解することであり、そして次に省略形態（Salmonella TyphimuriumまたはS. Typhimurium）を用いることである。属および種名（Salmonella enterica）はイタリック体で示されるが、血清型(serotype／serovar)名（Typhimurium）はそうではないことに留意されたい。分類委員会はさらに実際の種名を公的に是認しなければならないため、この後者のシステムはＣＤＣにより用いられるものである（Brennerら2000 J. Clin. Microbiol.38:2465-2467）。分類学的優先事項および医学的重要性の両方の問題のため、これらの血清型のいくつかは、結局、完全種名を受け得た（S. typhiが最も顕著である）。
【０３９０】
したがって、本明細書中で用いる場合、「サルモネラ・エンテリカ（Salmonella enterica）またはS. enterica」は、血清型（serovar）Typhi（チフス）、Typhimurium（ネズミチフス）、Paratyphi（パラチフス）、Choleraesuis（ブタコレラ）等を含む。しかしながら、「公認」名の要請は進行中であり、分類名は変わり得る（S.choleraesuisは、優先事項のみに基づいたS. entericaに取って代わり得る種名である）。
【０３９１】
「化合物を同定する」とは、コンビナトリアルケミストリーライブラリー(combinatorial chemical library)または化学化合物の他のライブラリーのような化合物の集合中の1つまたはそれ以上の化合物をスクリーニングすること、または所定のアッセイにおいて化合物を試験し、それが所望の活性を示すか否かを測定することにより単一化合物を特性化することを意味する。
【０３９２】
「誘導物質」とは、細胞または微生物に接触しておかれた場合に、所望のプロモーターからの転写、もしくは阻害剤および／またはプロモータークリアランス／フィデリティ(promoter clearance/fidelity)を増大する物質または溶液を意味する。
【０３９３】
本明細書中で用いる場合、「核酸」とは、ＤＮＡ、ＲＮＡまたは修飾核酸を意味する。したがって、「配列番号Ｘの核酸」または「ヌクレオチド配列を含む核酸」という術語は、配列番号ＸのＤＮＡ配列およびＲＮＡ配列の両方を含む、この場合、ＤＮＡ配列中のチミジンがＲＮＡ配列中のウリジンで置換されており、そしてＤＮＡ配列のデオキシリボース主鎖はＲＮＡ配列中のリボース主鎖で置換されている。修飾核酸は、天然には生じないヌクレオチドまたは構造を有する核酸、例えばヌクレオチド間リン酸残基がメチルホスホネート、ホスホロチオネート、ホスホロアミデートおよびリン酸エステルを有する核酸である。非リン酸ヌクレオチド間類像体、例えばシロキサン架橋、カーボネート架橋、チオエステル架橋、ならびに当技術分野で既知の多数のその他のものも、修飾核酸中に用いられ得る。修飾核酸はα−アノマーヌクレオチド単位も含み得るし、そして修飾ヌクレオチド、例えば１，２−ジデオキシ−ｄ−リボフラノース、１，２−ジデオキシ−１−フェニルリボフラノース、およびＮ⁴，Ｎ⁴−エタノ−５−メチル−シトシンは、本発明に用いるために意図される。修飾核酸は、全デオキシリボース−リン酸主鎖が化学的に完全に異なるが、しかし構造的には相同である２−アミノエチルグリシン単位を含有するポリアミド（ペプチド）主鎖と交換されているペプチド核酸でもあり得る。
【０３９４】
本明細書中で用いる場合、「致死量以下」とは、全細胞成長を抑制するのに必要な濃度より低い物質の濃度を意味する。
【０３９５】
［好ましい実施形態の詳細な説明］
本発明は、細胞増殖に必要とされる原核生物遺伝子および遺伝子ファミリーの一群について記載する。スタフィロコッカス・オーレウス(Staphylococcus aureus)、サルモネラ・チフィムリウム(Salmonella typhimurium)、クレブシエラ・ニューモニエ(Klebsiella pneumoniae)、シュードモナス・アエルギノーサ(Pseudomonas aeruginosa)およびエンテロコックス・フェカリス(Enterococcus faecalis)、エシェリヒア・コリ(Escherichia coli)、エンテロコックス・フェカリス(Enterococcus faecalis)、ヘモフィルス・インフルエンザ(Haemophilus influenzae)、ヘリコバクター・ピロリ(Helicobacter pylori)、クレブシエラ・ニューモニエ(Klebsiella pneumoniae)、シュードモナス・アエルギノーサ(Pseudomonas aeruginosa)、スタフィロコッカス・オーレウス(Staphylococcus aureus)、およびサルモネラ・チフィ(Salmonella typhi)由来の例示的遺伝子および遺伝子ファミリーが提供される。増殖に必要な遺伝子または遺伝子ファミリーは、遺伝子転写物および／または遺伝子産物の非存在下または実質的低減下で、細胞もしくは微生物の成長または生存可能性が低減されるかまたは排除されるものである。したがって、本明細書中で用いる場合、「増殖に必要な」または「増殖のために必要とされる」という用語は、遺伝子転写物および／または遺伝子産物の非存在または実質的低減が完全に細胞成長を排除する場合、ならびに遺伝子転写物および／または遺伝子産物の非存在が細胞成長を単に低減する場合を含む。これらの増殖に必要な遺伝子は、新規の抗菌剤の生成のための潜在的標的として用いられ得る。その目標を達成するために、本発明は、増殖に必要な遺伝子を分析するための、そして増殖に必要な遺伝子の遺伝子および／または遺伝子産物と相互作用する化合物を同定するためのアッセイも含む。さらに本発明は、遺伝子の発現、および必要増殖遺伝子として同定されて、本明細書中で報告される核酸配列によりコードされるタンパク質の精製を意図する。精製タンパク質を用いて試薬を生成し、新規の抗菌化合物を産生するためにさらに、開発され得る化合物に関して、小分子ライブラリーまたはその他の候補化合物ライブラリーをスクリーニングし得る。
【０３９６】
本発明はまた、配列番号３９７６〜３８００、３８０６〜４８６０、５９１６〜１００１２の核酸に相同的なヌクレオチド配列、および配列番号３８０１〜３８０５、４８６１〜５９１５、１００１３〜１４１１０のポリペプチドに相同的なポリペプチドを含む核酸を含む、本明細書に記載されるこれらの遺伝子およびポリペプチドに相同的なヌクレオチド配列を同定する方法を記載する。例えば、これらの配列を、アナプラスマ・マルギナレ(Anaplasma marginale)、アスペルギルス・フミガツス(Aspergillus fumigatus)、バチルス・アンスラシス(Bacillus anthracis)、バクテリオイデス・フラギリス(Bacterioides fragilis)、百日咳菌(Bordetella pertussis)、ブルクホルデリア・セパシア(Burkholderia cepacia)、カンピロバクター・イェジュニィ(Campylobacter jejuni)、カンジダ・アルビカンス (Candida albicans)、カンジダ・グラブラタ(Candida glabrata)（トルロプシス・グラブラタ(Torulopsis glabrata)とも呼ばれる）、カンジダ・トロピカリス(Candida tropicalis)、カンジダ・パラプシロシス(Candida parapsilosis)、カンジダ・ギルリエルモンジイ(Candida guilliermondii)、カンジダ・クルセイ(Candida krusei)、カンジダ・ケフィア(Candidakefyr)（カンジダ・シュードトロピカリス(Candidapseudotropicalis)とも呼ばれる）、カンジダ・デュブリニエンシス(Candida dubliniensis)、クラミジア・ニューモニエ(Chlamydia pneumoniae)、トラコーマ・クラミジア(Chlamydia trachomatus)、クロストリジウム・ボツリヌム(Clostridium botulinum)、クロストリジウム・ジフィシル(Clostridium difficile)、クロストリジウム・パーフリンゲンス(Clostridium perfringens)、コクシジオデス・イミチス(Coccidiodes immitis)、コリネバクテリウム・ジフテリア(Corynebacterium diptheriae)、クリプトコックス・ネオフォルマンス(Cryptococcus neoformans)、エンテロバクター・クロアカエ(Enterobacter cloacae)、エンテロコックス・フェカリス(Enterococcus faecalis)、エンテロコックス・ファエシウム(Enterococcus faecium)、エシェリヒア・コリ(Escherichia coli)、ヘモフィルス・インフルエンザ(Haemophilus influenzae)、ヘリコバクター・ピロリ(Helicobacter pylori)、ヒストプラスマ・カプスラツム(Histoplasma capsulatum)、クレブシエラ・ニューモニエ(Klebsiella pneumoniae)、リステリア・モノサイトゲネス(Listeria monocytogenes)、マイコバクテリウム・レプラエ(Mycobacterium leprae)、マイコバクテリウム・ツベルクローシス(Mycobacterium tuberculosis)、ナイセリア・ゴノローエ(Neisseria gonorrhoeae)、髄膜炎菌(Neisseria meningitidis)、ノカルジア・アステロイデス(Nocardia asteroides)、パスツレラ・ヘモリチカ(Pasteurella haemolytica)、パスツレラ・ムルトシダ(Pasteurella multocida)、ニューモシスティス・カリニー(Pneumocystis carinii)、プロテウス・ブルガリス(Proteus vulgaris)、シュードモナス・アエルギノーサ(Pseudomonas aeruginosa)、サルモネラ・ボンゴリ(Salmonella bongori)、サルモネラ・コレラスイス(Salmonella cholerasuis)、サルモネラ・エンテリカ(Salmonella enterica)、サルモネラ・パラチフィ(Salmonella paratyphi)、サルモネラ・チフィ(Salmonella typhi)、サルモネラ・チフィムリウム(Salmonella typhimurium)、スタフィロコッカス・オーレウス(Staphylococcus aureus)、リステリア・モノサイトゲネス(Listeria monocytogenes)、モクサレラ・カタルハリス(Moxarella catarrhalis)、シゲラ・ボイディ(Shigella boydii)、シゲラ・ディッセンリイ(Shigelladysenteriae)、シゲラ・フレックスネリ(Shigellaflexneri)、シゲラ・ソネイ(Shigellasonnei)、スタフィロコッカス・エピダーミディス(Staphylococcusepidermidis)、ストレプトコッカス・ニューモニエ(Streptococcuspneumoniae)、ストレプトコッカス・ミュータンス(Streptococcusmutans)、トレポネーマ・パリダム(Treponemapallidum)、エルシニア・エンテロコリチカ(Yersiniaenterocolitica)、エルシニア・ペスティス(Yersiniapestis)、または上記種のいずれかの属に属する任意の種などの微生物における相同コード核酸、相同アンチセンス核酸、または相同ポリペプチドを同定するために用い得る。いくつかの実施形態では、相同コード核酸、相同アンチセンス核酸、または相同ポリペプチドは、エシェリヒア・コリ以外の生物において同定される。
【０３９７】
次に、相同コード核酸、相同アンチセンス核酸または相同ポリペプチドは本明細書中に記載される方法の各々に、例えば相同コード核酸、相同アンチセンス核酸または相同ポリペプチドを含有する生物の増殖を抑制する化合物の同定方法、相同コード核酸、相同アンチセンス核酸または相同ポリペプチドを含有する生物の成長の抑制方法、相同コード核酸、相同アンチセンス核酸または相同ポリペプチドを含有する生物の増殖に必要とされる遺伝子産物の活性またはレベルに影響を及ぼす化合物の同定方法、相同コード核酸、相同アンチセンス核酸または相同ポリペプチドを含有する生物の増殖に必要とされる遺伝子産物のレベルもしくは活性を低減する能力を有する化合物または核酸の同定方法、相同コード核酸、相同アンチセンス核酸または相同ポリペプチドを含有する生物の増殖に必要とされるオペロン中の遺伝子の活性または発現の抑制方法、相同コード核酸、相同アンチセンス核酸または相同ポリペプチドを含有する生物の増殖に必要とされる遺伝子の同定方法、相同コード核酸、相同アンチセンス核酸または相同ポリペプチドを含有する生物の増殖に必要とされる遺伝子または遺伝子産物が存在する生物学的経路の同定方法、相同コード核酸、相同アンチセンス核酸または相同ポリペプチドを含有する生物の増殖に必要とされる生物学的経路に対する活性を有する化合物の同定方法、試験化合物が作用する生物学的経路の決定方法、ならびに被験体における相同コード核酸、相同アンチセンス核酸または相同ポリペプチドを含有する生物生物の増殖の抑制方法に用いられ得る。本発明のいくつかの実施形態では、上記方法は、エシェリヒア・コリ以外の生物、またはエシェリヒア・コリ以外の生物由来の遺伝子もしくは遺伝子産物を用いて実施される。
【０３９８】
本発明は、増殖に必要な配列を同定するための新規の方法を利用する。一般に、所定の供給源由来の核酸配列のライブラリーは、適切なベクター、例えばスタフィロコッカス・オーレウス／エシェリヒア・コリまたはシュードモナス・アエルギノーサ／エシェリヒア・コリシャトルベクター、またはサルモネラ・チフィムリウムおよびクレブシエラ・ニューモニエの両方で複製するベクター、もしくは意図された生物中で機能する、その他のベクターまたはシャトルベクター上の誘導性プロモーターのすぐ下流にサブクローニングされるかまたは別の方法で挿入され、したがって発現ライブラリーを生成し得る。培地への可変濃度の誘導物質分子または阻害剤分子の添加により発現レベルが調整され得るように、調節可能プロモーター配列により発現が誘導されるのが一般的に好ましい。温度活性化プロモーター、例えば温度感受性リプレッサー、例えばλＣ₁₈₅₇リプレッサーにより調節されるプロモーターも意図される。挿入核酸は発現ベクターが導入されるべき細胞または微生物の染色体から得られ得るが、しかし挿入物はその天然染色体位置に存在しないため、挿入核酸は本明細書中での考察の目的では外因性核酸である。「発現」という用語は、遺伝子、遺伝子断片、ゲノム断片、染色体、オペロンもしくはそれらの一部からのセンスまたはアンチセンスＲＮＡ分子の産生と定義される。発現はまた、ペプチドまたはポリペプチド合成の過程を指すために用いられ得る。発現ベクターは、リボ核酸（ＲＮＡ）配列が発現伝達体(expression vehicle)内に保有される核酸配列から転写される伝達体と定義される。発現ベクターは、発現ベクターにより保有される外因性核酸配列から発現される転写ＲＮＡメッセージからのタンパク質産物の翻訳を可能にするという特徴も含有し得る。したがって、発現ベクターはその唯一の産物としてＲＮＡ分子を産生し得るか、または発現ベクターは最終的にはタンパク質産物に翻訳されるＲＮＡ分子を産生し得る。
【０３９９】
一旦生成されれば、外因性核酸配列を含有する発現ライブラリーは細胞の集団（例えば外因性核酸配列が得られた生物）に導入されて、細菌増殖に必要とされる遺伝子に関して調べられる。ライブラリー分子は、この文脈中では、細胞の集団に対して外来性であるため、発現ベクターおよびそこに含有される核酸セグメントは外因性核酸と考えられる。
【０４００】
次に発現ライブラリーを含有する細胞の試験集団中での外因性核酸断片の発現が活性化される。発現ベクターの活性化は、発現ライブラリーにより保有される外因性核酸配列の発現を生じる条件に、ベクターを含有する細胞を付すことからなる。次に細胞の試験集団は、細胞の試験集団に及ぼす外因性核酸断片の発現の効果を決定するためにアッセイされる。ベクターに含有されるランダム配列の発現の誘導時に細胞の成長に負の影響を及ぼす発現ベクターが同定され、単離され、さらなる試験のために精製された。
【０４０１】
発現時に成長に負の影響を及ぼす核酸配列を同定するために、種々のアッセイが意図される。一実施形態では、外因性核酸配列を発現する培養中での成長と、これらの配列を発現しない培養中での成長が比較される。成長測定は、吸光度を測定することにより成長の程度を検査することによりアッセイされる。あるいは、当該外因性核酸配列を同定するために細菌成長速度を測定するために、酵素アッセイが用いられ得る。コロニーサイズ、コロニー形態および細胞形態は、宿主細胞の増殖を評価するために用いられる付加的因子である。発現条件下で増殖できないか、または低速度で増殖する培養は、増殖に必要な遺伝子に負の影響を及ぼす核酸断片をコードする発現ベクターを含有すると同定される。
【０４０２】
当該外因性核酸が一旦同定されれば、それらは分析される。分析の第一工程は、当該核酸断片のヌクレオチド配列を獲得することである。この目的を達成するために、当該ヌクレオチド配列を含有すると同定された発現ベクター中の挿入物は、当技術分野で既知の標準技法を用いて配列決定される。このプロセスの次の工程は、ヌクレオチド配列の供給源を決定することである。本明細書中で用いる場合、「供給源」とはクローニングした断片を含有するゲノム領域を意味する。
【０４０３】
ヌクレオチド配列に対応する遺伝子の決定は、得られた配列データを種々の微生物由来の既知のタンパク質およびヌクレオチド配列を含有するデータベースと比較することにより達成された。したがって、最初の遺伝子同定は、特性化されたまたは予測されたスタフィロコッカス・オーレウス、サルモネラ・チフィムリウム、クレブシエラ・ニューモニエ、シュードモナス・アエルギノーサまたはエンテロコックス・フェカリスの遺伝子、もしくはそれらのコードタンパク質および／または他の種における相同体との有意の配列類似性または同一性に基づいてなされた。
【０４０４】
データベース系中の利用可能なヌクレオチドおよびタンパク質配列の数は、長年の間に指数関数的に増大してきた。例えば線虫(Caenorhabditis elegans)の完全ヌクレオチド配列、およびいくつかの細菌のゲノム、例えばエシェリヒア・コリ、好気性好熱菌(Aeropyrum pernix)、超好熱性細菌(Aquifex aeolicus)、好熱性硫黄細菌(Archaeoglobus fulgidus)、バチルス・サブチルス(Bacillus subtilus)、ボレリア・グルグドルゲリ(Borrelia burgdorgeri)、クラミジア(Chlamydia pneumoniae)、トラコーマ・クラミジア(Chlamydia trachomatis)、クロストリジウム・テタニ(Clostridium tetani)、コリネバクテリウム・ジフテリア(Corynebacterium diptheria)、デイノコックス・ラジオデュランス(Deinococcus radiodurans)、ヘモフィルス・インフルエンザ(Haemophilus influenzae)、ヘリコバクター・ピロリ(Helicobacter pylori)２６６９５、ヘリコバクターピロリＪ９９、メタノバクテリウム・サーモオートトロフィクム(Methanobacterium thermoautotrophicum)、メタノコックス・ジャンナシイ(Methanococcus jannaschii)、マイコバクテリウム・ツベルクローシス(Mycobacterium tuberculosis)、マイコプラズマ・ゲニタリウム(Mycoplasma genitalium)、肺炎マイコプラズマ(Mycoplasma pneumoniae)、シュードモナス・アエルギノーサ、パイコックスアビシ(Pyrococcus abyssi)、パイロコックス・ホリコシイ(Pyrococcus horikoshii)、発疹チフスリケッチア(Rickettsia prowazekii)、シネコシスチス属の(Synechocystis)ＰＣＣ６８０３、サーモト・マルチナ(Thermotoga maritima)、トレポネーマ・パリダム(Treponema pallidum)、百日咳菌(Bordetella pertussis)、カンピロバクター・イェジュニィ(Campylobacter jejuni)、クロストリジウム・アセトブチリクム(Clostridium acetobutylicum)、マイコバクテリウム・ツベルクローシスＣＳＵ＃９３、ナイセリア・ゴノローエ(Neisseria gonorrhoeae)、髄膜炎菌(Neisseria meningitidis)、シュードモナス・アエルギノーサ、ピロバクルム・アエロフィルム(Pyrobaculum aerophilum)、ピロコックス・フリオサス(Pyrococcus furiosus)、ロドバクター・カプスラツス(Rhodobacter capsulatus)、サルモネラ・チフィムリウム、ストレプトコッカス・ミュータンス(Streptococcus mutans)、化膿連鎖球菌(Streptococcus pyogenes)、ウレアプラスマ・ウレアリテクム(Ureaplasma urealyticum)およびビブリオ・コレラ(Vibrio cholera)が利用可能である。このヌクレオチド配列情報は、多数のデータバンク、例えばGenBank、National Centerfor Biotechnology Information (NCBI)、Genome Sequencing Center(http://genome.wustl.edu/gsc/salmonella.shtml)、およびSanger Centre(http://www.sanger.ac.uk/projects/S_typhi)に保存されており、これらは検索のために公的に利用可能である。種々のコンピュータプログラムは、これらのデータベース内に保存された配列の分析を助けるのに利用可能である。ＦＡＳＴＡ（W.R. Pearson (1990) "Rapid and Sensitive Sequence Comparisonwith FASTP and FASTA" Methods in Enzymology 183: 63-98）、Sequence Retrieval System（ＳＲＳ）（Etzold & Argos, SRS an indesxing andretrieval tool for flat file data libraries. Comput. Appl. Biosci. 9: 49-57,1993）は、当該配列を分析するために用いられ得るコンピュータプログラムの２つの例である。本発明の一実施形態では、デフォルトパラメーターでのＢＬＡＳＴＮバージョン２．０またはデフォルトパラメーターでのＢＬＡＳＴＸバージョン２．０を含むＢＬＡＳＴファミリーのコンピュータプログラムを用いてヌクレオチド配列を分析する。
【０４０５】
「Basic Local AlignmentSearch Tool」の頭文字語であるＢＬＡＳＴは、データベース類似性検索のためのプログラムの一ファミリーである。プログラムのＢＬＡＳＴファミリーとしては、ＢＬＡＳＴＮ（ヌクレオチド配列データベース検索プログラム）、ＢＬＡＳＴＸ（入力が核酸配列であるタンパク質データベース検索プログラム）およびＢＬＡＳＴＰ（タンパク質データベース検索プログラム）が挙げられる。ＢＬＡＳＴプログラムは、配列マッチング(sequence matching)のための迅速なアルゴリズム、マッチの有意性を判断するための厳密な統計学的方法、ならびに特殊な状況に関してプログラムを仕立てるための種々のオプションを具体化する。プログラムを使用する上での補助は、blast@ncbi.nim.nih.gov上のｅ−メールにより得られ得る。ｔＢＬＡＳＴＸは、３つの考え得るリーディングフレームすべてにおけるヌクレオチド配列をアミノ酸配列に翻訳するために用いられ得る。
【０４０６】
細菌遺伝子はしばしば、多シストロン性群中に転写される。これらの群は、一般調節下での遺伝子および遺伝子間配列の集合であるオペロンを含む。オペロンの遺伝子は同一ｍＲＮＡ上に転写され、多くの場合機能的に関連する。スクリーニングプロトコルの性質を仮定すると、同定される外因性核酸は、隣接非コード配列、遺伝子内配列（すなわち遺伝子内の配列）、遺伝子間配列（すなわち遺伝子間の配列）、２つまたはそれ以上の遺伝子の少なくとも一部にまたがるヌクレオチド配列、細菌増殖に必要とされる実際のヌクレオチド配列から上流または下流に位置する５’非コード領域または３’非コード領域を伴うか、または伴わない遺伝子もしくはそれの一部に対応することが可能である。したがって、オペロン内でコードされる遺伝子が別々に増殖に必要とされることを決定するのがしばしば望ましい。
【０４０７】
本発明の一実施形態では、オペロンが同定され、次に分析されて、単数または複数の遺伝子が増殖に必要とされることを決定する。オペロンは、当業者に既知の種々の手段により同定され得る。例えばHuertaら（Nucl. AcidsRes. 26: 55-59, 1998）により記載されたRegulonDBDataBase（ウェブサイトhttp://www.cifn.unam.mx/Computational_Biology/regulondb/上に、見出され得る）は、エシェリヒア・コリ中のオペロンについての情報を提供する。サブチリストデータベース(Subtilist Database)（http://bioweb.pasteur.fr/GenoList/SubtiList）、（Moszer, I., Glaser, P. and Danchin, A.(1995) Microbiology 141: 261-268およびMoszer, I(1998) FEBS Letters 430: 28-36）もまたオペロンを予測するために用いられ得る。このデータベースは、十分に配列決定されたグラム陽性菌であるバチルス・サブチルス(Bacillus subtilus)由来の遺伝子を、予測プロモーターおよびターミネーター部位と一緒に列挙する。この情報は、オペロンを予測し、したがって本発明のアンチセンス核酸により影響を受ける遺伝子の一覧を作るために、スタフィロコッカス・オーレウスゲノム配列データとともに用いられ得る。シュードモナス・アエルギノーサウェブサイト（http://www.pseudomonas.com）は、この細菌におけるオペロン組織化を予測するのを助けるのに使用され得る。ゲノムシークエンシングセンター(Genome SequencingCenter)(http://genome.wustl.edu/gsc/salmonella.shtml)、およびサンガーセンター（Sanger Centre）(http://www.sanger.ac.uk/projects/S_typhi)から利用可能なデータベースを用いて、サルモネラ・チフィムリウムにおけるオペロンを予測し得る。ＴＩＧＲ微生物データベースは、不完全バージョンのＥ．フェカリスゲノムhttp://www.tingr.org/cgi-bin/BlastSearch/blast.cgi?organism=faecalisを有する。ヌクレオチド配列を選び取り、そして相同体に関してそれにＢＬＡＳＴを行うことができる。
【０４０８】
当技術分野で周知の多数の技法を用いて、オペロンを分析し得る。ノーザンブロットまたはプライマー伸長技法によるＲＮＡ転写物の分析は、オペロン転写物を分析するために一般に用いられる。この実施形態の一態様において、相同組換えによる遺伝子破壊は、増殖に必要な遺伝子を含有すると考えられるオペロンの遺伝子を別々に不活性化するために用いられる。
【０４０９】
突然変異非機能性（ヌル）対立遺伝子による機能性遺伝子の置き換えに関するいくつかの遺伝子破壊技法が、記載されている。これらの技法は一般的に、相同組換えの使用を含む。スタフィロコッカス・オーレウスにおいて相同組換えを用いる一技法は、Xiaら, 1999, Plasmid42:144-149に記載されている。この技法は、交差ＰＣＲを用いて、標的遺伝子のコード領域のフレーム内欠失を有するヌル対立遺伝子を作製する。ヌル対立遺伝子は、野生型遺伝子に隣接するヌクレオチド配列が保持されるような方法で構築される。スタフィロコッカス・オーレウス染色体上の野生型遺伝子が構築されたヌル対立遺伝子に置換され得るように、欠失ヌル対立遺伝子を取り囲むこれらの相同配列は相同組換えのための標的を提供する。この方法は、他の細菌、例えばサルモネラスピーシーズおよびクレブシエラスピーシーズにも同様に用いられ得る。対抗選択マーカーｓａｃＢを用いる同様の遺伝子破壊法（Schweizer, H.P., Klassen, T. and Hoang, T.(1996) Mol. Biol. ofPseudomonas. ASM press, 229-237）は、シュードモナス、サルモネラおよびクレブシエラスピーシーズに利用可能である。Ｅ．フェカリス遺伝子は、その遺伝子に対する内部断片を含有する非複製プラスミド中での組換えにより破壊され得る（Leboeuf, C., L. Leblanc, Y. Auffray and A. Hartke. 2000, J.Bacteriol. 182:5799-5806）。
【０４１０】
交差ＰＣＲ増幅産物は、選択マーカー、例えば薬剤耐性マーカーを有する適切なベクターにサブクローニングされる。いくつかの実施形態では、ベクターは、エシェリヒア・コリ中でまたは相同組換えが起こるべき生物とは異なる別の生物中で機能的である複製の起点を有し、エシェリヒア・コリまたは相同組換えが起こるべき生物以外の生物中でプラスミドを成長させ得るが、選択可能マーカーの選択がスタフィロコッカス・オーレウス、サルモネラ・チフィムリウム、クレブシエラ・ニューモニエ、シュードモナス・アエルギノーサおよびエンテロコックス・フェカリス、エシェリヒア・コリ、エンテロコックス・フェカリス、ヘモフィルス・インフルエンザ、ヘリコバクター・ピロリ、クレブシエラ・ニューモニエ、シュードモナス・アエルギノーサ、スタフィロコッカス・オーレウス、またはサルモネラ・チフィ染色体の相同領域中へのベクターの組込みを必要とするように、スタフィロコッカス・オーレウス、サルモネラ・チフィムリウム、クレブシエラ・ニューモニエ、シュードモナス・アエルギノーサ、およびエンテロコックス・フェカリス、エシェリヒア・コリ、エンテロコックス・フェカリス、ヘモフィルス・インフルエンザ、ヘリコバクター・ピロリ、クレブシエラ・ニューモニエ、シュードモナス・アエルギノーサ、スタフィロコッカス・オーレウス、またはサルモネラ・チフィ中で機能的な複製起点を欠如し得る。通常は、スタフィロコッカス・オーレウス、サルモネラ・チフィムリウム、クレブシエラ・ニューモニエ、シュードモナス・アエルギノーサおよびエンテロコックス・フェカリス、エシェリヒア・コリ、エンテロコックス・フェカリス、ヘモフィルス・インフルエンザ、ヘリコバクター・ピロリ、クレブシエラ・ニューモニエ、シュードモナス・アエルギノーサ、スタフィロコッカス・オーレウス、またはサルモネラ・チフィ染色体が、ベクター配列により分離された１つの野生型対立遺伝子および１つの欠失ヌル対立遺伝子からなる標的遺伝子のタンデム重複を目下含有するように、単一交差事象がこの組込み事象に関与する。複製のその後の分析は、ベクター配列の除去および野生型遺伝子の復活またはフレーム内欠失による置き換えの両方を生じる。後者の結果は、遺伝子が必須であると証明されるであろう場合には、起こらない。この方法のより詳細な説明を、以下の実施例５で提供する。この方法は、本明細書中に記載される核酸または生物のいずれかを用いて実施され得る。
【０４１１】
組換えＤＮＡ技術は、増殖に必要と同定された遺伝子の全コード配列またはその一部を発現するために用いられ得る。過剰発現タンパク質は、さらなる研究のための試薬として用いられ得る。同定された外因性配列は、当技術分野で既知の方法を用いて単離され、精製され、適切な発現ベクターにクローニングされる。所望により、核酸は単一ペプチドをコードするヌクレオチド配列を含有して、発現タンパク質の分泌を促し得る。
【０４１２】
増殖に必要であると同定された細菌遺伝子の断片の発現もまた、本発明により意図される。同定遺伝子の断片は、本発明の同定された配列の１つに相補的な遺伝子の少なくとも５個、少なくとも１０個、少なくとも１５個、少なくとも２０個、少なくとも２５個、少なくとも３０個、少なくとも３５個、少なくとも４０個、少なくとも４５個、少なくとも５０個、少なくとも５５個、少なくとも６０個、少なくとも６５個、少なくとも７５個または７５個より多い連続アミノ酸を含むポリペプチドをコードし得る。発現ベクター中に挿入される核酸は、コード配列の上流および下流に内因性配列も含有し得る。
【０４１３】
細菌増殖に必要であると同定されたものまたはその断片のコードタンパク質を発現する場合、発現されるべきヌクレオチド配列は、慣用的クローニング技法を用いて発現ベクター中のプロモーターと作動可能に連結された。発現ベクターは、当技術分野で既知の細菌、昆虫、酵母、または哺乳類発現系のいずれかであり得る。市販ベクターおよび発現系は、種々の供給元、例えばGenetics Institute(Cambridge, MA)、Stratagene(La Jolla, CA)、Promega(Madison, WI)、およびInvitrogen(San Diego, CA)から入手可能である。所望により、発現を強化し、適正なタンパク質フォールディングを促すために、配列のコドン使用法およびコドンバイアスは、Hatfieldら（米国特許第５，０８２，７６７号）により説明されているように、発現ベクターが導入される特定の発現生物に関して最適化され得る。融合タンパク質発現系もまた、本発明により意図される。
【０４１４】
同定外因性核酸によりコードされるタンパク質の発現後、タンパク質は精製され得る。タンパク質精製技法は、当技術分野で既知である。同定外因性核酸からコードされ、発現されるタンパク質は、沈殿技法（例えばポリエチレングリコールを用いた沈殿）を用いて、部分的に精製され得る。あるいは、タンパク質のエピトープタグ付けを用いて、タンパク質の簡易な一工程の精製を可能にし得る。さらにクロマトグラフィー法、例えばイオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過、ヒドロキシアパタイトカラムの使用、固定化反応性染料、クロマトフォーカシングおよび高速液体クロマトグラフィーの使用も、タンパク質を精製するために用いられ得る。電気泳動法、例えば一次元ゲル電気泳動、高分解能二次元ポリアクリルアミド電気泳動、等電点電気泳動、およびその他は、精製方法として意図される。さらに、抗体カラム、リガンド提示カラムおよびその他のアフィニティークロマトグラフィーマトリックスを含むアフィニティークロマトグラフィー法が、本発明における精製方法として意図される。
【０４１５】
増殖に必要であると同定された遺伝子コード配列から産生される精製タンパク質は、有用な抗菌試薬を生成するための種々のプロトコルに用いられ得る。本発明の一実施形態では、抗体は同定外因性核酸から発現されるタンパク質に対して生成される。モノクローナルおよびポリクローナル両抗体が発現タンパク質に対して生成され得る。モノクローナルおよびポリクローナル抗体の生成方法は、当技術分野で既知である。さらに、上記の産生抗体から調製される抗体断片調製物が意図される。
【０４１６】
さらに、精製タンパク質、その断片、またはその誘導体は、タンパク質に対する免疫応答を誘導するために、薬学的に許容可能な担体中で個体に投与され得る。好ましくは、免疫応答は、個体を防御する防御免疫応答である。タンパク質および薬学的に許容可能な担体の適切な投与量の決定方法は経験的に決定され得て、当業者に既知である。
【０４１７】
本発明の精製タンパク質に関する別の用途は、本発明の種々の標的タンパク質に対して活性な候補化合物に関して小分子ライブラリーをスクリーニングすることである。コンビナトリアルケミストリーの分野における進展は、標的タンパク質に及ぼす結合またはそうでなければ抑制効果を有し得る多数の候補化合物を生産するための、当技術分野で既知の方法を提供する。したがって、同定遺伝子から産生された標的タンパク質に対する結合親和性または抑制活性を有する化合物に関する小分子ライブラリーのスクリーニングは、本発明により意図される。
【０４１８】
本発明はさらに、スタフィロコッカス・オーレウス、サルモネラ・チフィムリウム、クレブシエラ・ニューモニエ、シュードモナス・アエルギノーサおよびエンテロコッカス・フェカリス、エシェリヒア・コリ、エンテロコッカス・フェカリス、ヘモフィルス・インフルエンザ、ヘリコバクター・ピロリ、クレブシエラ・ニューモニエ、シュードモナス・アエルギノーサ、スタフィロコッカス・オーレウスまたはサルモネラ・チフィのほかに、種々のその他の病原性微生物に対する実用性を意図する。例えば、その他の病原性微生物からの相同コード核酸、相同アンチセンス核酸または相同ポリペプチド（例えば配列番号３７９６〜３８００、３８０６〜４８６０、５９１６〜１００１２の核酸に相同的な核酸、配列番号８〜３７９５のアンチセンス核酸に相同的な核酸、配列番号３８０１〜３８０５、４８６１〜５９１５、１００１３〜１４１１０のポリペプチドに相同的なポリペプチド）は、本明細書中に記載されるような方法を用いて同定され得る。相同コード核酸、相同アンチセンス核酸または相同ポリペプチドは、本明細書中に記載される方法のような方法を用いて、これらのその他の病原性微生物の増殖を抑制する化合物を同定するために用いられ得る。
【０４１９】
例えば、本明細書中に記載されるスタフィロコッカス・オーレウス、サルモネラ・チフィムリウム、クレブシエラ・ニューモニエ、シュードモナス・アエルギノーサおよびエンテロコッカス・フェカリス、エシェリヒア・コリ、エンテロコッカス・フェカリス、ヘモフィルス・インフルエンザ、ヘリコバクター・ピロリ、クレブシエラ・ニューモニエ、シュードモナス・アエルギノーサ、スタフィロコッカス・オーレウス、またはサルモネラ・チフィ由来の増殖に必要な核酸、アンチセンス核酸、およびポリペプチド（例えば配列番号３７９６〜３８００、３８０６〜４８６０、５９１６〜１００１２の核酸、配列番号８〜３７９５のアンチセンス核酸、配列番号３８０１〜３８０５、４８６１〜５９１５、１００１３〜１４１１０のポリペプチド）は、原核生物および真核生物における増殖に必要な相同コード核酸、相同アンチセンス核酸または相同ポリペプチドを同定するために用いられ得る。例えば、原生動物（例えば、プラスモディウ属マラリア病原虫（Plasmodium spp.））、植物、動物（例えば、エントアメーバスピーシーズ（Entamoeba spp.）およびコントラシーカムスピーシーズ（Contracaecum spp.）、ならびに真菌類（例えば、カンジダスピーシーズ（Candida spp）（例えばカンジダ・アルビカンス（Candida albicans））、クリプトコッコス・ネオフォルマンス（Cryprococcus neofarmans）およびアスペルギルス・フミガツス（Aspergillus fumigatus）の増殖に必要な核酸またはポリペプチドが同定され得る。本発明の一実施形態では、モネラ、特に細菌、例えばグラム陽性およびグラム陰性菌の両方が、増殖に必要な新規の遺伝子配列の探求において精査される。同様に、これらの生物の成長を抑制するために、または抗生物質を同定するために用いられ得る相同アンチセンス核酸も同定され得る。これらの実施形態は、薬剤耐性細菌を生じるために特に重要である。
【０４２０】
既存の抗生物質に対して耐性になりつつある細菌種の数は、増加しつつある。これらの微生物の一覧の一部を以下に挙げる。エシェリヒアスピーシーズ（Escherichia spp.）（例えば、エシェリヒア・コリ）、エンテロコッカススピーシーズ（例えば、E.フェカリス）、シュードモナススピーシーズ（Pseudomonas spp.）(例えば、シュードモナス・アエルギノーサ）、クロストリジウムスピーシーズ（Clostridiumspp.）（例えば、クロストリジウム・ボツリヌム）、ヘモフィルススピーシーズ（Haemophilus spp.）（例えば、ヘモフィルス・インフルエンザ）、エンテロバクタースピーシーズ（Enterobacter spp.）（例えば、Ｅ.クロアカエ（E. cloacae））、ビブリオスピーシーズ（Vibrio spp.）（例えば、ビブリオ・コレラ）、モラクセラスピーシーズ（Moraxala spp.）（例えば、Ｍ．カタルハリス（M.catarrhalis）、ストレプトコッカススピーシーズ(Streptococcusspp.)（例えば、ストレプトコッカス・ニューモニエ（S.pneumoniae）、ナイセリアスピーシーズ（Neisseriaspp.）（例えば、ナイセリア・ゴノローエ)、マイコプラズマスピーシーズ（例えば、肺炎マイコプラズマ）、サルモネラ・チフィムリウム、ヘリコバクター・ピロリ、エシェリヒア・コリ、およびマイコバクテリウム・ツベルクローシス。スタフィロコッカス・オーレウス、サルモネラ・チフィムリウム、クレブシエラ・ニューモニエ、シュードモナス・アエルギノーサおよびエンテロコッカス・フェカリス、エシェリヒア・コリ、エンテロコッカス・フェカリス、ヘモフィルス・インフルエンザ、ヘリコバクター・ピロリ、クレブシエラ・ニューモニエ、シュードモナス・アエルギノーサ、スタフィロコッカス・オーレウス、またはサルモネラ・チフィの増殖に必要と同定された遺伝子およびポリペプチド（例えば配列番号３７９６〜３８００、３８０６〜４８６０、５９１６〜１００１２の核酸、配列番号３７９６〜３８００、３８０６〜４８６０、５９１６〜１００１２の核酸に相補的な配列、および配列番号３８０１〜３８０５、４８６１〜５９１５、１００１３〜１４１１０のポリペプチド）は、核酸ハイブリダイゼーションおよびコンピュータデータベース分析のような方法を用いて、これらおよびその他の生物からの増殖に必要とされる相同コード核酸または相同ポリペプチドを同定するために用いられ得る。同様に、スタフィロコッカス・オーレウス、サルモネラ・チフィムリウム、クレブシエラ・ニューモニエ、シュードモナス・アエルギノーサおよびエンテロコッカス・フェカリス、エシェリヒア・コリ、エンテロコッカス・フェカリス、ヘモフィルス・インフルエンザ、ヘリコバクター・ピロリ、クレブシエラ・ニューモニエ、シュードモナス・アエルギノーサ、スタフィロコッカス・オーレウス、またはサルモネラ・チフィの増殖を抑制するアンチセンス核酸（例えば配列番号８〜３７９５のアンチセンス核酸またはそれに相補的な配列）は、核酸ハイブリダイゼーションまたはコンピュータデータベース分析を用いて、これらおよびその他の微生物または細胞の増殖を抑制するアンチセンス核酸を同定するためにも用いられ得る。
【０４２１】
本発明の一実施形態では、スタフィロコッカス・オーレウス、サルモネラ・チフィムリウム、クレブシエラ・ニューモニエ、シュードモナス・アエルギノーサおよびエンテロコッカス・フェカリス、エシェリヒア・コリ、エンテロコッカス・フェカリス、ヘモフィルス・インフルエンザ、ヘリコバクター・ピロリ、クレブシエラ・ニューモニエ、シュードモナス・アエルギノーサ、スタフィロコッカス・オーレウス、またはサルモネラ・チフィ由来の核酸配列（例えば配列番号３７９６〜３８００、３８０６〜４８６０、５９１６〜１００１２の核酸、および配列番号８〜３７９５のアンチセンス核酸）は、スタフィロコッカス・オーレウス、サルモネラ・チフィムリウム、クレブシエラ・ニューモニエ、シュードモナス・アエルギノーサおよびエンテロコッカス・フェカリス、エシェリヒア・コリ、エンテロコッカス・フェカリス、ヘモフィルス・インフルエンザ、ヘリコバクター・ピロリ、クレブシエラ・ニューモニエ、シュードモナス・アエルギノーサ、スタフィロコッカス・オーレウスまたはサルモネラ・チフィおよびその他の当該細菌種から生成されるゲノムライブラリーをスクリーニングするために用いられる。例えば、ゲノムライブラリーは、
アナプラスマ・マルギナレ(Anaplasmamarginale)、アスペルギルス・フミガツス(Aspergillusfumigatus)、バチルス・アンスラシス(Bacillusanthracis)、バクテリオイデス・フラギリス(Bacterioidesfragilis)、百日咳菌(Bordetellapertussis)、ブルクホルデリア・セパシア(Burkholderiacepacia)、カンピロバクター・イェジュニィ(Campylobacterjejuni)、カンジダ・アルビカンス (Candidaalbicans)、カンジダ・グラブラタ(Candidaglabrata)（トルロプシス・グラブラタ(Torulopsisglabrata)とも呼ばれる）、カンジダ・トロピカリス(Candidatropicalis)、カンジダ・パラプシロシス(Candidaparapsilosis)、カンジダ・ギルリエルモンジイ(Candidaguilliermondii)、カンジダ・クルセイ(Candidakrusei)、カンジダ・ケフィア(Candidakefyr)（カンジダ・シュードトロピカリス(Candidapseudotropicalis)とも呼ばれる）、カンジダ・デュブリニエンシス(Candida dubliniensis)、クラミジア・ニューモニエ(Chlamydia pneumoniae)、トラコーマ・クラミジア(Chlamydia trachomatus)、クロストリジウム・ボツリヌム(Clostridium botulinum)、クロストリジウム・ジフィシル(Clostridium difficile)、クロストリジウム・パーフリンゲンス(Clostridium perfringens)、コクシジオデス・イミチス(Coccidiodes immitis)、コリネバクテリウム・ジフテリア(Corynebacterium diptheriae)、クリプトコックス・ネオフォルマンス(Cryptococcus neoformans)、エンテロバクター・クロアカエ(Enterobacter cloacae)、エンテロコックス・フェカリス(Enterococcus faecalis)、エンテロコックス・ファエシウム(Enterococcus faecium)、エシェリヒア・コリ(Escherichia coli)、ヘモフィルス・インフルエンザ(Haemophilus influenzae)、ヘリコバクター・ピロリ(Helicobacter pylori)、ヒストプラスマ・カプスラツム(Histoplasma capsulatum)、クレブシエラ・ニューモニエ(Klebsiella pneumoniae)、リステリア・モノサイトゲネス(Listeria monocytogenes)、マイコバクテリウム・レプラエ(Mycobacterium leprae)、マイコバクテリウム・ツベルクローシス(Mycobacterium tuberculosis)、ナイセリア・ゴノローエ(Neisseria gonorrhoeae)、髄膜炎菌(Neisseria meningitidis)、ノカルジア・アステロイデス(Nocardia asteroides)、パスツレラ・ヘモリチカ(Pasteurella haemolytica)、パスツレラ・ムルトシダ(Pasteurella multocida)、ニューモシスティス・カリニー(Pneumocystis carinii)、プロテウス・ブルガリス(Proteus vulgaris)、シュードモナス・アエルギノーサ(Pseudomonas aeruginosa)、サルモネラ・ボンゴリ(Salmonella bongori)、サルモネラ・コレラスイス(Salmonella cholerasuis)、サルモネラ・エンテリカ(Salmonella enterica)、サルモネラ・パラチフィ(Salmonella paratyphi)、サルモネラ・チフィ(Salmonella typhi)、サルモネラ・チフィムリウム(Salmonella typhimurium)、スタフィロコッカス・オーレウス(Staphylococcus aureus)、リステリア・モノサイトゲネス(Listeria monocytogenes)、モクサレラ・カタルハリス(Moxarella catarrhalis)、シゲラ・ボイディ(Shigella boydii)、シゲラ・ディッセンリイ(Shigelladysenteriae)、シゲラ・フレックスネリ(Shigellaflexneri)、シゲラ・ソネイ(Shigellasonnei)、スタフィロコッカス・エピダーミディス(Staphylococcusepidermidis)、ストレプトコッカス・ニューモニエ(Streptococcuspneumoniae)、ストレプトコッカス・ミュータンス(Streptococcusmutans)、トレポネーマ・パリダム(Treponemapallidum)、エルシニア・エンテロコリチカ(Yersiniaenterocolitica)、エルシニア・ペスティス(Yersiniapestis)、またはスタフィロコッカスのコアグラーゼ陰性種を含む上記種のいずれかの属に属する任意の種を含む、グラム陽性菌、グラム陰性菌、または他の生物由来であり得る。いくつかの実施形態では、ゲノムライブラリーはエシェリヒア・コリ以外の生物由来であり得る。標準分子生物学技法は、種々の細胞または微生物からゲノムライブラリーを生成するために用いられる。一態様では、ライブラリーが生成され、ニトロセルロース紙に結合される。次に、本発明の同定外因性核酸配列は、相同配列に関してライブラリーをスクリーニングするためのプローブとして用いられ得る。
【０４２２】
例えば、ライブラリーは、配列番号８〜３７９５からなる群から選ばれる核酸にストリンジェントな条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列を含む相同コード核酸または相同アンチセンス核酸、配列番号８〜３７９５の１つの少なくとも１０個、１５個、２０個、２５個、３０個、３５個、４０個、５０個、７５個、１００個、１５０個、２００個、３００個、４００個、または５００個の連続ヌクレオチドを含む断片に、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列を含む核酸、配列番号８〜３７９５の１つに相補的な核酸に、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列を含む核酸、配列番号８〜３７９５の１つに相補的な配列の少なくとも１０個、１５個、２０個、２５個、３０個、３５個、４０個、５０個、７５個、１００個、１５０個、２００個、３００個、４００個、または５００個の連続ヌクレオチドを含む断片に、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列を含む核酸、配列番号３７９６〜３８００、３８０６〜４８６０、５９１６〜１００１２からなる群から選ばれる核酸に、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列を含む核酸、配列番号３７９６〜３８００、３８０６〜４８６０、５９１６〜１００１２の１つの少なくとも１０個、１５個、２０個、２５個、３０個、３５個、４０個、５０個、７５個、１００個、１５０個、２００個、３００個、４００個、または５００個の連続ヌクレオチドを含む断片に、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列を含む核酸、配列番号３７９６〜３８００、３８０６〜４８６０、５９１６〜１００１２の１つに相補的な核酸に、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列を含む核酸、配列番号３７９６〜３８００、３８０６〜４８６０、５９１６〜１００１２の１つに相補的な配列の少なくとも１０個、１５個、２０個、２５個、３０個、３５個、４０個、５０個、７５個、１００個、１５０個、２００個、３００個、４００個、または５００個の連続ヌクレオチドを含む断片に、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列を含む核酸、配列番号３７９６〜３８００、３８０６〜４８６０、５９１６〜１００１２からなる群から選ばれる核酸に、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列を含む核酸、配列番号３７９６〜３８００、３８０６〜４８６０、５９１６〜１００１２の１つの少なくとも１０個、１５個、２０個、２５個、３０個、３５個、４０個、５０個、７５個、１００個、１５０個、２００個、３００個、４００個または５００個の連続ヌクレオチドを含む断片に、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列を含む核酸を同定するためにスクリーニングされ得る。
【０４２３】
ライブラリーは、配列番号８〜３７９５からなる群から選ばれる核酸に、穏やかな条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列を含む相同コード核酸または相同アンチセンス核酸、配列番号８〜３７９５の１つの少なくとも１０個、１５個、２０個、２５個、３０個、３５個、４０個、５０個、７５個、１００個、１５０個、２００個、３００個、４００個、または５００個の連続ヌクレオチドを含む断片に、穏やかな条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列を含む核酸、配列番号８〜３７９５の１つに相補的な核酸に、穏やかな条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列を含む核酸、配列番号８〜３７９５の１つに相補的な配列の少なくとも１０個、１５個、２０個、２５個、３０個、３５個、４０個、５０個、７５個、１００個、１５０個、２００個、３００個、４００個、または５００個の連続ヌクレオチドを含む断片に、穏やかな条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列を含む核酸、配列番号３７９６〜３８００、３８０６〜４８６０、５９１６〜１００１２からなる群から選ばれる核酸に、穏やかな条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列を含む核酸、配列番号３７９６〜３８００、３８０６〜４８６０、５９１６〜１００１２の１つの少なくとも１０個、１５個、２０個、２５個、３０個、３５個、４０個、５０個、７５個、１００個、１５０個、２００個、３００個、４００個、または５００個の連続ヌクレオチドを含む断片に、穏やかな条件下でハイブリダイズする核酸配列を含む核酸、配列番号３７９６〜３８００、３８０６〜４８６０、５９１６〜１００１２の１つに相補的な核酸に、穏やかな条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列を含む核酸、および配列番号３７９６〜３８００、３８０６〜４８６０、５９１６〜１００１２の１つに相補的な配列の少なくとも１０個、１５個、２０個、２５個、３０個、３５個、４０個、５０個、７５個、１００個、１５０個、２００個、３００個、４００個、または５００個の連続ヌクレオチドを含む断片に、穏やかな条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列を含む核酸を同定するためにスクリーニングされ得る。
【０４２４】
次に、上記のように同定された相同核酸コード核酸、相同アンチセンス核酸または相同ポリペプチドは、本明細書中に記載されるような方法を用いて、新規の抗菌化合物の同定のための標的または道具として用いられ得る。いくつかの実施形態では、相同コード核酸、相同アンチセンス核酸、または相同ポリペプチドは、１つより多い微生物に対する活性を有する化合物を同定するために用いられ得る。
【０４２５】
例えば、上述の方法を用いて、配列番号８〜３７９５の配列の１つからなる群から選ばれるヌクレオチド配列、その少なくとも１０個、１５個、２０個、２５個、３０個、３５個、４０個、５０個、７５個、１００個、１５０個、２００個、３００個、４００個または５００個の連続ヌクレオチドを含む断片、およびそれに相補的な配列に対して少なくとも９７％、少なくとも９５％、少なくとも９０％、少なくとも８５％、少なくとも８０％、または少なくとも７０％のヌクレオチド配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む相同コード核酸または相同アンチセンス核酸を単離し得る。上述の方法は、配列番号３７９６〜３８００、３８０６〜４８６０、５９１６〜１００１２のヌクレオチド配列の１つからなる群から選ばれるヌクレオチド配列、その少なくとも１０個、１５個、２０個、２５個、３０個、３５個、４０個、５０個、７５個、１００個、１５０個、２００個、３００個、４００個、または５００個の連続ヌクレオチドを含む断片、およびそれに相補的な配列に対して少なくとも９７％、少なくとも９５％、少なくとも９０％、少なくとも８５％、少なくとも８０％、または少なくとも７０％のヌクレオチド配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む相同コード核酸または相同アンチセンス核酸を単離するためにも用いられ得る。いくつかの実施形態では、上述の方法は、配列番号３７９６〜３８００、３８０６〜４８６０、５９１６〜１００１２の配列の１つからなる群から選ばれる核酸配列、その少なくとも１０個、１５個、２０個、２５個、３０個、３５個、４０個、５０個、７５個、１００個、１５０個、２００個、３００個、４００個、または５００個の連続ヌクレオチドを含む断片、およびそれに相補的な配列に対して少なくとも９７％、少なくとも９５％、少なくとも９０％、少なくとも８５％、少なくとも８０％、または少なくとも７０％のヌクレオチド配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む相同コード核酸または相同アンチセンス核酸を単離するために用いられ得る。同一性は、デフォルトパラメーターでＢＬＡＳＴＮバージョン２．０を用いて測定され得る（Altschul, S.F.ら Gapped BLAST andPSI-BLAST: A New Generation of Protein Database Search Programs, Nucleic AcidRes. 25: 3389-3402(1997)）。例えば、相同ポリヌクレオチドは、本明細書中に記載されるコード配列の１つの天然対立遺伝子変異体であるコード配列を含み得る。このような対立遺伝子変異体は、配列番号８〜３７９５、配列番号３７９６〜３８００、３８０６〜４８６０、５９１６〜１００１２の核酸またはそれに相補的なヌクレオチド配列と比較した場合に、１つまたはそれ以上のヌクレオチドの置換、欠失または付加を有し得る。
【０４２６】
さらに、上記の手法は、デフォルトパラメーターでのＦＡＳＴＡバージョン３．０ｔ７８アルゴリズムを用いて決定される場合に、配列番号３８０１〜３８０５、４８６１〜５９１５、１００１３〜１４１１０の配列を含むポリペプチド、または配列番号８〜３７９５の１つの核酸により抑制される発現が、ポリペプチド、またはその少なくとも５個、１０個、１５個、２０個、２５個、３０個、３５個、４０個、５０個、７５個、１００個、１５０個、２００個、３００個、４００個、もしくは５００個の連続アミノ酸を含む断片に対して少なくとも９９％、９５％、少なくとも９０％、少なくとも８５％、少なくとも８０％または少なくとも７０％、少なくとも６０％、少なくとも５０％、少なくとも４０％もしくは少なくとも２５％のアミノ酸同一性または類似性を有するポリペプチドをコードする相同コード核酸を単離するために用いられ得る。あるいは、タンパク質同一性または類似性は、デフォルトパラメーターでのＢＬＡＳＴＰ、デフォルトパラメーターでのＢＬＡＳＴＸ、またはデフォルトパラメーターでのＴＢＬＡＳＴＮを用いて同定され得る（Altschul, S.F.ら Gapped BLASTand PSI-BLAST: A New Generation of Protein Database Search Programs, NucleicAcid Res. 25: 3389-3402(1997)）。
【０４２７】
あるいは、相同コード核酸、相同アンチセンス核酸または相同ポリペプチドは、増殖に関与する核酸またはポリペプチド、または微生物増殖に関与する核酸に対するアンチセンス核酸に対する所望レベルのヌクレオチドまたはアミノ酸配列相同を有する配列を同定するために、データベースを検索することにより同定され得る。種々のこのようなデータベース、例えばGenBankおよびGenSeqは、当業者に利用可能である。いくつかの実施形態では、データベースは、増殖に必要とされる核酸、増殖を抑制するアンチセンス核酸、または増殖に必要とされる核酸の一部もしくは増殖を抑制するアンチセンス核酸の一部に対して少なくとも９７％、少なくとも９５％、少なくとも９０％、少なくとも８５％、少なくとも８０％、または少なくとも７０％のヌクレオチド配列同一性を有する核酸を同定するためにスクリーニングされる。例えば、相同コード配列は、配列番号８〜３７９５の１つに相同的な核酸、その少なくとも１０個、１５個、２０個、２５個、３０個、３５個、４０個、５０個、７５個、１００個、１５０個、２００個、３００個、４００個、または５００個の連続ヌクレオチドを含む断片に相同的な核酸、配列番号３７９６〜３８００、３８０６〜４８６０、５９１６〜１００１２の１つに相同的な核酸、配列番号３７９６〜３８００、３８０６〜４８６０、５９１６〜１００１２の１つの少なくとも１０個、１５個、２０個、２５個、３０個、３５個、４０個、５０個、７５個、１００個、１５０個、２００個、３００個、４００個、または５００個の連続ヌクレオチドを含む断片に相同な核酸、配列番号８〜３７９５の１つに相同な核酸、その少なくとも１０個、１５個、２０個、２５個、３０個、３５個、４０個、５０個、７５個、１００個、１５０個、２００個、３００個、４００個、または５００個の連続ヌクレオチドを含む断片に相同な核酸、または上述の核酸のいずれかに相補的な配列に相同的な核酸を同定するために、データベースを用いることにより同定され得る。その他の実施形態では、データベースは、増殖に関与するポリペプチドまたはその一部に対して少なくとも９９％、９５％、少なくとも９０％、少なくとも８５％、少なくとも８０％、少なくとも７０％、少なくとも６０％、少なくとも５０％、少なくとも４０％または少なくとも２５％のアミノ酸配列同一性または類似性を有するポリペプチドを同定するためにスクリーニングされる。例えば、データベースは、配列番号３８０１〜３８０５、４８６１〜５９１５、１００１３〜１４１１０の１つを含むポリペプチド、配列番号８〜３７９５の１つの核酸により発現が抑制されるポリペプチドに相同的なポリペプチドまたは上述のポリペプチドのいずれかの少なくとも５個、１０個、１５個、２０個、２５個、３０個、３５個、４０個、５０個、７５個、１００個、もしくは１５０個の連続アミノ酸を含む断片に相同的なポリペプチドを同定するためにスクリーニングされ得る。いくつかの実施形態では、データベースは、それらが得られたスタフィロコッカス・オーレウス、サルモネラ・チフィムリウム、クレブシエラ・ニューモニエ、シュードモナス・アエルギノーサおよびエンテロコックス・フェカリス、エシェリヒア・コリ、エンテロコックス・フェカリス、ヘモフィルス・インフルエンザ、ヘリコバクター・ピロリ、クレブシエラ・ニューモニエ、シュードモナス・アエルギノーサ、スタフィロコッカス・オーレウス、またはサルモネラ・チフィスピーシーズ以外の細胞または微生物からの相同コード核酸、相同アンチセンス核酸または相同ポリペプチドを同定するためにスクリーニングされ得る。例えば、データベースは、アナプラスマ・マルギナレ(Anaplasma marginale)、アスペルギルス・フミガツス(Aspergillus fumigatus)、バチルス・アンスラシス(Bacillus anthracis)、バクテリオイデス・フラギリス(Bacterioides fragilis)、百日咳菌(Bordetella pertussis)、ブルクホルデリア・セパシア(Burkholderia cepacia)、カンピロバクター・イェジュニィ(Campylobacter jejuni)、カンジダ・アルビカンス (Candida albicans)、カンジダ・グラブラタ(Candida glabrata)（トルロプシス・グラブラタ(Torulopsis glabrata)とも呼ばれる）、カンジダ・トロピカリス(Candida tropicalis)、カンジダ・パラプシロシス(Candida parapsilosis)、カンジダ・ギルリエルモンジイ(Candida guilliermondii)、カンジダ・クルセイ(Candida krusei)、カンジダ・ケフィア(Candidakefyr)（カンジダ・シュードトロピカリス(Candidapseudotropicalis)とも呼ばれる）、カンジダ・デュブリニエンシス(Candida dubliniensis)、クラミジア・ニューモニエ(Chlamydia pneumoniae)、トラコーマ・クラミジア(Chlamydia trachomatus)、クロストリジウム・ボツリヌム(Clostridium botulinum)、クロストリジウム・ジフィシル(Clostridium difficile)、クロストリジウム・パーフリンゲンス(Clostridium perfringens)、コクシジオデス・イミチス(Coccidiodes immitis)、コリネバクテリウム・ジフテリア(Corynebacterium diptheriae)、クリプトコックス・ネオフォルマンス(Cryptococcus neoformans)、エンテロバクター・クロアカエ(Enterobacter cloacae)、エンテロコックス・フェカリス(Enterococcus faecalis)、エンテロコックス・ファエシウム(Enterococcus faecium)、エシェリヒア・コリ(Escherichia coli)、ヘモフィルス・インフルエンザ(Haemophilus influenzae)、ヘリコバクター・ピロリ(Helicobacter pylori)、ヒストプラスマ・カプスラツム(Histoplasma capsulatum)、クレブシエラ・ニューモニエ(Klebsiella pneumoniae)、リステリア・モノサイトゲネス(Listeria monocytogenes)、マイコバクテリウム・レプラエ(Mycobacterium leprae)、マイコバクテリウム・ツベルクローシス(Mycobacterium tuberculosis)、ナイセリア・ゴノローエ(Neisseria gonorrhoeae)、髄膜炎菌(Neisseria meningitidis)、ノカルジア・アステロイデス(Nocardia asteroides)、パスツレラ・ヘモリチカ(Pasteurella haemolytica)、パスツレラ・ムルトシダ(Pasteurella multocida)、ニューモシスティス・カリニー(Pneumocystis carinii)、プロテウス・ブルガリス(Proteus vulgaris)、シュードモナス・アエルギノーサ(Pseudomonas aeruginosa)、サルモネラ・ボンゴリ(Salmonella bongori)、サルモネラ・コレラスイス(Salmonella cholerasuis)、サルモネラ・エンテリカ(Salmonella enterica)、サルモネラ・パラチフィ(Salmonella paratyphi)、サルモネラ・チフィ(Salmonella typhi)、サルモネラ・チフィムリウム(Salmonella typhimurium)、スタフィロコッカス・オーレウス(Staphylococcus aureus)、リステリア・モノサイトゲネス(Listeria monocytogenes)、モクサレラ・カタルハリス(Moxarella catarrhalis)、シゲラ・ボイディ(Shigella boydii)、シゲラ・ディッセンリイ(Shigelladysenteriae)、シゲラ・フレックスネリ(Shigellaflexneri)、シゲラ・ソネイ(Shigellasonnei)、スタフィロコッカス・エピダーミディス(Staphylococcusepidermidis)、ストレプトコッカス・ニューモニエ(Streptococcuspneumoniae)、ストレプトコッカス・ミュータンス(Streptococcusmutans)、トレポネーマ・パリダム(Treponemapallidum)、エルシニア・エンテロコリチカ(Yersiniaenterocolitica)、エルシニア・ペスティス(Yersiniapestis)、またはスタフィロコッカスのコアグラーゼ陰性種を含む上記種のいずれかの属に属する任意の種などの微生物由来の相同コード核酸、相同アンチセンス核酸、または相同ポリペプチドを同定するためにスクリーニングされ得る。いくつかの実施形態では、相同コード核酸、相同アンチセンス核酸、または相同ポリペプチドは、エシェリヒア・コリ以外の生物由来である。
【０４２８】
別の実施形態では、遺伝子発現アレイおよびマイクロアレイが用いられ得る。遺伝子発現アレイは、ガラスチップ、ナイロン膜などの上の特定の位置に沈着されたＤＮＡ試料の高密度アレイである。このようなアレイは、異なる条件下での相対的遺伝子発現を定量化するために研究者により用いられ得る。遺伝子発現アレイは、最適な薬剤標的を同定し、新規化合物をプロファイルし、そして疾患経路を決定するのを助けるために研究者により用いられる。この技法の一例は、米国特許第５８０７５２２号に見出される。
【０４２９】
単一アレイを用いて、特定の微生物のゲノム中のすべての遺伝子の発現を研究することができる。例えば、アレイは、スタフィロコッカス・オーレウス、サルモネラ・チフィムリウム、クレブシエラ・ニューモニエ、シュードモナス・アエルギノーサおよびエンテロコックス・フェカリス、エシェリヒア・コリ、エンテロコックス・フェカリス、ヘモフィルス・インフルエンザ、ヘリコバクター・ピロリ、クレブシエラ・ニューモニエ、シュードモナス・アエルギノーサ、スタフィロコッカス・オーレウス、またはサルモネラ・チフィ由来のＯＲＦに対応するＰＣＲ産物（例えば配列番号３７９６〜３８００、３８０６〜４８６０、５９１６〜１００１２の核酸）を含有する１２×２４ｃｍナイロンフィルターから成り得る。１０ｎｇの各ＰＣＲ産物を、フィルター上に１．５ｍｍ毎に点在させる。一本鎖標識ｃＤＮＡが、アレイとのハイブリダイゼーションのために調製され（第２の鎖合成または増幅工程は実行されない）、フィルターと接触して置かれる。したがって、標識ｃＤＮＡは、「アンチセンス」方向を有するものである。定量分析は、リン画像生成機（phosphorimager）により実行される。
【０４３０】
全細胞ｍＲＮＡの試料から作製されたｃＤＮＡとこのようなアレイとのハイブリダイゼーション、その後の１つまたはそれ以上の当業者に既知の種々の技法による結合の検出は、ｃＤＮＡがハイブリダイズしたアレイ上の各位置にシグナルを生じる。したがって、アレイ中の各位置で得られたハイブリダイゼーションシグナルの強度は、試料中に存在したその特定の遺伝子に関するｍＲＮＡ量を反映する。したがって、異なる条件下で成長した細胞から単離されたｍＲＮＡに関して得られた結果の比較は、異なる条件下で成長中の個々の遺伝子の各々の発現の相対量の比較を可能にする。
【０４３１】
遺伝子発現アレイは、増殖に必要な遺伝子に相補的なアンチセンス核酸の誘導後の種々の時点での全ｍＲＮＡ発現パターンを分析するために用いられ得る。アレイとのハイブリダイゼーションにより示される発現パターンの分析は、その発現がアンチセンス発現により影響を及ぼされるその他の遺伝子に関する情報を提供する。例えば、アンチセンスが５０Ｓサブユニット中のリボソームタンパク質Ｌ７／Ｌ１２に関する遺伝子に相補的である場合、その他のｍＲＮＡのレベルはＬ７／Ｌ１２遺伝子に対するアンチセンスの発現後、増大するか、低減するか、またはそのままであることが観察され得る。アンチセンスが異なる５０Ｓサブユニットリボソームタンパク質ｍＲＮＡ（例えばＬ２５）に相補的である場合、異なるｍＲＮＡ発現パターンが生じ得る。したがって、増殖に必要な遺伝子に相補的なヌクレオチド配列を含むアンチセンス核酸の発現後に観察されるｍＲＮＡ発現パターンは、他の増殖に必要な核酸を同定し得る。さらに、細菌が候補薬剤化合物または既知の抗生物質に曝露された場合に観察されるｍＲＮＡ発現パターンは、増殖に必要な核酸に相補的なヌクレオチド配列を含むアンチセンス核酸を用いて観察されたものと比較され得る。候補薬剤化合物を用いて観察されたｍＲＮＡ発現パターンがアンチセンス核酸を用いて観察されたものと類似する場合、薬剤化合物は有望な治療薬候補であり得る。したがってアッセイは、薬剤開発における使用のための有望な候補薬剤化合物の選定を補佐するのに有用であろう。
【０４３２】
アレイ上に沈着された核酸の供給源およびアレイとハイブリダイズされる核酸の供給源が２つの異なる細胞または微生物由来である場合、遺伝子発現アレイは２つの細胞または微生物中の相同核酸を同定し得る。
【０４３３】
本発明は、増殖に必要な遺伝子に関してその他の微生物をスクリーニングするためのさらなる方法も意図する。この実施形態の一太陽では、スタフィロコッカス・オーレウス、サルモネラ・チフィムリウム、クレブシエラ・ニューモニエ、シュードモナス・アエルギノーサおよびエンテロコックス・フェカリス、エシェリヒア・コリ、エンテロコックス・フェカリス、ヘモフィルス・インフルエンザ、ヘリコバクター・ピロリ、クレブシエラ・ニューモニエ、シュードモナス・アエルギノーサ、スタフィロコッカス・オーレウス、またはサルモネラ・チフィ由来の増殖に必要な配列またはその一部に相補的なヌクレオチド配列を含むアンチセンス核酸は、自己または異種細胞もしくは微生物の増殖に必要とされる核酸のレベルまたは活性を変えるような方法でアンチセンス方向で転写される。例えば、アンチセンス核酸は、相同アンチセンス核酸、例えば配列番号３７９６〜３８００、３８０６〜４８６０、５９１６〜１００１２の１つに相補的なヌクレオチド配列に相同的なアンチセンス核酸、配列番号８〜３７９５の１つに相同的なヌクレオチド配列を含むアンチセンス核酸、または上述の核酸のうちのいずれかの一部に相補的なヌクレオチド配列を含むアンチセンス核酸であり得る。相同アンチセンス核酸を転写する細胞または微生物を、細胞ベースのアッセイ、例えば本明細書中に記載するアッセイにて用いて、候補抗生物質化合物を同定し得る。別の実施形態では、増殖に必要であると同定されたヌクレオチド配列の保存部分を用いて、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）における使用のための縮重プライマーを生成し得る。ＰＣＲ技法は、当技術分野で既知である。本明細書中で同定されたヌクレオチド配列から生成される縮重プローブを用いたＰＣＲ産物の上首尾の産生は、スクリーニングされている種における相同遺伝子配列の存在を示す。次に、この相同遺伝子は単離され、発現され、そして候補抗生物質化合物のための標的として用いられる。この実施形態の別の態様では、このように同定された相同遺伝子（例えば相同コード核酸）またはその一部は、自己または異種細胞もしくは微生物中での増殖に必要とされる相同遺伝子のレベルまたは活性を変えるような方法で、アンチセンス方向で、自己細胞または微生物中で、または異種細胞もしくは微生物中で転写される。あるいは、相同アンチセンス核酸は、自己または異種細胞もしくは微生物中での増殖に必要とされる遺伝子産物のレベルまたは活性を変えるような方法で、自己または異種細胞もしくは微生物中で転写され得る。
【０４３４】
スタフィロコッカス・オーレウス、サルモネラ・チフィムリウム、クレブシエラ・ニューモニエ、シュードモナス・アエルギノーサおよびエンテロコックス・フェカリス、エシェリヒア・コリ、エンテロコックス・フェカリス、ヘモフィルス・インフルエンザ、ヘリコバクター・ピロリ、クレブシエラ・ニューモニエ、シュードモナス・アエルギノーサ、スタフィロコッカス・オーレウス、またはサルモネラ・チフィの増殖に必要とされる遺伝子に相同的な核酸またはそれに相補的な配列は、スタフィロコッカス・オーレウス、サルモネラ・チフィムリウム、クレブシエラ・ニューモニエ、シュードモナス・アエルギノーサおよびエンテロコックス・フェカリス、エシェリヒア・コリ、エンテロコックス・フェカリス、ヘモフィルス・インフルエンザ、ヘリコバクター・ピロリ、クレブシエラ・ニューモニエ、シュードモナス・アエルギノーサ、スタフィロコッカス・オーレウス、またはサルモネラ・チフィ以外の細胞もしくは微生物由来の相同コード核酸または相同アンチセンス核酸を同定するために用いられて、スタフィロコッカス・オーレウス、サルモネラ・チフィムリウム、クレブシエラ・ニューモニエ、シュードモナス・アエルギノーサおよびエンテロコックス・フェカリス、エシェリヒア・コリ、エンテロコックス・フェカリス、ヘモフィルス・インフルエンザ、ヘリコバクター・ピロリ、クレブシエラ・ニューモニエ、シュードモナス・アエルギノーサ、スタフィロコッカス・オーレウスもしくはサルモネラ・チフィ以外の細胞または微生物中の同定相同コード核酸または相同ポリペプチドの活性を抑制するか、または量を低減することにより、スタフィロコッカス・オーレウス、サルモネラ・チフィムリウム、クレブシエラ・ニューモニエ、シュードモナス・アエルギノーサおよびエンテロコックス・フェカリス、エシェリヒア・コリ、エンテロコックス・フェカリス、ヘモフィルス・インフルエンザ、ヘリコバクターピロリ、クレブシエラ・ニューモニエ、シュードモナス・アエルギノーサ、スタフィロコッカス・オーレウスもしくはサルモネラ・チフィ以外の細胞または微生物の増殖を抑制してもよく、または下記のようにスタフィロコッカス・オーレウス、サルモネラ・チフィムリウム、クレブシエラ・ニューモニエ、シュードモナス・アエルギノーサおよびエンテロコックス・フェカリス、エシェリヒア・コリ、エンテロコックス・フェカリス、ヘモフィルス・インフルエンザ、ヘリコバクター・ピロリ、もしくはサルモネラ・チフィ以外の細胞または微生物の成長を抑制する化合物を同定し得る。例えば、スタフィロコッカス・オーレウス、サルモネラ・チフィムリウム、クレブシエラ・ニューモニエ、シュードモナス・アエルギノーサおよびエンテロコックス・フェカリス、エシェリヒア・コリ、エンテロコックス・フェカリス、ヘモフィルス・インフルエンザ、ヘリコバクター・ピロリ、クレブシエラ・ニューモニエ、シュードモナス・アエルギノーサ、スタフィロコッカス・オーレウス、またはサルモネラ・チフィ由来の増殖に必要とされる遺伝子に相同的な核酸またはそれに相補的な配列は、アナプラスマ・マルギナレ(Anaplasma marginale)、アスペルギルス・フミガツス(Aspergillus fumigatus)、バチルス・アンスラシス(Bacillus anthracis)、バクテリオイデス・フラギリス(Bacterioides fragilis)、百日咳菌(Bordetella pertussis)、ブルクホルデリア・セパシア(Burkholderia cepacia)、カンピロバクター・イェジュニィ(Campylobacter jejuni)、カンジダ・アルビカンス (Candida albicans)、カンジダ・グラブラタ(Candida glabrata)（トルロプシス・グラブラタ(Torulopsis glabrata)とも呼ばれる）、カンジダ・トロピカリス(Candida tropicalis)、カンジダ・パラプシロシス(Candida parapsilosis)、カンジダ・ギルリエルモンジイ(Candida guilliermondii)、カンジダ・クルセイ(Candida krusei)、カンジダ・ケフィア(Candidakefyr)（カンジダ・シュードトロピカリス(Candidapseudotropicalis)とも呼ばれる）、カンジダ・デュブリニエンシス(Candida dubliniensis)、クラミジア・ニューモニエ(Chlamydia pneumoniae)、トラコーマ・クラミジア(Chlamydia trachomatus)、クロストリジウム・ボツリヌム(Clostridium botulinum)、クロストリジウム・ジフィシル(Clostridium difficile)、クロストリジウム・パーフリンゲンス(Clostridium perfringens)、コクシジオデス・イミチス(Coccidiodes immitis)、コリネバクテリウム・ジフテリア(Corynebacterium diptheriae)、クリプトコックス・ネオフォルマンス(Cryptococcus neoformans)、エンテロバクター・クロアカエ(Enterobacter cloacae)、エンテロコックス・フェカリス(Enterococcus faecalis)、エンテロコックス・ファエシウム(Enterococcus faecium)、エシェリヒア・コリ(Escherichia coli)、ヘモフィルス・インフルエンザ(Haemophilus influenzae)、ヘリコバクター・ピロリ(Helicobacter pylori)、ヒストプラスマ・カプスラツム(Histoplasma capsulatum)、クレブシエラ・ニューモニエ(Klebsiella pneumoniae)、リステリア・モノサイトゲネス(Listeria monocytogenes)、マイコバクテリウム・レプラエ(Mycobacterium leprae)、マイコバクテリウム・ツベルクローシス(Mycobacterium tuberculosis)、ナイセリア・ゴノローエ(Neisseria gonorrhoeae)、髄膜炎菌(Neisseria meningitidis)、ノカルジア・アステロイデス(Nocardia asteroides)、パスツレラ・ヘモリチカ(Pasteurella haemolytica)、パスツレラ・ムルトシダ(Pasteurella multocida)、ニューモシスティス・カリニー(Pneumocystis carinii)、プロテウス・ブルガリス(Proteus vulgaris)、シュードモナス・アエルギノーサ(Pseudomonas aeruginosa)、サルモネラ・ボンゴリ(Salmonella bongori)、サルモネラ・コレラスイス(Salmonella cholerasuis)、サルモネラ・エンテリカ(Salmonella enterica)、サルモネラ・パラチフィ(Salmonella paratyphi)、サルモネラ・チフィ(Salmonella typhi)、サルモネラ・チフィムリウム(Salmonella typhimurium)、スタフィロコッカス・オーレウス(Staphylococcus aureus)、リステリア・モノサイトゲネス(Listeria monocytogenes)、モクサレラ・カタルハリス(Moxarella catarrhalis)、シゲラ・ボイディ(Shigella boydii)、シゲラ・ディッセンリイ(Shigelladysenteriae)、シゲラ・フレックスネリ(Shigellaflexneri)、シゲラ・ソネイ(Shigellasonnei)、スタフィロコッカス・エピダーミディス(Staphylococcusepidermidis)、ストレプトコッカス・ニューモニエ(Streptococcuspneumoniae)、ストレプトコッカス・ミュータンス(Streptococcusmutans)、トレポネーマ・パリダム(Treponemapallidum)、エルシニア・エンテロコリチカ(Yersiniaenterocolitica)、エルシニア・ペスティス(Yersiniapestis)、または上記種のいずれかの属に属する任意の種の成長を抑制する化合物を同定するために用いられ得る。本発明のいくつかの実施形態では、スタフィロコッカス・オーレウス、サルモネラ・チフィムリウム、クレブシエラ・ニューモニエ、シュードモナス・アエルギノーサおよびエンテロコックス・フェカリス、エシェリヒア・コリ、エンテロコックス・フェカリス、ヘモフィルス・インフルエンザ、ヘリコバクターピロリ、クレブシエラ・ニューモニエ、シュードモナス・アエルギノーサ、スタフィロコッカス・オーレウス、またはサルモネラ・チフィ由来の増殖に必要な配列に相同的な核酸（例えば配列番号３７９６〜３８００、３８０６〜４８６０、５９１６〜１００１２の１つに相同的な核酸）またはそれに相補的な配列（例えば配列番号８〜３７９５の１つに相同的な核酸）は、エシェリヒア・コリ以外の生物中での増殖に必要な配列を同定するために用いられる。
【０４３５】
本発明の別の実施形態では、増殖に必要であると同定された配列に相補的なアンチセンス核酸またはその一部（例えば配列番号３７９６〜３８００、３８０６〜４８６０、５９１６〜１００１２の１つに相補的なヌクレオチド配列を含むアンチセンス核酸またはその一部、例えば配列番号８〜３７９５の核酸）は、配列が得られた種以外の種内で機能し得るベクターに移される。例えば、ベクターは、アナプラスマ・マルギナレ(Anaplasma marginale)、アスペルギルス・フミガツス(Aspergillus fumigatus)、バチルス・アンスラシス(Bacillus anthracis)、バクテリオイデス・フラギリス(Bacterioides fragilis)、百日咳菌(Bordetella pertussis)、ブルクホルデリア・セパシア(Burkholderia cepacia)、カンピロバクター・イェジュニィ(Campylobacter jejuni)、カンジダ・アルビカンス (Candida albicans)、カンジダ・グラブラタ(Candida glabrata)（トルロプシス・グラブラタ(Torulopsis glabrata)とも呼ばれる）、カンジダ・トロピカリス(Candida tropicalis)、カンジダ・パラプシロシス(Candida parapsilosis)、カンジダ・ギルリエルモンジイ(Candida guilliermondii)、カンジダ・クルセイ(Candida krusei)、カンジダ・ケフィア(Candidakefyr)（カンジダ・シュードトロピカリス(Candidapseudotropicalis)とも呼ばれる）、カンジダ・デュブリニエンシス(Candida dubliniensis)、クラミジア・ニューモニエ(Chlamydia pneumoniae)、トラコーマ・クラミジア(Chlamydia trachomatus)、クロストリジウム・ボツリヌム(Clostridium botulinum)、クロストリジウム・ジフィシル(Clostridium difficile)、クロストリジウム・パーフリンゲンス(Clostridium perfringens)、コクシジオデス・イミチス(Coccidiodes immitis)、コリネバクテリウム・ジフテリア(Corynebacterium diptheriae)、クリプトコックス・ネオフォルマンス(Cryptococcus neoformans)、エンテロバクター・クロアカエ(Enterobacter cloacae)、エンテロコックス・フェカリス(Enterococcus faecalis)、エンテロコックス・ファエシウム(Enterococcus faecium)、エシェリヒア・コリ(Escherichia coli)、ヘモフィルス・インフルエンザ(Haemophilus influenzae)、ヘリコバクター・ピロリ(Helicobacter pylori)、ヒストプラスマ・カプスラツム(Histoplasma capsulatum)、クレブシエラ・ニューモニエ(Klebsiella pneumoniae)、リステリア・モノサイトゲネス(Listeria monocytogenes)、マイコバクテリウム・レプラエ(Mycobacterium leprae)、マイコバクテリウム・ツベルクローシス(Mycobacterium tuberculosis)、ナイセリア・ゴノローエ(Neisseria gonorrhoeae)、髄膜炎菌(Neisseria meningitidis)、ノカルジア・アステロイデス(Nocardia asteroides)、パスツレラ・ヘモリチカ(Pasteurella haemolytica)、パスツレラ・ムルトシダ(Pasteurella multocida)、ニューモシスティス・カリニー(Pneumocystis carinii)、プロテウス・ブルガリス(Proteus vulgaris)、シュードモナス・アエルギノーサ(Pseudomonas aeruginosa)、サルモネラ・ボンゴリ(Salmonella bongori)、サルモネラ・コレラスイス(Salmonella cholerasuis)、サルモネラ・エンテリカ(Salmonella enterica)、サルモネラ・パラチフィ(Salmonella paratyphi)、サルモネラ・チフィ(Salmonella typhi)、サルモネラ・チフィムリウム(Salmonella typhimurium)、スタフィロコッカス・オーレウス(Staphylococcus aureus)、リステリア・モノサイトゲネス(Listeria monocytogenes)、モクサレラ・カタルハリス(Moxarella catarrhalis)、シゲラ・ボイディ(Shigella boydii)、シゲラ・ディッセンリイ(Shigelladysenteriae)、シゲラ・フレックスネリ(Shigellaflexneri)、シゲラ・ソネイ(Shigellasonnei)、スタフィロコッカス・エピダーミディス(Staphylococcusepidermidis)、ストレプトコッカス・ニューモニエ(Streptococcuspneumoniae)、ストレプトコッカス・ミュータンス(Streptococcusmutans)、トレポネーマ・パリダム(Treponemapallidum)、エルシニア・エンテロコリチカ(Yersiniaenterocolitica)、エルシニア・ペスティス(Yersiniapestis)、または上記種のいずれかの属に属する任意の種において機能し得る。本発明のいくつかの実施形態では、ベクターはエシェリヒア・コリ以外の生物中で機能的であり得る。当業者に理解されるように、ベクターは、種特異的なある種の要素を含有し得る。これらの要素としては、プロモーター配列、オペレーター配列、リプレッサー遺伝子、複製起点、リボソーム結合配列、終止配列などが挙げられ得る。アンチセンス核酸を用いるために、培養細菌細胞からの当該配列を含有するベクターを単離し、それらの配列を単離および精製し、そしてスクリーニングされるべき細菌種中で用いるために適合されたベクターにそれらの配列をサブクローニングするために標準分子生物学的技法を用いることを当業者は知っている。
【０４３６】
種々のその他の種に関するベクターは、当技術分野で既知である。例えば、エシェリヒア・コリ中で機能する多数のベクターが当技術分野で既知である。また、Plaらは、多数の関連宿主中で、例えばサルモネラ・チフィムリウム、シュードモナス・プチダ（Pseudomonas putida）およびシュードモナス・アエルギノーサ中で機能する発現ベクターを報告している（J. Bacteriol. 172(8): 4448-55(1990)）。BrunschwigとDarzins(Gene(1992) 111:35-4)は、シュードモナス・アエルギノーサに関するシャトル発現ベクター(shuttle expression vector)について記載した。同様に、種々のグラム陽性微生物の間で自由に移行可能である発現ベクターの多数の例が存在する。エンテロコックス・フェカリスに関する発現ベクターは、ｐＡＫ８０主鎖中に適切なプロモーターを組み込むことにより操作され得る（Israelsen, H., S.M.Madsen, A.Vrang, E.B.Hansen and E.Johansen. 1995.Appl. Environ. Microbiol. 61:2540-2547）。
【０４３７】
当該第２の細胞または微生物（例えば、同定された核酸が得られたもの以外の細胞または微生物）中で機能的なベクターへの、スタフィロコッカス・オーレウス、サルモネラ・チフィムリウム、クレブシエラ・ニューモニエ、シュードモナス・アエルギノーサおよびエンテロコックス・フェカリス、エシェリヒア・コリ、エンテロコックス・フェカリス、ヘモフィルス・インフルエンザ、ヘリコバクター・ピロリ、クレブシエラ・ニューモニエ、シュードモナス・アエルギノーサ、スタフィロコッカス・オーレウス、またはサルモネラ・チフィ由来の増殖に必要な配列またはその一部に相補的なアンチセンス核酸のサブクローニング後、アンチセンス核酸は、細菌成長抑制に関して試験するために条件付で転写される。転写されると、第２の細胞または微生物の成長を抑制するスタフィロコッカス・オーレウス、サルモネラ・チフィムリウム、クレブシエラ・ニューモニエ、シュードモナス・アエルギノーサおよびエンテロコックス・フェカリス、エシェリヒア・コリ、エンテロコックス・フェカリス、ヘモフィルス・インフルエンザ、ヘリコバクター・ピロリ、またはサルモネラ・チフィ由来の核酸のヌクレオチド配列は、第２の生物由来の相同遺伝子を同定するために、第２の細胞または微生物の既知のゲノム配列と比較される。第２の細胞または微生物由来の相同配列が既知でない場合、それは、当該増殖に必要なスタフィロコッカス・オーレウス、サルモネラ・チフィムリウム、クレブシエラ・ニューモニエ、シュードモナス・アエルギノーサおよびエンテロコックス・フェカリス、エシェリヒア・コリ、エンテロコックス・フェカリス、ヘモフィルス・インフルエンザ、ヘリコバクター・ピロリ、またはサルモネラ・チフィ配列とのハイブリダイゼーションにより、もしくは上記のような当該増殖に必要なヌクレオチド配列に基づくＰＣＲプライマーを用いた増幅により、同定および単離され得る。この方法において、第２の細胞または微生物の増殖に必要とされ得る配列が同定され得る。例えば、第２の微生物は、アナプラスマ・マルギナレ(Anaplasma marginale)、アスペルギルス・フミガツス(Aspergillus fumigatus)、バチルス・アンスラシス(Bacillus anthracis)、バクテリオイデス・フラギリス(Bacterioides fragilis)、百日咳菌(Bordetella pertussis)、ブルクホルデリア・セパシア(Burkholderia cepacia)、カンピロバクター・イェジュニィ(Campylobacter jejuni)、カンジダ・アルビカンス (Candida albicans)、カンジダ・グラブラタ(Candida glabrata)（トルロプシス・グラブラタ(Torulopsis glabrata)とも呼ばれる）、カンジダ・トロピカリス(Candida tropicalis)、カンジダ・パラプシロシス(Candida parapsilosis)、カンジダ・ギルリエルモンジイ(Candida guilliermondii)、カンジダ・クルセイ(Candida krusei)、カンジダ・ケフィア(Candidakefyr)（カンジダ・シュードトロピカリス(Candidapseudotropicalis)とも呼ばれる）、カンジダ・デュブリニエンシス(Candida dubliniensis)、クラミジア・ニューモニエ(Chlamydia pneumoniae)、トラコーマ・クラミジア(Chlamydia trachomatus)、クロストリジウム・ボツリヌム(Clostridium botulinum)、クロストリジウム・ジフィシル(Clostridium difficile)、クロストリジウム・パーフリンゲンス(Clostridium perfringens)、コクシジオデス・イミチス(Coccidiodes immitis)、コリネバクテリウム・ジフテリア(Corynebacterium diptheriae)、クリプトコックス・ネオフォルマンス(Cryptococcus neoformans)、エンテロバクター・クロアカエ(Enterobacter cloacae)、エンテロコックス・フェカリス(Enterococcus faecalis)、エンテロコックス・ファエシウム(Enterococcus faecium)、エシェリヒア・コリ(Escherichia coli)、ヘモフィルス・インフルエンザ(Haemophilus influenzae)、ヘリコバクター・ピロリ(Helicobacter pylori)、ヒストプラスマ・カプスラツム(Histoplasma capsulatum)、クレブシエラ・ニューモニエ(Klebsiella pneumoniae)、リステリア・モノサイトゲネス(Listeria monocytogenes)、マイコバクテリウム・レプラエ(Mycobacterium leprae)、マイコバクテリウム・ツベルクローシス(Mycobacterium tuberculosis)、ナイセリア・ゴノローエ(Neisseria gonorrhoeae)、髄膜炎菌(Neisseria meningitidis)、ノカルジア・アステロイデス(Nocardia asteroides)、パスツレラ・ヘモリチカ(Pasteurella haemolytica)、パスツレラ・ムルトシダ(Pasteurella multocida)、ニューモシスティス・カリニー(Pneumocystis carinii)、プロテウス・ブルガリス(Proteus vulgaris)、シュードモナス・アエルギノーサ(Pseudomonas aeruginosa)、サルモネラ・ボンゴリ(Salmonella bongori)、サルモネラ・コレラスイス(Salmonella cholerasuis)、サルモネラ・エンテリカ(Salmonella enterica)、サルモネラ・パラチフィ(Salmonella paratyphi)、サルモネラ・チフィ(Salmonella typhi)、サルモネラ・チフィムリウム(Salmonella typhimurium)、スタフィロコッカス・オーレウス(Staphylococcus aureus)、リステリア・モノサイトゲネス(Listeria monocytogenes)、モクサレラ・カタルハリス(Moxarella catarrhalis)、シゲラ・ボイディ(Shigella boydii)、シゲラ・ディッセンリイ(Shigelladysenteriae)、シゲラ・フレックスネリ(Shigellaflexneri)、シゲラ・ソネイ(Shigellasonnei)、スタフィロコッカス・エピダーミディス(Staphylococcusepidermidis)、ストレプトコッカス・ニューモニエ(Streptococcuspneumoniae)、ストレプトコッカス・ミュータンス(Streptococcusmutans)、トレポネーマ・パリダム(Treponemapallidum)、エルシニア・エンテロコリチカ(Yersiniaenterocolitica)、エルシニア・ペスティス(Yersiniapestis)、または上記種のいずれかの属に属する任意の種であり得る。本発明のいくつかの実施形態では、第２の微生物は、エシェリヒア・コリ以外の生物であり得る。
【０４３８】
次に、上記のように同定された第２の細胞または微生物由来の相同核酸配列は、プロモーター、例えば誘導性プロモーターと、アンチセンス方向で作動可能に連結され、第２の細胞または微生物中に導入され得る。したがって、増殖に必要とされるスタフィロコッカス・オーレウス、サルモネラ・チフィムリウム、クレブシエラ・ニューモニエ、シュードモナス・アエルギノーサおよびエンテロコックス・フェカリス、エシェリヒア・コリ、エンテロコックス・フェカリス、ヘモフィルス・インフルエンザ、ヘリコバクター・ピロリ、クレブシエラ・ニューモニエ、シュードモナス・アエルギノーサ、スタフィロコッカス・オーレウス、またはサルモネラ・チフィ遺伝子を同定するための本明細書中に記載された技法は、第２の細胞または微生物由来の同定ヌクレオチド配列が第２の細胞または微生物の増殖を抑制するか否かを決定するために用いられ得る。例えば、第２の微生物は、アナプラスマ・マルギナレ(Anaplasma marginale)、アスペルギルス・フミガツス(Aspergillus fumigatus)、バチルス・アンスラシス(Bacillus anthracis)、バクテリオイデス・フラギリス(Bacterioides fragilis)、百日咳菌(Bordetella pertussis)、ブルクホルデリア・セパシア(Burkholderia cepacia)、カンピロバクター・イェジュニィ(Campylobacter jejuni)、カンジダ・アルビカンス (Candida albicans)、カンジダ・グラブラタ(Candida glabrata)（トルロプシス・グラブラタ(Torulopsis glabrata)とも呼ばれる）、カンジダ・トロピカリス(Candida tropicalis)、カンジダ・パラプシロシス(Candida parapsilosis)、カンジダ・ギルリエルモンジイ(Candida guilliermondii)、カンジダ・クルセイ(Candida krusei)、カンジダ・ケフィア(Candidakefyr)（カンジダ・シュードトロピカリス(Candidapseudotropicalis)とも呼ばれる）、カンジダ・デュブリニエンシス(Candida dubliniensis)、クラミジア・ニューモニエ(Chlamydia pneumoniae)、トラコーマ・クラミジア(Chlamydia trachomatus)、クロストリジウム・ボツリヌム(Clostridium botulinum)、クロストリジウム・ジフィシル(Clostridium difficile)、クロストリジウム・パーフリンゲンス(Clostridium perfringens)、コクシジオデス・イミチス(Coccidiodes immitis)、コリネバクテリウム・ジフテリア(Corynebacterium diptheriae)、クリプトコックス・ネオフォルマンス(Cryptococcus neoformans)、エンテロバクター・クロアカエ(Enterobacter cloacae)、エンテロコックス・フェカリス(Enterococcus faecalis)、エンテロコックス・ファエシウム(Enterococcus faecium)、エシェリヒア・コリ(Escherichia coli)、ヘモフィルス・インフルエンザ(Haemophilus influenzae)、ヘリコバクター・ピロリ(Helicobacter pylori)、ヒストプラスマ・カプスラツム(Histoplasma capsulatum)、クレブシエラ・ニューモニエ(Klebsiella pneumoniae)、リステリア・モノサイトゲネス(Listeria monocytogenes)、マイコバクテリウム・レプラエ(Mycobacterium leprae)、マイコバクテリウム・ツベルクローシス(Mycobacterium tuberculosis)、ナイセリア・ゴノローエ(Neisseria gonorrhoeae)、髄膜炎菌(Neisseria meningitidis)、ノカルジア・アステロイデス(Nocardia asteroides)、パスツレラ・ヘモリチカ(Pasteurella haemolytica)、パスツレラ・ムルトシダ(Pasteurella multocida)、ニューモシスティス・カリニー(Pneumocystis carinii)、プロテウス・ブルガリス(Proteus vulgaris)、シュードモナス・アエルギノーサ(Pseudomonas aeruginosa)、サルモネラ・ボンゴリ(Salmonella bongori)、サルモネラ・コレラスイス(Salmonella cholerasuis)、サルモネラ・エンテリカ(Salmonella enterica)、サルモネラ・パラチフィ(Salmonella paratyphi)、サルモネラ・チフィ(Salmonella typhi)、サルモネラ・チフィムリウム(Salmonella typhimurium)、スタフィロコッカス・オーレウス(Staphylococcus aureus)、リステリア・モノサイトゲネス(Listeria monocytogenes)、モクサレラ・カタルハリス(Moxarella catarrhalis)、シゲラ・ボイディ(Shigella boydii)、シゲラ・ディッセンリイ(Shigelladysenteriae)、シゲラ・フレックスネリ(Shigellaflexneri)、シゲラ・ソネイ(Shigellasonnei)、スタフィロコッカス・エピダーミディス(Staphylococcusepidermidis)、ストレプトコッカス・ニューモニエ(Streptococcuspneumoniae)、ストレプトコッカス・ミュータンス(Streptococcusmutans)、トレポネーマ・パリダム(Treponemapallidum)、エルシニア・エンテロコリチカ(Yersiniaenterocolitica)、エルシニア・ペスティス(Yersiniapestis)、または上記種のいずれかの属に属する任意の種であり得る。本発明のいくつかの実施形態では、第２の微生物は、エシェリヒア・コリ以外の生物であり得る。
【０４３９】
スタフィロコッカス・オーレウス、サルモネラ・チフィムリウム、クレブシエラ・ニューモニエ、シュードモナス・アエルギノーサ、エンテロコックス・フェカリス、エシェリヒア・コリ、エンテロコックス・フェカリス、ヘモフィルス・インフルエンザ、ヘリコバクター・ピロリ、またはサルモネラ・チフィ以外の微生物の増殖に必要とされるアンチセンス核酸、もしくはそれに対応する遺伝子はまた、スタフィロコッカス・オーレウス、サルモネラ・チフィムリウム、クレブシエラ・ニューモニエ、シュードモナス・アエルギノーサおよびエンテロコックス・フェカリスＯＲＦ、エシェリヒア・コリ、エンテロコックス・フェカリス、ヘモフィルス・インフルエンザ、ヘリコバクター・ピロリ、およびサルモネラ・チフィを含有するマイクロアレイ（例えば、配列番号３７９６〜３８００、３８０６〜４８６０、５９１６〜１００１２の核酸）とハイブリダイズされて、スタフィロコッカス・オーレウス、サルモネラ・チフィムリウム、クレブシエラ・ニューモニエ、シュードモナス・アエルギノーサ、エンテロコックス・フェカリス、エシェリヒア・コリ、エンテロコックス・フェカリス、ヘモフィルス・インフルエンザ、ヘリコバクター・ピロリ、またはサルモネラ・チフィ配列と、他の細胞または微生物由来の増殖に必要な核酸との間の相同性を測定し得る。例えば、増殖に必要な核酸は、アナプラスマ・マルギナレ(Anaplasma marginale)、アスペルギルス・フミガツス(Aspergillus fumigatus)、バチルス・アンスラシス(Bacillus anthracis)、バクテリオイデス・フラギリス(Bacterioides fragilis)、百日咳菌(Bordetella pertussis)、ブルクホルデリア・セパシア(Burkholderia cepacia)、カンピロバクター・イェジュニィ(Campylobacter jejuni)、カンジダ・アルビカンス (Candida albicans)、カンジダ・グラブラタ(Candida glabrata)（トルロプシス・グラブラタ(Torulopsis glabrata)とも呼ばれる）、カンジダ・トロピカリス(Candida tropicalis)、カンジダ・パラプシロシス(Candida parapsilosis)、カンジダ・ギルリエルモンジイ(Candida guilliermondii)、カンジダ・クルセイ(Candida krusei)、カンジダ・ケフィア(Candidakefyr)（カンジダ・シュードトロピカリス(Candidapseudotropicalis)とも呼ばれる）、カンジダ・デュブリニエンシス(Candida dubliniensis)、クラミジア・ニューモニエ(Chlamydia pneumoniae)、トラコーマ・クラミジア(Chlamydia trachomatus)、クロストリジウム・ボツリヌム(Clostridium botulinum)、クロストリジウム・ジフィシル(Clostridium difficile)、クロストリジウム・パーフリンゲンス(Clostridium perfringens)、コクシジオデス・イミチス(Coccidiodes immitis)、コリネバクテリウム・ジフテリア(Corynebacterium diptheriae)、クリプトコックス・ネオフォルマンス(Cryptococcus neoformans)、エンテロバクター・クロアカエ(Enterobacter cloacae)、エンテロコックス・フェカリス(Enterococcus faecalis)、エンテロコックス・ファエシウム(Enterococcus faecium)、エシェリヒア・コリ(Escherichia coli)、ヘモフィルス・インフルエンザ(Haemophilus influenzae)、ヘリコバクター・ピロリ(Helicobacter pylori)、ヒストプラスマ・カプスラツム(Histoplasma capsulatum)、クレブシエラ・ニューモニエ(Klebsiella pneumoniae)、リステリア・モノサイトゲネス(Listeria monocytogenes)、マイコバクテリウム・レプラエ(Mycobacterium leprae)、マイコバクテリウム・ツベルクローシス(Mycobacterium tuberculosis)、ナイセリア・ゴノローエ(Neisseria gonorrhoeae)、髄膜炎菌(Neisseria meningitidis)、ノカルジア・アステロイデス(Nocardia asteroides)、パスツレラ・ヘモリチカ(Pasteurella haemolytica)、パスツレラ・ムルトシダ(Pasteurella multocida)、ニューモシスティス・カリニー(Pneumocystis carinii)、プロテウス・ブルガリス(Proteus vulgaris)、シュードモナス・アエルギノーサ(Pseudomonas aeruginosa)、サルモネラ・ボンゴリ(Salmonella bongori)、サルモネラ・コレラスイス(Salmonella cholerasuis)、サルモネラ・エンテリカ(Salmonella enterica)、サルモネラ・パラチフィ(Salmonella paratyphi)、サルモネラ・チフィ(Salmonella typhi)、サルモネラ・チフィムリウム(Salmonella typhimurium)、スタフィロコッカス・オーレウス(Staphylococcus aureus)、リステリア・モノサイトゲネス(Listeria monocytogenes)、モクサレラ・カタルハリス(Moxarella catarrhalis)、シゲラ・ボイディ(Shigella boydii)、シゲラ・ディッセンリイ(Shigelladysenteriae)、シゲラ・フレックスネリ(Shigellaflexneri)、シゲラ・ソネイ(Shigellasonnei)、スタフィロコッカス・エピダーミディス(Staphylococcusepidermidis)、ストレプトコッカス・ニューモニエ(Streptococcuspneumoniae)、ストレプトコッカス・ミュータンス(Streptococcusmutans)、トレポネーマ・パリダム(Treponemapallidum)、エルシニア・エンテロコリチカ(Yersiniaenterocolitica)、エルシニア・ペスティス(Yersiniapestis)、または上記種のいずれかの属に属する任意の種由来であり得る。本発明のいくつかの実施形態では、スタフィロコッカス・オーレウス、サルモネラ・チフィムリウム、クレブシエラ・ニューモニエ、シュードモナス・アエルギノーサ、エンテロコックス・フェカリス、エシェリヒア・コリ、エンテロコックス・フェカリス、ヘモフィルス・インフルエンザ、ヘリコバクター・ピロリ、またはサルモネラ・チフィ由来の増殖に必要なヌクレオチド配列、もしくは相同核酸は、エシェリヒア・コリ以外の生物中の増殖に必要な配列を同定するために用いられる。本発明のいくつかの実施形態では、増殖に必要な配列は、エシェリヒア・コリ以外の生物由来であり得る。スタフィロコッカス・オーレウス、サルモネラ・チフィムリウム、クレブシエラ・ニューモニエ、シュードモナス・アエルギノーサおよびエンテロコックス・フェカリス、エシェリヒア・コリ、エンテロコックス・フェカリス、ヘモフィルス・インフルエンザ、ヘリコバクター・ピロリ、もしくはサルモネラ・チフィ以外の細胞または微生物由来の増殖に必要な核酸は、プローブがマイクロアレイ上のヌクレオチド配列に対して異なるレベルの相同性を有する場合に、ハイブリダイゼーションを起こさせる種々の条件下で、アレイとハイブリダイズされ得る。これは、細胞または微生物全体の相同性の指標、ならびにこれらの細胞または微生物中のその他の潜在的必須遺伝子に対する手がかりを提供するであろう。
【０４４０】
さらに別の実施形態では、細菌成長または増殖を抑制する本発明のアンチセンス核酸（例えば、配列番号８〜３７９５のアンチセンス核酸または相同アンチセンス核酸）は、細菌を死滅させるためのアンチセンス治療薬として用いられ得る。アンチセンス配列は、配列番号３７９６〜３８００、３８０６〜４８６０、５９１６〜１００１２の１つ、それらの相同核酸またはそれの一部に相補的であり得る。あるいは、アンチセンス治療薬は、増殖に必要な遺伝子が存在するオペロンの１つであり得る（すなわち、アンチセンス核酸は、増殖に必要な遺伝子が存在するオペロン中の任意の遺伝子のヌクレオチド配列にハイブリダイズし得る）。さらに、アンチセンス治療薬は、隣接非コード配列、遺伝子内配列（すなわち遺伝子内の配列）、遺伝子間配列（すなわち遺伝子の間の配列）、２つまたはそれ以上の遺伝子の少なくとも一部にまたがる配列、細菌増殖に必要とされる実際の配列から上流または下流に位置する５’非コード領域または３’非コード領域、もしくは増殖に必要な遺伝子を含有するオペロンを伴ってまたは伴わない増殖に必要な遺伝子またはその一部の１つであり得る。
【０４４１】
治療的用途のほかに、本発明は、診断ツールとしての、増殖に必要とされる核酸に相補的な核酸の使用を含む。例えば、特定種の細胞または微生物に特異的な増殖に必要配列に相補的なヌクレオチド配列を含む核酸プローブをプローブとして用いて、臨床検体中の特定の微生物種または細胞を同定し得る。この有用性は、細菌感染の原因物質を同定する迅速かつ信頼できる方法を提供する。この実用性は、感染に関与する種を正確に同定し、それに対して有効な化合物を投与する能力を臨床医に提供する。この実用性の範囲において、増殖に必要な配列から転写されたｍＲＮＡから翻訳されたタンパク質に対して産生される抗体は、種特異的な方法でこのようなタンパク質を産生する特定の細胞または微生物に関してスクリーニングするためにも用いられ得る。
【０４４２】
本発明のその他の実施形態としては、合理的な薬剤デザイン(drug design)を用いた細胞増殖に必要とされる遺伝子産物の活性を抑制する化合物を同定する方法が挙げられる。以下でさらに詳述されるように、このような方法においては、遺伝子産物の構造は、ｘ線結晶学またはコンピュータモデリングを用いて決定される。化合物は、それらを遺伝子産物またはその一部と相互作用させて、その活性を抑制する構造を有するものを同定するためにスクリーニングされる。化合物は、当業者に既知の種々の方法のいずれか、例えばコンビナトリアルケミストリー(combinatorial chemistry)を用いて得られ得る。いくつかの実施形態では、化合物は天然産物ライブラリーから得られ得る。いくつかの実施形態では、遺伝子産物の活性部位、例えば酵素の活性部位と、または別の生物分子と相互作用して、複合体を形成する遺伝子産物の一部と化合物を相互作用させる構造を有する化合物が同定される。所望により、リード化合物(lead compound)が同定され、遺伝子産物に対して非常に有効である化合物を提供するためにさらに最適化され得る。
【０４４３】
以下の実施例は、本発明の遺伝子、ならびに増殖に必要であると同定された遺伝子に関する用途のサブセット(subset)を教示する。これらの実施例は本発明を単に説明するものであり、本発明の範囲を限定する意図ではない。
【０４４４】
実施例
以下の実施例は、増殖に必要な遺伝子の同定および利用に関する。遺伝子同定の方法、ならびに同定された配列を利用する種々の方法を考察する。本明細書中で記載するアンチセンス核酸、増殖に必要な遺伝子または増殖に必要な遺伝子産物、またはそれらの一部のいずれか、例えば配列番号８〜３７９５のアンチセンス核酸、配列番号３７９６〜３８００、３８０６〜４８６０、５９１６〜１００１２の核酸、もしくは配列番号３８０１〜３８０５、４８６１〜５９１５、１００１３〜１４１１０のポリペプチドのアンチセンス核酸を、下記の手法に用い得ることが理解されよう。同様に、相同コード核酸またはその一部は、下記の手法のいずれかに用いられ得る。
【０４４５】
スタフィロコッカス・オーレウス、サルモネラ・チフィムリウム、クレブシエラ・ニューモニエ、シュードモナス・アエルギノーサまたはエンテロコックス・フェカリスの増殖に必要であると同定される遺伝子
ゲノム断片をベクター中の誘導性プロモーターと作動可能に連結し、成長抑制活性に関してアッセイした。実施例１は、誘導可性プロモーターを含むベクター中にクローニングされたゲノム断片のライブラリーの検査について記載する。キシロースまたはＩＰＴＧによる誘導時に、ベクターは、サブクローニングされたゲノム断片に対応するＲＮＡ分子を産生した。ゲノム断片がプロモーターに関してアンチセンス方向である場合、産生された転写体は、種々のスタフィロコッカス・オーレウス、サルモネラ・チフィムリウム、クレブシエラ・ニューモニエ、シュードモナス・アエルギノーサまたはエンテロコックス・フェカリス遺伝子から産生されたセンスｍＲＮＡと相互作用し、それによりセンスメッセンジャーＲＮＡの翻訳効率またはレベルを低減し、したがってこれらのセンスｍＲＮＡ分子によりコードされるタンパク質の産生を低減するように、スタフィロコッカス・オーレウス、サルモネラ・チフィムリウム、クレブシエラ・ニューモニエ、シュードモナス・アエルギノーサまたはエンテロコックス・フェカリス遺伝子産物をコードするｍＲＮＡ（メッセンジャーＲＮＡ）の少なくとも一部に相補的であった。センスｍＲＮＡが増殖に必要とされるタンパク質をコードした場合、プロモーターからの転写が誘導されていたベクターを含有する細菌細胞は、成長できないか、または実質的に低減した速度で成長した。さらに、産生された転写体が非翻訳ＲＮＡの少なくとも一部の１つであるか、または非翻訳ＲＮＡが増殖に必要とされる場合には、プロモーターからの転写が誘導されていたベクターを含有する細菌細胞はまた、成長できないか、または実質的に低減した速度で成長した。
【０４４６】
実施例１
アンチセンス発現の誘導後の細菌増殖の抑制
スタフィロコッカス・オーレウス、サルモネラ・チフィムリウムおよびクレブシエラ・ニューモニエの増殖に関与する核酸を、以下のように同定した。スタフィロコッカス・オーレウス、サルモネラ・チフィムリウム、クレブシエラ・ニューモニエ、シュードモナス・アエルギノーサまたははエンテロコックス・フェカリスゲノムＤＮＡのランダム生成断片を誘導性プロモーターから転写した。
【０４４７】
スタフィロコッカス・オーレウスの場合には、スタフィロコッカス・オーレウスのｘｙｌＡプロモーター由来のｘｙｌＯオペレーターに融合させた修飾Ｔ５プロモーターを含む、新規の誘導性プロモーター系ＸｙｌＴ５を用いた。このプロモーターは、米国仮特許出願第６０／２５９，４３４号に記載されている。このハイブリッドプロモーターからの転写は、キシロースにより誘導可能である。
【０４４８】
サルモネラ・チフィムリウムゲノムＤＮＡのランダム生成断片を、ｐＬＥＸ５ＢＡ中のＩＰＴＧ誘導性プロモータ（Krauseら J. Mol. Biol.274:365(1997)）またはその誘導体から転写した。ｐＬＥＸ５ＢＡ−Ｋａｎ中のＩＰＴＧ誘導性プロモータから、クレブシエラ・ニューモニエゲノムＤＮＡのランダム生成断片が発現させた。ｐＬＥＸ５ＢＡ−ｋａｎを構築するために、ｐＬＥＸ５ＢＡをＣｌａＩで完全に消化して、ｂｌａ遺伝子を除去した。次にプラスミドを部分ＮｏｔＩ消化で処理し、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼで平滑化した。次に３．２ｋｂｐ断片をゲル精製して、ｐＫａｎπからの平滑化１．３ｋｂｐ ｋａｎ遺伝子に連結させた。ｋａｎ耐性形質転換体をＫａｎプレート上で選択した。ｋａｎ遺伝子の配向を、ＳｍａＩ消化により検査した。ｂｌａ遺伝子と同一配向のｋａｎ遺伝子を有するクローンを用いて、クレブシエラ・ニューモニエの増殖に必要とされる遺伝子を同定した。
【０４４９】
シュードモナス・アエルギノーサゲノムＤＮＡのランダム生成断片を、２成分誘導性プロモータ系から転写した。ｌａｃＵＶ５／ｌａｃＯにより調節されるＴ７ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子を染色体上に組み込んだ（Brunschwig, E. and Darzins, A. 1992. Gene 111: 35-41）。別個のプラスミド上で、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼにより転写されるＴ７遺伝子１０プロモーターをｌａｃＯオペレーターに、その後、多クローニング部位に融合させた。
【０４５０】
プロモーターの下流のゲノムＤＮＡは、アンチセンス方向で、増殖に関与する遺伝子産物をコードするｍＲＮＡまたは非翻訳ＲＮＡの少なくとも一部を含有すべきであり、その場合、プロモーターからの転写の誘導は、増殖の検出可能な抑制を生じるであろう。
【０４５１】
スタフィロコッカス・オーレウスの場合には、スタフィロコッカス・オーレウスゲノム断片のショットガンライブラリーを、ＸｙＩＴ５誘導性プロモータを保有するベクターｐＸｙＩＴ５−Ｐ１５ａ中にクローニングした。ＸｙＩＴ５プロモーター／オペレーターのすぐ下流の特有のＢａｍＨＩ部位で、ベクターを線状化した。線状化したベクターをエビアルカリホスファターゼで処理して、線状化した末端の再閉鎖を防止した。スタフィロコッカス・オーレウス株ＲＮ４５０から単離したゲノムＤＮＡを制限酵素Ｓａｕ３Ａで完全に消化するか、またはＤＮアーゼＩで部分的に消化して、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼとともにインキュベートすることにより「平滑末端化」した。２００〜８００塩基対長の無作為ゲノム断片を、ゲル精製により選択した。サイズ選択したゲノム断片を、０．１対１のモル比で線状化および脱リン酸化ベクターに添加し、連結して、ショットガンライブラリーを形成した。
【０４５２】
連結産物をエレクトロコンピテントエシェリヒア・コリ株ＸＬ１−ＢｌｕｅＭＲＦ’（Stratagene）に形質転換し、カルベニシリンを１００μｇ／ｍｌで補充したＬＢ培地上で平板培養した。その結果生じた５×１０⁵またはそれ以上の数のコロニーを掻き取り、併合して、次にプラスミド精製に付した。
【０４５３】
次に、精製ライブラリーをエレクトロコンピテントスタフィロコッカス・オーレウスＲＮ４２２０に形質転換した。１回のプレーティングにつき５００コロニーの１００〜１５０プレーティングを生成するために、生じた形質転換体を、ＬＢ＋０．２％グルコース（ＬＢＧ培地）＋クロラムフェニコール（１５μｇ／ｍｌ）（ＬＢＧ＋ＣＭ１５培地）を含む寒天上で平板培養した。コロニーを無人操縦採取(roboric picking)にかけて、３８４ウエル培養皿のウエル中に整列させた。各ウエルは、１００μｌのＬＢＧ＋ＣＭ１５液体培地を含有した。接種３８４ウエル皿を３７℃で１６時間インキュベートし、各ウエルを、２％キシロースを含有するかまたはしない固体ＬＢＧ＋ＣＭ１５培地上へ無人操縦で格子画線した(robotically gridded)。格子画線したプレートを３７℃で１６時間インキュベートし、次に、キシロースの存在下で成長−易感染性(compromised)整列コロニーに関して手動で印をつけた。
【０４５４】
２％キシロースを含有する培地上で増殖感受性である整列コロニーは、キシロースを欠く同様の培地上で依然として増殖できたが、これをさらに以下のように増殖感受性分析にかけた。キシロースを欠くプレートからのコロニーを手動で採取して、ＬＢＧ＋ＣＭ１５を含有する９６ウエル培養皿の個々のウエル中に接種し、３７℃で１６時間インキュベートした。これらの培養液を無人操縦で新鮮な倍地中に１／１００で希釈して、３７℃で４時間インキュベートさせ、その後、それらを３８４ウエルアレイ中で連続希釈を施した後、２％キシロースを含有する培地またはキシロースを欠く培地上に格子画線した。３７℃で１６時間成長させた後、２つの培地上に生じたアレイを互いに比較した。両培地上でのすべての希釈で同様に成長したクローンは陰性であると採点し、それ以上考察しなかった。キシロース上で成長したが、非キシロースプレート上の同一連続希釈では成長しなかったクローンを、差に基づいて得点をつけた。すなわち、クローンは、キシロースプレート上で１０⁴以下の連続希釈で成長し、かつ非キシロースプレート上で１０⁸以下の連続希釈で成長する場合、対応するクローンには、観察された成長の対数差を示す「４」の得点をつけた。
【０４５５】
サルモネラ・チフィムリウムおよびクレブシエラ・ニューモニエに関しては、１ｍＭのＩＰＴＧを含有する新鮮な培地またはＩＰＴＧを欠く培地中に１：２００で培養を戻し希釈し、３０分毎にＯＤ₄₅₀を測定することにより、成長曲線を完成させた。固形培地に及ぼす転写誘導の作用を研究するために、一夜培養の１０²、１０³、１０⁴、１０⁵、１０⁶、１０⁷、１０⁸倍希釈液を調製した。これらの希釈液０．５〜３μｌのアリコートを、１ｍＭのＩＰＴＧを含有するかまたはしない選定寒天プレート上にスポッティングした。一夜のインキュベーション後、プレートを比較して、ＩＰＴＧに対するクローンの感受性を評価した。
【０４５６】
シュードモナス・アエルギノーサの増殖に関与する核酸を以下のように同定した。シュードモナス・アエルギノーサゲノムＤＮＡのランダム生成断片を、２成分誘導性プロモータ系から転写した。ｌａｃＵＶ５／ｌａｃＯにより調節されるＴ７ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子を染色体上に組み込んだ（Brunschwig, E. and Darzins, A. 1992. Gene 111: 35-41）。発現プラスミド上には、Ｔ７遺伝子１０プロモーターが存在し、これをＴ７ＲＮＡポリメラーゼにより転写し、ｌａｃＯオペレーターに、その後、多クローニング部位に融合させた。このハイブリッドプロモーターからの転写は、ＩＰＴＧにより誘導可能である。プロモーターの下流のゲノムＤＮＡは、アンチセンス方向で、増殖に関与する遺伝子産物をコードするｍＲＮＡの少なくとも一部を含有すべきであり、その場合、プロモーターからの発現の誘導は、増殖の検出可能な抑制を生じるであろう。
【０４５７】
シュードモナス・アエルギノーサゲノム断片のショットガンライブラリーを、Ｔ７／ｌａｃＯ誘導性プロモーターを保有するベクターｐＥＰ５、ｐＥＰ５Ｓまたはその他の同様に構築されたベクター中にクローニングした。Ｔ７／ｌａｃＯプロモーター／オペレーターのすぐ下流の特有のＳｍａＩ部位で、ベクターを線状化した。線状化したベクターをエビアルカリホスファターゼで処理して、線状化した末端の再閉鎖を防止した。シュードモナス・アエルギノーサ株ＰＡＯ１から単離されたゲノムＤＮＡをＤＮアーゼＩで部分的に消化して、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼとともにインキュベートすることにより「平滑末端化」した。２００〜８００塩基対長のランダムゲノム断片を、ゲル精製により選択した。サイズ選択したゲノム断片を、２対１のモル比で線状化および脱リン酸化ベクターに添加し、連結して、ショットガンライブラリーを形成した。
【０４５８】
連結産物をエレクトロコンピテントエシェリヒア・コリ株ＸＬ１−ＢｌｕｅＭＲＦ’（Stratagene）に形質転換し、カルベニシリン１００ｇ／ｍｌまたはストレプトマイシン１００ｇ／ｍｌを有するＬＢ培地上で平板培養した。その結果生じた５×１０⁵またはそれ以上の数のコロニーを掻き取り、併合して、次にプラスミド精製に付した。
【０４５９】
次に、精製ライブラリーをエレクトロコンピテントシュードモナス・アエルギノーサ株ＰＡＯ１に形質転換した。１回のプレーティングにつき５００コロニーの１００〜１５０プレーティングを生成するために、生じた形質転換体を、カルベニシリン１００ｇ／ｍｌまたはストレプトマイシン４０ｇ／ｍｌを有するＬＢ寒天上で平板培養した。コロニーを自動採取(robotic picking)し、３８４ウエル培養皿のウエル中に整列させた。各ウエルは、１００μｌのＬＢ＋ＣＢ１００またはストレプトマイシン４０液体培地を含有した。接種３８４ウエル皿を室温で１６時間インキュベートし、各ウエルを、１ｍＭのＩＰＴＣを含有するかまたはしない固体ＬＢ＋ＣＢ１００またはストレプトマイシン４０培地上へ自動操縦で格子画線した。格子画線したプレートを３７℃で１６時間インキュベートし、次に、ＩＰＴＧの存在下で成長−易感染性整列コロニーに関して手動で印をつけた。
【０４６０】
１ｍＭのＩＰＴＧを含有する培地上で増殖感受性である整列コロニーは、ＩＰＴＧを欠く同様の培地上で依然として増殖できたが、これをさらに以下のように増殖感受性分析にかけた。ＩＰＴＧを欠くプレートからのコロニーを手動で採取して、ＬＢ＋ＣＢ１００またはストレプトマイシン４０を含有する９６ウエル培養皿の個々のウエル中に接種し、３０℃で１６時間インキュベートした。これらの培養液を新鮮な倍地中に１／１００で自動希釈して、３７℃で４時間インキュベートさせ、その後、それらを３８４ウエルアレイ中で連続希釈を施した後、１ｍＭのＩＰＴＧを含有する培地および含有しない培地上に格子画線した。３７℃で１６時間培養した後、生じた連続希釈スポットのアレイを２つの培地間で比較した。両培地上でのすべての希釈で同様に成長したクローンは陰性であると採点し、それ以上考察しなかった。ＩＰＴＧ培地上で成長したが、非ＩＰＴＧプレート上の同一連続希釈では成長しなかったクローンに、差に基づいて得点をつけた。すなわち、クローンは、ＩＰＴＧプレート上で１０⁴以下の連続希釈で成長し、かつＩＰＴＧプレート上で１０⁸以下の連続希釈で成長する場合、対応するクローンには、観察された成長の対数差を示す「４」の得点をつけた。
【０４６１】
誘導時に、シュードモナス・アエルギノーサ成長または増殖に負の影響を及ぼすベクターの同定後、それらのベクター中に含入される挿入物または核酸断片を、その後の特性化のために単離した。当該ベクターを核酸配列決定に付した。
【０４６２】
Ｅ．フェカリスの増殖に関与する核酸を以下のように同定した。ゲノムＤＮＡのランダム生成断片が、ｘｙ１オペレーター／リプレッサーにより調節される、それぞれＣＰ２５またはＰ５９プロモーターを含有するベクターｐＥＰＥＦ３またはｐＥＰＥＦ１４から発現させた。プロモーターの下流のゲノムＤＮＡは、アンチセンス方向で、増殖に関与する遺伝子産物をコードするｍＲＮＡの少なくとも一部を含有すべきであり、その場合、プロモーターからの発現の誘導は、増殖の検出可能な抑制を生じるであろう。
【０４６３】
Ｅ．フェカリスゲノム断片のショットガンライブラリーを、キシロース誘導性プロモーターを保有するベクターｐＥＰＥＦ３、またはｐＥＰＥＦ１４中にクローニングした。プロモーター／オペレーターのすぐ下流の特有のＳｍａＩ部位で、ベクターを線状化した。線状化したベクターをアルカリホスファターゼで処理して、線状化した末端の再閉鎖を防止した。Ｅ．フェカリス株ＯＧ１ＲＦから単離されたゲノムＤＮＡをＤＮアーゼＩで部分的に消化して、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼとともにインキュベートすることにより「平滑末端化」した。２００〜８００塩基対長のランダムゲノム断片を、ゲル精製により選択した。サイズ選択したゲノム断片を、２対１のモル比で線状化および脱リン酸化ベクターに添加し、連結して、ショットガンライブラリーを形成した。
【０４６４】
連結産物をエレクトロコンピテントエシェリヒア・コリ株ＴＯＰ１０細胞（Invitrogen）に形質転換し、１５０μｇ／ｍｌのエリスロマイシン（Ｅｒｍ）を有するＬＢ培地上で平板培養した。その結果生じた５×１０⁵またはそれ以上の数のコロニーを掻き取り、併合して、次にプラスミド精製に付した。
【０４６５】
次に、精製ライブラリーをエレクトロコンピテントＥ．フェカリス株ＯＧ１ＲＦに形質転換した。１回のプレーティングにつき５００コロニーの１００〜１５０プレーティングを生成するために、生じた形質転換体を、エリスロマイシン１０μｇ／ｍｌを有するＴｏｄｄ−Ｈｅｗｉｔｔ（ＴＨ）寒天上で平板培養した。コロニーを自動採取し、３８４ウエル培養皿のウエル中に整列させた。各ウエルは、１００μｌのＴＨＢ＋Ｅｒｍ１０μｇ／ｍｌを含有した。接種３８４ウエル皿を室温で１６時間インキュベートし、各ウエルを、５％キシロースを含有するかまたはしない固体ＴＨ寒天＋Ｅｒｍ上へ自動操縦で格子画線した。格子画線したプレートを３７℃で１６時間インキュベートし、次に、キシロースの存在下で成長−易感染性整列コロニーに関して手動で印をつけた。
【０４６６】
５％キシロースを含有する培地上で増殖感受性である整列コロニーは、キシロースを欠く同様の培地上で依然として成長できたが、これをさらに増殖感受性分析にかけた。キシロースを欠くプレートからのコロニーを手動で採取して、ＴＨＢ＋Ｅｒｍ１０を含有する９６ウエル培養皿の個々のウエル中に接種し、３０℃で１６時間インキュベートした。これらの培養を新鮮な倍地中に１／１００で自動希釈して、３７℃で４時間インキュベートさせ、その後、それらを５％キシロースを含有するプレートまたはキシロースを欠くプレート上で連続希釈を施した。３７℃で１６時間成長させた後、生じた連続希釈スポットのアレイを２つの培地間で比較した。両培地上で同様に成長したコロニーを陰性であると採点し、対応するコロニーをそれ以上考察しなかった。非キシロースプレート上のものに比して、同一連続希釈に対して成長しなかったキシロース培地上のコロニーを、差に基づいて得点をつけた。例えば、キシロース培地上のコロニーは連続希釈液に対して−４だけ成長し、一方でそれらは非キシロースプレート上では−８に成長できたが、その場合対応する形質転換体コロニーには、観察された成長の対数差を示す「４」の得点をつけた。
【０４６７】
誘導時に、Ｅ．フェカリス成長または増殖に負の影響を及ぼすベクターの同定後、それらの発現ベクター中に含入される挿入物または核酸断片を、その後の特性化のために単離した。当該ベクター中の挿入物をヌクレオチド配列決定した。
【０４６８】
その他の制限酵素およびその他のエンドヌクレアーゼまたは方法論が、ランダムゲノム断片を生成するために用いられ得ることが理解されよう。さらに、ランダムゲノム断片は、機械的剪断により生成され得る。超音波処理および噴霧は、ＤＮＡの機械的剪断のために一般に用いられる２つのこのような技法である。
【０４６９】
実施例２
スタフィロコッカス・オーレウス、サルモネラ・チフィムリウム、クレブシエラ・ニューモニエ、シュードモナス・アエルギノーサまたはエンテロコックス・フェカリス増殖に有害な作用を及ぼす核酸断片を転写する同定クローンのヌクレオチド配列決定
「２」またはそれ以上の希釈プレーティングスコア(dilutionplating score)を得たクローンからのプラスミドを単離して、成長抑制に関与するゲノムＤＮＡ挿入物を、以下のようにして得た。スタフィロコッカス・オーレウスを標準ラボラトリー培地中（プラスミドに関して選択するための１５ｕｇ／ｍｌクロラムフェニコールを含有するＬＢまたはＴＢ）で培養した。培養試験管中または２ｍｌ深型ウエルマイクロタイタープレート中で３７℃で一夜、培養した。
【０４７０】
スタフィロコッカス・オーレウスの溶解を、以下のように実施した。培養液（２〜５ｍｌ）を遠心分離し、細胞ペレットを、リソスタフィン(lysostaphin)の１．５ｍｇ／ｍｌ溶液中に再懸濁させ（２０μｌ／ｍｌのオリジナル培養）、その後、２５０μｌの再懸濁緩衝液（Qiagen）を添加した。あるいは、細胞ペレットを２５０μｌの再懸濁緩衝液（Qiagen）中に直接再懸濁させ、これに５〜２０μｌの１ｍｇ／ｍｌリソスタフィン溶液を添加した。
【０４７１】
製造業者に提供される使用説明書にしたがって、Qiagenミニプレップキット(miniprep kit)またはWizard（Qiagen）ミニプレップキットを用いて、ＤＮＡを単離した。
【０４７２】
以下のようにＰＣＲにより、精製プラスミドからゲノムＤＮＡ挿入物を増幅した。
【０４７３】
１μｌのQiagen精製プラスミドを、総反応容量２５μｌのQiagenホットスタートＰＣＲミックス中に入れた。スタフィロコッカス・オーレウスに関して、以下のプライマーをＰＣＲ反応に用いた：
ｐＸｙ１Ｔ５Ｆ：CAGCAGTCTGAGTTATAAAATAG（配列番号１）
ＬｅｘＬ TGTTTTATCAGACCGCTT（配列番号２）
【０４７４】
サルモネラ・チフィムリウムおよびクレブシエラ・ニューモニエに関して、同様の方法を実行した。サルモネラ・チフィムリウムおよびクレブシエラ・ニューモニエに関しては、以下のプライマーを用いた：
5'-TGTTTTATCAGACCGCTT-3'（配列番号２）および
5'-ACAATTTCACACAGCCTC-3'（配列番号４）
以下のサイクル時間で、ＰＥ ＧｅｎＡｍｐにおいてＰＣＲを実施した：
工程１．９５℃で１５分
工程２．９４℃で４５秒
工程３．５４℃で４５秒
工程４．７２℃で１分
工程５．段階２に戻り、２９回
工程６．７２℃で１０分
製造業者の使用説明書にしたがって、QiagenQiaquickＰＣＲプレートを用いて、ＰＣＲ産物を清浄化した。
【０４７５】
シュードモナス・アエルギノーサに関して、「２」またはそれ以上の希釈プレーティングスコアを得た形質転換体コロニーからのプラスミドを単離して、成長抑制に関与するゲノムＤＮＡ挿入物を、以下のようにして得た。シュードモナス・アエルギノーサを標準ラボラトリー培地中（プラスミドに関して選択するための１００ｇ／ｍｌのカルベニシリンまたは４０ｇ／ｍｌのストレプトマイシンを含有するＬＢ）で成長させた。マイクロタイタープレート中の１００μｌ培養ウエル中で３０℃で一夜、成長を実施した。挿入ＤＮＡを増幅するために、２μｌの培養液を、２５μｌのQiagenホットスタートＰＣＲミックス中に入れた。ＰＣＲ反応は、９６ウエルマイクロタイタープレート中で行った。プラスミドｐＥＰ５Ｓに関して、以下のプライマーをＰＣＲ反応で用いた：
Ｔ７Ｌ１＋：GTCGGCGATATAGGCGCCAGCAACCG（配列番号５）
ｐＳｔｒＡ３：ATAATCGAGCATGAGTATCATACG（配列番号６）
以下のサイクル時間で、ＰＥ ＧｅｎＡｍｐにおいてＰＣＲを実施した：
工程１．９５℃で１５分
工程２．９４℃で４５秒
工程３．５４℃で４５秒
工程４．７２℃で１分
工程５．段階２に戻り、２９回
工程６．７２℃で１０分
工程７．４℃で保持
製造業者の使用説明書にしたがって、QiagenQiaquickＰＣＲプレートを用いて、ＰＣＲ産物を清浄化した。
【０４７６】
次に、QiagenホットスタートＰＣＲミックスを用いて、精製ＰＣＲ産物を直接サイクル配列決定した。以下のプライマーを、配列決定反応で用いた：
Ｔ７／Ｌ２：ATGCGTCCGGCGTAGAGGAT（配列番号７）
以下のサイクル時間で、ＰＥ ＧｅｎＡｍｐにおいてＰＣＲを実施した：
工程１．９４℃で１５分
工程２．９６℃で１０秒
工程３．５０℃で５秒
工程４．６０℃で４分
工程５．段階２に戻り、２４回
工程６．４℃で保持
製造業者の使用説明書にしたがって、QiagenQiaquickＰＣＲプレートを用いて、ＰＣＲ産物を清浄化した。
【０４７７】
Ｅ．フェカリスに関して、「２」またはそれ以上の希釈プレーティングスコアを得た形質転換体コロニーからのプラスミドを単離して、成長抑制に関与するゲノムＤＮＡ挿入物を、以下のようにして得た。Ｅ．フェカリスをＴＨＢ１０μｇ／ｍｌＥｒｍ中で３０℃で一夜、マイクロタイタープレート中の１００μｌ培養ウエル中で培養した。挿入ＤＮＡを増幅するために、２μｌの培養液を、２５μｌのQiagenホットスタートＰＣＲミックス中に入れた。ＰＣＲ反応は、９６ウエルマイクロタイタープレート中で行った。以下のプライマーをＰＣＲ反応で用いた：
ｐＸｙｌＴ５：ＣＡＧＣＡＧＴＣＴＧＡＧＴＴＡＴＡＡＡＡＴＡＧ（配列番号１）およびｐＥＰ／ｐＡＫ１プライマー。
以下のサイクル時間で、ＰＥ ＧｅｎＡｍｐにおいてＰＣＲを実施した：
工程１．９５℃で１５分
工程２．９４℃で４５秒
工程３．５４℃で４５秒
工程４．７２℃で１分
工程５．段階２に戻り、２９回
工程６．７２℃で１０分
工程７．４℃で保持
製造業者の使用説明書にしたがって、QiagenQiaquickＰＣＲプレートを用いて、ＰＣＲ産物を清浄化した。
【０４７８】
次に、QiagenホットスタートＰＣＲミックスを用いて、精製ＰＣＲ産物を直接サイクル配列決定した。以下のプライマーを、ＰＣＲ反応で用いた：
ｐＸｙｌＴ５：ＣＡＧＣＡＧＴＣＴＧＡＧＴＴＡＴＡＡＡＡＴＡＧ（配列番号１）
以下のサイクル時間で、ＰＥ ＧｅｎＡｍｐにおいてＰＣＲを実施した：
工程１．９４℃で１５分
工程２．９６℃で１０秒
工程３．５０℃で５秒
工程４．６０℃で４分
工程５．段階２に戻り、２４回
工程６．４℃で保持
【０４７９】
製造業者の使用説明書にしたがって、QiagenQiaquickＰＣＲプレートを用いて、ＰＣＲ産物を清浄化した。
【０４８０】
上記の手法それぞれからの増幅ゲノムＤＮＡ挿入物に自動配列決定を施した。同定挿入物に関する配列同定番号（配列番号）およびクローン名を第１Ａ表に列挙し、以下で考察する。
【０４８１】
実施例３
単離核酸と既知の配列との比較
上記の発現ベクターから得たスタフィロコッカス・オーレウス、サルモネラ・チフィムリウム、クレブシエラ・ニューモニエ、シュードモナス・アエルギノーサまたはエンテロコックス・フェカリス由来のサブクローニングした断片のヌクレオチド配列を、スタフィロコッカス・オーレウス、サルモネラ・チフィムリウム、クレブシエラ・ニューモニエ、シュードモナス・アエルギノーサまたはエンテロコックス・フェカリスおよびその他の微生物由来の既知の配列と以下のように比較した。まず、各クローンが染色体上の一位置から生じ、キメラでないことを確証するために、選定クローンのヌクレオチド配列を、スタフィロコッカス・オーレウス、サルモネラ・チフィムリウム、クレブシエラ・ニューモニエ、シュードモナス・アエルギノーサまたはエンテロコックス・フェカリスゲノム配列に対して比較して、染色体上の正しい位置にクローンを一列に並べた。ＮＣＢＩ ＢＬＡＳＴＮバージョン２．０．９プログラムをこの比較のために用い、そしてＴＩＧＲならびにＮＣＢＩ非冗長性ＧｅｎＢａｎｋデータベースからライセンスされた不完全スタフィロコッカス・オーレウスゲノム配列を、ゲノムデータの供給源として用いた。サルモネラ・チフィムリウム配列を、ゲノムシークエンシングセンター（Genome Sequencing Center） (http://genome.wustl.edu/gsc/salmonella.shtml)およびサンガーセンター
（Sanger Centre） (http://www.sanger.ac.uk/projects/S_typhi)から利用可能な配列と比較した。シュードモナス・アエルギノーサ配列を、所有権データベースおよびＮＣＢＩ ＧｅｎＢａｎｋデータベースと比較した。Ｅ．フェカリス配列を、所有権データベースと比較した。
【０４８２】
フィルタリング(filtering)を止めた以外は、デフォルトパラメーターを用いてＢＬＡＳＴＮ分析を実施した。複数断片の連結に起因する挿入物に関しては、さらなる分析は実施しなかった。
【０４８３】
概して、アンチセンス分子およびそれらの相補的遺伝子を、以下のように同定する。まず、すべての考え得る全長オープンリーディングフレーム(ＯＲＦ)を利用可能なゲノムデータベースから抽出する。このようなデータベースとしては、ＧｅｎＢａｎｋ非冗長性(ｎｒ)データベース、ＴＩＧＲから利用可能な未完成ゲノムデータベースおよびIncyteGenomicsにより開発されたパソシーク（PathoSeq）データベースが挙げられる。後者のデータベースは、完全ＯＲＦ分析を含めた４０を上回る注釈付細菌ゲノムを含む。当該細菌ゲノムに関してデータベースが不完全である場合、ゲノム中の全てのＯＲＦを抽出する必要はないが、当該クローンに相補的である利用可能なゲノム配列の一部内のＯＲＦを抽出することだけは必要である。ＧｅｎｅＭａｒｋのようなＯＲＦを同定するためのコンピュータアルゴリズムは利用可能であり、当業者に既知である。クローンＤＮＡと相補的ＯＲＦとの比較は、クローンがセンスクローンまたはアンチセンスクローンであるかの決定を可能にする。さらにデータベースから抽出された各ＯＲＦを、例えばＧｅｎＢａｎｋ(ｎｒ)タンパク質データベース、ＳＷＩＳＳＰＲＯＴ等の十分な注釈付データベースの中にある配列と比較し得る。その遺伝子または密接に関連する微生物中の密接に関連する遺伝子の記述はしばしば、これらのデータベース中で利用可能である。同様の方法を用いて、非翻訳ＲＮＡをコードする遺伝子に対応するアンチセンスクローンを同定する。
【０４８４】
第１Ｂ表中に編集した遺伝子同定データを生成するために、配列番号８〜３７９５に対応する上記のクローニングした核酸配列を用いて、対応するスタフィロコッカス・オーレウス、サルモネラ・チフィムリウム、クレブシエラ・ニューモニエ、シュードモナス・アエルギノーサまたはエンテロコックス・フェカリスＯＲＦを微生物ゲノム配列のパソシーク（PathoSeq）バージョン４．１(２０００年３月公開)データベース中で同定した。この目的のために、ＮＣＢＩ ＢＬＡＳＴＮ２．０．９コンピュータアルゴリズムを用いた。フィルタリングを止めた以外は、デフォルトパラメーターを用いた。ＢＬＡＳＴＮおよびＢＬＡＳＴＸ分析に関するデフォルトパラメーターを以下に示す：
期待値(ｅ)＝１０
アラインメントビューオプション(Alignmentview options)：対方式
フィルタークエリー配列(ＢＬＡＳＴＮによるＤＵＳＴ、その他によるＳＥＧ)＝Ｔ
ギャップを開放するためのコスト(ゼロは行動を引き起こす)＝０
ギャップを伸長するためのコスト(ゼロは行動を引き起こす)＝０
ギャップアラインメントに関するＸドロップオフ(dropoff)値(ビット)(ゼロは行動を引き起こす)＝０
デフライン（defline）でＧＩを示す＝Ｆ
ヌクレオチドミスマッチに関するペナルティー(ＢＬＡＳＴＮのみ)＝−３
ヌクレオチドマッチに関するリウォード（reward）(ＢＬＡＳＴＮのみ)＝１
ワンラインディスクリプション(one-linedescriptions)の数(Ｖ)＝５００
表示アラインメント数（Ｂ）＝２５０
伸長ヒットに関する閾値＝デフォルト
ギャップアラインメントの実施(ＢＬＡＳＴＸと一緒に利用可能でない)＝Ｔ
使用クエリー遺伝コード＝１
ＤＢ遺伝コード(ＴＢＬＡＳＴ[ｎｘ]のみ)＝１
使用プロセッサ数＝１
ＳｅｑＡｌｉｇｎファイル
クエリーデフライン（defline）＝Ｆと考える
マトリックス＝ＢＬＯＳＵＭ６２
ワードサイズ＝デフォルト
データベースの有効長(実寸に関してはゼロを用いる)＝０
維持するための領域からのベストヒット数＝１００
ヒットを判定するために用いられる領域長＝２０
検索スペースの有効長（実寸に関してはゼロを用いる）＝０
データベースに対して検索するためのクエリー鎖(ＢＬＡＳＴ[ｎｘ]およびＴＢＬＡＳＴＸに関して)、３は両方、１は上部、２は底部である。
ＨＴＭＬ出力＝Ｆを生じる
【０４８５】
あるいは、公的もしくは私的データソースの調査を実行することにより、ＯＲＦを同定し、精製した。これらの生物に関する全長遺伝子タンパク質およびヌクレオチド配列を種々の供給源から構築した。シュードモナス・アエルギノーサに関しては、シュードモナスゲノムシーケンシングプロジェクト(http://www.pseudomonas.comからダウンロードした)から遺伝子配列を採択した。クレブシエラ・ニューモニエ、スタフィロコッカス・オーレウス、ストレプトコッカス・ニューモニエおよびサルモネラ・チフィに関しては、パソシーク（PathoSeq）バージョン４．１(２０００年３月公開)からのゲノム配列を、遺伝子発見ソフトウエアＧｅｎｅＭａｒｋバージョン２．４ａ(GenePro Inc. 451 Bishop St., N.W., Suite B, Atlanta, GA, 30318, USAから購入)を用いてＯＲＦに関して再分析した。
【０４８６】
アンチセンスクローンは、誘導性プロモータからの転写が相補的ＯＲＦ、遺伝子間または遺伝子内配列に対するＲＮＡアンチセンスの発現を生じるクローンと同定された。単一挿入物を含有し、誘導時に増殖感受性を生じたクローンを、第１Ａ表に列挙する。アンチセンス核酸に相補的なＯＲＦ、およびそれらのコードポリペプチドを、第１Ｂ表に列挙する。
【０４８７】
パソシーク（PathoSeq）データベース中の遺伝子説明は、上記の公的な配列データベースで利用可能な注釈から得られる。クローンが２つまたはそれ以上の隣接ＯＲＦとの有意の配列同一性を共有することが判明した場合、それを各ＯＲＦに関して一旦列挙し、そして各ＯＲＦに関するパソシーク（PathoSeq）情報を第１Ｂ表中に編集した。
【０４８８】
第１Ａ表は、増殖を抑制した挿入物の配列番号ならびにクローン名、ならびにクローンが同定された生物を列挙する。この情報を用いて、その遺伝子産物（配列番号３８０１〜３８０５、４８６１〜５９１５、１００１３〜１４１１０）が配列番号８〜３７９５のヌクレオチド配列を含む核酸により抑制されるＯＲＦ（配列番号：３７９６〜３８００、３８０６〜４８６０、５９１６〜１００１２）を同定した。第１Ｂ表は、クローン名（Clone name）、アンチセンスクローンの配列番号（クローン配列番号(Clone Seq ID)と表示した欄で）、クローンを含有するパソシーク遺伝子座(PathoSeq Locus)、パソシーク（PathoSeq）で同定されたＯＲＦの配列番号(遺伝子配列番号(タンパク質)(Gene SeqID(protein))と表示した欄)で)、精製全長遺伝子(マーカー遺伝子(Genemarked gene)と表示した欄)、および精製全長遺伝子によりコードされるタンパク質の配列番号(全長ＯＲＦタンパク質配列番号(fulllength ORF Protein Seq ID)と表示した欄)を列挙する。
【０４８９】
第１Ｃ表は、第１Ｂ表に列挙したパソシーク遺伝子座(PathoSeq Gene Locus)、パソシーク（PathoSeq）タンパク質の配列番号（ProteinSeqID）およびそれらをコードする核酸の配列番号(NucleotideSeqID)間の相互参照を提供する。
【０４９０】
ＯＲＦは、パソシーク（PathoSeq）以外のデータベースを用いても同定され得ることが理解されよう。例えばＯＲＦは、米国特許仮出願第６０／１９１，０７８号(２０００年３月２１日提出)に記載された方法を用いて同定され得る。
【０４９１】
実施例４
アンチセンス抑制による影響を受ける遺伝子およびそれらの対応するオペロンの同定
スタフィロコッカス・オーレウス、サルモネラ・チフィムリウム、クレブシエラ・ニューモニエ、シュードモナス・アエルギノーサまたはエンテロコックス・フェカリス増殖に関与する遺伝子が一旦上記のように同定されれば、既知の微生物ゲノムとの比較により、これらの遺伝子が存在するオペロンを同定し得る。細菌遺伝子は多シストロン様式で転写されるため、オペロン上のその他の遺伝子または同定された単一遺伝子から下流の遺伝子のすべての発現に、オペロン中の単一遺伝子のアンチセンス抑制は影響し得る。したがって、増殖に及ぼすそれらの作用に関して、オペロン内に含入される遺伝子の各々を分析し得る。
【０４９２】
間に大きな非コードギャップを有さずに、同一配向で存在するゲノム領域におけるすべての隣接遺伝子を探すことにより、オペロンを予測する。まず、アンチセンス分子に相補的な全長ＯＲＦを、上記と同様に同定する。次に隣接ＯＲＦを同定し、そしてアンチセンスクローンに相補的なＯＲＦ周囲のゲノム配列を直接分析することにより、または上記の全ゲノムＯＲＦ分析とその後のＯＲＦアラインメントにより得られた収集物から隣接ＯＲＦを抽出することにより、それらの相対配向を決定する。この方法で予測されるオペロンは、http://bioweb.pasteur.fr/GenoList/SubtiList/ HYPERLINK"http://bioweb.pasteur.fr/GenoList/SubtiList/" で見出され得るInstitut Pasteur Subtilist ReleaseR15.1（1999年6月24日）で編集されたゲノムデータベースにより報告されたように、バチルス・サブチルス完全ゲノム配列中の相同核酸の列との比較により確証し得る。バチルス・サブチルスゲノムは、グラム陽性微生物からの唯一の完全に配列され、注釈されたゲノムであり、遺伝子配列の保存とオペロン構造を含めたゲノム組織化のレベルの両方で、スタフィロコッカス・オーレウスと高レベルの類似性を有すると思われる。サルモネラ・チフィムリウムおよびクレブシエラ・ニューモニエに関するオペロンは、エシェリヒア・コリ、ヘモフィルス属またはシュードモナス属配列との比較により同定し得る。シュードモナス・アエルギノーサにおけるオペロン組織化の予測を補助するために、シュードモナス・アエルギノーサウェブサイト（http://www.pseudomonas.com）も用い得る。
【０４９３】
サルモネラ・チフィムリウムの広範なＤＮＡ配列は、サルモネラゲノムセンター（Washington University, St. Louis, MO）、サンガーセンター（United Kingdom）およびパソシーク（PathoSeq）データベース（Incyte）を介して利用可能である。上記のデータベースのいくつかにおけるＤＮＡ配列のうちのいくつかの注釈は欠落しているが、しかしＢＬＡＳＴＸのようなツールを用いてエシェリヒア・コリとの比較をなし得る。
【０４９４】
公的または私的なデータベースを用いて、Ｅ．フェカリス配列ならびに上記の生物からの配列を分析し得る。
【０４９５】
スタフィロコッカス・オーレウス由来のクローン番号Ｓ１Ｍ１００００００１Ａ０５に適用されたような分析の結果を、第２表に列挙する。第２表は、増殖に関与するスタフィロコッカス・オーレウス遺伝子の配列番号、これらの遺伝子によりコードされるタンパク質の配列番号、ならびにスタフィロコッカス・オーレウス増殖を抑制する核酸を含有するクローン名を列挙する。さらに第２表は、上記のように決定されたスタフィロコッカス・オーレウスゲノム配列中に含まれるオペロン上に位置するその他の遺伝子を列挙する。第２表に記載される遺伝子の各々に関しては、公的なデータベースの１つで同定された最も密接に関連する相同体を含有する微生物も、第２表中に示されている。
【０４９６】
【表１】

【０４９７】
上述の分析は、増殖を抑制する第１Ａ表に列挙した配列、第１Ｂ表および第１Ｃ表に列挙したＯＲＦの各々に関して実行し得る。上記の方法を用いて全長ＯＲＦおよび／またはそれらを含有するオペロンが一旦同定されれば、所望の配列の各末端にプライマーを用いてＰＣＲ増幅を実施することにより、ゲノムライブラリーからそれらを得ることができる。ＯＲＦと他の細胞または微生物中の相同配列との比較は、ＯＲＦの末端の、開始および停止コドンの確証を促すことを当業者は理解するであろう。
【０４９８】
いくつかの実施形態では、プライマーは、所望のベクター中への遺伝子またはオペロンの挿入を促す制限部位を含有し得る。例えば遺伝子を発現ベクター中に挿入し、そして下記のような増殖に必要なタンパク質を産生するために用い得る。全長ＯＲＦおよび／またはオペロンを得るためのその他の方法は、当業者に既知である。例えば天然制限部位を用いて、所望のベクター中に全長ＯＲＦおよび／またはオペロンを挿入し得る。
【０４９９】
実施例５
増殖に必要なオペロン内の個々の遺伝子の同定
以下の実施例は、染色体中の標的対立遺伝子を標的遺伝子のコード領域のフレーム内欠失に置き換えることにより、オペロン内の標的遺伝子が細胞増殖に必要とされるか否かを決定するための方法を説明する。
【０５００】
スタフィロコッカス・オーレウス、サルモネラ・チフィムリウム、クレブシエラ・ニューモニエ、シュードモナス・アエルギノーサおよびエンテロコックス・フェカリス、エシェリヒア・コリ、エンテロコックス・フェカリス、ヘモフィルス・インフルエンザ、ヘリコバクター・ピロリまたはサルモネラ・チフィ中の遺伝子の染色体コピーの欠失不活性化は、組込み遺伝子置換により達成し得る。この方法の原理は、Xia, M.ら, 1999, Plasmid42:144-149およびHamilton, C.M.ら 1989. J. Bacteriol. 171:4617-4622に記載されている。同様の遺伝子破壊法はシュードモナス・アエルギノーサに関して利用可能であるが、但し対抗選択マーカーはｓａｃＢである（Schweizer, H.P., Klassen, T. and Hoang, T.(1996) Mol. Biol. ofPseudomonas. ASM press, 229-237）。このアプローチでは、標的遺伝子の突然変異体対立遺伝子は、フレーム内欠失により構築され、自殺ベクター（suicide vector）を用いて染色体中に導入される。これは、標的遺伝子の欠失（ヌル）対立遺伝子および野生型対立遺伝子を含む縦列重複(tandem duplication)を生じる。ベクター配列が検出された細胞を、対抗選択技法を用いて単離する。染色体挿入からのベクター配列の除去は、野生型標的配列の回復または欠失（ヌル）対立遺伝子による野生型配列の置換を生じる。Ｅ．フェカリス遺伝子は、当該遺伝子の内部断片を含有する自殺ベクターを用いて破壊し得る。適切な選択により、このプラスミドは相同的に染色体に再結合するであろう（Nallapareddy, S.R., X.Qin, G.M. Weinstock, M.Hook, B.E.Murray. 2000.Infect. Immun. 68:5218-5224）。
【０５０１】
次に、その結果生じるスタフィロコッカス・オーレウス、サルモネラ・チフィムリウム、クレブシエラ・ニューモニエ、シュードモナス・アエルギノーサおよびエンテロコックス・フェカリス、エシェリヒア・コリ、エンテロコックス・フェカリス、ヘモフィルス・インフルエンザ、ヘリコバクター・ピロリまたはサルモネラ・チフィコロニーのコロニーを評価して、標的配列が増殖に必要とされるか否かを、影響を受けた標的配列のＰＣＲ増幅により決定する。標的遺伝子が増殖に必要でない場合には、ＰＣＲ分析は、ほぼ同数のコロニーが野生型または突然変異体対立遺伝子を保有したことを示すであろう。標的遺伝子が増殖に必要とされる場合には、野生型対立遺伝子だけがＰＣＲ分析において回収されるであろう。
【０５０２】
その結果生じる２つのＰＣＲ増幅産物間の重複がそれらをハイブリダイズさせるよう、特に設計されたプライマーを用いて、当該遺伝子のコード領域に隣接するがそれを含まないヌクレオチド配列の増幅によって突然変異体対立遺伝子を生成するために交差ＰＣＲの方法を用いる。先端５’および３’末端を表すプライマーを用いたこのハイブリダイゼーション産物のさらなるＰＣＲ増幅は、コード領域のフレーム内欠失を含有するが、実質的フランキング配列(flanking sequence)を保持する増幅産物を生成し得る。
【０５０３】
スタフィロコッカス・オーレウスに関しては、この増幅産物は、自己複製に関して宿主依存性である自殺ベクターｐＳＡ３１８２中でサブクローニングされる（Xia, M.ら, 1999, Plasmid42:144-149）。このベクターは、ｔｅｔＣテトラサイクリン耐性マーカーおよび既知のスタフィロコッカス・オーレウスプラスミドｐＴ１８１の複製起点を含む（Mojumdar, M and Kahn, S.A., Characterisation of the TetracyclineResistance Gene of Plasmid pT181, J. Bacteriol. 170:5522(1988)）。ベクターは、ｐＴ１８１起点でのベクターの自己複製に必要とされるｒｅｐＣ遺伝子を欠く。このベクターは、トランスでｒｅｐＣを発現するＳＡ３５２８のようなスタフィロコッカス・オーレウス宿主株中で増殖され得る。いったん増幅切断型標的遺伝子配列がｐＳＡ３１８２ベクター中でクローニングされ、増殖されれば、それは次に、テトラサイクリン耐性に関する選択を用いてエレクトロポレーションにより、ｒｅｐＣマイナス株、例えばＲＮ４２２０中に導入され得る（Kreiswirth, B.N.ら, The ToxicShock Syndrome Exotoxin Structural Gene is Not Detectably Transmitted by aProphage, Nature 305:709-712(1983)）。この株中では、薬剤耐性を付与するために染色体中の標的遺伝子での相同組換えによりベクターを組み込まなければならない。これは、対立遺伝子の挿入切断型コピー、その後のｐＳＡ３１８２ベクター配列および最後に標的遺伝子の無傷かつ機能性である対立遺伝子を生じる。
【０５０４】
上記の技法を用いてテトラサイクリン耐性スタフィロコッカス・オーレウス株が単離され、上記のような標的遺伝子の切断型および野生型対立遺伝子を含むことが示されれば、エレクトロポレーションにより株中に第２のプラスミドｐＳＡ７５９２（Xia, M.ら, 1999, Plasmid42: 144-149）を導入する。この遺伝子は、エリスロマイシン耐性遺伝子および高レベルで発現されるｒｅｐＣ遺伝子を含む。これらの形質転換体中でのｒｅｐＣの発現は、組込まれたｐＴ１８１複製起点での正常染色体複製の妨害に起因して毒性である。これは、相同組換えによりベクター配列を除去された株を選択し、以下の２つの結果のいずれかを生じる。選定細胞は標的遺伝子の野生型対立遺伝子、または切断型対立遺伝子の操作したフレーム内欠失により野生型対立遺伝子が置き換えられた遺伝子を保有する。
【０５０５】
ＰＣＲ増幅を用いて、その結果生じるエリスロマイシン耐性ｔｅｔ感受性形質転換体コロニーにおける上記過程の遺伝子結果を決定し得る。標的遺伝子が細胞複製に必要でない場合には、野生型および突然変異体対立遺伝子の両方に関するＰＣＲ証拠は、その結果生じる形質転換体の集団の間に見出される。しかしながら標的遺伝子が細胞増殖に必要な場合には、野生型形態の遺伝子のみがその結果生じる形質転換体の中で明白になる。
【０５０６】
同様に、サルモネラ・チフィムリウム、クレブシエラ・ニューモニエ、シュードモナス・アエルギノーサまたはエンテロコックス・フェカリス、エシェリヒア・コリ、エンテロコックス・フェカリス、ヘモフィルス・インフルエンザ、ヘリコバクター・ピロリまたはサルモネラ・チフィに関しては、標的配列の突然変異体対立遺伝子を含有するＰＣＲ産物を適切なノックアウトベクター中に導入し得るし、そして適切な方法論を用いて野生型標的が破壊された細胞を選択する。
【０５０７】
上記方法は、フレーム内欠失突然変異の挿入が、標的遺伝子と同一オペロン中の遺伝子に及ぼす下流極性作用を引き起こすとはほとんど考えられないという利点を有する。しかしながら、当業者に既知のスタフィロコッカス・オーレウス、サルモネラ・チフィムリウム、クレブシエラ・ニューモニエ、シュードモナス・アエルギノーサ、エンテロコックス・フェカリス、エシェリヒア・コリ、エンテロコックス・フェカリス、ヘモフィルス・インフルエンザ、ヘリコバクター・ピロリまたはサルモネラ・チフィ遺伝子を破壊するためのその他の方法も用い得ることが理解されよう。
【０５０８】
オペロン中の各遺伝子は、それが増殖に必要であるか否かを決定するために、上記方法を用いて破壊され得る。
【０５０９】
実施例６
スタフィロコッカス・オーレウス、サルモネラ・チフィムリウム、クレブシエラ・ニューモニエ、シュードモナス・アエルギノーサ、エンテロコックス・フェカリス、エシェリヒア・コリ、エンテロコックス・フェカリス、ヘモフィルス・インフルエンザ、ヘリコバクター・ピロリまたはサルモネラ・チフィ増殖に必要であると同定された遺伝子によりコードされるタンパク質の発現
上記のように同定された増殖に必要なタンパク質を発現するための方法の一例として以下を提供する。当技術分野で既知の細菌、昆虫、酵母または哺乳類発現系のいずれかを用いて、増殖に必要なタンパク質を発現し得る。いくつかの実施形態では、エシェリヒア・コリに関して、またはスタフィロコッカス・オーレウス、サルモネラ・チフィムリウム、クレブシエラ・ニューモニエ、シュードモナス・アエルギノーサ、エンテロコックス・フェカリス、エンテロコックス・フェカリス、ヘモフィルス・インフルエンザ、ヘリコバクター・ピロリまたはサルモネラ・チフィに関して設計された発現系を用いて、上記の同定ヌクレオチド配列によりコードされる増殖に必要なタンパク質（配列番号３７９６〜３８００、３８０６〜４８６０、５９１６〜１００１２の核酸によりコードされる配列番号３８０１〜３８０５、４８６１〜５９１５、１００１３〜１４１１０のタンパク質を含む）を発現する。まず、遺伝子に関する開始および終結コドンを同定する。望ましい場合、タンパク質の翻訳または発現の改良方法は、当技術分野で既知である。例えば発現されるべきポリペプチドをコードする核酸が開始部位、強力なシャイン・ダルガルノ配列(Shine-Delgarno sequence)または停止コドンとして役立つメチオニンコドンを欠く場合、これらのヌクレオチド配列を付加し得る。同様に、同定核酸が転写終結シグナルを欠く場合、例えば適切な供与配列からこのような配列をスプライシング(splicing)することにより、構築物にこのヌクレオチド配列を付加し得る。さらに、所望により、コード配列を強力な構成プロモーターまたは誘導性プロモータに作動可能的に連結し得る。例えば、コード配列がベクターのプロモーターから発現され得るように、同定核酸またはその一部に相補的であり、ベクター中へのコード配列の挿入に適した制限エンドヌクレアーゼ配列を含有するオリゴヌクレオチドプライマーを用いた、細菌発現ベクターまたはゲノムからのＰＣＲにより、発現されるべきポリペプチドをコードする同定核酸またはその一部を得る。あるいは、その他の慣用的クローニング技法を用いて、プロモーターの制御下にコード配列を配置し得る。いくつかの実施形態では、コード配列の転写が適切な位置で終了するよう、終結シグナルをコード配列の下流に配置し得る。
【０５１０】
エシェリヒア・コリにおけるタンパク質発現のためのいくつかの発現ベクター系は既知であり、当業者に利用可能である。コード配列をこれらのベクターのいずれかに挿入し、プロモーターの制御下に置き得る。次に発現ベクターを、タンパク質の過剰発現に適したＤＨ５αまたはいくつかのその他のエシェリヒア・コリ菌株中で形質転換させ得る。
【０５１１】
あるいは、スタフィロコッカス・オーレウス、サルモネラ・チフィムリウム、クレブシエラ・ニューモニエ、シュードモナス・アエルギノーサ、エンテロコックス・フェカリス、エシェリヒア・コリ、エンテロコックス・フェカリス、ヘモフィルス・インフルエンザ、ヘリコバクター・ピロリまたはサルモネラ・チフィの増殖に必要なタンパク質をコードする発現ベクターを、スタフィロコッカス・オーレウス、サルモネラ・チフィムリウム、クレブシエラ・ニューモニエ、シュードモナス・アエルギノーサ、エンテロコックス・フェカリス、エシェリヒア・コリ、エンテロコックス・フェカリス、ヘモフィルス・インフルエンザ、ヘリコバクター・ピロリまたはサルモネラ・チフィ中に導入し得る。これらの生物中に核酸を導入するためのプロトコルは、当技術分野で既知である。例えば、J.C.Lee "Electroporation of Staphylococci" from Methods inMolecular Biology vol 47: Electroporation Protocols for Microorganisms Editedby: J.A.Nickoloff Humana Press Inc., Totowa, NJ. Pp209-216に記載されているプロトコルを用いて、スタフィロコッカス・オーレウス中に核酸を導入し得る。当技術分野で既知の方法を用いて、サルモネラ・チフィムリウム、クレブシエラ・ニューモニエ、シュードモナス・アエルギノーサまたはエンテロコックス・フェカリス中にも核酸を導入し得る。ベクターが抗生物質に対する耐性を付与した形質転換細胞を、当該抗生物質を含有するプレート上で培養した後に、陽性形質転換体を選択する。一実施形態では、コードタンパク質発現がキシロースにより誘導可能であるように、キシロースオペレーターを含有するＴ５プロモーターとコード配列が作動可能に連結された発現ベクターを用いて、スタフィロコッカス・オーレウスを形質転換する。
【０５１２】
一実施形態では、ネイティブ配列としてタンパク質を細胞質中で発現させ、保持する。代替的実施形態では、例えばグラム陰性またはグラム陽性発現宿主の細胞周辺腔への、もしくは細胞の外部（すなわち培地中）への示差的細胞ターゲッティングを可能にするタンパク質標識(Protein tag)を含めるために、発現タンパク質を修飾し得る。いくつかの実施形態では、Chapter 16 of Current Protocols in Molecular Biology, Vol. 2,(Ausubelら, Eds.) John Wiley& Sons, Inc. (1997)に記載されている浸透圧ショック細胞溶解法を用いて、細胞からポリペプチドを遊離させ得る。さらに別の実施形態では、このようなタンパク質標識は、アフィニティークロマトグラフィーによる分別細胞からのまたは培地からのタンパク質の精製も促し得る。これらの手法の各々を用いて、増殖に必要なタンパク質を発現し得る。
【０５１３】
次に発現タンパク質は、培地中であれ、または細胞周辺腔もしくは細胞質から遊離されたものであれ、従来の技法、例えば硫酸アンモニウム沈殿法、標準クロマトグラフィー、免疫沈降、免疫クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィーおよびＨＰＬＣを用いて、上清から精製され、または濃縮される。あるいは、ポリペプチドは、さらなる濃縮を伴わずにその意図された目的のためにそれを使用され得るために、上清または宿主細胞の増殖培地中に、十分に濃縮された状態または純粋状態で宿主細胞から分泌され得る。当業者に既知のタンパク質分解技法であるＳＤＳ ＰＡＧＥのような技法を用いて、得られたタンパク質産物の純度を評価し得る。クーマシー、銀染色または抗体を用いた染色は、当該タンパク質を可視化するために用いられる典型的方法である。
【０５１４】
当技術分野で既知の方法を用いた合成ペプチドを用いて、当該タンパク質を特異的に認識し得る抗体を生成し得る（Antibodies: A Laboratory Mannual, (Harlow and Lane, Eds.) ColdSpring Harbor Laboratory(1988)参照）。例えば、適切に同定された当該遺伝子配列によりコードされるアミノ酸配列またはその一部を有する１５量体ペプチドを、化学的に合成し得る。同定された当該核酸配列によりコードされるポリペプチドまたはその一部に対する抗体を生成するためにマウスに合成ペプチドを注入する。あるいは、上記の発現ベクターから発現されたタンパク質の試料を精製し、アミノ酸配列決定分析に付して、組換え的発現タンパク質の同一性を確証し、その後抗体を生じるために用い得る。モノクローナルおよびポリクローナル抗体の生成を詳細に記載する実施例は、実施例７に見られる。
【０５１５】
標準免疫クロマトグラフィー技法を用いて、同定された当該核酸またはその一部によりコードされるタンパク質を精製し得る。このような手法では、分泌タンパク質を含有する溶液、例えば培地または細胞抽出物を、クロマトグラフィーマトリックスに付着した分泌タンパク質に対する抗体を有するカラムに適用する。分泌タンパク質を免疫クロマトグラフィーカラムと結合させる。その後、カラムを洗浄して、非特異的結合タンパク質を除去する。次に標準技法を用いて、特異的結合分泌タンパク質をカラムから放出させ、回収する。これらの手法は当技術分野で周知である。
【０５１６】
代替的タンパク質精製計画では、当該同定核酸またはその一部を、キメラポリペプチドを用いた精製計画に用いるために設計された発現ベクター中に組み込み得る。このような戦略において、当該同定核酸またはその一部のコード配列を、キメラの他の半分をコードする遺伝子を有するフレーム内に挿入する。キメラの他の半分は、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）またはニッケル結合ポリペプチドコード配列であり得る。次に、それに結合されたマルトースまたはニッケルを有するクロマトグラフィーマトリックスを用いて、キメラタンパク質を精製する。ＭＢＰ遺伝子またはニッケル結合ポリペプチドおよび当該同定予測遺伝子またはその一部の間でプロテアーゼ切断部位を操作し得る。したがって、プロテアーゼ消化によりキメラの２つのポリペプチドを互いに分離し得る。
【０５１７】
マルトース結合タンパク質融合タンパク質を生成するための有用な一発現ベクターはｐＭＡＬ（New England Biolab）であり、これはｍａｌＥ遺伝子をコードする。ｐＭａｌタンパク質融合系では、クローニングした遺伝子をｍａＬＥ遺伝子から下流のｐＭａｌベクター中に挿入する。これは、ＭＢＰ融合タンパク質の発現を生じる。アフィニティークロマトグラフィーにより、融合タンパク質を精製する。上記のこれらの技法は、分子生物学の当業者に既知である。
【０５１８】
実施例７
単離スタフィロコッカス・オーレウス、サルモネラ・チフィムリウム、クレブシエラ・ニューモニエ、シュードモナス・アエルギノーサ、エンテロコックス・フェカリス、エシェリヒア・コリ、エンテロコックス・フェカリス、ヘモフィルス・インフルエンザ、ヘリコバクター・ピロリまたはサルモネラ・チフィタンパク質に対する抗体の産生
実施例６に記載したように形質転換細胞から実質的に純粋なタンパク質またはポリペプチド（配列番号３８０１〜３８０５、４８６１〜５９１５、１００１３〜１４１１０のポリペプチドの１つを含む）を単離する。例えば１０，０００モル重量切断ＡＭＩＣＯＮフィルター装置（Millipore, Bedford, MA）で数μｇ／ｍｌのレベルに濃縮することにより、最終調製物中のタンパク質の濃度を調整する。次にタンパク質に対するモノクローナルまたはポリクローナル抗体を以下のように調製し得る。
【０５１９】
ハイブリドーマ融合によるモノクローナル抗体産生
Kohler, G. andMilstein, C., Nature 256:495(1975)の古典的方法、またはその周知の誘導方法のいずれかにしたがって、ネズミハイブリドーマから上記のように同定および単離されたペプチドのいずれかのエピトープに対するモノクローナル抗体を調製し得る。要するに、数週間にわたってそれから得られる数μｇの選定タンパク質またはペプチドをマウスに反復接種する。次にマウスを屠殺して、脾臓の抗体産生細胞を単離する。ポリエチレングリコールにより脾臓細胞をマウス骨髄腫細胞と融合させ、アミノプテリンを含む選択培地（ＨＡＴ培地）上での系の成長により、余分の非融合細胞を破壊する。首尾よく融合された細胞を希釈し、希釈液のアリコートをマイクロタイタープレートのウエル中に入れて、そこで培養の成長を継続した。イムノアッセイ手法、例えばEngvall, E., "Enzyme immunoassay ELISA and EMIT," Meth.Enzymol. 70:419(1980)に記載されているようなＥＬＩＳＡおよびその誘導方法により、ウエルの上清液中の抗体を検出し、抗体産生クローンを同定する。選定陽性クローンを展開し、それらのモノクローナル抗体産物を使用のために収集し得る。モノクローナル抗体産生のための詳細な手法は、Davis, L.ら Basic Methods inMolecular Biology Elsevier, New York. Section 21-2に記載されている。
【０５２０】
免疫感作によるポリクローナル抗体産生
単一タンパク質またはペプチドの異種エピトープに対する抗体を含有するポリクローナル抗血清は、上記から得られる発現タンパク質またはペプチドで適切な動物を免疫感作することにより調製し得るが、これは未修飾であるか、または免疫原性を強化するために修飾され得る。有効なポリクローナル抗体産生は、抗原および宿主種の両方に関連する多数の因子により影響を及ぼされる。例えば小型分子は大型分子より免疫原性が低い傾向があり、担体およびアジュバントの使用を要し得る。さらに宿主動物は接種の部位および用量に応答して変化し、不適正または過剰な用量の抗原は低力価抗血清を生じる。複数の皮内部位に投与される小用量（ｎｇレベル）の抗原が最も信頼できると思われる。ウサギに関する有効免疫感作プロトコルは、Vaitukaitis, J.ら J. Clin. Endocrinol.Metab. 33:988-991(1971)に見出され得る。
【０５２１】
一定間隔でブースター注射をし、例えば既知の濃度の抗原に対する寒天中での二重免疫拡散法等によって半定量的に測定した場合、その抗体価が低下し始めたときに、抗血清を収集し得る（例えばOuchterlony, O.ら, Chap. 19 in:Handbook of Experimental Immunology D. Wier (ed) Blackwell(1973)参照）。抗体のプラトー濃度は、通常は０．１〜０．２ｍｇ／血清１ｍｌ（約１２μＭ）の範囲である。例えばFisher, D., Chap. 42 in: Mannualof Clinical Immunology, 2d Ed.(Rose and Friedman, Eds.) Amer. Soc. ForMicrobiol., Washington, D.C.(1980)により記載されているように、競合結合曲線を作成することにより、抗原に対する抗血清の親和性を決定する。
【０５２２】
いずれかのプロトコルにより調製される抗体調製物は、生物学的試料中の抗原保有物質の濃度を決定する定量的イムノアッセイに有用である。それらを半定量的または定性的に用いて、生物学的試料中の抗原の存在も同定する。抗体は、タンパク質を発現する細菌細胞を死滅させるための治療用組成物中にも用い得る。
【０５２３】
実施例８
化学ライブラリーのスクリーニング
Ａ．タンパク質ベースのアッセイ
細菌増殖に必要であることが示された細菌タンパク質を単離および発現させたならば、本発明はさらに、考え得る薬剤候補に関して化合物のライブラリーをスクリーニングするためのアッセイにおけるこれらの発現標的タンパク質の使用を意図する。化学ライブラリーの生成は、当技術分野で既知である。例えばコンビナトリアルケミストリーを用いて、本明細書中に記載するアッセイにおいてスクリーニングされるべき化合物のライブラリーを生成し得る。コンビナトリアルケミストリーライブラリーは、多数の化学「構成単位」試薬を組合せることにより、化学的合成または生物学的合成により生成される多様な化学化合物の集合である。例えば、ポリペプチドライブラリーのような一次的コンビナトリアルケミストリーライブラリーは、所定長のペプチドを産生するためのすべての考え得る組合せでアミノ酸を組み合わせることにより生成される。化学的構成単位のこのような組合せ混合により、何百万もの化学化合物を理論的に合成し得る。例えば１００の互換性化学的構成単位の系統的組合せ混合は、１億の四量体化合物または１００億の五量体化合物の理論的合成を生じる、ということを一解説者が観察した（Gallopら,"Applications of Combinatorial Technologies to Drug Discovery, Backgroundand Peptide Combinatorial Libraries," Journal of Medicinal Chemistry, Vol.37, No.9, 1233-1250(1994)）。当業者に既知のその他の化学ライブラリー、例えば天然産物ライブラリーも用い得る。
【０５２４】
一旦生成されれば、望ましい生物学的特性を保有する化合物に関して、コンビナトリアルライブラリーをスクリーニングし得る。例えば薬剤として、または薬剤を開発するために有用であり得る化合物は、上記のように同定され、発現され、そして精製された標的タンパク質に結合する能力を有すると考えられる。さらに、同定標的タンパク質が酵素である場合、候補化合物は標的タンパク質の酵素特性を妨害すると思われる。例えば標的タンパク質の酵素的機能は、プロテアーゼ、ヌクレアーゼ、ホスファターゼ、デヒドロゲナーゼ、輸送体タンパク質、転写酵素および任意のその他の型の既知または未知の酵素として役立つことであり得る。したがって本発明は、コンビナトリアルケミストリーライブラリーをスクリーニングするための上記のタンパク質産物の使用を意図する。
【０５２５】
一例では、標的タンパク質はセリンプロテアーゼであり、酵素の基質は既知である。この例は、標的酵素の阻害剤として機能する化合物を同定するための化合物のライブラリーの分析に関するものである。まず、当技術分野で既知の組合せライブラリー生成法を用いて、小分子のライブラリーを生成する。「System and Method of Automatically Generating Chemical Compoundswith Desired Properties」という表題の米国特許第５，４６３，５６４号および第５，５７４，６５６号（Agrafiotisら）は、２つのそのような教示である。次にライブラリー化合物をスクリーニングして、所望の構造的および機能的特性を保有する化合物を同定する。米国特許第５，６８４，７１１号も、ライブラリーのスクリーニング方法について考察する。
【０５２６】
スクリーニング過程を説明するために、標的ポリペプチドおよびライブラリーの化学化合物を互いに組合せて、互いに相互作用させる。標識基質をインキュベーションに添加する。基質上の標識は、標的ポリペプチドの活性に起因する基質分子の産物から検出可能シグナルを発生するようなものである。このシグナルの発生は、コンビナトリアルライブラリー化合物の非存在下で発生されるシグナルとそれを比較することにより、標的酵素の酵素活性に及ぼすコンビナトリアルライブラリー化合物の作用の測定を可能にする。酵素に対する活性を示す化合物が分析され、同定された種々の化合物と共通の特徴を示す化合物が単離され、ライブラリーの将来的な反復に併合され得るように、各ライブラリー化合物の特徴はコードされる。
【０５２７】
化合物のライブラリーが一旦スクリーニングされれば、標的酵素に対する活性を有するために、第１回スクリーニングで示された特徴を有する化学的構成単位を用いて、その後のライブラリーを生成する。この方法を用いて、候補化合物のその後の反復により、酵素に対して高い特異性を有する一群の酵素阻害剤が見出され得るまで、標的酵素の機能を抑制するのに必要な構造的および機能的特徴をますます有するようになる。次に、哺乳類における使用のための抗生物質としてのそれらの安全性および効力に関して、これらの化合物をさらに試験し得る。
【０５２８】
この特定のスクリーニング法は単なる例にすぎないことは容易に理解されるであろう。その他の方法は、当業者に既知である。例えば広範な種々のスクリーニング法は、標的タンパク質の生化学的機能が既知である場合、多数の天然標的に関して既知である。例えばいくつかの技法は、薬剤リード(drug lead)を同定し、開発するために、生化学的および遺伝学的に標的タンパク質をプローブし、分析するための小ペプチドの生成および使用を含む。このような技法としては、ＰＣＴ国際公開第９９３５４９４号、国際公開第９８１９１６２号、国際公開第９９５４７２８号に記載される方法が挙げられる。その他の技法は、天然産物ライブラリーまたは大型分子、例えばタンパク質のライブラリーを利用する。
【０５２９】
スタフィロコッカス・オーレウス、サルモネラ・チフィムリウム、クレブシエラ・ニューモニエ、シュードモナス・アエルギノーサ、エンテロコックス・フェカリス、エシェリヒア・コリ、エンテロコックス・フェカリス、ヘモフィルス・インフルエンザ、ヘリコバクター・ピロリまたはサルモネラ・チフィ由来の増殖に必要なポリペプチド（配列番号３８０１〜３８０５、４８６１〜５９１５、１００１３〜１４１１０のポリペプチドを含む）のいずれかまたはその一部を用いて上記のタンパク質ベースのアッセイを実施し得ることが理解されるであろう。さらに、相同ペプチドまたはその一部を用いて、上記のタンパク質ベースのアッセイを実施し得る。
【０５３０】
Ｂ．細胞ベースのアッセイ
薬剤発見および開発のために化合物を同定しまたは特性化するために用いられる現在の細胞ベースのアッセイはしばしば、細胞内に存在するかまたは細胞の表面に存在する標的分子の活性を調節する試験化合物の能力を検出することに依存する。細胞ベースのアッセイの利点は、インビトロ(in vitro)環境と対照的に、細胞の生理学的関連環境内で検出される標的分子の活性に及ぼす化合物の作用を可能にすることである。最も多くの場合、このような標的分子は、タンパク質、例えば酵素、レセプター等である。しかしながら、標的分子としては、その他の分子、例えばＤＮＡ、脂質、炭水化物およびＲＮＡ（例えばメッセンジャーＲＮＡ、リボソームＲＮＡ、ｔＲＮＡ、調節ＲＮＡ等）も挙げられ得る。多数の高感受性細胞ベースアッセイ法は、試験化合物と特定の標的分子との結合および相互作用を検出するために、当業者に利用可能である。しかしながらこれらの方法は一般に、試験化合物が中度または低度の親和性を有するその標的分子と結合するかまたはそうでなければ相互作用する場合、非常に有効であるというわけではない。さらに標的分子は、標的分子が細胞内部または細胞区画内に存在する場合のように、溶液中で試験化合物に容易に接近可能であるわけではない。したがって現在の細胞ベースのアッセイ方法は、それらが中度または低度の親和性を有するそれらの標的と相互作用する化合物、または容易に接近可能ではない標的と相互作用する化合物を同定または特性化するのに有効というわけではないという点で限定される。
【０５３１】
本発明の細胞ベースのアッセイ方法は、現在の細胞ベースのアッセイを上回る実質的利点を有する。これらの利点は、少なくとも１つの増殖に必要な遺伝子産物（標的分子）のレベルまたは活性が、その機能の存在または非存在が細胞増殖のための速度を決定する工程になる点まで特異的に低減された感作細胞の使用に由来する。細菌、真菌、植物または動物細胞はすべて、本発明とともに用い得る。このような感作細胞は、影響を受けた標的分子に対して活性である化合物によりいっそう感受性になる。したがって本発明の細胞ベースのアッセイは、このような化合物が、非感作細胞上よりも感作細胞上で実質的により強力であるため、当該標的分子に対する低度または中度の効力を示す化合物を検出することができる。その作用は、試験化合物が、非感作細胞と比較して、感作細胞に関して試験した場合に、２〜数倍、少なくとも１０倍、少なくとも２０倍、少なくとも５０倍、少なくとも１００倍、少なくとも１０００倍、または１０００倍以上強力であり得る。スタフィロコッカス・オーレウス、サルモネラ・チフィムリウム、クレブシエラ・ニューモニエ、シュードモナス・アエルギノーサ、エンテロコックス・フェカリス、エシェリヒア・コリ、エンテロコックス・フェカリス、ヘモフィルス・インフルエンザ、ヘリコバクター・ピロリまたはサルモネラ・チフィ由来の増殖に必要な核酸またはポリペプチドまたはその一部は、本明細書中に記載した細胞ベースのアッセイのいずれかに用い得る。同様に、相同コード核酸、相同アンチセンス核酸または相同ポリペプチド、もしくは相同核酸または相同ポリペプチドの一部は、本明細書中に記載される細胞ベースのアッセイのいずれかに用い得る。
【０５３２】
病原性微生物における抗生物質耐性の出現の増大、およびいくつかの現在用いられる抗生物質と関連するかなりの副作用に部分的に起因して、新しい標的に作用する新規の抗生物質が、当技術分野で非常に求められている。しかしながら、細胞ベースのアッセイに関連した一般的技術分野におけるさらに別の制限は、同一の限られた生物学的経路の組み合わせにおける同一種類の標的分子に対するヒットを反復的に同定するという問題である。これは、新しい標的に作用する化合物よりも「古い」標的に作用する化合物はより頻繁に遭遇し、より強力であるため、このような新しい標的に作用する化合物が棄てられ、無視され、または検出され得ない場合に起こり得る。その結果、現在使用中の大多数の抗生物質は、さらにより限定された組の生物学的経路内で、比較的少数の標的分子と相互作用する。
【０５３３】
本発明の感作細胞の使用は、２つの方法で上記の問題に対する解決を提供する。第一に、当該標的に作用する所望の化合物は、新しい標的であれ、または従来既知であるが十分には活用されていない標的であれ、本発明の感作細胞に関して試験した場合、このような所望の化合物の効力の特異的および実質的増大のために、「古い」標的に作用する化合物の「ノイズ」より高くここでは検出することができる。第二に、当該標的に作用する化合物に対して細胞を感作するために用いられる方法により、同一生物学的経路内のその他の標的分子に作用する化合物に対してもこれらの細胞を感作し得る。例えばリボソームタンパク質をコードする遺伝子に対するアンチセンス分子の発現は、そのリボソームタンパク質に作用する化合物に対して細胞を感作すると予測され、リボソーム構成成分（タンパク質またはｒＲＮＡ）のいずれかに作用する化合物に対して、またはタンパク質合成経路の一部である任意の標的に作用する化合物に対してさえ、細胞を感作し得る。したがって本発明の重要な利点は、薬剤発見法に従来は容易に近づき得なかった新しい標的および経路を明示する能力である。
【０５３４】
標的分子の活性またはレベルを低減させることにより、本発明の感作細胞を調製する。標的分子は、遺伝子産物、例えばスタフィロコッカス・オーレウス、サルモネラ・チフィムリウム、クレブシエラ・ニューモニエ、シュードモナス・アエルギノーサ、エンテロコックス・フェカリス、エシェリヒア・コリ、エンテロコックス・フェカリス、ヘモフィルス・インフルエンザ、ヘリコバクター・ピロリまたはサルモネラ・チフィ由来の増殖に必要な核酸から（例えば配列番号３７９６〜３８００、３８０６〜４８６０、５９１６〜１００１２の核酸から産生される遺伝子産物、例えば配列番号３８０１〜３８０５、４８６１〜５９１５、１００１３〜１４１１０のポリペプチド）、または相同核酸から産出されるＲＮＡまたはポリペプチドであり得る。例えば標的分子は、配列番号３８０１〜３８０５、４８６１〜５９１５、１００１３〜１４１１０のポリペプチドの１つまたは相同ポリペプチドであり得る。または標的は、スタフィロコッカス・オーレウス、サルモネラ・チフィムリウム、クレブシエラ・ニューモニエ、シュードモナス・アエルギノーサ、エンテロコックス・フェカリス、エシェリヒア・コリ、エンテロコックス・フェカリス、ヘモフィルス・インフルエンザ、ヘリコバクター・ピロリまたはサルモネラ・チフィ由来の、または相同核酸由来の増殖に必要な核酸と同一オペロン内の配列から産生される遺伝子産物、例えばＲＮＡまたはポリペプチドであり得る。さらに標的は、スタフィロコッカス・オーレウス、サルモネラ・チフィムリウム、クレブシエラ・ニューモニエ、シュードモナス・アエルギノーサ、エンテロコックス・フェカリス、エシェリヒア・コリ、エンテロコックス・フェカリス、ヘモフィルス・インフルエンザ、ヘリコバクター・ピロリまたはサルモネラ・チフィ由来の、もしくは相同核酸由来の、増殖に必要な核酸と同一生物学的経路中のＲＮＡまたはポリペプチドであり得る。このような生物学的経路としては、酵素的、生化学的および代謝的経路、ならびに細胞構造、例えば細胞壁の産生に関与する経路が挙げられるが、これらに限定されない。
【０５３５】
医学的およびコンビナトリアルケミストリーの分野で用いられる現在の方法により、種々の生物学的アッセイ、例えば直接結合アッセイおよび細胞ベースのアッセイにおいて化合物を試験することから得られる構造−活性関係情報を使用することができる。時折、このようなアッセイにおいて、薬剤として開発されるのに十分に強力である化合物を直接同定する。さらに頻繁に、初期ヒット化合物は、中度または低度の効力を示す。いったん低度または中度の効力を有するヒット化合物が同定されれば、より強力なリードを同定するために、化合物の指示ライブラリーを合成し、試験する。一般に、これらの指示ライブラリーは、ヒット化合物に関連した構造を有するが、系統的変異、例えば種々の構造的特徴の付加、削除および置換を含有する化合物からなるコンビナトリアルケミストリーライブラリーである。標的分子に対する活性に関して試験した場合、単独でまたは他の特徴と組合せて、活性を強化または低減する構造的特徴が同定される。この情報を用いて、標的分子に対する活性強化を示す化合物を含有するその後の指示ライブラリーを設計する。この過程の１回または数回反復後、標的分子に対する活性の実質的増大を示す化合物を同定し、薬剤としてさらに開発し得る。選定標的に作用する化合物はこのような細胞ベースのアッセイにおいて効力増大を示すため、本発明の感作細胞の使用によりこの過程は促進される。したがって、より多くの化合物をここで特性化することができ、別の方法で得られたものより有用な情報を提供する。
【０５３６】
したがって、本発明の細胞ベースのアッセイを用いて、従来は容易に同定または特性化されなかった化合物、例えば細胞ベースのアッセイを用いて従来は容易に活用されなかった標的に作用する化合物をここで同定または特性化し得る。初期ヒット化合物からの強力な薬剤リードを導き出す方法も、同数の試験化合物に関して、より多くの構造−機能関係の情報が明示されると考えるため、本発明の細胞ベースのアッセイにより実質的に改善される。
【０５３７】
細胞の感作方法は、適切な遺伝子またはオペロンの選択を要する。適切な遺伝子またはオペロンは、その転写および／または発現が感作される細胞の増殖に必要とされるものである。次の工程は、適切な遺伝子またはオペロンに、もしくは適切な遺伝子またはオペロンによりコードされるＲＮＡにハイブリダイズすることが可能なアンチセンスＲＮＡを、感作されるべき細胞中に導入することである。アンチセンスＲＮＡの導入は、誘導性プロモータの制御下でアンチセンスＲＮＡが産生されるベクターの形態であり得る。細胞が曝露される誘導物質の濃度を変え、それによりアンチセンスＲＮＡのプロモーター駆動性転写の活性を変えることにより、産生されるアンチセンスＲＮＡの量を調節する。したがって、致死量以下のレベルのアンチセンスＲＮＡ発現を生じる誘導物質濃度にそれらを曝露することにより、細胞を感作する。必要量の誘導物質は、当業者により経験的に誘導し得る。
【０５３８】
細胞ベースのアッセイの一実施形態では、同定されたスタフィロコッカス・オーレウス、サルモネラ・チフィムリウム、クレブシエラ・ニューモニエ、シュードモナス・アエルギノーサ、エンテロコックス・フェカリス、エシェリヒア・コリ、エンテロコックス・フェカリス、ヘモフィルス・インフルエンザ、ヘリコバクター・ピロリまたはサルモネラ・チフィヌクレオチド配列またはその一部に相補的なアンチセンス核酸（配列番号３７９６〜３８００、３８０６〜４８６０、５９１６〜１００１２の１つに相補的なヌクレオチド配列を含むアンチセンス核酸、および配列番号８〜３７９５のアンチセンス核酸またはその外来核酸の一部に相補的なヌクレオチド配列を含むアンチセンス核酸を含む）、相同コード核酸またはその一部に相補的なアンチセンス核酸、もしくは相同アンチセンス核酸を用いて、増殖に必要なタンパク質の産生を抑制する。増殖に必要とされる同定遺伝子に相補的なアンチセンスＲＮＡまたはその一部を産生するベクターを用いて、成長を重度に抑制することなく増殖に必要なタンパク質の濃度を制限する。増殖に必要なタンパク質は、配列番号３８０１〜３８０５、４８６１〜５９１５、１００１３〜１４１１０のタンパク質の１つまたは相同ポリペプチドであり得る。その目的を達成するために、アンチセンス発現により引き起こされる対応する成長抑制に対する種々の用量の誘導物質をプロットすることにより、誘導物質の成長抑制用量曲線を算定する。この曲線から、１％〜１００％の種々のパーセンテージのアンチセンス誘導性成長抑制を達成するのに必要な誘導物質の濃度を決定することができる。
【０５３９】
種々の異なる調節可能プロモーターを用いて、アンチセンス核酸を生産し得る。調節可能プロモーターに作用する転写因子リプレッサーの活性を制御することにより、調節可能プロモーターからの転写を調節し得る。例えばリプレッサーの活性に作用することにより転写を調整する場合、用いられるべき誘導物質の選択は、アンチセンス核酸の転写の調節を担うリプレッサー／オペレーターに依存する。調節可能プロモーターがｘｙｌＯ（キシロースオペレーター、例えばスタフィロコッカスキシロシス(Staphylococcus xylosis)から得られる（Schnappinger, D. ら, FEMSMicrobiol. Let. 129:121-128(1995)））に融合されたＴ５プロモーターを含む場合には、キシロースリプレッサーによりアンチセンス核酸の転写を調節し得る。例えばＳ．キシロシスＤＮＡに由来する外因性キシロースリプレッサー遺伝子のスタフィロコッカス・オーレウス細胞内での異所性発現により、キシロースリプレッサーを提供し得る。このような場合、プロモーターからのアンチセンスＲＮＡの転写は、培地にキシロースを添加することにより誘導可能であり、したがってプロモーターは「キシロース誘導性」である。同様に、ＩＰＴＧ誘導性プロモータを用い得る。例えば成長速度を有意に低減しない誘導物質の最高濃度は、曲線から概算し得る。ＯＤ測定による増殖培地の濁度によって、細胞増殖をモニタリングすることができる。別の例では、成長を２５％低減する誘導物質の濃度は、曲線から予測し得る。さらに別の例では、成長を５０％低減する誘導物質の濃度を算定し得る。コロニー形成単位（ｃｆｕ）のような付加的パラメーターを用いて、細胞成育可能性を測定し得る。
【０５４０】
アッセイされるべき細胞を、上記の濃度の誘導物質に曝露する。この致死量以下の濃度の誘導物質の存在は、増殖に必要な遺伝子産物の量を、依然として成長を支持する細胞中で最適以下に低減する。したがって、この濃度の誘導物質の存在下での細胞成長は、当該増殖に必要なタンパク質またはＲＮＡの阻害剤に対して、もしくは当該増殖に必要なタンパク質またはＲＮＡと同一生物学的経路中のタンパク質もしくはＲＮＡの阻害剤に対して特により感受性であるが、関連のないタンパク質またはＲＮＡの阻害剤に対してはそうではない。
【０５４１】
次に、抑制する濃度以下の誘導物質で前処理した細胞、したがって低減された量の増殖に必要な標的遺伝子産物を含有する細胞を用いて、細胞成長を低減する化合物に関してスクリーニングする。誘導物質の致死量以下の濃度は、細胞がより感受性である候補化合物を同定するためのアッセイの意図された使用と一致する任意の濃度であり得る。例えば誘導物質の致死量以下の濃度は、増殖抑制が少なくとも約５％、少なくとも約８％、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７５％またはそれ以上であるようなものである。上記の方法を用いて予備感作される細胞は、これらの細胞が、抑制するための標的タンパク質を野生型細胞より少なく含有するため、標的タンパク質の阻害剤により感受性が高い。
【０５４２】
スタフィロコッカス・オーレウス、サルモネラ・チフィムリウム、クレブシエラ・ニューモニエ、シュードモナス・アエルギノーサ、エンテロコックス・フェカリス、エシェリヒア・コリ、エンテロコックス・フェカリス、ヘモフィルス・インフルエンザ、ヘリコバクター・ピロリまたはサルモネラ・チフィ由来の増殖に必要な核酸のいずれかまたはその一部に相補的なヌクレオチド配列を含むアンチセンス核酸、相同コード核酸またはその一部に相補的なアンチセンス核酸、もしくは相同アンチセンス核酸を用いて、上記の細胞ベースのアッセイを実施し得ることが理解される。このようにして、スタフィロコッカス・オーレウス、サルモネラ・チフィムリウム、クレブシエラ・ニューモニエ、シュードモナス・アエルギノーサ、エンテロコックス・フェカリス、エシェリヒア・コリ、エンテロコックス・フェカリス、ヘモフィルス・インフルエンザ、ヘリコバクター・ピロリまたはサルモネラ・チフィ由来の増殖に必要なポリペプチドのいずれかまたは相同ポリペプチドのような標的のレベルまたは活性。
【０５４３】
本発明の細胞ベースアッセイの別の実施形態では、増殖に必要な遺伝子産物をコードする遺伝子における突然変異、例えば温度感受性突然変異およびそれらの増殖に必要な遺伝子産物をコードする遺伝子に相補的なヌクレオチド配列を含むアンチセンス核酸またはその一部を用いて、増殖に必要な遺伝子産物のレベルまたは活性を低減する。突然変異が増殖に必要な遺伝子中に存在する感熱性突然変異体の許容温度と制限温度との間の中間温度での細胞の成長は、増殖に必要な遺伝子産物の活性低減を示す細胞を生じる。増殖に必要な配列に相補的なアンチセンスＲＮＡはさらに、増殖に必要な遺伝子産物の活性を低減する。アンチセンス核酸の転写が誘導されており、また許容温度と制限温度の間の温度で成長する細胞が、アンチセンス核酸の発現が同定されておらず、また許容温度で成長する細胞よりも試験化合物に対して実質的に感受性であるか否かを決定することにより、温度感受性突然変異またはアンチセンス核酸単独のいずれかを用いて見出されていない薬剤を同定し得る。さらにアンチセンス核酸単独または温度感受性突然変異単独のいずれかからこれまでに見出された薬剤は、２つのアプローチを併用して細胞中で用いた場合、異なる感受性プロフィールを有して、またその感受性プロフィールは、遺伝子産物の１つまたはそれ以上の活性の抑制に際して薬剤の、より特異的な作用を示し得る。
【０５４４】
温度感受性突然変異は、遺伝子内の異なる部位に位置し、タンパク質の異なるドメインに対応する。例えばエシェリヒア・コリのｄｎａＢ遺伝子は、複製フォークＤＮＡヘリカーゼをコードする。ＤｎａＢは、いくつかのドメイン、例えばオリゴマー化、ＡＴＰ加水分解、ＤＮＡ結合、プリマーゼとの相互作用、ＤｎａＣとの相互作用およびＤｎａＡとの相互作用のためのドメインを有する［（Biswas, E.E. and Biswas, S.B. 1999. Mechanism and DnaB helicase ofEscherichia coli: structural domains involved in ATP hydrolysis, DNA binding,and oligomerization. Biochem. 38:10919-10928; Hiasa, H. and Marians, K.J. 1999.Initiation of bidirectional replication at the chromosomal origin is directedby the interaction between helicase and primase. J. Biol. Chem.274:27244-27248; San Martin, C., Radermacher, M., Wolpensinger, B., Engel, A.,Miles, C.S., Dixon, N.E., and Carazo, J.M. 1998．Three-dimension reconstructions from cryoelectron microscopy imagesreveal an intimate complex between helicase DnaB and its loading partner DnaC.Structure 6:501-9; Sutton, M.D., Carr, K.M., Vicente, M., and Kaguni, J.M.1998. Escherichia coli DnaA protein. The N-terminal domain and loading of DnaBhelicase at the E. coli chromosomal origin. J. Biol. Chem. 273:34255-62）］。ＤｎａＢの異なるドメインにおける温度感受性突然変異は、制限温度で異なる表現型を付与し、その例としては、ＤＮＡ崩壊を伴うかまたは伴わないＤＮＡ複製における突然の停止または緩やかな停止（Wechsler, J.A. and Gross, J.D. 1971. Escherichia coli mutantstemperature-sensitive for DNA synthesis. Mol. Gen. Genetics 113:273-284）、ならびに成長の終結または細胞死が挙げられる。制限温度で細胞死を引き起こすｄｎａＢ遺伝子に温度感受性突然変異の使用を、ｄｎａＢ遺伝子に対するアンチセンスと組合せると、ＤｎａＢにより示される１つまたは小群の活性の非常に特異的かつ有効な阻害剤の発見がもたらされる。
【０５４５】
増殖に必要とされる遺伝子産物の活性またはレベルを低減するが、排除しない任意の突然変異を用いて、上記の方法を実施し得ることが理解されよう。
【０５４６】
スタフィロコッカス・オーレウス、サルモネラ・チフィムリウム、クレブシエラ・ニューモニエ、シュードモナス・アエルギノーサ、エンテロコックス・フェカリス、エシェリヒア・コリ、エンテロコックス・フェカリス、ヘモフィルス・インフルエンザ、ヘリコバクター・ピロリまたはサルモネラ・チフィ由来の増殖に必要な遺伝子産物をコードする遺伝子のいずれかまたはその一部（配列番号３７９６〜３８００、３８０６〜４８６０、５９１６〜１００１２の核酸を含む）における温度感受性突然変異などの突然変異、およびそれに相補的なヌクレオチド配列を含むアンチセンス核酸、相同コード核酸またはその一部における突然変異およびそれに相補的なアンチセンス核酸、もしくは相同アンチセンス核酸を用いて、上記の細胞ベースのアッセイを実施し得ることが理解される。このようにして、スタフィロコッカス・オーレウス、サルモネラ・チフィムリウム、クレブシエラ・ニューモニエ、シュードモナス・アエルギノーサ、エンテロコックス・フェカリス、エシェリヒア・コリ、エンテロコックス・フェカリス、ヘモフィルス・インフルエンザ、ヘリコバクター・ピロリまたはサルモネラ・チフィ由来の増殖に必要なポリペプチド（配列番号３８０１〜３８０５、４８６１〜５９１５、１００１３〜１４１１０のポリペプチドを含む）のいずれかまたは相同ポリペプチドのような標的のレベルまたは活性を低減し得る。
【０５４７】
増殖に必要な遺伝子産物に対する抗菌剤に関してスクリーニングする場合、限定量のその増殖に必要な遺伝子産物を含有する細胞の成長抑制をアッセイすることができる。実験試料および対照試料間で、増殖培地の吸光度により測定した成長の量を直接比較することにより、成長抑制を測定することができる。細胞増殖をアッセイするための代替的方法としては、グリーン蛍光タンパク質（ＧＦＰ）レポーター構築物発光の測定、種々の酵素活性アッセイ、ならびに当技術分野で既知のその他の方法が挙げられる。
【０５４８】
固相、液相またはその２つの組合せにおいて上記方法を実施し得ることが理解されよう。例えばアンチセンス構築物の誘導物質を含有する栄養寒天上で成長させた細胞を、寒天表面に点在させた化合物に曝露し得る。所望により、種々の濃度の誘導物質を含有する寒天上で、細胞を成長させ得る。細胞が成長しない化合物適用点周囲の面積である、その結果生じる致死ゾーン（killing zone）の直径から、化合物の効果を判定し得る。多数の化合物を寒天プレートに移し、自動および半自動装置（例えばマルチチャネルピペット（例えばBeckman Multimek）およびマルチチャネルスポッター（例えばGenomic Solutions Flexys）を含むが（これらに限定されない）を用いて同時に試験し得る。この方法で、１日当たり多数のプレートおよび１０００〜１００万の化合物を試験し得る。
【０５４９】
下記のようにマイクロタイタープレートを用いて液相中で化合物を完全に試験し得る。液相スクリーニングは、１日当たり多数のプレートおよび１０００〜１００万の化合物をスクリーニングするための９６、３８４、１５３６またはそれ以上のウエル／マイクロタイタープレートを含有するマイクロタイタープレートで実施し得る。試薬（例えば細胞および化合物）の添加、ならびに細胞密度の測定のために、自動および半自動装置を用い得る。
【０５５０】
実施例９
リボソームタンパク質をコードする遺伝子に相補的なアンチセンスを用いた細胞ベースのアッセイ
リボソームタンパク質Ｌ７／Ｌ１２、Ｌ１０およびＬ２３をそれぞれコードする増殖に必要なエシェリヒア・コリ遺伝子ｒｐｌＬ、ｒｐｌＪおよびｒｐｌＷに対するアンチセンスＲＮＡを転写する構築物を用いて、上記の細胞ベースのアッセイの有効性を確認した。これらのタンパク質は、細胞のタンパク質合成装置の必須構成成分であり、したがって、増殖に必要とされる。リボソームに結合し、それによってタンパク質合成を抑制することが既知である抗生物質に対する細胞感受性に及ぼすアンチセンス転写の作用を、これらの構築物を用いて試験した。その産物がタンパク質合成に関与しない、いくつかのその他の遺伝子（ｅｌａＤ、ｖｉｓＣ、ｙｏｈＨおよびａｔｐＥ／Ｂ）に対するアンチセンスＲＮＡを転写する構築物を、比較のために用いた。
【０５５１】
まずｒｐｌＷに対するまたはｅｌａＤに対するアンチセンス構築物を含有するｐＬｅｘ５ＢＡ（Krauseら, J. Mol. Biol.274:365(1997)）ベクターを、別々のエシェリヒア・コリ細胞集団に導入した。ベクター導入は、当業者に周知の技法である。この実施例のベクターは、誘導物質の存在下でアンチセンスＲＮＡの転写を駆動するＩＰＴＧ誘導性プロモータを含有する。しかしながら、その他の誘導性プロモータも用い得ることを当業者は理解するであろう。適切なベクターも当技術分野で既知である。異なるリボソームタンパク質をコードする遺伝子に対する、またはタンパク質合成に関与しないタンパク質をコードする遺伝子に対するアンチセンスクローンを利用して、リボソームタンパク質に結合してタンパク質合成を抑制することが既知の抗生物質に対する細胞感受性に及ぼすアンチセンス転写の作用を試験した。ｅｌａＤ、ａｔｐＢ＆ａｔｐＥ、ｖｉｓＣおよびｙｏｈＨ遺伝子に相補的なヌクレオチド配列を含むアンチセンス核酸は、それぞれＡＳ−ｅｌａＤ、ＡＳ−ａｔｐＢ／Ｅ、ＡＳ−ｖｉｓＣ、ＡＳ−ｙｏｈＨと呼ばれる。これらの遺伝子は、タンパク質合成に関与することが既知でない。ｒｐｌＬ、ｒｐｌＬ＆ｒｐｌＪおよびｒｐｌＷ遺伝子に対するアンチセンス核酸は、それぞれＡＳ−ｒｐｌＬ、ＡＳ−ｒｐｌＬ／ＪおよびＡＳ−ｒｐｌＷと呼ばれる。これらの遺伝子は、リボソームタンパク質Ｌ７／Ｌ１２（ｒｐｌＬ）、Ｌ１０（ｒｐｌＪ）およびＬ２３（ｒｐｌＷ）をコードする。これらのアンチセンス核酸を含有するベクターを、別々のエシェリヒア・コリ細胞集団中に導入した。
【０５５２】
ＡＳ−ｅｌａＤまたはＡＳ−ｒｐｌＷを産生するベクターを含有する細胞集団を液体培地中の一連のＩＰＴＧ濃度に曝露させて、各クローンに関する成長抑制用量曲線を得る（図１）。まず、成長溶液の吸光度（ＯＤ）により測定される特定の濁度に、種培養を成長させる。溶液のＯＤは、その中に含入される細菌細胞の数に直接関連する。その後、１６個の２００μｌ液体培地培養物を、１６００ｕＭから１２．５μＭ（最終濃度）までの二重反復二倍連続希釈液中での一連のＩＰＴＧ濃度の範囲を用いて、９６ウエルマイクロタイタープレート中で３７℃にて成長させた。さらに、ＩＰＴＧを用いずに、二重反復試験で対照細胞を成長させた。当該クローンの同一初期種子培養由来の等量の細胞の接種物からこれらの培養を開始した。１５時間まで細胞を増殖させ、６００ｎｍで培養液の吸光度を測定することにより、成長の程度を決定した。対照培養が中対数期(mid-log phase)に達したら、ＩＰＴＧ成長を含有する培養液の各々に関する成長パーセント（対照培養に対する）を、対数濃度のＩＰＴＧに対してプロットして、ＩＰＴＧに関する成長抑制用量応答曲線を生成した。次に、０ｍＭのＩＰＴＧ対照（０％成長抑制）と比較した場合に、５０％（ＩＣ₅₀）にまで細胞成長を抑制するＩＰＴＧの濃度を、曲線から算定した。ｒｐｌＷまたはｅｌａＤの発現レベルを低減する量のアンチセンスＲＮＡを、それらのそれぞれのアンチセンスベクターを含有する細胞の成長を５０％抑制するような程度に生成した。
【０５５３】
成長を測定する代替的方法も意図される。これらの方法の例としては、その発現が試験されるべき細胞中で操作され、容易に測定され得るタンパク質の測定が挙げられる。このようなタンパク質の例としては、グリーン蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、ルシフェラーゼおよび種々の酵素が挙げられる。
【０５５４】
細胞を選定濃度のＩＰＴＧで前処理し、次にテトラサイクリン、エリスロマイシンおよびその他の既知のタンパク質合成阻害剤に対する細胞集団の感受性を試験するために用いた。図１は、タンパク質合成に必要とされ、細胞増殖に必須なリボソームタンパク質Ｌ２３をコードするエシェリヒア・コリｒｐｌＷ遺伝子に対するアンチセンスクローン（ＡＳ−ｒｐｌＷ）、またはタンパク質合成に関与することが既知でないｅｌａＤ遺伝子に対するアンチセンスクローン（ＡＳ−ｅｌａＤ）を含有するＩＰＴＧ誘導性プラスミドで形質転換されたエシェリヒア・コリにおけるＩＰＴＧ用量応答曲線である。
【０５５５】
テトラサイクリン用量応答曲線の例を、ぞれぞれｒｐｌＷおよびｅｌａＤ遺伝子に関して図２ＡおよびＢに示す。細胞を対数期(log phase)に成長させ、次に培地単独、またはＩＰＴＧ用量応答曲線により測定した場合に２０％および５０％成長抑制を生じる濃度のＩＰＴＧを含有する培地中に希釈した。２．５時間後、（１）２．５時間の予備インキュベーションのために用いられる同一濃度の＋／−ＩＰＴＧ；および（２）テトラサイクリンの最終濃度が１μｇ／ｍｌから１５．６ｎｇ／ｍｌまでおよび０μｇ／ｍｌの範囲であるようなテトラサイクリンの連続２倍希釈液を含有する９６ウエルプレート中に０．００２の最終ＯＤ₆₀₀に細胞を希釈した。９６ウエルプレートを３７℃でインキュベートし、１５時間までの間５分毎にプレート読取器によりＯＤ₆₀₀を読取った。
【０５５６】
ＩＰＴＧを用いた場合と用いない場合とでテトラサイクリン感受性を比較するために、用量応答曲線からテトラサイクリンＩＣ_50Sを決定した（図３Ａ〜Ｂ）。リボソームタンパク質Ｌ７／Ｌ１２およびＬ２３をそれぞれコードする遺伝子に対するアンチセンス核酸ＡＳ−ｒｐｌＬまたはＡＳ−ｒｐｌＷを転写する細胞は、ｅｌａＤ遺伝子産物のレベル低減を示す細胞（ＡＳ−ｅｌａＤ）（図２Ｂ）と比較して、テトラサイクリンに対する感受性増大を示した（図２Ａ）。図３は、ＩＰＴＧなしで決定されたテトラサイクリンＩＣ_50Sに対する５０％成長抑制を生じるＩＰＴＧの存在下で決定されたテトラサイクリンＩＣ_50S対の比（テトラサイクリン感受性の増加倍数）をプロットした要約棒グラフを示す。Ｌ７／Ｌ１２（遺伝子ｒｐｌＬ、ｒｐｌＪによりコードされる）またはＬ２３（ｒｐｌＷ遺伝子によりコードされる）のレベル低減を示す細胞は、テトラサイクリンに対する感受性増大を示した（図３）。タンパク質合成に関与することが既知でない遺伝子に対するアンチセンスを発現する細胞（ＡＳ−ａｔｐＢ／Ｅ、ＡＳ−ｖｉｓＣ、ＡＳ−ｅｌａＤ、ＡＳ−ｙｏｈＨ）は、テトラサイクリンに対する同一の感受性増大を示さず、このアッセイの特異性を確認した（図３）。
【０５５７】
上記のほかに、タンパク質合成に関与する遺伝子に対するアンチセンスＲＮＡを転写するクローン（リポソームタンパク質Ｌ７／Ｌ１２＆Ｌ１０、Ｌ７Ｌ１２単独、Ｌ２２、およびＬ１８をコードする遺伝子、ならびにｒＲＮＡおよび伸長因子Ｇをコードする遺伝子を含む）は、マクロライドであるエリスロマイシンに対する感受性増大を示すが、一方非タンパク質合成遺伝子ｅｌａＤ、ａｔｐＢ／ＥおよびｖｉｓＣに対するアンチセンスを転写するクローンはそうではないということが初期実験で観察された。さらにｒｐｌＬおよびｒｐｌＪに対するアンチセンスを転写するクローン（ＡＳ−ｒｐｌＬ／Ｊ）は、タンパク質合成を抑制しない抗生物質であるナリジクス酸およびオフロキサシンに対する感受性増大を示さない。
【０５５８】
リボソームタンパク質遺伝子ｒｐｌＬ、ｒｐｌＪおよびｒｐｌＷを用いた結果、ならびに種々の他のアンチセンスクローンおよび抗生物質を用いた初期結果は、抗生物質標的の濃度の限定が、そのタンパク質と特異的に相互作用する抗菌剤に対して細胞をより感受性にすることを示す。結果は、これらの細胞が、タンパク質標的が関与する機能全体を抑制する抗菌剤に感作されるが、その他の機能を抑制する抗菌剤に対しては感作されない、ということも示す。本明細書中に記載する増殖に必要な遺伝子の活性を抑制するスタフィロコッカス・オーレウス、サルモネラ・チフィムリウム、クレブシエラ・ニューモニエ、シュードモナス・アエルギノーサ、エンテロコックス・フェカリス、エシェリヒア・コリ、エンテロコックス・フェカリス、ヘモフィルス・インフルエンザ、ヘリコバクター・ピロリまたはサルモネラ・チフィのアンチセンスヌクレオチド配列（配列番号８〜３７９５のアンチセンス核酸を含む）または配列番号３７９６〜３８００、３８０６〜４８６０、５９１６〜１００１２の配列またはその一部分に相補的なヌクレオチド配列を含むアンチセンス核酸を用いて、上記の細胞ベースのアッセイを実行し得ることが理解される。
【０５５９】
スタフィロコッカス・オーレウス、サルモネラ・チフィムリウム、クレブシエラ・ニューモニエ、シュードモナス・アエルギノーサ、エンテロコックス・フェカリス、エシェリヒア・コリ、エンテロコックス・フェカリス、ヘモフィルス・インフルエンザ、ヘリコバクター・ピロリまたはサルモネラ・チフィ由来の増殖に必要な核酸のいずれかまたはその一部に相補的なアンチセンス核酸、相同コード核酸またはその一部に相補的なアンチセンス核酸、もしくは相同アンチセンス核酸を用いて、上記の細胞ベースのアッセイを実施し得ることが理解される。このようにして、スタフィロコッカス・オーレウス、サルモネラ・チフィムリウム、クレブシエラ・ニューモニエ、シュードモナス・アエルギノーサ、エンテロコックス・フェカリス、エシェリヒア・コリ、エンテロコックス・フェカリス、ヘモフィルス・インフルエンザ、ヘリコバクター・ピロリまたはサルモネラ・チフィ由来の増殖に必要なポリペプチドのいずれかまたは相同ポリペプチドのような標的のレベルまたは活性を低減し得る。
【０５６０】
上記の細胞ベースのアッセイを用いて、増殖に必要な核酸またはその遺伝子産物が存在する生物学的経路も同定し得る。このような方法においては、標的の増殖に必要な核酸に対する致死量以下のレベルのアンチセンスを転写する細胞、ならびにアンチセンスの転写が誘導されなかった対照細胞を、種々の経路で作用することが既知の抗生物質のパネル（ｐａｎｅｌ）と接触させる。標的の増殖に必要な核酸またはその遺伝子産物が存在する経路で抗生物質が作用する場合、アンチセンスの転写が誘導された細胞は、アンチセンスの発現が誘導されなかった細胞よりも抗生物質に対してより感受性である。
【０５６１】
対照として、アンチセンス核酸を転写する細胞のパネルを、多数の異なる増殖に必要な遺伝子、例えば標的の増殖に必要な遺伝子と接触させることにより、アッセイの結果を確証し得る。抗生物質が特異的に作用している場合、抗生物質に対する感受性増大は、標的の増殖に必要な遺伝子に対するアンチセンスを転写する細胞（または標的の増殖に必要な遺伝子と同一経路で他の増殖に必要な遺伝子に対するアンチセンスを発現する細胞）においてのみ観察されるが、増殖に必要な遺伝子に対するアンチセンスを発現するすべての細胞で一般的に観察されるわけではない。
【０５６２】
スタフィロコッカス・オーレウス、サルモネラ・チフィムリウム、クレブシエラ・ニューモニエ、シュードモナス・アエルギノーサ、エンテロコックス・フェカリス、エシェリヒア・コリ、エンテロコックス・フェカリス、ヘモフィルス・インフルエンザ、ヘリコバクター・ピロリまたはサルモネラ・チフィ由来の増殖に必要な核酸のいずれかまたはその一部に相補的なアンチセンス核酸（配列番号３７９６〜３８００、３８０６〜４８６０、５９１６〜１００１２に相補的なアンチセンス核酸、または配列番号８〜３７９５のアンチセンス核酸を含む）、相同コード核酸またはその一部に相補的なアンチセンス核酸、もしくは相同アンチセンス核酸を用いて、上記の細胞ベースのアッセイを実施し得ることが理解される。このようにして、スタフィロコッカス・オーレウス、サルモネラ・チフィムリウム、クレブシエラ・ニューモニエ、シュードモナス・アエルギノーサ、エンテロコックス・フェカリス、エシェリヒア・コリ、エンテロコックス・フェカリス、ヘモフィルス・インフルエンザ、ヘリコバクター・ピロリまたはサルモネラ・チフィ由来の増殖に必要なポリペプチド（配列番号３８０１〜３８０５、４８６１〜５９１５、１００１３〜１４１１０のポリペプチドを含む）のいずれかまたは相同ポリペプチドのような標的のレベルまたは活性を低減し得る。
【０５６３】
同様に、上記の方法を用いて、試験化合物、例えば試験抗生物質が作用する経路を決定し得る。その各々が既知の経路で増殖に必要な核酸に対するアンチセンスを転写する細胞のパネルを、それが作用する経路を決定するのが望ましい化合物と接触させる。アンチセンスの転写が誘導された細胞において、ならびにアンチセンスの発現が誘導されなかった対照細胞において、試験化合物に対する細胞のパネルの感受性を決定する。アンチセンス核酸が作用する経路で試験化合物が作用する場合、アンチセンスの発現が誘導された細胞は、アンチセンスの発現が誘導されなかった細胞より化合物に対してより感受性である。さらに、他の経路での増殖に必要な遺伝子に対するアンチセンスの発現が誘導された対照細胞は、化合物に対する感受性増大を示さない。このようにして、試験化合物が作用する経路を決定し得る。
【０５６４】
スタフィロコッカス・オーレウス、サルモネラ・チフィムリウム、クレブシエラ・ニューモニエ、シュードモナス・アエルギノーサ、エンテロコックス・フェカリス、エシェリヒア・コリ、エンテロコックス・フェカリス、ヘモフィルス・インフルエンザ、ヘリコバクター・ピロリまたはサルモネラ・チフィ由来の増殖に必要な核酸のいずれかまたはその一部に相補的なヌクレオチド配列を含むアンチセンス核酸（配列番号３７９６〜３８００、３８０６〜４８６０、５９１６〜１００１２に相補的なアンチセンス核酸、例えば配列番号８〜３７９５のアンチセンス核酸を含む）、相同コード核酸またはその一部に相補的なアンチセンス核酸、もしくは相同アンチセンス核酸を用いて、上記の細胞ベースのアッセイを実施し得ることが理解される。このようにして、スタフィロコッカス・オーレウス、サルモネラ・チフィムリウム、クレブシエラ・ニューモニエ、シュードモナス・アエルギノーサ、エンテロコックス・フェカリス、エシェリヒア・コリ、エンテロコックス・フェカリス、ヘモフィルス・インフルエンザ、ヘリコバクター・ピロリまたはサルモネラ・チフィ由来の増殖に必要なポリペプチド（配列番号３８０１〜３８０５、４８６１〜５９１５、１００１３〜１４１１０のポリペプチドを含む）のいずれかまたは相同ポリペプチドのような標的のレベルまたは活性を低減し得る。
【０５６５】
以下の実施例は、このようなアッセイを実施するための一方法を提供する。
【０５６６】
実施例１０
増殖に必要な遺伝子が存在する経路または抗生物質が作用する経路の同定
Ａ．アッセイ用細菌ストックの調製
スクリーニングのための細胞の一貫した供給源を提供するために、標準微生物技法を用いて所望のアンチセンス構築物を含有する宿主細菌の凍結ストックを調製する。例えば、細胞成長のための栄養、ならびにアンチセンス構築物がそれに対する耐性を付与する選択可能マーカーを含有する抗生物質を含有する寒天プレート上にオリジナルストックの試料を画線することにより、微生物の単一クローンを単離し得る。一夜成長後、滅菌針を用いてプレートから単離コロニーを採取し、プラスミドの保持に必要な抗生物質を含有する適切な液体増殖培地に移す。４〜６時間激しく振盪しながら３０℃〜３７℃で細胞をインキュベートして、指数関数的成長で培養液を産生する。滅菌グリセロールを１５％（容量対容量）に添加し、１００μＬ〜５００μＬの一部を滅菌冷凍管中に配分し、液体窒素中ですばやく凍結させて、さらなるアッセイのために−８０℃で保存する。
【０５６７】
Ｂ．アッセイに用いるための細菌の成長
アッセイ前日に、ストックバイアルを冷凍庫から取り出して、急速解凍（３７℃湯煎）し、細胞成長のための栄養ならびにアンチセンス構築物の選択可能マーカーがそれに対する耐性を付与する抗生物質を含有する寒天プレート上に培養液のループを画線する。３７℃で一夜成長後、無作為に選択した１０個の単離コロニーをプレート（滅菌接種物ループ）から、アンチセンスベクターがそれに対する耐性を付与する抗生物質を含有するＬＢ培地５ｍＬを含有する滅菌試験管に移す。激しく混合して均質細胞懸濁液を生成した後、懸濁液の吸光度を６００ｎｍ（ＯＤ₆₀₀）で測定し、必要な場合には、懸濁液の一部を抗生物質の入った５ｍＬ滅菌ＬＢ培地を含有する第２試験管中に希釈して、ＯＤ₆₀₀≦０．０２吸光度単位を達成する。次に、ＯＤ₆₀₀がＯＤ０．２〜０．３に達するまで振盪しながら培養液を３７℃で１〜２時間インキュベートする。この時点で、細胞はアッセイに用いられる用意ができる。
【０５６８】
Ｃ．アッセイに用いるための培地の選定
アンチセンス構築物の保持のための適切な抗生物質を含有する培地中で、誘導物質の２倍希釈系列を生成する。数個の培地を並行して試験し、３〜４個のウエルを用いて、各培地中の各濃度の誘導物質の作用を評価する。例えば以下の濃度、５ｍＭ、１０ｍＭ、２０ｍＭ，４０ｍＭ、８０ｍＭ、１２０ｍＭおよび１６０ｍＭの誘導物質キシロースを用いて、ＬＢブロス、ＴＢＤブロスおよびミューラー・ヒントン培地を試験し得る。等容量の試験培地−誘導物質および細胞を３８４ウエルマイクロタイタープレートのウエルに添加し、混合する。上記と同様に細胞を調製し、マイクロタイタープレートウエルに添加する直前に、試験抗生物質を含有する適切な培地中に細胞を１：１００に希釈する。対照のために、誘導物質を含有しない、例えば０ｍＭキシロースの各培地の数個のウエルにも細胞を添加する。１８時間にわたってウエルのＯＤ₆₀₀をモニタリングするマイクロタイタープレート読取器における３７℃でのインキュベーションにより、細胞成長を継続的にモニタリングする。誘導物質を含有しない培地中で成長する細胞により示されるものに対する対数成長率を比較することにより、各濃度の誘導物質により生成される成長の抑制パーセントを算定する。下記のアッセイに用いるために、誘導物質に対する最大感受性を生じる培地を選定する。
【０５６９】
Ｄ．アンチセンス構築物誘導の非存在下での試験抗生物質感受性の測定
構築物を保持するために用いられる抗生物質を補充しておいた、さらなるアッセイ開発のために選定される培地中に、既知の作用メカニズムを有する抗生物質の２倍希釈系列を生成する。各濃度での細胞成長に及ぼす試験抗生物質の作用を評価するために用いられている３〜４個のウエルを用いて、異なる経路に作用することが既知である試験抗生物質のパネルを並行して試験する。等容量の試験抗生物質および細胞を３８４ウエルマイクロタイタープレートのウエルに添加し、混合する。アンチセンス構築物を保持するのに必要な抗生物質を補充したアッセイ開発のために選定した培地を用いて、上記と同様に細胞を調製し、マイクロタイタープレートウエルに添加する直前に同一培地中に細胞を１：１００に希釈する。対照のために、抗生物質を欠くが抗生物質を溶解するために用いられる溶媒を含有する数個のウエルにも細胞を添加する。１８時間にわたってウエルのＯＤ600をモニタリングするマイクロタイタープレート読取器における３７℃でのインキュベーションにより、細胞成長を継続的にモニタリングする。抗生物質を含有しない培地中で成長する細胞により示されるものに対する対数成長率を比較することにより、各濃度の抗生物質により生成される成長の抑制パーセントを算定する。ｌｏｇ［抗生物質濃度］に対する抑制パーセントのプロットは、各抗生物質に関するＩＣ₅₀値の外挿を可能にする。
【０５７０】
Ｅ．アンチセンス構築物誘導物質の存在下での試験抗生物質感受性の測定
アッセイに用いるために選定した培地に、上記のように細胞成長を５０％および８０％抑制することが示された濃度の誘導物質、ならびに構築物を保持するために用いられる抗生物質を補充する。上記で用いた試験抗生物質のパネルの２倍希釈系列を、これらの各培地中で生成する。各濃度での細胞成長に及ぼす抗生物質の作用を評価するために用いられている３〜４個のウエルを用いて、数個の抗生物質を各培地中で並行して試験する。等容量の試験抗生物質および細胞を３８４ウエルマイクロタイタープレートのウエルに添加し、混合する。アンチセンス構築物を保持するのに必要な抗生物質を補充したアッセイに用いるために選定した培地を用いて、上記と同様に細胞を調製する。細胞成長をそれぞれ５０％および８０％抑制することが示された濃度の誘導物質を含有する同一培地の２つの５０ｍＬ部分中に、１：１００で細胞を希釈し、２．５時間振盪しながら３７℃でインキュベートする。マイクロタイタープレートウエルに添加する直前に、同一濃度の誘導物質ならびにアンチセンス構築物を保持するために用いられる抗生物質を補充した温（３７℃）滅菌培地中への希釈により、約ＯＤ₆₀₀（典型的には０．００２）に培養液を調整する。対照のために、試験抗生物質を溶解するために用いられる溶媒を含有するが抗生物質を含有しない数個のウエルにも細胞を添加する。１８時間にわたってウエルのＯＤ₆₀₀をモニタリングするマイクロタイタープレート読取器における３７℃でのインキュベーションにより、細胞成長を継続的にモニタリングする。抗生物質を含有しない培地中で成長する細胞により示されるものに対する対数成長率を比較することにより、各濃度の抗生物質により生成される成長の抑制パーセントを算定する。ｌｏｇ［抗生物質濃度］に対する抑制パーセントのプロットは、各抗生物質に関するＩＣ₅₀値の推定を可能にする。
【０５７１】
Ｆ．試験抗生物質の感受性の決定
アンチセンス誘導および非誘導条件下での既知の作用メカニズムを有する抗生物質により生じるＩＣ_50Sの比較により、増殖に必要な核酸が存在する経路が同定され得る。増殖に必要な遺伝子に相補的なヌクレオチド配列を含むアンチセンス核酸を発現する細胞が、特定経路を介して作用する抗生物質に対して選択的に感受性である場合には、アンチセンスが作用する遺伝子は、抗生物質が作用を及ぼす経路に関与する。
【０５７２】
Ｇ．試験抗生物質が作用する経路の同定
上記のように、細胞ベースのアッセイを用いて、試験抗生物質が作用する経路も決定し得る。このような分析においては、アンチセンス核酸のパネルの各成員が作用する経路は、上記と同様に同定される。既知の増殖に必要な経路中の遺伝子に相補的なヌクレオチド配列を含むアンチセンス核酸を転写する誘導性ベクターを各々が含有する細胞のパネルを、誘導性および非誘導性条件下でそれが作用する経路を決定するのが望ましい試験抗生物質と接触させる。感受性増大が、特定経路における遺伝子に相補的なアンチセンスを転写する誘導細胞中で観察されるが、他の経路中の遺伝子に相補的なヌクレオチド配列を含むアンチセンス核酸を転写する誘導細胞中では観察されない場合には、試験抗生物質は、感受性増大が観察された経路に対して作用する。
【０５７３】
アンチセンス転写を誘導するために用いられる誘導物質の濃度および／またはアッセイに用いられる培養条件（例えばインキュベーション温度および培地構成成分）などのアッセイ条件、のさらなる最適化は、示される抗生物質感受作の選択性および／または大きさをさらに増大させ得ることを当業者は理解するであろう。
【０５７４】
スタフィロコッカス・オーレウス、サルモネラ・チフィムリウム、クレブシエラ・ニューモニエ、シュードモナス・アエルギノーサ、エンテロコックス・フェカリス、エシェリヒア・コリ、エンテロコックス・フェカリス、ヘモフィルス・インフルエンザ、ヘリコバクター・ピロリまたはサルモネラ・チフィ由来の増殖に必要な核酸のいずれかまたはその一部に相補的なヌクレオチド配列を含むアンチセンス核酸（配列番号３７９６〜３８００、３８０６〜４８６０、５９１６〜１００１２に相補的なヌクレオチド配列を含むアンチセンス核酸、例えば配列番号８〜３７９５のアンチセンス核酸を含む）、相同コード核酸またはその一部に相補的なアンチセンス核酸、もしくは相同アンチセンス核酸を用いて、上記の細胞ベースのアッセイを実施し得ることが理解される。このようにして、スタフィロコッカス・オーレウス、サルモネラ・チフィムリウム、クレブシエラ・ニューモニエ、シュードモナス・アエルギノーサ、エンテロコックス・フェカリス、エシェリヒア・コリ、エンテロコックス・フェカリス、ヘモフィルス・インフルエンザ、ヘリコバクター・ピロリまたはサルモネラ・チフィ由来の増殖に必要なポリペプチド（配列番号３８０１〜３８０５、４８６１〜５９１５、１００１３〜１４１１０のポリペプチドを含む）のいずれかまたは相同ポリペプチドのような標的のレベルまたは活性を低減し得る。
【０５７５】
以下の実施例は、上述の方法の有効性を確認する。
【０５７６】
実施例１１
増殖に必要な遺伝子が存在する生物学的経路の同定
上記と同様の手法を用いて同定されたエシェリヒア・コリ由来の増殖に必要な遺伝子を用いて、上記のアッセイの有効性を確認した。種々の化学的種類および作用様式の抗生物質を、Sigma Chemicals（St. Louis, MO）から購入した。製造業者により提供される情報に基づいて、適切な水性溶液中に各抗生物質を溶解することにより、ストック溶液を調製した。各抗生物質の最終使用溶液は、わずか０．２％（ｗ／ｖ）の任意の有機溶液を含有した。増殖に必要な５０Ｓリボソームタンパク質に相補的なヌクレオチド配列を含むアンチセンスの転写のために操作された細菌株に対するそれらの効力を決定するために、アンチセンス構築物の保持のための適切な抗生物質を補充した増殖培地中に各抗生物質を２倍または３倍に連続希釈した。各抗生物質に関して、少なくとも１０個の希釈液を調製した。マルチチャネルピペットを用いて、３８４ウエルマイクロプレート（アッセイプレート）の別個のウエルに各希釈液の一部２５μＬを移した。各処理条件下（誘導物質ありおよびなし）で抗生物質の各希釈のために、四重反復試験ウエルを用いた。各アッセイプレートは、細胞増殖対照用の２０個のウエル（抗生物質を取り替えている増殖培地）、各処理用の１０個のウエル（誘導物質ありおよびなし、この実施例ではＩＰＴＧ）を含有した。アッセイプレートは、通常、２つの処理に分けた。すなわち半分のプレートは誘導細胞および誘導状態を保持するための適切な濃度の誘導物質（この実施例ではＩＰＴＧ）を含有し、他の半分はＩＰＴＧの非存在下で非誘導細胞を含有していた。
【０５７７】
アッセイ用の細胞を、以下のように調製した。増殖に必要な５０Ｓリボソームサブユニットタンパク質をコードする、ｒｐｌＬおよびｒｐｌＪに相補的なヌクレオチド配列を含むアンチセンス核酸（ＡＳ−ｒｐｌＬ／Ｊ）の転写がＩＰＴＧの存在下で誘導性である構築物を含有する細菌細胞を指数関数的成長に増殖させ（ＯＤ₆₀₀０．２〜０．３）、次に４００μＭまたは０μＭ誘導物質（ＩＰＴＧ）を含有する新鮮な培地中に細胞を１：１００で希釈した。これらの培養液を、３７℃で２．５時間インキュベートした。２．５時間のインキュベーション後、誘導および非誘導細胞をそれぞれ、０．０００４の最終ＯＤ₆₀₀値でアッセイ培地中に希釈した。培地は、アンチセンス構築物の保持のために適切な濃度の抗生物質を含有した。さらに、アッセイプレートへの添加が４００μＭの最終ＩＰＴＧ濃度を生じるように、誘導細胞を希釈するために用いられる培地に８００μＭのＩＰＴＧを補充した。誘導および非誘導細胞懸濁液を、上述のようなアッセイプレートの適切なウエル中に分取した（２５μｌ／ウエル）。次にプレートをプレート読取器に入れて、一定温度でインキュベートし、５９５ｎｍでの光散乱の測定により、各ウエル中で細胞成長をモニタリングした。細胞培養が定常成長期を獲得するまで、５分毎に成長をモニタリングした。各濃度の抗生物質に関して、関連対照ウエル（抗生物質なし、ＩＰＴＧありまたはなし）に関する中指数関数的成長に対応する時点で、成長の抑制パーセントを算定した。各抗生物質および条件（ＩＰＴＧありまたはなし）に関しては、抗生物質濃度のｌｏｇに対する抑制パーセントのプロットを生成し、ＩＣ₅₀を決定した。ＩＰＴＧの存在および非存在下での各抗生物質に関するＩＣ₅₀の比較は、アンチセンス構築物の誘導が抗生物質により示される作用メカニズムに対して細胞を感作するか否かを明示した。誘導物質の存在下でＩＣ₅₀値の統計学的に有意の低減を示す細胞は、試験抗生物質に対する感受性増大を示すとみなした。
【０５７８】
結果を以下の表に提示するが、これは、分析に用いられる抗生物質の種類および名称、抗生物質の標的、ＩＰＴＧの非存在下でのＩＣ₅₀、ＩＰＴＧの存在下でのＩＣ₅₀、ＩＣ₅₀に関する濃度単位、ＩＰＴＧの存在下でのＩＣ₅₀の増加倍数、ならびに感受性増大がＩＰＴＧの存在下で観察されたか否かを列挙する。
【０５７９】
【表２】

【０５８０】
上記の結果は、５０Ｓリボソームサブユニットタンパク質をコードする遺伝子に相補的なアンチセンスＲＮＡの誘導が、リボソーム機能およびタンパク質合成を抑制する抗生物質に対する細胞の選択的および非常に有意な感作を生じるということを実証する。上記の結果はさらに、必須遺伝子に対するアンチセンスの誘導が、その遺伝子産物の生物学的役割を妨害する化合物に対して細胞または微生物を感作するということを実証する。この感作は、標的遺伝子およびその産物に関連する経路を妨害する化合物に制限される。
【０５８１】
スタフィロコッカス・オーレウス、サルモネラ・チフィムリウム、クレブシエラ・ニューモニエ、シュードモナス・アエルギノーサ、エンテロコックス・フェカリス、エシェリヒア・コリ、エンテロコックス・フェカリス、ヘモフィルス・インフルエンザ、ヘリコバクター・ピロリまたはサルモネラ・チフィ由来の増殖に必要な核酸のいずれかまたはその一部に相補的なアンチセンス核酸（配列番号３７９６〜３８００、３８０６〜４８６０、５９１６〜１００１２に相補的なアンチセンス核酸、例えば配列番号８〜３７９５のアンチセンス核酸を含む）、相同コード核酸またはその一部に相補的なアンチセンス核酸、もしくは相同アンチセンス核酸を用いて、上記の細胞ベースのアッセイを実施し得ることが理解される。このようにして、スタフィロコッカス・オーレウス、サルモネラ・チフィムリウム、クレブシエラ・ニューモニエ、シュードモナス・アエルギノーサ、エンテロコックス・フェカリス、エシェリヒア・コリ、エンテロコックス・フェカリス、ヘモフィルス・インフルエンザ、ヘリコバクター・ピロリまたはサルモネラ・チフィ由来の増殖に必要なポリペプチド（配列番号３８０１〜３８０５、４８６１〜５９１５、１００１３〜１４１１０のポリペプチドを含む）のいずれかまたは相同ポリペプチドのような標的のレベルまたは活性を低減し得る。
【０５８２】
実施例１１Ａでは、スタフィロコッカス・オーレウスにおいて実行される分析を記載する。
【０５８３】
実施例１１Ａ
スタフィロコッカス・オーレウスの増殖に必要な遺伝子が存在する生物学的経路の同定
種々の化学的種類および作用様式の抗生物質を化学物質供給業者、例えばSigma Chemical（St. Louis, MO）から購入した。製造業者により提供される情報に基づいて、適切な水性溶液中に各抗生物質を溶解することにより、ストック溶液を調製した。各抗生物質の最終使用溶液は、わずか０．２％（ｗ／ｖ）の任意の有機溶媒を含有した。
【０５８４】
キシロース誘導性プロモーターの制御下で、ＤＮＡジャイレース（これは増殖に必要とされる）のβサブユニットをコードするヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を含むアンチセンス核酸を含有する細菌株に対するその効力を決定するために、アンチセンス構築物の保持のために適切な抗生物質を補充した増殖培地中に各抗生物質を２倍または３倍に連続希釈した。各抗生物質に関して、少なくとも１０個の希釈液を調製した。
【０５８５】
マルチチャネルピペットを用いて３８４ウエルマイクロプレート（アッセイプレート）の別個のウエルに各希釈液のアリコート（２５μＬ）を移した。各処理条件下（誘導物質ありまたはなし）で抗生物質の各希釈のために、四重反復試験ウエルを用いた。各アッセイプレートは、細胞増殖対照用の２０個のウエル（増殖培地、抗生物質なし）、各処理用の１０のウエル（誘導物質ありまたはなし、この実施例ではキシロース）を含有した。半分のアッセイプレートは誘導細胞（この実施例ではスタフィロコッカス・オーレウス細胞）および誘導状態を保持するために適切な濃度の誘導物質（この実施例ではキシロース）を含有し、アッセイプレートの他の半分は誘導物質の非存在下で保持される非誘導細胞を含有した。
【０５８６】
細菌細胞の調製
ＤＮＡジャイレースのβサブユニットをコードする配列に相補的なヌクレオチド配列を含むアンチセンスの転写がキシロース誘導性プロモーターの制御下で誘導可能である構築物を含有する細菌クローンの細胞（Ｓ１Ｍ１００００００１Ｆ０８）を指数関数的成長に成長させ（ＯＤ₆₀₀０．２〜０．３）、次に１２ｍＭまたは０ｍＭ誘導物質（キシロース）を含有する新鮮な培地中に細胞を１：１００で希釈した。これらの培養液を、３７℃で２．５時間インキュベートした。２．５時間のインキュベーション後、誘導および非誘導細胞をそれぞれ、アンチセンス構築物の保持のための適切な濃度の抗生物質を含有するアッセイ培地中に希釈した。さらに、アッセイプレートへの添加が１２ｍＭの最終キシロース濃度を生じるように、誘導細胞を希釈するために用いられる培地に２４ｍＭのキシロースを補充した。細胞を希釈して、最終ＯＤ₆₀₀値を０．０００４とした。
【０５８７】
誘導および非誘導細胞懸濁液を、上述のようなアッセイプレートの適切なウエル中に分取した（２５μｌ／ウエル）。次にプレートをプレート読取器に入れて、一定温度でインキュベートしながら、５９５ｎｍでの光散乱の測定により、各ウエル中で細胞成長をモニタリングした。細胞培養が定常成長期を獲得するまで、５分毎に成長をモニタリングした。各濃度の抗生物質に関して、関連対照ウエル（抗生物質なし、キシロースありまたはなし）に関する中指数関数的成長に対応する時点で、成長の抑制パーセントを算定した。各抗生物質および条件（キシロースありまたはなし）に関しては、抗生物質濃度のｌｏｇに対する抑制パーセントのプロットを生成し、ＩＣ₅₀を決定した。
【０５８８】
誘導物質(この実施例ではキシロース)の存在および非存在下での各抗生物質のＩＣ₅₀の比較は、アンチセンス構築物の誘導が抗生物質の作用メカニズムに対して細胞を感作するか否かを明示する。抗生物質がＤＮＡジャイレースのβサブユニットに対して作用する場合、誘導細胞のＩＣ₅₀は非誘導細胞のＩＣ₅₀より有意に低い。
【０５８９】
図４は、試験した抗生物質、それらの標的、および誘導細胞および非誘導細胞間の効力におけるそれらの増加指数を列挙する。図４に示すように、各々がジャイレースのβサブユニット以外の標的に作用するセフォタキシム、セフォキシチン、フシジン酸、リンコマイシン、トブラマイシン、トリメトプリムおよびバンコマイシンの効力は、非誘導細胞と比較した場合、誘導細胞において有意に異ならなかった。しかしながら、ＤＮＡジャイレースのβサブユニットに対して作用することが既知であるノボビオシンの効力は、誘導細胞および非誘導細胞間で有意に異なった。
【０５９０】
したがって、ジャイレースのβサブユニットをコードする配列に相補的なヌクレオチド配列を含むアンチセンス核酸の誘導は、このタンパク質の活性を抑制する抗生物質に対するスタフィロコッカス・オーレウスの選択的および有意な感作を生じる。さらに結果は、必須遺伝子に対するアンチセンス構築物の誘導が、その遺伝子産物の生物学的役割を妨害する化合物に対して細胞または微生物を感作することを実証する。この感作は、標的遺伝子およびその産物を妨害する化合物に制限されるように見える。
【０５９１】
スタフィロコッカス・オーレウス、サルモネラ・チフィムリウム、クレブシエラ・ニューモニエ、シュードモナス・アエルギノーサ、エンテロコックス・フェカリス、エシェリヒア・コリ、エンテロコックス・フェカリス、ヘモフィルス・インフルエンザ、ヘリコバクター・ピロリまたはサルモネラ・チフィ由来の増殖に必要な核酸のいずれかまたはその一部に相補的なアンチセンス核酸（配列番号３７９６〜３８００、３８０６〜４８６０、５９１６〜１００１２に相補的なアンチセンス核酸、例えば配列番号８〜３７９５のアンチセンス核酸を含む）、相同コード核酸またはその一部に相補的なアンチセンス核酸、もしくは相同アンチセンス核酸を用いて、上記の細胞ベースのアッセイを実施し得ることが理解される。このようにして、スタフィロコッカス・オーレウス、サルモネラ・チフィムリウム、クレブシエラ・ニューモニエ、シュードモナス・アエルギノーサ、エンテロコックス・フェカリス、エシェリヒア・コリ、エンテロコックス・フェカリス、ヘモフィルス・インフルエンザ、ヘリコバクター・ピロリまたはサルモネラ・チフィ由来の増殖に必要なポリペプチドのいずれかまたは相同ポリペプチドのような標的のレベルまたは活性を低減し得る。
【０５９２】
必須遺伝子またはその一部に対するアンチセンス構築物を利用するアッセイを用いて、それらの遺伝子産物の活性を妨害する化合物を同定し得る。このようなアッセイを用いて、薬剤リード、例えば抗生物質を同定し得る。
【０５９３】
異なるアンチセンス核酸を転写する細胞のパネルを用いて、作用メカニズムがわかっていない抗生物質を含む必須生化学経路に影響を及ぼす化合物の介入点を特性化し得る。
【０５９４】
必須遺伝子に対するアンチセンス構築物を利用するアッセイを用いて、経路中の多数の標的の活性を特異的に妨害する化合物を同定し得る。このような構築物を用いて、一反応において一経路中の多数の標的に対して試料を同時にスクリーニングし得る（コンビナトリアルＨＴＳ）。
【０５９５】
さらに上記のように、アンチセンス構築物含有細胞のパネルを用いて、作用メカニズムがわかっていない抗生物質を含む必須生化学経路に影響を及ぼす任意の化合物の介入点を特性化し得る。
【０５９６】
スタフィロコッカス・オーレウス、サルモネラ・チフィムリウム、クレブシエラ・ニューモニエ、シュードモナス・アエルギノーサ、エンテロコックス・フェカリス、エシェリヒア・コリ、エンテロコックス・フェカリス、ヘモフィルス・インフルエンザ、ヘリコバクター・ピロリまたはサルモネラ・チフィ由来の増殖に必要な核酸のいずれかまたはその一部に相補的なアンチセンス核酸（配列番号３７９６〜３８００、３８０６〜４８６０、５９１６〜１００１２に相補的なヌクレオチド配列を含むアンチセンス核酸、例えば配列番号８〜３７９５のアンチセンス核酸を含む）、相同コード核酸またはその一部に相補的なアンチセンス核酸、もしくは相同アンチセンス核酸を用いて、上記の細胞ベースのアッセイを実施し得ることが理解される。このようにして、スタフィロコッカス・オーレウス、サルモネラ・チフィムリウム、クレブシエラ・ニューモニエ、シュードモナス・アエルギノーサ、エンテロコックス・フェカリス、エシェリヒア・コリ、エンテロコックス・フェカリス、ヘモフィルス・インフルエンザ、ヘリコバクター・ピロリまたはサルモネラ・チフィ由来の増殖に必要なポリペプチドのいずれかまたは相同ポリペプチドのような標的のレベルまたは活性を低減し得る。
【０５９７】
本発明の別の実施形態は、試験抗生物質化合物が活性である経路の決定であって、増殖に必要な経路に関与する標的タンパク質または核酸の活性が、標的タンパク質または核酸に対して作用する致死量以下の濃度の既知の抗生物質と細胞を接触することにより低減される方法である。一実施形態では、標的タンパク質または核酸は、上記の方法を用いて同定される増殖に必要な核酸、例えば配列番号３８０１〜３８０５、４８６１〜５９１５、１００１３〜１４１１０のポリペプチドまたは相同ポリペプチドに対応する。本方法は、試験抗生物質がどの経路に対して作用するかの決定に関しては上記と同様であるが、但し増殖に必要な核酸に対する致死量以下のレベルのアンチセンスを用いて増殖に必要な遺伝子産物の活性またはレベルを低減するというよりむしろ、感作細胞は、増殖に必要な遺伝子産物に対して作用する致死量以下のレベルの既知の抗生物質を用いて増殖に必要な遺伝子産物の活性またはレベルを低減することにより生成される。感受性増大は、試験化合物が活性である経路を決定する。
【０５９８】
同一生物学的経路に影響を及ぼす薬剤間の相互作用は、文献に記載されている。例えば、ミシリナム（アムジノシリン）はペニシリン結合タンパク質２（ＰＢＰ２、エシェリヒア・コリ中のｍｒｄＡの産物）に結合し、不活性化する。この抗生物質は、ＰＢＰ２を抑制する他の抗生物質、ならびにその他のペニシリン結合タンパク質、例えばＰＢＰ３を抑制する抗生物質と相互作用する［（Gutmann,L., Vincent, S., Billot-Klein, D., Acar, J.F., Mrena, E., and Williamson,R.(1986) Involvement of penicillin-binding protein 2 with otherpenicillin-binding proteins in lysis of Escherichia coli by some beta-lactamantibiotics alone end in synergistic lytic effect of amdinocillin(mecillinam). AntimicrobialAgents & Chemotherapy, 30:906-912）］。したがって、薬剤間の相互作用は、同一標的タンパク質または核酸を抑制するか、もしくは同一経路中の異なるタンパク質または核酸を抑制する２つの薬剤を包含し得る［（Fukuoka,T., Domon, H., Kakuta, M., Ishii, C., Hirasawa, A., Utsui, Y., Ohya, S., andYyasuda, H.(1997) Combination effect between panipenem and vancomycin on highlymethicillin-resistant Staphylococcus aureus. Japan. J. Antibio. 50:411-419;Smith, C.E., Foleno, B.E., Barrett, J.F., and Frosc, M.B.(1997) Assessment ofthe synergistic interactions of levofloxacin and ampicillin againstEnterococcus faecium by the checkerboard agar dilution and time-kill methods.Diagnos. Microbiol. Infect. Disease 27:85-92; den Hollander, J.G., Horrevorts,A.M., van Goor, M.L., Verbrugh, H.A., and Mouton, J.W.(1997) Synergism betweentobramycin and ceftazidime against a resistant Pseudomonas aeruginosa strain,tested in an in vitro pharmacokinetic model. Antimicrobial Agents &Chemotherapy. 41: 95-110）］。
【０５９９】
２つの薬剤は、それらが異なる標的を抑制するとしても、相互作用し得る。例えば、一緒に作用する２つの相乗的化合物であるプロトンポンプ阻害剤であるオメプラゾールおよび抗生物質であるアモキシシリンは、ヘリコバクター・ピロリ感染を治癒することができる［（Gabryelewicz,A., Laszewicz, W., Dzieniszewski, J., Ciok, J., Marlicz, K., Bielecki, D.,Popiela, T., Legutko, J., Knapik, Z., Poniewierka, E.(1997) Multicenterevaluation of dual-therapy (omeprazol and amoxycillin) for Helicobacterpylori-associated duodenal and gastric ulcer (two years of the observation). J.Physiol. Pharmacol. 48 Suppl 4:93-105）］。
【０６００】
致死量以下の濃度の既知の抗生物質からの成長抑制は、少なくとも約５％、少なくとも約８％、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％または少なくとも約７５％またはそれ以上であり得る。
【０６０１】
あるいは、成長抑制を測定するというよりむしろ、標的の増殖に必要な遺伝子産物の活性を測定することにより、致死量以下の濃度の既知の抗生物質を決定し得る。
【０６０２】
細胞を、致死量以下のレベルでの既知の抗生物質のパネルの各成員と種々の濃度の試験抗生物質の組合せと接触させる。対照として、細胞を、種々の濃度の試験抗生物質単独と接触させる。既知の抗生物質の存在下および非存在下での試験構成物質のＩＣ₅₀を決定する。既知の薬剤の存在下および非存在下でのＩＣ_50Sが実質的に類似する場合には、試験薬剤および既知の薬剤は異なる経路で作用する。ＩＣ_50Sが実質的に異なる場合には、試験薬剤および既知の薬剤は同一経路で作用する。
【０６０３】
スタフィロコッカス・オーレウス、サルモネラ・チフィムリウム、クレブシエラ・ニューモニエ、シュードモナス・アエルギノーサ、エンテロコックス・フェカリス、エシェリヒア・コリ、エンテロコックス・フェカリス、ヘモフィルス・インフルエンザ、ヘリコバクター・ピロリまたはサルモネラ・チフィ由来の増殖に必要な核酸のいずれかまたはその一部の産物（配列番号３７９６〜３８００、３８０６〜４８６０、５９１６〜１００１２の産物を含む）、もしくは相同コード核酸またはその一部の産物に対して作用する、致死量以下の濃度既知の抗生物質を用いて、上記の細胞ベースのアッセイを実施し得ることが理解される。このようにして、スタフィロコッカス・オーレウス、サルモネラ・チフィムリウム、クレブシエラ・ニューモニエ、シュードモナス・アエルギノーサ、エンテロコックス・フェカリス、エシェリヒア・コリ、エンテロコックス・フェカリス、ヘモフィルス・インフルエンザ、ヘリコバクター・ピロリまたはサルモネラ・チフィ由来の増殖に必要なポリペプチド（配列番号３８０１〜３８０５、４８６１〜５９１５、１００１３〜１４１１０のポリペプチドを含む）のいずれかまたは相同ポリペプチドのような標的のレベルまたは活性を低減し得る。
【０６０４】
本発明の別の実施形態は、抗生物質として用いるための候補化合物の同定方法であって、標的タンパク質または核酸に対して作用する致死量以下の濃度の既知の抗生物質と細胞を接触させることにより、増殖に必要な経路に関与する標的タンパク質または核酸の活性が低減される方法である。一実施形態では、標的タンパク質または核酸は、上記の方法を用いて同定される増殖に必要な核酸に対応する標的タンパク質または核酸である。本方法は、抗生物質として用いるための候補化合物を同定するための本明細書中に上述したものと同様であるが、但し、増殖に必要な核酸に対する致死量以下のレベルのアンチセンスを用いて増殖に必要な遺伝子産物の活性またはレベルを低減するというよりむしろ、増殖に必要な遺伝子産物に対して作用する致死量以下のレベルの既知の抗生物質を用いて増殖に必要な遺伝子産物の活性またはレベルは低減される。
【０６０５】
致死量以下の濃度の既知の抗生物質からの成長抑制は、少なくとも約５％、少なくとも約８％、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％または少なくとも約７５％またはそれ以上であり得る。
【０６０６】
あるいは、成長抑制を測定するというよりむしろ、標的の増殖に必要な遺伝子産物の活性を測定することにより、致死量以下の濃度の既知の抗生物質を決定し得る。
【０６０７】
当該試験化合物を特性化するために、細胞を、致死量以下のレベルでの既知の抗生物質のパネル、および１つまたはそれ以上の濃度の試験化合物の組合せと接触させる。対照として、細胞を、同一濃度の試験抗生物質単独と接触させる。既知の抗生物質の存在下および非存在下での試験化合物のＩＣ₅₀を決定する。既知の薬剤の存在下および非存在下での試験化合物のＩＣ_50Sが実質的に異なる場合には、試験化合物は抗生物質として用いるための良好な候補である。上記のように、上記の方法を用いて候補化合物が一旦同定されれば、標準技法、例えばコンビナトリアルケミストリーを用いてその構造を最適化し得る。
【０６０８】
上記の方法の各々に用いられ得る代表的な既知の抗生物質を、以下の第４表に示す。しかしながら他の抗生物質も用い得ることは理解されよう。
【０６０９】
【表３】

【表４】

【表５】

【０６１０】
スタフィロコッカス・オーレウス、サルモネラ・チフィムリウム、クレブシエラ・ニューモニエ、シュードモナス・アエルギノーサ、エンテロコックス・フェカリス、エシェリヒア・コリ、エンテロコックス・フェカリス、ヘモフィルス・インフルエンザ、ヘリコバクター・ピロリまたはサルモネラ・チフィ由来の増殖に必要な核酸のいずれかまたはその一部、もしくは相同核酸の産物に対して作用する、致死量以下の濃度既知の抗生物質を用いて、上記の細胞ベースのアッセイを実施し得ることが理解される。このようにして、スタフィロコッカス・オーレウス、サルモネラ・チフィムリウム、クレブシエラ・ニューモニエ、シュードモナス・アエルギノーサ、エンテロコックス・フェカリス、エシェリヒア・コリ、エンテロコックス・フェカリス、ヘモフィルス・インフルエンザ、ヘリコバクター・ピロリまたはサルモネラ・チフィ由来の増殖に必要なポリペプチドのいずれかまたは相同ポリペプチドのような標的のレベルまたは活性を低減し得る。
【０６１１】
実施例１２
他の細菌種への外因性核酸配列の導入
第１の生物中で同定されるアンチセンス分子の、第２の生物の増殖を抑制する能力（それにより、第１の生物由来の遺伝子に相同的な第２の生物中の遺伝子が第２の生物の増殖に必要とされることを確証する）を、上記と同様の方法を用いて同定されたエシェリヒア・コリの成長を抑制するアンチセンス核酸を用いて確認した。ＩＰＴＧを用いたアンチセンスＲＮＡ発現の誘導時にエシェリヒア・コリの成長を抑制した発現ベクターを、エンテロバクター・クロアカエ（Enterobactercloacae）、クレブシエラ・ニューモニエまたはサルモネラ・チフィムリウム中に直接形質転換させた。次に実施例１の方法にしたがって、成長抑制に関して形質転換細胞をアッセイした。液体培養液中での成長後、細胞を種々の連続希釈で平板培養し、コロニーが観察された最大１０倍希釈により決定した場合の誘導対非誘導アンチセンスＲＮＡ発現に関して成長の対数差を算定することにより、スコアを決定した。これらの実験の結果を以下の第５表に列挙する。微生物中でアンチセンスＲＮＡ発現の作用が認められなかった場合、クローンは第５表中では−である。これに対して、第５表中の＋は、同じ条件下で用いた非誘導プレート上で、およびその微生物中でよりも、誘導プレート上でコロニーを観察するためには少なくとも１０倍多い細胞が必要であったことを意味する。
【０６１２】
【表６】

【表７】

【表８】

【表９】

【０６１３】
したがって、スタフィロコッカス・オーレウス、サルモネラ・チフィムリウム、クレブシエラ・ニューモニエ、シュードモナス・アエルギノーサおよびエンテロコッカス・フェカリス、エシェリヒア・コリ、エンテロコッカス・フェカリス、ヘモフィルス・インフルエンザ、ヘリコバクター・ピロリ、またはサルモネラ・チフィの増殖を抑制するアンチセンス核酸の、他の生物の成長を抑制する能力を、それらが得られた生物以外の種にアンチセンス核酸を直接形質転換することによって評価し得る。特に、アナプラスマ・マルギナレ(Anaplasmamarginale)、アスペルギルス・フミガツス(Aspergillus fumigatus)、バチルス・アンスラシス(Bacillus anthracis)、バクテリオイデス・フラギリス(Bacterioidesfragilis)、百日咳菌(Bordetella pertussis)、ブルクホルデリア・セパシア(Burkholderia cepacia)、カンピロバクター・イェジュニィ(Campylobacterjejuni)、カンジダ・アルビカンス (Candida albicans)、カンジダ・グラブラタ(Candida glabrata)（トルロプシス・グラブラタ(Torulopsisglabrata)とも呼ばれる）、カンジダ・トロピカリス(Candida tropicalis)、カンジダ・パラプシロシス(Candida parapsilosis)、カンジダ・ギルリエルモンジイ(Candidaguilliermondii)、カンジダ・クルセイ(Candida krusei)、カンジダ・ケフィア(Candida kefyr)（カンジダ・シュードトロピカリス(Candidapseudotropicalis)とも呼ばれる）、カンジダ・デュブリニエンシス(Candida dubliniensis)、クラミジア・ニューモニエ(Chlamydiapneumoniae)、トラコーマ・クラミジア(Chlamydia trachomatus)、クロストリジウム・ボツリヌム(Clostridiumbotulinum)、クロストリジウム・ジフィシル(Clostridium difficile)、クロストリジウム・パーフリンゲンス(Clostridiumperfringens)、コクシジオデス・イミチス(Coccidiodes immitis)、コリネバクテリウム・ジフテリア(Corynebacteriumdiptheriae)、クリプトコックス・ネオフォルマンス(Cryptococcus neoformans)、エンテロバクター・クロアカエ(Enterobactercloacae)、エンテロコックス・フェカリス(Enterococcus faecalis)、エンテロコックス・ファエシウム(Enterococcusfaecium)、エシェリヒア・コリ(Escherichia coli)、ヘモフィルス・インフルエンザ(Haemophilus influenzae)、ヘリコバクター・ピロリ(Helicobacterpylori)、ヒストプラスマ・カプスラツム(Histoplasma capsulatum)、クレブシエラ・ニューモニエ(Klebsiellapneumoniae)、リステリア・モノサイトゲネス(Listeria monocytogenes)、マイコバクテリウム・レプラエ(Mycobacteriumleprae)、マイコバクテリウム・ツベルクローシス(Mycobacterium tuberculosis)、ナイセリア・ゴノローエ(Neisseriagonorrhoeae)、髄膜炎菌(Neisseria meningitidis)、ノカルジア・アステロイデス(Nocardia asteroides)、パスツレラ・ヘモリチカ(Pasteurellahaemolytica)、パスツレラ・ムルトシダ(Pasteurella multocida)、ニューモシスティス・カリニー(Pneumocystiscarinii)、プロテウス・ブルガリス(Proteus vulgaris)、シュードモナス・アエルギノーサ(Pseudomonas aeruginosa)、サルモネラ・ボンゴリ(Salmonellabongori)、サルモネラ・コレラスイス(Salmonella cholerasuis)、サルモネラ・エンテリカ(Salmonella enterica)、サルモネラ・パラチフィ(Salmonellaparatyphi)、サルモネラ・チフィ(Salmonella typhi)、サルモネラ・チフィムリウム(Salmonella typhimurium)、スタフィロコッカス・オーレウス(Staphylococcusaureus)、リステリア・モノサイトゲネス(Listeria monocytogenes)、モクサレラ・カタルハリス(Moxarellacatarrhalis)、シゲラ・ボイディ(Shigella boydii)、シゲラ・ディッセンリイ(Shigella dysenteriae)、シゲラ・フレックスネリ(Shigellaflexneri)、シゲラ・ソネイ(Shigella sonnei)、スタフィロコッカス・エピダーミディス(Staphylococcusepidermidis)、ストレプトコッカス・ニューモニエ(Streptococcus pneumoniae)、ストレプトコッカス・ミュータンス(Streptococcusmutans)、トレポネーマ・パリダム(Treponema pallidum)、エルシニア・エンテロコリチカ(Yersinia enterocolitica)、エルシニア・ペスティス(Yersiniapestis)、または上記種のいずれかの属に属する任意の種の成長を抑制するアンチセンス核酸の能力を評価する。本発明のいくつかの実施形態では、アンチセンス核酸の、エシェリヒア・コリ以外の生物の成長を抑制する能力を評価し得る。それらの実施形態では、アンチセンス核酸を、アンチセンス核酸が評価される生物にて機能的な発現ベクター内に挿入する。
【０６１４】
スタフィロコッカス・オーレウス、サルモネラ・チフィムリウム、クレブシエラ・ニューモニエ、シュードモナス・アエルギノーサ、エンテロコックス・フェカリス、エシェリヒア・コリ、エンテロコックス・フェカリス、ヘモフィルス・インフルエンザ、ヘリコバクター・ピロリまたはサルモネラ・チフィ由来の増殖に必要な核酸またはその一部のいずれかに相補的なアンチセンス核酸（配列番号３７９６〜３８００、３８０６〜４８６０、５９１６〜１００１２に相補的なアンチセンス核酸、例えば配列番号８〜３７９５のアンチセンス核酸を含む）、相同コード核酸またはその一部に相補的なアンチセンス核酸、もしくは相同アンチセンス核酸を用いて、異種生物の増殖を抑制するアンチセンス核酸の能力を評価する上記方法を実施し得ることが理解される。
【０６１５】
異種細胞または微生物における負の結果は、細胞または微生物がその遺伝子を欠いていることを意味しないし、また遺伝子が必須でないことも意味しないことを当業者は理解するであろう。しかしながら正の結果は、異種細胞または微生物がその細胞または微生物の増殖に必要とされる相同遺伝子を含有することを意味する。相同遺伝子は、本明細書中に記載する方法を用いて得られ得る。アンチセンスにより抑制される細胞は、これらの細胞または微生物中で有効な抗生物質を開発するために、化合物の同定および特性化に関して本明細書中に記載するような細胞ベースのアッセイに用い得る。それが得られた微生物中で機能するアンチセンス分子が、異種細胞または微生物中で常に機能するというわけではないことを当業者は理解するであろう。
【０６１６】
実施例１２Ａ
スタフィロコッカス・オーレウス、サルモネラ・チフィムリウム、クレブシエラ・ニューモニエ、シュードモナス・アエルギノーサ、エンテロコックス・フェカリス、エシェリヒア・コリ、エンテロコックス・フェカリス、ヘモフィルス・インフルエンザ、ヘリコバクター・ピロリまたはサルモネラ・チフィの発現ベクターまたはスタフィロコッカス・オーレウス、サルモネラ・チフィムリウム、クレブシエラ・ニューモニエ、シュードモナス・アエルギノーサ、エンテロコックス・フェカリス、エシェリヒア・コリ、エンテロコックス・フェカリス、ヘモフィルス・インフルエンザ、ヘリコバクター・ピロリまたはサルモネラ・チフィ以外の細菌種中で機能的な発現ベクターを用いる他の細菌種への外因性核酸配列の導入
スタフィロコッカス・オーレウス、サルモネラ・チフィムリウム、クレブシエラ・ニューモニエ、シュードモナス・アエルギノーサ、エンテロコックス・フェカリス、エシェリヒア・コリ、エンテロコックス・フェカリス、ヘモフィルス・インフルエンザ、ヘリコバクター・ピロリまたはサルモネラ・チフィの成長を抑制するアンチセンス核酸またはその一部はまた、スタフィロコッカス・オーレウス、サルモネラ・チフィムリウム、クレブシエラ・ニューモニエ、シュードモナス・アエルギノーサ、エンテロコックス・フェカリス、エシェリヒア・コリ、エンテロコックス・フェカリス、ヘモフィルス・インフルエンザ、ヘリコバクター・ピロリまたはサルモネラ・チフィ以外の細胞または微生物の成長を抑制するそれらの能力についても評価され得る。例えば、スタフィロコッカス・オーレウス、サルモネラ・チフィムリウム、クレブシエラ・ニューモニエ、シュードモナス・アエルギノーサ、エンテロコックス・フェカリス、エシェリヒア・コリ、エンテロコックス・フェカリス、ヘモフィルス・インフルエンザ、ヘリコバクター・ピロリまたはサルモネラ・チフィの成長を抑制するアンチセンス核酸を、他の生物の成長を抑制する能力について評価し得る。特に、アナプラスマ・マルギナレ(Anaplasmamarginale)、アスペルギルス・フミガツス(Aspergillus fumigatus)、バチルス・アンスラシス(Bacillus anthracis)、バクテリオイデス・フラギリス(Bacterioidesfragilis)、百日咳菌(Bordetella pertussis)、ブルクホルデリア・セパシア(Burkholderia cepacia)、カンピロバクター・イェジュニィ(Campylobacterjejuni)、カンジダ・アルビカンス (Candida albicans)、カンジダ・グラブラタ(Candida glabrata)（トルロプシス・グラブラタ(Torulopsisglabrata)とも呼ばれる）、カンジダ・トロピカリス(Candida tropicalis)、カンジダ・パラプシロシス(Candidaparapsilosis)、カンジダ・ギルリエルモンジイ(Candida guilliermondii)、カンジダ・クルセイ(Candida krusei)、カンジダ・ケフィア(Candidakefyr)（カンジダ・シュードトロピカリス(Candida pseudotropicalis)とも呼ばれる）、カンジダ・デュブリニエンシス(Candidadubliniensis)、クラミジア・ニューモニエ(Chlamydia pneumoniae)、トラコーマ・クラミジア(Chlamydiatrachomatus)、クロストリジウム・ボツリヌム(Clostridium botulinum)、クロストリジウム・ジフィシル(Clostridiumdifficile)、クロストリジウム・パーフリンゲンス(Clostridium perfringens)、コクシジオデス・イミチス(Coccidiodesimmitis)、コリネバクテリウム・ジフテリア(Corynebacterium diptheriae)、クリプトコックス・ネオフォルマンス(Cryptococcusneoformans)、エンテロバクター・クロアカエ(Enterobacter cloacae)、エンテロコックス・フェカリス(Enterococcusfaecalis)、エンテロコックス・ファエシウム(Enterococcus faecium)、エシェリヒア・コリ(Escherichia coli)、ヘモフィルス・インフルエンザ(Haemophilusinfluenzae)、ヘリコバクター・ピロリ(Helicobacter pylori)、ヒストプラスマ・カプスラツム(Histoplasmacapsulatum)、クレブシエラ・ニューモニエ(Klebsiella pneumoniae)、リステリア・モノサイトゲネス(Listeriamonocytogenes)、マイコバクテリウム・レプラエ(Mycobacterium leprae)、マイコバクテリウム・ツベルクローシス(Mycobacteriumtuberculosis)、ナイセリア・ゴノローエ(Neisseria gonorrhoeae)、髄膜炎菌(Neisseria meningitidis)、ノカルジア・アステロイデス(Nocardiaasteroides)、パスツレラ・ヘモリチカ(Pasteurella haemolytica)、パスツレラ・ムルトシダ(Pasteurellamultocida)、ニューモシスティス・カリニー(Pneumocystis carinii)、プロテウス・ブルガリス(Proteus vulgaris)、シュードモナス・アエルギノーサ(Pseudomonasaeruginosa)、サルモネラ・ボンゴリ(Salmonella bongori)、サルモネラ・コレラスイス(Salmonella cholerasuis)、サルモネラ・エンテリカ(Salmonellaenterica)、サルモネラ・パラチフィ(Salmonella paratyphi)、サルモネラ・チフィ(Salmonella typhi)、サルモネラ・チフィムリウム(Salmonellatyphimurium)、スタフィロコッカス・オーレウス(Staphylococcus aureus)、リステリア・モノサイトゲネス(Listeriamonocytogenes)、モクサレラ・カタルハリス(Moxarella catarrhalis)、シゲラ・ボイディ(Shigella boydii)、シゲラ・ディッセンリイ(Shigelladysenteriae)、シゲラ・フレックスネリ(Shigella flexneri)、シゲラ・ソネイ(Shigella sonnei)、スタフィロコッカス・エピダーミディス(Staphylococcusepidermidis)、ストレプトコッカス・ニューモニエ(Streptococcus pneumoniae)、ストレプトコッカス・ミュータンス(Streptococcusmutans)、トレポネーマ・パリダム(Treponema pallidum)、エルシニア・エンテロコリチカ(Yersinia enterocolitica)、エルシニア・ペスティス(Yersiniapestis)、または上記種のいずれかの属に属する任意の種の成長を抑制するアンチセンス核酸の能力を評価し得る。本発明のいくつかの実施形態では、エシェリヒア・コリ以外の生物の成長を抑制するアンチセンス核酸の能力を評価し得る。
【０６１７】
このような方法においては、スタフィロコッカス・オーレウス、サルモネラ・チフィムリウム、クレブシエラ・ニューモニエ、シュードモナス・アエルギノーサ、エンテロコックス・フェカリス、エシェリヒア・コリ、エンテロコックス・フェカリス、ヘモフィルス・インフルエンザ、ヘリコバクター・ピロリまたはサルモネラ・チフィの成長を抑制するアンチセンス核酸の発現が誘導性プロモーターの制御下にある発現ベクターを、それらが評価される細胞または微生物中に導入する。いくつかの実施形態では、スタフィロコッカス・オーレウス、サルモネラ・チフィムリウム、クレブシエラ・ニューモニエ、シュードモナス・アエルギノーサ、エンテロコックス・フェカリス、エシェリヒア・コリ、エンテロコックス・フェカリス、ヘモフィルス・インフルエンザ、ヘリコバクター・ピロリもしくはサルモネラ・チフィに密接に関連する細胞または微生物中でアンチセンス核酸を評価し得る。次に、これらのアンチセンス核酸の、誘導物質の存在下で関連細胞または微生物の成長を抑制する能力を測定する。
【０６１８】
例えば、本明細書中に記載するような方法を用いて、スタフィロコッカス・オーレウスの成長を抑制した３９個のアンチセンス核酸を同定し、それらの発現がキシロース誘導性Ｘｙｌ−Ｔ５プロモーターの制御下にあるように、発現ベクター中に挿入した。Ｘｙｌ−Ｔ５プロモーターの制御下でグリーン蛍光タンパク質（ＧＥＰ）を有するベクターを用いて、スタフィロコッカス・エピダーミディス（Staphylococcusepidermidis）中でのＸｙｌ−Ｔ５プロモーターからの発現がスタフィロコッカス・オーレウス中での発現に匹敵することを示した。
【０６１９】
以下のようにエレクトロポレーションにより、スタフィロコッカス・エピダーミディス中にベクターを導入した。スタフィロコッカス・エピダーミディスを液体培養液中で中対数期に成長させ、次に遠心分離により収集した。１／３培養容量の中氷冷ＥＰ緩衝液（０．６２５Ｍスクロース、１ｍＭ ＭｇＣｌ₂、ｐＨ＝４．０）のに細胞ペレットを再懸濁させ、次に再び遠心分離により収集した。次に細胞ペレットを１／４０容量のＥＰ緩衝液を用いて再懸濁し、氷上で１時間インキュベートさせた。次に細胞を−８０℃での保存のために凍結した。エレクトロポレーションのために、解凍エレクトロコンピテント細胞５０μｌをプラスミドＤＮＡ０．５μｇと組み合わせ、次にバイオラド遺伝子パルサーエレクトロポレーション装置を用いて１０ｋＶ／ｃｍ、２５ｕＦａｒａｄ、２００ｏｈｍの電気パルスを与えた。細胞を直ちに２００μｌの増殖培地で再懸濁し、プラスミドベクターを保持するための薬剤選択を伴う固体増殖培地上でのプレーティング前に、２時間インキュベートした。これらのプレーティングの一晩の増殖により生じるコロニーを選択し、薬剤選択を伴う液体培地中で培養して、次に上記の実施例１０でスタフィロコッカス・オーレウスに関して記載したのと同様に希釈プレーティング分析を施して、誘導物質キシロースの存在下で増殖感受性を試験した。
【０６２０】
結果を以下の第６表に示す。第１の欄は、スタフィロコッカス・エピダーミディスに導入されたスタフィロコッカス・オーレウスアンチセンス核酸の分子番号を示す。第２の欄は、アンチセンス核酸がスタフィロコッカス・エピダーミディスの成長を抑制したか否かを示し、「＋」は増殖が抑制されたことを示す。評価した３９個のスタフィロコッカス・オーレウスアンチセンス核酸のうち、２０個がスタフィロコッカス・エピダーミディスの成長を抑制した。
【０６２１】
【表１０】

【表１１】

【０６２２】
本発明の核酸のサブセットを用いて上記の結果を得たが、本発明の他の核酸が、スタフィロコッカス・オーレウス、サルモネラ・チフィムリウム、クレブシエラ・ニューモニエ、シュードモナス・アエルギノーサ、エンテロコックス・フェカリス、エシェリヒア・コリ、エンテロコックス・フェカリス、ヘモフィルス・インフルエンザ、ヘリコバクター・ピロリもしくはサルモネラ・チフィ以外の細胞または微生物の増殖を抑制するか否かを決定するために、本発明の他の核酸を用いて同様の分析を実施し得ることが理解されるであろう。
【０６２３】
したがって、スタフィロコッカス・オーレウス、サルモネラ・チフィムリウム、クレブシエラ・ニューモニエ、シュードモナス・アエルギノーサ、エンテロコックス・フェカリス、エシェリヒア・コリ、エンテロコックス・フェカリス、ヘモフィルス・インフルエンザ、ヘリコバクター・ピロリまたはサルモネラ・チフィ由来の増殖に必要な核酸のいずれかまたはその一部に相補的なアンチセンス核酸（配列番号３７９６〜３８００、３８０６〜４８６０、５９１６〜１００１２に相補的なアンチセンス核酸、例えば配列番号８〜３７９５のアンチセンス核酸を含む）、相同コード核酸またはその一部に相補的なアンチセンス核酸、もしくは相同アンチセンス核酸を用いて、異種生物の増殖を抑制するアンチセンス核酸の能力を評価する上記方法を実施し得ることが理解される。
【０６２４】
実施例１２Ｃ
必須遺伝子に相同であることを見出すために必要な方法論の例証として、９個の原核生物を分析し、詳細に比較した。まず、公的および私的データ源の調査を実行することにより、各生物に関する遺伝子配列の最も信頼できる源を評価した。調査した９個の生物は、エシェリヒア・コリ(Escherichiacoli)、ヘモフィルス・インフルエンザ(Haemophilus influenzae)、ヘリコバクター・ピロリ(Helicobacter pylori)、クレブシエラ・ニューモニエ(Klebsiellapneumoniae)、シュードモナス・アエルギノーサ(Pseudomonas aeruginosa)、スタフィロコッカス・オーレウス(Staphylococcusaureus)、ストレプトコッカス・ニューモニエ(Streptococcus pneumoniae)およびサルモネラ・チフィ(Salmonellatyphi)である。これらの生物に関する全長遺伝子タンパク質およびヌクレオチド配列を、種々の源から集めた。エシェリヒア・コリ、ヘモフィルス・インフルエンザおよびヘリコバクター・ピロリに関しては、遺伝子配列は公的シーケンシングプロジェクトから採択し、ＧｅｎＰｅｐｔ１１５データベース（ＮＣＢＩから利用可能）から得た。シュードモナス・アエルギノーサに関しては、シュードモナスゲノムシーケンシングプロジェクト(http://www.pseudomonas.comからダウンロードしたした)から遺伝子配列を採択した。クレブシエラ・ニューモニエ、スタフィロコッカス・オーレウス、ストレプトコッカス・ニューモニエおよびサルモネラ・チフィに関しては、パソシーク(PathoSeq)バージョン４．１(２０００年３月公開)からのゲノム配列を、遺伝子発見ソフトウエアＧｅｎｅＭａｒｋバージョン２．４ａ(GeneProInc. 451 Bishop St. N.W., Suite B, Atlanta, GA, 30318, USAから購入)を用いてＯＲＦに関して再分析した。
【０６２５】
その後、所定の遺伝子に対する相同遺伝子すべてを見つけ出すために、アンチセンス方法体系により見出された必須遺伝子を、得られた当該プロテオームと比較した。ＦＡＳＴＡプログラムバージョン３．３を用いて、この比較を実行した。遺伝子は、それらが２５％より多く同一であり、２つの遺伝子間のアラインメントが遺伝子の１つの長さの７０％以上に及ぶ場合、相同であるとみなした。また上記の判定基準を満たす最も有意のスコアリングマッチと規定された９個の生物の各々に関する最良の相同性を、第７Ａ表に示した。第７Ａ表は、上記のように同定された最良ＯＲＦ（ＬＯＣＵＳＩＤと表示した欄）、配列番号、同一性％、ならびに上記のように評価した９個の生物の各々において同定された遺伝子に関するクエリー配列（カバレージ）と良好にアラインするタンパク質の量を列挙する。
【０６２６】
第７Ｂ表は、本明細書中に記載する方法を用いてエンテロコックス・フェカリス、エシェリヒア・コリ、シュードモナス・アエルギノーサおよびスタフィロコッカス・オーレウスにおいて増殖に必要であると同定された遺伝子に関するパソシーク（PathoSeq）クラスターＩＤを列挙する。パソシーククラスターＩＤと表示した欄で示されるように、これらの配列は互いに相同性を共有し、したがって同一パソシーク(PathoSeq)クラスター内に分類される。このように、本明細書中に記載する方法は、相同性を共有する数個の種における、増殖に必要とされる遺伝子を同定した。
【０６２７】
【表１２】

【表１３】

【表１４】

【表１５】

【表１６】

【表１７】

【表１８】

【表１９】

【表２０】

【表２１】

【表２２】

【表２３】

【表２４】

【表２５】

【表２６】

【表２７】

【表２８】

【表２９】

【表３０】

【表３１】

【表３２】

【表３３】

【表３４】

【表３５】

【表３６】

【表３７】

【表３８】

【表３９】

【表４０】

【表４１】

【表４２】

【表４３】

【表４４】

【表４５】

【表４６】

【表４７】

【表４８】

【表４９】

【表５０】

【表５１】

【表５２】

【表５３】

【表５４】

【表５５】

【表５６】

【表５７】

【表５８】

【表５９】

【表６０】

【表６１】

【表６２】

【表６３】

【表６４】

【表６５】

【表６６】

【表６７】

【表６８】

【表６９】

【表７０】

【表７１】

【表７２】

【表７３】

【表７４】

【表７５】

【表７６】

【表７７】

【表７８】

【表７９】

【表８０】

【表８１】

【表８２】

【表８３】

【表８４】

【表８５】

【表８６】

【表８７】

【表８８】

【表８９】

【表９０】

【表９１】

【表９２】

【表９３】

【表９４】

【０６２８】
【表９５】

【表９６】

【表９７】

【０６２９】
実施例１３
プローブとしての同定核酸配列の使用
本明細書中に記載したスタフィロコッカス・オーレウス、サルモネラ・チフィムリウム、クレブシエラ・ニューモニエ、シュードモナス・アエルギノーサ、エンテロコックス・フェカリス、エシェリヒア・コリ、エンテロコックス・フェカリス、ヘモフィルス・インフルエンザ、ヘリコバクター・ピロリもしくはサルモネラ・チフィ由来の配列、相同コード核酸または相同アンチセンス核酸をプローブとして用いて、第２の細胞または微生物から付加的当該遺伝子の配列を生成し得る。例えば、考え得る細菌標的タンパク質をコードする遺伝子に対するプローブを、他の生物、例えば他の細菌および高等生物由来の核酸にハイブリダイズさせて、これらのその他の生物における相同配列を同定し得る。例えば、スタフィロコッカス・オーレウス、サルモネラ・チフィムリウム、クレブシエラ・ニューモニエ、シュードモナス・アエルギノーサおよびエンテロコッカス・フェカリス、エシェリヒア・コリ、エンテロコッカス・フェカリス、ヘモフィルス・インフルエンザ、ヘリコバクター・ピロリ、またはサルモネラ・チフィ由来の同定配列、相同コード核酸、または相同アンチセンス核酸は、アナプラスマ・マルギナレ(Anaplasmamarginale)、アスペルギルス・フミガツス(Aspergillus fumigatus)、バチルス・アンスラシス(Bacillus anthracis)、バクテリオイデス・フラギリス(Bacterioidesfragilis)、百日咳菌(Bordetella pertussis)、ブルクホルデリア・セパシア(Burkholderia cepacia)、カンピロバクター・イェジュニィ(Campylobacterjejuni)、カンジダ・アルビカンス (Candida albicans)、カンジダ・グラブラタ(Candida glabrata)（トルロプシス・グラブラタ(Torulopsisglabrata)とも呼ばれる）、カンジダ・トロピカリス(Candida tropicalis)、カンジダ・パラプシロシス(Candidaparapsilosis)、カンジダ・ギルリエルモンジイ(Candida guilliermondii)、カンジダ・クルセイ(Candida krusei)、カンジダ・ケフィア(Candidakefyr)（カンジダ・シュードトロピカリス(Candida pseudotropicalis)とも呼ばれる）、カンジダ・デュブリニエンシス(Candidadubliniensis)、クラミジア・ニューモニエ(Chlamydia pneumoniae)、トラコーマ・クラミジア(Chlamydiatrachomatus)、クロストリジウム・ボツリヌム(Clostridium botulinum)、クロストリジウム・ジフィシル(Clostridiumdifficile)、クロストリジウム・パーフリンゲンス(Clostridium perfringens)、コクシジオデス・イミチス(Coccidiodesimmitis)、コリネバクテリウム・ジフテリア(Corynebacterium diptheriae)、クリプトコックス・ネオフォルマンス(Cryptococcusneoformans)、エンテロバクター・クロアカエ(Enterobacter cloacae)、エンテロコックス・フェカリス(Enterococcusfaecalis)、エンテロコックス・ファエシウム(Enterococcus faecium)、エシェリヒア・コリ(Escherichia coli)、ヘモフィルス・インフルエンザ(Haemophilusinfluenzae)、ヘリコバクター・ピロリ(Helicobacter pylori)、ヒストプラスマ・カプスラツム(Histoplasmacapsulatum)、クレブシエラ・ニューモニエ(Klebsiella pneumoniae)、リステリア・モノサイトゲネス(Listeriamonocytogenes)、マイコバクテリウム・レプラエ(Mycobacterium leprae)、マイコバクテリウム・ツベルクローシス(Mycobacteriumtuberculosis)、ナイセリア・ゴノローエ(Neisseria gonorrhoeae)、髄膜炎菌(Neisseria meningitidis)、ノカルジア・アステロイデス(Nocardiaasteroides)、パスツレラ・ヘモリチカ(Pasteurella haemolytica)、パスツレラ・ムルトシダ(Pasteurellamultocida)、ニューモシスティス・カリニー(Pneumocystis carinii)、プロテウス・ブルガリス(Proteus vulgaris)、シュードモナス・アエルギノーサ(Pseudomonasaeruginosa)、サルモネラ・ボンゴリ(Salmonella bongori)、サルモネラ・コレラスイス(Salmonella cholerasuis)、サルモネラ・エンテリカ(Salmonellaenterica)、サルモネラ・パラチフィ(Salmonella paratyphi)、サルモネラ・チフィ(Salmonella typhi)、サルモネラ・チフィムリウム(Salmonellatyphimurium)、スタフィロコッカス・オーレウス(Staphylococcus aureus)、リステリア・モノサイトゲネス(Listeriamonocytogenes)、モクサレラ・カタルハリス(Moxarella catarrhalis)、シゲラ・ボイディ(Shigella boydii)、シゲラ・ディッセンリイ(Shigelladysenteriae)、シゲラ・フレックスネリ(Shigella flexneri)、シゲラ・ソネイ(Shigella sonnei)、スタフィロコッカス・エピダーミディス(Staphylococcusepidermidis)、ストレプトコッカス・ニューモニエ(Streptococcus pneumoniae)、ストレプトコッカス・ミュータンス(Streptococcusmutans)、トレポネーマ・パリダム(Treponema pallidum)、エルシニア・エンテロコリチカ(Yersinia enterocolitica)、エルシニア・ペスティス(Yersiniapestis)、または上記種のいずれかの属に属する任意の種における相同配列を同定するために用いられ得る。本発明のいくつかの実施形態では、本明細書中に記載したスタフィロコッカス・オーレウス、サルモネラ・チフィムリウム、クレブシエラ・ニューモニエ、シュードモナス・アエルギノーサ、エンテロコックス・フェカリス、エシェリヒア・コリ、エンテロコックス・フェカリス、ヘモフィルス・インフルエンザ、ヘリコバクター・ピロリまたはサルモネラ・チフィ由来の核酸、相同コード核酸または相同アンチセンス核酸を用いて、エシェリヒア・コリ以外の異種生物由来の相同核酸を同定し得る。
【０６３０】
本明細書中に記載したスタフィロコッカス・オーレウス、サルモネラ・チフィムリウム、クレブシエラ・ニューモニエ、シュードモナス・アエルギノーサ、エンテロコックス・フェカリス、エシェリヒア・コリ、エンテロコックス・フェカリス、ヘモフィルス・インフルエンザ、ヘリコバクター・ピロリまたはサルモネラ・チフィ由来の核酸、相同コード核酸または相同アンチセンス核酸およびヒトからの核酸間のハイブリダイゼーションは、プローブが対応する遺伝子によりコードされるタンパク質がヒトにおいて見出され、したがって必ずしも最適薬剤標的であるというわけではないことを示し得る。あるいは、遺伝子は細菌中でのみ保存され、したがって広範囲の抗生物質または抗菌剤のための良好な薬剤標的であり得る。これらのプローブを既知の方法で用いて、スタフィロコッカス属、サルモネラ属、クレブシエラ属、シュードモナス属、エンテロコックス属またはその他の細胞もしくは微生物由来の相同核酸を、例えばゲノムまたはｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることにより単離し得る。
【０６３１】
本明細書中に記載したスタフィロコッカス・オーレウス、サルモネラ・チフィムリウム、クレブシエラ・ニューモニエ、シュードモナス・アエルギノーサ、エンテロコックス・フェカリス、エシェリヒア・コリ、エンテロコックス・フェカリス、ヘモフィルス・インフルエンザ、ヘリコバクター・ピロリまたはサルモネラ・チフィ由来の核酸配列、相同コード核酸もしくは相同アンチセンス核酸、またはそれらの一部に由来するプローブを、当技術分野で既知の検出可能標識、例えば放射性同位体および非放射性標識で標識して、検出可能プローブを提供し得る。検出可能プローブは一本鎖または二本鎖であり得るし、当技術分野で既知の技法、例えばインビトロ転写、ニックトランスレーションまたはキナーゼ反応を用いて作製され得る。標識プローブにハイブリダイズし得る配列を含有する核酸試料を、標識プローブと接触させる。試料中の核酸が二本鎖である場合、それをプローブの接触前に変性させ得る。いくつかの用途においては、核酸試料をニトロセルロースまたはナイロン膜のような表面に固定し得る。核酸試料は、種々の供給源、例えばゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡライブラリー、ＰＮＡ、または組織試料から得られた核酸を含み得る。
【０６３２】
検出可能プローブにハイブリダイズし得る核酸の存在を検出するために用いられる手法としては、既知の技法、例えばサザンブロッティング、ノーザンブロッティング、ドットブロッティング、コロニーハイブリダイゼーションおよびプラークハイブリダイゼーションが挙げられる。いくつかの用途においては、標識プローブにハイブリダイズし得る核酸を、発現ベクター、シーケンシングベクターまたはインビトロ転写ベクターのようなベクター中でクローニングして、試料中のハイブリダイズ核酸の特性化および発現を促し得る。例えば、このような技法を用いて、実施例５および６で同定された配列から作製されたプローブにハイブリダイズし得る、種々の細菌種から作製されるゲノムライブラリーから配列を単離し、精製しおよびクローニングし得る。
【０６３３】
実施例１４
ＰＣＲプライマーの調製およびＤＮＡの増幅
増殖に必要な核酸配列に直接対応するかまたはそのオペロン内に位置する同定されたスタフィロコッカス・オーレウス、サルモネラ・チフィムリウム、クレブシエラ・ニューモニエ、シュードモナス・アエルギノーサ、エンテロコックス・フェカリス、エシェリヒア・コリ、エンテロコックス・フェカリス、ヘモフィルス・インフルエンザ、ヘリコバクター・ピロリもしくはサルモネラ・チフィ遺伝子、相同コード核酸、または相同アンチセンス核酸、もしくはそれらの一部を用いて、種々の用途、例えば他の種からの相同配列の同定または単離のためのＰＣＲプライマーを調製し得る。例えば、スタフィロコッカス・オーレウス、サルモネラ・チフィムリウム、クレブシエラ・ニューモニエ、シュードモナス・アエルギノーサおよびエンテロコッカス・フェカリス、エシェリヒア・コリ、エンテロコッカス・フェカリス、ヘモフィルス・インフルエンザ、ヘリコバクター・ピロリ、またはサルモネラ・チフィ遺伝子は、アナプラスマ・マルギナレ(Anaplasmamarginale)、アスペルギルス・フミガツス(Aspergillus fumigatus)、バチルス・アンスラシス(Bacillus anthracis)、バクテリオイデス・フラギリス(Bacterioidesfragilis)、百日咳菌(Bordetella pertussis)、ブルクホルデリア・セパシア(Burkholderia cepacia)、カンピロバクター・イェジュニィ(Campylobacterjejuni)、カンジダ・アルビカンス (Candida albicans)、カンジダ・グラブラタ(Candida glabrata)（トルロプシス・グラブラタ(Torulopsisglabrata)とも呼ばれる）、カンジダ・トロピカリス(Candida tropicalis)、カンジダ・パラプシロシス(Candidaparapsilosis)、カンジダ・ギルリエルモンジイ(Candida guilliermondii)、カンジダ・クルセイ(Candida krusei)、カンジダ・ケフィア(Candidakefyr)（カンジダ・シュードトロピカリス(Candida pseudotropicalis)とも呼ばれる）、カンジダ・デュブリニエンシス(Candidadubliniensis)、クラミジア・ニューモニエ(Chlamydia pneumoniae)、トラコーマ・クラミジア(Chlamydiatrachomatus)、クロストリジウム・ボツリヌム(Clostridium botulinum)、クロストリジウム・ジフィシル(Clostridiumdifficile)、クロストリジウム・パーフリンゲンス(Clostridium perfringens)、コクシジオデス・イミチス(Coccidiodesimmitis)、コリネバクテリウム・ジフテリア(Corynebacterium diptheriae)、クリプトコックス・ネオフォルマンス(Cryptococcusneoformans)、エンテロバクター・クロアカエ(Enterobacter cloacae)、エンテロコックス・フェカリス(Enterococcusfaecalis)、エンテロコックス・ファエシウム(Enterococcus faecium)、エシェリヒア・コリ(Escherichia coli)、ヘモフィルス・インフルエンザ(Haemophilusinfluenzae)、ヘリコバクター・ピロリ(Helicobacter pylori)、ヒストプラスマ・カプスラツム(Histoplasmacapsulatum)、クレブシエラ・ニューモニエ(Klebsiella pneumoniae)、リステリア・モノサイトゲネス(Listeriamonocytogenes)、マイコバクテリウム・レプラエ(Mycobacterium leprae)、マイコバクテリウム・ツベルクローシス(Mycobacteriumtuberculosis)、ナイセリア・ゴノローエ(Neisseria gonorrhoeae)、髄膜炎菌(Neisseria meningitidis)、ノカルジア・アステロイデス(Nocardiaasteroides)、パスツレラ・ヘモリチカ(Pasteurella haemolytica)、パスツレラ・ムルトシダ(Pasteurellamultocida)、ニューモシスティス・カリニー(Pneumocystis carinii)、プロテウス・ブルガリス(Proteus vulgaris)、シュードモナス・アエルギノーサ(Pseudomonasaeruginosa)、サルモネラ・ボンゴリ(Salmonella bongori)、サルモネラ・コレラスイス(Salmonella cholerasuis)、サルモネラ・エンテリカ(Salmonellaenterica)、サルモネラ・パラチフィ(Salmonella paratyphi)、サルモネラ・チフィ(Salmonella typhi)、サルモネラ・チフィムリウム(Salmonellatyphimurium)、スタフィロコッカス・オーレウス(Staphylococcus aureus)、リステリア・モノサイトゲネス(Listeriamonocytogenes)、モクサレラ・カタルハリス(Moxarella catarrhalis)、シゲラ・ボイディ(Shigella boydii)、シゲラ・ディッセンリイ(Shigelladysenteriae)、シゲラ・フレックスネリ(Shigella flexneri)、シゲラ・ソネイ(Shigella sonnei)、スタフィロコッカス・エピダーミディス(Staphylococcusepidermidis)、ストレプトコッカス・ニューモニエ(Streptococcus pneumoniae)、ストレプトコッカス・ミュータンス(Streptococcusmutans)、トレポネーマ・パリダム(Treponema pallidum)、エルシニア・エンテロコリチカ(Yersinia enterocolitica)、エルシニア・ペスティス(Yersiniapestis)、または上記種のいずれかの属に属する任意の種由来の相同配列を同定または単離するためのＰＣＲプライマーを調製するために用いられ得る。本発明のいくつかの実施形態では、ＰＣＲプライマーを、エシェリヒア・コリ以外の生物由来の相同核酸を同定または単離するために用い得る。
【０６３４】
ＰＣＲプライマーを用いて得られる同定または単離核酸は、相同核酸の一部または全部を含有し得る。相同核酸は配列中で相関するが、同一でないため、当業者はしばしば縮重配列ＰＣＲプライマーを用いる。このような縮重配列プライマーは、保存されることが既知であるかまたは保存されると思われる配列領域、例えば保存コード領域を基礎にして設計される。本明細書中で同定された配列から生成される縮重プローブを用いたＰＣＲ産物の産生の成功は、スクリーニングされている種における相同遺伝子配列の存在を示す。ＰＣＲプライマーは、少なくとも１０ヌクレオチド長、好ましくは少なくとも２０ヌクレオチド長である。さらに好ましくはＰＣＲプライマーは、少なくとも２０〜３０ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態では、ＰＣＲプライマーは３０ヌクレオチド長より長くあり得る。融解温度がほぼ同一であるように、プライマー対はほぼ同一Ｇ／Ｃ比を有するのが好ましい。種々のＰＣＲ技法が当業者には既知である。ＰＣＲ技法の説明に関して、MolecularCloning to Genetic Engineering White, B.A. Ed. In Methods in Molecular Biology67:Humana Press, Totowa 1997を参照されたい。標的遺伝子の全コード配列が既知である場合、標的遺伝子の５’および３’領域をＰＣＲプローブ生成のための配列供給源として用い得る。これらのＰＣＲ手法の各々において、増幅されるべき核酸配列のいずれかの側のＰＣＲプライマーを、ｄＮＴＰおよび熱安定性ポリメラーゼ、例えばＴａｑポリメラーゼ、Ｐｆｕポリメラーゼ、またはＶｅｎｔポリメラーゼとともに適切に調製した核酸試料に添加する。試料中の核酸を変性し、ＰＣＲプライマーを試料中の相補的核酸配列に特異的にハイブリダイズさせる。ハイブリダイズしたプライマーを伸長させる。その後、変性、ハイブリダイゼーション、および伸長サイクルをもう一度開始する。サイクルを多数回反復して、プライマー部位間に核酸配列を含有する増幅断片を生成する。
【０６３５】
実施例１５
逆ＰＣＲ
逆ポリメラーゼ連鎖反応の技法を用いて、実施例５および６で同定した既知の核酸配列を伸長し得る。逆ＰＣＲ反応は、一般的にOchmanら, in Ch. 10of PCR Technology: Principles and Applications for DNA Amplification, (Henry A.Erlich, Ed.) W.H. Freeman and Co.(1992)により記載されている。伝統的ＰＣＲは、ＤＮＡの相補鎖の合成を用意するために用いられる２つのプライマーを要する。逆ＰＣＲでは、コア配列のみが既知である必要がある。
【０６３６】
実施例５および６で教示された技法から関連があると同定され、他の細菌種に適用される配列を用いて、細菌増殖に必要である遺伝子またはオペロンに対応する核酸配列のサブセットを同定する。ゲノム配列が既知でない種では、配列を決定するために、または同定核酸配列が結合する標的配列との十分な関係においてプローブ配列を配置するために、逆ＰＣＲの技術は遺伝子を獲得する方法を提供する。
【０６３７】
この技法を実施するために、同定配列ならびに同定配列に隣接する未知の配列を含有する核酸の断片を作製するために、標的生物のゲノムを適切な制限酵素で消化する。次にこれらの断片を環化し、ＰＣＲ反応のための鋳型にする。実施例１５の教示にしたがってＰＣＲプライマーを設計し、同定配列の末端へと誘導する。プライマーは既知の配列から、環状鋳型内に含まれた未知の配列に向けて、核酸合成を指図する。ＰＣＲ反応完了後、その結果生じたＰＣＲ産物を、同定された同定外因性核酸配列のコア配列を超えて同定遺伝子の配列を伸長するために、配列決定し得る。このようにして、各新規遺伝子の全配列を同定し得る。さらに隣接コード領域および非コード領域の配列を同定し得る。
【０６３８】
実施例１６
エシェリヒア・コリ増殖に必要な遺伝子の同定
上記の方法にしたがって、エシェリヒア・コリにおける増殖に必要な遺伝子を同定する。
【０６３９】
実施例１７
ナイセリア・ゴノローエ増殖に必要な遺伝子の同定
上記の方法にしたがって、ナイセリア・ゴノローエの増殖に必要な遺伝子を同定する。
【０６４０】
実施例１８
サルモネラ・エンテリカ増殖に必要な遺伝子の同定
上記の方法にしたがって、サルモネラ・エンテリカの増殖に必要な遺伝子を同定する。
【０６４１】
実施例１９
エンテロコックス・ファエシウム増殖に必要な遺伝子の同定
上記の方法にしたがって、エンテロコックス・ファエシウムの増殖に必要な遺伝子を同定する。
【０６４２】
実施例２０
ヘモフィルス・インフルエンザ増殖に必要な遺伝子の同定
上記の方法にしたがって、ヘモフィルス・インフルエンザの増殖に必要な遺伝子を同定する。
【０６４３】
実施例２１
アスペルギルス・フミガツス増殖に必要な遺伝子の同定
上記の方法にしたがって、アスペルギルス・フミガツスの増殖に必要な遺伝子を同定する。
【０６４４】
実施例２２
ヘリコバクター・ピロリ増殖に必要な遺伝子の同定
上記の方法にしたがって、ヘリコバクター・ピロリの増殖に必要な遺伝子を同定する。
【０６４５】
実施例２３
肺炎マイコプラズマ増殖に必要な遺伝子の同定
上記の方法にしたがって、肺炎マイコプラズマの増殖に必要な遺伝子を同定する。
【０６４６】
実施例２４
卵形マラリア原虫増殖に必要な遺伝子の同定
上記の方法にしたがって、卵形マラリア原虫の増殖に必要な遺伝子を同定する。
【０６４７】
実施例２５
エントアメーバ・ヒストリティカ増殖に必要な遺伝子の同定
上記の方法にしたがって、エントアメーバ・ヒストリティカの増殖に必要な遺伝子を同定する。
【０６４８】
実施例２６
カンジダ・アルビカンス増殖に必要な遺伝子の同定
上記の方法にしたがって、カンジダ・アルビカンスの増殖に必要な遺伝子を同定する。
【０６４９】
実施例２７
ヒストプラスマ・カプスラツム増殖に必要な遺伝子の同定
上記の方法にしたがって、ヒストプラスマ・カプスラツムの増殖に必要な遺伝子を同定する。
【０６５０】
実施例２８
サルモネラ・チフィ増殖に必要な遺伝子の同定
上記の方法にしたがって、サルモネラ・チフィの増殖に必要な遺伝子を同定する。
【０６５１】
実施例２９
サルモネラ・パラチフィ増殖に必要な遺伝子の同定
上記の方法にしたがって、サルモネラ・パラチフィの増殖に必要な遺伝子を同定する。
【０６５２】
実施例３０
サルモネラ・コレラスイス増殖に必要な遺伝子の同定
上記の方法にしたがって、サルモネラ・コレラスイスの増殖に必要な遺伝子を同定する。
【０６５３】
実施例３１
スタフィロコッカス・エピダーミディス増殖に必要な遺伝子の同定
上記の方法にしたがって、スタフィロコッカス・エピダーミディスの増殖に必要な遺伝子を同定する。
【０６５４】
実施例３２
マイコバクテリウム・ツベルクローシス増殖に必要な遺伝子の同定
上記の方法にしたがって、マイコバクテリウム・ツベルクローシスの増殖に必要な遺伝子を同定する。
【０６５５】
実施例３３
マイコバクテリウム・レプラエ増殖に必要な遺伝子の同定
上記の方法にしたがって、マイコバクテリウム・レプラエの増殖に必要な遺伝子を同定する。
【０６５６】
実施例３４
トレポネーマ・パリダム増殖に必要な遺伝子の同定
上記の方法にしたがって、トレポネーマ・パリダムの増殖に必要な遺伝子を同定する。
【０６５７】
実施例３５
バチルス・アンスラシス増殖に必要な遺伝子の同定
上記の方法にしたがって、バチルス・アンスラシスの増殖に必要な遺伝子を同定する。
【０６５８】
実施例３６
エルシニア・ペスティス増殖に必要な遺伝子の同定
上記の方法にしたがって、エルシニア・ペスティスの増殖に必要な遺伝子を同定する。
【０６５９】
実施例３７
クロストリジウム・ボツリヌム増殖に必要な遺伝子の同定
上記の方法にしたがって、クロストリジウム・ボツリヌムの増殖に必要な遺伝子を同定する。
【０６６０】
実施例３８
カンピロバクター・イェジュニィ増殖に必要な遺伝子の同定
上記の方法にしたがって、カンピロバクター・イェジュニィの増殖に必要な遺伝子を同定する。
【０６６１】
実施例３９
トラコーマ・クラミジア増殖に必要な遺伝子の同定
上記の方法にしたがって、トラコーマ・クラミジアの増殖に必要な遺伝子を同定する。
【０６６２】
実施例４０
スタフィロコッカス・オーレウス増殖に必要な遺伝子の同定
上記の方法にしたがって、スタフィロコッカス・オーレウスの増殖に必要な遺伝子を同定する。
【０６６３】
実施例４１
サルモネラ・チフィムリウム増殖に必要な遺伝子の同定
上記の方法にしたがって、サルモネラ・チフィムリウムの増殖に必要な遺伝子を同定する。
【０６６４】
実施例４２
クレブシエラ・ニューモニエ増殖に必要な遺伝子の同定
上記の方法にしたがって、クレブシエラ・ニューモニエの増殖に必要な遺伝子を同定する。
【０６６５】
実施例４３
シュードモナス・アエルギノーサ増殖に必要な遺伝子の同定
上記の方法にしたがって、シュードモナス・アエルギノーサの増殖に必要な遺伝子を同定する。
【０６６６】
実施例４４
エンテロコックス・フェカリス増殖に必要な遺伝子の同定
上記の方法にしたがって、エンテロコックス・フェカリスの増殖に必要な遺伝子を同定する。
【０６６７】
アンチセンス抗生物質としての単離外因性核酸断片の使用
抗生物質を同定するのに有用な化合物を同定するための分子ライブラリーのスクリーニングを可能にするための同定配列の使用のほかに、増殖に必要な配列またはその一部に相補的なアンチセンス核酸、相同コード核酸に相補的なアンチセンス核酸、または相同アンチセンス核酸を治療薬として用い得る。特にアンチセンス方向での増殖に必要な配列もしくは相同コード核酸、またはそれらの一部、もしくは相同アンチセンス核酸を、細菌標的遺伝子の翻訳、または非翻訳ＲＮＡのタンパク質／ＲＮＡ複合体へのプロセシング、フォールディングもしくはアセンブリーを抑制するために個体に提供し得る。
【０６６８】
実施例４５
同定外因性配列からのアンチセンス治療薬の生成
本明細書に記載される増殖に必要な配列に相補的なアンチセンス核酸またはその一部、相同コード核酸に相補的なアンチセンス核酸またはその一部、もしくは相同アンチセンス核酸またはその一部を、細菌による汚染を治療するため、もしくは単にインビトロまたはインビボ（invivo）での細菌の成長を抑制するためのアンチセンス治療薬として用いることができる。例えば、アンチセンス治療薬を、スタフィロコッカス・オーレウス、サルモネラ・チフィムリウム、クレブシエラ・ニューモニエ、シュードモナス・アエルギノーサおよびエンテロコッカス・フェカリス、エシェリヒア・コリ、エンテロコッカス・フェカリス、ヘモフィルス・インフルエンザ、ヘリコバクター・ピロリ、クレブシエラ・ニューモニエ、シュードモナス・アエルギノーサ、スタフィロコッカス・オーレウス、またはサルモネラ・チフィに起因する細菌による汚染を治療するために、またはそれら生物の成長を抑制するために用い得る。アンチセンス治療薬は、アナプラスマ・マルギナレ(Anaplasmamarginale)、アスペルギルス・フミガツス(Aspergillus fumigatus)、バチルス・アンスラシス(Bacillus anthracis)、バクテリオイデス・フラギリス(Bacterioidesfragilis)、百日咳菌(Bordetella pertussis)、ブルクホルデリア・セパシア(Burkholderia cepacia)、カンピロバクター・イェジュニィ(Campylobacterjejuni)、カンジダ・アルビカンス (Candida albicans)、カンジダ・グラブラタ(Candida glabrata)（トルロプシス・グラブラタ(Torulopsisglabrata)とも呼ばれる）、カンジダ・トロピカリス(Candida tropicalis)、カンジダ・パラプシロシス(Candidaparapsilosis)、カンジダ・ギルリエルモンジイ(Candida guilliermondii)、カンジダ・クルセイ(Candida krusei)、カンジダ・ケフィア(Candidakefyr)（カンジダ・シュードトロピカリス(Candida pseudotropicalis)とも呼ばれる）、カンジダ・デュブリニエンシス(Candidadubliniensis)、クラミジア・ニューモニエ(Chlamydia pneumoniae)、トラコーマ・クラミジア(Chlamydiatrachomatus)、クロストリジウム・ボツリヌム(Clostridium botulinum)、クロストリジウム・ジフィシル(Clostridiumdifficile)、クロストリジウム・パーフリンゲンス(Clostridium perfringens)、コクシジオデス・イミチス(Coccidiodesimmitis)、コリネバクテリウム・ジフテリア(Corynebacterium diptheriae)、クリプトコックス・ネオフォルマンス(Cryptococcusneoformans)、エンテロバクター・クロアカエ(Enterobacter cloacae)、エンテロコックス・フェカリス(Enterococcusfaecalis)、エンテロコックス・ファエシウム(Enterococcus faecium)、エシェリヒア・コリ(Escherichia coli)、ヘモフィルス・インフルエンザ(Haemophilusinfluenzae)、ヘリコバクター・ピロリ(Helicobacter pylori)、ヒストプラスマ・カプスラツム(Histoplasmacapsulatum)、クレブシエラ・ニューモニエ(Klebsiella pneumoniae)、リステリア・モノサイトゲネス(Listeriamonocytogenes)、マイコバクテリウム・レプラエ(Mycobacterium leprae)、マイコバクテリウム・ツベルクローシス(Mycobacteriumtuberculosis)、ナイセリア・ゴノローエ(Neisseria gonorrhoeae)、髄膜炎菌(Neisseria meningitidis)、ノカルジア・アステロイデス(Nocardiaasteroides)、パスツレラ・ヘモリチカ(Pasteurella haemolytica)、パスツレラ・ムルトシダ(Pasteurellamultocida)、ニューモシスティス・カリニー(Pneumocystis carinii)、プロテウス・ブルガリス(Proteus vulgaris)、シュードモナス・アエルギノーサ(Pseudomonasaeruginosa)、サルモネラ・ボンゴリ(Salmonella bongori)、サルモネラ・コレラスイス(Salmonella cholerasuis)、サルモネラ・エンテリカ(Salmonellaenterica)、サルモネラ・パラチフィ(Salmonella paratyphi)、サルモネラ・チフィ(Salmonella typhi)、サルモネラ・チフィムリウム(Salmonellatyphimurium)、スタフィロコッカス・オーレウス(Staphylococcus aureus)、リステリア・モノサイトゲネス(Listeriamonocytogenes)、モクサレラ・カタルハリス(Moxarella catarrhalis)、シゲラ・ボイディ(Shigella boydii)、シゲラ・ディッセンリイ(Shigelladysenteriae)、シゲラ・フレックスネリ(Shigella flexneri)、シゲラ・ソネイ(Shigella sonnei)、スタフィロコッカス・エピダーミディス(Staphylococcusepidermidis)、ストレプトコッカス・ニューモニエ(Streptococcus pneumoniae)、ストレプトコッカス・ミュータンス(Streptococcusmutans)、トレポネーマ・パリダム(Treponema pallidum)、エルシニア・エンテロコリチカ(Yersinia enterocolitica)、エルシニア・ペスティス(Yersiniapestis)、または上記種のいずれかの属に属する任意の種の成長に起因する感染を治療するか、またはそれらの成長を抑制するために用いられ得る。本発明のいくつかの実施形態では、アンチセンス治療薬を、エシェリヒア・コリ以外の生物の成長による汚染を治療するためか、またはそれらの成長を抑制するために用い得る。
【０６６９】
本療法は、遺伝子がメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）に転写され、次にタンパク質に翻訳される細胞中での生物学的過程を活用する。アンチセンスＲＮＡ技法は、標的核酸に結合し、標的遺伝子の発現を低減または抑制する標的遺伝子に相補的なアンチセンス核酸、例えばアンチセンスオリゴヌクレオチドの使用を意図する。例えばアンチセンス核酸は、標的核酸の翻訳または転写を抑制し得る。一実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドを用いて、細菌で汚染された所望の細胞集団を含有する細胞培養の細菌感染を治療および制御し得る。別の実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドを用いて、細菌感染を有する生物を治療し得る。
【０６７０】
アンチセンスオリゴヌクレオチドは、当技術分野で既知の方法を用いて、本発明の配列のいずれかから合成し得る。好ましい実施形態では、人工的手段を用いてアンチセンスオリゴヌクレオチドを合成する。Uhlmann& Peymann, Chemical Rev. 90:543-584(1990)は、アンチセンスオリゴヌクレオチド技法を詳細に説明する。修飾または非修飾アンチセンスオリゴヌクレオチドを治療薬として用い得る。修飾アンチセンスオリゴヌクレオチドが好ましい。ヌクレオチド間リン酸残基をメチルホスホネート、ホスホロチオエート、ホスホルアミデートおよびリン酸エステルで置換することにより、アンチセンスオリゴヌクレオチドのリン酸塩主鎖の修飾を達成し得る。非リン酸ヌクレオチド間類縁体、例えばシロキサンブリッジ、カーボネートブリッジ、チオエステルブリッジ、ならびに当技術分野で既知の多数の他のものも用い得る。修飾ヌクレオチド間連結を有するある種のアンチセンスオリゴヌクレオチドの調製は、米国特許第５，１４２，０４７号に記載されている。
【０６７１】
アンチセンスオリゴヌクレオチドのヌクレオチド単位に対する修飾も意図される。これらの修飾は、インビボでのオリゴヌクレオチドに関する半減期を増大し、細胞取り込み率を増大し得る。例えばα−アノマーヌクレオチド単位および修飾ヌクレオチド、例えば１，２−ジデオキシ−ｄ−リボフラノース、１，２−ジデオキシ−１−フェニルリボフラノース、およびＮ⁴，Ｎ⁴−エタノ−５−メチル−シトシンが本発明に用いるために意図される。
【０６７２】
さらなる形態の修飾アンチセンス分子がペプチド核酸中に見出される。ペプチド核酸（ＰＮＡ）は、一本鎖および二本鎖核酸にハイブリダイズするために開発されてきた。ＰＮＡは、全デオキシリボース−リン酸主鎖が、２−アミノエチルグリシン単位を含有する、化学的に異なるが構造的には同族であるポリアミド（ペプチド）主鎖と交換されている核酸類縁体である。高陰性荷電されるＤＮＡと違って、ＰＮＡ主鎖は中性である。したがってＰＮＡ−ＤＮＡハイブリッド中の相補鎖間の反発エネルギーは、匹敵するＤＮＡ−ＤＮＡハイブリッドよりはるかに低く、したがってそれらは非常に安定である。ＰＮＡは、ワトソン／クリックまたはフーグスティーン様式のいずれかでＤＮＡにハイブリダイズし得る（Demidovら, Pro. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92:2637-2641、1995; Egholm, Nature 365:566-568,1993; Nielsenら, Science 254:1497-1500, 1991; Dueholm ら, New J. Chem. 21:19-31,1997）。
【０６７３】
３つの８−アミノ−３,６−ジオキサオクタン酸単位を含有する可変ヘアピンリンカーにより連結された２つの同一ＰＮＡ配列を有するＰＮＡ「クランプ(clamps)」と呼ばれる分子が合成されている。ＰＮＡクランプが相補的ホモプリンまたはホモピリミジンＤＮＡ標的配列と混合されると、非常に安定であることが示されているＰＮＡ−ＤＮＡ−ＰＮＡ三重ハイブリッドを形成し得る（Bentinら,Biochemistry 35:8863-8869, 1996; Egholmら, Nucleic Acids Res. 23:217-222, 1995;Griffithら, J. Am. Chem. Soc. 117:831-832, 1995）。
【０６７４】
ＰＮＡの配列特異性および高親和性二重および三重結合は、広範に記載されている（Nielsenら, Science 254; 1497-1500, 1991;Egholmら, J. Am. Chem. Soc. 114:9677-9678, 1992; Egholmら, Nature 365:566-568,1993; Almarsson et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90:9542-9546, 1993;Demidovら, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92:2637-2641, 1995）。それらは、ヌクレアーゼおよびプロテアーゼ消化に耐性であることも示されている（Demidovら,Biochem. Pharm. 48:1010-1313, 1994）。ＰＮＡは、遺伝子発現を抑制するために（Hanvey ら, Science258:1481-1485, 1992; Nielsenら, Nucl. Acids. Res., 21:197-200, 1993; Nielsenら,Gene 149:139-145, 1994; Good & Nielsen, Science, 95:2073-2076, 1998）、制限酵素活性を遮断するために（Nielsenら,上記,1993）、人工転写プロモーターとして作用するために（Mollegaard, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 91:3892-3895,1994）ならびに擬似制限エンドヌクレアーゼとして作用するために（Demidovら, Nucl. Acids. Res. 21:2103-2107, 1993）用いられてきた。近年、ＰＮＡはまた、アンチセンスメカニズムにより媒介される抗ウイルスおよび抗腫瘍活性を有することが示された（Norton,Nature Biotechnol., 14:615-619, 1996; Hirschmanら, J. Investig. Med. 44:347-351,1996）。ＰＮＡは、細胞中へのＰＮＡの進入を促進するために、種々のペプチドと連結された（Basuら, Bioconj. Chem. 8:481-488,1997; Pardridgeら, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92:5592-5596, 1995）。
【０６７５】
本発明により意図されるアンチセンスオリゴヌクレオチドを、当技術分野で既知の標準技法を用いて、標的にオリゴヌクレオチドを直接適用することにより投与し得る。プラスミドまたはファージを用いて、標的内にアンチセンスオリゴヌクレオチドを生成し得る。または標的細胞の染色体中の配列から、アンチセンス核酸を発現し得る。例えば、プロモーターがアンチセンス核酸の転写を指図するように、標的遺伝子付近の標的細胞の染色体中にプロモーターを導入し得る。あるいは、プロモーターと作動可能に連結されたアンチセンス配列を含有する核酸を、標的細胞の染色体中に導入し得る。アンチセンスを特異的に結合させ、その標的ｍＲＮＡを切断することができるために、アンチセンスオリゴヌクレオチドをリボザイム配列に組み込むことがさらに意図される。リボザイムおよびアンチセンスオリゴヌクレオチドの技術的用途に関しては、Rossiら,Pharmacol. Ther. 50(2):245-254(1991)を参照されたい。本発明は、アンチセンスオリゴヌクレオチドを細胞に導入するためのレトロンの使用も意図する。レトロン技術は、米国特許第５，４０５，７７５号により例示される。リポソームを用いてまたは当技術分野で既知であるエレクトロポレーション技法により、アンチセンスオリゴヌクレオチドを送達し得る。
【０６７６】
上記のアンチセンス核酸を用いて、細胞内三重らせん形成により機能する核酸を含む抗生物質化合物を設計し得る。三重らせんオリゴヌクレオチドを用いて、ゲノムからの転写を抑制する。アンチセンス核酸を用いて、細胞または微生物遺伝子発現を、このような微生物に感染した個体またはこのような細胞を含有する個体中で抑制する。伝統的に、ホモプリン配列は三重らせん戦略に最も有用であると考えられた。しかしながらホモピリミジン配列も遺伝子発現を抑制し得る。このようなホモピリミジンオリゴヌクレオチドは、ホモプリン：ホモピリミジン配列で主溝に結合する。したがって、増殖に必要とされるスタフィロコッカス・オーレウス、サルモネラ・チフィムリウム、クレブシエラ・ニューモニエ、シュードモナス・アエルギノーサ、エンテロコックス・フェカリス、エシェリヒア・コリ、エンテロコックス・フェカリス、ヘモフィルス・インフルエンザ、ヘリコバクター・ピロリまたはサルモネラ・チフィ由来の配列または相同核酸を基礎にした両型の配列は、抗生物質化合物鋳型として用いるために意図される。
【０６７７】
スタフィロコッカス・オーレウス、サルモネラ・チフィムリウム、クレブシエラ・ニューモニエ、シュードモナス・アエルギノーサ、エンテロコックス・フェカリス、エシェリヒア・コリ、エンテロコックス・フェカリス、ヘモフィルス・インフルエンザ、ヘリコバクター・ピロリまたはサルモネラ・チフィ由来の増殖に必要な核酸、もしくは相同コード核酸、またはそれらの一部に相補的であるアンチセンス核酸、例えばアンチセンスオリゴヌクレオチドを用いて、標的核酸転写または翻訳を抑制することにより、細菌細胞死または少なくとも細菌静止を誘導し得る。本明細書中に記載した増殖に必要な核酸または相同コード核酸の約８〜４０ヌクレオチドに相補的なアンチセンスオリゴヌクレオチドは、生理学的条件下で標的配列と二重鎖を形成するのに十分な相補性を有する。
【０６７８】
細菌細胞を死滅させるかまたはそれらの成長を抑制するために、アンチセンスオリゴヌクレオチドを、それらの取り込みを促す条件下で、細菌にまたは標的細胞に適用する。これらの条件としては、アンチセンスオリゴヌクレオチドが細胞に取り込まれるような、細胞およびオリゴヌクレオチドの十分なインキュベーション時間が挙げられる。一実施形態では、７〜１０日のインキュベーション期間は試料中の細菌を死滅させるのに十分である。アンチセンスオリゴヌクレオチドの使用最適濃度が選択される。
【０６７９】
用いられるべきアンチセンスオリゴヌクレオチドの濃度は、制御されることが求められる細菌型、用いられるべきアンチセンスオリゴヌクレオチドの性質、ならびに処理培養中の所望の細胞に対するアンチセンスオリゴヌクレオチドの相対的毒性に依存して変わり得る。多数の異なる濃度で、好ましくは１×１０^-10Ｍ〜１×１０^-4Ｍで、アンチセンスオリゴヌクレオチドを細胞試料に導入し得る。遺伝子発現を適切に制御し得る最小濃度が同定されれば、最適用量をインビボでの使用に適した投与に変換する。例えば、１×１０^-7の培養中抑制濃度は、約０．６ｍｇ／体重１ｋｇの用量に変換される。１００ｍｇ／体重１ｋｇ近づくオリゴヌクレオチドのレベルまたはそれ以上のレベルは、実験室動物におけるオリゴヌクレオチドの毒性試験後に可能であり得る。さらに、被験体から細胞を取り出し、アンチセンスオリゴヌクレオチドで処理し、被験体に再導入することが意図される。この範囲は単に説明のためであり、当業者は所定の場合に用いられるべき最適濃度を決定し得る。
【０６８０】
細菌細胞が所望の培養中で死滅するか、または制御された後、所望の細胞集団を他の目的に用い得る。
【０６８１】
実施例４６
汚染細胞培養を処理するためのアンチセンスオリゴヌクレオチドの使用
以下の実施例は、汚染細胞培養系を処理するための殺細菌剤または静菌剤として作用する、スタフィロコッカス・オーレウス、サルモネラ・チフィムリウム、クレブシエラ・ニューモニエ、シュードモナス・アエルギノーサ、エンテロコックス・フェカリス、エシェリヒア・コリ、エンテロコックス・フェカリス、ヘモフィルス・インフルエンザ、ヘリコバクター・ピロリもしくはサルモネラ・チフィアンチセンスオリゴヌクレオチドまたは相同コード核酸に相補的なアンチセンスオリゴヌクレオチド、またはそれらの一部の能力を実証する。本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドの適用は、増殖に必要な細菌遺伝子産物の翻訳を抑制するためであると考えられる。アンチセンス核酸は、標的ＲＮＡの転写、フォールディングまたはプロセシングも抑制し得る。
【０６８２】
本発明の一実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、第１Ａ表に列挙したアンチセンス核酸の少なくとも約１５個、少なくとも約２０個、少なくとも約２５個、少なくとも約３０個、少なくとも約３５個、少なくとも約４０個または４０個より多い連続ヌクレオチドを含むホスホロチオエート修飾核酸を含み得る。アンチセンス配列に相補的なセンスオリゴデオキシヌクレオチドを合成し、対照として用いる。Matsukuraら,Gene 72:343(1988)の手法にしたがってオリゴヌクレオチドを合成し、精製する。試験オリゴヌクレオチドを小容量のオートクレーブ処理水中に溶解し、培地に添加して、１００μＭストック溶液を作る。
【０６８３】
２名の患者の末梢血からヒト骨髄細胞を獲得し、当技術分野で既知の標準手法にしたがって培養する。培養液をスタフィロコッカス・オーレウス、サルモネラ・チフィムリウム、クレブシエラ・ニューモニエ、シュードモナス・アエルギノーサ、エンテロコックス・フェカリス、エシェリヒア・コリ、エンテロコックス・フェカリス、ヘモフィルス・インフルエンザ、ヘリコバクター・ピロリまたはサルモネラ・チフィもしくは相同核酸を含有する生物で汚染し、３７℃で一夜インキュベートして、細菌感染を確立する。
【０６８４】
対照およびアンチセンスオリゴヌクレオチドを含有する溶液を汚染培養に添加し、細菌成長に関してモニタリングする。培養およびオリゴヌクレオチドの１０時間インキュベーション後、対照および実験培養からの試料を抜き取り、当技術分野で既知の標準微生物技法を用いて標的細菌遺伝子の翻訳に関して分析する。標的スタフィロコッカス・オーレウス、サルモネラ・チフィムリウム、クレブシエラ・ニューモニエ、シュードモナス・アエルギノーサ、エンテロコックス・フェカリス、エシェリヒア・コリ、エンテロコックス・フェカリス、ヘモフィルス・インフルエンザ、ヘリコバクター・ピロリまたはサルモネラ・チフィ遺伝子もしくは相同コード核酸を含有する生物は、対照オリゴヌクレオチドで処理した対照培養中で翻訳されることが見出されるが、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドで処理した実験培養中の標的遺伝子の翻訳は検出されないかまたは低減され、このことは培養がもはや汚染されていないかまたは低減レベルで汚染されていることを示す。
【０６８５】
実施例４７
感染を処理するためのアンチセンスオリゴヌクレオチドの使用
スタフィロコッカス・オーレウス、サルモネラ・チフィムリウム、クレブシエラ・ニューモニエ、シュードモナス・アエルギノーサ、エンテロコックス・フェカリス、エシェリヒア・コリ、エンテロコックス・フェカリス、ヘモフィルス・インフルエンザ、ヘリコバクター・ピロリまたはサルモネラ・チフィ感染もしくは相同コード核酸を含有する生物による感染に罹患している被験体を、上記のアンチセンスオリゴヌクレオチド調製物で処理する。標的核酸の転写または翻訳を抑制するのに有効な濃度で薬学的に許容可能な担体中にアンチセンスオリゴヌクレオチドを提供する。約０．１〜１００μｍｏｌの血中濃度を達成するのに十分なアンチセンスオリゴヌクレオチド濃度で本発明の被験体を処理する。患者にアンチセンスオリゴヌクレオチドを毎日注射して、１週間この濃度を保持する。週の終わりに、血液試料を採取し、当技術分野で既知の標準技法を用いて、生物の存在または非存在に関して分析する。スタフィロコッカス・オーレウス、サルモネラ・チフィムリウム、クレブシエラ・ニューモニエ、シュードモナス・アエルギノーサ、エンテロコックス・フェカリス、エシェリヒア・コリ、エンテロコックス・フェカリス、ヘモフィルス・インフルエンザ、ヘリコバクター・ピロリまたはサルモネラ・チフィ、もしくは相同コード核酸を含有する生物の検出可能な証拠は認められず、処理を終結する。
【０６８６】
相同コード核酸またはそれらの一部に相補的なアンチセンス核酸を、上記の方法で用いて、相同コード核酸を含有する生物に感染した個体を処理し得る。
【０６８７】
実施例４８
三重らせん形成オリゴヌクレオチドの調製および使用
増殖に必要な核酸、相同コード核酸または相同アンチセンス核酸の配列を走査して、遺伝子発現を抑制するための三重らせんベースの戦略に用い得る１０量体〜２０量体ホモピリミジンまたはホモプリンの一続きを同定する。候補ホモピリミジンまたはホモプリンの一続きの同定後、一般に標的遺伝子を発現する細菌細胞の集団中に、候補配列を含有する種々の量のオリゴヌクレオチドを導入することにより、遺伝子発現の抑制におけるそれらの効率を評価する。オリゴヌクレオチドはオリゴヌクレオチド合成機で調製し得るか、またはそれらは、オリゴヌクレオチド合成受託を専門にしている会社から購入し得る。
【０６８８】
当業者に既知の種々の方法（リン酸カルシウム沈殿、ＤＥＡＥ−デキストラン、エレクトロポレーション、リポソーム媒介性トランスフェクションまたは天然取込みを含むが、これらに限定されない）を用いて、細胞中にオリゴヌクレオチドを導入することができる。
【０６８９】
吸光度測定を用いる、未処理細胞と比較した場合の成長レベルのモニタリングのような技法を用いて、増殖の低減に関して、処理細胞をモニタリングする。次に培養細胞中の遺伝子発現を抑制するのに有効であるオリゴヌクレオチドを、有効であることが示された投与量レベルで、当技術分野で既知の技法を用いてインビボで導入し得る。
【０６９０】
いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチド単位の天然（β）アノマーをαアノマーに取り替えて、オリゴヌクレオチドをヌクレアーゼに対してより耐性にさせ得る。さらに挿入剤、例えば臭化エチジウム等をαオリゴヌクレオチドの３’末端に結合させて、三重らせんを安定化することができる。三重らせん形成に適したオリゴヌクレオチドの生成に関する情報に関しては、Griffiら（Science245:967-971(1989)）を参照されたい。
【０６９１】
実施例４９
ＰＣＲによる単離検体からの細菌株の同定
種々の細菌種の検出のための古典的細菌学的方法は、時間が掛かり、コストがかかる。これらの方法は、特殊培地中での被験体から単離された細菌の成長、選択寒天培地上での培養、その後の、完了するのに８〜１０日以上を要し得る一組の確証アッセイを含む。本発明の同定配列の使用は、試料中に存在する特定細菌種を検出し、同定するのに必要な時間を劇的に低減する方法を提供する。
【０６９２】
一つの例示的方法では、濃縮培地中で細菌を成長させ、例えば血液、尿、糞便、唾液または中枢神経系液の検体から、慣用的方法によりＤＮＡ試料を単離する。次に細胞もしくは微生物の種々の種または型に特有の同定配列を基礎にしたＰＣＲプライマーのパネルを実施例１２にしたがって利用して、検体からの約１００〜２００ヌクレオチド長のＤＮＡを増幅する。各ＰＣＲプライマー性に関して別個のＰＣＲ反応を設定し、ＰＣＲ反応完了後に、ＰＣＲ産物の存在に関して反応混合物をアッセイする。種々の試験ＰＣＲ反応チューブ中のＰＣＲ産物の存在または非存在により、ＰＣＲプライマー対が属する種からの細菌の存在または非存在を決定する。
【０６９３】
種々の細菌の存在に関して単離試料をアッセイするためにＰＣＲ反応を用いるが、他のアッセイ、例えばサザンブロットハイブリダイゼーションも意図される。
【０６９４】
合理的な薬剤設計を用いて、増殖に必要な遺伝子産物の活性を抑制するか、またはその量を低減させる化合物を同定し得る。これらの方法は、本明細書中に記載する増殖に必要なポリペプチドまたは相同ポリペプチドとともに用い得る。このような方法においては、Ｘ線結晶学、ＮＭＲまたはコンピュータモデリングのような方法を用いて、遺伝子産物の構造を決定する。化合物をスクリーニングして、それらを遺伝子産物と相互作用させる構造を有するものを同定する。いくつかの実施形態では、化合物をスクリーニングして、活性に対して重要である遺伝子産物の領域とそれらを相互作用させる構造を有するものを同定する。例えば化合物をスクリーニングして、それらを遺伝子産物の活性部位に結合させて、その活性を抑制させる構造を有するものを同定する。例えば化合物は、高親和性で活性部位に結合し、それにより遺伝子産物がその天然基質に作用するのを防止する自殺基質であり得る。あるいは、化合物は、他の生体分子との複合体形成に関与する遺伝子産物の領域に結合し得る。このような場合、遺伝子産物と複合体の他の成員との間の相互作用を遮断することにより、遺伝子産物の活性を抑制する。
【０６９５】
したがって、本発明の一実施形態は、本発明の遺伝子産物の結晶および／または薬剤スクリーニングアッセイにおいて結晶から得られる三次元座標を含むデータセットを使用する方法を含む。本発明は、必須遺伝子産物の活性を抑制するか、またはその量を調節するために、本発明の方法により同定される物質（モジュレーターまたは薬剤）の使用方法と一緒に、本発明の方法により同定される物質（モジュレーターまたは薬剤）も含む。本発明は、本発明の遺伝子産物またはそれらの一部を含む結晶も含む。
【０６９６】
本発明のいくつかの実施形態では、Ｘ線結晶学またはＮＭＲを用いて、増殖に必要なポリペプチドの三次元構造を決定する。決定した構造の座標をコンピュータシストモデリングプログラムに用いて、コードポリペプチドに結合するか、および／またはその活性または量を調節する化合物を同定する。本方法は、以下の工程を包含し得る：１)分析用のコード組換え（または内因性）ポリペプチドの高純度結晶の生成、２)ポリペプチドの三次元構造の決定、ならびに３）化合物構造およびポリペプチドの分子相互作用を分析するためのコンピュータアシスト「ドッキング(docking)」プログラムの使用（すなわち、薬剤スクリーニング）。
【０６９７】
上記の工程の各々を実施するための一般的方法は以下に記載されており、当業者にも既知である。本明細書中に記載したものを含めて当業者に既知の任意の方法は、各々の同定された必須遺伝子産物に関する三次元構造の生成ならびに薬剤スクリーニングアッセイにおけるその使用のために用い得る。
【０６９８】
以下のようにして、増殖に必要な遺伝子産物の結晶を得る。ある種の条件下で、分子を溶液から高次結晶格子に凝縮するが、これは、結晶配列の最小反復容積である単位セルにより規定される。このようなセルの内容物は、ある種の電磁および粒子波（例えばＸ線、中性子線、電子線等）と相互作用し、それらを回析し得る。格子の対称性のために、回析波は相互作用して、回析パターンを生じる。回析パターンを測定することにより、結晶中の原子の三次元構造を結晶学者は再構築し得る。
【０６９９】
以下に記述する方法を含めて、当業者に既知の任意の方法を用いて、高純度結晶を調製し得る。例えば、バッチ結晶化、蒸気拡散（着座小滴または懸垂小滴による）を含めた多数の技法により、ならびに微量透析により、同定された必須遺伝子の産物の結晶を成長させ得る。いくつかの場合の結晶のシーディングは、Ｘ線上質結晶を得ることを必要とする。したがって結晶の標準ミクロおよび／またはマクロシーディングを用い得る。懸垂小滴蒸気拡散法を以下に例示する。２０ｍＭトリス、ｐＨ＝８．０、１００ｍＭのＮａＣｌ中の必須遺伝子産物（２．５μｌ、１０ｍｇ／ｍｌ）の懸垂小滴を、２．７〜３．２Ｍ蟻酸ナトリウムおよび１００ｍＭトリス緩衝液、ｐＨ＝８．０を含有する等量のリザーバ緩衝液と混合し、４℃に維持する。１〜２日後に結晶シャワーが出現し、２〜３週間以内に大きな単一結晶が最大サイズ（０．３×０．３×０．１５ｍｍ³）に成長する。３．５Ｍ蟻酸ナトリウムおよび１００ｍＭトリス緩衝液、ｐＨ＝８．０中に結晶を収集し、３．５Ｍ蟻酸ナトリウムおよび１００ｍＭトリス緩衝液、ｐＨ＝８．０、１０％（ｗ／ｖ）スクロースおよび１０％（ｖ／ｖ）エチレングリコール中で凍結防止処理した後、液体プロパン中で瞬間凍結する。いくつかの実施形態では、米国特許第５，８６９，６０４号に記載される方法を用いて結晶を生成し得る。その方法は、（ａ）非結晶化ポリペプチドを含有する混合物を、そのポリペプチドと少なくとも９０．４％の面積格子マッチを有する外因性成核剤と接触させることと、（ｂ）ポリペプチドを結晶化し、それにより成核剤に結合したポリペプチドの少なくとも１つの結晶（その結合結晶は高純度を有する）、および成核剤に結合していない少なくとも１つのポリペプチド結晶（その非結合結晶は結合結晶より低純度を有する）を生成することと、（ｃ）成核剤と結合した結晶を成核剤に結合していない結晶と分離することとを含む。（ａ）非結晶化ポリペプチドおよび夾雑物を含有する混合物をそのポリペプチドと少なくとも９０．４％の面積格子マッチを有する外因性成核剤と接触させることと、（ｂ）ポリペプチドを結晶化し、それにより成核剤に結合したポリペプチドの少なくとも１つの結晶（結合結晶は高純度を有し、高収率で産生される）および成核剤に結合していない少なくとも１つの結晶（その非結合結晶は結合結晶より低純度を有する）を生成することと、（ｃ）成核剤に結合した結晶を成核剤に結合していない結晶と分離することによっても、結晶化ポリペプチドを夾雑物から精製し得る。
【０７００】
本発明の結晶を一旦成長させれば、当業者に既知の方法を用いて、Ｘ線回析データを収集することができる。したがって、本発明の教示を有し、過度の実験を伴わないタンパク質結晶化の任意の当業者は、種々の異なる生物由来の多数の代替的形態の必須遺伝子産物、またはそれらのアミノ酸配列中に保存的置換を有するポリペプチドを結晶化することができる。
【０７０１】
その単位セルの対称性、ならびに単位セルが含有する任意の構造モチーフにより結晶格子を規定する。例えば任意の結晶格子に関しては２３０個の考え得る対称群が存在するが、一方結晶格子群の単位セルは、格子を作り上げる分子によって任意の寸法を有し得る。しかしながら生物学的高分子は、不斉中心を有し、２３０個の対称群のうちの６５個に限定される（Cantorら,Biophysical Chemistry, Vol.III, W.H.Freeman & Company(1980)参照）。
【０７０２】
結晶格子は、単位セル中の原子間の間隔と同一水準の大きさの波長を有する電磁または粒子波、例えばそれぞれＸ線または電子線と相互作用する。回析波は、結晶に隣接して位置する検出表面上のスポットのアレイとして測定される。各スポットは、三次元位置ｈｋｌおよび強度Ｉ（ｈｋｌ）を有し、それらの両方が、いわゆる電子密度方程式を用いて結晶の三次元電子密度を再構築するために用いる。電子密度方程式は、単位セルの三次元電子密度が構造因子のフーリエ変換であることを示す。したがって、理論では、検出空間中の十分な数のスポットに関して構造因子が既知である場合には、電子密度方程式を用いて単位セルの三次元電子密度を算定し得る。
【０７０３】
本発明のいくつかの実施形態では、デジタルコンピュータの、ならびに米国特許第５，３５３，２３６号に記載されるような結晶回析パターンの助けを借りて、増殖に必要な遺伝子産物またはそれらの一部分の結晶の画像を得る。回析パターンは、各々が付随分解能を有する複数の反射を含有する。画像は、（ａ）自動回析計を用いて生成される結晶の回析パターンをコンピュータで使用できる正規化振幅に変換し、（ｂ）回析パターンから結晶の単位セルの寸法を決定し、（ｃ）結晶中の遺伝子産物またはそれらの一部が占める単位セルの領域を規定する包絡線を提供し、（ｄ）上記包絡線内の散乱体の集団を分布し、（その散乱体の集団は種々の配置を有し、その各々はフーリエ振幅の関連パターンを有する）、（ｅ）散乱体の集合を、散乱体の上記の集団に関して回析パターンとフーリエ振幅のパターンとの間に高度の相関を生じる凝縮配置に凝縮し、（ｆ）散乱体の凝縮配置からの上記の回析パターンの反射のうちの少なくとも１つと関連する相を決定し、（ｇ）手法ｆで決定した相からの単位セル内の遺伝子産物または一部の電子密度分布を算定し、（ｈ）上記の電子密度分布から構築される遺伝子産物またはその一部のグラフ像を示すことにより得られる。
【０７０４】
増殖に必要な遺伝子産物の結晶は、米国特許第６，１５６，５２６号に記載されているような薬剤スクリーニング法に用い得る。要するに、このような方法においては、遺伝子産物またはその一部を含む複合体の形成を抑制する化合物を、以下のように同定する。当該遺伝子産物またはその一部を含む複合体の三次元構造を限定する一組の原子座標を決定する。複合体形成に関与する遺伝子産物またはその一部分に結合する考え得る化合物を、上記で得た原子座標を用いて選定する。考え得る化合物の非存在下で複合体を生成させる条件下で、複合体中の遺伝子産物またはその一部分およびその結合相手と、化合物とを接触させる。その結合相手に対する遺伝子産物またはその一部分の結合親和性を決定し、その結合相手に対する遺伝子産物またはその一部の結合親和性の低減が認められる場合、複合体の生成を抑制する化合物として、考え得る化合物を同定する。
【０７０５】
本発明のいくつかの実施形態では、必須遺伝子産物の三次元構造を決定し、考え得るアゴニストおよび／または考え得るアンタゴニストを、コンピュータモデリングの助けを借りて設計する［Buggら,Scientific American, Dec.: 92-98(1993); Westら, TIPS, 16:67-74(1995); Dunbrackら,Folding & Design, 2:27-42(1997)］。
【０７０６】
１つまたはそれ以上のコンピュータプログラムを用いてコンピュータ分析を実施し得る。その例としては以下のものが挙げられる：ＱＵＡＮＴＡ、ＣＨＡＲＭＭ、ＩＮＳＩＧＨＴ、ＳＹＢＹＬ、ＭＡＣＲＯＭＯＤＥＬおよびＩＣＭ［Dunbrackら, Folding & Design, 2:27-42(1997)］。本発明のこの態様のさらなる実施形態では、そのようにして得られた三次元構造を、好ましくはドッキングコンピュータプログラムと一緒に用いて、初期薬剤スクリーニングアッセイを実施する。このようなコンピュータモデリングは、１つまたはそれ以上のドッキングプログラム、例えばＦｌｅｘＸ、ＤＯＣ、ＧＲＡＭおよびＡＵＴＯ ＤＯＣＫを用いて実施することができる［Dunbrackら,Folding & Design, 2:27-42(1997)］。
【０７０７】
本明細書中に提供した各薬剤スクリーニングアッセイに関しては、いずれかのまたはすべての工程の多数の繰り返しサイクルを実施して、選択を最適化し得ることが理解されるべである。本発明の薬剤スクリーニングアッセイは、物質または薬剤と必須遺伝子産物との間の相互作用を決定するための多数の手段のいずれかを用い得る。
【０７０８】
本発明のいくつかの実施形態では、ＮＭＲベースの方法論により、本発明の必須遺伝子産物に結合するように薬剤を具体的に設計することができる［Shukerら, piScience 274:1531-1534(1996)］。当業者に既知の装置、例えば各々が、Bagbyら［Cell 82:857-867(1995)］に記載されるように分析される場合に、パルス場グラジエント三重共鳴プローブを装備したVarianUnity Plus５００およびunity６００分光計を用いて、ＮＭＲスペクトルを記録し得る。上記と同様の三重共鳴実験の組合せを用いて、主鎖¹Ｈ、・¹⁵Ｎ、および・¹³Ｃ原子の逐次共鳴割当を成し得る［Bagbyら,Biochemistry, 33:2409-2421(1994a)］が、但し感度強化［Muhandiram and Kay, J. Magn. Reson.,103:203-216(1994)］および最小Ｈ₂Ｏ飽和［Kayら, J. Magn. Reson.,109:129-133(1994)］を除く。溶液中での８分および１６分の混合時間を伴うが構造算定には含む必要のないＨＣＣＨ−ＴＯＣＳＹ［Baxら, J.Magn. Reson., 87:620-627(1990)］実験を用いて、側鎖¹Ｈおよび¹³Ｃ割当を成し得る。二次元¹Ｈ――¹ＨＮＯＥ分光分析（ＮＯＥＳＹ）、三次元¹⁵Ｎ−編集ＮＯＥＳＹ−ＨＳＱＣ［Zhanget al., J. Biomol, NMR, 4:845-858(1994)］および三次元同時獲得¹⁵Ｎ／¹³Ｃ編集ＮＯＥ［Pascalら,J. Magn. Reson., 103: 197-201(1994)］スペクトルにおける核オーバーハウザー効果（ＮＯＥ）交差ピークは、１００分のＮＯＥ混合時間を用いて得られる。標準擬似原子距離補正［Wuthrichら,J. Mol. Biol., 169: 949-961(1983)］を組入れて、中心平均化を説明し得る。付加的０．５．ＡＮＧ．を、メチル基を含む距離に関する上限に付加し得る［Wagnerら,J. Mol. Biol., 196:611-639(1987); Cloreら, Biochemistry, 26:8012-8023(1987)］。
【０７０９】
上記の戦略［Bagbyら, Structure, 2:107-122(1994b)］を用いて、Ｘ−ＰＬＯＲ［Brunger, X-PLOR Manual,Version 3.1, New Haven, Conn.: Department of Molecular Biophysics andBiochemistry, Yale University(1993)］内で模擬アニーリングプロトコル［Nilgesら, In computationalAspects of the Study of Biological Macromolecules by Nuclear Magnetic ResonanceSpectroscopy, J.C. Hoch, F.M. Poulsen, and C. Redfield, eds., New York: PlenumPress, pp. 451-455(1991)］を用いて、構造を算定することができる。K. Yapが書いたプログラムを用いて、らせん間の角度を算定し得る。プログラムＮａｃｃｅｓｓ（Prof.J. Thornton, University College, Londonから入手可能）を用いて、アクセシブル表面積を算定した。
【０７１０】
米国特許第６，０７７，６８２号に記載される方法を用いて、細胞増殖に必要な遺伝子産物の活性または量を低減することができる化合物を同定し得る。要するに、（ａ）遺伝子産物またはその一部の１つまたはそれ以上の組の原子座標から決定した三次元構造を、コンピュータモデリングとともに用いて合理的な薬剤設計を実施することにより、考え得る薬剤を選択し、（ｂ）遺伝子産物またはその一部を含むポリペプチドと、考え得る薬剤とを接触させ、（ｃ）上記のポリペプチドとの考え得る薬剤の結合をアッセイすることにより、遺伝子産物またはその一部の三次元構造を、薬剤スクリーニングアッセイに用い得るが、この場合、考え得る薬剤がポリペプチドに結合する場合には、考え得る薬剤は薬剤として選定される。いくつかの方法では、（ａ）遺伝子産物またはその一部の三次元構造を用いて構造ベースの合理的な薬剤設計を実施することにより、考え得る薬剤を選択すること（この場合、上記の選択はコンピュータモデリングとともに実施する）と、（ｂ）遺伝子産物の基質の存在下で遺伝子産物またはその一部を含むポリペプチドと、考え得る薬剤とを接触させる（この場合、考え得る薬剤の非存在下では、基質は遺伝子産物により作用する）と、（ｃ）考え得る薬剤遺伝子産物が基質に作用した程度を決定すること（この場合、その非存在に対して、考え得る薬剤の存在下で基質に及ぼす遺伝子産物の作用の低減が決定された場合に薬剤が選定される）ことを含む薬剤スクリーニングアッセイに、遺伝子産物またはその一部の三次元構造を用いる。いくつかの実施形態では、上記の方法はさらに、（ｄ）ＮＭＲ分析のために、考え得る薬剤を遺伝子産物またはその一部と接触させること（この場合、ＮＭＲ分析のための考え得る薬剤と前期の遺伝子産物またはその一部との間に結合複合体が形成され、ＮＭＲ分析用の遺伝子産物またはその一部は保存的アミノ酸置換を含む）と、（ｅ）ＮＭＲにより結合複合体の三次元構造を決定することと、（ｆ）結合複合体に関して決定された三次元構造を用いて構造ベースの合理的な薬剤設計を実施することにより候補薬剤を選定すること（この場合、上記の選定はコンピュータモデリングとともに実施される）と、（ｇ）遺伝子産物またはその一部の基質の存在下で遺伝子産物またはその一部を含む第２のポリペプチドと候補薬剤とを接触させること（この場合、候補薬剤の非存在下では、基質は第２のポリペプチドにより作用される）と、また（ｈ）基質に及ぼす第２のポリペプチドの作用の量を決定すること（この場合、薬剤は、候補薬剤の非存在に対して、候補薬剤の存在下で第２のポリペプチドの作用量の低減が決定される場合に選定される）ことを含む。
【０７１１】
必須遺伝子産物を含む結晶の三次元構造が一旦決定されれば、ドッキングプログラム、例えばＦｌｅｘＸ、ＧＲＡＭ、ＤＯＣＫおよびＡＵＴＯＤＯＣＫ［Dunbrackら,1997、上記］を用いるコンピュータモデリングの使用により、その活性の考え得るモジュレーターを検査して、考え得るモジュレーターを同定することができる。この手法は、ポリペプチドまたはその断片に対する考え得るモジュレーターのコンピュータ適合を含んで、考え得るモジュレーターの形状および化学構造が如何に良好に結合するかを確証することができる。コンピュータプログラムを用いて、２つの結合相手（例えば必須遺伝子産物および考え得るモジュレーター）の引力、反発力および立体障害を推定することができる。一般に、これらの特性はより厳しい結合定数と一致するため、ぴったり適合するほど立体障害は低く、また引力が大きいほど考え得るモジュレーターは強力である。さらに、考え得る薬剤の設計における特異性が大きいほど、薬剤は他のタンパク質と同様に相互作用しないと思われる。
【０７１２】
１つまたはそれ以上の有望と思われる類縁体が同定されるまで、コンピュータモデリングプログラムにより化合物および化合物類縁体は系統的に修飾される。さらに続いて、選定類縁体の系統的修飾は、１つまたはそれ以上の考え得る類縁体が同定されるまで、コンピュータモデリングプログラムにより系統的に修飾され得る。このような分析は、ＨＩＶプロテアーゼ阻害剤の開発に有効であることが示されている［Lamら,Science 263:380-384(1994); Wlodawerら, Ann. Rev. Biochem. 62:543-585(1993);Appelt, Perspectives in Drug Discovery and Design 1:23-48(1993); Erickson,Perspectives in Drug Discovery and Design 1:109-128(1993)］。あるいは、例えば組換えバクテリオファージにより産生されたランダムペプチドライブラリーを初期スクリーニングすることにより、考え得るモジュレーターを獲得し得る［Scottand Smith, Science, 249:386-390(1990); Cwirlaら, Pro. Natl. Acad.Sci.,87:6378-6382(1990); Devlinら, Science, 249:404-406(1990)］。次に、このようにして選定されたペプチドを上記のようなコンピュータモデリングプログラムにより系統的に修飾し、続いて構造類縁体と同様に処理する。
【０７１３】
実施例４５は、増殖に必要な遺伝子産物の構造のコンピュータモデリングを記載する。
【０７１４】
実施例５０
コンピュータモデリングを用いた増殖に必要な遺伝子産物の構造の決定
以下のように、コードタンパク質のアミノ酸配列を用いて、スタフィロコッカス・オーレウスの増殖に必要な遺伝子産物のいくつかにコンピュータモデリング法を適用することにより、三次元モデルを構築した。TriposAssociates in their BIOPOLYMER module to SYBYLにより提供されるようなSir Tom BlundellのプログラムＣＯＭＰＯＳＥＲを用いて、モデルを構築した。Matchmakerで実行されるようなトポロジーフィンガープリンティングのSkolnik法を用いて、平均突然変異自由エネルギーを採点した。この数字はボルツマン数（単位：ｋＴ）であり、負であるべきである(負であるほど、良好なモデルである)。
【０７１５】
作者は、乱雑にしているNeedleman Wunschアラインメントを用いて、有意のアラインメントを見出す。報告されたパラメーターは、乱雑にすることから測定した場合の同一性％および有意性である。３０％同一であり、スケールで４より大きい有意性を有するマッチが、モデル構築鋳型のための良好な候補であると判断された。三次元構造がこれらの判定基準を満たさない場合には、ＢＬＡＳＴ検索を最新ＰＤＢ配列データベースに対して実行した。次に、このようにして発見された任意の有意のヒットを二進タンパク質構造データベースに付加し、上記の方法で候補検索を反復した。
【０７１６】
次の段階で、作者は、構造的に保存された構造的可変部を割当て、主鎖構造を作り上げ、次に可変ループの構造に関してデータベースを検索した。次にこれらを、スプライシングし、タンパク質のモデルが得られた。割当不可能な任意のループ(可変部)を手動で作り、動力学の組合せで精製した。
【０７１７】
次に構造を精製した。水素原子を付加し、非活性集合体を限定した。ＡＭＢＥＲ ＡＬＬ−ＡＴＯＭおよびコールマン電荷を用いた動力学の１０００ｐＳを実施した。次に、最小限サイクルの５０００までの最急降下工程を実施し、次に集合体を解凍し、全タンパク質に関して過程を反復した。
【０７１８】
次に、その結果生じた構造をＭＡＴＣＨＭＡＫＥＲで確認した。経験的に得られたタンパク質トポロジーから決定されたトポロジー的走査自由エネルギーをコンピュータ処理し、ボルツマン数で報告される平均エネルギー／残基を報告した。この数は自由エネルギーを表すので、それが負であるほど、それはより望ましい。
【０７１９】
スタフィロコッカス・オーレウスの増殖に必要な６６のタンパク質を上記のようにモデル化した。ＭＡＴＣＨＭＡＫＥＲエネルギーをこれらに関してコンピュータ処理した。クラスにより構築されたモデルの分布を、以下の表に示す。
【０７２０】
【表９８】

【０７２１】
ＦｔｓＺを用いて、上記の方法の妥当性を確証した。ＦｔｓＺの場合、M． Janeschiからの結晶構造を利用した。上記のモデリングを用いて決定した全構造特徴の検査は、正しい位置でのフォールドのすべてを示したが、Ｘ線結晶学により決定された構造とのいくつかの小差が認められた。
【０７２２】
実施例５１
機能的補完
別の実施形態では、スタフィロコッカス・オーレウス、サルモネラ・チフィムリウム、クレブシエラ・ニューモニエ、シュードモナス・アエルギノーサ、エンテロコックス・フェカリス、エシェリヒア・コリ、エンテロコックス・フェカリス、ヘモフィルス・インフルエンザ、ヘリコバクター・ピロリまたはサルモネラ・チフィ由来の増殖に必要な遺伝子産物または相同ポリペプチドにより活性が補完され得る遺伝子産物を、部分二倍体(merodiploid)を用いて同定し、遺伝子産物の活性を低減または排除する必須遺伝子中の突然変異を有する生物中に、プラスミドまたは細菌人工染色体を導入することにより作製した。いくつかの実施形態では、生物が許容状態の下では増殖するが、しかしプラスミドまたは細菌人工染色体上の遺伝子による相補性の非存在下での非許容状態の下では増殖できないように、突然変異は条件的突然変異、例えば温度感受性突然変異であり得る。あるいは、Rothら(1987)Biosynthesis of Aromatic Amino Acids in Escherichia coli and Salmonellatyphimurium, F.C. Neidhardt, ed., American Society for Microbiology, publisher,pp. 2269-2270に記載されているような重複が構築され得る。このような方法は、当業者に既知である。
【０７２３】
第８表は、本明細書中で考察したヌクレオチド配列の配列番号およびこれらのヌクレオチドによりコードされるポリペプチドの配列番号に関する相互参照を提供する。
【０７２４】
【表９９】

【表１００】

【表１０１】

【表１０２】

【表１０３】

【表１０４】

【表１０５】

【表１０６】

【表１０７】

【表１０８】

【表１０９】

【表１１０】

【表１１１】

【表１１２】

【表１１３】

【表１１４】

【表１１５】

【表１１６】

【表１１７】

【表１１８】

【表１１９】

【表１２０】

【表１２１】

【表１２２】

【表１２３】

【表１２４】

【表１２５】

【表１２６】

【表１２７】

【表１２８】

【表１２９】

【表１３０】

【表１３１】

【表１３２】

【表１３３】

【表１３４】

【表１３５】

【表１３６】

【表１３７】

【表１３８】

【表１３９】

【表１４０】

【表１４１】

【表１４２】

【表１４３】

【０７２５】
【表１４４】

【表１４５】

【表１４６】

【表１４７】

【表１４８】

【表１４９】

【表１５０】

【表１５１】

【表１５２】

【表１５３】

【表１５４】

【表１５５】

【表１５６】

【表１５７】

【表１５８】

【表１５９】

【表１６０】

【表１６１】

【表１６２】

【表１６３】

【表１６４】

【表１６５】

【表１６６】

【表１６７】

【表１６８】

【表１６９】

【表１７０】

【表１７１】

【表１７２】

【表１７３】

【表１７４】

【表１７５】

【表１７６】

【表１７７】

【表１７８】

【表１７９】

【表１８０】

【表１８１】

【表１８２】

【表１８３】

【表１８４】

【表１８５】

【表１８６】

【表１８７】

【表１８８】

【表１８９】

【表１９０】

【表１９１】

【表１９２】

【表１９３】

【表１９４】

【表１９５】

【表１９６】

【表１９７】

【表１９８】

【表１９９】

【表２００】

【表２０１】

【表２０２】

【表２０３】

【表２０４】

【表２０５】

【表２０６】

【表２０７】

【表２０８】

【表２０９】

【表２１０】

【表２１１】

【表２１２】

【表２１３】

【表２１４】

【表２１５】

【表２１６】

【表２１７】

【表２１８】

【表２１９】

【表２２０】

【表２２１】

【０７２６】
【表２２２】

【表２２３】

【表２２４】

【表２２５】

【表２２６】

【表２２７】

【表２２８】

【表２２９】

【表２３０】

【表２３１】

【表２３２】

【表２３３】

【表２３４】

【表２３５】

【表２３６】

【表２３７】

【表２３８】

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【表２４０】

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【表３１３】

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【０７２７】
【表３１５】

【表３１６】

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【表３２２】

【表３２３】

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【表３２９】

【表３３０】

【表３３１】

【表３３２】

【表３３３】

【表３３４】

【表３３５】

【図面の簡単な説明】
【図１】 図１は、タンパク質合成に必要とされ、細胞増殖に必須であるエシェリヒア・コリリボソームタンパク質ｒｐｌＷに対するアンチセンスクローン（ＡＳ−ｒｐｌＷ）、またはタンパク質合成に関与することが既知でなく、増殖に必須であるｅｌａＤに対するアンチセンスクローン（ＡＳ−ｅｌａＤ）遺伝子のいずれかを含有するＩＰＴＧ誘導性プラスミドで形質転換されたエシェリヒア・コリにおけるＩＰＴＧ用量応答曲線である。
【図２】 図２Ａは、２０％および５０％成長抑制を生じる濃度のＩＰＴＧの非存在下（０）または存在下でのｒｐｌＷに対するアンチセンス（ＡＳ−ｒｐｌＷ）を含有するＩＰＴＧ誘導性プラスミドで形質転換されたエシェリヒア・コリにおけるテトラサイクリン用量応答曲線である。
図２Ｂは、２０％および５０％成長抑制を生じる濃度のＩＰＴＧの非存在下（０）または存在下でのｅｌａＤに対するアンチセンス（ＡＳ−ｅｌａＤ）を含有するＩＰＴＧ誘導性プラスミドで形質転換されたエシェリヒア・コリにおけるテトラサイクリン用量応答曲線である。
【図３】 図３は、必須リボソームタンパク質Ｌ２３（ＡＳ−ｒｐｌＷ）ならびにＬ７／Ｌ１２およびＬ１０（ＡＳ−ｒｐｌＬｒｐｌＪ）に対するアンチセンスクローンでトランスフェクトされたエシェリヒア・コリのテトラサイクリン感受性における増大倍数を示すグラフである。タンパク質合成に直接関与しないことが既知である遺伝子に対するアンチセンスクローンａｔｐＢ／Ｅ（ＡＳ−ａｔｐＢ／Ｅ）、ｖｉｓＣ（ＡＳ−ｖｉｓＣ）、ｅｌａＤ（ＡＳ−ｅｌａＤ）、ｙｏｈＨ（ＡＳ−ｙｏｈＨ）は、テトラサイクリンに対して非常に低い感受性である。
【図４】 図４は、ジャイレースのβサブユニットをコードするｇｙｒＢ遺伝子に相補的なアンチセンス核酸を転写するスタフィロコッカス・オーレウス細胞を、その標的が既知であるいくつかの抗体と接触させたアッセイの結果を示す。

Claims (25)

1. 細胞増殖を低減させる能力について候補化合物をスクリーニングする方法であって、
   （ａ）配列番号１２６００のアミノ酸配列を含むポリペプチドの発現を減少させる、致死量以下の濃度のアンチセンス核酸を提供して、それにより感作細胞を作製し、ただし、前記細胞は原核生物細胞であり、
   （ｂ）前記感作細胞を化合物と接触させ、
   （ｃ）非感作細胞に比べて、前記感作細胞の増殖を前記化合物が抑制する度合いを決定すること
   を含む方法。
2. 前記アンチセンス核酸が、配列番号１４６３、配列番号１３９０、配列番号１８４５、配列番号２７８２、および配列番号３２８３からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含む、請求項１に記載の方法。
3. 前記核酸が配列番号１４６３のヌクレオチド配列を含む、請求項２に記載の方法。
4. 細胞増殖を低減させる能力について候補化合物をスクリーニングする方法であって、
   （ａ）細胞において、遺伝子産物をコードする核酸の少なくとも一部に相補的な、致死量以下の濃度のアンチセンス核酸を提供して、前記細胞における前記遺伝子産物の活性または量を低減させて、それにより感作細胞を生産し、ただし、前記細胞は原核生物細胞であり、
   ここで、前記遺伝子産物は、
   ｉ）配列番号１４６３のヌクレオチド配列を含むアンチセンス核酸により発現が抑制されるポリペプチドをコードする核酸に対して、デフォルトパラメータでＢＬＡＳＴＮバージョン２．０を用いて決定される場合に少なくとも８０％のヌクレオチド配列同一性を有する核酸によってコードされ、
   ｉｉ）配列番号１４６３のヌクレオチド配列を含むアンチセンス核酸により発現が抑制されるポリペプチドをコードする核酸に対して、デフォルトパラメータでＢＬＡＳＴＮバージョン２．０を用いて決定される場合に少なくとも９５％のヌクレオチド配列同一性を有する核酸によってコードされ、
   ｉｉｉ）配列番号４２２８に対して、デフォルトパラメータでＢＬＡＳＴＮバージョン２．０を用いて決定される場合に少なくとも８０％のヌクレオチド配列同一性を有する核酸によってコードされ、
   ｉｖ）配列番号４２２８に対して、デフォルトパラメータでＢＬＡＳＴＮバージョン２．０を用いて決定される場合に少なくとも９５％のヌクレオチド配列同一性を有する核酸によってコードされ、
   ｖ）配列番号１４６３のヌクレオチド配列を含む核酸に、ストリンジェントな条件下にてハイブリダイズするヌクレオチド配列を含む核酸によりコードされ、前記ストリンジェントな条件は、４５℃で６×ＳＳＣ中でのハイブリダイゼーションと、その後の６８℃で０．１×ＳＳＣ／０．２％ＳＤＳ中での１回またはそれ以上の洗浄を意味し、あるいは
   ｖｉ）配列番号１２６００のアミノ酸配列を含むポリペプチドにより補完され得る活性を有する、
   のいずれかであり、
   （ｂ）前記感作細胞を化合物と接触させ、
   （ｃ）前記化合物が、非感作細胞に比べて、前記感作細胞の成長を抑制する度合いを決定すること
   を含む方法。
5. 前記化合物が、非感作細胞に比べて前記感作細胞の増殖を抑制する度合いを決定することは、前記化合物が、前記非感作細胞の増殖を抑制するよりも、大きい度合いで前記感作細胞の増殖を抑制することを決定することを含む、請求項４に記載の方法。
6. 前記遺伝子産物がエシェリヒア・コリ以外の生物由来である、請求項４または５に記載の方法。
7. 前記細胞がエシェリヒア・コリ以外の生物の細胞である、請求項４〜６のいずれか１項に記載の方法。
8. 前記感作細胞が病原性微生物である、請求項４〜７のいずれか１項に記載の方法。
9. 前記感作細胞がグラム陽性細菌である、請求項４〜８のいずれか１項に記載の方法。
10. 前記グラム陽性細菌が、スタフィロコッカススピーシーズ、ストレプトコッカススピーシーズ、エンテロコッカススピーシーズ、ミコバクテリウムスピーシーズ、クロストリジウムスピーシーズ、およびバチルススピーシーズからなる群から選ばれる、請求項９に記載の方法。
11. 前記細菌は、スタフィロコッカス・オーレウスである、請求項１０に記載の方法。
12. 前記スタフィロコッカススピーシーズは、コアグラーゼ陰性である、請求項１０に記載の方法。
13. 前記細菌は、スタフィロコッカス・オーレウスＲＮ４５０およびスタフィロコッカス・オーレウスＲＮ４２２０からなる群から選ばれる、請求項１１に記載の方法。
14. 前記アンチセンス核酸は、誘導性プロモーターから転写される、請求項４〜１３のいずれか１項に記載の方法。
15. 前記細胞を、前記アンチセンス核酸の転写を致死量以下の濃度に誘導する濃度の誘導物質と接触させる工程をさらに含む、請求項１４に記載の方法。
16. 成長抑制は、培養成長溶液の吸光度をモニターすることにより測定される、請求項４〜１５のいずれか１項に記載の方法。
17. 前記遺伝子産物は、ポリペプチドである、請求項４〜１６のいずれか１項に記載の方法。
18. 前記遺伝子産物は、配列番号１２６００のアミノ酸配列を含むポリペプチドに対して、ＦＡＳＴＡバージョン３．０ｔ７８を用いて決定される場合に少なくとも９９％のアミノ酸同一性を有するポリペプチド、または、その活性が配列番号１２６００のアミノ酸配列を含むポリペプチドにより補完され得るポリペプチドである、請求項１７に記載の方法。
19. 前記遺伝子産物は、配列番号１２６００のアミノ酸配列を含むポリペプチドに対して、ＦＡＳＴＡバージョン３．０ｔ７８を用いて決定される場合に少なくとも９５％のアミノ酸同一性を有するポリペプチド、または、その活性が配列番号１２６００のアミノ酸配列を含むポリペプチドにより補完され得るポリペプチドである、請求項１７に記載の方法。
20. 前記遺伝子産物は、配列番号１２６００のアミノ酸配列を含むポリペプチドに対して、ＦＡＳＴＡバージョン３．０ｔ７８を用いて決定される場合に少なくとも９０％のアミノ酸同一性を有するポリペプチド、または、その活性が配列番号１２６００のアミノ酸配列を含むポリペプチドにより補完され得るポリペプチドである、請求項１７に記載の方法。
21. 前記遺伝子産物は、配列番号１２６００のアミノ酸配列を含むポリペプチドに対して、ＦＡＳＴＡバージョン３．０ｔ７８を用いて決定される場合に少なくとも８５％のアミノ酸同一性を有するポリペプチド、または、その活性が配列番号１２６００のアミノ酸配列を含むポリペプチドにより補完され得るポリペプチドである、請求項１７に記載の方法。
22. 前記遺伝子産物は、配列番号１２６００のアミノ酸配列を含むポリペプチドに対して、ＦＡＳＴＡバージョン３．０ｔ７８を用いて決定される場合に少なくとも８０％のアミノ酸同一性を有するポリペプチド、または、その活性が配列番号１２６００のアミノ酸配列を含むポリペプチドにより補完され得るポリペプチドである、請求項１７に記載の方法。
23. 前記ポリペプチドが配列番号１２６００のアミノ酸配列からなる、請求項１７に記載の方法。
24. 前記アンチセンス核酸が、配列番号１４６３、配列番号１３９０、配列番号１８４５、配列番号２７８２、および配列番号３２８３からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含む、請求項４〜２３のいずれか１項に記載の方法。
25. 前記核酸が配列番号１４６３のヌクレオチド配列を含む、請求項２４に記載の方法。

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