JP4847539B2 - グルコースイソメラーゼ変異体の使用 - Google Patents
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Description
［発明の分野］
本発明は、分子生物学に関する発明であり、具体的には、活性が改善された又は活性および熱安定性の両方が改善された組換え型グルコースイソメラーゼ、組換え技術を用いたその調製方法、並びにその使用に関する。
本発明は、分子生物学に関する発明であり、具体的には、活性が改善された又は活性および熱安定性の両方が改善された組換え型グルコースイソメラーゼ、組換え技術を用いたその調製方法、並びにその使用に関する。
［発明の背景］
グルコースイソメラーゼ(E.C.5.3.1.5またはキシロースイソメラーゼ)は、ペントースリン酸経路において鍵となる酵素であり、最も重要な産業的な酵素の一つである（Kaneko et al., Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry 2000, 64:940-947）。バイオエネルギー産業において、人々は、バイオエタノールを商業的に生産するためにセルロースおよびヘミセルロースの分解経路において前記酵素を他の鍵となる酵素と共に使用することを試している。例えば、キシランからキシルロース-5-リン酸への酵素的な分解の経路は、次のとおりである： キシランはβ-1,4-キシラナーゼの存在下でキシロ―オリゴサッカライドへと転換され、キシロ―オリゴサッカライドはさらにβ-キシロシダーゼでキシロースへと転換される。次に、キシロースはキシルロースへとグルコースイソメラーゼ(キシロースイソメラーゼ)によって転換され、キシルロースはキシルロース-5-リン酸へとβ-キシルロキナーゼによって転換される。
環境汚染の圧力および油が不足する状況下で、世界の多くの国家（例えば、ブラジル、米国およびカナダ）は、サトウキビまたはトウモロコシを燃料エタノールを生産するための出発原料として用いている。中国も、バイオエタノールを生産するためにトウモロコシまたは他の作物を用いている。バイオマスは世界で非常に豊富なので、様々な国々の科学者は、バイオエタノールを産業的に生産するためにセルロースおよびヘミセルロースが豊富な農業廃棄物を使用する道を探索している。グルコースイソメラーゼは、ヘミセルロースの生分解において鍵となる酵素である。高い活性で又は高い活性および熱安定性の両方で、グルコースイソメラーゼは、バイオエタノールの産業的な生産を促進するためにバイオエタノール生産のコストを効率的に減らすことができる。
グルコースイソメラーゼ(E.C.5.3.1.5またはキシロースイソメラーゼ)は、ペントースリン酸経路において鍵となる酵素であり、最も重要な産業的な酵素の一つである（Kaneko et al., Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry 2000, 64:940-947）。バイオエネルギー産業において、人々は、バイオエタノールを商業的に生産するためにセルロースおよびヘミセルロースの分解経路において前記酵素を他の鍵となる酵素と共に使用することを試している。例えば、キシランからキシルロース-5-リン酸への酵素的な分解の経路は、次のとおりである： キシランはβ-1,4-キシラナーゼの存在下でキシロ―オリゴサッカライドへと転換され、キシロ―オリゴサッカライドはさらにβ-キシロシダーゼでキシロースへと転換される。次に、キシロースはキシルロースへとグルコースイソメラーゼ(キシロースイソメラーゼ)によって転換され、キシルロースはキシルロース-5-リン酸へとβ-キシルロキナーゼによって転換される。
環境汚染の圧力および油が不足する状況下で、世界の多くの国家（例えば、ブラジル、米国およびカナダ）は、サトウキビまたはトウモロコシを燃料エタノールを生産するための出発原料として用いている。中国も、バイオエタノールを生産するためにトウモロコシまたは他の作物を用いている。バイオマスは世界で非常に豊富なので、様々な国々の科学者は、バイオエタノールを産業的に生産するためにセルロースおよびヘミセルロースが豊富な農業廃棄物を使用する道を探索している。グルコースイソメラーゼは、ヘミセルロースの生分解において鍵となる酵素である。高い活性で又は高い活性および熱安定性の両方で、グルコースイソメラーゼは、バイオエタノールの産業的な生産を促進するためにバイオエタノール生産のコストを効率的に減らすことができる。
世界中の科学者は、好熱性細菌からの耐熱性で高度に活性なグルコースイソメラーゼの同定、並びにタンパク質工学を介したグルコースイソメラーゼの生産に従事してきた。J.G. Zeikusおよび彼の協力者は、好熱性細菌（例えば、Thermoanaerobacterium saccharolyticum およびThermotoga neapolitana）の耐熱性のグルコースイソメラーゼを分離し、研究を行った（Lee et al., Journal of General Microbiology, 139:1227-1234, 1993; Vieille et al., Methods in Enzymology, 330:215-24, 2001; Lee et al., Journal of General Microbiology, 139:1241-1243, 1993; Scriprapundh et al., Protein Engineering, 13:259-265, 2000; Scriprapundh et al., Protein Engineering, 16:683-690, 2003; Zeikus et al., 米国特許第5,656,497号）。これらの及び他の生物資源からの耐熱性グルコースイソメラーゼの熱安定性は望まれるものにたいし大きいにもかかわらず、その活性は低く、産業的な適用に応用されない。従って、高活性または高活性および熱安定性を有しているグルコースイソメラーゼが望ましい。
［発明の概要］
本発明の発明者は、Thermoanaerobacterium saccharolyticumのグルコースイソメラーゼの遺伝子およびタンパク質工学によって得られた変異体系列の活性を研究している。本発明は、D-キシロースからD-キシルロースへ高温で転換する改善された触媒活性を有するグルコースイソメラーゼ変異体の使用を提供する。
本発明の発明者は、Thermoanaerobacterium saccharolyticumのグルコースイソメラーゼの遺伝子およびタンパク質工学によって得られた変異体系列の活性を研究している。本発明は、D-キシロースからD-キシルロースへ高温で転換する改善された触媒活性を有するグルコースイソメラーゼ変異体の使用を提供する。
本発明の発明者は、部位特異的突然変異誘発で変異をT. saccharolyticumグルコースイソメラーゼ遺伝子へ導入し、MacConkey寒天上でスクリーニング後に高度に活性または高度に活性且つ耐熱性のグルコースイソメラーゼ変異体の系列を得た。より具体的には、グルコースイソメラーゼ変異体を生産するために使用されたモレキュラーバイオテクノロジーには次のものが含まれる： 野生型のグルコースイソメラーゼ遺伝子を保持しているプラスミドの作出；変異部位および変異アミノ酸の設計；適切なプライマーの設計；野生型のグルコースイソメラーゼ遺伝子又はその誘導体を鋳型として用いるＤＮＡ断片のPCR増幅；ＤＮＡ断片の組立；変異を含んでいる完全長グルコースイソメラーゼ遺伝子のPCR増幅；変異体遺伝子の適切なベクターへのクローニング；遺伝子を含んでいるベクターでの適切な宿主細胞の形質転換；所望のグルコースイソメラーゼ変異体を保持しているクローンに関する形質転換体のスクリーニング；陽性のクローンからのプラスミドDNAの単離；および変異を検証するためのDNAシークエンシングの実施。最終的に、変異型イソメラーゼの活性が、D-キシロースを基質として用いて評価された。野生型のものより高い触媒活性を有する変異型イソメラーゼが選択された。選択されたイソメラーゼは、D-キシロースからD-キシルロースへの転換、ヘミセルロースの分解およびバイオエタノールの産生に使用される。
本発明の新規のグルコースイソメラーゼの調製に関して、適切なベクターには、原核生物の発現ベクター pGEMT-Easy, pRSETおよびpET21；真核生物の発現ベクター pYD1およびpYES2/GS；クローニングベクターpUC18/19およびpBluescript-SKが含まれるが、これらに限定されない。
本発明のグルコースイソメラーゼ変異体の調製に関して、変異させたグルコースイソメラーゼ遺伝子は、当該技術分野において既知の任意の他の技術を用いて、原核生物もしくは真核生物の細胞内で発現させることができる又は原核生物もしくは真核生物の細胞外で発現させることができる。
本発明の新規グルコースイソメラーゼの調製に関して、宿主細胞は原核生物もしくは真核生物の細胞であってもよい。原核細胞には、E. coli, Bacillus subtilis, Bacillus brevis, Bacillus megaterium (例えば、B. megaterium BP931), T. saccharolyticum and Streptomyces (例えば、S. diastaticus M1033)が含まれるが、これらに限定されない。真核生物細胞には、Saccharomyces cerevisiae および Pichia pastoris (例えば、P. pastoris GS115/9891)が含まれるが、これらに限定されない。
参照配列として配列表の配列2を用いる、本発明によるグルコースイソメラーゼ変異体は、少なくとも一つの変異, 又は少なくとも二つの変異, 又は少なくとも 三つの変異, 又は少なくとも四つの変異, 又は少なくとも五つの変異, 又は少なくとも六つの変異又は少なくとも七つの変異を87, 139, 182, 187, 217, 260, 276 および 299から選択されたポジションに具備する。また、グルコースイソメラーゼ変異体は、D-キシロースを基質として用いて、キシルロース産生の反応において野生型よりも少なくとも50%高い触媒活性を有する。グルコースイソメラーゼ変異体は、ヘミセルロースの分解およびバイオエタノールの産生に使用できる。
参照配列として配列表の配列2を用い、好ましくは、ポジション87でのアミノ酸フェニルアラニン(Phe)はメチオニン (Met), または ロイシン (Leu)に変異される；ポジション139でのトリプトファン(Trp)はセリン (Ser), またはリジン (Lys), またはシステイン (Cys), またはイソロイシン (Ile), またはスレオニン(Thr), またはアスパラギン (Asn), またはアスパラギン酸(Asp)に変異される；ポジション182でのアルギニン(Arg)はアラニン (Ala), またはプロリン (Pro), またはセリン (Ser), またはイソロイシン (Ile), またはスレオニン(Thr), またはバリン (Val)に変異される；ポジション187でのバリン(Val)はグリシン (Gly), またはアラニン (Ala), またはプロリン (Pro)に変異される；ポジション217でのバリン(Val)はアルギニン (Arg), またはグリシン (Gly)に変異される；ポジション260でのアスパラギン酸(Asp)はグルタミン酸(Glu), またはアラニン (Ala)に変異される；ポジション276でのフェニルアラニン (Phe)はグリシン (Gly), またはスレオニン(Thr)に変異される；および/またはポジション299でのスレオニン(Thr)はイソロイシン (Ile), またはチロシン (Tyr), またはシステイン (Cys), またはメチオニン (Met), またはグルタミン酸 (Glu)に変異される。
より好ましくは、本発明の変異体のアミノ酸配列は、配列表に記載される配列5〜配列40(配列番号:5〜配列番号:40に対応する)の何れか一つを含む。
最も好ましくは、本発明のグルコースイソメラーゼ変異体は、表 2の変異型アミノ酸配列を含む。本発明で得られたグルコースイソメラーゼ変異体は、高い触媒活性 および 熱安定性の両方を有する。例えば、七変異の変異体MGI4-34は、野生型のものよりも305.9%高い活性を有し、80゜Cで19.2 時間の加熱処理後に最初の触媒活性の50% 以上をなおも有している。別の七変異の変異体MGI4-35は、野生型のものよりも296.3%高い活性を有し、80゜Cで24 時間の加熱処理後に最初の触媒活性の50% 以上をなおも有している。
本発明のグルコースイソメラーゼ変異体は、非精製の粗製の酵素形態に、又は部分的に精製された酵素形態に、又は完全に精製された酵素調製物に使用できる。必要に応じて、グルコースイソメラーゼ変異体は、公知の固定化法を用いて固定化酵素または固定化された細胞として調製できる。発現されたグルコースイソメラーゼ変異体を有するベクターで、キシロースの代謝を加速するために、細菌、例えば、Klebsiella oxytocaおよびZymomonas mobilis、Saccharomyces、または他の宿主、例えば、Pichia pastorisを形質転換できる。具体的には、グルコースイソメラーゼ変異体の発現細菌には、バイオエタノール発酵のための天然の又は操作された細菌（例えば、Klebsiella oxytocaおよびZymomonas mobilis）；バイオエタノール発酵のための天然の又は操作された酵母；バイオエタノール発酵のための天然の又は操作されたPichia pastorisが含まれる。
定 義
本明細書中に使用される「野生型」の用語は、Thermoanaerobacterium saccharolyticum ATCC 49915からのグルコースイソメラーゼを意味し、そのDNA 配列は配列 1として配列表に記載され、そのアミノ酸配列は配列 2として配列表に記載される。本発明の野生型グルコースイソメラーゼのDNA 配列は、公開された同じ種のグルコースイソメラーゼの二つのヌクレオチドと異なっている（Lee et al., Journal of General Microbiology, 139:1227-1234, 1993; GenBank L09699）；すなわち、ポジション241-242での本発明の野生型グルコースイソメラーゼのヌクレオチドはGCであり、ポジション 81でのアラニン (Ala)をコードするが；GenBank L09699の対応するヌクレオチドはCGであり、ポジション 81でアルギニン (Arg)をコードする。
本明細書中に使用される「野生型」の用語は、Thermoanaerobacterium saccharolyticum ATCC 49915からのグルコースイソメラーゼを意味し、そのDNA 配列は配列 1として配列表に記載され、そのアミノ酸配列は配列 2として配列表に記載される。本発明の野生型グルコースイソメラーゼのDNA 配列は、公開された同じ種のグルコースイソメラーゼの二つのヌクレオチドと異なっている（Lee et al., Journal of General Microbiology, 139:1227-1234, 1993; GenBank L09699）；すなわち、ポジション241-242での本発明の野生型グルコースイソメラーゼのヌクレオチドはGCであり、ポジション 81でのアラニン (Ala)をコードするが；GenBank L09699の対応するヌクレオチドはCGであり、ポジション 81でアルギニン (Arg)をコードする。
本明細書中に使用される「参照配列」の用語は、それがDNA 配列である場合には配列表の配列 1；又はそれがアミノ酸配列である場合には配列表の配列 2を意味する。参照配列およびグルコースイソメラーゼ変異体の配列のアラインメントは、手動で又はコンピュータで行うことができる（例えば、コンピュータソフトウェアCLUSTALW, AMAS, DIALIGN,などを用いて）。
本明細書中に使用される「ポジション」または「ポジションx」（ここでxは数字である）の用語は、本発明のグルコースイソメラーゼ変異体と野生型グルコースイソメラーゼとの間のアラインメントが最大の相同性に達するときの対応する参照配列の変異体配列のヌクレオチドまたはアミノ酸のポジションを意味する。
本明細書中に使用される「グルコースイソメラーゼ変異体」の用語は、配列表の配列 2を参照配列として用いて、最低一つの変異をポジション 87, ポジション 139, ポジション 182, ポジション 187, ポジション 217, ポジション 260, ポジション 276 またはポジション 299に含有し、D-キシロースを基質として用いて、キシルロースの反応において野生型グルコースイソメラーゼよりも少なくとも50%高い触媒活性を有する酵素を意味する。従って、本発明において、グルコースイソメラーゼ変異体には、配列表の配列 4と同じである、又は配列 4の保存された置換である、又は一つ又は幾つかのアミノ酸の付加, または削除を有する配列 4である、又はアミノ末端の又はカルボキシ末端の削除を有する配列 4である、または配列 4の部分的な又は完全な反復を含むアミノ酸配列を有する変異体が含まれる。
IUPAC命名法およびアミノ酸の略語に関するシンボルが、本発明に使用された（European Journal of Biochemistry, 138:9-37, 1984）。
［好適な態様の記載］
以下に記載される例は、本発明の説明のためのみであり、本発明を限定すると認定されることを意図していない。以下の例において、条件が特定されていない場合、従来の実施または製造者の指示/プロトコールにしたがう。
以下に記載される例は、本発明の説明のためのみであり、本発明を限定すると認定されることを意図していない。以下の例において、条件が特定されていない場合、従来の実施または製造者の指示/プロトコールにしたがう。
例1
野生型グルコースイソメラーゼの増幅およびpGEMT-TSの作出
プライマー T1 および T2 (表 1)を、GenBank L09699の配列に基づいて設計し、T. saccharolyticum ATCC 49915 (ATCC, USA)からの野生型グルコースイソメラーゼ遺伝子を増幅するために使用した。
野生型グルコースイソメラーゼの増幅およびpGEMT-TSの作出
プライマー T1 および T2 (表 1)を、GenBank L09699の配列に基づいて設計し、T. saccharolyticum ATCC 49915 (ATCC, USA)からの野生型グルコースイソメラーゼ遺伝子を増幅するために使用した。
増幅条件は次のとおりであった： 20 mM Tris-HCl (pH 8.8), 10 mM KCl, 10 mM (NH4)2SO4, 2 mM MgSO4, 0.1% トリトン X-100, 50 μM dATP, 50 μM dTTP, 50 μM dCTP, 50 μM dGTP, 400 nM プライマー T1, 400 nM プライマー T2, 1.5 U Taq ＤＮＡポリメラーゼ (プロメガ, USA), 白金耳量のT. saccharolyticumのコロニー。そして、総容積を、無菌の蒸留水で50 μlに調製した。
反応に対するPCR増幅プログラムは、95℃, 3 min; 次に40 サイクルの95℃, 50 sec, 50℃, 30 sec, 72℃, 1 min; および 最終的に 72℃, 10 minであった。増幅されたPCR産物（約 1.5 kbの長さ）を、ベクターpGEMT-EasyにライゲーションしてpGEMT-TSを作出した。pGEMT-TSを、シークエンスして野生型グルコースイソメラーゼのDNA配列を配列表の配列 1と、対応するアミノ酸配列を配列表の配列 2と決定した。野生型グルコースイソメラーゼのDNA 配列は、公開された同じ種(GenBank L09699)のグルコースイソメラーゼのDNA 配列と異なっており、ポジション241-242での本発明の野生型グルコースイソメラーゼのヌクレオチドはGCであり、アミノ酸ポジション 81でのアラニン (Ala)をコードするが；GenBank L09699の対応するヌクレオチドはCGであり、ポジション 81でアルギニン (Arg)をコードする。
例2
野生型グルコースイソメラーゼのTrp139の部位特異的突然変異誘発
部位特異的突然変異誘発を、Ho等（Ho et al., Gene 77:51-59, 1989 および White et al., PCR protocol: current methods and applications. Totowa, N.J.: Humana Press 1993）に記載のとおり行った。
野生型グルコースイソメラーゼのTrp139の部位特異的突然変異誘発
部位特異的突然変異誘発を、Ho等（Ho et al., Gene 77:51-59, 1989 および White et al., PCR protocol: current methods and applications. Totowa, N.J.: Humana Press 1993）に記載のとおり行った。
pGEMT-TS (例 1)を鋳型として、野生型グルコースイソメラーゼのポジション 139のTrp (W)を、プライマー 139FF および 139FR (表 1) および 普遍的なプライマー T1 および T2(例 1)を用いるPCR 増幅によってPhe (F)に変異させて、グルコースイソメラーゼ 変異体 MGI-W139Fを作出した。
断片 T1FRを、プライマーペアT1 および 139FRを用いて増幅した。断片FFT2を、プライマーペア139FFおよびT2を用いて増幅した。増幅条件は次のとおりであった： 20 mM Tris-HCl (pH 8.8), 10 mM KCl, 10 mM (NH4)2SO4, 2 mM MgSO4, 0.1% トリトン X-100, 50 μM dATP, 50 μM dTTP, 50 μM dCTP, 50 μM dGTP, 400 nM プライマー T1 および 400 nM プライマー 139FR (断片 T1FRに対して) または400 nM プライマー T2 および 400 nM プライマー 139FF (断片 FFT2に対して), 1.5 UのPfu ＤＮＡポリメラーゼ (プロメガ, USA), 20 ng pGEMT-TS。そして、総容積を、無菌の蒸留水で50 μlに調製した。反応に対するPCR増幅プログラムは、95℃, 3 min; 次に35 サイクルの95℃, 50 sec, 52℃, 30 sec, 72℃, 3 min; および 最終的に 72℃, 5 minであった。PCR産物（断片T1FRおよび断片FFT2）を、1%アガロースゲルで分離し、QIAquick Gel Extraction Kit (QIAGEN, German)を用いて回収した。完全長のグルコースイソメラーゼ遺伝子を次の条件で組立てた： 20 mM Tris-HCl (pH 8.8), 10 mM KCl, 10 mM (NH4)2SO4, 2 mM MgSO4, 0.1% トリトン X-100, 50 μM dATP, 50 μM dTTP, 50 μM dCTP, 50 μM dGTP, 400 nM プライマー T1 および 400 nM プライマー T2, 1.5 UのPfu ＤＮＡポリメラーゼ, 20 ngの断片T1FR および 20 ngの断片FFT2。そして、総容積を、無菌の蒸留水で50 μlに調製した。反応に対するPCR増幅プログラムは、95℃, 3 min; 次に35 サイクルの95℃, 50 sec, 52℃, 30 sec, 72℃, 3 min; および最終的に 72℃, 5 minであった。完全長の変異体MGI-W139Fを、1%アガロースゲルで分離し、QIAquick Gel Extraction Kit (QIAGEN, German)を用いて回収した。MGI-W139FをpGEMT-Easyにライゲーション後に作出したプラスミドpGEMT-MGI-W139Fでコンピテント E. coli HB101を形質転換し、形質転換体を1% D-キシロース および 50 mg/L アンピシリンを含有している1% MacConkey プレートでグルコースイソメラーゼ活性で選抜した。プラスミドpGEMT-MGI-W139F DNAを、陽性クローンから単離し、シークエンスした。MGI-W139Fのアミノ酸配列は、配列表の配列 5として示され、その比活性は表 2に示される。
例3
グルコースイソメラーゼのArg182の部位特異的突然変異誘発
部位特異的突然変異誘発を、Ho等（Ho et al., Gene 77:51-59, 1989 および White et al., PCR protocol: current methods and applications. Totowa, N.J.: Humana Press 1993）に記載のとおり行った。
グルコースイソメラーゼのArg182の部位特異的突然変異誘発
部位特異的突然変異誘発を、Ho等（Ho et al., Gene 77:51-59, 1989 および White et al., PCR protocol: current methods and applications. Totowa, N.J.: Humana Press 1993）に記載のとおり行った。
pGEMT-TS (例 1)を鋳型として用いて、野生型グルコースイソメラーゼのポジション 182のArg (R)を、部位特異的プライマー 182AF および182AR (表 1) およびユニバーサルプライマーT1 および T2(例 1)でのPCR 増幅によってAla (A)に変異させて、グルコースイソメラーゼ 変異体 MGI-R182Aを作出した。
断片 T1ARを、プライマーペアT1 および 182ARを用いて増幅した。断片AFT2を、プライマーペア182AFおよびT2を用いて増幅した。増幅条件は次のとおりであった： 20 mM Tris-HCl (pH 8.8), 10 mM KCl, 10 mM (NH4)2SO4, 2 mM MgSO4, 0.1% トリトン X-100, 50 μM dATP, 50 μM dTTP, 50 μM dCTP, 50 μM dGTP, 400 nM プライマー T1 および 400 nM プライマー 182ARまたは400 nM プライマー T2 および 400 nM プライマー 182AF, 1.5 UのPfu ＤＮＡポリメラーゼ, 20 ng pGEMT-TS。そして、総容積を、無菌の蒸留水で50 μlに調製した。反応に対するPCR増幅プログラムは、95℃, 3 min; 次に35 サイクルの95℃, 50 sec, 52℃, 30 sec, 72℃, 3 min; および最終的に 72℃, 5 minであった。PCR産物（断片T1ARおよび断片AFT2）を、1%アガロースゲルで分離し、QIAquick Gel Extraction Kitを用いて回収した。完全長のグルコースイソメラーゼ遺伝子を次の条件で組立てた： 20 mM Tris-HCl (pH 8.8), 10 mM KCl, 10 mM (NH4)2SO4, 2 mM MgSO4, 0.1% トリトン X-100, 50 μM dATP, 50 μM dTTP, 50 μM dCTP, 50 μM dGTP, 400 nM プライマー T1 および 400 nM プライマー T2, 1.5 UのPfu ＤＮＡポリメラーゼ, 20 ngの断片T1AR および 20 ngの断片AFT2。そして、総容積を、無菌の蒸留水で50 μlに調製した。反応に対するPCR増幅プログラムは、95℃, 3 min; 次に35 サイクルの95℃, 50 sec, 52℃, 30 sec, 72℃, 3 min; および最終的に 72℃, 5 minであった。完全長の変異体MGI-R182Aを、1%アガロースゲルで分離し、QIAquick Gel Extraction Kit (QIAGEN, German)を用いて回収した。MGI-R182AをベクターpGEMT-Easyにライゲーション後に作出したプラスミドpGEMT-MGI-R182Aでコンピテント E. coli HB101を形質転換し、形質転換体を1% D-キシロース および 50 mg/L アンピシリンを含有している1% MacConkeyプレートでグルコースイソメラーゼ活性で選抜した。プラスミドpGEMT-MGI-R182A DNAを、陽性クローンから単離し、シークエンスした。MGI-R182Aのアミノ酸配列は、配列表の配列 6として示される。
例4
グルコースイソメラーゼのPhe187の部位特異的突然変異誘発
部位特異的突然変異誘発を、Ho等（Ho et al., Gene 77:51-59, 1989 および White et al., PCR protocol: current methods and applications. Totowa, N.J.: Humana Press 1993）に記載のとおり行った。
グルコースイソメラーゼのPhe187の部位特異的突然変異誘発
部位特異的突然変異誘発を、Ho等（Ho et al., Gene 77:51-59, 1989 および White et al., PCR protocol: current methods and applications. Totowa, N.J.: Humana Press 1993）に記載のとおり行った。
pGEMT-TS (例 1)を鋳型として用いて、野生型グルコースイソメラーゼのポジション 187のPhe (F)を、部位特異的プライマー 187SF および187SR (表 1) およびユニバーサルプライマーT1 および T2(例 1)でのPCR 増幅によってSer (S)に変異させて、グルコースイソメラーゼ 変異体 MGI-F187Sを作出した。
断片 T1SR を、プライマーペアT1 および 187SR を用いて増幅した。断片 SFT2 を、プライマーペア 187SF およびT2を用いて増幅した。増幅条件は次のとおりであった： 20 mM Tris-HCl (pH 8.8), 10 mM KCl, 10 mM (NH4)2SO4, 2 mM MgSO4, 0.1% トリトン X-100, 50 μM dATP, 50 μM dTTP, 50 μM dCTP, 50 μM dGTP, 400 nM プライマー T1 および 400 nM プライマー 187SR または400 nM プライマー T2 および 400 nM プライマー 187SF, 1.5 UのPfu ＤＮＡポリメラーゼ, 20 ng pGEMT-TS。そして、総容積を、無菌の蒸留水で50 μlに調製した。反応に対するPCR増幅プログラムは、95℃, 3 min; 次に35 サイクルの95℃, 50 sec, 52℃, 30 sec, 72℃, 3 min; および最終的に 72℃, 5 minであった。PCR産物（断片T1SRおよび断片SFT2）を、1%アガロースゲルで分離し、QIAquick Gel Extraction Kitを用いて回収した。完全長のグルコースイソメラーゼ遺伝子を次の条件で組立てた： 20 mM Tris-HCl (pH 8.8), 10 mM KCl, 10 mM (NH4)2SO4, 2 mM MgSO4, 0.1% トリトン X-100, 50 μM dATP, 50 μM dTTP, 50 μM dCTP, 50 μM dGTP, 400 nM プライマー T1 および 400 nM プライマー T2, 1.5 UのPfu ＤＮＡポリメラーゼ, 20 ngの断片T1SR および 20 ngの断片SFT2。そして、総容積を、無菌の蒸留水で50 μlに調製した。反応に対するPCR増幅プログラムは、95℃, 3 min; 次に35 サイクルの95℃, 50 sec, 52℃, 30 sec, 72℃, 3 min; および最終的に 72℃, 5 minであった。完全長の変異体MGI-F187Sを、1%アガロースゲルで分離し、QIAquick Gel Extraction Kit (QIAGEN, German)を用いて回収した。MGI-F187SをベクターpGEMT-Easyにライゲーション後に作出したプラスミドpGEMT-MGI-F187Sでコンピテント E. coli HB101を形質転換し、形質転換体を1% D-キシロース および 50 mg/L アンピシリンを含有している1% MacConkeyプレートでグルコースイソメラーゼ活性で選抜した。プラスミドpGEMT-MGI-F187S DNAを、陽性クローンから単離し、シークエンスした。MGI-F187Sのアミノ酸配列は、配列表の配列 7として示される。
例5
グルコースイソメラーゼのThr299の部位特異的突然変異誘発
部位特異的突然変異誘発を、Ho等（Ho et al., Gene 77:51-59, 1989 および White et al., PCR protocol: current methods and applications. Totowa, N.J.: Humana Press 1993）に記載のとおり行った。
グルコースイソメラーゼのThr299の部位特異的突然変異誘発
部位特異的突然変異誘発を、Ho等（Ho et al., Gene 77:51-59, 1989 および White et al., PCR protocol: current methods and applications. Totowa, N.J.: Humana Press 1993）に記載のとおり行った。
pGEMT-TS (例 1)を鋳型として用いて、野生型グルコースイソメラーゼのポジション 299のThr (T)を、部位特異的プライマー 299QF および299QR (表 1) およびユニバーサルプライマーT1 および T2(例 1)でのPCR 増幅によってGln (Q)に変異させて、グルコースイソメラーゼ 変異体 MGI-T299Qを作出した。
断片 T1QR を、プライマーペアT1 および 299QR を用いて増幅した。断片 QFT2 を、プライマーペア 299QF およびT2を用いて増幅した。増幅条件は次のとおりであった： 20 mM Tris-HCl (pH 8.8), 10 mM KCl, 10 mM (NH4)2SO4, 2 mM MgSO4, 0.1% トリトン X-100, 50 μM dATP, 50 μM dTTP, 50 μM dCTP, 50 μM dGTP, 400 nM プライマー T1 および 400 nM プライマー 299QR または400 nM プライマー T2 および 400 nM プライマー 299QF, 1.5 UのPfu ＤＮＡポリメラーゼ, 20 ng pGEMT-TS。そして、総容積を、無菌の蒸留水で50 μlに調製した。反応に対するPCR増幅プログラムは、95℃, 3 min; 次に35 サイクルの95℃, 50 sec, 52℃, 30 sec, 72℃, 3 min; および最終的に 72℃, 5 minであった。PCR産物（断片T1QRおよび断片QFT2）を、1%アガロースゲルで分離し、QIAquick Gel Extraction Kitを用いて回収した。完全長のグルコースイソメラーゼ遺伝子を次の条件で組立てた： 20 mM Tris-HCl (pH 8.8), 10 mM KCl, 10 mM (NH4)2SO4, 2 mM MgSO4, 0.1% トリトン X-100, 50 μM dATP, 50 μM dTTP, 50 μM dCTP, 50 μM dGTP, 400 nM プライマー T1 および 400 nM プライマー T2, 1.5 UのPfu ＤＮＡポリメラーゼ, 20 ngの断片T1QR および 20 ngの断片QFT2。そして、総容積を、無菌の蒸留水で50 μlに調製した。反応に対するPCR増幅プログラムは、95℃, 3 min; 次に35 サイクルの95℃, 50 sec, 52℃, 30 sec, 72℃, 3 min; および最終的に 72℃, 5 minであった。完全長の変異体MGI-T299Qを、1%アガロースゲルで分離し、QIAquick Gel Extraction Kit (QIAGEN, German)を用いて回収した。MGI-T299QをベクターpGEMT-Easyにライゲーション後に作出したプラスミドpGEMT-MGI-T299Qでコンピテント E. coli HB101を形質転換し、形質転換体を1% D-キシロース および 50 mg/L アンピシリンを含有している1% MacConkeyプレートでグルコースイソメラーゼ活性で選抜した。プラスミドpGEMT-MGI-T299Q DNAを、陽性クローンから単離し、シークエンスした。MGI-T299Qのアミノ酸配列は、配列表の配列 8として示され、その比活性は表 2に示される。
例6
二つの変異を含んでいるグルコースイソメラーゼ変異体MGI-2の作出
部位特異的突然変異誘発を、Ho等（Ho et al., Gene 77:51-59, 1989 および White et al., PCR protocol: current methods and applications. Totowa, N.J.: Humana Press 1993）に記載のとおり行った。
二つの変異を含んでいるグルコースイソメラーゼ変異体MGI-2の作出
部位特異的突然変異誘発を、Ho等（Ho et al., Gene 77:51-59, 1989 および White et al., PCR protocol: current methods and applications. Totowa, N.J.: Humana Press 1993）に記載のとおり行った。
断片 T1FR および AFT2を、それぞれ例 2 および 3にしたがって増幅し、回収した。断片 FFARをプライマーペア 139FF (例 2) および 182AR (例 3)を用いて次の条件で増幅した： 20 mM Tris-HCl (pH 8.8), 10 mM KCl, 10 mM (NH4)2SO4, 2 mM MgSO4, 0.1% トリトン X-100, 50 μM dATP, 50 μM dTTP, 50 μM dCTP, 50 μM dGTP, 400 nM プライマー 139FF および 400 nM プライマー 182AR, 1.5 U Pfu ＤＮＡポリメラーゼ, 20 ng pGEMT-TS。そして、総容積を、無菌の蒸留水で50 μlに調製した。反応に対するPCR増幅プログラムは、95℃, 3 min; 次に35 サイクルの95℃, 50 sec, 52℃, 30 sec, 72℃, 3 min; および最終的に 72℃, 5 minであった。PCR産物（断片FFAR）を、1%アガロースゲルで分離し、QIAquick Gel Extraction Kit (QIAGEN, German)を用いて回収した。完全長のグルコースイソメラーゼ遺伝子を次の条件で組立てた： 20 mM Tris-HCl (pH 8.8), 10 mM KCl, 10 mM (NH4)2SO4, 2 mM MgSO4, 0.1% トリトン X-100, 50 μM dATP, 50 μM dTTP, 50 μM dCTP, 50 μM dGTP, 400 nM プライマー T1 および 400 nM プライマー T2, 1.5 UのPfu ＤＮＡポリメラーゼ, 20 ngの断片T1FR, 20 ngの断片FFAR, 20 ngの断片AFT2。そして、総容積を、無菌の蒸留水で50 μlに調製した。反応に対するPCR増幅プログラムは、95℃, 3 min; 次に35 サイクルの95℃, 50 sec, 52℃, 30 sec, 72℃, 3 min; および最終的に 72℃, 5 minであった。完全長の変異体MGI-2を、1%アガロースゲルで分離し、QIAquick Gel Extraction Kit (QIAGEN, German)を用いて回収した。MGI-MGI-2をベクターpGEMT-Easyにライゲーション後に作出したプラスミドpGEMT-MGI-MGI-2でコンピテント E. coli HB101を形質転換し、形質転換体を1% D-キシロース および 50 mg/L アンピシリンを含有している1% MacConkeyプレートでグルコースイソメラーゼ活性で選抜した。プラスミドpGEMT-MGI-MGI-2 DNAを、陽性クローンから単離し、シークエンスした。MGI-2の配列は、W139F および R182Aを含んでいる二つの変異を含む。MGI-MGI-2のアミノ酸配列は、配列表の配列 9として示され、その比活性は表 2に示される。
例7
三つの変異を含んでいるグルコースイソメラーゼ変異体MGI-3の作出
部位特異的突然変異誘発を、文献（Ho et al., Gene 77:51-59, 1989 および White et al., PCR protocol: current methods and applications. Totowa, N.J.: Humana Press 1993）に記載のとおり行った。
三つの変異を含んでいるグルコースイソメラーゼ変異体MGI-3の作出
部位特異的突然変異誘発を、文献（Ho et al., Gene 77:51-59, 1989 および White et al., PCR protocol: current methods and applications. Totowa, N.J.: Humana Press 1993）に記載のとおり行った。
断片 T1FR, QFT2 およびFFARを、それぞれ例 2, 5 および6にしたがって増幅し、回収した。断片 AFQRをプライマーペア 182AF (例 3) および 299QR (例 5)を用いて次の条件で増幅した： 20 mM Tris-HCl (pH 8.8), 10 mM KCl, 10 mM (NH4)2SO4, 2 mM MgSO4, 0.1% トリトン X-100, 50 μM dATP, 50 μM dTTP, 50 μM dCTP, 50 μM dGTP, 400 nM プライマー 182AF および 400 nM プライマー 299QR, 1.5 U Pfu ＤＮＡポリメラーゼ, 20 ng pGEMT-TS。そして、総容積を、無菌の蒸留水で50 μlに調製した。反応に対するPCR増幅プログラムは、95℃, 3 min; 次に35 サイクルの95℃, 50 sec, 52℃, 30 sec, 72℃, 3 min; および最終的に 72℃, 5 minであった。PCR産物（断片AFQR）を、1%アガロースゲルで分離し、QIAquick Gel Extraction Kit (QIAGEN, German)を用いて回収した。完全長のグルコースイソメラーゼ遺伝子を次の条件で組立てた： 20 mM Tris-HCl (pH 8.8), 10 mM KCl, 10 mM (NH4)2SO4, 2 mM MgSO4, 0.1% トリトン X-100, 50 μM dATP, 50 μM dTTP, 50 μM dCTP, 50 μM dGTP, 400 nM プライマー T1 および 400 nM プライマー T2, 1.5 UのPfu ＤＮＡポリメラーゼ, 20 ngの断片T1FR, 20 ngの断片FFAR, 20 ngの断片AFQR, 20 ngの断片QFT2。そして、総容積を、無菌の蒸留水で50 μlに調製した。反応に対するPCR増幅プログラムは、95℃, 3 min; 次に35 サイクルの95℃, 50 sec, 52℃, 30 sec, 72℃, 3 min; および最終的に 72℃, 5 minであった。完全長の変異体MGI-3を、1%アガロースゲルで分離し、QIAquick Gel Extraction Kit (QIAGEN, German)を用いて回収した。MGI-MGI-3をベクターpGEMT-Easyにライゲーション後に作出したプラスミドpGEMT-MGI-MGI-3でコンピテント E. coli HB101を形質転換し、形質転換体を1% D-キシロース および 50 mg/L アンピシリンを含有している1% MacConkeyプレートでグルコースイソメラーゼ活性で選抜した。プラスミドpGEMT-MGI-MGI-3 DNAを、陽性クローンから単離し、シークエンスした。MGI-3の配列は、W139F, R182A およびT299Qを含んでいる三つの変異を含む。MGI-MGI-3のアミノ酸配列は、配列表の配列 10として示され、その比活性は表 2に示される。
例8
四つの変異を含んでいるグルコースイソメラーゼ変異体MGI-4の作出
部位特異的突然変異誘発を、文献（Ho et al., Gene 77:51-59, 1989 および White et al., PCR protocol: current methods and applications. Totowa, N.J.: Humana Press 1993）に記載のとおり行った。
四つの変異を含んでいるグルコースイソメラーゼ変異体MGI-4の作出
部位特異的突然変異誘発を、文献（Ho et al., Gene 77:51-59, 1989 および White et al., PCR protocol: current methods and applications. Totowa, N.J.: Humana Press 1993）に記載のとおり行った。
断片 T1FR, QFT2 およびFFARを、それぞれ例 2, 5 および6にしたがって増幅し、回収した。断片 AFSRをプライマーペア 182AF (例 3) および 187SR (例 4)を用いて次の条件で増幅した： 20 mM Tris-HCl (pH 8.8), 10 mM KCl, 10 mM (NH4)2SO4, 2 mM MgSO4, 0.1% トリトン X-100, 50 μM dATP, 50 μM dTTP, 50 μM dCTP, 50 μM dGTP, 400 nM プライマー 182AF および 400 nM プライマー 187SR, 1.5 U Pfu ＤＮＡポリメラーゼ, 20 ng pGEMT-TS。そして、総容積を、無菌の蒸留水で50 μlに調製した。反応に対するPCR増幅プログラムは、95℃, 3 min; 次に35 サイクルの95℃, 50 sec, 52℃, 30 sec, 72℃, 3 min; および最終的に 72℃, 5 minであった。PCR産物（断片AFSR）を、1%アガロースゲルで分離し、QIAquick Gel Extraction Kit (QIAGEN, German)を用いて回収した。断片 SFQRをプライマー 187SF (例 4) および 299QR (例 5)を用いて次の条件で増幅した： 20 mM Tris-HCl (pH 8.8), 10 mM KCl, 10 mM (NH4)2SO4, 2 mM MgSO4, 0.1% トリトン X-100, 50 μM dATP, 50 μM dTTP, 50 μM dCTP, 50 μM dGTP, 400 nM プライマー 187SF および 400 nM プライマー 299QR, 1.5 U Pfu ＤＮＡポリメラーゼ, 20 ng pGEMT-TS。そして、総容積を、無菌の蒸留水で50 μlに調製した。反応に対するPCR増幅プログラムは、95℃, 3 min; 次に35 サイクルの95℃, 50 sec, 52℃, 30 sec, 72℃, 3 min; および最終的に 72℃, 5 minであった。断片SFQRを、1%アガロースゲルで分離し、QIAquick Gel Extraction Kit (QIAGEN, German)を用いて回収した。完全長のグルコースイソメラーゼ遺伝子を次の条件で組立てた： 20 mM Tris-HCl (pH 8.8), 10 mM KCl, 10 mM (NH4)2SO4, 2 mM MgSO4, 0.1% トリトン X-100, 50 μM dATP, 50 μM dTTP, 50 μM dCTP, 50 μM dGTP, 400 nM プライマー T1 および 400 nM プライマー T2, 1.5 UのPfu ＤＮＡポリメラーゼ, 20 ngの断片T1FR, 20 ngの断片FFAR, 20 ngの断片AFSR, 20 ngの断片SFQRおよび20 ngの断片QFT2。そして、総容積を、無菌の蒸留水で50 μlに調製した。反応に対するPCR増幅プログラムは、95℃, 3 min; 次に35 サイクルの95℃, 50 sec, 52℃, 30 sec, 72℃, 3 min; および最終的に 72℃, 5 minであった。完全長の変異体MGI-4を、1%アガロースゲルで分離し、QIAquick Gel Extraction Kit (QIAGEN, German)を用いて回収した。MGI-MGI-4をベクターpGEMT-Easyにライゲーション後に作出したプラスミドpGEMT-MGI-MGI-4でコンピテント E. coli HB101を形質転換し、形質転換体を1% D-キシロース および 50 mg/L アンピシリンを含有している1% MacConkeyプレートでグルコースイソメラーゼ活性で選抜した。プラスミドpGEMT-MGI-MGI-4 DNAを、陽性クローンから単離し、シークエンスした。MGI-4の配列は、W139F, R182A, F187S およびT299Qを含んでいる四つの変異を含む。MGI-MGI-4のアミノ酸配列は、配列表の配列 11として示され、その比活性は表 2に示される。
例9
四変異グルコースイソメラーゼ変異体MGI-4のポジション 139の飽和突然変異誘発
部位特異的突然変異誘発を、文献（Ho et al., Gene 77:51-59, 1989 および White et al., PCR protocol: current methods and applications. Totowa, N.J.: Humana Press 1993）に記載のとおり行った。
四変異グルコースイソメラーゼ変異体MGI-4のポジション 139の飽和突然変異誘発
部位特異的突然変異誘発を、文献（Ho et al., Gene 77:51-59, 1989 および White et al., PCR protocol: current methods and applications. Totowa, N.J.: Humana Press 1993）に記載のとおり行った。
pGEMT-MGI-4 (例 8)を鋳型として用いて、グルコースイソメラーゼ変異体MGI-4のポジション 139のPhe (F)を、部位特異的プライマー 139SF および139SR (表 1) およびユニバーサルプライマーT1 および T2(例 1)でのPCR 増幅によってSer (S)に変異させて、グルコースイソメラーゼ 変異体 MGI4-F139Sを作出した。
断片 T1SR を、プライマーペアT1 および 139SRを用いて増幅した。断片 SFT2 を、プライマーペア 139SF およびT2を用いて増幅した。増幅条件は次のとおりであった： 20 mM Tris-HCl (pH 8.8), 10 mM KCl, 10 mM (NH4)2SO4, 2 mM MgSO4, 0.1% トリトン X-100, 50 μM dATP, 50 μM dTTP, 50 μM dCTP, 50 μM dGTP, 400 nM プライマー T1 および 400 nM プライマー 139SR または400 nM プライマー T2 および 400 nM プライマー 139SF, 1.5 UのPfu ＤＮＡポリメラーゼ(Promega, USA), 20 ng pGEMT-MGI-4。そして、総容積を、無菌の蒸留水で50 μlに調製した。反応に対するPCR増幅プログラムは、95℃, 3 min; 次に35 サイクルの95℃, 50 sec, 52℃, 30 sec, 72℃, 3 min; および最終的に 72℃, 5 minであった。PCR産物（断片T1SRおよび断片SFT2）を、1%アガロースゲルで分離し、QIAquick Gel Extraction Kit (QIAGEN, German)を用いて回収した。完全長のグルコースイソメラーゼ遺伝子を次の条件で組立てた： 20 mM Tris-HCl (pH 8.8), 10 mM KCl, 10 mM (NH4)2SO4, 2 mM MgSO4, 0.1% トリトン X-100, 50 μM dATP, 50 μM dTTP, 50 μM dCTP, 50 μM dGTP, 400 nM プライマー T1 および 400 nM プライマー T2, 1.5 UのPfu ＤＮＡポリメラーゼ, 20 ngの断片T1SR および 20 ngの断片SFT2。そして、総容積を、無菌の蒸留水で50 μlに調製した。反応に対するPCR増幅プログラムは、95℃, 3 min; 次に35 サイクルの95℃, 50 sec, 52℃, 30 sec, 72℃, 3 min; および最終的に 72℃, 5 minであった。完全長の変異体MGI4-F139Sを、1%アガロースゲルで分離し、QIAquick Gel Extraction Kit (QIAGEN, German)を用いて回収した。MGI4-F139SをベクターpGEMT-Easyにライゲーション後に作出したプラスミドpGEMT-MGI4-F139Sでコンピテント E. coli HB101を形質転換し、形質転換体を1% D-キシロース および 50 mg/L アンピシリンを含有している1% MacConkeyプレートでグルコースイソメラーゼ活性で選抜した。プラスミドpGEMT-MGI4-F139S DNAを、陽性クローンから単離し、シークエンスした。MGI4-F139Sの配列は、F139S, R182A, F187S およびT299Qを含んでいる四つの変異を含む。MGI4-F139Sのアミノ酸配列は、配列表の配列 12として示され、その比活性は表 2に示される。
変異体 MGI4-F139K, MGI4-F139C, MGI4-F139I, MGI4-F139T, MGI4-F139N および MGI4-F139Dを、類似の処理で構築した。使用したプライマーを表1に示す。アミノ酸配列は、配列表の配列13〜18として示され、その比活性は表 2に示される。
例10
四変異グルコースイソメラーゼ変異体MGI-4のポジション 182の飽和突然変異誘発
部位特異的突然変異誘発を、文献（Ho et al., Gene 77:51-59, 1989 および White et al., PCR protocol: current methods and applications. Totowa, N.J.: Humana Press 1993）に記載のとおり行った。
四変異グルコースイソメラーゼ変異体MGI-4のポジション 182の飽和突然変異誘発
部位特異的突然変異誘発を、文献（Ho et al., Gene 77:51-59, 1989 および White et al., PCR protocol: current methods and applications. Totowa, N.J.: Humana Press 1993）に記載のとおり行った。
pGEMT-MGI-4 (例 8)を鋳型として用いて、グルコースイソメラーゼ変異体MGI-4のポジション 182のAla (A)を、部位特異的プライマー 182PF および182PR (表 1) およびユニバーサルプライマーT1 および T2(例 1)でのPCR 増幅によってPro (P)に変異させて、グルコースイソメラーゼ 変異体 MGI4-A182Pを作出した。
断片 T1PRを、プライマーペアT1 および 182PRを用いて増幅した。断片PFT2を、プライマーペア182PFおよびT2を用いて増幅した。増幅条件は次のとおりであった： 20 mM Tris-HCl (pH 8.8), 10 mM KCl, 10 mM (NH4)2SO4, 2 mM MgSO4, 0.1% トリトン X-100, 50 μM dATP, 50 μM dTTP, 50 μM dCTP, 50 μM dGTP, 400 nM プライマー T1 および 400 nM プライマー 182PR または400 nM プライマー T2 および 400 nM プライマー 182PF, 1.5 UのPfu ＤＮＡポリメラーゼ, 20 ng pGEMT-MGI-4。そして、総容積を、無菌の蒸留水で50 μlに調製した。反応に対するPCR増幅プログラムは、95℃, 3 min; 次に35 サイクルの95℃, 50 sec, 52℃, 30 sec, 72℃, 3 min; および最終的に 72℃, 5 minであった。PCR産物（断片T1PRおよび断片PFT2）を、1%アガロースゲルで分離し、QIAquick Gel Extraction Kitを用いて回収した。完全長のグルコースイソメラーゼ遺伝子を次の条件で組立てた： 20 mM Tris-HCl (pH 8.8), 10 mM KCl, 10 mM (NH4)2SO4, 2 mM MgSO4, 0.1% トリトン X-100, 50 μM dATP, 50 μM dTTP, 50 μM dCTP, 50 μM dGTP, 400 nM プライマー T1 および 400 nM プライマー T2, 1.5 UのPfu ＤＮＡポリメラーゼ, 20 ngの断片T1PR および 20 ngの断片PFT2。そして、総容積を、無菌の蒸留水で50 μlに調製した。反応に対するPCR増幅プログラムは、95℃, 3 min; 次に35 サイクルの95℃, 50 sec, 52℃, 30 sec, 72℃, 3 min; および最終的に 72℃, 5 minであった。完全長の変異体MGI4-A182Pを、1%アガロースゲルで分離し、QIAquick Gel Extraction Kit (QIAGEN, German)を用いて回収した。MGI4-A182PをベクターpGEMT-Easyにライゲーション後に作出したプラスミドpGEMT-MGI4-A182Pでコンピテント E. coli HB101を形質転換し、形質転換体を1% D-キシロース および 50 mg/L アンピシリンを含有している1% MacConkeyプレートでグルコースイソメラーゼ活性で選抜した。プラスミドpGEMT-MGI4-A182P DNAを、陽性クローンから単離し、シークエンスした。MGI4-A182Pの配列は、W139F, A182P, F187S およびT299Qを含んでいる四つの変異を含む。MGI4-A182Pのアミノ酸配列は、配列表の配列 19として示され、その比活性は表 2に示される。
変異体 MGI4-A182S, MGI4-A182I, MGI4-A182T および MGI4-A182Vを、類似の処理で構築した。使用したプライマーを表1に示す。アミノ酸配列は、配列表の配列20〜23として示され、その比活性は表 2に示される。
例11
四変異グルコースイソメラーゼ変異体MGI-4のポジション 187の飽和突然変異誘発
部位特異的突然変異誘発を、文献（Ho et al., Gene 77:51-59, 1989 および White et al., PCR protocol: current methods and applications. Totowa, N.J.: Humana Press 1993）に記載のとおり行った。
四変異グルコースイソメラーゼ変異体MGI-4のポジション 187の飽和突然変異誘発
部位特異的突然変異誘発を、文献（Ho et al., Gene 77:51-59, 1989 および White et al., PCR protocol: current methods and applications. Totowa, N.J.: Humana Press 1993）に記載のとおり行った。
pGEMT-MGI-4 (例 8)を鋳型として用いて、グルコースイソメラーゼ変異体MGI-4のポジション 187のSer (S)を、部位特異的プライマー 187GF および187GR (表 1) およびユニバーサルプライマーT1 および T2(例 1)でのPCR 増幅によってGly (G)に変異させて、グルコースイソメラーゼ 変異体 MGI4-S187Gを作出した。
断片 T1GR を、プライマーペアT1 および 187GR を用いて増幅した。断片 GFT2 を、プライマーペア 187GF およびT2を用いて増幅した。増幅条件は次のとおりであった： 20 mM Tris-HCl (pH 8.8), 10 mM KCl, 10 mM (NH4)2SO4, 2 mM MgSO4, 0.1% トリトン X-100, 50 μM dATP, 50 μM dTTP, 50 μM dCTP, 50 μM dGTP, 400 nM プライマー T1 および 400 nM プライマー 187GR または400 nM プライマー T2 および 400 nM プライマー 187GF, 1.5 UのPfu ＤＮＡポリメラーゼ, 20 ng pGEMT-MGI-4。そして、総容積を、無菌の蒸留水で50 μlに調製した。反応に対するPCR増幅プログラムは、95℃, 3 min; 次に35 サイクルの95℃, 50 sec, 52℃, 30 sec, 72℃, 3 min; および最終的に 72℃, 5 minであった。PCR産物（断片T1GRおよび断片GFT2）を、1%アガロースゲルで分離し、QIAquick Gel Extraction Kitを用いて回収した。完全長のグルコースイソメラーゼ遺伝子を次の条件で組立てた： 20 mM Tris-HCl (pH 8.8), 10 mM KCl, 10 mM (NH4)2SO4, 2 mM MgSO4, 0.1% トリトン X-100, 50 μM dATP, 50 μM dTTP, 50 μM dCTP, 50 μM dGTP, 400 nM プライマー T1 および 400 nM プライマー T2, 1.5 UのPfu ＤＮＡポリメラーゼ, 20 ngの断片T1GR および 20 ngの断片GFT2。そして、総容積を、無菌の蒸留水で50 μlに調製した。反応に対するPCR増幅プログラムは、95℃, 3 min; 次に35 サイクルの95℃, 50 sec, 52℃, 30 sec, 72℃, 3 min; および最終的に 72℃, 5 minであった。完全長の変異体MGI4-S187Gを、1%アガロースゲルで分離し、QIAquick Gel Extraction Kit (QIAGEN, German)を用いて回収した。MGI4-S187GをベクターpGEMT-Easyにライゲーション後に作出したプラスミドpGEMT-MGI4-S187Gでコンピテント E. coli HB101を形質転換し、形質転換体を1% D-キシロース および 50 mg/L アンピシリンを含有している1% MacConkeyプレートでグルコースイソメラーゼ活性で選抜した。プラスミドpGEMT-MGI4-S187G DNAを、陽性クローンから単離し、シークエンスした。MGI4-S187Gの配列は、W139F, R182A, S187G およびT299Qを含んでいる四つの変異を含む。MGI4-S187Gのアミノ酸配列は、配列表の配列 24として示され、その比活性は表 2に示される。
変異体 MGI4-S187A および MGI4-S187Pを、類似の処理で構築した。使用したプライマーを表1に示す。アミノ酸配列は、配列表の配列25〜26として示され、その比活性は表 2に示される。
例12
四変異グルコースイソメラーゼ変異体MGI-4のポジション 299の飽和突然変異誘発
部位特異的突然変異誘発を、文献（Ho et al., Gene 77:51-59, 1989 および White et al., PCR protocol: current methods and applications. Totowa, N.J.: Humana Press 1993）に記載のとおり行った。
四変異グルコースイソメラーゼ変異体MGI-4のポジション 299の飽和突然変異誘発
部位特異的突然変異誘発を、文献（Ho et al., Gene 77:51-59, 1989 および White et al., PCR protocol: current methods and applications. Totowa, N.J.: Humana Press 1993）に記載のとおり行った。
pGEMT-MGI-4 (例 8)を鋳型として用いて、グルコースイソメラーゼ変異体MGI-4のポジション 299のGln (Q)を、部位特異的プライマー 299IF および299IR (表 1) およびユニバーサルプライマーT1 および T2(例 1)でのPCR 増幅によってIle (I)に変異させて、グルコースイソメラーゼ 変異体 MGI4-Q299Iを作出した。
断片 T1IR を、プライマーペアT1 および 299IR を用いて増幅した。断片 IFT2 を、プライマーペア 299IF およびT2を用いて増幅した。増幅条件は次のとおりであった： 20 mM Tris-HCl (pH 8.8), 10 mM KCl, 10 mM (NH4)2SO4, 2 mM MgSO4, 0.1% トリトン X-100, 50 μM dATP, 50 μM dTTP, 50 μM dCTP, 50 μM dGTP, 400 nM プライマー T1 および 400 nM プライマー 299IR または400 nM プライマー T2 および 400 nM プライマー 299IF, 1.5 UのPfu ＤＮＡポリメラーゼ, 20 ng pGEMT-MGI-4。そして、総容積を、無菌の蒸留水で50 μlに調製した。反応に対するPCR増幅プログラムは、95℃, 3 min; 次に35 サイクルの95℃, 50 sec, 52℃, 30 sec, 72℃, 3 min; および最終的に 72℃, 5 minであった。PCR産物（断片T1IRおよび断片IFT2）を、1%アガロースゲルで分離し、QIAquick Gel Extraction Kitを用いて回収した。完全長のグルコースイソメラーゼ遺伝子を次の条件で組立てた： 20 mM Tris-HCl (pH 8.8), 10 mM KCl, 10 mM (NH4)2SO4, 2 mM MgSO4, 0.1% トリトン X-100, 50 μM dATP, 50 μM dTTP, 50 μM dCTP, 50 μM dGTP, 400 nM プライマー T1 および 400 nM プライマー T2, 1.5 UのPfu ＤＮＡポリメラーゼ, 20 ngの断片T1IR および 20 ngの断片IFT2。そして、総容積を、無菌の蒸留水で50 μlに調製した。反応に対するPCR増幅プログラムは、95℃, 3 min; 次に35 サイクルの95℃, 50 sec, 52℃, 30 sec, 72℃, 3 min; および最終的に 72℃, 5 minであった。完全長の変異体MGI4-Q299Iを、1%アガロースゲルで分離し、QIAquick Gel Extraction Kit (QIAGEN, German)を用いて回収した。MGI4-Q299IをベクターpGEMT-Easyにライゲーション後に作出したプラスミドpGEMT-MGI4-Q299Iでコンピテント E. coli HB101を形質転換し、形質転換体を1% D-キシロース および 50 mg/L アンピシリンを含有している1% MacConkeyプレートでグルコースイソメラーゼ活性で選抜した。プラスミドpGEMT-MGI4-Q299I DNAを、陽性クローンから単離し、シークエンスした。MGI4-Q299Iの配列は、W139F, R182A, F187S およびQ299Iを含んでいる四つの変異を含む。MGI4-Q299Iのアミノ酸配列は、配列表の配列 27として示され、その比活性は表 2に示される。
変異体 MGI4-Q299Y, MGI4-Q299C, MGI4-Q299M およびMGI4-Q299Eを、類似の処理で構築した。使用したプライマーを表1に示す。アミノ酸配列は、配列表の配列28〜31として示され、その比活性は表 2に示される。
例13
五変異グルコースイソメラーゼ変異体 MGI4-F87L, MGI4-F87M, MGI4-V217R, MGI4-D260E およびMGI4-F276Gの産生
部位特異的突然変異誘発を、文献（Ho et al., Gene 77:51-59, 1989 および White et al., PCR protocol: current methods and applications. Totowa, N.J.: Humana Press 1993）に記載のとおり行った。
五変異グルコースイソメラーゼ変異体 MGI4-F87L, MGI4-F87M, MGI4-V217R, MGI4-D260E およびMGI4-F276Gの産生
部位特異的突然変異誘発を、文献（Ho et al., Gene 77:51-59, 1989 および White et al., PCR protocol: current methods and applications. Totowa, N.J.: Humana Press 1993）に記載のとおり行った。
pGEMT-MGI-4 (例 8)を鋳型として用いて、MGI-4のポジション 87のPhe (F)を、部位特異的プライマー 87LF および87LR (表 1) およびユニバーサルプライマーT1 および T2(例 1)でのPCR 増幅によってLeu (L)に変異させて、グルコースイソメラーゼ 変異体 MGI4-F87Lを作出した。
断片 T1LR を、プライマーペアT1 および 87LR を用いて増幅した。断片 LFT2 を、プライマーペア 87LF およびT2を用いて増幅した。増幅条件は次のとおりであった： 20 mM Tris-HCl (pH 8.8), 10 mM KCl, 10 mM (NH4)2SO4, 2 mM MgSO4, 0.1% トリトン X-100, 50 μM dATP, 50 μM dTTP, 50 μM dCTP, 50 μM dGTP, 400 nM プライマー T1 および 400 nM プライマー 87LR または400 nM プライマー T2 および 400 nM プライマー 87LF, 1.5 UのPfu ＤＮＡポリメラーゼ(Promega, USA), 20 ng pGEMT-MGI-4。そして、総容積を、無菌の蒸留水で50 μlに調製した。反応に対するPCR増幅プログラムは、95℃, 3 min; 次に35 サイクルの95℃, 50 sec, 52℃, 30 sec, 72℃, 3 min; および最終的に 72℃, 5 minであった。PCR産物（断片T1LRおよび断片LFT2）を、1%アガロースゲルで分離し、QIAquick Gel Extraction Kit (QIAGEN, German)を用いて回収した。完全長のグルコースイソメラーゼ遺伝子を次の条件で組立てた： 20 mM Tris-HCl (pH 8.8), 10 mM KCl, 10 mM (NH4)2SO4, 2 mM MgSO4, 0.1% トリトン X-100, 50 μM dATP, 50 μM dTTP, 50 μM dCTP, 50 μM dGTP, 400 nM プライマー T1 および 400 nM プライマー T2, 1.5 UのPfu ＤＮＡポリメラーゼ, 20 ngの断片T1LR および 20 ngの断片LFT2。そして、総容積を、無菌の蒸留水で50 μlに調製した。反応に対するPCR増幅プログラムは、95℃, 3 min; 次に35 サイクルの95℃, 50 sec, 52℃, 30 sec, 72℃, 3 min; および最終的に 72℃, 5 minであった。完全長の変異体MGI4-F87Lを、1%アガロースゲルで分離し、QIAquick Gel Extraction Kit (QIAGEN, German)を用いて回収した。MGI4-F87LをベクターpGEMT-Easyにライゲーション後に作出したプラスミドpGEMT-MGI4-F87Lでコンピテント E. coli HB101を形質転換し、形質転換体を1% D-キシロース および 50 mg/L アンピシリンを含有している1% MacConkeyプレートでグルコースイソメラーゼ活性で選抜した。プラスミドpGEMT-MGI4-F87L DNAを、陽性クローンから単離し、シークエンスした。MGI4-F87Lの配列は、F87L, W139F, R182A, F187S およびT299Qを含んでいる五つの変異を含む。MGI4-F87Lのアミノ酸配列は、配列表の配列 32として示され、その比活性は表 2に示される。
変異体 MGI4-F87Mを、類似の処理で構築した。使用したプライマーを表1に示す。変異体MGI4-F87Mの配列は、F87M, W139F, R182A, F187S およびT299Qを含んでいる五つの変異を含む。アミノ酸配列は、配列表の配列 33として示され、その比活性は表 2に示される。変異体 MGI4-V217Rを、類似の処理で構築した。使用したプライマーを表1に示す。変異体MGI4-V217Rの配列は、W139F, R182A, F187S, V217R およびT299Qを含んでいる五つの変異を含む。MGI4-V217Rのアミノ酸配列は、配列表の配列 34として示され、その比活性は表 2に示される。変異体 MGI4-D260Eを、類似の処理で構築した。使用したプライマーを表1に示す。変異体の配列は、W139F, R182A, F187S, D260E およびT299Qを含んでいる五つの変異を含む。MGI4-D260Eのアミノ酸配列は、配列表の配列 35として示され、その比活性は表 2に示される。変異体 MGI4-F276Gを、類似の処理で構築した。使用したプライマーを表1に示す。変異体の配列は、W139F, R182A, F187S, F276G およびT299Qを含んでいる五つの変異を含む。MGI4-F276Gのアミノ酸配列は、配列表の配列 36として示され、その比活性は表 2に示される。
例14
六変異グルコースイソメラーゼ変異体MGI4-24およびMGI4-25の産生
部位特異的突然変異誘発を、文献（Ho et al., Gene 77:51-59, 1989 および White et al., PCR protocol: current methods and applications. Totowa, N.J.: Humana Press 1993）に記載のとおり行った。
六変異グルコースイソメラーゼ変異体MGI4-24およびMGI4-25の産生
部位特異的突然変異誘発を、文献（Ho et al., Gene 77:51-59, 1989 および White et al., PCR protocol: current methods and applications. Totowa, N.J.: Humana Press 1993）に記載のとおり行った。
断片T1LRを、増幅し、例 13のとおり回収した。断片 LFAR を、プライマーペア 87LF および 260AR を用いて増幅した（表 1）。増幅条件は次のとおりであった： 20 mM Tris-HCl (pH 8.8), 10 mM KCl, 10 mM (NH4)2SO4, 2 mM MgSO4, 0.1% トリトン X-100, 50 μM dATP, 50 μM dTTP, 50 μM dCTP, 50 μM dGTP, 400 nM プライマー 87LF および400 nM プライマー 260AR, 1.5 UのPfu ＤＮＡポリメラーゼ, 20 ng pGEMT-MGI-4。そして、総容積を、無菌の蒸留水で50 μlに調製した。反応に対するPCR増幅プログラムは、95℃, 3 min; 次に35 サイクルの95℃, 50 sec, 52℃, 30 sec, 72℃, 3 min; および最終的に 72℃, 5 minであった。PCR産物（断片LFAR）を、1%アガロースゲルで分離し、QIAquick Gel Extraction Kit (QIAGEN, German)を用いて回収した。断片 AFT2 を、プライマーペア 260AF および T2 を用いて増幅し、回収した（表 1）。増幅条件は次のとおりであった： 20 mM Tris-HCl (pH 8.8), 10 mM KCl, 10 mM (NH4)2SO4, 2 mM MgSO4, 0.1% トリトン X-100, 50 μM dATP, 50 μM dTTP, 50 μM dCTP, 50 μM dGTP, 400 nM プライマー 260AF および400 nM プライマー T2, 1.5 UのPfu ＤＮＡポリメラーゼ, 20 ng pGEMT-MGI-4。そして、総容積を、無菌の蒸留水で50 μlに調製した。反応に対するPCR増幅プログラムは、95℃, 3 min; 次に35 サイクルの95℃, 50 sec, 52℃, 30 sec, 72℃, 3 min; および最終的に 72℃, 5 minであった。PCR産物（断片AFT2）を、1%アガロースゲルで分離し、QIAquick Gel Extraction Kit (QIAGEN, German)を用いて回収した。完全長のグルコースイソメラーゼ遺伝子を次の条件で組立てた： 20 mM Tris-HCl (pH 8.8), 10 mM KCl, 10 mM (NH4)2SO4, 2 mM MgSO4, 0.1% トリトン X-100, 50 μM dATP, 50 μM dTTP, 50 μM dCTP, 50 μM dGTP, 400 nM プライマー T1 および 400 nM プライマー T2, 1.5 UのPfu ＤＮＡポリメラーゼ, 20 ngの断片T1LR, 20 ngの断片LFARおよび 20 ngの断片AFT2。そして、総容積を、無菌の蒸留水で50 μlに調製した。反応に対するPCR増幅プログラムは、95℃, 3 min; 次に35 サイクルの95℃, 50 sec, 52℃, 30 sec, 72℃, 3 min; および最終的に 72℃, 5 minであった。完全長の変異体MGI4-24を、1%アガロースゲルで分離し、QIAquick Gel Extraction Kit (QIAGEN, German)を用いて回収した。MGI-MGI4-24をベクターpGEMT-Easyにライゲーション後に作出したプラスミドpGEMT-MGI4-MGI-24でコンピテント E. coli HB101を形質転換し、形質転換体を1% D-キシロース および 50 mg/L アンピシリンを含有している1% MacConkeyプレートでグルコースイソメラーゼ活性で選抜した。プラスミドpGEMT-MGI4-24 DNAを、陽性クローンから単離し、シークエンスした。MGI4-24の配列は、F87L, W139F, R182A, F187S, T299Q およびD260Aを含んでいる六つの変異を含む。MGI4-24のアミノ酸配列は、配列表の配列 37として示され、その比活性は表 2に示される。
変異体 MGI4-25を、類似の処理で構築した。使用されたプライマーペアは、T1 および 87LR, 87LF および 276TR, 276TF および T2であった(表 1)。変異体の配列は、F87L, W139F, R182A, F187S, T299Q およびF276Tを含んでいる六つの変異を含む。アミノ酸配列は、配列表の配列 38として示され、その比活性は表 2に示される。
例15
七変異グルコースイソメラーゼ変異体MGI4-34およびMGI4-35の産生
部位特異的突然変異誘発を、文献（Ho et al., Gene 77:51-59, 1989 および White et al., PCR protocol: current methods and applications. Totowa, N.J.: Humana Press 1993）に記載のとおり行った。
七変異グルコースイソメラーゼ変異体MGI4-34およびMGI4-35の産生
部位特異的突然変異誘発を、文献（Ho et al., Gene 77:51-59, 1989 および White et al., PCR protocol: current methods and applications. Totowa, N.J.: Humana Press 1993）に記載のとおり行った。
断片T1LRを、増幅し、例 13のとおり回収した。断片 LFGR を、プライマーペア 87LF および 217GR を用いて増幅した（表 1）。増幅条件は次のとおりであった： 20 mM Tris-HCl (pH 8.8), 10 mM KCl, 10 mM (NH4)2SO4, 2 mM MgSO4, 0.1% トリトン X-100, 50 μM dATP, 50 μM dTTP, 50 μM dCTP, 50 μM dGTP, 400 nM プライマー 87LF および400 nM プライマー 217GR, 1.5 UのPfu ＤＮＡポリメラーゼ, 20 ng pGEMT-MGI-4。そして、総容積を、無菌の蒸留水で50 μlに調製した。反応に対するPCR増幅プログラムは、95℃, 3 min; 次に35 サイクルの95℃, 50 sec, 52℃, 30 sec, 72℃, 3 min; および最終的に 72℃, 5 minであった。PCR産物（断片LFGR）を、1%アガロースゲルで分離し、QIAquick Gel Extraction Kit (QIAGEN, German)を用いて回収した。断片 GFTR を、プライマーペア 217GF および276TR を用いて増幅し、回収した（表 1）。増幅条件は次のとおりであった： 20 mM Tris-HCl (pH 8.8), 10 mM KCl, 10 mM (NH4)2SO4, 2 mM MgSO4, 0.1% トリトン X-100, 50 μM dATP, 50 μM dTTP, 50 μM dCTP, 50 μM dGTP, 400 nM プライマー 217GF および400 nM プライマー 276TR, 1.5 UのPfu ＤＮＡポリメラーゼ, 20 ng pGEMT-MGI-4。そして、総容積を、無菌の蒸留水で50 μlに調製した。反応に対するPCR増幅プログラムは、95℃, 3 min; 次に35 サイクルの95℃, 50 sec, 52℃, 30 sec, 72℃, 3 min; および最終的に 72℃, 5 minであった。PCR産物（断片GFTR）を、1%アガロースゲルで分離し、QIAquick Gel Extraction Kit (QIAGEN, German)を用いて回収した。断片 TFT2 を、プライマーペア 276TF および T2 を用いて増幅し、回収した（表 1）。増幅条件は次のとおりであった： 20 mM Tris-HCl (pH 8.8), 10 mM KCl, 10 mM (NH4)2SO4, 2 mM MgSO4, 0.1% トリトン X-100, 50 μM dATP, 50 μM dTTP, 50 μM dCTP, 50 μM dGTP, 400 nM プライマー 276TF および400 nM プライマー T2, 1.5 UのPfu ＤＮＡポリメラーゼ, 20 ng pGEMT-MGI-4。そして、総容積を、無菌の蒸留水で50 μlに調製した。反応に対するPCR増幅プログラムは、95℃, 3 min; 次に35 サイクルの95℃, 50 sec, 52℃, 30 sec, 72℃, 3 min; および最終的に 72℃, 5 minであった。PCR産物（断片TFT2）を、1%アガロースゲルで分離し、QIAquick Gel Extraction Kit (QIAGEN, German)を用いて回収した。完全長のグルコースイソメラーゼ遺伝子を次の条件で組立てた： 20 mM Tris-HCl (pH 8.8), 10 mM KCl, 10 mM (NH4)2SO4, 2 mM MgSO4, 0.1% トリトン X-100, 50 μM dATP, 50 μM dTTP, 50 μM dCTP, 50 μM dGTP, 400 nM プライマー T1 および 400 nM プライマー T2, 1.5 UのPfu ＤＮＡポリメラーゼ, 20 ngの断片T1LR, 20 ngの断片LFAR, 20 ngの断片GFTRおよび 20 ngの断片TFT2。そして、総容積を、無菌の蒸留水で50 μlに調製した。反応に対するPCR増幅プログラムは、95℃, 3 min; 次に35 サイクルの95℃, 50 sec, 52℃, 30 sec, 72℃, 3 min; および最終的に 72℃, 5 minであった。完全長の変異体MGI4-34を、1%アガロースゲルで分離し、QIAquick Gel Extraction Kit (QIAGEN, German)を用いて回収した。MGI-MGI4-34をベクターpGEMT-Easyにライゲーション後に作出したプラスミドpGEMT-MGI4-MGI-34でコンピテント E. coli HB101を形質転換し、形質転換体を1% D-キシロース および 50 mg/L アンピシリンを含有している1% MacConkeyプレートでグルコースイソメラーゼ活性で選抜した。プラスミドpGEMT-MGI4-34 DNAを、陽性クローンから単離し、シークエンスした。MGI4-34の配列は、F87L, W139F, R182A, F187S, T299Q, V217G およびF276Tを含んでいる七つの変異を含む。MGI4-34のアミノ酸配列は、配列表の配列 39として示され、その比活性は表 2に示される。
七つの変異を有する変異体 MGI4-35を、類似の処理で構築した。使用されたプライマーペアは、T1 および87LR, 87LF および217GR, 217GF および260AR, 260AF およびT2であった(表 1)。変異体の配列は、F87L, W139F, R182A, F187S, T299Q, V217G およびD260Aを含んでいる七つの変異を含む。アミノ酸配列は、配列表の配列 40として示され、その比活性は表 2に示される。
例16
野生型グルコースイソメラーゼの単離 および 精製
野生型グルコースイソメラーゼの単離 および 精製は、文献（Lee et al., Journal of General Microbiology, 139:1227-1234, 1993）にしたがって行った。
野生型グルコースイソメラーゼの単離 および 精製
野生型グルコースイソメラーゼの単離 および 精製は、文献（Lee et al., Journal of General Microbiology, 139:1227-1234, 1993）にしたがって行った。
プラスミド pGEMT-TSで形質転換したE. coli HB101細胞を、1% D-キシロース および 50 mg/L アンピシリンを含有しているMacConkey プレートで37゜Cで36 時間インキュベーションした。前記プレートからの単一コロニーを、播種し、50 mg/L アンピシリンを添加した5 ml LBで16 時間培養した。細菌細胞を、ペレットとし、1 mlの20 mM リン酸ナトリウム緩衝剤 (pH 6.5)に再懸濁し、CoCl2 およびMgCl2を、それぞれ250 μM および 5 mMの最終濃度まで添加し、超音波を用いて破砕し、遠心分離を17,800 g で15 min、10゜Cで行って上清を粗タンパク質として採取した。その粗タンパク質を、80゜Cで10 min熱し、遠心分離を17,800 gで15 min、10゜Cで行って沈殿物を除去した。結果として生じる部分的に精製されたグルコースイソメラーゼを、引き続くアッセイに使用した。
例17
グルコースイソメラーゼ変異体の単離 および 精製
グルコースイソメラーゼ 変異体 MGI4-35の単離 および 精製を、例 16に記載のとおり行った（但し、使用したプラスミドはpGEMT-MGI4-35であった）。また、他のグルコースイソメラーゼ変異体を、例 16に記載のとおり単離し、精製した。
グルコースイソメラーゼ変異体の単離 および 精製
グルコースイソメラーゼ 変異体 MGI4-35の単離 および 精製を、例 16に記載のとおり行った（但し、使用したプラスミドはpGEMT-MGI4-35であった）。また、他のグルコースイソメラーゼ変異体を、例 16に記載のとおり単離し、精製した。
例18
野生型グルコースイソメラーゼの活性アッセイ
1.0 M D-キシロース, 20 mM リン酸ナトリウム 緩衝剤 (pH6.5), 250 μM CoCl2 (終濃度) および 5 mM MgCl2 (終濃度)を含有している基質溶液Aの保存溶液を、pH 6.5に調整した。90μlの基質溶液Aの保存溶液を、例 16に記載のとおり調製された10 μlのグルコースイソメラーゼと混合し、インキュベーションを80゜Cで10 min行い、すぐに氷上で停止した。形成されたD-キシルロースを、システイン-カルバゾール法（Dische et al., Journal of Biological Chemistry, 192:583-587, 1951; および Nakamura, Agricultural and Biological Chemistry, 32:701-706, 1968）で測定した。タンパク質濃度を、クーマシー（登録商標）プラス タンパク質 アッセイ 試薬 キット (ピアス, USA) および SDS-PAGEを用いて決定した。一単位の酵素活性は、アッセイ条件下で分ごとに1 μモルのD-キシロースからキシルロースを産生する酵素量と規定される。以下の表 2は、野生型のグルコースイソメラーゼの比活性を示す。
野生型グルコースイソメラーゼの活性アッセイ
1.0 M D-キシロース, 20 mM リン酸ナトリウム 緩衝剤 (pH6.5), 250 μM CoCl2 (終濃度) および 5 mM MgCl2 (終濃度)を含有している基質溶液Aの保存溶液を、pH 6.5に調整した。90μlの基質溶液Aの保存溶液を、例 16に記載のとおり調製された10 μlのグルコースイソメラーゼと混合し、インキュベーションを80゜Cで10 min行い、すぐに氷上で停止した。形成されたD-キシルロースを、システイン-カルバゾール法（Dische et al., Journal of Biological Chemistry, 192:583-587, 1951; および Nakamura, Agricultural and Biological Chemistry, 32:701-706, 1968）で測定した。タンパク質濃度を、クーマシー（登録商標）プラス タンパク質 アッセイ 試薬 キット (ピアス, USA) および SDS-PAGEを用いて決定した。一単位の酵素活性は、アッセイ条件下で分ごとに1 μモルのD-キシロースからキシルロースを産生する酵素量と規定される。以下の表 2は、野生型のグルコースイソメラーゼの比活性を示す。
例19
グルコースイソメラーゼ変異体の活性アッセイ
グルコースイソメラーゼ変異体 MGI4-35 および 他の変異体の活性を、例 18に記載のとおり測定した。以下の表 2は、野生型グルコースイソメラーゼ および変異体の特異的活性の比較を示す。
例20
野生型グルコースイソメラーゼの熱安定性
例 16に記載のとおり得られた百μlの部分的に精製された野生型グルコースイソメラーゼを、七つの1.5 ml 微量遠心チュウブの各々に添加し、200 μlのミネラル油でオーバーレイした。前記チュウブを、80゜Cのウォーターバスに配置した。前記七つのチュウブを一つ、0 h, 4 h, 12 h および 24 hの時間間隔でウォーターバスから除き、遠心分離を17,800 gで20 min、10゜Cで行った。上清の残留タンパク質 および 残留グルコースイソメラーゼ活性を、例 18に記載のとおり決定した。図 1は、野生型グルコースイソメラーゼの80゜Cでの熱安定性を示す。
グルコースイソメラーゼ変異体の活性アッセイ
グルコースイソメラーゼ変異体 MGI4-35 および 他の変異体の活性を、例 18に記載のとおり測定した。以下の表 2は、野生型グルコースイソメラーゼ および変異体の特異的活性の比較を示す。
野生型グルコースイソメラーゼの熱安定性
例 16に記載のとおり得られた百μlの部分的に精製された野生型グルコースイソメラーゼを、七つの1.5 ml 微量遠心チュウブの各々に添加し、200 μlのミネラル油でオーバーレイした。前記チュウブを、80゜Cのウォーターバスに配置した。前記七つのチュウブを一つ、0 h, 4 h, 12 h および 24 hの時間間隔でウォーターバスから除き、遠心分離を17,800 gで20 min、10゜Cで行った。上清の残留タンパク質 および 残留グルコースイソメラーゼ活性を、例 18に記載のとおり決定した。図 1は、野生型グルコースイソメラーゼの80゜Cでの熱安定性を示す。
例21
グルコースイソメラーゼ変異体の熱安定性
グルコースイソメラーゼ 変異体 MGI-4, MGI4-34 またはMGI4-35の熱安定性を、例 20に記載のとおり測定し、図 1に示した。図 1に示したとおり、野生型グルコースイソメラーゼの80゜Cでの活性の半減期は、13.4 時間であり、MGI-4では21.4 時間であり、MGI4-34では19.2 時間であり、MGI4-35では24 時間をこえていた。
グルコースイソメラーゼ変異体の熱安定性
グルコースイソメラーゼ 変異体 MGI-4, MGI4-34 またはMGI4-35の熱安定性を、例 20に記載のとおり測定し、図 1に示した。図 1に示したとおり、野生型グルコースイソメラーゼの80゜Cでの活性の半減期は、13.4 時間であり、MGI-4では21.4 時間であり、MGI4-34では19.2 時間であり、MGI4-35では24 時間をこえていた。
本発明は、上記の例の詳細な記述によって限定されない。当業者は様々な修飾を本発明の範囲を逸脱することなく達成し得る。
Claims (1)
- セルロースまたはヘミセルロースをバイオエタノールに分解する間のＤ−キシロースからキシルロースへの転換におけるグルコースイソメラーゼ変異体の使用方法であって、前記グルコースイソメラーゼ変異体は、配列表の配列番号１２〜配列番号４０のアミノ酸配列の何れか一つを有し、Ｄ−キシロースを基質として用いるキシルロースへの転換において配列表の配列番号２の野生型グルコースイソメラーゼよりも少なくとも５０％高い触媒活性を有する使用方法。
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