JP4848358B2 - 非メチル化ＣｐＧモチーフを含むＤＮＡに特異的に結合するタンパク質を用いて原核生物ＤＮＡの濃縮または分離のうち少なくともいずれか一方を行う方法 - Google Patents

Description

本発明は、ＤＮＡの非メチル化シチジン‐ホスフェート‐グアノシンジヌクレオチド（ＣｐＧモチーフ）に特異的に結合するタンパク質を用いて、原核生物ＤＮＡの濃縮または分離のうち少なくともいずれか一方、または生理学的液体からの前記ＤＮＡの除去を行う方法、ならびに前記方法を実施するためのキットに関する。

細菌感染は炎症性疾患の最大の原因のうちの一つである。臨床的要因の予後を診断するため、ならびに、特に適切な治療手段を適時に選択するために、病原性細菌の早期検出は決定的に重要である。

病原性細菌の検出においては、今日でもとりわけ種々の細胞培養法が用いられている。しかしながら、最新の研究から、病原体の検出のために培養に依存した方法を用いることは不適切であることが明白に示されている（非特許文献１、２）。これらの研究によれば、検査した全ての血液培養物のおよそ１５〜１６％でしか病原体を特定することができなかった。これらの方法には欠点があるので、特にこの１０年間、分子生物学の急速な技術的発展と併行して代替法を見出す一層の取り組みがなされてきた。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）の原理に基づく、培養に依存しない病原性細菌検出法の使用に関する最初の報告は、１９９０年代初期にさかのぼる。例えば、ミラーら（非特許文献３）は、結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）の検出について培養を用いない方法が古典的な培養および顕微鏡観察の方法よりも優れていることを示すことができた。しかしながら、病原体に特異的な核酸の検出に基づくさらなる分子生物学的手法（例えば非特許文献４〜７）が重要となってきている。

このような分子生物学的手法の高い特異性に加えて、従来の培養を用いる方法に対する実質的な利点として言及すべきなのは所要時間の縮小である。しかしながら、前処理済みの試験材料ではなく、体液から直接原核生物ＤＮＡを検出する感度は、微生物の培養に比べて非常に低いものであった。前処理されていない試験材料から病原体を直接検出するのに十分な細菌核酸の量は、細菌染色体上の１６Ｓ領域のＰＣＲと該ＰＣＲ断片の配列分析による１６Ｓ‐ｒＲＮＡ分析については限られた範囲でのみ達成されるが、これは多くの場合、１６Ｓ‐ｒＲＮＡをコードする部分が染色体上に数コピー見出されるからである。１６Ｓ‐ｒＲＮＡ分析を用いて病原体を特異的に直接検出するには、検査する試料中に病原体が１種類しか存在しないことが必要である。試料中に異なる種類の病原体が存在する場合、１６Ｓ‐ｒＲＮＡ領域の配列決定による特異的検出は不可能となる。これは、使用されるプライマーがほとんどの細菌について共通するからである。さらに、１６Ｓ‐ｒＲＮＡ分析による病原体の検出には、検出しようとする細菌が代謝状態にあって十分に１６Ｓ‐ｒＲＮＡを発現していることが必須条件である。この条件は通常、特に抗生物質の予測治療を受けている患者においては当てはまらない。さらに、細菌のある種の病原性因子は、その遺伝子が細菌ゲノム上に存在はしていても常に発現しているわけではない。その結果、誤った陰性結果が臨床医へと伝わってしまう。従って、抗生物質を選択した治療が全く開始されないか、開始が遅すぎてしまう可能性がある。そのような場合、医師は経験による自身の知識と一般的ガイドライン（パウル・エールリッヒ・ゲゼルシャフトのガイドラインなど）を頼りにしなければならず、従って非常に特異性の低い抗生物質治療を行うことになる。抗生物質の非特異的な使用は、個々の患者に対するリスク（腎臓障害などの不必要な副作用など）だけでなく、社会全体に対しても（ＭＲＳＡ（メチシリン耐性黄色ブドウ球菌）などのさらなる抗生物質耐性菌の出現など）多くのリスクを有している。
従って、臨床上重要な細菌の病原性因子および耐性を染色体レベルおよびプラスミドレベル、すなわち最終的にはＤＮＡレベルで検出することは、多くの感染症や敗血症の診断に大きな利点をもたらす。このことは、そのレベルであれば病原細菌と共生細菌の区別もできるので一層妥当である。

病原体特異的な核酸の検出は、例えばポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）またはリガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）による原核生物ＤＮＡの増幅などの核酸増幅技術（ＮＡＴ）によりそれぞれ行われることが最も多い。その結果は特異性が高く迅速に得られるが、一方でコンタミネーションや臨床試料由来の強力な反応阻害因子により影響を受けやすい。

従来のＰＣＲによる検出法では、血液中の病原体を十分に検出するには、理論上１０μｌの血液中に少なくとも１つの標的病原体ＤＮＡが存在している必要がある。これは、１ｍｌの血液中約１００個の標的、あるいは１０ｍｌの血液中約１０００個の標的にそれぞれ相当する。感染性病原体の検出のための血液培養物については事情が異なる。この場合は、検出限界は血液１０ｍｌあたり細菌約３〜５個である。

現在、ＰＣＲ法では、染色体上の１６Ｓ‐ｒＲＮＡ領域周辺に標的配列を有するＰＣＲ法であってもまだこの検出限界に達していない。１６Ｓ‐ｒＲＮＡをコードする領域は数個、大抵は３〜６個、細菌染色体上に位置しているが、少なくとも１分子の鋳型ＤＮＡがＰＣＲ反応混合物中にあるという必須条件には満たない。

微生物の染色体またはプラスミド上の特異的標的配列が種特異的なタンパク質をコードするＰＣＲ法については、診断上の安全性の向上が期待される。検出限界に関する上述の見解がここでも当てはまる。特に現行の抗生物質療法の作用のもとでは、最終的に使用される抗生物質が最適な効果を有していなくても、病原体の増殖が大幅に減速、制限または阻害される可能性がある。この状況は、特に抗生物質治療をすでに受けている患者、従ってその血液培養物またはその他の試料（例えば気管スミア、気管支肺洗浄物（ＢＡＬ）など）から病原性細菌が増殖できない患者において見られることが多い。

感度が不十分なため、増幅工程を伴わず原核生物ＤＮＡを直接検出すること（プローブ法、ＦＩＳＨ法）による病原体特異的な核酸の検出は、試験材料中の病原菌数が十分高い場合にのみ診断上重要となる。

体液中の病原性細菌を特定するための原核生物ＤＮＡの検出に関する本質的な問題点は、試験材料中のＰＣＲ阻害成分に加えて、主に、原核生物ＤＮＡ濃度が低いこと、その結果真核生物ＤＮＡと原核生物ＤＮＡとの比が非常に大きいことにある。このことに関しては、特に、ＤＮＡ分析における競合的プロセスならびに原核生物ＤＮＡの量を、病原体の定性的かつ定量的検出に対する障害とみなすことができる。

通常のＤＮＡ単離方法では、体液の全ＤＮＡが濃縮されて、宿主ＤＮＡと微生物ＤＮＡとの比が１：１０^−６〜１：１０^−８になる。この差から、体液中の微生物ＤＮＡの検出が困難であることが極めて容易に理解される。

原核生物ＤＮＡは、例えば非メチル化ＣｐＧモチーフの存在という点で真核生物ＤＮＡとは異なっている（非特許文献８）。原核生物ＤＮＡには、真核生物ＤＮＡの１６倍のＣｐＧモチーフが存在しているが、真核生物ＤＮＡはそのようなモチーフを、例えばがん細胞やプロモーター領域において一時的にのみ含んでいる。これらのモチーフは原核生物ＤＮＡではメチル化されていないが、真核生物ＤＮＡでは大多数がメチル化されており、このことは両ＤＮＡの区別を増補するものである。非メチル化ＣｐＧモチーフとは、原核生物ゲノムまたはその断片の中の、メチル化されていないデオキシシチジル酸‐デオキシグ
アニル酸‐ジヌクレオチドである。

さらに、ヒトＤＮＡ中のメチル化パターンの差異に基づいて、がんについて診断することが可能である（非特許文献９）。ゲノム中のメチル化シトシンおよび非メチル化シトシンは、組織特異的パターンならびに疾患特異的なパターンとして特定されうる。疾患の特異的メチル化パターンは、一方では非常に早い時点での診断を可能にし、他方では疾患の分子レベルの分類や、特定の治療に対する患者の応答の予測を可能にする。このことに関する詳細な情報については、例えば非特許文献１０、エピゲノミクス・アーゲー（Ｅｐｉｇｅｎｏｍｉｃｓ ＡＧ）のホームページ（http://www.epigenomics.de ）、または特許文献１を参照されたい。

非特許文献１１には、メチル化ＣｐＧモチーフをタンパク質に結合させることによって、メチル化されたヒトゲノムＤＮＡを分離することが可能であることが示されている。従って、この方法はメチル化ＣｐＧモチーフを含むＤＮＡを結合させる働きを有する。非メチル化ＤＮＡとメチル化ＤＮＡとを十分に単離することは、技術的理由から、すなわち用いられるタンパク質が非メチル化ＤＮＡにも弱く結合することから、不可能である。また、これらの方法を用いて非メチル化ＤＮＡを濃縮することについても、用いられるタンパク質の許容能力が大過剰のメチル化ＤＮＡがある場合にも十分非メチル化ＤＮＡを分離するほど十分ではないため、不可能である。さらに、メチル化ＤＮＡの結合によって非メチル化ＤＮＡの存在する初期容量が変化することはないので、濃縮は達成されない。

従って、真核生物ＤＮＡから原核生物ＤＮＡを、あるいはメチル化状態の異なるヒトＤＮＡをそれぞれ互いに分離するために、非メチル化ＤＮＡをメチル化ＤＮＡから分離し、非メチル化ＤＮＡを濃縮可能とすることが望ましいであろう。さらに、非メチル化ＤＮＡの単離および濃縮が、大過剰のメチル化ＤＮＡを含む混合物（例えば全血）からも可能となれば、健康の経済学の観点からも望ましく非常に興味深いこととなろう。

ブー（Ｖｏｏ）らによれば、ヒトＣｐＧ結合タンパク質（ｈＣＧＢＰ）は非メチル化ＣｐＧモチーフに結合することができる。この報告には、ＣｐＧモチーフ内の遺伝子発現の制御において役割を果たすことが示されている転写活性化因子ｈＣＧＢＰについて記載されている。

特許文献２には、非メチル化ＤＮＡに特異的に結合するタンパク質に原核生物ＤＮＡを結合させることによって、原核生物ＤＮＡと真核生物ＤＮＡとの混合物からの原核生物ＤＮＡの単離および濃縮を可能とする方法が示されている。
国際公開公報第２００４／０６７７７５号パンフレット 欧州特許出願公開第０２０２０９０４号明細書（ＥＰ０２０２０９０４） ヘレブラント、ヴェー．（Ｈｅｌｌｅｂｒａｎｄ Ｗ．）、ケーニッヒ‐ブルーンス、ツェー．（Ｋｏｅｎｉｇ‐Ｂｒｕｈｎｓ Ｃ．）、ハス、ヴェー．（Ｈａｓｓ Ｗ．）、「Ｓｔｕｄｉｅ ｚｕｒ Ｂｌｕｔｋｕｌｔｕｒｄｉａｇｎｏｓｔｉｋ ｉｍ Ｊａｈｒ ２００２」、Ｐｏｓｔｅｒ Ｊａｈｒｅｓｔａｇｕｎｇ ｄｅｒ Ｄｅｕｔｓｃｈｅｎ Ｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ ｆｕｅｒ Ｈｙｇｉｅｎｅ ｕｎｄ Ｍｉｋｒｏｂｉｏｌｏｇｉｅ、ゲッティンゲン（Ｇｏｅｔｔｉｎｇｅｎ）、２００４年 シュトラウベ、エー（Ｓｔｒａｕｂｅ Ｅ）、２００３年、「Ｓｐｅｓｉｓ‐ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｄｉａｇｎｏｓｉｓ」、Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ、第３１巻、ｐ．２８４ ミラー、エヌ（Ｍｉｌｌｅｒ Ｎ）、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、１９９４年２月、第３２巻第２号、ｐ．３９３‐７ エム．グリジャルバ（Ｍ．Ｇｒｉｊａｌｖａ）ら、Ｈｅａｒｔ、第８９巻、２００３年、ｐ．２６３‐２６８ ウィッテンデーレ、エム（Ｕｙｔｔｅｎｄａｅｌｅ Ｍ．）ら、Ｌｅｔｔ Ａｐｐｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、２００３年、第３７巻第５号、ｐ．３８６‐９１ ソーッコリッピ、エイ（Ｓａｕｋｋｏｒｉｉｐｉ Ａ）ら、Ｍｏｌ Ｄｉａｇｎ．、２００３年３月、第７巻第１号、ｐ．９‐１５ ツァナカキ、ジー（Ｔｚａｎａｋａｋｉ Ｇ）ら、ＦＥＭＳ Ｉｍｍｕｎｌ Ｍｅｄ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、２００３年１０月２４日、第３９巻第１号、ｐ．３１‐６ ハルトマン、ゲー（Ｈａｒｔｍａｎｎ Ｇ）ら、ドイツ医師会誌（Ｄｅｕｔｓｃｈｅｓ Ａｅｒｚｔｅｂｌａｔｔ）、Ｊｇ ９８／１５：Ａ９８１−Ａ９８５、２００１年 「Ｅｐｉｇｅｎｅｔｉｃｓ ｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ：Ｅａｒｌｙ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｒｉｓｋ Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ」、Ａｎｎａｌｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、第９８３巻、ムーケシュ フェルマ（Ｍｕｋｅｓｈ Ｖｅｒｍａ）編、ＩＳＢＮ １−５７３３１−４３１−５ ベック、エス（Ｂｅｃｋ Ｓ）、オレク、エイ（Ｏｌｅｋ Ａ）、ウォルター、ジェイ（Ｗａｌｔｅｒ Ｊ）、「Ｆｒｏｍ ｇｅｎｏｍｉｃｓ ｔｏ ｅｐｉｇｅｎｏｍｉｃｓ：ａ ｌｏｆｔｉｅｒ ｖｉｅｗ ｏｆ ｌｉｆｅ」、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１９９９年１２月、第１７巻第１２号、ｐ．１１４４ クロス、エスエイチ（Ｃｒｏｓｓ ＳＨ）、チャールトン、ジェイエイ（Ｃｈａｒｌｔｏｎ ＪＡ）、ナン、エックス（Ｎａｎ Ｘ）、バード、エイピー（Ｂｉｒｄ ＡＰ）、「Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ＣｐＧ ｉｓｌａｎｄｓ ｕｓｉｎｇ ａ ｍｅｔｈｙｌａｔｅｄ ＤＮＡ ｂｉｎｄｉｎｇ ｃｏｌｕｍｎ」、Ｎａｔ Ｇｅｎｅｔ．、１９９４年３月、第６号第３号、ｐ．２３６−４４

従って、本発明の目的は、特に感染患者由来の、真核生物ＤＮＡを大量に含有する検査試料から、原核生物ＤＮＡの分離および濃縮のうち少なくともいずれか一方を実施する方法を提供することである。

本発明によれば、上記課題は非メチル化ＣｐＧモチーフに結合するタンパク質により達成され、前記タンパク質は野生型のＣＰＧＢタンパク質と２５〜３５％、特に約２７．６％の相同性を有し、野生型ＣＰＧＢタンパク質に対して最大限で結合部位の長さまで短縮されたものである。

ヒトＣＰＧＢタンパク質（ブー（Ｖｏｏ）ら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．、２０００年３月、第２０巻第６号、ｐ．２１０８−２１）を、以降本明細書中では野生型ＣＰＧＢ（またはＣＰＧｂＰ６５６）と呼ぶ。本発明のタンパク質を以降本明細書中ではＣＰＧｂＰ１８１と呼ぶ。特許文献２に記載の、野生型ＣＰＧＢタンパク質の短縮型バリアントであり本発明のタンパク質の基礎となったタンパク質を、以降本明細書中ではＣＰＧｂＰ２４１と呼ぶ。

本発明について、図面を参照しながら以下に説明する。

野生型ＣＰＧＢタンパク質であるＣＰＧｂＰ６５６は、原核生物ＤＮＡの非メチル化ＣｐＧモチーフに結合することにより、タンパク質‐ＤＮＡ複合体を形成する。この複合体
を、例えば担体に結合させてもよいし、結合するようにしてもよく、そうすることによってＤＮＡの分離および濃縮のうち少なくともいずれか一方が実施可能である。ここで、本発明は、野生型ＣＰＧＢタンパク質（６５６アミノ酸からなるＣＰＧｂＰ６５６）よりも短く、野生型ＣＰＧＢタンパク質と２５〜３５％、特に約２７．６％の相同性を示すタンパク質が、野生型ＣＰＧＢタンパク質や８０％以上の相同性を有するそのバリアントよりも、原核生物ＤＮＡの非メチル化ＣｐＧモチーフに対し高い結合性を有するという驚くべき発見に基づくものである。そのような短縮型タンパク質の例は、１８１アミノ酸のＣＰＧｂＰ１８１である。

原核生物ＤＮＡは、例えば非メチル化ＣｐＧモチーフの存在という点で真核生物ＤＮＡとは異なっている（非特許文献８）。本発明は、真核生物ＤＮＡと原核生物ＤＮＡとでＣｐＧモチーフの割合が異なっているという発見に基づいている。原核生物ＤＮＡでは、ＣｐＧモチーフが真核生物ＤＮＡに比べて２０倍過剰に存在するが、真核生物ＤＮＡはそのようなモチーフを、例えばがん細胞やプロモーター領域において一時的にしか含まない（非特許文献８）。原核生物ＤＮＡではこれらのモチーフはメチル化されていないが、真核生物ＤＮＡではそのほとんどがメチル化されており、このことにより両者の識別性がさらに高まっている。非メチル化ＣｐＧモチーフとは、原核生物ゲノムまたはその断片の中の、メチル化されていないデオキシシチジル酸‐デオキシグアニル酸ジヌクレオチドである。

本発明はさらに、本発明のタンパク質が非メチル化ＣｐＧモチーフに特異的に結合するという発見に基づく。本発明のタンパク質の特異的結合性は、原核生物ＤＮＡを結合し、続いて、例えば大多数の真核生物ＤＮＡを含む試料から原核生物ＤＮＡを濃縮、分離、および単離するために利用される。

用語「非メチル化ＣｐＧモチーフを含むＤＮＡ」とは、真核生物ＤＮＡおよび原核生物ＤＮＡのいずれをも意味する。前記ＤＮＡは精製かつ再溶解されていてもよいし（例えば組織から単離された非メチル化ＤＮＡ）、元の供給源（例えば、血液、血清、気管吸引物、尿、気管支肺洗浄物、鼻スミア物、皮膚スミア物、穿刺液などの体液など）の中に直接存在していてもよい。

好適な実施形態によれば、非メチル化ＣｐＧモチーフを含むＤＮＡは原核生物ＤＮＡ、特に細菌ＤＮＡである。

本発明の意味における用語「相同性」とは、２つのタンパク質の配列の一致の度合いに関するものである。例えば、６０％の相同性とは、それらの配列中の１００個のアミノ酸部位のうち６０個が一致していることを意味する。本発明のタンパク質を特徴付けるために用いられる用語「短縮型」とは、本発明のタンパク質（例えば、ＣＰＧｂＰ１８１）のアミノ酸配列の長さが、野生型のＣＰＧＢタンパク質（ＣＰＧｂＰ６５６）のアミノ酸配列の長さよりも短いことを意味する。野生型タンパク質配列はそのＮ末端およびＣ末端において短縮される（図１）。最大限短縮化されると、該タンパク質のＤＮＡ結合部位に相当する。

本発明で使用されるタンパク質は、分子量が例えば約１９，９５９ダルトン（天然型）または２１，４４４ダルトン（プラスミドｐＱＥ６０内）である。別の好適な実施形態では、本発明のタンパク質の等電点は約１０．０９（天然型タンパク質）または１０．１５（プラスミドｐＱＥ６０内）である。本発明で使用される特に好適なタンパク質は、配列番号２または図１に示すアミノ酸配列を有する。このタンパク質は、原核生物ＤＮＡの非メチル化ＣｐＧモチーフに対して特に良好な結合性を有する。

特許文献２に記載のタンパク質（ＣＰＧｂＰ２４１）は、野生型ＣＰＧＢタンパク質（ＣＰＧｂＰ６５６）の短縮型バリアントであり、本発明で用いられるタンパク質（例えばＣＰＧｂＰ１８１）の基礎の役割を果たしたものであるが、長さは２４１アミノ酸であり、分子量は約３３，６５０ダルトン（天然型）または２８，１３８ダルトン（プラスミドｐＱＥ６０内）であり、等電点は９．８９（天然型）または９．８８（プラスミドｐＱＥ６０内）である。そのｃＤＮＡ配列およびアミノ酸配列を図１および図２に示す。

野生型ＣＰＧＢタンパク質は長さが６５６アミノ酸であり、１３５個の正に荷電した残基と９４個の負に荷電した残基とを有し、分子量は約７５，６８４ダルトンで、等電点は８．１５である。そのｃＤＮＡ配列およびアミノ酸配列を図１に示す。

本発明で使用される配列番号２のタンパク質ＣＰＧｂＰ１８１と、特許文献２に記載のタンパク質（ＣＰＧｂＰ２４１）との比較を、図１および図２に示す。

本発明で使用されるタンパク質は、対応するｃＤＮＡ配列をプラスミドにクローニングして大腸菌で発現させることにより生産されることが好ましい。本発明のタンパク質を発現する大腸菌株は、２００４年２月１６日にドイツ微生物・培養生物保存機関（Ｄｅｕｔｓｃｈｅ Ｓａｍｍｌｕｎｇ ｆｕｅｒ Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ ｕｎｄ Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ）に番号ＤＳＭ１６２２９として寄託されている。別例として、当技術分野で知られたその他の製造法を適用することも可能である。プラスミドｐＱＥ９の使用は可能な例を表すものであり、その他の任意の適切なプラスミドがベクターとして有用である。大腸菌における発現もまた単に１実施例にすぎない。その他の原核生物系および真核生物系における発現ならびに化学合成もしくは酵素的合成または天然供給源（例えば植物のタバコなど）からの精製は、タンパク質を抽出するために可能な別の実施形態である。該タンパク質は、実験室規模で（例えばエルレンマイヤーフラスコで）生産してもよいし産業規模で（例えば発酵槽で）生産してもよい。例えば、本発明のタンパク質は、同タンパク質の先端または末端に導入されたヒスチジンタグ（Ｈｉｓタグ）を適切なニッケル含有マトリクスに結合させることによって精製することも可能であり、これは当技術分野で周知の方法である。

精製のさらなる可能性としては、適切なマトリクス（カラム、ゲル、ビーズなど）を介した精製を可能にする任意の種類の融合タンパク質がありうる。その他の形態のタグは、ストレプトアビジンタグ、Ｍｙｃタグなどの融合ペプチド／融合タンパク質でありうる。

本発明により使用されるタンパク質の好適な形態は天然型であるが、変性型も非メチル化ＣｐＧモチーフを結合するのに適している。本発明の意味における「変性型」とは、天然状態で見られる二次構造以外の二次構造として理解される。

本発明により使用されるタンパク質の天然型または変性型は、例示的実施形態である。本発明は、タンパク質のｉｎ ｖｉｔｒｏ合成ならびにその他の任意の化学修飾または酵素的修飾、例えばジスルフィド架橋の導入、グリコシル化、リン酸化、アシル化、アミノ酸交換ならびにタンパク質その他の分子との融合などを含む。そのような修飾は、例えば組換え、発現、１つまたは複数のアミノ酸の化学修飾もしくは酵素的修飾のうち少なくともいずれか１つにより達成可能である。

本発明で使用されるタンパク質は様々な利点を有している。同タンパク質は、野生型ＣＰＧＢタンパク質または８０％以上の相同性を有するそのバリアントよりも、非メチル化ＣｐＧモチーフを介した原核生物ＤＮＡの結合において好都合である。このことにより、原核生物ＤＮＡと真核生物ＤＮＡとの混合物から原核生物ＤＮＡを特異的に分離および／または濃縮することが可能となる。最終的には、病原体の迅速かつ簡単な検出ならびに病
原性細菌による感染症の早期診断が可能となる。逆に言えば、本発明は、患者の体液、特に血液中に細菌またはその切断産物が非生理的に存在している臨床状態について、精製するという意味で微生物ＤＮＡを除去するために使用することも可能である。このことは、細菌およびその切断産物、例えば細菌ＤＮＡなどが、患者に対して有害な種々の生物学的作用の原因であることが良く実証されていることからみても、一層妥当なことである。

本発明で使用されるタンパク質が原核生物ＤＮＡの非メチル化ＣｐＧモチーフに良好に結合しうることから、本発明は、原核生物ＤＮＡの分離および濃縮のうち少なくともいずれか一方を行う方法に関し、該方法は、
（ａ）溶液中に存在する少なくとも１つの原核生物ＤＮＡを、原核生物ＤＮＡに特異的に結合し、野生型のＣＧＰＢタンパク質と２５％〜３５％の相同性を有するタンパク質と接触させることによって、タンパク質‐ＤＮＡ複合体を形成する工程と、
（ｂ）前記複合体を分離する工程と
からなる。

ＤＮＡは精製されて再溶解されていてもよいし、元の供給源（例えば、血液、血清、気管吸引物、尿、気管支肺洗浄物、鼻スミア物、皮膚スミア物、穿刺液など）の中に直接存在していてもよい。

分離は、ＤＮＡ‐タンパク質複合体またはＤＮＡ‐ポリペプチド複合体を分離、単離もしくは濃縮するための、当技術分野の技術者に周知の種々の方法により実施することが可能である。実施に際しては、試料溶液からＤＮＡを分離および／または濃縮するために、ＤＮＡ結合タンパク質を担体に固定化する（または固定化されている）方法を使用することが好ましいであろう。

好適な実施形態によれば、分離の次に、前記複合体中の本発明のタンパク質からＤＮＡを分離する工程が続く。この工程は、例えば、当技術分野の技術者に周知の従来のＤＮＡ精製法により実施可能である。最も簡単な例では、媒体／緩衝液のｐＨ値または塩濃度を変化させる（例えば塩濃度を１Ｍ ＮａＣｌにする）ことにより、あるいはカオトロピック試薬を添加することなど、すなわちタンパク質‐ＤＮＡ複合体を分離させる適切なパラメータにより、実施される。そのような方法は当技術分野の技術者に周知である。

さらに好適な実施形態によれば、本発明のタンパク質は担体に連結される。この実施形態は、原核生物ＤＮＡを濃縮するための特に簡単な方法に該当するが、それは、例えば溶液からチャージされた状態の担体を物理的に（例えば遠心分離により）除去することにより、溶液からの分離が特に容易であるからである。

原核生物ＤＮＡの溶液については、任意の適切な溶媒が基本的に想定される。しかしながら、本方法は、種々の生体分子、特に様々な種類のＤＮＡを含有する溶液からの原核生物ＤＮＡの濃縮に特に有用である。好ましくは本発明は、原核生物ＤＮＡと真核生物ＤＮＡとの混合物から原核生物ＤＮＡまたはウイルスＤＮＡを分離および濃縮する方法に関する。その実施に際しては、例えば、体液中に存在する原核生物ＤＮＡが、本発明のタンパク質への特異的結合により真核生物ＤＮＡから分離され、濃縮される。こうして濃縮された原核生物ＤＮＡにより、分子生物学的方法を利用した病原性原核生物の検出が容易になり、病原性病原体による疾患の診断にも貢献しうる。

特に、ＤＮＡ結合タンパク質が担体の表面に固定化される実施形態は、体液、好ましくは血液から原核生物ＤＮＡを吸着するのに適している。さらに、この手法により、血液その他の体液中に存在する微生物ＤＮＡを該体液から除去することも可能となる。次いで、それ自体患者に重篤な炎症反応を引き起こしうる微生物ＤＮＡについてこのように精製さ
れた体液（例えば全血、血清または髄液）を、体内に戻すこともできる。この原理は、本発明のタンパク質の特異的結合性を利用した、精製という意味での生理学的液体からの原核生物ＤＮＡの除去についても使用することができる。

ＤＮＡの非メチル化ＣｐＧモチーフに関する結合能および結合効率を増大させるために、本発明は、該タンパク質の結合能および結合効率を強化してメチル化ＤＮＡと非メチル化ＤＮＡとの混合物からの非メチル化ＤＮＡの分離および／または濃縮を改善する方法を提供する。

本発明によれば、このことは本発明のタンパク質をマトリクスに間接的に連結させることにより達成される。この方法については図９および図１０を参照しながら後述する。

非メチル化ＣｐＧモチーフを含むＤＮＡに関するＣｐＧｂＰ１８１タンパク質の結合能および結合効率を強化するために、本発明は、該タンパク質の、スペーサーを介したマトリクスへの間接的結合に関する。スペーサーを介してマトリクスにタンパク質を連結することにより、ＣｐＧｂＰ１８１タンパク質の可動性および空いている結合部位の数が増大する。従って、結合能および結合効率が増大する。このことにより、使用するタンパク質量の低減もさらに可能となる。

本発明の意味におけるスペーサーとは、マトリクスと本発明で使用されるタンパク質、例えばＣｐＧｂＰ１８１タンパク質との間に空間的距離をもたらす、短い鎖状の分子として理解される。そのようなスペーサーは、例えばアフィニティ（親和性）クロマトグラフィまたはタンパク質の固定化などの当技術分野において周知である。そのような鎖状の分子は、Ｃ原子およびＨ原子ならびに任意選択でヘテロ原子（例えばＮ）から構成される。これらの鎖状分子はＣ原子を基本とする個々の鎖要素（例えばＣＨ_２）と、存在しうるものとしてはヘテロ原子を基本とする鎖要素（例えばＮＨ）とで構成される。特に、スペーサーは４〜２０個、好ましくは７〜１０個の鎖要素を含んでなる。特に好ましいスペーサーはジアミンヘキサン（ＮＨ_２（ＣＨ_２）_６‐ＮＨ_２）由来のものである。本発明の意味における抗体は、スペーサーとしてはみなされない。

本発明の意味におけるマトリクスとは、スペーサーおよび本発明のタンパク質のための担体として機能する物質のことである。担体材料は、例えば、セファロース、パールセルロース（Ｐｅｒｌｚｅｌｌｕｌｏｓｅ）、シリカ、または当技術分野で周知の類似の物質であってよい。

本発明の意味における体液は、ヒトなどの哺乳動物の体を起源とする全ての液体、特に、血液、尿、髄液、胸膜液、心嚢液、腹膜液ならびに滑液などの病原体が見出されうる液体として理解される。ヒト血液に関する本発明の記載は限定的なものではなく、単に例示的な適用としての記載にすぎない。

病原性細菌とは、好ましくは敗血症の病原体として理解されるが、感染症についてのその他の任意の病原性細菌としても理解される。病原性細菌は、共生病原体、すなわち正常な生物集団の一部であって患者由来の試験試料中にも見出される場合があるが臨床上何ら問題のない病原体とは異なるものであってよい。

感染した体液から全ＤＮＡを単離するとき、宿主ＤＮＡと病原体ＤＮＡとの比率は多くの場合わずか１：１０^−６〜１：１０^−８またはそれ未満であろう。原核生物ＤＮＡが本発明のタンパク質に特異的に結合することにより、本発明の方法で１指数関数単位以上の濃縮が可能となる。

本発明で用いられるタンパク質は直接的または間接的に担体に連結させることができる。連結の種類は担体および担体材料によって変わる。適切な担体には、特に、メンブレン、微小粒子および樹脂、または類似のアフィニティ（親和性）マトリクス用の材料が挙げられる。本発明のタンパク質を結合させるため、ならびに（材料の種類に応じて）そのような結合を実施するために適した材料は、当業者には周知である。間接的な連結については、本発明のタンパク質またはペプチドに対する特異抗体が適しており、例えば、該抗体を周知の方法で担体に結合させる。

本発明の方法の１つの応用は、原核生物ＤＮＡを濃縮することにある。別の応用は、例えばマトリクスに固定化されている本発明のタンパク質に原核生物ＤＮＡを結合させることにより、真核生物ＤＮＡと原核生物ＤＮＡとの混合物から原核生物ＤＮＡを分離することにある。生体自身のＤＮＡと原核生物ＤＮＡとの混合物を、適切な手段によりアフィニティマトリクスと接触させると、その間に原核生物ＤＮＡは固定化されたタンパク質に結合するが、真核生物ＤＮＡは例えば分離カラムを通過し、別途回収することができる。アフィニティマトリクスには、例えば、アガロースなどのポリマー多糖、その他のバイオポリマー、合成ポリマー、または多孔質ガラスなどのケイ酸骨格を有する担体もしくはその他本発明のＤＮＡ結合タンパク質が固定化される固体担体もしくは可撓性担体が挙げられる。真核生物ＤＮＡから原核生物ＤＮＡを分離した後、アフィニティマトリクスを適切な試薬ですすぎ、原核生物ＤＮＡが結合している結合タンパク質をマトリクスから分離するか、あるいは原核生物ＤＮＡを結合タンパク質から分離するかのうち少なくともいずれかを実施してその後の処理工程に十分な量を得るようにする。

本発明の方法の別の応用は、微小粒子上に固定化されている本発明のタンパク質に原核生物ＤＮＡを結合させることにより、真核生物ＤＮＡから原核生物ＤＮＡを分離および濃縮することにある。これに関しては、本発明のＤＮＡ結合タンパク質を固定化させることが可能なあらゆる微小粒子が適用可能である。そのような微小粒子は、ラテックス、プラスチック（例えば発泡スチレン、ポリマー）、金属、または強磁性体で構成されるものであってよい。さらに、蛍光性微小粒子、例えばＬｕｍｉｎｅｘ社から入手可能な蛍光性微小粒子などを使用することもできる。微小粒子上に固定化された本発明のタンパク質に原核生物ＤＮＡを結合させた後、ろ過、遠心分離、沈殿、蛍光強度測定によるソーティング、または磁力を用いる方法などの適切な方法で、物質混合物から前記微小粒子を分離する。微小粒子から分離した後には、原核生物ＤＮＡをさらなる処理に用いることができる。

本発明の方法の別の応用は、本発明のタンパク質に原核生物ＤＮＡを結合させることにより、真核生物ＤＮＡから原核生物ＤＮＡを分離および濃縮した後、電気泳動により混合物中のその他の成分から原核生物ＤＮＡを分離することにある。

本発明の方法の別の応用は、本発明のタンパク質に原核生物ＤＮＡを結合させることにより、真核生物ＤＮＡから原核生物ＤＮＡを分離および濃縮することにある。続いて本発明のタンパク質を対応する抗体に結合させる。該抗体は、ガラス、プラスチック、シリコーン、微小粒子、メンブレンなどの固体物質または可撓性物質に結合していてもよいし、溶液状態であってもよい。原核生物ＤＮＡが本発明のタンパク質に結合し、同タンパク質が特異抗体に結合した後、当業者に周知の方法により物質混合物からの分離を実施する。

本発明の方法は、体液から原核生物ＤＮＡを除去して体液を精製するために使用することもできる。これに関しては、体液を再度体内に戻すことが可能なように、分離を体外で無菌条件下にて実施して、前記体液に含まれる原核生物ＤＮＡの除去により生体自身の免疫系が感染を除去するのを助けるようにすると好都合である。

任意の適切な化学的、機械的、または電気化学的手法が、体外で体液から原核生物ＤＮ
Ａを除去するために検討可能である。さらに、その他の体外的手法、例えば血液潅流、心肺装置またはエンドトキシン吸着器などとの併用はさらに好都合な応用である。

本発明のタンパク質は、原核生物ＤＮＡの検出に使用することもできる。この場合、原核生物ＤＮＡの濃縮に続いて前記原核生物ＤＮＡを増幅する工程となり、該工程にはあらゆる増幅方法（ＰＣＲ、ＬＣＲ、ＬＭ−ＰＣＲなど）が適している。

本発明の方法、特に上述の実施形態では、非メチル化状態のＣｐＧモチーフに富む原核生物ＤＮＡを、そのような構造に特異的親和性を有するタンパク質に特異的に結合させることにより、感染した宿主の全ＤＮＡから原核生物ＤＮＡを首尾よく濃縮し、よって体液中の病原体ＤＮＡの検出感度を著しく向上させる。

特異的結合タンパク質を用いて真核生物ＤＮＡから原核生物ＤＮＡを分離する可能性は、全ＤＮＡを単離する周知の方法よりも時間を要するものではない。しかしながら、その後の検出はＰＣＲだけで実施可能である。多くの場合、ネスティドＰＣＲは必要なく、診断の時間をかなり節約することが可能である。

生理学的体液中の原核生物ＤＮＡを除去するために本発明の方法を使用することについてはすでに上述した。本発明の意味における除去とは、原核生物ＤＮＡの量を低減させることを意味する。このような原核生物ＤＮＡを低減させるという可能性はまた、環境技術、廃水管理および空調技術における本発明のタンパク質の利用をも可能にする。

本発明はさらに、非メチル化状態のゲノムＤＮＡとメチル化状態のゲノムＤＮＡとの混合物から非メチル化状態のゲノムＤＮＡを分離かつ濃縮する方法にも関する。メチル化状態のゲノムＤＮＡは、マトリクスに連結させたＣｐＧｂＰ１８１タンパク質に非メチル化状態のゲノムＤＮＡを結合させることによって分離される。この手法は実質的に、メチル化状態のゲノムＤＮＡのメチル化パターンの簡易検査を提供することになり、特定のメチル化パターンを有する疾患の診断を可能にする。

さらに、本発明は上述の方法のうちの１つにより原核生物ＤＮＡを濃縮するためのキットに関し、前記キットは少なくとも１つの本発明のタンパク質と、任意選択で、前記方法を実施するのに適したさらなる試薬とを備える。

本発明のタンパク質に加えて、前記キットは、標準的な条件下で特定の原核生物のゲノムＤＮＡを増幅するのに適した少なくとも一組のプライマーを備えていてもよい。

本発明について、実施例を参照しながら以下に詳細に説明するが、該実施例は本発明を限定するものではない。

本発明のタンパク質の調製
完全長ＣＰＧｂＰタンパク質のＤＮＡ配列を用いて、ＣｐＧに結合する短縮型タンパク質ＣＰＧｂＰ１８１をコードする短いＤＮＡ断片を増幅するプライマー１（ＧＧＡＴＣＣＧＧＴＧＧＡＧＧＧＣＧＣＡＡＧＡＧＧＣＣＴＧ（順方向）、配列番号３）およびプライマー２（ＡＡＧＣＴＴＡＧＡＧＧＴＡＧＧＴＣＣＴＣＡＴ‐ＣＴＧＡＧ（逆方向）、配列番号４）を構築した。該ＤＮＡ断片を、制限酵素ＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで切断済みのｐＱＥ９ベクター（キアゲン（Ｑｉａｇｅｎ））にライゲーションした。ｐＱＥ９ベクター内では、６×ＨｉｓタグをコードするＤＮＡ断片が５’末端に融合したオープンリーディングフレーム（ｐＱＥ９［６ＨｉｓＣＰＧｂＰ１８１］）が形成される。融合タ
ンパク質６Ｈｉｓ‐ＣＰＧｂＰ１８１をコードする全アミノ酸配列を本明細書に後述するが、太字で示されている部分はＣＰＧｂＰ１８１ペプチドを表し、イタリック体で示されている部分はプラスミドｐＱＥ９由来の融合された外来アミノ酸を示している。

プラスミドｐＱＥ９［６ＨｉｓＣＰＧｂＰ１８１］で、発現用大腸菌株Ｍ１５［ｐＲＥＰ４］（キアゲン）を形質転換した。このクローンを本明細書では以降Ｍ１５［ｐＣＰＧｂＰ１８１］と呼び、発現されるタンパク質をｒＣＰＧｂＰ１８１と呼ぶ。ｒＣＰＧｂＰ１８１タンパク質の発現は以下のプロトコールに従って行われる。すなわち、発現菌株Ｍ１５［ｐＣＰＧｂＰ１８１］のコロニーを、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンと２５μｇ／ｍｌのカナマイシンとを含む２ｍｌのルリア（Ｌｕｒｉａ）培地で３７℃にて振蕩しながら一晩増殖させる。次いで、この前培養物を、同濃度の抗生物質を含有する２００ｍｌの予熱済み栄養培地に移す。３７℃にて振蕩しながら３時間増殖させた後、ＩＰＴＧを添加して発現を誘導し、インキュベーションを５時間継続する。その後、遠心分離により細菌を分離し、沈殿物を５ｍｌの０．２Ｍトリス緩衝液（ｐＨ７．５）に再懸濁させる。この細菌を、氷冷槽中で５×１分間超音波処理する。遠心分離後、沈殿物を１０ｍｌの０．２Ｍトリス、０．２Ｍ尿素（ｐＨ７．５）に再懸濁させて、１５分間振蕩する。遠心分離を実施した後、残存沈殿物を取り出して０．２Ｍトリス、６Ｍ塩酸グアニジン、０．００１Ｍジチオエリスリトール（ＤＴＥ）、０．０２Ｍイミダゾール中に入れて懸濁させる。この封入体を撹拌しながら室温で１時間溶解させる。遠心分離後、上清中には粗製タンパク質が存在し、３ｍｌのＮｉ‐アガロースカラムに直接かけることができる。その後の工程は４℃〜６℃の冷却チャンバ内で実施しなければならない。最初に、０．２Ｍトリス、６Ｍ塩酸グアニジン、０．００１Ｍジチオエリスリトール（ＤＴＥ）、０．０２Ｍイミダゾールの緩衝液（ｐＨ７．５）を用いて、吸光度がゼロの線に達するまでカラムを洗浄する。この時点からは、異なる方法でｒＣＰＧｂＰ１８１を得ることが可能である。すなわち、方法１：６Ｍ塩酸グアニジンまたは６Ｍ尿素に溶解して変性タンパク質として得る。方法２：生理学的濃度の緩衝液に溶解した天然型タンパク質として得る。方法２の場合は収率が低くなる。

方法１による精製（変性型）：
０．２Ｍトリス、６Ｍ塩酸グアニジン、０．００１Ｍジチオエリスリトール（ＤＴＥ）、０．０２Ｍイミダゾールの緩衝液（ｐＨ７．５）中で、０‐０．５Ｍイミダゾールのグラジエントにより、Ｎｉ‐ＮＴＡアガロースからｒＣＰＧｂＰ１８１タンパク質を塩基性物として溶出させる。実施の際には、ｒＣＰＧｂＰ１８１は０．２‐０．３Ｍイミダゾールでカラムから脱離する。こうして得られたタンパク質を、０．２Ｍトリス、６Ｍ尿素、０．００１Ｍジチオエリスリトール（ＤＴＥ）（ｐＨ７．５）に対して透析し、凍結させる。生理学的緩衝液に対して透析すると、精製ｒＣＰＧｂＰ１８１が沈殿する。

方法２による精製（天然型）：
本方法では、ｒＣＰＧｂＰ１８１が結合したＮｉ‐ＮＴＡアガロース上で塩酸グアニジンの濃度を６Ｍから０Ｍまでのグラジエントにより変化させる。このときのベースは０．２Ｍトリス、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、０．００１Ｍジチオエリスリトール（ＤＴＥ）、０．０２Ｍイミダゾールの緩衝液（ｐＨ７．５）とする。この場合、流速は０．５ｍｌ／分を選択した。続いて、０．２Ｍトリス、０．５Ｍ ＮａＣｌ、０．００１Ｍジチオエリスリトール（ＤＴＥ）の緩衝液（ｐＨ７．５）をベースとして０‐０．５Ｍイミダゾールのグラジエントで溶出させた。この場合も、結合したタンパク質のかなりの比率（２０％）が０．２‐０．３Ｍイミダゾールで溶出した。この天然型ｒＣＰＧｂＰ１８１溶出物はＰＢＳ中での透析後も上記緩衝液に溶解状態のままであった。しかしながら、これらの条件ではＮｉ‐ＮＴＡアガロースに結合したｒＣＰＧｂＰ１８１の約８０％がカラムに残り、その後は方法１の変性条件でしか抽出できないことが欠点である。このことは、使用した方法２の収率が、わずか２０％の、生理学的緩衝液に可溶な天然型ｒＣＰＧｂＰ１８１で
あったことを意味している。

ネスティドＰＣＲによる病原体の検出
コロニー形成単位で１ｍｌあたり１０^３の化膿連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ
ｐｙｏｇｅｎｅｓ）を病原体として含む、ヘパリン処理した新鮮なヒト血液を、病原体の検出のために使用した。体液から全ＤＮＡを単離するための市販のキットを用いて、製造業者の指示書の変法によりＤＮＡ結合マトリクスに吸着させることでＤＮＡを単離した。このために、プロテイナーゼＫおよびＳＤＳを含む２００μｌの全体溶解緩衝液を、エッペンドルフチューブに入った１００μｌの感染血液に添加する。この混合物を３７℃で３０分間インキュベートし、次いで９５℃で２０分間加熱する。冷却後、２０μｇのムタノリシンを添加して３７℃でさらに６０分間インキュベートする。遠心分離後、該混合物を、ＤＮＡ結合マトリクスを備えた遠心分離カラムに供し、製造業者の指示書に従ってＤＮＡを精製する。精製されたＤＮＡは、最終容量１００μｌの０．０１Ｍトリス緩衝液（ｐＨ７．５）、または等容量の製造業者提供の溶出用緩衝液に含める。病原体の検出用に、ストレプトリシンＯ遺伝子（ｓｌｏ）を特定するためのプライマーを選択した。

１．ＰＣＲ（４６５ｂｐ断片の増幅）
前方向プライマー１：５’‐ＡＧＣＡＴＡＣＡＡＧＣＡＡＡＴＴＴＴＴＴＡＣＡＣＣＧ
逆方向プライマー２：５’‐ＧＴＴＣＴＧＴＴＡＴＴＧＡＣＡＣＣＣＧＣＡＡＴＴ
プライマー濃度 １ｍｇ／ｍｌ
出発材料：５μｌ 単離ＤＮＡ
０．５μｌ 前方向プライマー１
０．５μｌ 逆方向プライマー２
１４μｌ 蒸留水
Ｒｅａｄｙ ｔｏ ｇｏ（商標）キット（アマシャム・ファルマシア）で総量２５μｌ
反応：
９５℃で５分間
４０サイクル（９５℃で３０秒、５１℃で３０秒、７２℃で３分、７２℃で７分を１回）。

ヒト血液中の連鎖球菌ＤＮＡの最初のＰＣＲについて図１に示す（出発材料２５μｌのうち各１０μｌを分離に供した。１）５μｌの鋳型ＤＮＡを含むＰＣＲ出発材料、２）１：１０に希釈した５μｌの鋳型を含む出発材料、３）陽性対照：血液由来の真核生物ＤＮＡを含まない、０．２μｌの鋳型連鎖球菌ＤＮＡ、ＳＴ）分子量マーカー）。
結果：最初の一次ＰＣＲでは陽性反応は得られていない。従って、続いて第２のＰＣＲ（ネスティドＰＣＲ）を実施した。

２．ＰＣＲ（ネスティド）（上記ｓｌｏ断片中の３４８ｂｐ断片の増幅）
前方向プライマー３：５’‐ＣＣＴＴＣＣＴＡＡＴＡＡＴＣＣＴＧＣＧＧＡＴＧＴ
逆方向プライマー４：５’‐ＣＴＧＡＡＧＧＴＡＧＣＡＴＴＡＧＴＣＴＴＴＧＡＴＡＡＣＧ
プライマー濃度 １ｍｇ／ｍｌ
出発材料：ＰＣＲ１（図１の試料１）から５μｌ
０．５μｌ 前方向プライマー１
０．５μｌ 逆方向プライマー２
１４μｌ 蒸留水
Ｒｅａｄｙ ｔｏ ｇｏ（商標）キット（アマシャム・ファルマシア）で総量２５μｌ
反応：
９５℃で５分間
４０サイクル（９５℃で３０秒、５４℃で３０秒、７２℃で３分、７２℃で７分を１回）。

図４は、図３の一次ＰＣＲの出発材料からのＰＣＲ産物を鋳型として用いたネスティドＰＣＲを示している。試料は図３の試料に対応している。
結果：ネスティドＰＣＲでは、血液１００μｌあたり連鎖球菌の細胞１００個の濃度で所望のｓｌｏＤＮＡ断片が増幅された（試料１）。１回目のＰＣＲ（図３）における出発材料５μｌについては、鋳型約５〜１０個に相当する。１：１０希釈の場合（試料２）、感度が限界となっている（鋳型０．５〜１個）。

これらの実験から、血液中の病原体のＰＣＲによる検出に成功するには、少なくとも１〜５ｍｌの血液から全ＤＮＡを単離する必要があることが示される。しかしながら、その全ＤＮＡの濃度は直接ＰＣＲに使用するには高すぎる。

細菌ＤＮＡを直接検出することによる、増幅工程を伴わないその他の病原体特異的核酸の検出、例えばＤＮＡハイブリダイゼーションによる検出も感度が非常に低いが、これは細菌ＤＮＡに対してヒトＤＮＡが非常に過剰であることが主な原因である。さらに、ＤＮＡ分析の際の競合的過程ならびに細菌ＤＮＡ量が少ないことが、定性分析および定量分析の障害であると考えられる。一般的なＤＮＡ単離方法では体液の全ＤＮＡが濃縮されて宿主ＤＮＡと微生物ＤＮＡとの比が１：１０^−６〜１：１０^−８になりうる。この差から、体液中の微生物ＤＮＡを検出する難しさが容易に理解される。

ｒＣＰＧｂＰ１８１の結合能の測定
ゲル遅延度アッセイで、変性型および天然型ｒＣＰＧｂＰ１８１タンパク質の、メチル化および非メチル化状態のＣｐＧモチーフ含有ＤＮＡ分子に対する結合について調べた。大腸菌プラスミドｐＵＣ１８に溶血性Ｃ群連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｄｙｓｇａｌａｃｔｉａｅ ｓｕｂｓｐ．ｅｑｕｉｓｉｍｉｌｉｓ）のＭタンパク質遺伝子部分を挿入して試験ＤＮＡとして使用した（ガイヤー（Ｇｅｙｅｒ）ら、ＦＥＭＳ Ｉｍｍｕｎｏ．Ｍｅｄ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．第２６巻、ｐ．１１−２４、１９９９年）。プラスミド調製物を分け、半分をニュー・イングランド・バイオラボ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ）のＣｐＧメチラーゼキットでメチル化した。調製物をいずれもｒＣＰＧｂＰ１８１（天然型または変性型）と混合し、アガロースゲルで電気泳動により分離した。結果を図５および図６に示す。ｒＣＰＧｂＰ１８１の天然型および変性型のいずれも非メチル化状態のプラスミドＤＮＡに高い親和性を示し、このことから非メチル化状態のＣｐＧに富むＤＮＡに対する選択的結合性が確認される。

図５のゲル遅延度アッセイの説明：５μｌ（７２ｎｇ）のメチル化ｐＵＣ１８ｅｍｍ ＤＮＡと１μｌ（１４２ｎｇ）の非メチル化ｐＵＣ１８ｅｍｍ ＤＮＡをそれぞれ５μｌ（０．５μｇ）の天然型ｒＣＰＧｂＰ１８１と混合し、次の緩衝液、すなわち０．０１Ｍトリス、０．０８Ｍ ＮａＣｌ、０．００１Ｍ ＥＤＴＡ、０．００５Ｍ ＤＴＥ、５％グリセリン、ｐＨ７．８で容量を３５μｌとした。２０℃で３０分間インキュベートした後、この混合物を１．５％アガロースで電気泳動により分離した。メチル化ＤＮＡをレーン１および３に、非メチル化ＤＮＡをレーン２および４に載せた。レーン１および２ではＤＮＡを天然型ｒＣＰＧｂＰ１８１と混合した。レーン２は、非メチル化ｐＵＣ１８ｅｍｍがｒＣＰＧｂＰ１８１と相互作用することを示しているが、これに対し、ｒＣＰＧｂＰ１８１はメチル化ｐＵＣ１８ｅｍｍとの相互作用を示さなかった（レーン１）。レーン４および５はｒＣＰＧｂＰ１８１を添加していない対照としてのプラスミドである。

変性型ｒＣＰＧｂＰ１８１とともにインキュベートした後の非メチル化ｐＵＣ１８ｅｍｍおよびメチル化ｐＵＣ１８ｅｍｍに関する、図６のゲル遅延度アッセイの説明。濃度は図５の濃度と対応する。メチル化ＤＮＡをレーン１および３に、非メチル化ＤＮＡをレーン２および４に載せた。レーン１〜４において、ＤＮＡを２種類の異なるバッチの変性型ｒＣＰＧｂＰ１８１と混合した。レーン２および４は、非メチル化ｐＵＣ１８ｅｍｍが変性型ｒＣＰＧｂＰ１８１とも相互作用することを示しているが、ｒＣＰＧｂＰ１８１はメチル化ｐＵＣ１８ｅｍｍとの相互作用は示さなかった（レーン１および３）。レーン５はｒＣＰＧｂＰ１８１を添加していない対照としてのｐＵＣ１８ｅｍｍである。

子ウシ胸腺ＤＮＡおよび細菌ＤＮＡの混合物の、固定化されたＣＰＧｂＰ１８１への結合および分離
精製ＣＰＧｂＰ１８１を、キャンビアッソ（Ｃａｍｂｉａｓｓｏ）らのプロトコール（キャンビアッソ、シー（Ｃａｍｂｉａｓｓｏ、Ｃ）ら、Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ
第１２巻、ｐ．２７３−２７８、１９７５年）に従ってグルタルアルデヒドを用いてアミノヘキシルセファロース（アマシャム・バイオサイエンシズ（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ））に連結させた。固定化タンパク質の濃度はセファロース１ｍｌあたり０．３ｍｇとした。３００μｌのセファロースを、ＤＮＡもタンパク質も吸着しないがセファロースを担持するガラス材料を含んだ遠心ろ過チューブに入れた。

２００ｎｇの子ウシ胸腺ＤＮＡおよび２５ｎｇのｐＵＣ１８ｅｍｍを１００μｌの２０ｍＭトリス‐ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５）に溶解し、上記のように調製したカラムに供した。各工程の後、液体をそれぞれ新たなエッペンドルフチューブに入れてエッペンドルフ遠心分離機にて１４，０００ＲＰＭで０．５分間遠心分離した。こうして２段階でＮａＣｌ濃度を０Ｍから１Ｍに増大させた。各チューブに１０μｌの４Ｍ酢酸（ｐＨ４．５）および２５０μｌの無水エタノールを添加し、混合し、１４，０００ＲＰＭで１５分間遠心分離することによってＤＮＡ沈殿を実施した。その後、上清を廃棄して沈殿物を３００μｌの７０％エタノールで洗浄した。上清を廃棄した後、残留物を真空遠心分離機で５分間乾燥させ、次いで１５μｌの蒸留水（ＰＣＲ好適品）に溶解した。一方では、各試料１０μｌについて２５４ｎｍでの吸光度を測定し（図７）、他方では、各試料３μｌを用いてｐＵＣ１８用のシーケンスプライマーでＰＣＲを実施した（図８）。

結果（図７、８）は、真核生物の子ウシ胸腺ＤＮＡが最初に０〜０．１Ｍ ＮａＣｌでカラムから洗い出され、原核生物ＤＮＡ（ｐＵＣ１８ｅｍｍ）が０．３Ｍ ＮａＣｌのフラクションに溶出されたことを示している。このことは、真核生物ＤＮＡのＣＰＧｂＰ１８１に対する親和性が低く、従って各ＤＮＡのフラクションが明確に分離されたことを示している。

スペーサーを介してＣＰＧｂＰ１８１タンパク質をマトリクスに間接的に結合させることによる、同タンパク質の結合性の増強
結合性について調べるために、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）およびヒトＤＮＡのＤＮＡ混合物から、ＣＮＢｒセファロースに直接連結させたＣＰＧｂＰ１８１タンパク質、またはジアミノヘキシル・スペーサー（ＡＨ）を介してセファロース（以下のＡＨセファロース）に間接的に連結させたＣＰＧｂＰ１８１タンパク質を用いて、原核生物ＤＮＡを濃縮した。

最初に、ＡＨセファロースにグルタルアルデヒドを添加して室温で１５分間インキュベートした。次に、ＡＨセファロースを０．１Ｍ Ｎａ_２ＨＰＯ_４で洗浄した。次いで、０
．２４ｍｇのＣＰＧｂＰ１８１タンパク質を該マトリクス上に載置した。室温で２時間インキュベートすることによりＣＰＧｂＰ１８１タンパク質をＡＨセファロースに結合させた。過剰なＣＰＧｂＰ１８１タンパク質を取り除いた。

続いて０．１Ｍ Ｎａ_２ＨＰＯ_４でＣＰＧｂＰ１８１‐ＡＨセファロースを洗浄して０．１Ｍグリシンを添加した後、ＣＰＧｂＰ１８１‐ＡＨセファロースを室温で２時間インキュベートして空いている結合部位を飽和させた。次いで、ＣＰＧｂＰ１８１‐ＡＨセファロースを再度０．１Ｍ Ｎａ_２ＨＰＯ_４で洗浄した。シッフ塩基を還元し結合を安定化させるために、ＣＰＧｂＰ１８１‐ＡＨセファロースを水素化ホウ素ナトリウムと混合して室温で１時間インキュベートした。

次に、ＣＰＧｂＰ１８１‐ＡＨセファロースを０．１Ｍ Ｎａ_２ＨＰＯ_４で洗浄した。

ＣＰＧｂＰ１８１‐ＡＨセファロースの４℃における保存性は２０％エタノールを添加することにより達成される。次に、ＣＰＧｂＰ１８１‐ＡＨセファロースをカラムに分配した。ＣＰＧｂＰ１８１‐ＡＨセファロースで作製したカラムを次にトリス緩衝液で洗浄し、非メチル化ＣｐＧモチーフを含むＤＮＡの分離／濃縮に利用可能とした。

２）ＤＮＡ混合物の濃縮後の、原核生物ＤＮＡの溶出およびＰＣＲによる原核生物ＤＮＡの濃度測定
ＤＮＡ混合物を、各々３３０ｎｇのヒトＤＮＡと１５０ｎｇの原核生物ＤＮＡ（黄色ブドウ球菌ＤＮＡ）とから構成されるものとした。このＤＮＡ混合物を、ＣＮＢｒセファロースまたはＡＨセファロースで作製されたカラムにそれぞれ載置し、室温で１分間インキュベートした。次いで、カラムを遠心分離して１００μｌのトリス緩衝液（１０μＭ、ｐＨ７）で洗浄した。この洗浄および遠心分離の工程を５回繰り返した。

上清を注意深く取り除いてから、１００μｌの溶出用緩衝液（１０μＭトリス緩衝液、０．５Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ７）を各々カラムに添加して遠心分離した。溶出工程を５回繰り返した。次いで、各試料の個々のフラクションに１０μｌの３Ｍ酢酸ナトリウムと２５０μｌのエタノールを加えてから混合して遠心分離（１５，０００ｇで１５分間）することにより沈殿を生じさせた。上清を注意深く廃棄し、ペレットを１μｌのエタノール（７０％）で洗浄して１５，０００ｇで遠心分離した。次に再度上清を取り除き、ペレットを真空遠心分離機で乾燥させて３０μｌのＤＥＰＣ水に溶解した。各５μｌをＰＣＲ検出に使用した。

ＰＣＲには１６Ｓ‐ＲＮＡ遺伝子に対するユニバーサルプライマーを使用した。ＰＣＲを実施した後、個々のフラクション各１５μｌを２％アガロースに載置した。

図９（ＣｐＧ１８１タンパク質をＣＮＢｒセファロースへ直接結合）および図１０（スペーサー（ＡＨ）を介してＣｐＧ１８１タンパク質をセファロースに間接的に結合）は、個々のフラクションについてのＰＣＲの結果を示している。ＡＨスペーサーの使用により、より多くの原核生物ＤＮＡが濃縮されたことが明らかである（フラクション１、溶出フラクション）。このような結合性の向上は、本発明の方法において有用である。

ＣＰＧｂＰ１８１のアミノ酸配列（太字）を野生型のＣＰＧＢタンパク質（ＣＰＧｂＰ６５６）およびＣＰＧｂＰ２４１（イタリック体）と比較して示す図。 完全長のＣＰＧ結合タンパク質ＣＰＧｂＰ６５６の、ＤＮＡ配列およびアミノ酸配列への翻訳を示す図。短縮型のＣＰＧ結合ペプチドＣＰＧｂＰ２４１（太字）およびＣＰＧｂＰ１８１（イタリック体）も示されている。 ヒト血液中の連鎖球菌のＰＣＲについて示す図。 図３の一次ＰＣＲのＰＣＲ産物を鋳型として用いたネスティドＰＣＲについて示す図。 ゲル遅延度アッセイについて示す図。 別のゲル遅延度アッセイについて示す図。 ｒＣｐＧ１８１セファロースによる子ウシ胸腺ＤＮＡおよびｐＵＣ１８ｅｍｍの溶出について示す図。 ２５４ｎｍの吸光度の測定によりフラクション中の溶出ＤＮＡを測定し、ＮａＣｌグラジエントの関数として示す図。 黄色ブドウ球菌およびヒトのＤＮＡのＤＮＡ混合物から、ＣＮＢｒセファロースに連結させたＣｐＧｂＰ１８１タンパク質を用いて原核生物ＤＮＡを濃縮した後の、ＰＣＲの結果を示す図。 黄色ブドウ球菌およびヒトのＤＮＡのＤＮＡ混合物から、ＡＨセファロースに連結させたＣｐＧｂＰ１８１タンパク質を用いて原核生物ＤＮＡを濃縮した後の、ＰＣＲの結果を示す図。

Claims (28)

1. ｉｎ ｖｉｔｒｏで原核生物ＤＮＡの分離または濃縮のうち少なくともいずれか一方を行う方法であって、
   （ａ）溶液中に存在する少なくとも１つの原核生物ＤＮＡを、原核生物ＤＮＡに特異的に結合し、かつ配列番号２のアミノ酸配列からなるタンパク質とｉｎ ｖｉｔｒｏで接触させることによって、タンパク質‐ＤＮＡ複合体を形成する工程と、
   （ｂ）前記複合体を分離する工程と
   からなる方法。
2. 前記タンパク質が非メチル化ＣｐＧモチーフを認識可能であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
3. 前記分離工程の後に複合体のタンパク質からＤＮＡを分離する工程が続くことを特徴とする、請求項１または２に記載の方法。
4. 前記タンパク質が担体に結合していることを特徴とする、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
5. 前記タンパク質が担体に直接結合していることを特徴とする、請求項４に記載の方法。
6. 前記タンパク質が同タンパク質に対する抗体を介して担体に結合していることを特徴とする、請求項４に記載の方法。
7. 前記タンパク質がスペーサーを介して担体に結合していることを特徴とする、請求項４に記載の方法。
8. スペーサーとしてジアミノヘキサン残基が使用されることを特徴とする、請求項７に記載の方法。
9. 担体が、マトリクス、微小粒子、またはメンブレンとして提供される、請求項４〜７のいずれか１項に記載の方法。
10. マトリクスとしてセファロースが用いられる、請求項９に記載の方法。
11. 分離工程が前記タンパク質に対する抗体または抗血清を用いて実施される、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
12. 分離が電気泳動によって実施される、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
13. 前記タンパク質が非メチル化ＣｐＧモチーフに対する抗体または抗血清である、請求項５〜１２のいずれか１項に記載の方法。
14. 溶液が真核生物ＤＮＡおよび原核生物ＤＮＡの混合物を含む、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
15. 原核生物ＤＮＡは細菌ＤＮＡである、請求項１４に記載の方法。
16. 溶液が体液または体液に由来する溶液であり、特に全血、血清、血漿、全血からの細胞調製物、尿、髄液、胸膜液、心嚢液、腹膜液、滑液ならびに気管支肺洗浄物である、請求項１４または１５に記載の方法。
17. 分離工程が前記ＤＮＡ‐タンパク質複合体をろ過するフィルタを用いて実施される、請求項１３〜１６のいずれか１項に記載の方法。
18. タンパク質がフィルタのマトリクスに固定化されている、請求項１７に記載の方法。
19. 環境技術、水管理および廃水管理ならびに空調技術において使用するための請求項１〜１８のいずれか１項に記載の方法。
20. 工程（ｂ）の後で工程（ｃ）において原核生物ＤＮＡが増幅される、請求項１〜１８のいずれか１項に記載の方法。
21. （ａ）タンパク質‐ＤＮＡ複合体から原核生物ＤＮＡを単離する工程と、
    （ｂ）該二本鎖ＤＮＡを変性させる工程と、
    （ｃ）個々のＤＮＡ鎖を相補的プライマーとハイブリダイズさせる工程と、
    （ｄ）ポリメラーゼ反応により二本鎖の断片を生成させる工程と、
    （ｅ）上記工程を所望の程度に増幅されるまで繰り返す工程と
    からなる請求項２０に記載の方法。
22. （ａ）単離した原核生物ＤＮＡ配列をベクターにクローニングする工程と、
    （ｂ）上記ベクターで適当な宿主細胞を形質転換する工程と、
    （ｃ）上記形質転換細胞を培養する工程と、
    （ｄ）上記細胞からベクターを単離する工程と、
    （ｅ）ＤＮＡを単離する工程と
    からなる請求項２１に記載の方法。
23. 請求項１〜２２のいずれか１項に記載の方法を用いて原核生物ＤＮＡの分離または濃縮のうち少なくともいずれか一方を行うためのキット。
24. 請求項１〜２２のいずれか１項に記載の方法を用いて、１組または数組の特異的プライマーを使用して原核生物ＤＮＡを検出するための試験キット。
25. ｉｎ ｖｉｔｒｏで非メチル化状態のゲノムＤＮＡとメチル化状態のゲノムＤＮＡとの混合物から非メチル化状態のゲノムＤＮＡの分離または濃縮のうち少なくともいずれか一方を行う方法であって、
    （ａ）溶液中に存在する少なくとも一つの非メチル化状態のゲノムＤＮＡを、該非メチル化状態のゲノムＤＮＡと特異的に結合し、かつ配列番号２のアミノ酸配列からなるタンパク質とｉｎ ｖｉｔｒｏで接触させることによって、タンパク質−ＤＮＡ複合体を形成する工程と、
    （ｂ）前記複合体を分離する工程と
    からなる方法。
26. ｉｎ ｖｉｔｒｏで非メチル化状態のＤＮＡとメチル化状態のＤＮＡとの混合物から非メチル化状態のＤＮＡの分離または濃縮のうち少なくともいずれか一方を行う方法であって、
    （ａ）溶液中に存在する少なくとも一つの非メチル化状態のＤＮＡを、該非メチル化状態のＤＮＡと特異的に結合し、かつ配列番号２のアミノ酸配列からなるタンパク質とｉｎ
    ｖｉｔｒｏで接触させることによって、タンパク質−ＤＮＡ複合体を形成する工程と、
    （ｂ）前記複合体を分離する工程と
    からなる方法。
27. 疾患における特定のメチル化パターンを検出するための請求項２５または請求項２６に記載の方法。
28. 前記疾患はがんである請求項２７に記載の方法。